Sejtbiológia - állati sejtek Biológia MSc

Sejtbiológia - állati sejtek Biológia MSc Állati sejtek - hosszú ideig élı, ritkán, vagy egyáltalán nem osztódó sejtek, pl: neuronok - rövid ideig élı sejtek pl. bélhámsejtek Proliferáció – differenciáció – sejthalál: nerózis, vagy apoptózis

Sejtciklus - olyan események sorozata, mely a sejt duplikálódásához vezet, minden eukariótában hasonlóan történik - szabályozásának zavara tumorképzıdéshez vezet – kikerül a sejt a kontroll alól Az idegrendszerben is vannak ıssejtek és osztódó sejtek, kis számban, de a legtöbb neuron differenciált, nem osztódik, csak elpusztul A kötıszöveti fibroblasztok tipikusan nem osztódó sejtek, de aktiválva újra beléphetnek a sejtciklusba. Tanulmányozás: elszarusodó laphám – bır példáján - alsó, bazális réteg: osztódóképes epitheliális ıssejtek – az alkalmanként osztódó sejtbıl az egyik utódsejt stem sejt marad, a másik gyorsan osztódó sejtté alakul – az összes réteg sejtjeit ezek állítják elı, melyek a felszín felé haladva differenciálódnak, majd elhalnak

A sejtciklus fázisai A sejtciklus lényege: 2 db, a szülıi sejttel teljesen azonos utódsejt létrehozása - M fázis – mitózis és citokinezis: a tulajdonképpeni sejtosztódás – két egyenértékő utódsejt létrehozása - interfázis: a sejtosztódások közötti intervallum. 3 szakasza: - G1 (first gap) fázis: mitózis és a DNS replikáció közötti szakasz - S (synthetic) fázis: DNS replikáció - G2 (second gap) fázis: DNS replikáció és a mitózisba való belépés közötti szakasz - G0 fázis: többsejtőek differenciált sejtjei nem osztódnak tovább, G0 fázisba lépnek Ellenırzı pontok, checkpoint: olyan pontok, ahol a külsı hatások szabályozni tudják a sejtciklus egyes szakaszaiba való át- vagy belépést, illetve az apoptótikus folyamatok beindulását.

1

Ellenırzı pontok, checkpoint Biokémiai szabályzó körök, melyek detektálják a környezetbıl érkezı jeleket, illetve a sejtciklus során keletkezı hibákat és gátolják a sejtciklus további lépéseit. 4 fı ellenırzıpont van: 1) restrikciós pont: a G1 fázisban – a sejt életfolyamataira, és az ıt körülvevı extracelluláris mátrixxal való kapcsolatokra érzékeny: ha a sejt nem kap megfelelı növekedést serkentı stimulust a környezetébıl, nem lép tovább a G1 fázisból, apoptotizálhat. 2) a DNS károsodást ellenırzı pont jelen van a G1, S, és a G2 fázisokban is – gátolják a sejtciklusban való továbblépést, és/vagy apoptózist indukálnak 3) DNS replikációs ellenırzı pont a nem replikálódott DNS-eket, vagy a replikáció során megrekedt replikációs villákat érzékeli – sok tekintetben hasonló a DNS károsodást ellenırzı ponthoz, de stabilizálva a replikáció során megrekedt replikációs villákat, elısegítheti azok kijavítását (repair-ban való részvétel). 4) osztódási orsó összeszerelését ellenırzı pont, vagy metafázis checkpoint: a mitózis alatt késlelteti a kromoszómaszegregációt minaddig, míg minden egyes kromoszóma hozzá nem kapcsolódik az osztódási orsókhoz. A G1, S, és G2 fázis ellenırzıpontjai ugyanazt a stratégiát követik. A DNS károsodást érzékelık detektálják (ataxia-telangiectasia mutated (ATM), ataxia-telangiectasia és Rad9 related (ATR)) – transzducereket: ált. protein kinázokat (Chk1 és Chk2), esetleg transzkripciós faktorokat (p53) aktiválnak – gátolják a sejtciklusban való továbblépést a ciklin-dependens kinázok gátlásán keresztül + egyéb hatások (pl. apoptózis)

A sejtciklus szabályozása Schizosaccharomyces pombe hasadóélesztı sejtosztódásának tanulmányozása - cell division cycle-2+ (cdc2+) gén felismerése, ez szükséges a G1 → S és a G2 → M átlépéshez. A gén egy 34 kF proteinkinázt, a p34cdc2- kódol. Minden eukariótában – emberben több, mint 10 kölönbözı p34cdc2-homológ protein kináz – néhány vesz részt a sejtciklus szabályozásában – reguláló alegységük a ciklin – ciklin-dependens kinázok (Cdk) - p34cdc2 - Cdk1: G2 → M átmenet szabályozása állati sejtekben - Cdk2: G1 → S és G2 → M átmenet - Cdk4 és Cdk6: restrikciós pontokon való átmenet szabályozása - Cdk7: más Cdk-k aktiválása, részt vesz továbbá az RNs transkripcióban, a sérült DNS javításában - más Cdk: transzkripciós szabályzás, neuron difefrenciálódás, más Cdk-k helyettesítése Ciklinek: - kötıdésük szükséges a Cdk-k katalitikus aktivitásához - 35 kD - 130 kD proteinek, hasonló struktúra: 5-5 α-hélixbıl álló 2 szimmetrikus domén – az egyik a ciklin-box - emberben 16 ciklin

2

Ciklin-dependens kinázok aktivitásának szabályozása - szigorúan szabályzott - rövid N-terminális, hosszú C-terminális közti hasadékban: aktív hely - 4 aktiváló mechanizmus: • ciklin kötés – konformációváltozás, T hurok elmozdulás és foszforiláció – enzimaktivitás stimulálása • ATP-kötıhely közeli aminósav oldalláncok foszforilálása – gátló proteinek bekötıdése – enzimaktivitás gátlás • ciklin kötés csak részleges aktiválás, Cdk-aktiváló kináz (CAK): teljes aktiválás, foszforilálja a Cdk2-cyclin A T hurkot (foszforilálható treonin oldalláncról kapta a nevét). Gerincesekben CAK: Cdk7-cyclin H •Cdk1 és Cdk2 a ciklinen kívül a C-terminális doménjükön kötnek egy kis Cdc kináz alegységet is (Cks) – növeli a szubsztrát felismerés, és a Cdk-ciklin-Cks kináz által történı szubsztrát foszforilálás hatékonyságát. A Cks proteinek fontos szerepet játszanak ezen kívül a ciklin B és a Cdk gátló p27Kip1 lebontásában - 2 inaktiváló mechanizmus • G2: Myt1, Wee1 protein kinázok Cdk1-hez kötıdnek, befolyásolják az ATP kötést és hidrolízist – gátló foszforilálás (reverz hatás: Cdc25 foszfatázok) • Cdk kis inhibitoros alegység: ciklin-dependens kináz inhibitor (CKI – Cdk-ciklin A inaktiválás), Cdk4 inhibitor (INK4 Cdk4/6-ciklin D komplex gátlás - ATP-kötıhely zavarásával) család kötése. A Cdk inhibitoros fehérjék sejtciklus szabályzó szerepe fontos a G1 és G0 fázisban

G0 fázis - a többsejtő elılények legtöbb sejtje egy bizonyos feladat elvégzésére specializálódik, speciális szöveti struktúrát alkot és tovább nem osztódik – „kilép a sejtciklusból, G0 fázisba lép – nem nyugvó állapot, csak nem osztódik. - nem feltétlenül végleges )órák, hetek, élethosszig) bizonyos hatásokra visszaléphetnek a sejtciklusba – szigorúan szabályozott folyamatok, a kontrollálatlan szaporodás tumorképzıdéshez vezet - a szövetekben mind az osztódások helye, mind az üteme behatárolt – általában csak az eolpusztult sejtek pótlása; szöveti sérüléskor megemelkedhet az osztódási ráta

