Semmelweis egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
PATHOBIOKÉMIA DOKTORI PROGRAM
A Vav2 fehérje szabályozásának vizsgálata az epidermális növekedési faktor jelpályájában Doktori (Ph.D . ) é r t e k e z é s t é z i s e i
TAMÁS PÉTER Témavezeto: Dr. Buday Lá s z l ó
Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet
BUDAPEST 2003
Bevezetés A
tirozin
kináz
aktivitással
rendelkezo
növekedési
f a k t o r r e c e p t o r o k a p r o l i f e r á c i ó m e l l e t t s z á m o s m á s h a t á s t is közvetítenek
a
sejt e k
b e ls e j e
felé.
Aktivációjuk
e r e d m é n y e k é p p e n a s e j t e k a k t i n c i t o s z k e le t o n j á n a k s z e r k e z e t e átalakul. Az elmúlt években nyilvánvalóvá vált, hogy az aktin hálózat átrendezodéséért elsosorban a Rho családba tartozó kis G fehérjék a felelosek. A család legismertebb t a g jai a Rho, a R a c é s a C d c 4 2 . A Rh o a k t i v á c i ó j á t k ö v e t o e n a s e j t e k b e n kontraktilis aktin -miozin kötegek, ún. stressz rostok jönnek létre. A Rac aktivitás fokozódásának hatására lamellipódiumok és membrán fodrozódások alakulnak ki, a Cdc42 aktivációját pedig filopódiumoknak nevezett vékony tuszeru nyúlványok keletkezése követi a sejtekben. A Rho fehérjék, mint minden G fehérje ,
GDP
kötött
formában
inaktívak
és
GTP
kötött
formában aktívak. A guanin nukleotidok cseréjét szabályzó fehérjék
befolyásolják.
A
guanin
nu kleotid
kicserélodési
f a k t o r ( G EF ) a G D P G T P - r e v a l ó c s e r é j é t k a t a l i z á l j a , s e z á l t a l a Rho fehérjék aktív formáját stabilizálja. A GTP-áz aktiváló protein (GAP) és a guanin nukleotid disszociációs inhibítor ( G D I ) s z a b á l y z ó f e h é r j é k e z z e l s z e m b e n a GD P k ö t ö t t i n a k t í v állapotnak kedveznek. A
kísérleteimben
egy
Rac -o t
és
Cdc42-t
aktiváló
kics e r é l o d é s i f a k t o rn a k a V a v 2-n e k a s z e r e p é t v i z s g á l t a m a z EGF receptor jelpályájában. Az irodalomból ismert, hogy az EGF receptor serkentését követoen a Rac aktiváló dik, és a sejtekben lamellipódiumok és membrán fodrozódások jönnek
létre.
A
Rac
aktiváció
pontos
mechanizmusa
azonban
ismeretlen, számos párhuzamos jelpálya létezését feltételezik. Több
eredmény
arra
utal,
hogy
a
Vav
fehérjéknek szerepe lehet a folyamatban.
családba
tartozó
A családnak jelenleg
három tagja ismert. A Vav1 csak hemopoetikus sejtekben fordul
elo,
és
szerepet
játszik
a
T
és
B
sejt
receptor
közvetítette jelpályákban. A Vav2 azonban minden szomatikus s e j t b e n m e g t a l á l h a t ó . A V a v 2 , m i n t m i n d e n R h o ki c s e r é l o d é s i f a k t o r, t a r t a l m a z z a a k i c s e r é l o d é s i a k t i v i t á s é r t f e l e l o s D b l homológ domént (DH) és a p leksztrin homológ domé nt (PH). A P H d o m é n f o s z f a t i d i l i n o z i t o l- 3 - f o s z f á t o k h o z k a p c s o l ó d h a t , é s szerepe
lehet
a
fehérje
kicserélodési
aktivitásának
a
szabályozásában. Az adapter fehérjékre jellemzo SH2 és SH3 domének
jelenléte
a
V a v 2- b e n ,
a
fehérje
számos
más
fehérjével való interakciójára utal. A Vav2 kapcsolódik az aktiválódott EGF receptorhoz, s az EGF receptor tirozinon foszforilálja a fehérjét. Az irodalmi adatok alapján a Vav2 kicserélodési fokozódik. ismert.
