Sejttenyésztés Alapvetés és néhány elméleti kérdés öt – itt egyetlen prezentációban összefoglalt – elıadásban
Dr. Schlammadinger József ny. egyet. docens DE OEC ÁOK Humángenetikai Tanszék
2007
Mentegetızés Az alábbiakban olvasható szöveges magyarázatok sokkal hosszabbak a kelleténél. Ennek praktikus oka az interneten való elérhetıség. Azok a hallgatók is, akik nem tudnak résztvenni az elıadásokon (évekre visszanyúló tapasztalatok szerint vélhetıen ez a többség), legyenek képesek egy lehetıleg egységes és egész, azaz valamelyest is használható képet kialakítani arról, amit ezek az elıadások – a megelızı években – felvállaltak. A reprodukált ábrák általában katalógusokból vétettek, feloldásuk, élességük emiatt kívánnivalókat hagy maga után. A szakszavak (idegen – vagy mára már csak idegen eredető, de elmagyarosodott – kifejezések) igen következetlen írásmódjáért, nemkülönben a gépelési hibákért az alulírottat terheli felelısség. Debrecenben, a 2007. év szeptember hó 3-án
Elöljáróban:
Itt és most mit értünk a sejttenyésztés fogalmán? 1) Bár széltében-hosszában elterjedt különféle prokarióta és egysejtő eukarióta szervezetek, valamint növényi sejtek in vitro tenyésztése (akárha több köbméteres fermentorokban is), nemkülönben alacsonyabbrendő, soksejtő állatfajokból is készítenek sejttenyészeteket (ipari méretekben is), valamint 2) jól definiált in vitro körülmények között emlıs szervrészleteket, szöveteket is fenntartanak, ebben a prezentációban emlıs sejtek – mint individuumokból álló populációk – kontrollált in vitro körülmények közötti fenntartását, szaporítását, különbözı kutatási és ipari jellegő célra alkalmas minıségben és mennyiségben való elıállításának fontosabb, általánosítható alapjait tekintjük át.
Szemléletünk: egy kis történeti visszapillantás (olvasmány) után a legegyszerőbb, legolcsóbb módszerek bemutatása. A bonyolultabb és a (sokszorosan) drágább eljárások is ezeken alapulnak. Kiindulópont és eredeti cél: szervek és szövetek szervezeten kívüli életben tartása. 1878. Claude Bernard. Szövetek in vitro fenntartása elméleti alapjainak megfogalmazása. 1880-as évek eleje. Sydney Ringer különbözı physiologiás sóoldatokat fejlesztett ki (NaCl + KCl + CaCl2 + MgCl2), amelyekben túlélı szíveket tartott fenn (egy-két napig). 1885. Wilhelm Roux. Csirke medullaris lemez physiologiás oldatban. Az ı nevét viseli a Roux-flaska (tenyésztıedény). 1903. Salamandra leukocyták életben tartása függıcseppben. (>1 hónap, szaporodtak is.)
Használt (táp)közegek: különféle sóoldatok, ascites folyadék, embrió-kivonat, vérplazma (alvadt kakasplazma) stb. 1907-1910. Ross Granville Harrison. A szövettenyésztés technikai alapjainak megteremtése. 1911- Alexis Carrel* (és munkatársai). Sebészeti technikák bevezetése (asepsis, antisepsis), megfelelı tápközegek keresése, alkalmas edényzet kifejlesztése. (Pl. Carrel-flaska.) „Bármilyen szövet, akármennyi ideig fenntartható in vitro, megfelelı subcultivatiós technikával.” (Csirkeembrió szívébıl készült explantatumból indított tenyészetet 32 évig sikerült folyamatosan in vitro fenntartani, mikoris lezárták a kísérletet. Ezt az eredményt sokan vitatják.**) 1940- Szintetikus tápközegek (medium) kifejlesztésének korszaka. 1952. Moscona. Szövetek trypsin emésztése ► tényleges sejttenyésztés. * L. következı oldal. ** L. a sejttenyészetek fenntarthatóságának teóriáját.
(Alexis Carrel. Francia sebész, aki élete nagyobb részét az Amerikai Egyesült Államokban töltötte. 1887-ben született a Lyon melletti Sainte Foyban, Párisban halt meg 1944-ben. Orvosi/fiziológiai Nobel-díj 1912ben: érvarratok technikájának kifejlesztéséért, ami a sikeres szervátültetések elıfeltétele volt. Az ismeretlen ember c. könyve természettudományos és filozófikus alkotás, a maga idejében világsiker volt, sok nyelvre lefordították, magyarul is megjelent a II. világháború elıtt. Ebben az emberiség nagy problémái megoldásának keresıje, egy intellektuális morál (vagy morális intellektus?) nyilvánul meg. Másik oldala: a II. világháború alatt Franciaországban a vichyi kormánynak dolgozott és a negatív eugenikát propagálta.)
Egy kis nevezéktan A sejttenyésztés modern kifejezés. Régen szövettenyésztésrıl beszéltek, ennek megvalósítása volt a cél (l. elıbb). A technika változásával, fejlıdésével ennek helyét fokozatosan és folyamatosan vette át a sejttenyésztés, ám ma újra nı az igény szövetek in vitro fenntartására is.
A sejttenyésztés egyik korai alapmővelete: a szöveti sejtek dezintegrálása (1) Mechanikus feldarabolás. (2) Trypsin (vagy egyéb protease, pl. collagenase) kezelés (37°C-on). (3) A sejtek mosása (centrifugálással). (4) Számolás haemocytometerben. (5) Tenyésztı edénybe helyezés, feltöltés tápfolyadékkal, 37°C CO2 termosztátban a sejtek szaporítása, azaz in vitro primer kultúra létrehozása.
Ugyanerre az emésztéses szétválasztásra vérbıl, ill. csontvelıbıl, nyirokcsomókból, thymusból származó sejtek esetén nincs szükség. Ebbıl máris következtethetünk bizonyos alapvetı különbségekre a sejtféleségek között. Primer kultúrát indíthatunk kis szövetdarabból, mint explantatumból is: A kivágott szövetdarabkát (biopsiás anyagot) a tenyésztıedény aljára helyezzük, tápfolyadékkal ellátjuk. A letapadt szövetrészbıl sejtek nınek ki az üvegfelületre.
Ezek a sejtek – az esetek túlnyomó többségében – fibroblastok (amelyek igen nagy in vitro proliferációs kapacitással rendelkeznek, szemben egyéb, magasabban differenciált szöveti sejtekkel). Egy érdemben igen kevés kötıszöveti állományt tartalmazó szövetbıl is rendkívül nehéz, különleges technikát igénylı feladat a jellemzı szöveti sejtek tiszta tenyészetének elıállítása (pl. keratinocyták bırbıl). A tömör (solid) szövetekbıl származó sejtek általában adherencia-dependensek, azaz a tenyésztıedény aljára (esetleg más hordozóhoz) letapadva képesek növekedni (kivétel néhány rosszindulatú daganatból származó sejt), míg a vérképzı- és immunrendszeri eredető sejtféleségek szuszpenzióban. Egy kis nevezéktan Sejttenyészetek esetén a növekedés kifejezés a tenyészet egészére, nem pedig az egyes sejtekre vonatkozik, azaz érdemben a sejtproliferációt, a sejtek szaporodását jelenti.
A sejttenyésztés fizikai környezete: a sejttenyésztı laboratórium Alapfelszerelés Germicid lámpa Lamináris box pl. ► Gázégı Központi vákuum vagy helyi vákuumpumpa, felfogó edénnyel Inverz (fordított) mikroszkóp Vízfürdı 37°C CO2 termosztát Centrifuga Hőtıszekrény
Vertikális légáramlású, belsı keringtetéső steril munkahely, szőrt levegı kibocsátással
Bár a sejttenyésztés különbözı munkafázisai egy jól tisztán tartott és kevés jövés-menéssel megzavart laboratóriumban is elvégezhetık, célszerő, hogy a sejttenyésztı laboratórium teljesen izolált helyiség legyen, amihez olyan kiszolgáló tér kapcsolódik, ami önmagában is megfelelıen tiszta, más laboratóriumi célokra nem használatos. A sejttenyésztı laboratóriummal szemben támasztott elsı és legfıbb követelmény a steril munkafeltételek biztosítása. Az in vitro sejttenyészeteknek nincs immunvédelme, rendkívül érzékenyek a különféle (prion-, vírus-, mycoplasma-, baktérium-, gomba-) fertızésekre. Ezek gyakorlatilag a környezet minden elemébıl származhatnak, ide értve az ott dolgozókat is. Ugyanakkor ez utóbbiakat is meg kell védeni a tenyészetekbıl esetleg rájuk átterjedhetı infectioktól! A sterilitás elsı számú feltétele a lamináris box.
Nem szabad azt hinni, hogy a lamináris box sterilizál is! Vertikális áramlású lamináris box munkaasztala Az elıtérben látható, a levegı elszívására szolgáló rácsra szigorúan tilos bármit is rátenni!
A lamináris boxban steril (pontosabban: részecske-mentes) levegı áramlik vízszintesen vagy függılegesen. Mind a horizontális, mind a vertikális elrendezésnek megvannak a maga elınyei és hátrányai, amelyekhez az ott dolgozónak alkalmazkodnia kell. (A csíramentes levegı védi az éppen nyitott edényekben a tenyészeteket vagy a tápfolyadékot.) A munkaasztalt használat után (alkalmasint esetleg elıtte is) át kell törölni, pl. 70%-os etil- vagy izopropilalkohollal. (Ez nem igazán sterilizál, ahhoz fertıtlenítı oldat szükséges [ill. használaton kívül folyamatos UV-besugárzás germicid lámpával], de általában kellı tisztaságot biztosít.) Egyszer használatos mőanyag eszközök alkalmazása mellett is általában szükség van gázégıre, egy-egy flaska vagy csı szájának, ill. pipetta végének a lángon való gyors áthúzására. Üveg eszközöknél ezt akkor is elengedhetetlennek kell tartanunk, ha a steril tartójukból éppen akkor vettük ki azokat, vagy egy flaska kupakját most csavartuk le.
A tenyészetbe helyezendı fedılemezeket lehet pl. úgy is sterilizálni, hogy alkoholba mártjuk (NB! l. még lent!), majd ezt gázlángon leégetjük róla. Ez néhány más eszköz esetén is célravezetı lehet. A gázégınek ırlánggal ellátott szerkezetőnek kell lennie: nem engedhetı meg a folyamatosan nagy lángon égés munkavédelmi szempontból (sérülés veszélye, a kis kubatúrájú és nem vagy csak nagyon rosszul szellızı laboratóriumban az oxigén elhasználódása és az égéstermékek felhalmozódása), ill. magának a lamináris boxnak a nem kívánatos hıterhelése okán sem. Az ırlángról csak akkor és csak annyi idıre kapcsoljunk át a Bunsen-égı fılángjára, amikor és amennyi idıre azt az ott végzett munka éppen megkívánja. Tekintettel arra, hogy a sejttenyésztı laboratórium – a fentiek értelmében is – veszélyes üzem, a kiszolgáló laboratórium felé üvegablakkal ellátott kell legyen: a kültérben tevékenykedı munkatárs észrevehesse, ha bent valami baj történik az ott dolgozóval. A sejttenyésztı laboratóriumban semmiféle gyulladásveszélyes anyag, párolgó (és/vagy robbanásveszélyes) folyadék nem tartható!
A germicid lámpa, mint a neve is mutatja, csíraölı hatású. Zárttéri levegı sterilizálására, csírátlanított eszközök és anyagok steril állapotban tartására, a baktériumok és penészgombák szaporodásának megakadályozására alkalmas. Így használják – egyebek között – steril fülkék levegıjének csírátlanítására, lamináris boxokban, valamint sterilizált eszközök és anyagok védelmére. Az alacsony nyomású germicid lámpa tulajdonképpen egy fénycsı, amelyben nincs fénypor. Kvarcüvegbıl készül, azaz az UV sugárzást (253,7 nm-es Hg-vonal) átengedi. Ennek DNS-roncsoló hatása van, így pusztítja el a baktériumokat, gombaspórákat. Az UV-sugárzástól a bırt, szemet védeni kell, ezért ez a lámpa csak akkor kapcsolható be, ha senki sem tartózkodik a laboratóriumban! Ne feledjük: az UV sugárzás ugyanúgy visszaverıdik tükrözı felületekrıl, mint a látható fény! Tudnunk kell azt is, hogy bizonyos festékek, mőanyagok stb. az UV-fény fotokémiai hatása következtében degradálódnak.