G0 fázisba való belépés - differenciálódást indító külsı hatásokra pl.: TGF-β – szerint/treonin kináz receptor – Smad transzkripciós faktor aktiválás – fokozza az Ink4 családba tartozó Cdk inhibitor p15Ink4b expresszióját – Cdk4-ciklin D és Cdk6-ciklin D komplex specifikus gátlása, ill a Cdk4-ciklin D-hez kötıdı CKI osztályba tartozó gátló peptideket leszorítva a kötésbıl lehetıvé válik azok Cdk2-ciklin E komplexhez való kötıdése, ami további sejtciklus-gátlást eredményez Kontakt gátlás: ha túl sok a szomszédos sejt, egészséges sejtek TGF-β-t termelnek, ami CKI inhibitor p27Kip1 peptiden keresztül felfüggeszti a sejtek sejtciklusát. Harántcsíkolt izomban: MyoD transzkripciós faktor az izomdifferenciálódás fı szabályzója - közvetlen környezeti hatások: pl mitogének hiánya – apoptózishoz, vagy G0 fázisba lépéshez vezet - túl sokszor osztódott sejt (fıleg sejttenyészetben), illetve kedvezıtlen környezet – „öregedési folyamat”

3

G0 fázisból való kilépés - külsı hatás: sérülés, vagy sejtpótlás (turnover) - tanulmányozás: sejttenyészeteken, pl.: fibroblaszt tenyészet – szérummentes tápoldatban: G0 fázis, szérum jelenlétében: gyors visszalépés a sejtciklusba – szövetsérülés modellje: a sérült sejtek közvetlen érintkeznek szérummal. Aktiválás hatására 3 expressziós hullám – aktivációs kapu – G1 fázisba való visszalépés szabályzó (restrikciós) pontja: az 1. több, mint „korai" gén átíródása miatt látható, úgymint: transzkripciós faktorok (Jun, fos, myc, cink ujj család) – számos a sejt növekedésében és osztódásában fontos gén átíródását szabályozzák; szöveti újrarendezıdést indító faktorok, citokinek (növekedési faktorok), extracelluláris mátrix komponensek (fibronektin), plazmamembrán receptorok (integrinek), citoszkeletális proteinek (aktin, tropomiozin, vimentin); angiogenezist, gyulladásos folyamatokat, véralvadást aktiváló anyagok – ezek elısegítik a fibroblasztok sérült területek felé vándorlását, a szövetkárosodás kijavító mechanizmusok beindulását. a 2. hullám a késıkorai gének átíródása, ami a sejtciklus S fázisába való lépést biztosítja a 3. hullám a késıi gének expressziója: S fázisába való belépés után, a sejt növekedéséhez, osztódásához szükséges proteinek, pl. ciklin D A 2. és 3. hullám az 1. fázisban átíródó géntermékek jelenlétét feltételezi.

A tumorképzıdés A daganatokban genetikailag módosult sejtklónok olyan sejtek populációit hozzák létre, amelyekre a kontrollálatlan növekedés jellemzı. A sejtek nem töltik be eredeti funkciójukat, végül halálhoz vezethetnek Bár a rákos megbetegedések aránya magas, az egyedben végbemenı sejtosztódások számához képest sejtszinten alacsonynak mondható. Oka: több genetikai módosulásnak kell általában egyszerre jelen lennie, hogy az egészséges sejt – daganatos sejt transzformáció végbemenjen, mivel a sejtciklus folyamatai olyan szigorúan szabályozottak. Több daganattípusban pont a szabályzó mechanizmus sérülése, vagy hiánya mutatható ki. Majdnem minden daganattípusnál a sejtosztódás zavara a G1 fázisban végbemenı szabályzó folyamatok zavarával hozható összefüggésbe. Kontakt gátlás: megfigyelhetı sejttenyészetekben: monolayert képzı sejtek, ha elérik a konfluenciát – kadherinek – osztódás gátlás A daganatos sejtek gyakran elvesztik ezt a kontrollt (mutáció, vagy daganatkeltı vírusok: papillomavírusok, adenovírusok, SV40 géntermékei miatt) és addig nınek, amíg van táplálék

Daganatos sejtek Két géncsalád aktivitásában van általában abnormalitás: - onkogének: sejtnövekedést és – osztódást szabályozó géntermékek, több, mint 100, állandó mitogén stimulációt utánozó hatás – szabályozatlan sejtosztódás. Pl.: Ras – MAP/ERK kináz kaszkád – ciklin D túltermelés, a humán daganatok 15%-ánál kimutatták a mutációját. A Ras nem megfelelı aktiválódása miatt a sejt azt hiszi, hogy állandó mitogén stimulus éri – állandó proliferáció. A restrikciós pont szabályozásában szereplı proteinek (E2F1, cyclin D (az emlıkarcinómák 50%-ában overexpresszált ), Cdk4) hiperaktivitása - tumor szuppresszor gének (Rb, p16): géntermékeik gátolják az onkogéneket Rb: restrikciós pont gátlása, mitogén stimulációig (defektes gén – gyerekben: retinoblasztóma, felnıttben: oszteoszarkóma) p16 gén mutációja gyakori daganatos sejtekben

4

İssejtek - embriogenezis során a megtermékenyített petesejt elsı osztódásaival a szervezet összes testi sejtjévé differenciálódni képes embrionális ıssejtek csoportja jön létre - az embrió különbözı szöveteit, szerveit hozzák létre. A sejtek egy másik csoportja az embrió táplálására, védelmére specializálódott egyéb szövetek kialakulásáért felel. - az embrionális ıssejtek pluripotensek: számos osztódás, differenciálódás után - bármely testi sejt kialakítására képesek - legtöbb kifejlett szövettípusban találhatók, ún. szöveti, vagy „felnıtt” ıssejtek (adult stem cell) – sejtpótlás, regeneráció - ıssejt: megtartja osztódóképességét; szimmetrikus és aszimetrikus sejtosztódás - a „felnıtt” ıssejtek osztódhatnak folyamatosan, pl.: epitheliális ıssejtek (bır, gyomor-bél traktus), vérképzı ıssejtek, növények merisztéma sejtjei; ill. lehetnek nyugvó állapotban, csak sérüléskor aktiválódnak, pl.: máj, vázizom, IR - nem aktiválódnak

Történeti háttér: 1981 - egér embrionális ıssejt deriválás 1998 - humán embrionális ıssejt (be nem ültetett in vitro megtermékenyített petesejtekbıl származó embriókból). 2006 - "újraprogramozott ıssejtek": specializált felnıtt egyedbıl származó testi sejtekbıl genetikai módosítással ıssejtek elıállítása: indukált pluripotens ıssejtek (IPSC). Az ıssejtek két fı csoportja - embrionális ıssejtek: korai embrionális fejlıdési stádiumban levı morula, vagy 4-5 napos blasztociszta (hólyagcsíra) belsı sejttömegébıl, az epiblasztból származó sejtekbıl továbbtenyésztett sejtek. Az összes sejttípus létrehozására képesek. Kísérletekhez: egér, vagy humán embrionális ıssejteket használnak - felnıtt egyedbıl származó ("adult") ıssejtek: differenciálatlan sejtek, melyek adott differenciált szövetekben fordulnak elı, aktiválódva osztódnak, önmagukhoz hasonló ıssejteket és progenitor sejteket képeznek, melyek az adott szövetben/szervben található sejttípusok irányába képesek differenciálódni, nem képesek a test bármely sejttípusát létrehozni. Viszonylag kis számban, helyenként fordulnak elı a kifejlett szervezetben. Gyakran nehéz ıket elkülöníteni, ill. azonosítani - alkalmazásuk nehézkes. Pl.: csontvelı, vér, szaruhártya, retina, agy, vázizom, máj, bır, gyomor-bél traktus, pankreász, köldökvér ıssejtjei.

