MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie Oddělení fyziologie a imunologie živočichů
Screening přírodních látek s perspektivou využití v protinádorové terapii Diplomová práce
Kateřina Fischerová
VEDOUCÍ PRÁCE: Doc. MUDr. Iva Slaninová, Ph.D
BRNO 2015
Bibliografický záznam Autor:
Kateřina Fischerová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Screening přírodních látek s perspektivou využití v protinádorové terapii
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Speciální biologie
Vedoucí práce:
Doc. MUDr. Iva Slaninová, Ph.D
Akademický rok:
2014/2015
Počet stran:
97
Klíčová slova:
Izochinolinové alkaloidy; flavonoidy; antiproliferační aktivita; cytotoxicita; buněčný cyklus; P-glykoprotein; buněčná smrt; maligní melanom
Bibliographic Entry Author:
Kateřina Fischerová Faculty of Science, Masaryk Univerzity Department of Experimental Biology
Title of Thesis:
Screening of natural compounds with the prospect for use in anticancer therapy
Degree Programme:
Experimental Biology
Field of Study:
Special Biology
Supervisor:
Doc. MUDr. Iva Slaninová, Ph.D
Academic Year:
2014/2015
Number of Pages:
97
Keywords:
Isoquinoline alkaloids; flavonoids; antiproliferative activity; cytotoxicity; cell cycle; P-glycoprotein; cell death; malignant melanoma
Abstrakt Rostliny obsahují široké spektrum látek využitelných nejen v tradiční medicíně, ale některé látky izolované z rostlin jsou využívány i v terapii, včetně terapie nádorů. Jednou ze zajímavých skupin přírodních látek jsou kvartérní benzofenanthridinové alkaloidy. Tyto alkaloidy mají široké spektrum biologických účinků, jako jsou antibakteriální, antivirové, protizánětlivé i antiproliferační. Méně studovanými skupinami, které jsou v této práci popsané, jsou protoberberinové a pavinanové alkaloidy. Další rozsáhlou skupinou látek, přirozeně se vyskytující v rostlinách, která je rovněž součástí lidské stravy, jsou flavonoidy. U flavonoidů byla mimo jiné popsána i schopnost inhibovat P-glykoprotein, jeden z nejznámějších ABC transportérů, jejichž zvýšená exprese je zodpovědná za mnohočetnou lékovou rezistenci. Tato práce se zaměřuje na screening vybraných alkaloidů a flavonoidů, jejichž aktivita není dosud známá, z hlediska jejich antiproliferačního účinku a schopnosti inhibovat P-glykoprotein.
Abstract Plants contain a wide spectrum of substances used not only in traditional medicine, but also as drugs in western medicine, including cytostatics. One of the interesting group of natural products are quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids. These alkaloids have a wide spectrum of biological effects such as antibacterial, antiviral, anti-inflammatory and antiproliferative. Less studied groups, which are described in this thesis, are protoberberine and pavinane alkaloids. Flavonoids are another large group of substances naturally occurring in plants, which are also part of the human diet. For flavonoids besides other things was described the ability to inhibit P-glycoprotein, one of the best known ABC transporters, whose overexpression is responsible for multidrug resistance. This paper focuses on screening of selected alkaloids and flavonoids for their antiproliferative effects and ability to inhibit Pglycoprotein.
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala své školitelce doc. MUDr. Ivě Slaninové, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a hlavně ochotu při vypracování této diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat Mgr. Stjepanu Uldrijanovi, CSc. a Mgr. Gabriele Páchnikové za cenné připomínky a odbornou pomoc při řešení problematických situací. V neposlední řadě bych ráda poděkovala prof. RNDr. Evě Táborské, PharmDr. Kristýně Šebrlové za alkaloidy a doc. PharmDr. Karlu Šmejkalovi, Ph.D. za flavonoidy. Mé díky patří také paní Zuzaně Prokopové za její ochotu a pomoc při práci v laboratoři a celému kolektivu Laboratoře nádorové biologie, Biologického ústavu, LF MU za vytvoření příjemného pracovního prostředí. Děkuji také celé své rodině, zvláště pak svým rodičům, za jejich podporu po celou dobu studia. Práce byla podpořena projektem Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy (KONTAKTII LH12176).
Obsah 1. Úvod ..................................................................................................................................... 12 2. Přírodní látky ...................................................................................................................... 13 2.1. Z historie přírodních látek.............................................................................................. 13 2.2. Vlastnosti přírodních látek ............................................................................................. 14 2.3. Alkaloidy ....................................................................................................................... 15 2.3.1. Benzofenanthridinové alkaloidy ............................................................................. 15 2.3.1.1. Výskyt a struktura kvartérních benzofenanthridinových alkaloidů ................. 16 2.3.1.2. Biologická aktivita kvartérních benzofenanthridinových alkaloidů ................ 17 2.3.1.2.1. Antimikrobiální, antifungální a antivirové účinky ................................... 17 2.3.1.2.2. Protinádorové účinky................................................................................ 18 2.3.1.2.3. Interakce s buněčnými strukturami........................................................... 19 2.3.1.2.4. Fluorescenční vlastnosti ........................................................................... 19 2.3.2. Protoberberinové alkaloidy ..................................................................................... 20 2.3.2.1. Biologická aktivita protoberberinů .................................................................. 21 2.3.3. Pavinanové alkaloidy .............................................................................................. 22 2.4. Flavonoidy ..................................................................................................................... 24 2.4.1. Rozdělení flavonoidů .............................................................................................. 24 2.4.2. Nejvýznamnější zdroje flavonoidů.......................................................................... 25 2.4.3. Biologická aktivita flavonoidů ................................................................................ 26 2.4.3.1. Antibakteriální aktivita .................................................................................... 27 2.4.3.2. Protizánětlivé účinky ....................................................................................... 27 2.4.3.3. Cytotoxicita flavonoidů ................................................................................... 28 2.4.3.4. Antioxidační účinky ........................................................................................ 29 2.4.3.5. Protinádorové účinky....................................................................................... 29 2.4.3.6. Schopnost blokovat ABC transportéry ............................................................ 30 3. Cíle diplomové práce .......................................................................................................... 32 4. Materiál a metody ............................................................................................................... 33 4.1. Buněčné linie a kultivační podmínky ............................................................................ 33 4.2. Studované látky.............................................................................................................. 34 4.2.1. Alkaloidy ................................................................................................................. 34 4.2.2. Flavonoidy............................................................................................................... 35
9
4.3. Příprava buněk pro experimenty .................................................................................... 36 4.4. Testování cytotoxicity.................................................................................................... 37 4.4.1. Test metabolické aktivity (MTT) ............................................................................ 37 4.4.2. Test životaschopnosti buněk (PI exclusion assay) .................................................. 37 4.5. Příprava buněčných lyzátů, SDS-PAGE, Westernový přenos, detekce proteinů na membráně.............................................................................................................................. 39 4.5.1. Příprava buněčných lyzátů ...................................................................................... 39 4.5.2. Polyakrylamidová elektroforéza (SDS-PAGE)....................................................... 39 4.5.3. Westernový přenos .................................................................................................. 40 4.5.4. Imunodetekce proteinů na membráně ..................................................................... 41 4.6. Analýza buněčného cyklu .............................................................................................. 43 4.7. Test akumulace DOXO .................................................................................................. 43 4.8. Detekce apoptózy pomocí značení jader DAPI ............................................................. 44 4.9. Fluorescenční mikroskopie ............................................................................................ 45 4.10. Statistická analýza ........................................................................................................ 45 5. Výsledky .............................................................................................................................. 46 5.1. Stanovení cytotoxicty izochinolinových alkaloidů ........................................................ 46 5.1.1. Test metabolické aktivity ........................................................................................ 46 5.1.2. Test životaschopnosti buněk A-375 ........................................................................ 48 5.1.3. Účinek alkaloidů na různé typy buněčných linií ..................................................... 48 5.2. Mechanismus působení alkaloidů .................................................................................. 50 5.2.1. Vliv alkaloidů na buněčný cyklus ........................................................................... 50 5.2.2. Detekce apoptózy .................................................................................................... 52 5.2.3. Mechanismy indukce apoptózy ............................................................................... 53 5.2.4. Poškození DNA působením alkaloidů .................................................................... 54 5.2.5. Studium různých typů buněčné smrti ...................................................................... 55 5.3. Testování schopnosti alkaloidů inhibovat ABC transportéry ........................................ 56 5.4. Fluorescenční vlastnosti alkaloidů ................................................................................. 58 5.5. Stanovení cytotoxicity flavonoidů ................................................................................. 60 5.5.1. Test metabolické aktivity ........................................................................................ 60 5.5.2. Test životaschopnosti buněk A-375 ........................................................................ 62 5.5.3. Účinek flavonoidů na různé typy buněčných linií .................................................. 62 5.6. Mechanismus působení flavonoidů................................................................................ 64 5.6.1. Vliv flavonoidů na buněčný cyklus ......................................................................... 64 10
5.6.2. Detekce apoptózy .................................................................................................... 65 5.6.3. Mechanismy indukce apoptózy ............................................................................... 67 5.6.4. Poškození DNA působením flavonoidů .................................................................. 67 5.6.5. Studium různých typů buněčné smrti ...................................................................... 69 5.7. Testování schopnosti flavonoidů inhibovat ABC transportéry...................................... 70 6. Diskuze................................................................................................................................. 72 7. Závěr .................................................................................................................................... 77 8. Seznam použitých zkratek ................................................................................................. 78 9. Seznam použité literatury .................................................................................................. 82
11
1. Úvod Přírodní látky rostlinného původu mají široké spektrum účinků na lidský organismus a z tohoto důvodu jsou předmětem testování pro jejich využitelnost nejen v nádorové terapii, ale i v léčbě jiných nemocí. Velká část již používaných chemoterapeutik je založena právě na přírodních látkách. Stále však probíhá intenzivní výzkum protinádorových látek z nových rostlinných druhů a studuje se mechanismus jejich účinku. Rostliny jsou obrovskou zásobárnou těchto přírodních látek, mezi které patří i dvě velké skupiny – alkaloidy a flavonoidy, jimiž jsem se zabývala v diplomové práci. Alkaloidy jsou přírodní dusíkaté látky zásaditého charakteru, které vznikají jako produkty metabolismu aminokyselin. Většina z nich se tvoří v rostlinách, ale vzácně se vyskytují také v těle živočichů (hlavně obojživelníků) a hub. Význam alkaloidů pro rostliny není zatím jednoznačně objasněn, ale je zřejmé, že mají především ochrannou funkci proti býložravcům a parazitům. Flavonoidy jsou rozsáhlou skupinou rostlinných fenolů, které se nacházejí v ovoci, zelenině, v květech, čaji a jiných potravinách, které denně přijímáme. Jsou známé svými antioxidačními účinky, chrání buňky před toxickým působením škodlivých látek pocházejících z vnějšího prostředí, ale i proti těm, které se tvoří v těle. Diplomová práce je zaměřena na screening přírodních látek, konkrétně 10 alkaloidů a 7 flavonoidů, jejichž mechanismus působení na nádorové buňky nebyl dosud podrobně studován. Kromě antiproliferačního účinku byla testována i jejich schopnost ovlivnit akumulaci cytostatika (doxorubicinu) v nádorových buňkách inhibicí P-glykoproteinu (P-gp), členu velké rodiny transmembránových ATP-binding cassette (ABC) transportérů, které pumpují toto cytostatikum ven z buněk. To pak vede ke vzniku mnohočetné lékové rezistence (MDR), která je častou příčinou selhání chemoterapie při léčbě onkologických onemocnění. Pro testování přírodních látek jsme si vybrali buňky maligního melanomu, neboť jde o nádorové onemocnění s nejrychleji vzrůstající incidencí na světě. Melanom patří mezi nejzhoubnější nádory. Na rozdíl od jiných kožních nádorů začíná relativně brzo metastazovat. Nejvíce lidí ročně onemocní v zemích s velkou sluneční aktivitou, jako je Austrálie a Nový Zéland. Hledání nových látek, které by mohly pomoci při léčbě maligního melanomu, je důležitým cílem v oblasti výzkumu rakoviny.