A sterilizáláshoz szükséges további eszközök,
amelyek a csatlakozó laboratóriumban helyezhetık el: Hılégsterilizáló. Amint a neve is mutatja, forró (160-180°C) levegıvel sterilizál. Biztonsággal elöli a vírusokat is, két órás kezelési idıtartam alatt. Csak üvegekhez (meg szilikongumihoz) és – bizonyos – fémeszközökhöz alkalmas. Autokláv. Forró gızzel csíramentesít. A nedves eljárás esetén 132°C is elegendı a tökéletes sterilizáláshoz, de bizonyos esetekben (pl. mőanyagok) ebbıl kényszerő engedményt kell tenni (pl. 115°C-on 30 percig végezni a mőveletet). Rendkívül fontos, hogy az autoklávban a sterilizálási folyamat alatt a munkakamra valóban csak gızt tartalmazzon, levegıt ne, és hogy a becsomagolt edények, eszközök belsejében se maradjon levegı. Folyadékok (vizes oldatok) sterilizálása esetén elengedhetetlen, hogy a munkakamra csak nagyon lassan hüljön le!
Autokláv (A munkakamrába itt éppen folyadékot helyeznek be, a megfelelı flaskákban.) Figyeljük meg az ajtó biztonságos bezárására szolgáló csavarokat! Ezeket apródonként kell meghúzni! Folyadék autoklávozása esetén az edények zárókupakja lazán, de teljesen becsavarható. Üres edényeknél a kupak inkább külön sterilizálandó (anyagi minısége függvényében). Ilyenkor a szájadékot záró alufólia legyen lazán felhelyezve és az edénybe cseppentsünk néhány csepp kétszer desztillált vizet. (Kivételnél az elsı lépés az alufólia tökéletes zárásúra való megszorítása.)
Magában a sejttenyésztı laboratóriumban szükséges:
Fordított (inverz) mikroszkóp és centrifuga A kondenzor és a tárgyasztal között elég nagy a távolság ahhoz, hogy egy tenyésztı flaska is kényelmesen elférjen
A sejttenyésztı laboratóriumban szükséges centrifuga kis teljesítményő, általában 100 fordulat/ perc elegendı, de 200 g-nél nagyobb érték azért sem kell, mert az már károsítaná a sejteket
A fordított mikroszkópnak feltétlenül fáziskontraszt (vagy DIC = differenciál interferencia kontraszt, de az nagyon drága) berendezésnek kell lennie, mert csak így ítélhetı meg jól a – festetlen! – élı sejtek állapota. A sejtek haemocytometerben való számolásához a kondenzor leengedhetı, tenyésztıedényben való vizsgálatukhoz a kondenzor felemelhetı. Az objektívek (maximálisan 40× nagyítással) nagyobb tárgytávolságot engednek meg, azaz a vastagabb aljú tenyésztıedényekben (és számoló kamrákban) is élesre állítható a kép, jól láthatók a sejtek. A fáziskontraszt beállítása ugyanúgy történik, mint a hagyományos mikroszkópon.
CO2 termosztát Követelmények: Hımérséklet tartása 37°C-on. Páratartalom lehetıleg 100%on (praktikus követelmény kb. 98% relatív nedvesség). Ehhez buborékoltató párologtató edény van beépítve (itt a belsı üvegajtón), de célszerő alulra plusz egy-két vizes tálcát is betenni. Vízbe: CuSO4. CO2 (~5%) a belsı atmoszférában szabályozható. (Drágább készülékben az [O2] is.) A CO2 palack a steril területen kívül legyen elhelyezve! Külsı (fém) ajtó főthetı. Polcok: vízszintbe állítva. A beltér rendszeresen tisztítandó és sterilizálandó!
Az elhasznált tápfolyadék leszívása zárt, utólag tökéletesen dezinficiálható rendszerben kell történjen, akár vákuumpumpa mőködteti azt (mint itt: c, d = lábkapcsoló), akár központi vákuumra van kötve. A rendszeres tisztítás alapvetı jelentıségő (pl. a leszívó csı minden munA győjtı (a) kafolyamat utáni átöblítése dezinficiens oldattal). szívópalackba elızetesen valamilyen alkalmas dezinficiens teendı. (Az elszívó rendszerbe a második (b) szívópalack nem engedi át az esetleg felcsapó folyadékot.) Az elhelyezés ne legyen balesetveszélyes!
Feltétlenül szükséges még a sejttenyésztı laboratóriumban egy 37°C hımérséklető vízfürdı. Ebben kell elımelegíteni a felhasználandó tápfolyadékokat, a sejttekkel érintkezésbe kerülı fiziológiás oldatokat stb. Ez a berendezés különösen gondos tisztítást, dezinficiálást igényel! Jó, ha a leírtak mellett a sejttenyésztı laboratóriumban érhetı még el: háztartási hőtıszekrény, amiben a közvetlen felhasználásra váró tápfolyadékok, pufferek, EDTA oldat stb. tárolhatók, a mélyhőtıjében enzim-oldatok és hasonlók. A csatlakozó (elıkészítı) laboratóriumban kell még -20°C fagyasztó láda (vagy szekrény). Célszerő ugyanitt a folyékony N2-es tároló edény (a hozzá tartozó szállító tartállyal) vagy pedig egy ultramélyhőtı fagyasztóláda -135°C tárolási hımérséklettel és az ehhez szükséges folyékony CO2, ill. folyékony N2-es – áramkimaradás esetén – biztonsági tartalékot jelentı, a mélyhőtıbe fagyasztó folyadékot adagoló készülékhez kapcsolódó tároló edény. Ne feledkezzünk el olyan „apróságok”ról, mint pl. marker tollak!
Folyékony nitrogénnel üzemelı tárolóedény és a benne megfelelı felfüggesztésben elhelyezhetı ampullatartó. A rendszer rendkívül biztonságos, feltéve, hogy a folyékony nitrogént (ami – sajnos – elég gyorsan párolog és drága), mindig pótolják. Ugyanakkor ne feledjük: a tartály nagyon sérülékeny! (Ugyanez vonatkozik az utánpótlást szállító kannára is.) Az edény száját hıszigetelı dugó zárja. Fontos! A folyékony nitrogénes tárolóban precíz, naprakész leltár szerint kell elhelyezni a benne ırzött tenyészeteket, amelyek jól láthatóan jelöltek legyenek! -196°C! Munkavédelmi rendszabályok betartása!
(Fogyó)eszközök és anyagok a sejttenyésztésben
Ezeknek se szeri, se száma, felsorolhatatlanok. A fontosabbak között vannak egyszer és többször használatos eszközök.
Az utóbbiak általában üvegbıl vannak (de pl. a folyadéktároló flaskák kupakja mőanyagból). Az üveg elınye – az átlátszósága mellett – a jó tisztíthatóság, kényelmes sterilizálhatóság. A képen bemutatott (Roux-típusú) tenyésztıedényen látható, hogy nagy letapadási felületet biztosít a benne tenyésztett sejteknek, relatíve kis térfogat mellett. Régen (a XX. század elsı felében, amikor CO2 termosztátok még nem léteztek) gumidugóval zárták a tenyésztı flaskákat. Ha jól állították be a pH-t, egy ilyen edényben hosszú ideig fenn lehetett tartani egy tenyészetet. Amennyiben közben valamilyen mőveletet kellett elvégezni, amilyen pl. a mintavétel vagy valamely anyag hozzáadása a sejtekhez, a gumidugóba illesztett, úgyszintén zárható csövön át ez megtehetı volt. Késıbb, a CO2 termosztátok elterjedésével megjelentek a (papír)vatta dugók.
A valaha érdemben csakis üvegbıl készült tenyésztı edények helyét mára gyakorlatilag átvették az egyszer használatos mőanyagok. Ezek gyakorta olcsóbbak, mint ha üvegeket mosogatunk. (a) Tenyésztı flaskák, (b) Petri csészék (angolban inkább culture dish), (c) 24 (hátul), ill. 96 lyukú lemez. A flaskák esetén nagyon fontos, hogy a légcsere megtörténhessen a külsı és belsı tér között, a sterilitás veszélyeztetése nélkül. Ehhez a kupak teljes rácsavarása után azt egy fél fordulattal meg kell lazítani. Ma már vannak steril szellızést zárt állapotban is biztosító kupakok (l. a következı oldalon). Az egyéb edényeknél a fedı eleve nem légmentesen zár.
Tenyésztés nagyobb felületen (letapadva növekedı sejtek számára megnövelt felület, gazdaságos tápfolyadék kihasználással) ▲ „Háromemeletes” tenyésztıedény, szellızı kupakkal Kerek, forgatható („roller”) tenyésztıedények és az azokat befogadó, a CO2 termosztátba beszerelhetı, forgató állvány ►
Tenyésztés nagyobb térfogatban szuszpenzióban növekvı sejtek Itt kétféle keverı megoldást láthatunk: mágneses (fent), ill. forgólapátos (lent). Ezen a módon több liternyi tenyészet is elıállítható. Megoldották a több tíz-, száz- vagy akár ezer liternyi tenyészet elıállítását különféle fermentorokban. Ezek is lehetnek keverılapátosak (-propelleresek), de van pl. olyan, amiben alulról steril (elınedvesített) levegı átbuborékoltatásával egyidejőleg oldják meg a keverést, a kívánatos O2-ellátás biztosítását, és a megfelelı CO2 koncentráció (ezáltal a pH értékének) beállítását (részletesebben l. a továbbiakban). (Letapadva növı sejtek apró, a mediumban könnyen lebegtethetı üveg vagy mőanyag gyöngyökre olthatók és így tenyészthetık.)
Egyebek Érdemben felsorolhatatlan, menynyi és milyen egyszer- vagy többször használatos eszköz (pl. csipesz, olló, gumirendır [= rubber policeman]), edény stb. szükséges egy sejttenyésztı laboratóriumban. Néhány példa: folyadéktároló (jól zárható) flaskák, centrifugacsövek (természetesen kupakkal), mérıhengerek, fecskendık, steril szőrık, pipetták, Pasteurkapillárisok, pipettatartó dobozok, mikropipetták, mőanyag pipettahegyek, és így tovább. Természetesen mind sterilen!
Akkumulátoros pipettázó
A felsı és alsó gombbal irányítható a felszívás, ill. kiengedés. A toldatban, amibe a pipetta illeszkedik, steril szőrı van. Ez megelızi a pipetta tartalmának esetleges kontaminációját. Ettıl függetlenül azonban: célszerő vattadugós pipettákat használni. Van az eszköznek digitális változata is, amelyen a mérendı térfogat elıre beállítható. Ehhez – értelemszerően – nem szükségesek beosztással ellátott pipetták. Ez sem csodaszer. Nagyon kényelmetlenné tud válni olyan lamináris box használatakor, ahol alacsony a benyúló nyílás.
Az egyszerhasználatos (általában mőanyag, de van üveg is) eszközök steril csomagolásban érkeznek a laborba. Ennek sértetlenségét mindig ellenırizni kell! Felbontáskor fontos, hogy ami aktuálisan nem szükséges, annak sterilitása hosszú távon megmaradjon. A felhasznált, bármilyen tenyészettel érintkezésbe került eszközök fertızötteknek tekintendık és ennek megfelelıen kezelendık, azaz a veszélyes hulladékokra elıírt megsemmisítési eljárásra (=égetés) kell zárt csomagolásban eljuttatni azokat. Kartondobozok ne kerüljenek a sejttenyésztı laboratóriumba! Nem egyszerhasználatos, azaz ismételten alkalmazni kívánt, tenyészettel érintkezésbe került eszközök esetén dezinficiáló szerben kell ezeket összegyőjteni, majd speciális mosogatási eljárással tenni újra felhasználhatóvá.
Nagyon fontos, hogy mindig legyünk tisztában a felhasznált anyagok fizikai és kémiai paramétereivel. Így hıállóság (sterilizálhatóság), lángállóság stb. Ollók, szikék élét az ismételt hıkezelések kilágyíthatják, ha ezeknek túl hosszan és túl magas hımérsékleten vannak kitéve. Az üveg pipetták (Pasteur-kapillárisok) sterilizálásához, eltartásához alkalmazott zárható fém hengerek mindkét végében üvegszövet (vagy hasonló), ill. szilikon gumi betét szükséges a törések megelızésére. Ennek a bélésnek ugyanúgy kell hıállónak lennie, mint a doboznak és az üveg pipettáknak. Kémiai jellemzı pl. az üvegek esetén azok oldhatósága. Nátronüvegben sem tenyészteni, sem folyadékokat mérni és tárolni nem szabad, erre boroszilikát üveg választandó, amibıl semmilyen ion sem oldódik ki.