Lehetnek: - szomatikus, vagy testi sejteket létrehozó - ivari sejteket létrehozó

5

Az ıssejtek differenciálódási potenciálja 1. totipotens ıssejteket: az összes (embrionális és extraembrionális) szövet és szerv létrehozására képes. Pl.: megtermékenyített petesejtet. 2. pluripotens ıssejteket: csökkent potenciával rendelkezı ıssejt, mely nem képes extraembrionális szövet létrehozására, de mind 3 csíralemez kialakítására és ivarsejtek képzésére is alkalmas. Pl: embrionális ıssejt. 3. multipotens ıssejteket: csökkent potenciával rendelkezı ıssejt, nem képes ivarsejt létrehozására, de bármely más sejttípus kifejlıdhet belıle. Ilyenek a szervezet szöveti ıssejtjei. 4. unipotens ıssejteket: csak 1 sejttípust képes elıállítani, de képes a megújulásra, ami megkülönbözteti a nem ıssejt testi sejtektıl (izom-ıssejtek)

Indukált pluripotens ıssejtek (iPSC) - genetikailag újraprogramozott, dedifferenciálódó kifejlett sejtek, - embrionális ıssejthez hasonló állapot – ıssejtmarkereket expresszálnak, embriogenezis korai szakaszában különbözı embrió-részeket hoznak létre, mindhárom csíralemez sejtjeit képesek osztódásaikkal elıállítani - de nem tudni, mennyire identikusak ESC-el Hasznosítás: gyógyszerfejlesztés, betegségek modellezése; ?transzplantáció? „reprogramming”: vírusok által a sejtbe juttatott újraprogramozó faktorok – daganatos elfajulás veszélye Kutatás-fejlesztés: nem vírus eredető célbajuttatás

Hematopoetikus ıssejtek - a csontvelı ıssejtjeinek felfedezése: sugérzéssal elölt csontvelejő egérbe (anémia, vérzés, gyulladás) egészséges egér csontvelejét injekciózva vérsejtképzést figyeltek meg. A transzplantált csontvelı prekurzor sejtjei osztódó sejtek kolóniáit hozták létre, melyek osztódva a vér összes sejtes elemévé differenciálódtak - csontvelıben nagyon kevés pluripotens hematopoetikus ıssejt van, a legtöbb G0 fázisban – alacsony metabolizmus, nyugalmi állapot – élettartam meghosszabbítás – stimulálásra: aszimmetrikus osztódás: pluripotens ıssejt + elkötelezett ıssejtek: kolóniaformáló sejtek - elkötelezett ıssejtek: kolóniaformáló sejtek – kolóniák létrehozása – valamely sejttípus (vvt, vérlemezke, granulociták, limfociták) létrehozásáért elkötelezett vonal – sejtfelszíni antitestek segítségével elkülöníthetık – transzplantálás - nagy számú, különbözı típusú és funkciójú vérsejt létrehozása: emberben másodpercenként 1 millió - a hemopoezis minden lépését, a proliferációt és a differenciálódást is citokinek (eritropoetin) és növekedési faktorok (Wnt, Notch, FGF: fibroblaszt növekedési faktor, IGF: inzuliszerő növekedési faktor) szabályozzák Eritropoetin – kinázzal kapcsolt receptor – citoplazmatikus transzkripciós faktorok aktiválása – proliferáció és differenciálódás szabályozása

A „felnıtt” ıssejtek (adult stem cell) - szimmetrikus és aszimmetrikus osztódás, attól függıen, hogy mire van szükség - speciális környezetre (stem cell niche) van szüksége, hogy fenntartsa ıssejt státuszát – szöveti sejtek és extracelluláris mátrix biztosítja. A niche sejt kihorgonyozza az ıssejtet, és biztosítja számára a szükséges sejtfelszínt, a sejtciklusát szabályzó jeltviteli mechanizmusokban szereplı proteineket. Egyes faktorok serkentik, mások gátolják az osztódást. A csontvelıben oszteoblaszt és endothél sejtek töltik be ezt a funkciót.

6

Epidermális ıssejtek - bır: állandóan megújuló szerv, nagy regenerációs kapacitással - multipotenciális és elkötelezett sejtek is részt vesznek a sejtpótlásban és a regenerációban: epidermis bazális részén – osztódó sejtek rétege – aszimmetikus sejtosztódás – bazális membrán felé nézı sejt marad ıssejt, a kifelé nézı sejt többszörös osztódás után több lépcsıben differenciálódik – a bır különbözı rétegeit hozza létre - multipotenciális ıssejtek a szörtüszık körül figyelhetık meg – a szörtüszı sejtjeit hozzák létre - mint a többi „felnıtt” ıssejt, relative nyugalmi állapotban van, csak a növekedési és difefrenciáló faktorok, illetve a környezet hatásai aktiválják

Vázizom ıssejtek - kis számú ıssejt a óriás sokmagvú izomrostok és a bazális membrán között helyezkednek el. - sérüléskor a nyugvó állapotban levı szatellitasejtek osztódni kezdenek – regeneráció - proliferációt és differenciálódást serkentı jelek receptor tirozin-kinázok - MAP kináz útvonal - gátló jelek miosztatinon (TGF-β család) keresztül – gátlása izomtömeg növekedést indukál. - az izom számos regenerációra képes, mert az ıssejt populáció regeneráció alatt megújítja magát, és/vagy a vér által a csontvelıbıl, egyéb szövetekbıl idekerülı ıssejtek

İssejtek az idegrendszerben (neural stem cell) IR – kicsi regenerációs képeség, - a kamrák körül egyes agyterületek tartalmaznak ıssejteket – kevés számú osztódásra képesek

Merisztéma ıssejtek - aszimmetrikus osztódás - gyökér- és hajtáscsúcsban

Daganat ıssejtek - proliferáló sejtek forrása – magyarázat arra, hogy a gyorsan osztódó daganatsejteket könnyő elpusztítani, daganatot mégsem lehet eliminálni a ritkábban osztódó daganat ıssejtek miatt

Az ıssejtek gyakorlati felhasználása Etikai gát - gyógyítás: egyedi terápia, génterápia, sérült szövetek, szervek pótlása, betegségek pl.: Parkinson, Alzheimer-kór, diabetes, szívizomelhalással járó kórképek, tumorok, gerincvelıi sérülések, sclerosis multiplex. - biotechnológiai ipar ígéretes területe a „tissue engineering”, a szövetek és szervek elıállítása ıssejtekbıl. Célja olyan szövetek elıállítása, melyek segítségével szívbillentyők, ízületek, porckorongok hozhatók létre, hogy aztán beültetve átvegyék a beteg szövetek, szervek funkcióját. - szerepük lehet a génterápiában: ıssejtben a hibás gének egészségesre való lecserélése – autológ transzplantáció: „javított” ıssejtek beültetése. - hatékonyabb felhasználása érdekében: új módszerek az ıssejtek mesterséges szaporíthatóságára - screening: új gyógyszerek, hatóanyagok hatásvizsgálata. - alapkutatás: - differenciálódás, - adott irányokba való elkötelezettség, - modellrendszerek kialakítása: - rákos sejtek burjánzása - egészséges sejtek osztódása - regeneráció, sejthalál, - születési rendellenességek hátterében álló folyamatok