aktivitása
a
f o s zf o r i l á c i ó
következtében
Az aktiváció pontos mechanizmusa azonban nem
Munkámmal
hozzájárulni.
ennek
tisztázásához
szerettem
volna
Célkituzések A Vav fehérjék szerepérol, muködési mechanizmusáról megjelent
eddigi
közlemények
számos
ellentmondást
tartalmaznak és további kérdéseket vetnek fel. A munká nk során arra vállalkoztunk, hogy felderítjük a Vav2 szerepét és m u k ö d é s é n e k m e c h a n i z m u s á t a z E G F r e c e p t o r j e l p á l y á j á b a n. Bizonyítani kívántuk, hogy a Vav2 sejten belül SH2 doménje közvetítésével kapcsolódik az aktiválódott EGF recetorhoz. Kíváncsiak voltunk, vajon az asszociációban az EGF receptor mely foszfotirozinjai vesznek részt. Terveinkben szerepelt a Vav2 foszforilációs helyeinek a meghatározása is. Az irodalmi adatok alapján a Vav2 aktivitásának a s z a b á l y o z á s á b a n a t i r o z i n f o s z f o r i l á c i ó é s a P I 3- k i n á z l i p i d termékei
vehetnek
ellentmondásosak.
részt. Vizsgálni
Az
eredmények
kívántuk
mindkét
azonban jelpálya
j e l e n t o s é g é t a V a v 2 R a c -o t s e r k e n t o k i c s e r é l o d é s i a k t i v i t á s á r a . I s m e r t t é n y , h o g y a V a v 2-t t ú l t e r m e l o s e j t e k b e n a z aktin citoszkeleton átrendezodik. Jellemezni kívántuk a Vav2 overexpresszió Cos7
hatására
sejtekben.
A
sejt
létrejövo aktin
morfológiai
citoszkeleton
változásokat változásainak
nyomon követése is alapul szolgált a tirozin foszforiláció és a foszfatidilinozitol
3-foszfátok
hatásainak vizsgála tához.
Vav2
aktivitásra
gyakorolt
Felhasznált módszerek
DNS konstrukciók A
Vav2
expresziós
cDNS-ét
vektorba
pGEX
bakteriális
klónoztam.
A
és
Vav2
GFP
egyes
emlos
darabjait
polimeráz láncreakció (PCR) segítségével állítottam elo. A V a v 2-b e
illetve
egyes
darabjaiba
célzott
pontmutációkat
vittem kétlépcsos polimeráz láncreakció segítségével. Az elso PCR egyik primere tartalmazta a kívánt mutációt, a második PCR-ben pedig az elso PCR termékét primerként alkalmaztam. A
GST
fúziós
fehérjéket
expresszáltattam,
s
affinitás
E.
coli
kromatográfia
baktériumban segítségével
tisztítottam. A GFP konstrukciókkal lipofektaminos eljárás s e g í t s é g é v e l C o s 7 s e j t e k e t t r a n z i e n s e n t r a n s z f e k t á l t a m.
In vitro kináz assay EGF - f e l k e z e l t A 4 3 1 s e j t e k b o l a f f i n i t á s k r o m a t o g r á f i a segítségével különbözo
aktivált
EGF
mutánsainak
jelenlétében
a
vizsgáltam.
A
receptort in
tisztított
vitro EGF
foszforiláció
tisztítottam.
A
Vav2
foszforilációját
ATP
receptor
mértékét
hozzáadásával
a n t i- f o s z f o t i r o z i n
Western blot segítségével határoztam meg.