A tenyésztıedény aljára letapadva növekvı sejtek Ca2+-hídon keresztül kapcsolódnak az aljzathoz. Ennek kialakítási lehetısége üveg esetén automatikusan adott, a mőanyag petri csészék közül csak az alkalmas, amelyik belsı felületét megfelelı (hidrofil, negatív töltést hordozó) bevonattal látták el. (Azaz az ún. közönséges mikrobiológiai Petri csészékben – lényegesen olcsóbb! – nagyon rossz eredmények érhetık el még a legkevésbé igényes letapadás-függı sejtek esetén is. Ugyanakkor ilyen csészékben a szuszpenzióban fenntartott tenyészetek jól proliferálnak és megbízható eredményekkel szolgálnak.) Mindebbıl következik, hogy az egyszerhasználatos tenyésztıedények valóban csak egyszer alkalmazhatók a letapadva növı sejtekhez, mert a mégoly gondos és kímélı mosogatás is eltávolítja az említett bevonatot. Azaz: itt és így takarékoskodni nem szabad.
Az aszepszis
fogalmát A. Carrel munkássága kapcsán említettük, a sterilitás megteremtésének és megtartásának néhány eszközérıl (és módszerérıl) már volt szó. Itt további kiegészítéseket teszünk. A többször használatos eszközök sterilizálására (1) fizikai és (2) kémiai módszerek állnak rendelkezésre. (1) A száraz és nedves hırıl (hılégsterilizáló, ill. autokláv) részletesen szóltunk. Ide tartozik még az UV és gamma (esetleg röntgen) sugár, azaz a sugársterilezés. Az UV fény csak ott hat, ahová közvetlenül el tud jutni, ami „árnyékban” marad, ott nincs hatás. Nyitott edények (és külön a fedelük) állíthatók pl. egy germicid- vagy egy kvarclámpa alá (egyébként steril környezetben). Kis kapacitású és nehézkes eljárás. Jobb a gamma-sterilezés, ami nagy áthatolóképességő (nincs elıtte „árnyékos” hely). Hozzáférhetısége erısen korlátozott, de ahol a közelben ilyen ipari berendezés, vagy pl. éjszaka nem használt kobaltágyu mőködik, ott elérhetı.
Az egyszerhasználatos pipettákat általában egyedileg (is) csomagolják. Modern sejttenyésztı laboratóriumokban ezekkel nem szokás szájjal pipettázni, hanem egy erre a célra szolgáló szívónyomó, steril levegıvel operáló kis kézi készülékkel. (Bemutattuk a megelızıekben.) Ennek ellenére megfigyelhetjük: a pipetták végében vattadugó van az esetleges kontaminációk vagy a túlszívás megelızésére. Üveg pipetták alkalmazásakor efféle vattadugót magunknak kell behelyeznünk a szájvégbe (ami ennek megfelelı kialakítású), és ez után végezni el a hılégsterilizálást. A gyapotvatta kibírja a két órás 160°C-os hıkezelést. De ha valami okból újra akarnánk forró levegıben kezelni az ilyen pipettákat, akkor ki kell cserélni a vattadugaszokat, mert azok a második alkalommal már megpörkölıdnének. (Autoklávra ez a megszorítás nem vonatkozik.) Értelemszerő: egyéb (papír)vatta dugóknál is érvényes ez a szabály (pl. Erlenmeyer flaskában rázott tenyészetek).
Szervetlen oldatok esetén (pl. pufferek) kiválóan megfelel az autoklávozás. Vannak újabb tenyésztıfolyadék formulák is, amelyek kibírják a hıkezelést (alkalmasint esetleg azon az áron, hogy egyes hılabilis komponenseket utólag, sterilen kell hozzájuk adagolni). Legelterjedtebb megoldás folyadékok esetén azok sterilre szőrése. Régen erre a célra szinterelt üvegszőrıket használtak, mára általánossá vált a membránszőrık alkalmazása. Rendkívül fontos: a gyártók hajlamosak a 0,45 m pórusnagysá-gú szőrımembránokat úgy reklámozni, hogy azok sterilre szőr-nek. Ez nem igaz! Csak a ≤ 0,2 m pórusnagyság megbízható! És – értelemszerően – az sem szőri ki a mycoplasmát meg a vírusokat.
A membránszőrı berendezéseknek számos (vagy inkább számtalan) típusa van. Vásárolhatók szétszedhetı-összerakható kivitelben. Ezek autoklávozással sterilizálhatók. Nyomószőrık érdemben csak ebben a típusban léteznek. Az egyszerhasználatosak vákuum segítségével szívják át a folyadékot a steril térbe. Ha egy ilyenen olyan tápfolyadékot akarunk szőrni, amiben már benne van a szérum, ez ebben az esetben igencsak csökkent szőrıkapacitást mutat. Mivel a szérumot amúgy is csíramentesen* árulják, célszerő az alapoldatot szőrni és ehhez sterilen adagolni a savót. Ha mégis mindenképpen szérummal komplettált médiumot kell szőrjünk, a nyomószőrı a helyes megoldás. Nyomógáz: N2. Vákuum alkalmazása esetén nem szabad elfeledkezni arról, hogy a CO2 távozása miatt a tápfolyadék pH-ja megemelkedhet. * Figyeljünk arra is, hogy az állati savót szállító cég a prion-, vírus- és mycoplasma-mentességet is garantálni tudja.
Membránszőrı alkalmatosságok oldatok (pufferek, tápfolyadékok stb.) sterilre szőréséhez
Balra: kis térfogatú szőréshez fecskendıre tehetı feltét. Középen: saját felfogó edénnyel rendelkezı vákuumszőrık. A felsı részbe töltött folyadék a toldathoz csatlakoztatott szívás nyomán sterilen győlik össze a felfogó edénybe. Nagyon fontos! Vízlégszivattyú (az esetleges vízvisszaáramlás miatt) semmiképpen sem használható! Jobbra: ugyanaz, de csavaros tetejő tároló flaskában történik a steril oldat felfogása.
(2) Kémiai sterilizálási módszerek Kevés olyan csíramentesítı ágens van, amelyik ne támadná meg a bırt. Így csak az enyhébb hatásúak alkalmasak a kéz dezinficiálására (amilyenek pl. a sebészek mőtét elıtti bemosakodására szolgáló szerek). Célszerő a gumikesztyő viselése, és ha az nem steril, szükség esetén erısebb hatású dezinficienssel is áttörölhetı. Ilyen, az egészségügyben alkalmazott oldatok jók ollók, szikék stb. kezelésére, pipetták, tenyésztıedények stb. használat utáni, mosogatás elıtti fertıtlenítésére. Mindig célszerő az aktuális lehetıségekrıl, kínálatról tájékozódni. Általánosan elterjedt nézet, hogy a 70%-os etilalkohol sterilizál. Ez nem igaz, még baktérium-spórák is lehetnek benne. De lemosásra (pl. lamináris box munkafelülete) alkalmazható (akár sterilizálás után). Ha már, akkor az izopropilalkohol jobb. Az utóbb említett célra alkalmasak különféle jód-tartalmú oldatok is, bár leginkább csak fém felületeken, s alkalmasint 70%-os etanollal utána letörölve.
Nagyon jó a formaldehid (gáz) vagy vizes oldata, a formalin. Hermetikusan zárt térben alkalmazandó! Viszont nehéz a maradványaitól (sterilen!) megszabadulni. Így leginkább erısen fertızött tenyészetek (pl. fonalas gomba, élesztı) és az ezekkel érintkezett edényzet kezelésére alkalmas. A HCHO az adott légtérben minden külön le nem zárt helyet elér. Úgyszintén jó (és hasonló kautélákkal használható) a nátrium(vagy egyéb) -hipoklorit (Hypo) oldat, megfelelı hígításban. (Ilyet szolgáltat pl. a Neomagnol tabletta is.) Ugyanígy elér minden térrészt az etilénoxid az eszközökben, amelyekhez alkalmazzák (és ami 60°C-on hatásos, mely hımérsékleten a legkényesebb mőanyagok sem károsodnak). Ez a gáz azonban erısen rákkeltı és rendkívül nehéz az etilénoxidos sterilizáló berendezés környezetében dolgozókat ettıl a hatástól megvédeni. (A sterilizálási ciklus befejeztével a gázt ki szokták engedni a környezetbe, ami a felelıtlenség csúcsa.) Alkalmazásának az is ellene szól, hogy az így sterilizált felületekhez adszorbeálódott anyagot elég nehéz „kiszellıztetni”.
Mosogatás Az ismételten használható eszközöket (üveg tenyésztıedények, pipetták, Pasteur-kapillárisok stb.) sterilizálás elıtt gondosan el kell mosogatni. Ez azzal kezdıdik, hogy semmiféle szennyezıdést nem hagyunk rájuk száradni, hanem a munkafolyamat után azonnal dezinficiáló folyadékba merítjük ezeket. Innentıl szétválik a különbözı típusú eszközök útja. A jól hozzáférhetı bennékő edények (pl. Petri csészék) ennek utána – ha szükséges, mechanikus tisztogatást követıen – valamilyen detergens megfelelı töménységő oldatába kerülnek (l. aktuális használati utasítás), amelyben puha (= nem karcoló) mosogató kefével, vagy alkalmas gumikesztyőbe bujtatott kézzel a felületeket jól átdörzsöljük. Vannak kifejezetten a sejttenyésztı laboratóriumi mosogatáshoz ajánlott (neutrális) detergensek, de elmondható, hogy sok háztartási mosogatószer is megfelelı. A lényeg a felületek alapos fizikai kezelése az oldatban, és az igen gondos, alapos öblögetés. Ha csak nyomai is maradnak ott a szernek az a sejteket elpusztíthatja.
Az öblítés elıször folyó, ill. többször váltott csapvízben történik. Oda kell figyelni arra, hogy ne maradjanak légbuborékok az edényekben, mert ott a víz nem érintkezhet a tisztítandó felülettel. Célszerő, hogy az öblítésben legyen egy éjszakán át tartó áztatási periódus is. (Ugyanez vonatkozik a következı lépésekre is.) A csapvizes öblítést ioncserélt vízzel történı követi, legalább három váltásban, hosszabb áztatási idıkkel, majd – a sejttenyésztésben általánosan megkövetelt tisztaságú – desztillált vízzel, úgyszintén háromszor. A receptúrák általában háromszor desztillált vizet emlegetnek, de gyakorlatilag a kétszer desztillált is megfelel, ha a kiinduló csapvízben nincs sok oldott volatilis anyag, ill. ha elızıleg már ionmentesített vízbıl indulunk ki a desztillálásnál. Ilyenkor arra kell különösen ügyelni, hogy az edények mozgatása közben ne érjünk a csupasz bırünkkel olyan felülethez, amely a sejtekkel, vagy akárha csak a tenyésztı folyadékkal érintkezhet a késıbbiekben. Ugyanez vonatkozik a szárításra való kipakolásra is, ide értve, hogy az tökéletesen tiszta és pormentes helyen történjen.
A pipetták és hasonlók (pl. Pasteur-kapilláris) belsejének megtisztítása komoly kihívást jelent. Bár erre a célra is árulnak speciális detergenseket, mind a mai napig legjobban bevált szer a krómkénsav. Egyúttal ez a legveszélyesebb is – sajnos. Lehetıleg ne a sejttenyésztı laboratórium elıterében, hanem egy külön, jól szellızı helyiségben használjuk, a megfelelı munkavédelmi elıírások maradéktalan betartásával (védıszemüveg vagy maszk, gumikesztyő). A savazóhenger nyílása feltétlenül legyen zárható. A pipettákból elıször el kell távolítani a vattadugókat, majd egyszerő átöblítés után kiszárítani ıket. Semmi sem érintkezhet nedves állapotban a krómkénsavval, mert ez rendkívül veszélyes, gız fejlıdése súlyos balesetet okozhat! A megszáradt pipettákat hegyükkel felfelé kell behelyezni a savazó kosárba, és azt – átmérıjének megfelelıen – lehetıleg teljesen kitölteni. A kosarat nagyon lassan engedjük bele a savazóhengerbe, amelyben pontosan a kívánt mennyiségő krómkénsav van. (Ha több, kifolyhat! Ha kevesebb, nem lepi el a legkényesebb részeket.)