7

A gyógyászatban alkalmazott ıssejt-források Három terápiában alkalmazott szöveti ıssejt-forrás a csontvelı, a perifériás vér és a köldökzsinórvér. - csontvelı: fıként vérképzı ıssejteket tartalmaz: vörösvértestek, fehérvérsejtek, vérlemezkék képzésére képes. A csontvelıi ıssejtek nyerése altatásban vagy gyakrabban spinális érzéstelenítésben, a hátsó csípıtövisekbıl, esetleg a szegycsontból történik. - perifériás vér: nagy dózisú, kolóniastimuláló-faktor (CSF) elıkezelés hatására a csontvelıbıl nagy mennyiségő ıssejt és elkötelezett elıdsejt (progenitor sejt) kerül a perifériás vérbe. A transzplantációra alkalmas ıssejtek győjtése a kezelést követıen a keringı vérbıl történik. - köldökzsinórvér: fájdalom – és kockázatmentes, közvetlenül az újszülött születését követıen a méhlepényben és a köldökzsinórban visszamaradt vér levétele, ami egyébként a szülés után orvosi hulladékként megsemmisítésre kerül, amennyiben nem rendelkeznek az abból kinyerhetı ıssejtek megırzésérıl. A köldökzsinórvérbıl az ıssejtek kiválaszthatók és életképesen megırizhetık, késıbbiekben bármikor felhasználhatók esetleges betegségek kezelése céljából. Azonban a magzati ıssejtek közvetlen befecskendezése után valamilyen jelre van szükség ahhoz, hogy éppen a megfelelı típusú sejtekké differenciálódjanak, és ne például tumorsejtekké A köldökzsinórvér-ıssejteket emberben elıször a csontvelı-elégtelenségben szenvedık kezelésére használták, mivel a köldökzsinórvér-ıssejtek könnyen alakulnak át csontvelıi sejtekké. Az ıssejtek jelenlegi gyakorlati alkalmazása: - elınyösebb a korábban szokásos, más emberbıl származó csontvelıvel végzett transzplantációknál. A köldökzsinórvér-ıssejtek ilyen célú hasznosítása is ritkábban okoz kilökıdést. Másrészt az eddigi tapasztalatok szerint a köldökzsinórvér-ıssejtek ilyen célú alkalmazása hatékonyabb a felnıttek csontvelı beültetésénél. Az ıssejteket a károsodott területre juttatva képesek arra, hogy a károsodott szöveteket regenerálja. A csontvelı rosszindulatú daganatos betegségeiben alkalmas a betegek kezelésére. Az olyan rosszindulatú daganatos betegségekben, amelyek sugárterápiát és/vagy citosztatikus (kemoterápia) kezelést igényelnek, a vérképzıszervek sejtjeinek is erısen károsodnak, a károsodott sejtek az ıssejtekbıl származó csontvelı beültetésével pótolhatók.

Megfelelı vizsgálati objektum kiválasztása - közös eredet miatt a sejtmőködés tanulmányozásához bármely szervezetbıl származó sejt használható, pl: osztódás, kromoszómaszerkezet, mutáció vizsgálata – (élesztı) gombák - speciális folyamatok, tulajdonságok vizsgálata – specializálódott sejtek, pl: kontraktilis fehérjék vizsgálata – izomsejtek, ostormozgás tanulmámyozása – Chlamydomonas fajok - „általánosabban használt”, jobban „feltérképezett” vizsgálati objektum – több ismeret, genetikai térkép, feltérképezett genom, ismert fiziológia, bevált vizsgálati módszerek Genetikai modellszervezetek organizmus

genom genom méret és gének homológ meiotikus biokémia ploidás szekvencia száma rekombináció rekombináció

Gram-negatív baktérium, Escherichia coli

4.6 Mb, haploid

+

4288

+

penészgomba Dictyostelium discoideum

34 Mb, haploid

-

kiváló

+

12,000

+

-

kiváló

sarjadzó élesztı 12.1 Mb, haploid Saccharomyces cerevisiae

+

6604

+

+

jó

hasadó élesztı Schizosaccharomyces pombe

14 Mb, haploid

+

4900

+

+

jó

Nematoda Caenorhabditis elegans

97 Mb, diploid

+

18,266

nehéz

+

szegényes

Drosophila melanogaster

180 Mb, diploid

+

13,338

nehéz

+

szegényes

lúdfő Arabidopsis thaliana

100 Mb, diploid

+

25,706

-

+

szegényes

Mus musculus

3000 Mb, diploid

+

25,000

+

jó

Homo sapiens

3000 Mb, diploid

+

25,000

+ +

+

jó

sejttenyészet

8

Modellszervezet - az ideális: teljesen szekvenált genom, ismert módszerek a tanulmányozásra és a manipulálásra, pl gén lecserélése homológ rekombinációval - a haploid szervezetek jól használhatók a mitótikus osztódás, és a mutációk vizsgálatára, a diploid életszakasszal is rendelkezık a meiozis, ill. a meiotikus rekombináció tanulmányozása, öröklıdés – sarjadzó és hasadó élesztık jó modellszervezetek ezekre a genetikai vizsgálatokra – sejtbiológiai alapkutatások – DE: egysejtő, speciális életciklussal – nem jó modellje a többsejtő élılények szövetei, szervei számára - többsejtő szervek szövetek mőködését modellezı szervezetek: gyümölcslégy, Nematoda férgek, egér, emberi sejtek tenyészetei. Fejlıdésbiológiai, szövettani vizsgálatok: Drosophila, Nematoda - gerinces modell: egér, patkány, pl. idegrendszeri kutatások; emlıs, humán sejttenyészetek - fiziológia - Arabidopsis: növénybiológiai vizsgálati objektum: kis genom, gyors reprodukciós ciklus, genetikai vizsgálatok - modellezni kívánt szervezet (általában humán) ↔ modell: elınyök ↔ hátrányok, mihez kell, élettartam humán más állat: emlıs más gerinces gerinctelen izolált szerv, szövet, sejt (tenyészetben) fenntartott szerv, szövet, differenciált sejt primer tenyészet: fibroblaszt, érendotélsejt, (valamilyen nyugvó, szöveti ıssejtbıl, vagy újraprogramozott szöveti sejtbıl) sejtvonal

Sejtizolálás szeparálással, pl. vérbıl mechanikailag enzimatikus emésztéssel: valamilyen proteolitikus enzimmel (kollagenáz, tripszin – extracelluláris mátrix bontása) kis szövetdarabok tápoldatba helyezése – a tenyészetben növeszthetı sejtek „kivándorolnak” a tápoldatba Az izolált sejteket primer sejteknek nevezzük – primer tenyészetek: kivéve a tumoros eredetőeket, általában limitált életidejőek, heterogén megjelenés, a sejtek csak meghatározott számú osztódásra képesek, azután differenciálódás, és/vagy öregedés – sejthalál Az immortalizált sejtvonalak korlátlan számú sejtosztódásra képesek, DE változnak: pl. mutációk Sejtvonalak sejtjeinek általános jellemzıi - kisebbek, lekerekítettek, nem tapadnak ki annyira, nagyobb a sejtmag/citoplazma arány - gyors növekedés, aneuploid kromoszómaszám - igénytelenebben: tápoldat és kiatapadás nem olyan fontos, szívesen nı szuszpenzióban - nagyobb sejtsőrőség, denzitás - fenotípusosan eltérnek a donortól - nem expresszálnak szövetspecifikus fehérjéket

9

Sejt szortírozás microbead preplating

Primer tenyészetbıl sejtvonal kialakítása - „tiszta” tenyészet létrehozása: sorozatos preplating” - sorozatos passzálásokkal klónok kialakításával, majd a klónok továbbpasszálásával – spontán transzformáció - akár embrionális szövetbıl, akár kifejlett egyedbıl indítható - transzgén onkogének segítségével – nem szükséges, mert az elıbbi jól mőködik - elınyök: tömegtermelés differenciálódás megakadályozása, proliferáció ha szükséges könnyen differenciáltatható proliferációs, és differenciálódási markerek anyagok hatásvizsgálata a proliferáció/differenciálódás folyamataira kereskedelmi forgalomban levı izom eredető sejtvonalak

10

Sejttenyészetek formái - kitapadva növı kultúrák: megfelelı felszínt igényelnek, gyakran extracelluláris mátrix proteinekkel bevonva: tenyészedény, mikrokarrier, 3D környezet – adhéziós szignál kell a növekedéshez, differenciálódáshoz. A 3D tenyészet közel áll a szöveti szervezıdéshez, de nehéz fenntartani, pl diffúziós korlátok miatt - szuszpenziós kultúrák Átmenet, pl. nagyobb mennyiség elıállítása miatt - mikrokarrier technika gömböcskék porózus mikrokarrier Sejtek eltávolítása: kelálás (EDTA), proteolitikus enzimek (tripszin), hipotóniás kezelés, hımérséklet, szonikálás - 3D háló, vagy rács struktúra