12
2. Přírodní látky 2.1. Z historie přírodních látek Příroda, zejména rostliny, odedávna poskytují zdroj pro léčbu širokého spektra chorob. Počátkem 19. století pokrok ve vědě vedl k objevu čistých bioaktivních látek, které se označují jako přírodní produkty (NPs; z angl. natural products). Prvními příklady byly strychnin, morfin, atropin, chinin a kolchicin. Prvním přírodním produktem komerčně dodávaným firmou Merck byl morfin a prvním semisyntetickým lékem na bázi přírodního produktu dodávaným firmou Bayer byl aspirin. Zavedení těchto léků do praxe byl začátek nové éry v medicíně (Cragg et al., 2014). Dalším milníkem byl objev penicilinu Flemingem v roce 1929, který zahájil „zlatý věk antibiotik“ – období od 40. do 70. let 20. století. Tato etapa vedla k rozsáhlému výzkumu mikrobů, především farmaceutickými společnostmi, jako zdrojů nových antibiotik vedoucích k objevu nejen penicilinů, ale celé řady dalších antibakteriálních antibiotik, včetně cefalosporinů, tetracyklinů, aminoglykosidů, glykopeptidů, lipopeptidů a makrocyklických sloučenin (Cragg et Newman, 2013). Rostliny, jako zdroj nových léčivých látek, byly v době intenzivního výzkumu antibiotik z mikrobiálních zdrojů nadále zkoumány, přičemž důraz byl kladen především na hledání protinádorových léčiv (Grothaus et al., 2010). Na rozdíl od suchozemských rostlin, mořské organismy nebyly příliš významné pro tradiční medicínu. Až do poměrně nedávné doby jim nebyla věnována velká pozornost. V současnosti se nadějným zdrojem nových přírodních látek jeví právě oceány, neboť pokrývají více než 70 % zemského povrchu. Prvním protinádorovým lékem z mořských organismů byl trabektedin, který byl schválen pro komerční využití v roce 2007 (Newman et al., 2009; Molinski et al., 2009).
13
2.2. Vlastnosti přírodních látek Přírodní produkty hrají významnou roli ve vývoji protinádorových léčiv. Existuje nejméně 250 000 druhů rostlin a bylo zjištěno, že látky z více než 1 000 mají významné protirakovinné vlastnosti (Mukherjee et al., 2001). Avšak nevýhodou mnoha přírodních látek je jejich limitovaná rozpustnost ve vodných rozpouštědlech a velmi silná účinnost i na nenádorové buňky, což má za následek nízký terapeutický index a brání tak možnosti zavedení přírodních produktů do preklinických a klinických studií. Proto je třeba tyto látky chemicky upravit tak, aby vytvořily klinicky významné látky (Cragg et al., 2014). Podle nejnovějších kritérií uvedených v publikaci Newmana a Cragga 74,8 % molekul protinádorových léčiv jsou jiné než syntetické látky a z toho 48,6 % jsou buď přímo přírodní produkty, nebo látky z nich odvozené (Obr. 1). Přesto, že se zvyšuje množství přírodních produktů sloužících k chemoterapii, mnoho jich zbývá ještě prozkoumat, zvláště z mořských mikroorganismů (Newman et Cragg, 2012). Přírodní produkty byly a stále jsou neocenitelným zdrojem nových léků a léků vedoucích k léčbě mnoha onemocnění (Baker et al., 2007; Butler, 2008; Cragg et Newman, 2013).
Obr. 1: Podíl všech protinádorových léků od roku 1981 – 2010 (převzato z Newman et Cragg, 2012) „B“ – biologický produkt; „N“ – přírodní produkt; „NB“ – přírodní produkt botanický; „ND“ – odvozený z přírodního produktu; „S“ – zcela syntetický lék; „S*“ – lék vyrobený celkovou syntézou; „NM“ – látky napodobující přírodní produkt; „V“ – vakcína
14
2.3. Alkaloidy Termín „alkaloid“ byl zaveden kolem roku 1819 německým farmaceutikem Wilhelmem Meissnerem. Arabsko-řecké slovo al-kal-oid doslova znamená „jako zásada“ (z angl. alkali like). Alkaloidy jsou nízkomolekulární sekundární metabolity rostlin, které obvykle obsahují heterocyklickou strukturu. Obecným chemickým znakem alkaloidů je přítomnost nejméně jednoho atomu dusíku (Dostál et Slavík, 2000). Hlavní zájem o alkaloidy nastal z medicínského hlediska, neboť mnoho rostlin se používá jako léčivo již po tisíciletí právě díky účinku alkaloidů. Dalším důvodem zájmu o alkaloidy bylo určení jejich složité struktury a syntézy. Nakonec s příchodem izotopových sledovacích technik v časných 50. letech začali biochemici pátrat po metabolických drahách, kterými rostliny syntetizují své alkaloidy (Robinson, 1974). Velkou skupinou alkaloidů jsou izochinolinové alkaloidy. Tyto alkaloidy obsahují izochinolinovou skupinu a jsou odvozené od aminokyseliny tyrozinu, která je široce rozšířená v živých organismech. Do této skupiny patří např. benzofenanthridinové, protoberberinové a pavinanové alkaloidy, jimiž jsem se zabývala ve své práci (Bentley, 1998).
2.3.1. Benzofenanthridinové alkaloidy Benzofenanthridinové alkaloidy (BA) jsou jednou z nejrozmanitějších skupin izochinolinových alkaloidů. Jsou to přírodní produkty s významným antiproliferačním účinkem a se schopností indukovat apoptózu, a proto jsou považovány za látky slibné pro léčbu rakoviny. Přesný mechanismus jejich účinku však není znám. Nejintenzivněji studovanou skupinou jsou benzofenanthridiny s kvartérním atomem dusíku, které se nazývají kvartérní benzofenanthridinové alkaloidy (QBA) (Šimánek, 1985; Dostál et Slavík, 2002; Slaninová et al., 2014).
15
2.3.1.1. Výskyt a struktura kvartérních benzofenanthridinových alkaloidů QBA jsou poměrně malá skupina přírodních látek, které jsou nápadné svým výrazným zbarvením. Přirozeně se vyskytují v rostlinách a jsou běžně izolované z čeledi Fumariaceae (zemědýmovité), Papaveraceae (makovité), Ranunculaceae (pryskyřníkovité) a Rutaceae (routovité) (Obr. 2). Některé tyto alkaloidy mají široké spektrum biologických aktivit včetně antimykotických, antibakteriálních, protizánětlivých a antiproliferačních účinků (Dostál et Slavík, 2000; Slaninová et al., 2007b; Šimánek, 1985; Slaninová et al., 2014).