Foszfopeptidekke l végzett kompetíciós kísérlet Az
EGF
receptor
ismert
autofoszforilációs
helyei
alapján foszfopeptideket szintetizáltattam, s egy kompetíciós kísérletben aktiválódott
vizsgáltam, EGF
hogy
receptor
a
Vav2 melyik
SH2
doménje
az
foszfotirozinjához
k a p c s o l ó d h at . foszfopeptidek vizsgáltam,
EGF
kezelt
sejtek
jelenlétében
hogy
melyik
Vav2
kivonatához SH2
foszfopeptid
a
domént tudja
különbözo adtam,
és
leszorítani
az
aktivált EGF receptort a Vav2 SH2 doménjérol.
Immunprecipitáció és Western blot A
transzfektált
s ejteket
EGF -fel
kezeltem.
A
GFP
f ú z i ó s f e h é r j é k e t a n t i- G F P e l l e n a n y a g g a l i m m u n p r e c i p i t á l t a m , majd SDS poliakrilamid gélelektroforézist követoen a fehérjék f o s z f o r i l á c i ó j á t a n t i- f o s z f o z i r o z i n W e s t e r n b l o t s e g í t s é g é v e l vizsgáltam.
Rac aktivitás mérés A Ra c s e j t e n b e l ü l i a k t i v i t á s á t P A K p u l l -d o w n a s s a y segítségével határoztam meg. A PAK a Rac egyik célfehérjéje. A glutation agaróz gyantához kötött PAK a sejtkivonatból csupán a Rac GTP kötött aktív formáját tudja megkötni. A precipitált Rac mennyiségét, mely bol következtethettem a Rac a k t i v i t á s á r a a n t i- R a c W e s t e r n b l o t -t a l h a t á r o z t a m m e g .
Immunfluoreszcencia A
V a v 2-t
és
különbözo
mutánsait
GFP
fúziós
fehérje
formájában állítottam elo, ezért lehetoségem nyílt a fehérjék intracelluláris
lokalizációjának
vizsgálatára
fluoreszcens
m i k r o s z k ó p s e g í t s é g é v e l . A f i x á l t é s p e r m e a b i l i z á l t s e j t e kb e n a z a k t i n p o l i m e r e k e t T R I T C- f a l l o i d i n n e l t e t t e m l á t h a t ó v á . A falloidin gombaméreg specifikusan kötodik az aktin rostokhoz.
Eredmények
Az EGF receptor foszforilálja a Vav2 142-e s , 1 5 9 -e s é s 172-es tirozinjait
Az aktivált
irodalomban
EGF
receptor
található tirozinon
közlemények f o s z f o r i l á lj a
alapján a
az
v a v 2-t . A
f o s z f o r i l á c i ó p o n t o s h e l y e a z o n b a n n e m i s m e r t . A V a v 2-t n é g y részre osztottam, és in vitro kísérletben vizsgáltam az egyes f r a g m e nt u m o k f o s z f o r i l á c i ó j á n a k m é r t é k é t . M e g á l l a p í t o t t a m , h o g y a z E G F r e c e p t o r c s u p á n a V a v 2 N t e r mi n á l i s d o m é n j é t fo s z f o r i l á l j a . A V a v 2 N t e r m i n á l i s d o m é n j é b e n h á r o m o l y a n tirozin
található,
receptornak.
melyek
Ezeket
szubsztrátjai
a
tirozinokat
lehetnek sorra
az
EGF
fenilalaninra
cseréltem, s vizsgáltam a mutánsok tirozin foszforilációját. Az in vitro kísérlet alapján az EGF receptor foszforilálhatja a Vav2 N terminális doménjének mindhárom tirozinját, közülük azonban
valószínuleg
a
172-es
és
159-es
tirozin
foszforilációja a jelentosebb. Sejten belül is megvizsgáltam a Vav2 EGF függo foszforilációját. A teljes hosszúságú Vav2 tirozin
mutánsait
meghatároztam
az
Cos7 EGF
sejtekben kezelés
e x p r e s s z á lt a m , hatására
majd
létrejövo
foszforilációjukat. A mutáns fehérjék foszforilációs mintázata jó összhangban volt az in vitro kísérlettel, s alátámasztotta annak eredményét.