Sejttípusok a) megjelenés szerint: - epithélsejt-szerő: kitapadva nı, „kockakıszerő” megjelenés, alakja sokszög - limfoblaszt-szerő: nem tapad ki, szuszpenzió, lekerekedett - fibroblaszt-szerő: kitapadva nı, elnyúlt, bipoláris alak

A sejttenyészetek fenntartása Szöveti sejtek, utánozni kell a szöveti környezetet: hımérséklet, páratartalom, gázok, intersticiális folyadék – fiziológiás sóoldat pH táplálék, sejt építıkövei speciális kiegészítık: vitaminok, ásványi anyagok, hormonok, növekedési fakorok + kiegészítés: gyakran emlıs (FBS, FCS, HS) vérszérum - emlıs sejtek: 37°C, 5% CO2 – szigorúan szabályzott: CO2 inkubátor; pH, ionösszetétel, sók, glükóz, aminósavak, növekedési faktorok – tápoldat: függ a tenyészettıl, általánosan használt GMEM, EMEM,DMEM, sterilen elkészített, tárolás 4°C Védelem a fertızések ellen: sterilitás, antifungális szerek (amfotericin B), antibiotikumok (penicillin, streptomicin) - tápoldat csere: a sejtek metabolizmusuk során savanyítják a közeget - passzálás: szuszpenziós kultúráknál egyszerő, letapadva növıknél: általában tripszin-EDTA kezelés – felváló sejtek szétosztása; ált. 80-90% konfluenciánál - lefagyasztás

11

A sejtek lefagyasztása - tartalék - mosás PBS-el, Tripszin-EDTA – sejtek tápoldatban való felvétele – centrifugálás – tápoldat + 10% DMSO-ba (DMSO: jégkristályok képzıdése ellen véd + sejtmembrán rigiditását is csökkenti) való felvétel fagyasztáshoz – cryo-csı – -80 °C – folyékony nitrogén

Kiolvasztás - felolvasztás: 37 °C vízfürdı – (centrifugálás) – reszuszpendálás tápoldatban (általában magas szérumkoncentráció 20% FBS - mellett) – kitapadás ellenırzése 24 óra elteltével – oldatcsere, 20% FBS-el kiegészített tápoldat, míg a tenyészet be nem indul

Gyakran használt sejtvonalak Humán

Fıemlıs

MCF-7

emlıtumor

HL 60

leukémia

HEK-293

embrionális vese

HeLa

Henrietta Lacks méhnyakrák

Vero

afrikai zöldmajom veseepithélsejt

Cos-7

afrikai zöldmajom vese

Egyéb: CHO – (kínai) hörcsög ovárium, sf9, sf21 rovarsejtek

Sejtek életképességének ellenırzése Sejtszám meghatározása - tenyészetet reprezentáló minta vizsgálata – következtetés a teljes tenyészet állapotára A) direkt meghatározás 1) sejtszámolás mikroszkóp alatt – hemocitométer rácsozott terület: 3 X 3 X 0,1mm = 0,9 mm3 3 részre osztott: 1 X 1 X 0,1mm = 0,1 mm3 - a szélsı négyzetek: 4X4 négyzetre vannak továbbosztva: 0,25 X 0,25 X 0,1mm = 0.00625 mm3 - a középsı, kettıs vonalakkal határolt négyzetek 25 nagy négyzetre vannak osztva - oldalhossza 0,2 mm, területe 0,2 X 0,2 X 0,1 mm = 0,004 mm3. A kettıs vonalakkal határolt négyzetek sarkainál található kis négyzetek oldalhossza - 0,05 mm, térfogata 0,05 X 0,05 X 0,1 mm = 0,00025 mm3 - tripánkékes festés: élı sejt membránja nem permeábilis a festékre, csak az elpusztult sejtek festıdnek meg Az élı sejtek arányának meghatározésa: sejtszámolással: élı sejtek aránya % = a meg nem festıdött sejtek száma összsejtszám

X100

- használható sejtmagszámlálásra is 2) elektromos/mőszeres számlálás: áramlási, vagy flow citometer – sejttörmelék is, denzitometria 3) biomassza monitorozás: 4 platina elektróda – alacsony rádiófrekvenciával – intakt mb felveszi az elektromos töltéseket, apró kapacitások – kapacitásmérés – sejtdenzitás (bioreaktorokban) 4) metabolikus aktivitás mérés: NADH UV fényben fluoreszkál 5) képalkotó eljárással történı meghatározás: számítógéphez kapcsolt CCD kamera - mikroszkóp

12

B) indirekt meghatározás 1) minta protein tartalmának meghatározása: kolorimetriásan. Pl. Bradford assay – gyors, érzékeny, pontos, megbízható: sejtlizátum + Coomassie blue – szín 10 perc múlva – koloriméter, vagy spektrofotométer – standard proteinnel való összehasonlítás biomassza enzimaktivitás 2) minta DNS tartalmának meghatározása: DNS-hez kötıdı floureszcens festékkel, pl. Hoechst 33258, DAPI 3) tápoldat glükóz-tartalmának (fogyásának) meghatározása, vagy laktát-termelés, ill O2-fogyasztás mérése. pl.: glükózoxidáz assay (glükóz-oxidáz, peroxidáz, és festék – o-dianizidin hidroklorid – szines termék – kolorimetriás mérés), hexokináz assay (hexokináz, glükóz-6-foszfát deidrogenáz – NADH képzıdés)

Proliferáció – sejtpusztulás nyomonkövetése 1) festék felvétel: tripánkék, eritrozin B, nigrozin, fluoreszcein diacetát 2) tertrazólium assay: a celluláris oxidatív metabolizmust méri a tetrazólium festék MTT segítségével: NAD(P)Hdependens dehidrogenáz enzim hatására színes termék 3) kolónia formálás nyomonkövetése: a legpontosabb, alacsony koncentrációban szélesztve a sejteket egy sejt – egy kolónia, a kolóniák méretének növekedése jellemzi az adott sejt proliferációjának mértékét 4) LDH meghatározás: a sejt életképességének csökkenése – sejtmembrán integritásának romlása – sejtalkotó makromolekulák kijutása a sejtbıl – a tápoldat enzimaktivitásának mérése, pl. LDH: pirovát jelenlétében történı NADH oxidáció mérése spektrofotometriásan 5) intracelluláris energia változás: AMP – ADP – ATP szint mérése – kromatográfiása, vagy a luciferin-luciferáz enzim rendszerrel lumineszcenciaméréssel. ATP szint csökkenése: sejtfunkciók romlása 6) protein szintézis ráta: radioaktívan jelzett aminosavakkal

Apoptózis mérése 1) áramlás citometria 2) DNS gélelektroforézis: kis DNS fragmentek detektálása 3) fluoreszcens mikroszkópia: akridin narancs + propidium-jodid: az akridin-narancs membránpermeábilis, DNS-hez kapcsolódik, emisszió: zöld, a propidium-jodid csak a sérült sejtmembránon jut át, nukleinsavakkal kapcsolódik – piros – kettıs festıdés, kör alakú, kondenz kromatin állomány – nekrotikus sejt 4) annexin V-FITC: az apoptotikus sejtek elvesztik foszfolipid membrán aszimmetriájukat – foszfatidil-szerin a sejtfelszínre kerül, annexin V-FITC konjugátum erısen kötıdik a foszfatidil-szerinhez 5) TUNEL (TdT-mediált dUTP Nick End Labeling): DNS fragmentek 3’OH végének jelölése biotin-konjugált nukleotidokkal. A reakciót az exogén deoxinukleotidil terminális treanszferáz (TdT) katalizálja 6) rodamin (zöld) felvétel – funkcionálisan aktív mitokondriumok, propidium-jodid festés 7) kaszpáz-3 aktivitás mérése: apoptotikus marker cisztein-proteáz – monoklonális antitesttel való jelölés, fluoreszcens mikroszkópia „Cross-contamination” – keresztfertızés - sejtvonalak „összekeverednek” - sejtvonalak tisztaságának megırzése, ellenırzése: régen: sejtmorfológia mikroszkópos ellenırzése ma: kariotipizálás fajspecifikus antigén imunfluoreszcencia izoenzim analízis DNS „fingerprint”: restrikciós fragment hossz polimorfizmuson alapul, változó számú ismétlıdı egységek összehasonlítása PCR-alapú vizsgálatok: hipervariábilis DNS szekvenciák, (single) nukleotid polimorfizmus - sejtbankok

13

Sterilitás fenntartása - steril oldatok, steril környezet - steril fülke: lamináris, v horizontális és vertikális box. A legnagyobb biztonságú a vertikális, „biology safety” fülke – a kifúvott levegı HEPA filter szőrt.