Obr. 2: Nejvýznamnější zdroje KBA: A) Chelidonium majus (vlaštovičník větší); B) Macleaya cordata (okecek srdčitý); C) Sanguinaria canadensis (krvavěnka kanadská); D) Dicranostigma lactucoides (převzato a upraveno z URL1–4)
Základem struktury QBA je N-methylbenzofenanthridinový kationt (Obr. 3). Skládá se ze čtyř aromatických kruhů, které mohou být různě substituované. Kombinace substituentů udávají, o který alkaloid se jedná. Přítomnost iminové vazby C=N+ je jednou z podmínek aktivity QBA, neboť jde o nejreaktivnější místo v molekule (Dostál et Slavík, 2002; Šimánek et al., 2003). QBA se v závislosti na pH vyskytují ve dvou základních formách. V kyselém prostředí převládá kvartérní neboli iminová (kationtová) forma (Obr. 3a), zatímco při vyšších hodnotách pH dochází k transformaci do pseudobáze neboli alkanolaminu (Obr. 3b). Tyto dvě formy se od sebe liší fyzikálně-chemickými vlastnostmi, vzhledem, výskytem, využitím v praxi a biologickou dostupností. Kvartérní kation alkaloidu je barevný a ve vodě rozpustný, zatímco vzniklý hydroxyadukt je bezbarvý a ve vodě nerozpustný. Rovnováha mezi těmito dvěma formami je reverzibilní (Dostál et Slavík, 2000; Slaninová et al., 2001).
16
Obr. 3: Struktura kvartérních benzofenthridinových alkaloidů: a) kvartérní neboli iminová (kationtová) forma, b) psedobáze neboli alkanolamin (převzato a upraveno ze Slaninová et al., 2001)
Nejznámější představitelé QBA jsou komerčně dostupné alkaloidy sanguinarin (SA) a chelerytrin (CHE). Jedná se o majoritní alkaloidy, které jsou extenzivně studovány díky jejich širokému spektru biologických aktivit. Minoritními alkaloidy jsou sanguilutin (SL), chelilutin (CHL), sanguirubin (SR), chelirubin (CHR) a makarpin (MA) a vzhledem k obtížné dostupnosti jsou studovány méně často (Slaninová et al., 2001; Slaninová et al., 2007b; Slunská et al., 2010; Hammerová et al., 2011, 2012).
2.3.1.2. Biologická aktivita kvartérních benzofenanthridinových alkaloidů Bylo prokázáno, že QBA vykazují různé biologické účinky, jako jsou antimikrobiální, antifugální, antivirové, protizánětlivé, antiproliferační a další. V nádorových buňkách QBA interagují s DNA (Sen et Maiti, 1994), indukují apoptózu (Slunská et al., 2010; Slaninová et al., 2007b), zastavují buněčný cyklus (Adhami et al., 2004), ovlivňují cytoskelet (Wolff et Knipling, 1993) a důležité členy signálních drah. Působí v koncentracích, které jsou srovnatelné s cytostatiky používanými v klinice. Ve své práci jsem se zabývala fagaroninem (FAG) a homochelidoninem (HOM), které patří do skupiny BA. O biologické aktivitě obou alkaloidů je známo velmi málo.
2.3.1.2.1. Antimikrobiální, antifungální a antivirové účinky Sušené stonky nebo kořeny ze stromu Fagara zanthoxyloides nazývané „žvýkací tyčinky“ jsou v mnohých částech Afriky a na Blízkém východě prostředkem ústní hygieny. Vodné extrakty z Fagara zanthoxyloides vykazují aktivitu proti bakteriím způsobujícím
17
paradentózu a jsou zodpovědné za nižší výskyt zubního kazu (Taiwo et al., 1999). Surové etanolové
extrakty
z Chelidonium
majus
vykazují
antimikrobiální
aktivitu
proti
mikroorganismům druhu Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus a Pseudomonas aeruginosa (Kokoška et al., 2002). U extraktů z Chelidonium majus byla také prokázána antifungální aktivita pro kmeny Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum canis a Aspergillus fumigatus (Walterová et al., 1995). Antivirový efekt vykazují alkaloidy extrahované z Chelidonium majus, které jsou účinné proti viru chřipky, encefalomyokarditidě, lidskému adenoviru typu 5 a 12, herpes simplex viru a proti viru dětské obrny (Colombo et Bosisio, 1996).
2.3.1.2.2. Protinádorové účinky Ideálním protinádorovým léčivem je látka, která zabíjí nádorové buňky a je neškodná pro zdravé buňky. Ahmad a kol. prokázali, že SA vykazuje výraznější cytotoxicitu na rakovinné buňky, než na normální, nenádorové buňky (Ahmad et al., 2000). Na druhé straně Debiton a kol. prokázali, že SA byl bez rozdílu toxický na normální i rakovinné buňky (Debiton et al., 2003). Také u SL a CHL byla pozorována vyšší rezistence nenádorových buněk na působení alkaloidů (Slunská et al., 2010). Citlivost buněk na alkaloidy především závisí na vlastnostech jednotlivých buněčných linií. Jedním z důležitých antiproliferačních mechanismů je indukce programované buněčné smrti (apoptózy). Neschopnost spustit buněčnou smrt může vést k vážným patologickým stavům, včetně rakoviny. Indukce apoptózy je hlavním mechanismem působení cytostatik. Slaninová a kol. testovali minoritní alkaloidy SR, CHR a MA a výsledky ukázaly, že vykazují silný antiproliferační a proapoptotický účinek (Slaninová et al., 2007b). Předpokládá se, že vysoká toxicita alkaloidů je způsobena jejich rychlým proniknutím do buněk. Může být ale také založena na schopnosti alkaloidů interagovat s SH skupinou proteinů (Vespalec et al., 2003). Proapoptotický účinek byl také prokázán u SA a CHE (Ahmad et al., 2000; Debiton et al., 2003; Yu et al., 2000; Yamamoto et al., 2001). Bylo prokázáno, že FAG má antileukemické vlastnosti, je silným induktorem diferenciace různých hematopoetických buněčných linií a indukuje akumulaci buněk v G2 a pozdní S-fázi (Comoë et al., 1988). Dále inhibuje aktivitu topoizomerázy I a II (Larsen et al., 1993). Oba enzymy představují důležité cíle pro vývoj nových protinádorových léků. Např. 18
topotekan a irinotekan, odvozené ze struktury přírodního alkaloidu kamptotecinu (CAMPT), jsou inhibitory topoizomerázy I (Bailly, 2000; Lerchen, 2002) a daunorubicin a doxorubicin (DOXO) jsou typickými příklady inhibitorů topoizomerázy II, které se v současné době používají v chemoterapii (Arcamone et al., 1997; Gewirtz, 1999).
2.3.1.2.3. Interakce s buněčnými strukturami V důsledku své chemické struktury jsou QBA schopny interagovat s různými buněčnými složkami, včetně DNA a RNA (Slaninová et al., 2007a; Urbanová et al., 2009). Interakce alkaloidů s nukleovými kyselinami jsou předmětem intenzivního výzkumu již desítky let (Maiti et Kumar, 2007). Bylo prokázáno, že QBA pouze v kvartérní (iminové) formě mají schopnost interagovat s DNA, ve formě pseudobáze se na DNA neváží (Sen et Maiti, 1994). Jejich interakce s DNA také závisí na obsahu bází a na sekvenci DNA, neboť bylo prokázáno, že alkaloidy vykazují vyšší vazebnou afinitu v místech bohatých na báze G-C než na A-T (Bai et al., 2006; Urbanová et al., 2009). Bylo zjištěno, že QBA také interagují s mikrotubuly. Wolff a Knipling ve své práci popsali, že alkaloidy chelidonin (CHLD), SA a CHE inhibovaly polymeraci tubulinu z mozkových buněk potkana v mikromolárním množství (Wolff et Knipling, 1993). Při vyšší koncentraci alkaloidů a delší době expozice došlo ke kompletní depolymerizaci tubulinu, v důsledku čehož nejsou chromozomy zachyceny mikrotubuly dělícího vřeténka v metafázi (Slaninová et al., 2001; Panzer et al., 2001). Interakce s mikrotubuly u běžných cytostatik (např. vinblastin a vinkristin) má za následek zástavu buněčného cyklu v G2/M fázi (Jordan et al., 1991). Nekontrolovaná buněčná proliferace je charakteristickým znakem rakoviny a blokáda buněčného cyklu je považována za účinnou strategii k eliminaci rakovinných buněk.
2.3.1.2.4. Fluorescenční vlastnosti QBA jsou nápadné svým výrazným zbarvením a vykazují fluorescenční vlastnosti, které jsou výhodné pro pozorování interakcí alkaloidů s buněčnými strukturami. Jejich barevnost se pohybuje v rozsahu spekter od žluté po červenou. Chromofory odpovědné za barevnost
jsou
kondenzovaná
aromatická
jádra
s elektron-donorovými
substituenty
obsahujícími kyslík (Kovář et al., 1985; Slaninová et al., 2001; Slaninová et al., 2007a; Urbanová et al., 2009). 19
Fluorescence QBA závisí na tom, v jaké strukturní formě se v daném prostředí nacházejí, neboť schopnost BA penetrovat buněčnou membránou je ovlivněna možností tvořit nepolární pseudobáze (Slaninová et al., 2001; Urbanová et al., 2009). Kombinace vlastnosti fluorescence a schopnosti vázat se na buněčné struktury otevírá otázku využitelnosti alkaloidů jako specifických fluorescenčních sond vhodných pro fluorescenční mikroskopii a průtokovou cytometrii. Tyto sondy by umožnily pozorování struktury jádra a jadérka a rozlišení jaderných buněk od bezjaderných. Bylo zjištěno, že MA, CHR a SA rychle pronikají do buněk, ihned se váží na nukleové kyseliny, a tak lze provést okamžité měření (Slaninová et al., 2007a).
2.3.2. Protoberberinové alkaloidy Protoberberinové alkaloidy (PA) jsou další skupinou izochinolinových alkaloidů. Většina se vyskytuje v rostlinách buď jako tetrahydroprotoberberiny nebo jako kvartérní protoberberinové soli (Obr. 4). Kvartérní protoberberinové alkaloidy (QPA) představují přibližně 25 % ze všech dosud známých alkaloidů, které byly izolované z přírodních zdrojů a mají protoberberinový skelet (Grycová et al., 2007).