A Vav2 foszforilációjának elofeltétele, hogy a fehérje SH2 doménje közvetítésével kapcsolódjon az EGF receptorhoz Az
irodalomb ól
ismert,
hogy
a
Vav2
in
vitro
körülmények között SH2 doménje közvetítésével kapcsolódik az aktiválódott EGF recetorhoz. Sejten belül azonban ez az asszociáció
nem
bizonyított.
A
Vav2
SH2
doménjét
pontmutáció segítségével elrontottam. A mutáns fehérjéket Cos7 sejtekben overexpresszáltam. Megállapítottam, hogy EGF k e z e l é s h a t á s á ra , s z e m b e n a v a d t í p u s ú V a v 2-v e l , a m u t á n s fehérjék
nem
foszforilálódtak
tirozinon,
és
nem
koimmunprecipitálódott velük az aktiválódott EGF receptor s e m.
A
kísérlet
alapján
tehát
a
Vav2
SH2
doménje
közvetítésével kapcsolódik az aktiválódott EGF receptorhoz, s ez az asszociáció az elofeltétele annak, hogy az EGF receptor foszforilálja a fehérjét. Feltevésünket egy másik módon is bizonyítottam. A foszforilációs
helyeket
tartalmazó
N
terminális
domén
foszfo r i l á c i ó j á t n e m t u d t a m k i m u t a t n i E G F k e z e l é s t k ö v e t o e n . A Vav2 N terminális doménjéhez hozzáfuztem az SH2 domént. Az NT - S H 2 f ú z i ó s f e h é r j e s z e m b e n a z N t e r m i n á l i s d o m é n n e l EGF kezelés hatására foszforilálódott, s asszociálódott az EGF r e c e p t o r r a l . A z S H 2 d o m é n e l e n g e d h e t e t le n s z e r e p é t ú g y i s i g a z o l t a m, h o g y m u t á c i ó k a t v i t t e m a z N T- S H 2 d o m é n e k e t tartalmazó
rekombináns
fehérjébe.
Elvárásainknak
megfeleloen a mutánsok nem foszforilálódtak tirozinon, s nem k a p c s o l ó d t a k a z E G F r e c ep t o r h o z s em.
A Vav2 SH2 doménje az EGF receptor 992-e s é s 1 1 4 8 as foszfotirozinjához kapcsolódik A
következo
kísérletben
arra
vállalkoztam,
hogy
meghatározzam, hogy a Vav2 SH2 doménje az aktiválódott E G F r e c e p t o r m e l y i k f r o s z f o t i r o z i n j á h o z k a p cs o l ó d i k . A z E G F r e ce p t o r
ismert
autofoszforilációs
helyei
alapján
foszfopeptideket szintetizáltattam, s vizsgáltam, hogy melyik foszfopeptid tudja leszorítani a Vav2 SH2 doménjérol az aktiválódott EGF receptort. EGF kezelt sejtek kivonatához a különbözo
foszfopeptidek
j e l e n lé t é b e n
glutation
agaróz
gyantához kötött Vav2 SH2 domént adtam, s megállapítottam, h o g y a 9 9 2 -e s é s 1 1 4 8 - a s f o s z f o t i r o z i n n a k m e g f e l e l o p e p t i d e k 50µM -o s k o n c e n t r á c i ó b a n l e s z o r í t o t t á k a z a k t i v á l ó d o t t E G F r e c e p t o r t a V a v 2 S H 2 d o m é n j é r o l . A V a v 2 S H 2 d o m é n j e t eh á t az
aktiválódott
EGF
rece ptor
992-es
és
1148-as
foszfotirozinjához kapcsolódhat.