A savazó kosarat az elhelyezés után még nagyon finom mozdulatokkal fel-le meg kell egy kicsit rázni (balesetveszély!), hogy a legkényesebb helyrıl, a pipetták hegyébıl minden levegı eltávozzon. A savkezelés folyamata (kb. 3 nap, több is lehet) alatt ez a mozgatás néhányszor még megismétlendı.
Balra: savazó henger. Középen: pipettaöblítı. Jobbra: savazó kosár.
A krómkénsavat jobb, ha ki-ki saját magának tudja elkészíteni, de erre ma már általában nincsenek berendezkedve a laboratóriumok. A gyári kiszerelés gyengébb minıségő: hamar kimerül. E kimerülés jele a barna színbıl zölddé válás. Az ilyen savat már nem szabad, de legalábbis nem érdemes használni. (NB! Ugyanolyan balesetveszélyes, mint a friss!) Az elhasznált krómkénsav rendkívül veszélyes hulladék! Eliminálásához a megfelelı szabályok betartandók! A savazás végén a kosár felemelése (de a hengerbıl ki nem vétele) útján ki kell csepegtetni a savat a pipettákból, majd megfelelı védelem mellett az üres pipattaöblítıbe kell áthelyezni a savazó kosarat. Lefedés után az öblítési folyamat elindítható. A továbbiakban a már ismertetettek szerint kell eljárni.
Mosogatás után a sterilizálás
a már említett berendezésekkel történhet. Ehhez a kezelendı eszközöket, anyagokat a megfelelı módon be kell csomagolni, hogy majdan sterilek is maradjanak. Hılégsterilizálás Pipetták (vattadugóval), Pasteur-kapillárisok: fém dobozba zártan. Szükség szerint individuálisan, alufóliában is kiégethetık. Petri csészék: alkalmas számban egy-egy alufóliába csomagolni. Tenyésztı flaskák, tárolásra szolgáló üvegek: a nyakra is ráterjedıen dupla alufóliával zárni a száját. (Itt: szorosan.) Ollók, csipeszek stb.: alufóliába csomagolva. Autokláv Mőanyag kupakok: úgy tekerni alufóliába, hogy az a sterilizálandó oldalon csıszerően nyitva maradjon. Bele két-három csepp kétszer desztillált víz. Autoklávozás után az alufóliát azonnal, még a tetthelyen rászorítani.
Apróbb gumi, mőanyag (pl. mikropipetta hegy) stb.: üvegedényben (Petri csésze, fızıpohár), amibe néhány csepp kétszer desztillált vizet tettünk és az alufóliát némiképpen felbillentve, a gız útját biztosítva helyeztük rá. (Majd az autoklávozás végén, a lehülés után, a munkakamrát kinyitva azonnal rászorítjuk a fóliát a szájadékra.) Gamma sugárral történı sterilizáláshoz olyan átlátszó fóliába célszerő csomagolni az eszközöket, amelyben azok hosszú ideig tárolhatók csíramentes állapotban. Pl. polietilén, polikarbonát zacskók. Ismételten hangsúlyozni kell, hogy az etilénoxidos sterilizálás kerülendı! Ha mégis alkalmazza valaki, a serilitást jól megırzı csomagolásnak olyannak kell lennie, hogy a gáz könnyen bejusson és ki is szellızhessen. (Ez utóbbihoz alkalomadtán egy-két hónap is szükséges lehet.) Bármilyen módszerrıl legyen is szó, a csomagolásnak olyannak kell lennie, hogy a lamináris boxban könnyen, sterilen nyitható legyen.
Milyen sejteket tenyésztünk? Minden sejttenyészet primer kultúraként kezdi pályafutását. Sok esetben megfelelnek az eredeti explantatumból származó sejtek, máskor szelektálni kell a kívánatosakat. Az elsı passzálás (szubkultiváció) után az in vitro tenyészet sejtjeit immár a szekunder kultúra megjelölés illeti. Szokás ettıl az átoltástól kezdve sejtvonalról beszélni. A primer kultúrák és az ezekbıl származók sejtjeire általában jellemzı, hogy annak a szövetnek megfelelı morfológiát mutatják, ahonnan vétettek, és ami ennél fontosabb, ırzik annak differenciált biokémiai funkcióit, valamint a kiindulási organizmus diploid kromoszómaszámát. (Szuszpenzióban a sejtek gömbölyőek.) A daganatos eredetőeket kivéve az ilyen tenyészetek élettartama erısen korlátozott: a sejtek osztódási kapacitása kb. 50 mitózisra elegendı. (Ez leginkább embrionális eredetnél igaz, felnıtt szervezetbıl történı indításkor 30 sejtgenerációra is korlátozódhat.)
Különféle, letapadva, egy rétegben (monolayer) növı sejttípusok in vitro morfológiai jellemzıi
A (A) Endothel, confluens kultúra: a sejtek egymáshoz illeszkednek. (B) Fibroblast, semi-confluens: orsó alakú, nyúlványos sejtek. (C) Neuralis sejtek, kb. 60-70%-os confluentia: rövidebb orsó, ill. csillag alakok. Valamennyi (eredetiben) 400×.
B
C
Az in vitro szaporodó tenyészetek sejtjeit passzálni kell. Adherencia-dependens sejtek esetén nem szabad megvárni, hogy azok a rendelkezésükre álló felület teljes egészét elfoglalják, azaz a tenyészet confluenssé váljék, hanem kb. 70-80%-os lefedettségnél el kell végezni az átoltást. Minden egyes tenyészetrıl tudnunk kell azt, hogy hányadik passzázsnál tart. NB! Ez nem jelenti azt, hogy hányadik mitózisnál. (Ez utóbbi erısen függ a le/át/oltás sőrőségétıl.) Ha a primer kultúra elınyeit kamatoztatni akaró kísérleti rendszerben összehasonlítható eredményeket akarnak elérni, akkor nagy denzitással indítják a tenyészetet és néhány passzálás után – lehetıleg sok – szubkultúrát lefagyasztanak, folyékony N2-ben eltesznek. Ezek egyenkénti felolvasztásával folyamatosan biztosítható a nagyjából homogén (egymással összehasonlítható) és még nem elöregedett tenyészeteken való munka.
Az aljzathoz (vagy más szilárd felszínhez) letapadva tenyészthetı (adherencia-dependens) sejtek esetén releváns kifejezés a confluentia, szuszpenzióban fenntarthatók esetében ez nem használható. Mindkét növekedési típusnál meg kell különböztessük a leoltási késlekedést, az exponenciális növekedési szakaszt és a telítési fázist. Ha jól proliferáló tenyészetbıl átoltással szubkultúrát hozunk létre, a sejtek elırehaladása a sejtciklusban leáll, majd egy-két nap után éri el az adott körülmények közötti maximális ütemet. Végül, ha a sejtek egy egységre (cm2 vagy ml) esı száma telítéshez közeledik, a mitotikus aktivitás lecsökken, majd leáll. Ha túl sokáig maradnak ebben a stacioner fázisban, az elégtelen tápanyagellátás miatt megindul a tenyészet involúciója, pusztulása. A tönkrement sejtekbıl felszabaduló anyagok károsítják a még élıket! Ebben a proliferációs viselkedésben is lényeges különbség van a letapadva, ill. a szuszpenzióban szaporodó sejtek között.
Egy kis nevezéktan Plating efficiency (megtapadási hatásfok). Azt mutatja meg, hogy az 1 cm2-re számított leoltási sejtszámból mekkora hányad tapad valóban le és kezd el szaporodni. Ez sohasem 100%! (Értelemszerően csak adherencia-dependens sejtekre vonatkoztatható paraméter, de a szuszpenzióban növekvıknél sem 100% a továbbiakban jól szaporodó sejtek aránya, itt ml-re számítva.) Fontos tudni minden egyes sejtféleség, sejtvonal esetén, hogy mekkora az optimális leoltási sejtszám, 1 cm2-re vagy 1 ml-re vonatkoztatva. Ez igen tág határok között váltakozhat. A sejtek között van bizonyos kooperativitás, kondícionálják a maguk számára a mediumot, ami ha túl alacsony a sejtszám, nem tud mőködni, és nem indul be a proliferáció. Ugyanakkor a feleslegesen túl sőrőre választott leoltás nagyon röviddé teheti a tenyészetnek az exponenciális növekedési fázisban eltöltött idejét, és a sejttenyészetek többségében ez a periódus az, ami alkalmas az elvégzendı kísérletek megbízható és összehasonlítható eredményekkel szolgáló kivitelezésére.
A letapadás-függı, egy rétegben növekvı tenyészetekben jellemzı a sejtek mozgása az aljzaton, mindaddig, amíg egymáshoz nem érnek. Ekkor megállnak (a mozgás kontakt-gátlása), majd más irányban, ha arra még van hely, tovább vándorolhatnak. Ha nincs már hely a felületen, akkor a sejtek szaporodása is leáll. Ezen folyamat közben a sejtek az aljzatot is kondícionálják: extracellularis matrix (ECM) fehérjéket és egyéb molekulákat is deponálhatnak. Vannak sejtek, amelyek – fıleg a differenciált funkcióikat megközelítı állapotban való proliferációjukhoz – egyenesen azt kívánják meg, hogy az aljzatot ECM molekulákkal elızetesen vonják be (pl. collagen, fibronectin stb). Ennek megvannak a bevált technikái, de kaphatók gyárilag így elıkészített tenyésztıedények is. Léteznek olyan fóliabetétek, amelyek az említett fehérjebevonatot hordozzák, és a hagyományos Petri csészékbe illeszhetık be.
Bizonyos (kényes, igényes) sejtféleségek kondícionált mediumot kívánnak: valamilyen más sejtféleség exponenciális (vagy esetleg már stacioner) fázisú tenyészetérıl leszívott és újból sterilre szőrt tápfolyadékában hajlandók csak szaporodni. Megint mások csak tápláló rétegre (feeder layer) oltva tenyészthetık in vitro. Ebben az esetben valamilyen sejtféleség egyrétegő tenyészetét állítják elı, majd ennek sejtjei további szaporodását lehetetlenné teszik (pl. a DNS roncsolásával: rtg., UV, esetleg kémiai ágens), és ezekre telepítik az igényes sejteket, szaporítandó azokat. Egy kis nevezéktan A sejtpopuláció megkettızıdési ideje (population doubling time). Megmutatja, hogy egy adott sejtszám mennyi idı alatt duplázódik (az exponenciális növekedési szakaszban). Nem tévesztendı össze a sejtciklus idejével! Ez ugyanis még primer kultúrákban is sejtrıl sejtre változó lehet, másrészt mindig vannak nem osztódó sejtek is egy tenyészetben.
Letapadva növı primer kultúrák sejtjei – ha normál szövetbıl származnak (= nem transzformáltak) – egy rétegben (monolayer) képesek benıni a tenyésztı edény alját, ezután a szaporodásuk leáll, azaz a sejtek kontakt-gátlást mutatnak. (A gátlás kiterjed a sejtek vándorlására is.) Ez igaz a belılük származó másodlagos tenyészetekre is, nem igaz viszont az ún. transzformált sejtvonalakra. Eleve transzformáltnak tekintendık a daganatszövetekbıl indított tenyészetek sejtjei, de a normál szekunder kultúrák is átalakulhatnak. Ennek több jele is van, amelyek közül legfontosabb az ún. immortalizáció. Ez azt jelenti, hogy a sejtek immár korlátlan ideig tenyészthetık in vitro. Másrészt megszőnik a kontakt-gátlás, a sejtek több rétegben képesek egymásra nıni (egy bizonyos határig). Megváltozik a transzformált sejtek genomja, akár annyira, hogy ez a kariotípusukban is megnyilvánul (és egy adott tenyészet sejtjei különféle aberrációkat is mutathatnak).
Mi vezethet egy szekunder kultúra, egy sejtvonal transzformációjához? Bekövetkezhet ez spontán, amit kifejezetten elısegít, ha a tenyészetet többször is confluentiáig hagyták nıni – letapadva szaporodó sejtek esetén. Lehet a transzformáció valamilyen – nem azonosított – kémiai ágens, vírusfertızés stb. következménye is, és lehet szándékosan elıidézett (pl. fertızés Epstein-Barr vírussal). Egy kis nevezéktan A sejtvonal kifejezést általában egy adott primer kultúrára viszszavezethetı, jól tenyészthetı (ennek megfelelıen az esetek többségében transzformáltnak tekinthetı) sejtekre használják, azaz itt a közös ısbıl eredés meghatározó. Az ún. „established cell line” tartósan azonosnak tekinthetı önmagával, de ez a kitétel erıs fenntartással fogadandó. A sejtvonalak irodalmilag azonosíthatók, ha magunk állítunk elı ilyet, igen részletes leírást kell adni róla, bármilyen közleményben szerepeljen is.