Obr. 4: Struktura kvartérních protoberberinových alkaloidů (převzato z Grycová et al., 2007)
Protoberberiny jsou distribuovány v rostlinách čeledi Papaveraceae (makovité), Berberidaceae
(dřišťálovité),
Fumariaceae
(zemědýmovité),
Menispermaceae
(lunoplodovité), Ranunculaceae (pryskyřníkovité), Rutaceae (routovité), Annonaceae (láhevníkovité) a několik příkladů se vyskytuje v
Magnoliaceae (šácholanovité) a
Convolvulaceae (svlačcovité) (Obr. 5) (Bentley, 1999–2006). Kvantitativní a kvalitativní rozdíly obsahu alkaloidů v rostlinách jsou ovlivněny několika faktory, např. klimatem, životním prostředím a složením půdy.
20
Obr. 5: Nejvýznamnější zástupci PA: A) Berberis aristata (dřišťál osinatý); B) Coptis chinensis (koptis čínský) (převzato a upraveno z URL5–6)
QPA jsou pevné látky vyznačující se jasnými barvami, které se pohybují od žluté po oranžovou (Grycová et al., 2007). Nejznámější zástupci této skupiny jsou berberin (BER), koptisin, palmatin (PAL), jatrorrhizin (JAT) a kolumbamin (COL).
2.3.2.1. Biologická aktivita protoberberinů Protoberberinové alkaloidy představují velmi zajímavou a významnou skupinu přírodních produktů se širokým spektrem biologických a farmakologických aktivit, které zahrnují inhibici syntézy DNA, biosyntézu bílkovin, inhibici membránové propustnosti a rozpojení oxidativní fosforylace. Tyto procesy mohou přispívat k toxickým účinkům na bakterie, plísně, viry, hmyz a obratlovce a zprostředkovávají tak chemickou obranu rostlin produkujících tyto alkaloidy (Schmeller et al., 1997). Nejběžnějším PA je BER, proto se také většina studií zabývá právě tímto alkaloidem (Grycová et al., 2007). Některé protoberberiny vykazují také antimikrobiální (Slobodníková et al., 2004; Iwasa et al., 1998b), antimalariální (Vennerstrom et Klayman, 1988; Iwasa et al., 1998a), fungicidní a herbicidní (Iwasa et al., 2000), protizánětlivé (Ivanovska et Philipov, 1996) a antidiabetické účinky (Leng et al., 2004). Pravděpodobně nejdůležitější a nejčastěji testovanou vlastností QPA je cytotoxicita. Cytotoxická aktivita je především důsledkem apoptózy a inhibice telomerázy. Schopnost cytotoxických PA působit jako inhibitory topoizomerázy I a II souvisí s jejich protinádorovou aktivitou, kdy vazba na DNA je velmi důležitá (Colombo et al., 2001; Orfila et al., 2000; Li et al., 2000). Bylo prokázáno, že BER vykazuje silnou vazbu na DNA (Li et al., 1998).
21
Při srovnání inhibičních a protinádorových vlastností některých PA a BA studie ukázaly, že účinky BA byly výraznější (Sethi, 1985). Důvodem může být pravděpodobně to, že na rozdíl od BA, protoberberiny nemají tendenci tvořit nepolární pseudobáze a do buněk pronikají v kvartérní formě a pouze v malém množství (Slaninová et al., 2001). Ve své práci jsem se zabývala minoritními protoberberiny COL, korypalminem (CRP), korysaminem (CRS), escholidinem (ESD), JAT a PAL. O biologické aktivitě těchto alkaloidů není známo mnoho informací. COL má inhibiční účinek na proliferaci a neovaskularizaci metastatických buněk osteosarkomu s velmi nízkou toxicitou. Studie Bao a kol. také prokázala, že indukuje zastavení buněčného cyklu v G2/M fázi. COL je tedy studován jako potenciální kandidát pro léčbu osteosarkomu (Bao et al., 2012). CRP je významný tím, že už v nízkých koncentracích (200 ppm) má antimykotické vlastnosti (Maurya et al., 2002). O JAT bylo prokázáno, že má antibakteriální, antimykotické a antiparazitární vlastnosti (Ingrid et Kurt, 1968). COL a JAT také snižují hladinu glukózy v krvi (Chen et al., 2012), vykazují antiplasmodiální aktivitu (Wright et al., 2000), antioxidační účinky a působí jako inhibitory lipoxygenázy (Misík et al., 1995). PAL vykazuje významnou protinádorovou aktivitu proti leukemickým buňkám a má schopnost interagovat s DNA (Kuo et al., 1995; Bhadra et al., 2007). V dalších studiích bylo prokázáno, že má antimikrobiální (Schmeller et al., 1997) a antihyperglykemické účinky (Chen et al., 2012) a používá se jako fluorescenční sonda DNA a RNA (Li et al., 2009; Islam et al., 2009; Hirakawa et al., 2005). Extrakty obsahující COL a PAL vykazují protizánětlivý a antinociceptivní účinek (Liu X. et al., 2010).
2.3.3. Pavinanové alkaloidy Pavinany se vyskytují ve čtyřech rostlinných čeledích – Papaveraceae (makovité), Berberidaceae (dřišťálovité), Lauraceae (vavřínovité) a Ranunculaceae (pryskyřníkovité). V rámci Papaveraceae se jedná rody Argemone a Eschscholtzia, u Berberidaceae o rody Berberis a Leontice, ve kterých se známé pavinany vyskytují. Z čeledi Lauraceae obsahuje pavinany pouze rod Cryptocarya a v rámci Ranunculaceae jde o rod Thalictrum (Gözler et al., 1983)
22
Obr. 6: Eschscholzia californica (sluncovka kalifornská) (převzato z URL7)
Alkaloidy
pavinanového
typu
jsou
nejvíce
zastoupenou
skupinou
rostliny
Eschscholzia californica (Obr. 6). Dominantní a unikátní složkou je silně polární kvartérní báze kalifornidin (CAL), který se vyskytuje v kořenech i nadzemních částech rostlin kromě květů a vyznačuje se sedativním a anxiolytickým účinkem. Hojně zastoupená je i terciární nefenolická báze escholtzin (ESL) (nazývaný též kalifornin), který se nachází pouze v nadzemních částech rostlin především v květech (Slavík et Slavíková, 1986; Sturm et Stuppner, 1998; Guédon et al., 1990; Rolland et al., 1991). Těmito dvěma hlavními alkaloidy nacházející se v Eschscholtzia californica jsem se zabývala ve své práci. V menší míře se v rostlině nacházejí terciární alkaloidy karyachin a neokaryachin, které byly izolované z rostliny Cryptocarya chinensis, O-metylkaryachin, N-metylescholcidin a argemonin (Lee et al., 1990; Cahlíková et al., 2010; Stermitz et McMurtrey, 1969).
23
2.4. Flavonoidy Flavonoidy, patřící mezi fenolové sloučeniny, jsou syntetizovány z fenylalaninu a jsou přítomné v zelených buňkách rostlin. Jsou zodpovědné za zbarvení listů, zejména na podzim. Přirozeně se vyskytují v ovoci, zelenině, ořechách, semenech a květech rostlin, kůře stromů a jsou nedílnou součástí lidské stravy. Základní struktura flavonoidů se skládá ze dvou benzenových jader (A a B), které jsou spojeny prostřednictvím heterocyklického pyronového kruhu C uprostřed (Obr. 7). Ve struktuře flavonoidů je fenylová skupina substituována v poloze 2 pyronového kruhu, substitucí do polohy 3 vznikají isoflavonoidy (Middleton et al., 2000).
2.4.1. Rozdělení flavonoidů Bylo identifikováno již tisíce flavonoidů v rámci hlavních flavonoidových tříd, mezi které patří flavony, flavonoly, flavanony, antokyany, isoflavonoidy a flavany (Obr. 7).
Obr. 7: Chemické struktury nejčastějších tříd flavonoidů (převzato a upraveno ze Šmejkal, 2014)
Flavony se nejčastěji nachází v čeledích Moraceae a Fabaceae a bývají izolovány ze zrn a bylin. Mohou přispívat k barvě rostlinné tkáně v případě, že se vyskytují ve vysokých koncentracích nebo jsou v komplexech s kovovými ionty. Flavonoly se nacházejí v mnoha rostlinách používaných jako potraviny. Flavanony se vyskytují převážně v citrusových plodech a je známo, že přispívají k jejich chuti (Peterson et Dwyer, 1998). 24
Isoflavonoidy jsou rozdílná třída flavonoidů známá pro svou estrogenní aktivitu. Strukturálně se liší od běžných flavonoidů polohou aromatického kruhu B. Nacházejí se převážně v luštěninách. Antokyany produkují modré a červené zbarvení bobulového ovoce, přičemž barva je závislá na pH. Množství antokyanů se zvyšuje s tím, jak ovoce dozrává. Flavany se nacházejí v ovoci a v černém a zeleném čaji (Peterson et Dwyer, 1998). Flavonoidy se dále rozdělují na jednoduché neprenylované, C-prenylované, Cgeranylované flavonoidy a jejich glykosidy. Některé flavonoidy mohou mít postranní řetězce dále modifikovány hydroxylací, methoxylací, oxidací, cyklizací a redukcí (Schneiderová et Šmejkal, 2014). Ve své práci jsem se zabývala celkem sedmi flavonoidy, kterými jsou 3´-Omethyldiplakon (F1), 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakon (F2), mimulon (F3), acteosid (F4), 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon (F5), 3´-O-methyldiplakol (F6) a kudraflavon B (F7). Prvních šest flavonoidů se řadí mezi geranylované a pouze kudraflavon B je prenylovaným flavonoidem.