- inkubátor, termosztát: rovarsejttenyészet: 25-30 °C , emlıssejtek: 37 °C, CO2 2-10% + 95% levegı – szöveti sejtek igényei + a bikarbonát puffer tápoldat pH-jának szabályozása miatt, 99% relatív páratartalom - tápoldatok, sejttenyésztésehez használt oldatok tartása 4 °C-on (hőtı, vagy hőtıszoba) - enzimek, szérumok, tápoldat összetevık: -20 °C - egyszer használatos tenyészedények: mőanyag flaskák (T25, T75), és petri-csészék - egyszer használatos és/vagy sterilezhetı eszközök: autokláv – mőanyag eszközök, hılégsterilizátor – üveg és fém eszközök - steril szőrık az oldatok elkészítéséhez

Sejttenyészetek manipulálása A tenyészet sejtjei addig nınek, míg van tápanyag és/vagy hely. A gyors növekedés problémája • a tápanyagok elfogynak a tápoldatból • megnı az apoptotikus/nekrotikus (elpusztult) sejtek száma • a közvetlen sejt-sejt kapcsolat kontakt gátlást okoz: sejtciklus nyugalmi G0 fázisába lépnek a sejtek, öregedés • a sejtsejt kapcsolat differenciálódást indíthat el Manipulálás: tápoldat változtatása, passzálás, transzfekció: idegen DND bejuttatása – fehérjetermék expressziója, vagy siRNS technika, vagy géncsendesítés: egyes gének átíródásának szabályozása. Sejtvonalak kialakítása Transzfekciós technikák „Mechanikai”: - lipid mediált lipofekció - elektroporáció - mikroinjektálás - kalcium-foszfát precipitáció: plazmid a kalciumfoszfáttal precipitálódik, a sejtek endocitózissal internalizálják: tranziens jellegő transzfekciós módszer: az idegen DNS gazdaseejt genomjába integrálódása nem biztosított - DEAE (dimethylaminoethyl)-dextran: kationos polimer, negatívan töltött DNS „lefedése” – endocitózis Vírus által közvetített: - adenovírus infekció - retrovírus infekció

14

Vírus – vektor által közvetített – transzfekció - primer sejtek általában ellenállnak a transzfekcióknak, kivéve a rekombináns vírus transzdukciót - adenoviralis és lentiviralis vectorok – sejttenyészetek immortalizálása, sejtvonalak kialakítása 1) Recombináns adenovírus vektorok - a leghatásosabb transzfekciós rendszer - az összes humán sejttípuson használható közel 100%-os hatásfokkal, kivéve a vér sejtes elemei, melyeken nem található adenovírus recepor - az adenoviralis vektorok nem integrálódnak a sejt genomjába – tranziens expresszió - a vektor a célsejtben széthullik, vagy sejtosztódáskor „felszívódik” – az expressziós szint függ az expresszió idıtartamától, és a sejtosztódás mértékétıl 2) Recombináns retrovírus vektorok - csak az aktívan osztódó sejteken alkalmazható, mert – sejtosztódás során a sejtmagmembrán szétesik, így a vírus DNS képes a gazdasejt DNS-éhez hozzáférni, beépülni a genomba – permanens, stabil expresszió. - korlátozott a használhatósága, kicsi a hatékonysága, különösen a ritkábban osztódó sejttípusoknál 3) Recombináns lentivírus vektorok - újabb, mind az osztódó, mind a nem osztódó sejteken alkalmazható, mert a lentivírusok aktívan képesek átjutni a sejtmagmemránon - beintegrálódik a gazdasejt genomjába, in vivo és in vitro is alkalmazható - hátránya: a beinzertálható génszakasz mérete limitált, kicsi: maximum 5.0 kb, de a transzfekció hatékonysága 3.0kb felett signifikánsan csökken

Adenovírus protokoll - adenovírus amplifikáció: gazdasejtben való felszaporítás megfelelı sejttípus felszaporítása, kb. 60-70% konfluenciáig adenovírus hozzáadása - inkubálás: akár 4-6 nap, míg a sejtek felválnak további vírusszaporításhoz – két lépcsı – párhuzamosan indított sejttenyészethez – vírus izolálás nélkül az elsı tenyészetbıl származó vírusokkal való továbbfertızés vírus izolálás: az összegyőjtött minta ismételt fagyasztása-felengedése, centrifugálás (2000 g, 10 perc) felülúszó - in vitro transzfekció, vagy tárolás 4°C néhány hétig, ill. –70°C Az adenovírus vektorok stabilan eltartható 4°C-on, vagy szobahımérsékleten (~25°C), a lentivírus és retrovírus vektorok kevésbé. Életképességet segíti, ha –70°C-on történı tároláskor 5% glicerolos mintát készítünk - adenovírus transzfekció: in vitro (sejttenyészet) felszaporított vírus: felülúszó, vagy tisztított adenovírus, in vivo csak tisztított vektor használható: sejt, sejttöredék, FBS, tápoldat -mentes célsejt tenyésztése: kb. 70% konfluenciaszint - vektor hozzáadása a tenyészethez, 1 óra inkubálás - mosás 48-72 óra múlva a transzdukció vizsgálható, pl.: Western blot, qPCR, szines (fluoreszcens) reporter gén alkalmazásával (fluoreszcens) mikroszkóppal Lentivírus és retrovírus protokoll - infekcióhoz általában valamilyen „segédanyag” használatos, pl.: a sejtmembrán felszíni töltéseit elfedı polikation (pl. Polybrene) – növeli a sejtmembrán és a víruskapszid kapcsolódási lehetıségét – nagy koncentrációban és/vagy hosszan alkalmazva toxikus lehet - ismételt transzfekció, hosszú 6-8 órás inkubálás lentivírus esetében, 24 órás inkubálás retrovírus esetében -72 óra elteltével passzálás, szelekció (rezisztencia alapján, pl.: Puromycin) - a túlélı sejtekbıl klónok - szelekciót követı 10-15 nap: az optimális klónok kiválasztása - sejtvonalak indítása

15

Sejttenyészetek felhasználása - „tömeggyártás” - fehérjetermékek elıállítása – biotechnológia: rekombináns DNS technológiával enzimek, hormonok, monoklonális antitestek, interleukinok, limfokinek, rákellenes szerek elıállítása - vannak amelyek elıállíthatók baktériumtenyészetekben is, de a komplex, glikozilált proteinek eukarióta sejtekben való elıállítást igényelnek pl: eritropoetin – állati sejttenyészetek Probléma: drága – egyéb utak: géntranszfer rovarsejtekbe, magasabbrendő növényekbe - szövettenyészet és szövetmérnökség: humán mesenchimális ıssejtek elıállítása, lefagyasztása - vakcinák, oltóanyagok elıállítása: himlı, gyermekparalízis, mumpsz, rubeola, kanyaró elleni védıoltások + influenza - gyógyszerfejlesztés - sejttoxicitás vizsgálat - rákkutatás - génterápia

Fehérjeexpressziós rendszerek 1) prokerióta expressziós rendszer - baktérium 2) eukarióta expressziós rendszer - élesztı - rovarsejt-bakulovírus expressziós rendszer - emlıs sejtek tranziens stabil indukálható