Egy kis nevezéktan A sejttörzs megnevezés valamennyire rokon a sejtvonallal, általában ilyenbıl is származik (ritkán primer kultúrából), valamilyen szelekciós vagy klónozási eljárás eredményeként. Ennek megfelelıen ez névleg még inkább azonos önmagával és az eredeteként szereplı sejtpopulációval. Névleg… Hangsúlyozni kell ugyanis, hogy a hosszú ideig in vitro tenyésztett sejtek populációjában spontán szelekció megy végbe: minél jobb alkalmazkodás az in vitro körülményekhez. Ez egyben dedifferenciálódást is jelent. Ezért az ilyen sejtpopulációk egyedei rendkívül tarka képet tudnak mutatni pl. a kariotípusukat illetıen (gyakran igen hasonlatosan a daganatsejtekhez, amelyekbıl alkalmasint származnak is), és ha ez annyira változatos, mint amennyire, akkor nyilván a genomjukban is sok eltérés lehet azokban a génekben, amelyek nem szükségesek feltétlenül az in vitro létezésmód fenntartásához.
Az eddigiekbıl értelemszerően következik, hogy a letapadásfüggı és a szuszpenzióban fenntartható sejtféleségek jelentik az alapvetı különbséget a sejttenyészetek között. A következı szint a transzformált és nem transzformált sejtek megkülönböztetése, majd pedig a jól jellemzett sejtvonalak közötti különbségek megállapítása. Az adherencia-dependens sejtek/sejtvonalak, ha rosszindulatú daganatból származnak, és/vagy már hosszú idıt töltöttek el in vitro ahhoz, hogy kifejezetten transzformáltaknak lehessen ıket tekinteni, hajlamosakká válnak arra, hogy szuszpenzióban is proliferáljanak, avagy lágy agarban kolóniát képezzenek (ahol – értelemszerően – nincs szilárd megtapadási felület), amellett, hogy több rétegben képesek egymásra növekedni. (Meg kell azonban jegyezni, hogy a legfelsı réteg sejtjei ilyen esetekben gyakran leválnak és ezzel együtt el is pusztulnak.)
A szuszpenzióban fenntartott sejtek
elvileg bármilyen tenyészedényben növeszthetık, de soha nem szabad megfeledkezni a morfológiai kontroll szükségességérıl, ami legalább az aljzat felıl plánparallel lemezzel való lehatárolást jelent. Az aljzathoz rögzülten fenntartott sejtek esetén ezen lemeznek kell plánparallelnek lennie. Morfológiai vizsgálatokra szánt tenyészetek – megfelelıen elıkészített, kezelt – fedı- vagy tárgylemezre növeszthetık. (Van olyan – sajnos meglehetısen drága – megoldás, amiben egy tárgylemez alkotja a tenyésztı flaska alját. Errıl a felsı rész eltávolítható, a lemez a ránıtt sejtekkel fixálóban, festékoldat(ok)ban kezelhetı, (immun)cito- Speciális tenyésztı csı, ami egy keskeny, kémiai reakciók végezhetık hosszúkás fedılemez befogadására alkalmas. Ennél egyszerőbb a fedılemezt el rajta stb.) egy Petri csésze aljára tenni.
Sejtszuszpenziókból (NB! itt és most ide értendık az aljzatukról felválasztott, valamilyen mediumban vagy fiziológiás pufferoldatban eloszlatott sejtek is) citocentrifugával, kicseppentéssel, kenetkészítéssel stb. állítható elı morfológiai vizsgálatokhoz megfelelı denzitású preparátum. Soha ne feledkezzünk meg ilyenkor arról a tényrıl, hogy a tenyészfolyadék egyik fontos komponense valamilyen állati szérum, amiben számos olyan fehérje van, ami adszorbeálódhat a vizsgálni kívánt sejtekhez. Felhívjuk a figyelmet az öblítés szükségességére! Ugyanez a megfontolás fokozottan érvényes a biokémiai, molekuláris biológiai stb. feldolgozásba vont, vagy valamilyen (tudományos, diagnosztikai, ipari) produkciót (pl. vírus, speciális fehérjék stb.) szolgáló sejtek szuszpenzióira. Monoklonalis antitesteket termelı hybridomák tápfolyadékában vagy vírusvakcínák elıállítására szolgáló tenyészetekében pl. nincs semmilyen savó, nehogy abból keveredhessen bármiféle fehérje a termékhez.
Miben, hogyan tenyésztjük az emlıs sejteket? Természetesen tápfolyadékban, szintetikus mediumban. Minden sejtféleségre létezik a számára optimális medium. Primer kultúrák indításakor alkalmasint ezt magunknak kell megkeresnünk, és ezek általában komplex mediumokat igényelnek, míg megalapozott sejtvonalak esetén az ún. bazális medium elegendı szokott lenni. Az irodalomban, ill. a sejtek forrásánál megtalálható egy-egy sejtvonal tápközeg igénye. Különbségek vannak általában a szuszpenziós, ill. letapadás-függı tenyészeteket támogató mediumok között (pl. az utóbbi esetén sokkal fontosabb a Ca2+, mint az elıbbinél), de azért szerencsére jóval kisebb a használt tápközegek száma, mint a sejtféleségeké. Amint a bevezetésben már esett szó róla, a mediumok célirányos fejlesztése a múlt század 40-es éveiben kezdıdött. Akkor a sejttenyésztés elsıdleges célja még a víruskutatás volt. (A vírusok – ismeretesen – csak élı sejtekben szaporíthatók.) Enders, Weller és Robbins kapott Nobel-díjat (1954-ben) a polio vírus majom vesesejtekben való tenyésztésének megoldásáért.
Nem csak a víruskutatásban, hanem a vírus-oltóanyagok kifejlesztésében is alapvetı szerepet játszottak az in vitro sejttenyészetek. (A gyermekbénulás elleni elsı oltás – mint ismeretes – Jonas Salk nevéhez főzıdik [1955-tıl alkalmazták], majd ezt felváltotta az egyszerőbben [peroralisan] és egyúttal hatásosabban is alkalmazható Sabin-csepp [Albert B. Sabin, 1957-tıl].) Néhány imertebb bazális medium: MEM (Minimum Essential Medium); BME (Basal Medium [Eagle]), DMEM (Dulbecco’s modified MEM, emelt aminosav- és vitamin-szint), GMEM (Glasgow MEM, BHK-21 sejtekhez adaptálva), Medium 199 stb. Komplex medium: RPMI 1640 (eredetileg leukémiás sejtekhez, késıbb kiderült, hogy nagyon sok sejtféleségnek – közöttük adherencia-dependenseknek is – jó), Iscove’s DMEM (nagyobb sejtsőrőség eléréséhez), Leibovitz’s L-15 Medium (CO2-ot nem tartalmazó atmoszférához), McCoy’s 5A Medium (citogenetikai vizsgálatokhoz), Nutrient Mixture Ham’s F-12 és így tovább… (A mediumokat szállító cégek katalógusait ajánlhatjuk az érdeklıdıknek.)
A mediumok alapvetı összetevıi – Anorganikus sók (Puffer-rendszerek) – Nyomelemek – Szénhidrátok – Aminosavak – Vitaminok – Zsírsavak és lipidek – Fehérjék és peptidek – Szérum – Fenolvörös indikátor – Egyebek, speciális igények kielégítésére A megfelelı szakkönyvekben és kereskedelmi katalógusokban számos medium összetétele is megtalálható. Ezek közül egyet idézünk (mennyiségi adatok nélkül) a következıkben.
Szervetlen sók adják az alapját a tápfolyadék ozmótikus koncentrációja pontos beállításának. Ez elvileg 300 milliosmol, de a legjobb termosztátban is elpárolog valamennyi víz a folyadék fázisból, ezért 280 milliosmolra állítják be a koncentrációt. Természetesen a gyakoribb ionok iránti igényt is ezek a szervetlen sók fedezik, valamint az oldat vegyhatásának pH 7,2 - 7,4 közé állítását is, ha bikarbonát pufferelésrıl van szó. (Ne feledjük: vannak ott foszfátok is!) Nyomelemek Ezeken olyan életfontos ionokat értünk, mint Fe, Cu, Zn stb. Ha nem is mindig, de sok esetben nem szervetlen só formájában jelennek meg ezek a tápfolyadékok össztevıi között. Miért? Mert felvételük fehérjéhez kötött formában lehetséges (pl. transferrin), és ez a konjugáció csak sejteken belül történik. Bár vannak vas-, rézcinkszulfátot tartalmazó formulák, ezen ionok forrása leginkább a mediumokhoz rutinszerően hozzáadott szérum (foetalis vagy borjú, marha, ill. lósavó stb., l. a továbbiakban).
Szénhidrátok Általában D-glükózról van szó, de igen sok formulában szerepel fruktóz, galaktóz, mannóz vagy egyéb. Bár nem szénhidrát, itt említhetı meg, hogy sok sejtvonal igényel pluszban piruvátot. Aminosavak Nem csak a 20-féle L-aminosav, hanem néhány más (pl. hidroxiprolin) is szerepelhet. Bizonyos mediumokat bizonyos sejtek számára pluszban ki kell egészíteni a nem esszenciális aminosavak keverékével, esetleg egyéb, rokon vegyületekkel. Vitaminok Ezek azért esszenciális szerves vegyületek, mert az emlıs szervezetnek feltétlenül szüksége van rájuk, de nem tudja azokat elıállítani. A lista érdemben megegyezik a táplálkozásunkban szükséges vitaminokéval. Zsírsavak és lipidek Ezek általában (de nem minden esetben) a tápfolyadékhoz adott szérumból származnak.
Fehérjék és peptidek Szállító fehérjék ionok és hidrofób molekulák számára (pl. transzferrin a vas esetén), hormonok, növekedési faktorok. Mindezek a mediumhoz adagolt vérszérumban találhatók meg. Számos sejtféleség kifejezetten igényli a savóban levı növekedési faktorokat (növekedési hormonok), és ezért foetalis borjúsavót kell a tápközegéhez adagolni, már az újszülött borjú vérszéruma sem biztos, hogy maximális növekedést garantál, a felnıtt állatból származó pedig elégtelen. Szérum (vérsavó) Az eddigiekben elıadottak szerint az egyik legfontosabb tápfolyadék komponens, ugyanakkor a legrosszabbul definiált is. Számos sejt beéri felnıtt marha- vagy lószérummal, mások csakis foetalis borjúsavón hajlandók proliferálni. (Bizonyos humán sejtekhez pedig emberi vérszérum szükséges.) Ennek a komponensnek a beszerzése kifejezetten bizalmi kérdés: az abszolút sterilitáson felül külön hangsúlyozottan vírus-, prion- és mycoplasma-mentesnek kell lennie.
Ez itt nem a reklám helye!
Nem is ajánlás!
Az állati vérsavók általában 500 ml-es kiszerelésben, fagyottan (szárazjégben) szerezhetık be, mőanyag flaskákban. Eltartás: -20°C-on (megbízható mélyhőtıben). Célszerő ezeket az elsı felhasználás szándékolt ideje elıtt felolvasztani (alkalmasint 30 percig 56°C-on hıkezelni – l. a továbbiakban), és olyan adagokban sterilen, csíramentes, a befagyasztást jól kibíró edényekbe szétmérni, ami egyszeri mediumkészítéshez szükséges. A szérumok többszöri felolvasztása és újra fagyasztása nem kívánatos, de a fenti egyszeres procedúrát általában jól bírják. A tényleges használatba vétel elıtt ki kell próbálni az újonnan érkezett szérumot azokon a sejteken, amelyek tenyésztéséhez használni kívánják. Vannak sajnos a sejtproliferációt (vagy bizonyos sejtek szaporodását) nem támogató savó-készítmények is. Nagyobb megrendelés esetén sok cég vállalja, hogy kisebb mintákat ad kipróbálásra, s a legjobban beváltból szállít több literes tételt.