2.4.2. Nejvýznamnější zdroje flavonoidů Bohatým zdrojem prenylovaných a geranylovaných flavonoidů je Paulownia tomentosa (paulovnie plstnatá; Obr. 9). P. tomentosa patřící do čeledi Paulowniaceae (paulovniovité; dříve Scrophulariaceae) je bohatým zdrojem biologicky aktivních sekundárních metabolitů. Extrakty z této rostliny se používají v tradiční čínské medicíně. Extrakty z plodů, listů a dřeva jsou používány ke zmírnění zánětu průdušek, především zmírněním kašle a snížením frekvence astmatických záchvatů (Zhu et al., 1986). Také se používá k léčbě zánětu spojivek, úplavice, enteritidy, streptokokové infekce, kapavky, hemeroidů, příušnic a zánětu mandlí (Schneiderová et Šmejkal, 2014). Vodné extrakty z plodů a listů podporují zdravý růst vlasů a stimulují vlasovou pokožku. Extrakty z plodů vykazují hypotenzní účinek a extrakty ze dřeva jsou používány k léčbě některých bakteriálních infekcí (Zhu et al., 1986). Pravděpodobně největší počet prenylovaných flavonoidů lze nalézt v čeledi Moraceae (morušovníkovité) (Barron et Ibrahim, 1996). Rostliny pravděpodobně využívají prenylované flavonoidy k ochraně proti patogenním mikroorganismům a dalším škůdcům, působí proti
25
abiotickému stresu způsobenému životním prostředím, jako je oxidační stres nebo vysoušení (Yazaki et al., 2009). Prenylované flavonoidy se nejčastěji nacházejí v kořenech nebo kůře, ale byly také nalezeny v nadzemních částech rostlin, v pupenech, semenech nebo plodech (Barron et Ibrahim, 1996). Kořeny Morus alba (moruše bílá; Obr. 8) jsou v tradiční medicíně používány pro své diuretické, antidiabetické, antipyretické účinky a proti kašli. Z těchto důvodů byla tato rostlina intenzivně studována.
Obr. 8: Nejvýznamnější zdroje flavonoidů: A) Paulownia tomentosa (paulovnie plstnatá); B) Morus alba (moruše bílá) (převzato a upraveno z URL8–9)
2.4.3. Biologická aktivita flavonoidů Široké spektrum biologických účinků flavonoidů se různí a je často modifikováno přítomností rozdílných substituentů na základním fenolovém skeletu. Pozornost je v současné době zaměřena na prenylované skupiny flavonoidů. Prenylované fenoly vykazují řadu biologických
účinků,
včetně
antioxidačních,
protizánětlivých,
antimikrobiálních
a
estrogenních (Yazaki et al., 2009). Kromě toho byly také objeveny protinádorové a cytotoxické vlastnosti prenylovaných flavonoidů. Roste ale i zájem o geranylované flavonoidy vzhledem k jejich možným biologickým účinkům při léčbě rakoviny a jejich antibakteriálním účinkům (Šmejkal, 2014).
26
2.4.3.1. Antibakteriální aktivita Bylo prokázáno, že extrakty z plodů P. tomentosa vykazují antibakteriální aktivitu (Kang et al., 1994). Některé studie uvádějí vyšší účinnost proti gram-pozitivním (G+) než proti gram-negativním (G-) bakteriím (Tsuchiya et Iinuma, 2000). To bylo prokázáno i u Cgeranylovaných flavonoidů izolovaných z P. tomentosa, které vykazují určitou míru antibakteriální aktivity proti Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus a Staphylococcus epidermidis. Avšak žádná ze sloučenin neinhibuje růst G- bakterií, jako jsou Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa a Salmonella enteritidis, nebo růst kvasinek druhu Candida albicans. To je pravděpodobně způsobeno lipofilním charakterem testovaných flavonoidů způsobené přítomností geranyl postranního řetězce. Odolnost G- bakterií je patrně způsobena složitější strukturou a hydrofilní povahou buněčných stěn. Některé experimenty se S. aureus také prokázaly, že OH5 skupina zvyšuje aktivitu flavonoidů, zatímco přítomnost methoxy skupiny snižuje potenciál inhibovat růst bakterií. Bylo také zjištěno, že substituce lipofilní skupiny v poloze 6 nebo 8 zvyšuje antibakteriální aktivitu (Šmejkal et al., 2008b). Navíc substituce geranyl postranního řetězce s karbonylovými, hydroxylovými nebo methoxylovými skupinami inhibují růst bakterií. Úroveň aktivity flavonoidů se liší v závislosti na jejich struktuře i použitém bakteriálním kmeni (Navrátilová et al., 2013).
2.4.3.2. Protizánětlivé účinky Flavonoidy jsou běžně studovány i pro jejich protizánětlivé účinky. První zmínka o protizánětlivé aktivitě geranylovaných flavonoidů byla popsána ve studii Hošek a kol. z roku 2010. Bylo zjištěno, že působení flavonoidu diplakonu na lidské makrofágy snížilo regulaci exprese prozánětlivých cytokinů – tumor nekrotizujícího faktoru α (TNFα) a monocytového chemotaktického proteinu 1 a zvýšilo regulaci exprese protizánětlivého proteinu. Působení diplakonu bylo srovnáváno s protizánětlivým lékem indometacinem a jeho účinek byl velmi podobný (Hošek et al., 2010). Snížení exprese a produkce TNFα bylo popsáno i u jiných flavonoidů (Lin et al., 2003; Geraets et al., 2009). Dále bylo prokázáno, že i kudraflavon B je silným inhibitorem mediátorů zánětu a také inhibitorem enzymů cyklooxygenázy 1 a 2, které jsou uvolňovány při zánětlivé reakci, blokací translokace jaderného faktoru NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) z cytoplazmy do jádra. Kudraflavon B
27
byl dokonce účinnější než klinicky používaný protizánětlivý lék indometacin (Pahl, 1999; Hošek et al., 2011). U některých flavonoidů rovněž izolovaných z M. alba nebyly prokázány takové výsledky jako u kudraflavonu B, ale všechny látky snižovaly expresi genů, které jsou pod transkripční kontrolou NF-κB. V důsledku toho bylo zjištěno, že jen relativně malé rozdíly ve struktuře testovaných látek (přítomnost 2,3 dvojné vazby, přítomnost a poloha prenyl a geranyl postranních řetězců nebo substituce na B kruhu) silně ovlivňují aktivitu a hrají roli v konečném účinku sloučeniny (Kollar et al., 2013). Flavonoidy byly také testovány pro léčbu chronického zánětlivého onemocnění ulcerózní kolitidy in vivo na potkanech. Podání testovaných sloučenin před i po indukci kolitidy zmírnilo její symptomy (průjem a přítomnost krve ve stolici) a zpozdilo jejich nástup. Účinek flavonoidů byl vyšší než u sulfasalazinu, léku používaného v léčbě zánětlivého střevního onemocnění (Vochyánová et al., 2015). Flavonoidy by tudíž mohly být slibné látky pro léčbu zánětlivých onemocnění, ale jsou zapotřebí další analýzy a in vivo testy pro lepší pochopení přesných mechanismů jejich účinku.
2.4.3.3. Cytotoxicita flavonoidů Cytotoxická aktivita flavonoidů závisí především na metylaci a hydroxylaci skeletu a na typu postranního řetězce. Bylo zjištěno, že nejsilnější cytotoxický účinek vykazují flavanony s 2´-OH substitucí (Shen et al., 2004). Oproti tomu přítomnost hydroxylové skupiny v poloze 3 snižuje cytotoxicitu flavanonů (Šmejkal et al., 2008a). Také bylo prokázáno, že ortho-dihydroxy substituce na kruhu B zvyšuje cytotoxický účinek a 4´methoxy substituce jej snižuje (Šmejkal et al., 2007). Cytotoxický účinek flavonoidů může také ovlivnit modifikace prenyl nebo geranyl postranního řetězce. Bylo zjištěno, že geranylované deriváty vykazují výrazně vyšší cytotoxicitu proti nádorovým buněčným liniím než odpovídající jednoduché flavanony. To naznačuje, že přítomnost geranyl postranního řetězce je zásadním předpokladem pro cytotoxický účinek flavanonů. Navíc sloučeniny, které mají C-geranylový postranní řetězec připojený ke kruhu B ve struktuře flavanonů, vykazují nižší cytotoxicitu než ty se stejným řetězcem připojeným ke kruhu A. Je však důležité zdůraznit, že cytotoxický účinek flavonoidů se může lišit v závislosti na použité buněčné linii (Šmejkal et al., 2010).
28
2.4.3.4. Antioxidační účinky V nedávných letech flavonoidy vyvolaly obrovský zájem jako možná léčiva proti nemocem zprostředkovaným volnými radikály, neboť jsou vynikajícími látkami pro jejich vychytávání (Soobrattee et al., 2005). Je zajímavé, že ani geranylový postranní řetězec, ani jeho substituce neovlivňují antioxidační aktivitu flavonoidů. Důležitější je prostorové uspořádání substituce na skeletu flavanonů (Chen et al., 2002). Flavonoidy izolované z plodů P. tomentosa vykazují významnou antiradikálovou aktivitu. Látky byly porovnány s rutinem a morinem jako známými antioxidačními sloučeninami. Nejvyšší aktivita byla pozorována u sloučenin s ortho-dihydroxy substitucí na kruhu B. Naopak účinek sloučenin s methoxylovou a para hydroxylovou skupinou byl mnohem nižší. 3-OH substituce významně neměnila antioxidační účinky, podobně jako hydroxy substituce geranyl postranního řetězce. Je tedy zřejmé, že plody P. tomentosa mohou poskytovat účinné zdroje přírodních antioxidačních látek (Šmejkal et al., 2007; Asai et al., 2008; Zima et al., 2010). Testované flavonoidy vyskytující se na povrchu plodů P. tomentosa také pravděpodobně slouží jako ochrana proti UV záření (Šmejkal et al., 2007). U flavonoidů izolovaných z propolisu bylo prokázáno, že také poloha prenylové nebo geranylové skupiny hraje významnou roli v antioxidační aktivitě, neboť sloučeniny s geranylovou skupinou na kruhu A byly účinnější než se skupinou umístěnou na kruhu B (Kumazawa et al., 2007).