Baktérium és élesztı expressziós rendszerek gyakran bakteriális fehérje fúziós fehérjéjeként termeltetik Elınyei: ipari méretekben is egyszerően és olcsón használható, ismert genom, egyszerő technikák Hátrányai: poszt-transzlációs módosítás eltérısége miatt nem vagy csak kevéssé használhatóak humánban az elıállított termékek, tisztítás, patogén szennyezés

Rovarsejt-bakulovirus rendszer Elınyei - biztonságos: a bakulovírusok gazdaszervezet-specifikusak, gerincesekre, növényekre veszélytelenek. Általában csak egy gazdaszervezetet (faj) betegítenek meg – más rovarokra sem jelentenek veszélyt. Mivel a rovaresejtek önmagukban nem veszélyesek, és a transzfektálásuk során használt bakulovíus sem – alacsony biztonság. - a baculovírusok genetikailag hordoznak minden szükséges információt – nem szükséges más - könnyő a fehérjetermelést beállítani, ellenırizni: sok, különféle géntermék nagy mennyiségben való elıállítása. A rekombináns fehérjék nagy része vízoldékony – könnyő elkülönítés, tisztítás - nagy pontosságú: emlıssejtekhez hasonló poszt-transzlációs módosítás - a használt sejtek, sejtvonalak könnyen tartható szuszpenziós tenyészetben: bioreaktorokban történı termelés Hátrányai: viszonylag drága, specifikusabb körőlmények

Emlıs sejttenyészet, transzgénikus állat Elıny: jobb minıségő termék Hátrány: drága, ipari elıállítás nehézkes, vagy lehetetlen, tisztítás, patogenitás

16

Transzgén állat - vagy egy másik szervezetbıl számazó a saját genomjába beépült idegen DNS szakaszt hordoz - vagy a genom egyes szakaszai delécióval, vagy mutációval módosítottak - azért lettek létrehozva, hogy az adott genetikai változést szervezet szintjén lehessen vizsgálni, illetve az adott gén, vagy génszakasz egyedfejlıdésre kifejtett hatása tanulmányozható -elsı transzgén egér:1980 - funkció fokozás, illetve csökkenés, vagy funkcióvesztés - 3 technika: 1) mikroinjektálás: DNS bejuttatása közvetlenül egy sejt sejtmagjába spec esete: megtermékenyített petesejt pronukleuszába injektálás – (ál)terhes egér oviductusába juttatás – egyedfejlıdés. Elıny: természetes kromoszómajavítás mechanizmusával tökéletesebb beépülés, gyakran több kópiában egymás mellé fej-vég állásban; egy sejtbe bejuttatott DNS szakasz a szervezet összes testi sejtjében meg fog jelenni, különösen az ivarsejtekbe. Ha az egyedfejlıdés késıbbi szakaszában történik meg a mikroinjektálás – mozaikos megjelenés – nyomon követhetı, hogy mely sejtbıl, vagy sejtpulációból milyen szövetek, sejtek fejlıdnek

2) korai embrionális szakaszban rekombináns retrovírussal történı infekció. Elıny: 1 kópia, meghatározott helyre, hátrány: nem egyforma a transzfekció az összes sejten, alacsony hatékonyság, kis DNS fragmentek klónozhatók a retrovirális vektorba 3) embrionális ıssejtek használatával: izolálás, transzformálás, korai blasztociszta állapotba való bejuttatása – kimérák elıállítása – fenotípusos kiválogatás. Használható: irányított kromoszóma változtatások, pl.: specifikus gén mutációja. Hátrány: nehéz és költséges technika Gén-targetálás: génszakasz mutációja – pluripotens embrionális ıssejtbe történı transzfektálás – homológ rekombináció – blasztocisztába való beültetés – anyaállatban embriogenezis - kiméra, pl.: pontmutációk, null (knockout - KO) mutáció): génszakasz és/vagy a génszakasz expressziója hiányzik. Sokszor a homozigóta nem életképes – heterozigóták fenntartása – gyakran ezek nem „betegek”, fenotípusos jelleg nem jelenik meg, valószínőleg egyéb aktiválódó gének, külsı hatások „kompenzálnak” Az integráció helye is fontos - „csendes”, heterokromatikus régióba beépült génszakasz expressziója alacsony. Probléma kiküszöbölése: több egérvonalból kiválogatva a „legjobbat” - az endogén fehérjék expressziója ne sérüljön, vagy csökkenjen – fenotípus! Probléma kiküszöbölése: több egérvonal összehasonlítása fenotípusosan Egérvonalak továbbszaporítása Probléma: hibrid egértörzsnél az egyes egyedek nem lesznek identikusak – genetikai variabilitás. Megoldás: beltenyésztett egértörzsek kialakítása – hatékonyság alacsony Leggyakrabban használt beltenyésztett egértörzsek: C57BL/6, DBA/2, CBA/Ca, BALB/c Egyéb transzgén állatok - patkány

17

Használatuk: transzgén állatok növények létrehozása: GMO, illetve betegségek tanulmányozása, biofarmakonok (inzulin, növekedési hormon) elıállítása – alacsony hatékonyság (haszonállatoknál: kecske, birka, szarvasmarha, kevesebb, mint 5%) – transzgén állatok kifejlesztése hosszadalmas, drága, de még így is olcsóbb és veszélytelenebb, mint sejtekben elıállítani. Farmakon általában tejben Veszély: új zoonózisok, prionok

Klónozás Somatic cell nuclear transfer Hibridóma technika A monoklonális antitesteket leggyakrabban hibridómák segítségévek állítják elı. A módszer lényege, hogy a megfelelı antitestet termelı plazmasejtet fúzionálják egy mielóma (limfoid tumor) sejttel, és a keletkezı sejt optimális esetben egyesíti a plazmasejt antitest termelı tulajdonságát a daganatsejt korlátlan szaporodóképességével. Az egyesítés (fúzió) vegyszerekkel vagy elektromos térben történik. A hibridóma elıállítása során a plazmasejtek forrását képezı állatot immunizálják az antigénnel, s a lépébıl kinyert sejteket fúzionálják mielóma sejtekkel. Így rengeteg hibridóma vonalat nyernek, melyek közül az antigénhez megfelelı helyen és nagy affinitással kötıdı antitestet termelıt ki kell választani és tovább szaporítani.

Túlélı szelet technika - elsısorban idegsejtek, idegelemek vizsgálatára: projekciók megtartása - általában embrióban, pre- vagy posztnatal állatból: könnyebb preparálás (jégen) - agaróz gélbe ágyazás - vibratómmal vékony szeletek (jégen): 200-300 µm - megfelelı szelet kiválasztása, tenyésztıedénybe, polikarbonát membrán felszín, szérumtartalmú tápoldatban tartás inkubátorban 1-2 órát, agaróz eltávolítása, majd szérummentes tápoldatban továbbtartás 3-4 napig

Ko-kultúra - idegsejt, (izomsejt) tenyészet - coating: poly-D-lizin, laminin, zselatin - tápláló(támasztó) sejtek tenyésztése: sejtvonal, vagy izolált fibroblaszt, ill.glia primer tenyészet - tenyészteni kívánt sejtek preparálása, szélesztése a tápláló sejtrétegre - tápoldat:általában szérum jelenlétében, növekedési faktorokkal kiegészítve - általában rövid életidı, nem passzálható

3D technika - átmenet a klasszikus in vitro és in vivo technikák között - utánozza a szöveti struktúrát: sejtdenzitás polaritás sejt-sejt, sejt-mátrix kapcsolatok bazális membrán (összetevık) - tumorigenezis vizsgálata: egészséges epithél, carcinoma morfogenezis - oncogének, onkoproteinek, növekedési faktorok meghatározása, proliferáció, differenciálódás, túlélés, apiko-bazális polaritás, programmozott sejthalál - „real-time imaging, részletes struktúr analízis (konfokális mikroszkópia) - belsı és külsı paraméterek hatásvizsgálata

18

Organotípiás szövettenyésztés - izolált szervbıl vékony metszetek, szeletek készítése – porózus anyagon (pl. fémrács, grid) a levegı-tápoldat határfelületen tartás - sejt gömböcskék „spheroid” – (több 100 µm átmérı) – differenciálódás, szöveti struktúra - függıcsepp „hanging drop”, vagy keverıfalú „rotating-wall” tenyészet. A sejtek a gravitáció miatt cluster-ekbe tömörülnek - polarizált epitél sejttenyészet porózus membránon monollayerben - 3D polarizált tenyészet: mestersége extracelluláris mátrix - mesterséges bır: primer fibroblaszt tenyészet biológiailag lebomló hálóra szélesztve - néhány hét múlva keratinociták - mikrokarrier anyagok: dextrán, zselatin, glikózaminoglikán, vagy más polimerbıl golyócskák - agaróz hordozó: a sejt – ECM-gél ebbe ágyazódik - üvegkapillárisban, egy csepp folyékony agarózba ágyazott vizsgálati objektum skála: 1 mm. - GFP tagged aktin expresszált, kollagén I gél 3 napos 3D tenyészet, sejtmag piros, skála: 20 µm. ECM: extracelluláris mátrix; MDCK, Madin–Darby canine kidney; SPIM, single plane illumination microscopy.