A szérumban számos olyan komponens van, amit csak ebbıl kaphatnak meg a tenyésztett sejtek. A megelızıekben nem említettek közül néhány: laminin, fibronectin, szabadgyökfogók, nehézfémeket és mérgeket megkötı molekulák. Tulajdonképpen ez lenne az ideális tápközeg a sejttenyészetek számára, de általában elegendı 5 – 10%-os arányban alkalmazni a teljes mediumban. (Csak nagyon igényes sejtek kívánnak 20%-nyi savótartalmat.) Az 1980-as és 90-es években különféle szérum-mentes mediumformulákat dolgoztak ki (pl. hybridoma tenyészetekhez), de ezek közös jellemzıje a rendkívüli drágaságuk, mert a legfontosabb szérumfehérjéket (növekedési faktorok, hormonok, transzferrin stb.) tisztított formában kell hozzáadni az adott mediumhoz. Bizonyos esetekben ez megéri: monoklonális antitestek, vakcinák elıállítása, mert itt a termék elviseli a magasabb költségeket. Foetalis borjúsavó esetén nem feltétlenül, de felnıtt állatból származó szérum esetén szükséges a hıinaktiválás: 56°C-on 30 perc. (A nemkívánatos fehérjekicsapódás megelızésében, valamint a gyors, egyenletes átmelegedéshez jó szolgálatot tesz, ha a hıkezelés rázatás közben történik.) Ez az eljárás inaktiválja a complement-rendszert, az antitesteket, és néhány enzimet, amilyen pl. az LDH (laktát dehidrogenáz), mely utóbbi indikátora lehet a sejtek tenyészetbeni sérülésének, szétesésének. (Nem apoptosis, hanem necrosis!)
Esetleges vírus- vagy mycoplasma szennyezıdés feltételezésekor szokás 254 nm-es UV-fénnyel besugarazni a szérumokat, mivel ez elroncsolja a DNS-t. (Ezt ebben az esetben jobbnak tartják a gammasugaras kezelésnél, amit úgyszintén szoktak alkalmazni a vérsavók sterilizálásához.) Egyes vizsgálatokhoz (pl. jelzett aminosavak vagy nukleozidok beépítése) dializált szérumot használnak, amelybıl a 10 kDa-nál kisebb molekulákat fiziológiás NaCl elleni dialízissel távolítják el. (Vigyázat: ilyenkor hormonok is távoznak a savóból!) A foetalis borjúsavó a legdrágább készítmény, a donor marháktól nyert a legolcsóbb. Ez utóbbi esetében is garanciát kell adjon a szállító a megelızıekben említett kontaminációk hiányát illetıen, de pl. arra is, hogy a vér nem tartalmazott szabad haemoglobint. Mivel vérszérumról (-savóról) van szó, értelemszerő a fibrinogénmentesség. Emberi savó csak AB és Rh+ donoroktól nyerhetı: nincs anti-A, anti-B, ill. anti-D ellenanyag a szérumban.
RPMI 1640 (RPMI = Rosswell Park Memorial Institute) Általánosan használható tápközeg szuszpenzióban (az eredeti definíciója szerint), ill. letapadva proliferáló sejtekhez is. Anorganikus sók: Ca(NO3)2, KCl, MgSO4, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4. Aminosavak: Mind a 20 L-aminosav + hidroxiprolin. Kiemelendı a glutamin abban az értelemben, hogy hamar elbomlik az oldat tárolása során, ezért idırıl idıre pótolandó. (Ez természetesen mindenféle mediumra vonatkozik. Gyárilag elıállított, kereskedelmi forgalomban beszerezhetı folyadék formában árult mediumokba eleve nem is tesznek glutamint, ez közvetlenül a felhasználás elıtt adandó hozzá, viszont NaHCO3 van benne, ami a por alakban kapható formulákban nincs.)
Vitaminok: D-biotin, D-Ca-pantotenát, kolin-klorid, fólsav, i-inozitol, nikotinamid, para-amino-benzoesav, piridoxal, riboflavin, tiamin, B12. Egyéb szerves: D-glükóz, (redukált) glutation, (HEPES), fenolvörös.
Fenolvörös indikátor és a medium pH-ja Mint a megelızıekben említettük, az emlıs sejtek tápközegéül szolgáló mediumok kívánatos pH-ja 7,2 – 7,4. A steril folyadékban ez – értelemszerően – közvetlenül nem mérhetı, ezért – néhány kivételtıl eltekintve – a mediumokhoz (de a fiziológiás sóoldatok egy részéhez is) fenolvörös indikátort adnak. Ennek „lazacvörös” színe mutatja, hogy a tenyészet pH-ja rendben van. Savasodás esetén (ami leggyakrabban a sejtek túlszaporodásakor, azaz elmulasztott idıbeni átoltáskor jelentkezik) a szín a sárga felé tolódik el, míg a lúgosodásra lila elszínezıdés hívja fel a figyelmet. Ezek a színek a CO2 termosztát üveg ajtaján keresztül jól megítélhetık. A tenyészetekre a tápfolyadék lúgosodása jelenti a nagyobb veszélyt. A „hagyományos”nak mondható mediumokban bikarbonát puffer állítja be a pH-t. Ehhez szükséges a CO2-szint kb. 5%-ra állítása a termosztát belsı atmoszférájában. Sok formulában szerepel HEPES (alkalmasint NaHCO3-tal együtt, de számos sejtféleség nem tolerálja ezt a puffer-anyagot, ugyanakkor mások HEPES-pufferelés esetén is igénylik a CO2-t).
A mediumok összetevıi között felsorolt „egyebek” közé sokféle anyag kerülhet, itt az antibiotikumokat és antimikotikumokat kell kiemelnünk. A. Carrel és kollégái munkája kapcsán az aszepszis mellett említettük az antiszepszist. A leggondosabban végzett steril munka során is érheti a sejttenyésztıt „váratlan baleset”, bakteriális, mycoplasma vagy gombafertızés. Ezek megoldásának legegyszerőbb módja a befertızıdött tenyészet elpusztítása. Sokszor azonban olyan értékes és pótolhatatlan sejtekrıl van szó, ami indokolhatja az antibiotikus vagy antimikotikus anyagokkal való kezelési kísérletet. Egyes laboratóriumokban ezt oda egyszerősítik, hogy eleve tesznek a használt mediumokba antibiotikumot, tipikusan penicillint és streptomycint (az utóbbi helyett vagy vele együtt gentamicint), igen ritkán antimikotikumot is. Az eljárás alapvetıen helytelen: így ki-ki „magának állít elı” antibiotikum-rezisztens baktériumokat.
Fertızésveszély! A bakteriális és gombafertızések veszélye – valamint magának a sejtpopuláció pillanatnyi állapotának megítélése – miatt rendkívül fontos a rendszeres mikroszkópos kontroll. Ha egy ilyen fertızésre még annak kezdeti állapotában derül fény, van esély a sikeres kezelésre, késıbb már nincs. (A vírusfertızések egészen más kategóriát képviselnek.) Baktérium-kontamináció esetében arra általában nincs idı, hogy a fertızı ágens azonosítására és a célzott kezelés érdekében mikrobiológiai tenyésztést és ez után antibiotikum-érzékenységi tesztet végezzenek. (Ezt legfeljebb utólagosan lehet, de úgy célszerő is elvégeztetni.) Elsı helyen ilyen esetekben az ampicillin ajánlható, ami penicillin-származék, de ritkább ellene a rezisztencia, mint maga a penicillin ellen. Kombinálható gentamicinnel, ha a mediumban ilyen nem volt. NB! Az antibiotikumok élettartama a tápfolyadékokban rövid! Szóba jön még: kanamycin, neomycin (azaz aminoglikozid antibiotikumok) és néhány egyéb készítmény (pl. ciprofloxacin), ami nem vagy csak igen kevéssé toxikus a fertızött tenyészet sejtjeire.
Rosszabb a helyzet fonalas gomba vagy élesztı fertızések esetén. Az ezek ellen hatásos antimikotikumok (Fungizon [amphotericin B], Nystatin és egyebek) általában inkább mérgezıek az eukarióta sejtekre (a gombák is eukarióták!), mint az antibiotikumok. Akármilyen kontaminációról legyen is szó, annak kifejezetten toxikus hatása van a tenyésztett emlıs sejtekre. Ha ez utóbbiak letapadva nınek, valamivel jobbak az esélyeink: a medium leszívása és többszörös átöblítés (antibiotikumot vagy antimikotikumot tartalmazó, elımelegített fiziológiás sóoldattal) fizikailag is sok fertızı ágenst távolít el. Nem láthatók – értelemszerően – fénymikroszkóppal a sejteket megtámadó vírusok, de az ilyen fertızésnek is megvannak a látható jelei. A bimbózással a környezetbe jutó vírusok ún. „blebbing”et okoznak: apró, sejtmembránnal fedett „bimbók” emelkednek ki a sejtfelszínbıl (amelyek majd leválnak), valamint az „értı” szem számára világossá válik, hogy a tenyészetnek „valami baja van”, amit nem elöregedés, nutriens hiány, vagy egyéb hasonló – relatíve egyszerőbb – ok magyaráz. A vírusfertızés nem kezelhetı!
Külön megfontolás tárgyát kell képezze a mycoplasma (PPLO) fertızés. Forrása lehet a kísérletezı (aki ilyen léguti fertızésben szenved), vagy a használt szérum. Ez az ágens mikroszkóposan nem látható, intracellularisan helyezkedik el a membrán alatt. Feltőnı lehet a sejtek megjelenése (l. pl. balra lent: „tükörtojás” képletek). Rendkívüli módon meghamisíthatja a sejttenyészettel kapott eredményeket. Ha felmerül a gyanú, többféle diagnosztikus módszer is szóba jöhet (pl. mikrobiológiai eljárás), ezek közül a Hoechst 33258 jelő fluoreszcens DNS-festékkel való kimutatás látható alul: középen negatív minta, jobbra fertızött sejtek. Kezelés pl.: anti-PPLO agent (tylocin), ciprofloxacin, BM cyclin stb.
Fiziológiás (élettani) sóoldatok Számos esetben merül fel annak szükségessége, hogy a tenyésztett sejtek ne mediumban legyenek (pl. öblítés), de mindenképpen olyan izozmótikus közegben, amelyben jól túlélnek. A legegyszerőbb formula a fiziológiás nátriumklorid: 0,150 M NaCl (= 300 mosmol). Ez azonban (mivel nem pufferelt, a levegıbıl elnyelt CO2 miatt) kissé savanyú, rövid túlélést biztosít, igen kevéssé használt. Inkább oldószer hozzáadott vegyületekhez. Az ún. „balanced salt solutions”-ról említettük, hogy ezekbıl fejlesztették ki a szintetikus mediumokat. Az egyik legáltalánosabban használt sóoldat a PBS (phosphate buffered saline: KH2PO4, NaCl, Na2HPO4), ill. ennek Dulbecco-féle változata (Ca2+ és Mg2+ ionokat is tartalmaz). A kétértékő fémionok hiányában az oldat nem támogatja a sejtek letapadását, ezt használják pl. az aljzatról trypsinnel vagy EDTAval történı felválasztás esetén.
Ismertebb fiziológiás sóoldatok (emlıs sejtekhez): Earle’s balanced salt solution (ebbıl lett pl. a BME medium) és a hozzá nagyon hasonló Hanks’ balanced salt solution. Ez utóbbi összetétele (gyári készítményként beszerezhetı porban, koncentrációk g/literben, kizárólag csak tájékoztatásképpen): CaCl2 vízmentes (0,14), KCl (0,40), KH2PO4 (0,06), MgSO4 vízmentes* (0,09767), NaCl (8,00), Na2HPO4 (0,04788), D-glükóz (1,00) és fenolvörös (0,01). * Gyárilag konfekcionált oldat esetén ezt MgCl2 és MgSO2 helyettesíti, az ilyen készítményben NaHCO3 is van. (A por formában megvásárolható gyári mediumokhoz és sóoldatokhoz azok feloldásakor kell hozzámérni a címkén megadott mennyiségő NaHCO3-t, ha folyadékban vásároljuk a kész mediumot, abban pedig glutamin nincs. Ha recept alapján magunk mérünk össze valamilyen oldatot, figyelni kell egyes vegyületek [pl. MgCl2] higroszkópos voltára!)