2.4.3.5. Protinádorové účinky Některé studie poukazují na flavonoidy, zvláště prenylované flavonoidy, jako potenciální protinádorové sloučeniny v závislosti na typu skeletu a modifikaci substituentů (Li et al., 2007). Bylo zjištěno, že prenylované flavonoidy izolované z Taiwanského propolisu indukují apoptózu u lidských melanomových buněk (Chen et al., 2004). Některé studie také uvádějí, že bioaktivní látky izolované z M. alba mají silné antiproliferační účinky a jsou induktory apoptózy u leukemických buněčných linií (Kollar et al., 2013; Kikuchi et al., 2010). Následně bylo prokázáno, že kudraflavon B způsobuje akumulaci buněk v G1 fázi buněčného cyklu a inhibuje jejich vstup do S fáze. Tato aktivita nebyla pozorována u nenádorových buněčných linií (Kollar et al., 2013). Také u flavonoidu acteosidu dochází k zástavě buněk v G1 fázi buněčného cyklu prostřednictvím snížení regulace cyklin
29
dependentních kináz, což dále vede k inhibici proliferace a indukci diferenciace do linie monocytů/makrofágů (Lee et al., 2007). Několik autorů poukázalo na možné účinky flavonoidů, obsažených v potravinách, v prevenci rakoviny, což ukazuje, že flavonoidy mohou být nejen cytotoxické sloučeniny, ale i chemoprotektivní činidla (Liu H. L. et al., 2010; Androutsopoulos et al., 2010). Nicméně je zapotřebí přesně objasnit biologický mechanismus působení, účinnost a toxicitu testovaných flavonoidů. Objasnění vztahu mezi strukturou a aktivitou je velmi důležité pro jejich další celkovou syntézu a uvedení do lékařské praxe (Šmejkal, 2014).
2.4.3.6. Schopnost blokovat ABC transportéry Schopnost nádorových buněk být rezistentní vůči protinádorovým lékům se označuje jako mnohočetná léková rezistence. Zvýšená exprese ABC transportérů je zodpovědná za většinu případů MDR, která je jednou z hlavních příčin selhání chemoterapie. Nejznámějším ABC transportérem je P-glykoprotein, který způsobuje transport xenobiotik, včetně cytostatik, ven z buněk. Možností, jak překonat tuto rezistenci, je současné podávání látek vykazující nízkou toxicitu a schopnost inhibovat ABC transportéry (Filipits, 2004; Yu et al., 2007; Ozben, 2006). U některých flavonoidů již interakce s ABC transportéry byly studovány. Jsou rovněž známé některé mechanismy, kterými mohou flavonoidy ABC transportéry inhibovat. Jednou z možností je inhibice ATPázy (např. genistein a quercetin), dále mohou působit jako substráty pro ABC transportéry (např. quercetin, kaempferol, isorhemnetin). Transportem flavonoidů tak může být inhibována přeprava jiných látek (Alvarez et al., 2010). Některé studie již prokázaly, že flavonoidy mají inhibiční účinky na transport látek zprostředkovaný P-gp. Di Pietro a kol. testovali účinek flavonoidů na intracelulární akumulaci daunomycinu v leukemických buňkách nadměrně exprimující P-gp. Zjistili, že prenylace flavonoidů zvyšuje jak jejich afinitu pro P-gp, tak jejich účinek na akumulaci daunomycinu (Di Pietro et al., 2002). Ji a He prokázali, že isoflavon CJY způsobuje značné zvýšení akumulace rhodaminu 123 a DOXO v buňkách nadměrně exprimujících P-gp (Ji et He, 2007). Také diosmin, flavonoid obsažený v citrusových plodech, výrazně zvýšil akumulaci rhodaminu 123 v lidských střevních buňkách (Yoo et al., 2007). Kromě P-gp mohou flavonoidy vykazovat
30
inhibiční účinek i na další ABC transportéry, jako jsou např. MRP2 (Schrickx et al., 2006; van Zanden et al., 2007) a BCRP (Imai et al., 2004; Zhang et al., 2005).
31
3. Cíle diplomové práce Diplomová práce je zaměřena na screening přírodních látek patřících do dvou skupin – alkaloidů a flavonoidů. Celkem bylo studováno 10 alkaloidů ze tří různých skupin izochinolinových alkaloidů a 7 flavonoidů, které se rozdělují na dva typy podle substituce postranního řetězce – prenylované a geranylované. Vzhledem k tomu, že se jedná o látky, o jejichž biologické aktivitě je málo známo, bylo hlavním předmětem této práce vytipovat látky, které by mohly být vhodnými kandidáty pro podrobnější studium z hlediska protinádorové aktivity. Dílčími cíli diplomové práce bylo:
Testování antiproliferační aktivity alkaloidů a flavonoidů na buněčných liniích lidského melanomu.
Stanovení toxicity vybraných látek na různé nádorové buněčné linie a porovnání jejich aktivity s nenádorovými buňkami.
Testování schopnosti blokovat ABC transportéry, které jsou jednou z hlavních příčin rezistence nádorových buněk na chemoterapii.
Podrobnější studium mechanismu účinku u aktivních látek, např. mechanismu indukce buněčné smrti (apoptóza, nekroptóza, autofagie) a vlivu testovaných sloučenin na buněčný cyklus.
32
4. Materiál a metody 4.1. Buněčné linie a kultivační podmínky V experimentech uvedených v této práci byly použity následující buněčné linie: A-375 (lidský maligní melanom), HL-60/MDR (rezistentní lidská promyeloidní leukémie), IPC-298 (lidský maligní melanom), HFF-1 (lidské předkožkové fibroblasty). Linie A-375 a IPC-298 byly získány z ECAC (European Collection of Animal Culture, Salisbury, Velká Británie), rezistentní linie HL-60/MDR nadměrně exprimující P-gp byla odvozena z linie HL-60 (lidská promyeloidní leukémie) v laboratoři prof. Sarkadi (Budapešť, Maďarsko) a linie HFF-1 byla získána z ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, USA). Buněčné linie A-375 a IPC-298 byly kultivovány v médiu RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium; Invitrogen), linie HL-60/MDR a HFF-1 v médiu DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Hy-Clone). Obě kultivační média byla doplněna o 10 % bovinního fetálního séra (Gibco), 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin a 100 μg/ml streptomycin (vše od PAA Laboratories, Pasching, Austria). Kultivační médium pro buněčnou linii HFF-1 obsahovalo všechny výše zmíněné látky, ale bylo doplněno o 20 % bovinního fetálního séra. Kultivace probíhala ve sterilním prostředí v termostatu při 37 °C, 5% obsahu CO2 a vysoké vzdušné vlhkosti. Při pasážování adherentních linií (A-375, IPC-298, HFF-1) bylo nejprve odsáto staré médium, buňky byly 1x (u HFF-1 4x) opláchnuty roztokem PBS a následně inkubovány 2 – 5 minut v roztoku Trypsinu s EDTA (Hy-Clone). Po uvolnění buněk z podkladu byl trypsin inaktivován přidáním média. Část suspenze byla přenesena na misku a naředěna čerstvým médiem. U linie HFF-1 musela být miska pokrytá tenkým filmem z 0,1% želatiny (Difco Laboratories, Detroit, USA), na které byly buňky přichycené. U suspenzní linie HL-60/MDR byla pouze část suspenze přenesena do kultivační lahvičky a naředěna čerstvým médiem. Pasážování bylo prováděno při cca 90% konfluenci buněk, většinou 2x – 3x týdně.
33
4.2. Studované látky 4.2.1. Alkaloidy Všechny studované alkaloidy byly získány od prof. RNDr. Evy Táborské, CSc. a PharmDr. Kristýny Šebrlové z Biochemického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně. FAG byl izolován z rostliny Fagara zanthoxyloides (Messmer et al., 1972), HOM z Chelidonium majus (Slavík, 1955), CRP a CRS z Corydalis cava (Slavík et Slavíková, 1979), ESD z Hunnemannia fumariaefolia SWEET (Slavík et al., 1980), PAL z Corydalis solida (L.) SW (Slavík et al., 1985), JAT z Berberis vulgaris L. (Slavík et Slavíková, 1995), COL z Bocconia frutescens L. (Slavík et Slavíková, 1975), ESL a CAL z Eschscholtzia californica (Obr. 9) (Slavík et Slavíková, 1986). Zásobní roztok každého alkaloidu byl připraven rozpuštěním 1 mg látky v 50 μl dimethylsulfoxidu (DMSO) a uchován při teplotě -20 °C. Kromě neovlivněných buněk také DMSO v experimentech sloužil jako kontrola.
palmatin
fagaronin
korypalmin
homochelidonin
jatrorrhizine
kolumbamin 34
korysamin
escholidin
kalifornidin
escholtzin
Obr. 9: Chemická struktura alkaloidů (převzato a upraveno z Li et al., 2009; Rivaud et al., 2012; URL10–15)
4.2.2. Flavonoidy Flavonoidy byly získány od doc. PharmDr. Karla Šmejkala, Ph.D. z Veterinární a Farmaceutické fakulty Masarykovy univerzity v Brně. Z plodů Paulownia tomentosa Steud. byly
izolovány
tyto
flavonoidy:
3´-O-methyldiplakon
(F1),
3´-O-methyl-5´-O-
hydroxydiplakon (F2), mimulon (F3), acteosid (F4), 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon (F5) a 3´-O-methyldiplakol (F6) (Obr. 10) (Šmejkal et al., 2007, 2008b; Jiang et al., 2004). Rostlina byla sbírána v oblasti Veterinární a farmaceutické fakulty v Brně během října 2004. Kudraflavon B (F7) byl izolován z kořenů Morus alba L. (Obr. 10) (Hošek et al., 2011). Zásobní roztok každého flavonoidu byl připraven rozpuštěním 1 mg látky v 50 μl DMSO a uchován při teplotě -20 °C. Rovněž u flavonoidů DMSO v experimentech sloužil jako kontrola.