A Vav2 tirozin mutánsai aktiválják a Rac -ot A Vav2 és az EGF receptor asszociációjának tisztázása után
érdeklodésünk
a
Vav2
kicserélodési
aktivitásának
a
s z a b á l y o z á s a fe l é f o r d u l t . A V a v 2 R a c -o t s e r k e n t o a k t i v i t á s á t sejten belül PAK pull down assay segítségével határoztam meg. A GFP- Vav2 fúziós fehérje GFP részét termelo sejtekben EGF kezeléssel sem tudtam Rac aktivitást kimutatni. Ezzel s z e m b e n a G F P - V a v 2-t t ú l t e r m e l o s e j t e k b e n
EGF
hatására
jelentosen fokozódott a Rac aktivitása. Ismereteink szerint ez
az elso bizonyíték arra, hogy az endogén Rac aktivitását egy extracelluláris stimulus a Vav2 közvetítésével fokozza. Az i r o d a l m i a d a t o k a l a p j á n a V a v 2 k i c s e r é l o d é s i a k t i v it á s á t a tirozin
foszforiláció
különbözo
tirozin
szabályozza.
mutáns
aktivitására.
Meglepetéssel
intenzitással
foszforilálódó
Vav2
Ezért
megvizsgáltam
fehérjék
tapasztaltam, mutánsok
hatását hogy
azonos
a
az
a
Rac eltéro
mértékben
fokozták a Rac aktivitását . Az alig foszforilálódó 172/159-es k e t t o s m u t á n s i s a v a d t í p u s ú Va v 2 -v e l a z o n o s m é r t é k b e n serkentette a Rac aktivitását. következtetésre
jutottunk,
A kísérlet alapján arra a
hogy
a
tirozin
foszforiláció
valószínuleg nincs hatással a Vav2 kicserélodés i aktivitására.
A PH domén szükséges a Vav2 EGF kezelés hatására létrejövo aktiválásához Az szerint
a
irodalomban
találhatóak
olyan
PI
részt
a
3-kináz
vesz
aktivitásának a szabályozásában.
adatok
Vav2
melyek
kicserélodési
A PI 3-kináz szerepét az
enzim specifikus gátlószerével az LY 29002-vel vizsgáltam. A G F P - V a v 2- t t ú l t e r m e l o s e j t e k h e z e g y ó r á v a l a z E G F k e z e l é s elott hozzáadtam a gátlószert.
Az Ly megakadályozta az EGF
kezelés hatására létrejövo Rac aktiválódást. Szerettük volna bizonyítani a PH domén közvetlen szerepét a folyamatban. Ezért
pontmutációt
megszüntette
annak
vittem
a
Vav2
PH
foszfatidilinozitol
doménjébe,
mely
3-foszfát
köto
képességét. A mutáns fehérjéket termelo sejtekben nem tudtam E G F k e z e l é s t k ö v e t o e n R a c a k t i v i t á s f o k o z ó d á s t k i m u t a tn i . A
kísérlet alapján a Vav2 kicserélodési aktivitását a fehérje PH doménjének
és
a
foszfatidilinozitol
3- f o s z f á t o k n a k
az
asszociációja fokozza. Megvizsgáltam
az
Ly
hatását
a
Vav2
tirozin
foszforilációjára. A PI 3-kináz gátlása nem befolyásolta a Vav2 EGF kezelést követo tirozin foszforilációjának mértékét. A
PI
3-kináz
tehát
nem
vesz
részt
a
Vav2
tirozin
foszforilációjának a szabályozásában.
A Vav2 foszforilációs mutánsai, szemben a PH domén mutánssal, a Cos7 sejtekben morfológiai változásokat okoznak U t o l s ó k í s é r l e t s o r o z a t u n k b a n m e g v i z s g á l t u k a V a v 2- n e k és
különbözo
m u t án s a i n a k a h a t á s á t a C o s 7 s e j t e k
citoszkeletonjának
szerkezetére.