Egyéb vegyületek a sejttenyésztı laboratóriumban Trypsin. 0,25%-os oldatát (Ca2+ és Mg2+ ion mentes fiziológiás sóoldatban, alkalmasint annak glükózt is tartalmazó változatában) használják az adherencia-dependens sejtek felválasztására az aljzatról. Hasítja azokat az extracelluláris fehérje-hídakat, amelyeknek a sejtek letapadásában van szerepük. (NB! Ez is lehet fertızési forrás! Az elkészített oldatot – magától értetıdıen – sterilre kell szőrni, de ez nem véd az esetleges viralis vagy mycoplasma kontamináció esetén, ami egy efféle állati fehérjénél nem kizárható. Célszerő ezért UV-sterilizált, kifejezetten sejttenyésztési célokra elıállított készítményt használni.) Alkalmasint EDTA-val kombináltan alkalmazzák. EDTA. Alkalmazása esetén a fent említett fertızési veszély nem áll fenn. Kelátképzı, megköti a Ca2+ ionokat, amelyek a sejteket a hordozó aljzatukhoz kapcsolják, így segíti elı azok felválását. 0,02%-os oldatát használják (Ca2+ és Mg2+ mentes PBS-ben oldva).
DMSO (dimetil-szulfoxid). Lefagyasztandó sejtekhez adagolják, mint krioprotektív ágenst (nem engedi meg a belsı szerkezeteket roncsoló mérető jégkristályok képzıdését). A közhiedelemmel ► ellentétben nem szükséges a sterilizálása, mert elpusztítja a baktériumokat, de ehhez természetesen az tartozik hozzá, hogy a tároló üvegbıl való kiméréskor a steril pipetta nehogy hozzáérjen a flaska szájához vagy belsı falához. Glicerin. Ezt is krioprotektív anyagként adják a lefagyasztandó sejtek szuszpenziójához. Természetszerőleg: sterilizálandó! Speciális anyagok, amelyek egyedi igényeket szolgálnak és itt felsorolhatatlanok.
Munka a sejttenyésztı laboratóriumban A lamináris boxban a levegıáramot a tervezett munkavégzés elıtt 30-45 perccel be kell kapcsolni (és ilyenkor az UV-lámpát még bekapcsolva hagyni, mert a munkát végzı ekkor még nem tevékenykedik a sejttenyésztı laboratóriumban). A munkavégzés feltételeit és szabályait érdemben már említettük a megelızıekben, különösen hangsúlyozva a sterilitási követelményeket. Szóltunk a letapadva, ill. szuszpenzióban szaporodó sejtekrıl, valamint a morfológiai kontroll szükségességérıl. Ez utóbbival kapcsolatban alapszabály, hogy rendszeres legyen, mert egyfelıl ennek alapján ítélhetı meg az átoltás szükségessége (amit ha idejében nem teszünk meg, kárt okozhatunk tenyészeteinkben), másrészt a sejtek általános állapota, nemkülönben a tenyészetek esetleges fertızöttsége. Lehetıleg ne kezeljünk egyszerre többféle sejtvonalat, ám ha ez elkerülhetetlen, mindig elızetesen jelöljük meg a használandó tenyészedényeket aszerint, hogy mi kerül beléjük. (Sejtféleség, dátum, passzázs-szám stb.)
Morfológiai kontroll Kb. semiconfluens tenyészet, ► közeledik az ideális Jellegzetes epiteloid megjelenés átoltási HeLa sőrőségInvolúcióban levı tenyészet hez. ► Confluens tenyészet, régen át kellett volna oltani.
Munka a lamináris boxban: mediumcsere letapadva növı tenyészeten Sejttípustól (és mediumtól) függıen két-három (esetleg négy) naponként friss tápfolyadékot kell kapjanak a sejtek, a nutriensek kimerülése miatt.
A munkát végzı gumikesztyőt visel. Célszerő lenne, ha ezt a köpenye ujjára is ráhúzta volna: szabad bırfelületrıl hámpikkelyek sodródhatnak le, amelyek garantáltan nem sterilek A tenyésztıedényt a gázláng mellet nyitja, a flaska száját egy pillanatra áthúzza a lángon.
Friss mediummal ellátás. A zárókupak viszszahelyezése elıtt: gázlángon áthúzás. Majd a kupak lazítva a helyére.
A mediumot vákuumhoz csatlakoztatott Pasteurkapillárissal szívja le, amit szintén áthúzott a gázlángon.
Fenntartás, átoltás (passzálás) és sejtszámolás Szaporodásuk során (és következtében) a tenyészetek sejtjei elfogyasztják a rendelkezésükre álló tápanyagokat: „meg kell etetni” ıket, azaz friss mediumot kell kapjanak. Ez az esetek nagy részében – szuszpenzióban fenntartott sejteknél mindenképpen – egyben átoltást is jelent. A letapadva proliferálók még ez elıtt elérhetik azt a sőrőséget, amelynél mindenképpen át kell oltani ıket új tenyészedénybe, friss mediummal ellátva. Ám ha a sejtdenzitás nem igényel még átoltást, az ilyen tenyészetek kezelése az egyszerőbb: a medium leszívása után a megfelelı mennyiségő friss (elımelegített!) tápfolyadékot adagoljuk a tenyészedénybe. (L. a három ábrát a megelızı dián.) Mit értünk ezeknél a „megfelelı” mennyiségen? Általában azt, ami a tenyészedényben 2 mm (maximálisan 3 mm) folyadékvastagsággal borítja be a sejteket. Ez képes elegendı nutrienst biztosítani és megfelelı gázdiffúziót (O2, CO2) is lehetıvé tesz.
Akár átoltásról, akár számolásról legyen is szó (a kettı nem igazán választható el egymástól), az adherencia-dependens sejteket mindenképpen fel kell választanunk az aljzatukról. Ennek fizikai és kémiai módszerei vannak. Fizikai: valamilyen alkalmas kaparóeszközzel (ilyen pl. a már említett „rubber policeman”), ami kevéssé károsítja a sejteket, választjuk fel azokat az alapjukról. Nem igazán jó megoldás, mert meglehetısen nagy anyagveszteséggel jár. Kémiai: A mediumot leszívjuk, majd az enzim vagy EDTA oldószereként szolgáló, elımelegített, Ca2+ és Mg2+ ion mentes fiziológiás sóoldatban (alkalmasint annak glükózt is tartalmazó változatában) öblítés. Trypsin oldat. Úgyszintén elımelegítve, igen kis (de a felszínt mindenképpen egyenletesen, jól beborító) mennyiségben alkalmazzuk. A sóoldat leszívása után ezt adjuk a tenyészethez, majd az edényt behelyezzük a 37°C-os termosztátba, 5-10 percre. (Ki kell tapasztalni, hogy az adott sejtféleség számára mi optimális.) A sejtréteg leválása az edény mozgatásával jól láthatóvá válik, de kétely esetén mikroszkópos kontrollal ez mindenképpen alkalmasan megítélhetı.
Az enzimet ezután közömbösíteni kell. Ez történhet trypsin-inhibitor alkalmazásával, vagy – egyszerőbben – a sejtek szérumot tartalmazó mediumban való felvételével, lecentrifugálásával és a véglegesnek szánt mediumban való – kívánt denzitású – felszuszpendálásával. Trypsin helyett szoktak alkalmasint egyéb proteázt is használni. A kezelés mindenképpen a külsı felületi fehérjék jó részének elvesztésével jár. Ez nem jelentkezik az EDTÁ-val való felválasztás esetén, ám ne felejtsük: ezt az oldatot is le kell öblíteni a sejtekrıl. Az átoltás – mint a megelızıekben láttuk – mindenképpen kapcsolódik a tenyészetek morfológiai kontrolljával. Minden sejtféleségnek megvan az optimális passzálási denzitása, s ehhez a leoltási sejtszám meghatározásával alkalmazkodunk. Szuszpenzióban szaporodó sejtek esetén könnyő a dolgunk: fel-le pipettázással egyenletessé tesszük a sejtek eloszlását a közegükben (a leülepedetteket fel kell keverni), a szuszpenzióból egy kicsiny mintát haemocytometerbe teszünk és ott megszámoljuk a sejteket. A letapadás-függıknél a felválasztás után úgyszintén gondoskodnunk kell az egyenletes denzitású szuszpenzióból való mintavételrıl.
Néhány haemocytometer típus rácsbeosztása A sejtszámláló kamrákat – mint a haemocytometer név is mutatja – vérsejtek megszámolására fejlesztették ki. Különféle változataik vannak, a felsı ábra a – meglehetısen elterjedt – Neubauer típus beosztását mutatja. A beosztás elve: egy-egy (nagyobb) négyzet pontosan 1×1 mm-es. (Ugyanez igaz a hazánkban jobban elterjedt Bürker kamrára is, l. következı két ábra.) A (belekarcolt) beosztást hordozó (vastag) alap és a fedılemez távolsága 0,1 mm. Így az egységnyi térfogat 0,1 mm3, vagyis 0,1 l.
Bürker kamra
Mindkét változat (leszorító rugó nélkül vagy azzal) esetén gondoskodni kell a fedılemez tökéletes felfekvésérıl, azaz a 0,1 mm kamramélység betartásáról. Csakis a rácsbeosztást hordozó, a környezetébıl kiemelkedı felszínen lehet sejtszuszpenzió! Ha ezen túlfolyik, az hibaforrás!
A Bürker kamra rácsbeosztása
1
2
3
4
5
6
7
A hármas vonalak középsıi által körbezárt négyzet pontosan 1 mm2, a kamra vastagsága 0,1 mm, azaz az 1 mm2 -en megszámolt sejtek 0,1 l térfogatban vannak. Tenyésztett emlıs sejteket nem érdemes kisebb térfogategységben számolni, mert ezek meglehetısen nagyok (szemben pl. a vörösvérsejtekkel). Célszerő 7 négyzetben számolni (pl. a jelzettek), a két szélsı értéket elhagyni, az ötbıl számolt átlagot 10 000rel szorozva kapjuk az 1 mlben levı sejtek számát.
Számolás a Bürker kamrában Csak az élı, jó állapotban levı sejteket szabad átoltani, ill. a megszámolt mennyiségbe beszámítani. Ezt vitális festéssel szokták ellenırizni: az ép, jó membránfunkciójú sejtek nem vesznek fel tripánkéket a környezetükbıl (= kizárják ezt a festéket), míg a sérült, pusztulóban lévı vagy már el is halt sejtek megfestıdnek. Ezeket nem számolják, ill. ha túl nagy arányban vannak jelen, annak okát meg kell keresni és meg kell szüntetni. A tripánkék bármilyen szuszpendáló közeghez hozzáadható, megfelelı (fiziológiás sóoldatban elkészített) törzsoldatból néhány l, hogy a végkoncentráció 0,2% legyen. Fel kell hívni azonban a figyelmet arra, hogy ha valaki jól ismeri az általa tenyésztett sejteket, és rendszeresen elvégzi azok morfológiai kontrollját, a fáziskontraszt mikroszkópos kép igen megbízható információt ad azok állapotáról, tripánkék festés nélkül is. (Jó fénytörés, erıs halo-jelenség = egészséges sejt.) (Ha a sejtállapot megítélhetıségének követelményétıl eltekintünk, Bürker kamrában számolni közönséges fénymikroszkóppal is lehet, de itt pl. nehézséget okozhat a rácsbeosztás felismerése, ami fáziskontraszttal jól látható.)
Hibalehetıséget rejt magában, ha nem figyelünk a határoló vonalakat érintı (vagy azokon fekvı) sejtek „beszámítsam – ne számoljam” kérdésére. Ha mind a négy vonalat érintı sejteket számoljuk, többet kapunk, ha egyiket sem, kevesebbet. A probléma megoldására legtöbben azt ajánlják, hogy két vonal (mondjuk a felsı és a bal) esetében igen, két másik vonal (példánkban a jobb és az alsó) esetén pedig nem számoljuk az azokat akárha a legkisebb mértékben is érintı sejteket. Ez külön abból a szempontból is fontos, hogy egymással határos négyzetekben számolunk. Bizonyos sejtek vonatkozásában azonban tehetünk engedményt (nem igazán jogos, tudományosan nem megalapozott, de kényelmes): a tenyésztett sejtek többsége van olyan nagy, hogy eléggé megbízhatóan eldönthetı, a nagyobb vagy a kisebb része van az adott, éppen számolt négyzet területén. Vigyázat! A számláló kamrát nem szoktuk sterilizálni! Ha bemértük a mintánkat, az erre használt pipetta már nem steril.