35
3´-O-methyldiplakon 3´-O-methyl-5´-hydroxydiplakon mimulon 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon 3´-O-methyldiplakol
R1 H H H H OH
R2 OMe OMe H OMe OMe
R3 OH OH OH OH OH
R4 H OH H OMe H
acteosid
kudraflavon B Obr. 10: Chemická struktura flavonoidů (převzato a upraveno z Schneiderová et Šmejkal, 2014; Argyropoulou et al., 2013; Hošek et al., 2011)
4.3. Příprava buněk pro experimenty Buňky byly opláchnuty 1x PBS a ztrypsinizovány. Po uvolnění buněk od podkladu byly přeneseny do zkumavky s čerstvým médiem a centrifugovány 5 minut/1100 rpm/20 °C. Poté bylo médium odsáto a přidáno nové. Buněčná suspenze byla smíchána s trypanovou modří v koncentraci 1:1 a byla spočítána hustota buněk pomocí Bürkerovy komůrky.
36
Následně byly buňky naředěné příslušným kultivačním médiem, v dané koncentraci byly přeneseny na kultivační desky a inkubovány při standardních kultivačních podmínkách.
4.4. Testování cytotoxicity 4.4.1. Test metabolické aktivity (MTT) MTT test je založen na jednoduché kolorimetrické reakci používané pro měření antiproliferační aktivity studovaných látek. Na mitochondriálních membránách metabolicky aktivních buněk dochází díky mitochondriálním dehydrogenázám k redukci žluté tetrazoliové soli MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid]; Sigma-Aldrich) na modrý, ve vodě nerozpustný formazan, který se rozpustí přidáním organického rozpouštědla (např. DMSO). Výsledná optická denzita se následně měří spektrofotometricky. Buňky byly nasazeny na 96-jamkové desky (Nunc A/S, Rockilde, Dánsko), do každé jamky bylo napipetováno 200 μl buněčné suspenze o koncentraci 104 buněk/ml a inkubováno 24 hodin. Následující den bylo médium odsáto a nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím testované látky o určité koncentraci. Po 48 hodinách byl proveden vlastní MTT test. Bylo odsáto médium, do každé jamky bylo napipetováno 200 μl kultivačního média obsahujícího MTT ve výsledné koncentraci 445 μg/ml a inkubováno 4 hodiny v termostatu. Poté byla směs odsáta
a
nahrazena
DMSO,
jež
rozpouští
formazanový
produkt.
Pomocí
spektrofotometrického readeru DTX 880, Multimode Detector (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) byla odečtena absorbance vzorků při vlnové délce 570 nm. Antiproliferační efekt byl vyjádřen jako hodnota IC50 (hodnota koncentrace testované látky, která má za následek 50% inhibici metabolické aktivity vzhledem k neovlivněné kontrole). Každá koncentrace studovaných látek byla testována ve čtyřech opakováních a jednotlivé experimenty pro danou koncentraci byly provedeny jednou.
4.4.2. Test životaschopnosti buněk (PI exclusion assay) Test životaschopnosti buněk je založen na schopnosti živých buněk vyloučit fluorescenční barvivo propidium jodid (PI; Sigma Aldrich), zatímco mrtvé buňky s porušenou cytoplazmatickou membránou tuto schopnost nemají.
37
Buňky byly nasazeny na 24-jamkové desky (Orange Scientific, Braine-l’ Alleud, Belgie). Do každé jamky bylo napipetováno 500 μl buněčné suspenze o koncentraci 5*104 buněk/ml a buňky byly kultivovány 24 hodin při standardních kultivačních podmínkách. Druhý den bylo médium odsáto a nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím testované látky či kombinaci látky s daným inhibitorem. Po 48 hodinách inkubace s testovanými látkami byl obsah jamek přenesen do zkumavek uložených na ledu. Jamky na destičce byly promyty nahřátým PBS a ztrypsinizovány. Vše bylo staženo do zkumavek a zcentrifugováno. Poté byl odsát supernatant a k peletu bylo přidáno 300 μl studeného PBS. Těsně před měřením na cytometru byl ke vzorkům přidán 1 μl PI (zásobní roztok 1 mg/ml PBS). Po 1 minutě inkubace v přítomnosti PI byl počet mrtvých buněk kvantifikován pomocí průtokového cytometru Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) v kanálu FL3, při emisní vlnové délce 620 nm. Počet analyzovaných buněk u každého vzorku byl 10 000. Každá koncentrace vzorku byla měřena ve třech opakováních a jednotlivé experimenty byly opakovány minimálně třikrát. Test životaschopnosti buněk byl použit k následujícím testům: Test cytotoxicity alkaloidů a flavonoidů – buněčné linie A-375, IPC-298 a HFF-1 byly 48 hodin kultivovány s alkaloidy: CRS (30, 40 a 60 μg/ml), ESL (30, 60 a 70 μg/ml), FAG (30 a 50 μg/ml), HOM (30, 40 a 60 μg/ml) a s flavonoidy: 3´-O-methyldiplakon (5, 10, 15 a 20 μg/ml), 3´-O-methyl-5´-hydroxydiplakon (5, 10, 15 a 20 μg/ml), mimulon (3, 5, 10, 15 a 20 μg/ml), 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon (5, 10, 15 a 20 μg/ml), 3´-O-methyldiplakol (5, 10, 15 a 20 μg/ml) a kudraflavon B (5, 10, 15 a 20 μg/ml). Jako negativní kontrola byl použit DMSO, ve kterém byly všechny látky rozpuštěné. Efekt inhibitoru kaspáz, z-VAD-fmk, na cytotoxicitu studovaných látek – buňky linie A-375 byly 3 hodiny preinkubovány 20 μM z-VAD-fmk (Enzo Life Sciences) a následně byly přidány testované látky v příslušné koncentraci. V kombinaci inhibitoru s danými látkami byly buňky kultivovány 45 hodin. Efekt inhibitoru RIP1 kinázy, Necrostatinu-1 (Nec-1), na cytotoxicitu studovaných látek – buňky linie A-375 byly 3 hodiny preinkubovány 20 μM Nec-1 (Sigma-Aldrich) a následně byly přidány testované látky v příslušné koncentraci. V kombinaci inhibitoru s danými látkami byly buňky kultivovány 45 hodin.
38
Efekt inhibitoru autofagie, 3-methyladeninu (3-MA), na cytotoxicitu studovaných látek – buňky linie A-375 byly 3 hodiny preinkubovány 5 mM 3-MA (Sigma-Aldrich) a následně byly přidány testované látky v příslušné koncentraci. V kombinaci inhibitoru s danými látkami byly buňky kultivovány 45 hodin.
4.5. Příprava buněčných lyzátů, SDS-PAGE, Westernový přenos, detekce proteinů na membráně 4.5.1. Příprava buněčných lyzátů Buňky byly kultivovány ve 12-jamkových deskách. Do každé jamky byl napipetován 1 ml buněčné suspenze o koncentraci 5*104 buněk/ml. Po 24 hodinové kultivaci bylo médium odsáto a nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím testované látky. Poté byly buňky opět kultivovány dle potřeby (8, 12 a 24 hodin). Po uplynutí dané doby bylo médium s plovoucími buňkami přeneseno do eppendorfek, stočeno v centrifuze 5 minut při 1000 rpm a supernatant byl odsát. Do jamek bylo napipetováno 100 μl 2× nanášecího pufru (Sample Buffer, 2×Laemmli; Sigma-Aldrich) (složení viz Tab. 3) a destička byla dána na třepačku na 5 – 10 minut. Jakmile pufr změnil svou konzistenci, buňky jím byly opláchnuty a přeneseny do eppendorfek k peletu. Takto připravené lyzáty byly zamraženy při -20 °C.