A
aktin
G F P- V a v 2-t
overexpresszáló sejtek plazmamembránt övezo aktin hálózata megvastagodott, membrán
és
hullámos
fodrozódást,
a
le futásúvá Rac
v á lt .
aktiválódás
A
sejtek
jellegzetes
morfológiai képét mutatták. A GFP- Vav2 felhalmozódott a membrán fodrozódások helyén. Az alig foszforilálódó kettos tirozin
mutáns
overexpressziója
a
vad
típusú
V a v 2-h ö z
h a s o n l ó a n m e m b r á n f o d r o zó d á s t i d é z e t t e l o a s e j t e k b e n . E z z e l szemben a PH mutáns fehérjéket termelo sejtekben nem tudtam a
Rac
aktiválódás
ezen
jellegzetes
morfológiai
képét
kimutatni. A különbözo mutáns fehérjék aktin citoszkeletonra k i f e j t e t t h a t á s a j ó l ö s s z h a n g b a n v o l t a z e l o zo vizsgált Rac aktiváló képességükkel.
kísérletben
Összefoglalás Kísérleteim alapján körvonalazódik a Vav2 aktiválódás mechanizmusa.
A
Vav2
SH2
doménje
közvetítésével
kapcsolódik az aktiválódott EGF receptor 992-es és 1148-as foszfotirozinjához. Ez a z asszociáció az elofeltétele annak, hogy az EGF receptor tirozinon foszforilálja a feh érjét. A Vav2
N
termi nális
szubsztrátja
az
doménjének
EGF
mindhárom
tirozinja
Közülük
azonban
r e c ep t o r n a k .
v a l ó s z í n u l e g a 1 5 9 -es é s a 1 7 2 - e s t i r o z i n f o s z f o r i l á c i ó j a a je lentosebb. A foszforiláció elképzelésünk szerint nem játszik szerepet
a
Vav2
kicserélodési
aktivitásának
a
szabályozásában. Úgy gondoljuk, hogy elsodleges funkciója más SH2 domént tartalmazó fehérjék megkötésében rejlik. A P I 3- k i n á z t e r m é k e i k a p c s o l ó d n a k a v a v 2 P H d o m é n j é h e z . E z az
asszociáció
foszforilációjára,
azonban viszont
nincs ezen
hatással interakció
a
fehérje
tirozin
következtében
a
Vav2 kicserélodési aktivitása fokozódik, s a Rac aktiválódik. A Rac aktiválódás eredményeképpen a sejtekben membrán fodrozódások alakulnak ki.
EGF EGF Foszfatidil inozitol 3 foszfátok EGF receptor
?
PI3 kináz
P
SH2 P
P
Tyr Tyr
P
Tyr P
DH PH
SH2
Vav2
Rac
Lamellipódiumok, Membrán fodrozódás
Megjelent közlemények
Péter Tamás, Zita Solti, László Buday: M e m b r a n e- t a r g e t i n g i s c r i t i c a l f o r t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f Vav2 by activated EGF receptor Cell Signal. 2001 Jul, 13(7):475-81
Pét e r T a m á s , Z i t a S o l t i , P e t r a B a u e r , A n d r á s I l l é s , S z a b o l c s Sipeki, András Bauer, Anna Faragó, Julian Downward, László Buday: Mechanism of Epidermal Growth Factor Regulation of Vav2, a Guanine Nucleotide Exchange Factor for Rac J. Biol. Chem. Vol. 278, No. 7 F e b r u a r y 1 4 p p . 5 1 6 3 - 5 1 7 1 , 2003
Az értekezéshez nem szorosan kapcsolódó közlemény:
László Buday, Livius Wunderlich, Péter Tamás: The Nck family of adapter proteins: regulators of actin cytoskeleton Cell signal. 2002 Sep, 14(9):723-31. Review