Immortalizált sejtvonalak kialakítása - primer sejttenyészet sejtjei elıre meghatározott, kis számú osztódásra képesek – függ fajtól, a sejt típusától, tenyésztés körülményeitıl – nem osztódó stádiumba kerülnek a sejtek – nem osztódó, öregedı tenyészet: jellemzı sejtalak (általában megnagyobbodott sejtek, több sejtmag), génexpressziós mintázat (tumor szuppresszor proteinek: p53, RB, p16 aktivációja), metabolizmus (megnövekedett lizoszóma biogenezis, endogén β-galaktozidáz overexpresszió) - meghatározott számú osztódás – limitált sejtszám – rövid életidı – új tenyészetek indítása - immortalizált sejtek, vagy sejtvonalak: nagyszámú osztódás, nagy sejttömeg. Elvárás: primer sejtekhez hasonló genotípus, fenotípus - használható technikák: • vírus génszakasz beépítése a genomba, pl.: simian (majom) virus 40 (SV40) T antigén: a legegyszerőbb, leghatékonyabb módja az immortalizációnak • telomeráz reverz transzkriptáz (TERT) protein expresszió: azokon a sejteken hatásos, amelyekben fontos szerepe van a telomer hossznak (pl. human). A TERT protein a testi sejtekben inaktív állapotban van jelen, a vírus növeli az expresszió szintjét, ami elısegíti a megfelelı telomerhossz fenntartását – megelızi a tenyészet öregedését. Elıny: általában megmarad a primer sejtre jellemzı stabil genotípus, jellemzı fenotípusos markerek. Néhány sejttípusban azonban ezzel ellentétes folyamat: sejthalál pl.: epitélsejtekben. Megoldás: hTERT katalitikus alegységének és p53, vagy RB siRNS-nek a ko-expressziója: • Ras, vagy Myc overexpressziója egyes sejttípusokban hatásos sejtimmortalizációs mechanizmus • általában a vírusgének inaktiválják a megfertızött sejt tumor szuppresszor génjeit (p53, Rb, stb) – közvetlen immortalizáló hatás

19

A primer sejtek osztódási mintázat alapján két fı típusa: 1) 20-50 passzálást megélı sejtek: blaszt sejttípusok, pl.: fibroblastok, retinoblasztok 2) kevesebb, mint 10 passzálást tőrı, illetve nem passzálható tenyészetek: epithélsejtek 1) 20-50 passzálást megélı sejtek: hTERT vagy SV40 T antigén 2) SV40 T antigén, vagy a Rb, p53 siRNA és hTERT koexpressziója, illetve SV40 T antigén és hTERT koexpressziója a nehezen immortalizálható primer sejteknél használható, pl.: epitél sejtek cells. Az epitélsejtek esetében az epithelialis növekedési faktor (EGF) használható: 10-20 passzálással meghosszabbítja a sejttenyészetek életidejét Elıny: nem szükséges a szelektálás, mivel a technika önmaga „kiválogatja” az ostódó sejteket (túlnövik a nem osztódókat, illetve a nem immortalizált sejtek elpusztulnak

Citotoxicitás assay-k Direkt kontakt módszer - csaknem konfluens fibroblaszt tenyészet, friss oldatcsere + vizsgálandó anyag - inkubálás: 24 óra, 37 °C - mosás, fixálás, festés – elı sejtek arányának megállapítása Agar diffúziós módszer - csaknem konfluens fibroblaszt tenyészet, oldatcsere 2% agar oldatra, vitális festékkel - az agar megszilárdulása után a vizsgálandó anyagot az agar felszínére helyezzük - inkubálás: 24 óra, 37 °C - az élı sejtek festıdnek csak meg Oldószer módszer - csaknem konfluens fibroblaszt tenyészet, - vizsgálandó anyag oldása fiziológiás sóoldatba, vagy szérummentes tápoldatba - inkubálás: 48 óra, 37 °C - hisztokémia, vagy vitális festés

20

Sejtek vizsgálata - molekuláris biológiai módszerekkel PCR, qPCR Western blot enzimaktivitás - elektrofiziológiás módszerekkel patch clamp voltage clamp - képalkotó eljárások – mikroszkópi technikák fénymikroszkóp: átesı fény, festések polarizációs mikroszkóp fáziskontraszt mikroszkóp elektronmikroszkóp fluoreszcens mikroszkóp konfokális (fluoreszcens) mikroszkóp

Upright fénymikroszkóp: a kondenzor lencse a vizsgálati objektumra fókuszálja a fényt, az objektív lencse összegyőjti az objektumról visszaverıdı fényt, az okulár lencséje felnagyítja a képet és a szembe, vagy a kamerába vetíti a sugarakat. Inverz fénymikroszkóp. Fluorescens mikroszkóp: az objektív lencse kondenzor is egyben, a gerjesztı fényt a vizsgálati objektumra fókuszálja – a fluoreszcens festékmolekulákgerjesztıdnek – emittált fényt ugyanaz az objektív lencse győjti össze: egy fényútba helyezett dichroikus tükör osztja a fényt, elkülönítve a gerjesztı és a kibocsátott fényt, filterek segítségével csak egy bizonyos hullámhosszú fény jut a detektorhoz. Elektronmikroszkóp: elektromágneses lencsék helyettesítik a fénymikroszkópok üveglencséit. Fluoreszcens mikroszkópia - akár egy fluoreszcens festékmolekulát is érzékel - élı és fixált sejtek, szövetek - immunfluoreszcencia - lipid, protein, nukleinsav is jelölhetı, ion- membránpotenciál-szenzitív festékek - autofluoreszcencia: GFP Konfokális mikroszkópia - a lézerfény csak egy keskeny rése (pinhole) keresztül, x, y, z dimenziókban pontosan fókuszálva éri el a vizsgálati objektumot, majd jut vissza a detektorba - leképezés pontról-pontra - különbözı (z) síkokban történı leképezés után 3D rekonstrukció

21

Elektronmikroszkóp - nagy felbontóképesség: elvileg 0,3 nm alatt, de az elektronnyaláb károsítja a vizsgált objektumot – speciális preparálás Preparáló technikák: - régen: fixálás, mőanyagba ágyazás, mikrotómos szeletelés, nehézfém ionokkal való festés – felbontás: 3 nm – krioelektronmikroszkópia: speciális vizsgálati objektumoknál, pl: fehérjeszerkezet vizsgálatoknál: gyors fagyasztás, amorf, nem kristályos jégbe ágyazás (bakteriorodopszin, aquaporin, tubulin szerkezet) – 2D-ban, számítógépes módszerekkel 3D struktúra kiszámítható -fagyasztva töréses eljárás: fixálás nélkül Pásztázó elektronmikroszkóp: vastagabb vizsgálati objektumokhoz, képalkotás pontról pontra „letapogatja” a felszínt

22