Leoltás után
a frissen tenyészedénybe telepített sejteket (még mielıtt az erre hajlamosak letapadhatnának) óvatos mozgatással minél egyenletesebben el kell oszlatni az új környezetükben. (Ha a termosztát polcai rosszul vannak beállítva, azok rezgése miatt a sejtek egyenlıtlenül töltik be a rendelkezésükre álló teret. Ez megbízhatatlanná teheti a tenyészet viselkedését.) Akár Petri csésze, akár tenyésztı flaska, a mozgatásánál mindig ügyelni kell arra, nehogy a folyadék a széléhez (szájadékához, kupakjához) érhessen, mert ez is fertızési forrás lehet. Még steril gumikesztyőben dolgozva is mindig kínosan ügyelni kell arra, mihez nyúlunk, mihez érhetünk hozzá, és mihez nem. Akár medium-csere, akár átoltás, akár a letapadva növı tenyészetek leszívott mediumáról, akár a lecentrifugált sejtek felülúszójáról legyen szó, azt mindig úgy kell összegyőjteni, hogy ne kerülhessen át a második szívópalackba (l. a megelızıekben) és mindig dezinficienshez (pl. Neomagnol tabletta a felfogó edényben) adódjék. Végezetül a leszívó rendszer csövét is át kell öblíteni dezinficienssel.
A használt sejtvonal egyszerő fenntartása esetén is
mindig célszerő megfelelı tartalékokkal dolgozni, azaz pl. az átoltásnál duplikátumokat (sıt: triplikátumokat) készíteni. (Ezeket, ha ténylegesen csak sejtfenntartásról van szó, lehet igen kis mennyiségben létrehozni, lényeg az egymástól – legalábbis részbeni – függetlenség.) Ugyanakkor, amikor a korábban megvoltak közül a legjobb kinézető tenyészetbıl készítjük a szubkultúrát, a második legjobbat érintetlenül, vagy csak egy medium-cserével mint biztonsági tartalékot tehetjük el. (Igen sok sejtféleség kibírja azt, hogy ha már passzálni kellene is, egy késıbbi involúciós fázisból – szükség esetén! – még visszanyerhetı legyen a sejtvonal. NB! Ez célszerő, de kényszermegoldás, nem pótolja a folyékony N2-ben való tartalékolást.) Ismételten meg kell említeni e helyen, hogy bármilyen sejtféleségrıl, sejtvonalról legyen is szó, az folyamatosan adaptálódik az in vitro tenyésztés körülményeihez, azaz egyre kevésbé azonos az elsı leoltáskori önmagával!
Ha kísérletbe kívánjuk állítani a sejteket, és az elıre láthatóan hosszabb ideig tart majd, akkor célszerő a már bemutatott elvet követni bármilyen sejtvonal esetén: nagyobb sejtmennyiség elıállítása után azt olyan porciókban fagyasztani le, amelyekbıl majd újabb és újabb kísérleti tenyészetek indulhatnak, melyek közül egyet-egyet csak limitált ideig (pl. egy hónap) használunk. Tárolás: folyékony N2.
A sejtek lefagyasztása és felolvasztása
rutin eljárás minden sejttenyésztı laboratóriumban. Alapelv: a tárolási hımérséklet elérése a lefagyasztás során egyenletesen, és nagyjából 1°C/perc hımérsékletcsökkenéssel történjen, a felolvasztás és a 37°C-ra való felmelegítés viszont olyan gyorsan, amilyen gyorsan csak lehet. Kaphatók olyan fagyasztó betétek, amelyek a folyéFagyasztó betétben elérhetı kony N2-es tároló edény hımérsékletcsökkenés szájadékába helyezhetık, és a kipárolgó hideg N2 a Ideális hőtıközegük. Ennél egyhımérsékszerőbb (olcsóbb) eljárás letcsökkenés vastagabb falú mőanyag dobozba (pl. hungarocell) rakni az ampullákat, és ezt a dobozt elıbb (egy éjszakára*) -20°C mélyhőtıbe tenni, majd áthelyezni -70°C – -80°C-ra (fél vagy egy napra*), és innen vinni át az ampullákat folyékony N2-be. (* Ez a két idıtartam felcserélhetı.)
Fagyasztó ampullák
Az ampullák töltése jégbe állított állványban történik!
Vitatható, hogy milyen fagyasztó ampulla típus a jobb: üveg vagy mőanyag. Az üvegbe semmilyen körülmények között nem kerülhet be a folyékony N2, míg a csavaros tetejő mőanyagba – legalábbis kellı elıvigyázatosság híján – igen; viszont az üveg leforrasztása speciális berendezést igényel, és az ilyen ampullák néha felrobbannak, azaz igen balesetveszélyesek. A mőanyag csövecskék kupakját minden egyes lépésben külön meg kell szorítani (anélkül, hogy a tartalom felmelegedhetne)!
A fagyasztás legnagyobb veszélye a sejtekre az intracelluláris jégképzıdés. Ez – értelemszerően – elkerülhetetlen, az okozott kár (sejtpusztulás) minimalizálására krioprotektív ágenst, mindenekelıtt DMSO-t [(CH3)2SO] használnak. Ha ez valamilyen okból ellenjavallt (pl. HL60 sejtekben haemoglobin szintézist indukál), helyettesíthetı glicerinnel. (Figyeljük meg: a folyékony N2-es tárolóban gız- és folyadékfázisú N2 egyaránt van. Az ampullatartó belógatható úgy, hogy csak az elsıbe érjen bele.)
A fagyasztva tároláshoz szükséges medium összetételére vonatkozóan több recept is forgalomban van, ezen a helyen egyet mutatunk be: az illetı sejtekhez szokásosan használt medium, 20% foetalis borjúsavó, 10% DMSO, + a szokásos egyéb adalékok. Lefagyasztáskor a sejtek nem 37°C-on vannak, hanem szobahın, így történik az öblítésük is (a trypsinbıl vagy EDTÁ-ból). Majd olvadó jégbe állított ampullákba pipettázunk be 1 - 1,5 - 2 ml-t (a befogadó térfogattól függıen, az ampullát sohasem maximálisan teletöltve), az elızetesen 2-4×106 sejt/ml-re beállított denzitású sejtszuszpenzióból. Ha csavaros kupakú mőanyag csövekben fagyasztjuk le a sejteket és nem gondoskodunk a zárókupakok ismételt, maximális meghúzásáról, elıfordulhat, hogy a folyékony nitrogén, ami mindig bakteriálisan szennyezettnek tekintendı, bejut az ampulla belsejébe, és a felolvasztott tenyészetet fertızött állapotban nyerjük vissza.
Ennek elkerülésére jó az a megoldás, ha az ampullatartók csak a gızfázisba nyúlnak be, a -178°C-on tárolás is maximális biztonságot nyújt. Ugyanakkor nagyon kényelmetlen: a folyadékfázisban igen kevés N2 lehet az adott tárolóedényben, sőrő utántöltésre van szükség. Ennek során viszont nehezen kerülhetı el, hogy az ampullákra valamennyi folyékony nitrogén rá ne folyhasson. Bármelyik ampullaféleségrıl legyen is szó, célszerő ezeket a kivétel után azonnal 37°C-ra felmelegített 70%-os etanolba mártani és intenzíven mozgatni a teljes felolvadásig, majd gázlángon áthúzás (= külsı leégetés) után nyitni ki. A sejtszuszpenziót csakis steril pipettával lehet kinyerni az ampullából (nem pedig kiönteni). Üveg ampullák felolvasztása esetén a vonatkozó munkavédelmi óvórendszabályokat (védıkesztyő, -álarc) be kell tartani, mert ezek könnyen felrobbanhatnak a melegítés hatására. Felnyitás: mint az injekciós készítményeknél. Mőanyag csövecskéknél gondolni kell a zárókupak ismételt meghúzására még a felolvasztás megkezdése elıtt (nehogy az etanol* bejuthasson a belsı térbe). * Mint említettük, a 70%-os etanol nem tekinthetı csíramentesnek, hacsak elızetesen sterilre nem szőrtük, ami itt erısen ajánlott. Ugyanakkor: toxikus.
A felolvasztott szuszpenziót egyesek szobahın levı, mások elımelegített mediummal hígítják fel (egyszerre vagy lépésenként). A lényeg: mielıbb kimosni a DMSO-t (vagy glicerint) a sejtekbıl, mert az rendkívül toxikus. Ehhez savót tartalmazó mediummal történı két-három átmosás szükséges, majd a sejtek a végsı tápközegükbe és tenyésztıedényükbe kerülnek. Az eljárást reggeli – kora délelıtti órán célszerő elkezdeni, majd mikroszkópos kontrollal ellenırizni a sikerességet. Ez az adherencia dependens tenyészetek esetén a jó kiterülést és letapadást jelenti. Ha ezek a sejtek kitapadtak, még aznap délután mediumcserét kell végrehajtani, majd másnap reggel újból. A felolvasztás utáni napon a szuszpenziós tenyészeteken is tápfolyadékot kell cserélni. A sejtek visszanyerése messze nem 100%-os. Eldönthetetlen kérdés, hogy a veszteségek a lefagyasztás vagy a felolvasztás során keletkeznek-e. (Nyilván mindkettı…)
Miért tenyésztünk sejteket in vitro? Erre a kérdésre itt nem lehet válaszolni! Ahány sejttenyésztı laboratórium, annyiféle cél, feladat. Molekuláris sejtbiológia ma már elképzelhetetlen sejttenyésztı laboratórium nélkül, ugyanúgy a molekuláris genetika. De a hagyományos (és nem annyira rutin, pl. amniocentesisbıl származó anyag) citogenetikai vizsgálatok is in vitro sejttenyésztést igényelnek. A felsorolás a végtelenségig folytatható. Amit még feltétlenül fel kell idézni a megelızıekben már említettek közül: vírusdiagnosztika, vakcinák készítése, monoklonális ellenanyagok elıállítása (és nagyüzemi gyártása). Gyógyszerek (egyéb xenobiotikumok) esetleges mutagenitásának és/vagy toxicitásának tesztelése, ill. hatásmechanizmusának vizsgálata (sok állatkísérlet megspórolható ezáltal). In vitro tenyésztett emlıs (és alkalomadtán nem csak ilyen, hanem pl. rovar vagy akárha növényi) sejtek alkalmasak lehetnek olyan terápiás célú fehérjék elıállítására, amelyek bakteriális rekombináns technikával nem készíthetık (pl. helyspecifikus glikozilálás).
Hogyan szerezhetünk sejteket? Az eddig elıadottakból világossá kellett váljon, hogy saját speciális céljainknak leggyakrabban a magunk által indított primer sejtkultúrák felelhetnek meg. Más esetekben viszont jók a megalapozott sejtvonalak (sejttörzsek), amelyek megvásárolhatók kommerciális forrásokból, ill. beszerezhetık kollegiális ajándékként. Mindkét esetben rendkívül fontos, hogy egy majdani, ezekre alapozott közleményben (szabadalomban stb.) az eredetnek és az egyéb vonatkozású pontos specikikáci(ók)nak szerepelniük kell (a saját metodikai leírás mellett). A következı kérdés: Hogyan kerülhetnek ezek a sejttenyészetek a mi sejtlaborunkba? Lefagyasztott sejteket tartalmazó ampullák szárazjégben meglehetısen biztonságosan szállíthatók (a CO2 hó/jég hımérséklete ≈79°C elég alacsony a sejtek megmaradásához, és ezt egészen megbízhatóan tartja, ingadozások nélkül, ami különösen fontos szempont ilyen relatíve „magas” hımérséklet esetén. Egy -80°C mélyhőtı kevésbé biztonságos, a szárazjég elpárologhat, de nincs nála áramszünet.)
A tenyésztett emlıs sejtek általában jól tolerálják a szobahın tartást. Ha letapadva proliferáló sejteket akarunk nagyobb távolságra küldeni (vinni), azokat leoltjuk egy jól zárható tenyészedénybe, kb. 50%-os denzitásig növesztjük (eközben meggyızıdünk arról, hogy rendben vannak), majd a flaskát teljesen feltöltjük meleg mediummal, a kupakot erısen rászorítjuk és a mellékelt ábra szerint parafilmmel is lezárjuk, lassan hagyjuk lehülni szobahıre. Hőteni nem szabad! Hasonló módon szuszpenziós tenyészetek is szállíthatók, de azoknak elég egy jól záródó centrifugacsı is. Szükség esetén (pl. CO2 termosztát tisztítása) a sejttenyésztı laboron belül is megoldás lehet ez a tárolási mód.
Sors bona, nihil aliud.