4.5.2. Polyakrylamidová elektroforéza (SDS-PAGE) Nejprve byla sestavena aparatura Hoefer Small Mighty SE 250 (Hoefer, Inc., Holliston, USA) k přípravě gelů. Mezi připravené sklo a keramickou destičku byl nejprve nalit dělící gel o příslušné koncentraci (složení gelů viz Tab. 1) asi 1 cm pod úroveň dna jamek a převrstven 70% ethanolem. Gel se nechal tuhnout po dobu 20 – 30 minut. Po zatuhnutí gelu byl ethanol odsát a na takto připravený gel byl nalit zaostřovací gel (složení gelu viz Tab. 2), do kterého byl zasunut hřebínek o 10 jamkách. Po 20 – 30 minutách byla aparatura s gelem vložena do elektroforetické vany a zalita elektroforetickým pufrem (složení viz Tab. 3). Po nalití pufru byl vysunut hřebínek. Do první jamky byl nanesen 1 μl markeru (Fermentas International Inc., Kanada), který byl doplněn do celkového objemu 20 μl 2× nanášecím pufrem. Do poslední jamky byl napipetován pouze 2× nanášecí pufr. Do ostatních jamek byly naneseny jednotlivé vzorky o objemu 19 μl, které byly předtím 5 minut povařeny
39
na termobločku při 95 °C a krátce stočeny v centrifuze. Aparatura byla zapojena do zdroje napětí (PowerPac Basic Power Supply; BioRad). Na začátek elektroforézy a při přechodu proteinů přes zaostřovací gel bylo napětí nastaveno na 70 – 80 V. Po přechodu proteinů do dělícího gelu bylo napětí zvýšeno na 110 – 120 V. Proces byl ukončen ve chvíli, kdy proteiny doputovaly asi 1 cm od konce gelu. Chemikálie Deionizovaná H2O 1M Tris-HCl (pH 8,8) 10% SDS 10% APS TEMED 30% Akrylamid
7,5% gel 1,35 ml 1,4 ml 37,5 μl 10 μl 2,5 μl 0,95 ml
10% gel 1,05 ml 1,4 ml 37,5 μl 10 μl 2,5 μl 1,25 ml
12,5% gel 0,75 ml 1,4 ml 37,5 μl 10 μl 2,5 μl 1,56 ml
Tabulka č. 1: Složení dělících gelů
Chemikálie Deionizovaná H2O 1M Tris-HCl (pH 6,8) 10% SDS 10% APS TEMED 30% Akrylamid
5% gel 1,3 ml 234,5 μl 18,75 μl 9,375 μl 1,875 μl 313,125 μl
Tabulka č. 2: Složení zaostřovacího gelu
4.5.3. Westernový přenos Po skončení elektroforézy byl gel vyjmut z aparatury. Do nachystaného vychlazeného roztoku 1× přenosového pufru (složení viz Tab. 3) byly ponořeny dva filtrační papíry (extra thick blot paper; BioRad), nitrocelulózová membrána pro westernový přenos (BioRad) a gel s odříznutými jamkami. Do přenosové aparatury (Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell; BioRad) byl nejprve umístěn filtrační papír, na něj membrána, pak gel a opět filtrační papír. Pomocí plastové pipety byly opatrně vytlačeny bubliny. Aparatura byla uzavřena víkem a zapojena do zdroje (PowerPac HC Power Supply; BioRad). Pro přenos proteinů z gelu na membránu byl použit konstantní proud 0,35 A po dobu 1 hodiny.
40
4.5.4. Imunodetekce proteinů na membráně Po ukončení westernového přenosu byla membrána s proteiny blokována 1 hodinu na třepačce v 5% roztoku sušeného mléka (Laktino) s TBS (z angl. Tris-buffered saline) (složení viz Tab. 3). Poté byla membrána rozřezána na pásky podle velikosti proteinů, vložena do vaničky s parafilmem a na jednotlivé pásky byla nanesena primární protilátka (použité primární protilátky viz Tab. 4), která byla naředěná do příslušné koncentrace v 1% roztoku mléka. Vanička s membránou byla takto ponechána přes noc v lednici. Následující den byla membrána promývána 4x 7 minut v 1% roztoku mléka. Poté na ni byla nanesena sekundární protilátka (použité sekundární protilátky viz Tab. 5) naředěná v 1% roztoku mléka v koncentraci 1:3500. Po 60 minutové inkubaci při pokojové teplotě byla membrána opět promývána 4x 7 minut v 1% roztoku mléka. Na membránu byla následně nanesena směs ECL (z angl. enhanced chemiluminescent substrate; GE Healthcare) v poměru 1:1 a nechána působit po dobu 1 minuty. Poté byla membrána vložena do folie a do světlotěsné kazety (Amersham Hypercassette; GE Healthcare). V temné komoře byl do kazety na membránu vložen světlocitlivý film (AGFA CP-BU new) a ponechán po dobu 2 – 30 minut. Film byl poté vyvolán ponořením do vývojky, vody, ustalovače a nakonec opláchnut vodou. Film byl nakonec oskenován (Canon MG5300 series) a upraven v programu IrfanView. Výsledek byl analyzován pomocí programu ImageJ. Hodnota optické denzity cílového proteinu byla normalizována vzhledem k hodnotě optické denzity PCNA (z angl. proliferating cell nuclear antigen), který sloužil jako nanášecí kontrola. Takto získané hodnoty byly porovnávány s hodnotou vzorku, který sloužil v daném experimentu jako kontrola.
41
Pufr 2× nanášecí pufr
10× elektroforetický pufr
1× elektroforetický pufr
1× přenosový pufr
10× TBS pufr (pH 7,4)
Chemikálie 1 M Tris-HCl (pH 6,8) 10% SDS β-mercaptoethanol směs glycerolu (20%) a bromfenolové modři (0,01%) destilovaná H2O Glycin Tris deionizovaná H2O 10× elektroforetický pufr 10% SDS destilovaná H2O 10× elektroforetický pufr methanol destilovaná H2O 2M Tris-HCl (pH 7,4) NaCl Tween-20 destilovaná H2O
Množství 6,25 ml 20 ml 5 ml 5 ml 13,75 ml 144,2 g 30,3 g 1000 ml 100 ml 10 ml 890 ml 100 ml 200 ml 700 ml 5 ml 5,9 g 500 μl 1000 ml
Tabulka č. 3: Složení pufrů používaných při polyakrylamidové elektroforéze, Westernovém přenosu a při detekci proteinů na membráně
Výrobce
Číslo produktu
Typ
Zdroj
Velikost (kDa)
Ředění
c-PARP
Cell Signaling
5625
monoklonální
K
89
1:1000
α-tubulin
EXBIO
11-250C100
monoklonální
M
55
1:1000
*
-
monoklonální
M
53
1:50
XIAP
Cell Signaling
2042
polyklonální
K
53
1:1000
PCNA
*
-
monoklonální
M
36
1:70
Bcl-xL
Cell Signaling
2764
monoklonální
K
26, 30
1:1000
c-CASP-3
Cell Signaling
9661
monoklonální
K
17
1:1000
BioLegend
613401
monoklonální
M
14
1:1000
Označení
p53
γH2AX
Zdroj – M/K – myší/králičí protilátka * - darováno Dr. Vojtěškem (Masarykův onkologický ústav, Brno, Česká republika) Tabulka č. 4: Seznam použitých primárních protilátek
42
Označení
Výrobce
Číslo produktu
Zdroj
Ředění
donkey antimouse IgGHRP
Santa Cruz Biotechnology
sc-2314
anti-M
1:3500
donkey antirabbit IgGHRP
Santa Cruz Biotechnology
sc-2313
anti-K
1:3500
Popis oslí protilátka proti myšímu IgG konjugovaná s křenovou peroxidázou oslí protilátka proti králičímu IgG konjugovaná s křenovou peroxidázou
Tabulka č. 5: Seznam použitých sekundárních protilátek
4.6. Analýza buněčného cyklu Buňky byly nasazeny na 6-jamkové desky. Do každé jamky byly napipetovány 2 ml buněčné suspenze o koncentraci 105 buněk/ml a buňky byly kultivovány 24 hodin při standardních laboratorních podmínkách. Následující den bylo médium odsáto a nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím testované látky. Po dalších 24 hodinách kultivace byl obsah jamek přenesen do zkumavek umístěných na ledu. Buňky byly promyty nahřátým PBS a ztrypsinizovány. Vše bylo přeneseno do zkumavek, které byly centrifugovány 6 minut/1500 rpm/20 °C. Byl odsát supernatant, pelet byl 3x promyt 250 μl PBS . K peletu bylo přidáno 265 μl PBS. Za neustálého vortexování bylo po kapkách přidáváno 735 μl ledového 95% ethanolu a zkumavky byly 30 minut inkubovány na ledu. Poté byl obsah zkumavek přenesen do eppendorfek, které byly zcentrifugovány a buňky byly 3x promyty 250 μl PBS. Následně bylo přidáno 50 μl RNázy o koncentraci 0,1 mg/ml a obsah eppendorfek byl inkubován 30 minut při 37 °C. Po inkubaci bylo přidáno 10 μl PI o koncentraci 1 mg/ml. Buněčný cyklus byl analyzován na průtokovém cytometru Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) v kanálu FL3, při emisní vlnové délce 620 nm. U každého vzorku bylo naměřeno nejméně 10 000 buněk. Výsledné grafické zobrazení obsahuje procentuální zastoupení buněk v sub-G1, G1, S a G2/M fázi.
4.7. Test akumulace DOXO Test akumulace DOXO je metoda, kterou testujeme schopnost látek působit jako inhibitory ABC transportérů. Principem je měření intenzity fluorescence DOXO (Sigma-
43
Aldrich, St. Louis, USA), což je cytostatikum vykazující fluorescenci, které ABC transportéry vylučují ven z buněk. Jako pozitivní kontrola byl použit verapamil (Sigma-Aldrich, USA) o koncentraci 20 μM, který je známý schopností blokovat ABC transportéry, přičemž DOXO zůstává uvnitř buněk a jeho množství odpovídá intenzitě fluorescence. Buňky linie HL-60/MDR byly nasazeny na 96-jamkovou destičku. Do každé jamky bylo napipetováno 150 μl buněčné suspenze o koncentraci 5*105 buněk/ml obsahující požadované množství testovaných látek. Po 15 minutové inkubaci při standardních kultivačních podmínkách bylo přidáno 15 μl 1 mM DOXO do každé jamky a buňky byly inkubovány dalších 60 minut v termostatu. Poté byla celá destička centrifugována 5 minut/1200 rpm, médium bylo odsáto, do vzorků bylo přidáno 300 μl chladného PBS a přeneseno do zkumavek. Následně byla měřena intenzita fluorescence DOXO uvnitř buněk pomocí průtokového cytometru Cytomics FC 500 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) v kanálu FL2, při excitační vlnové délce 488 nm a emisní vlnové délce 575 nm. Byl odečítán mean intenzity fluorescence. V každém vzorku bylo měřeno 10 000 buněk a každá koncentrace studovaných látek byla testována ve třech opakováních.
4.8. Detekce apoptózy pomocí značení jader DAPI Buňky byly vysety na mikroskopická sklíčka do 12-jamkové destičky. Do každé jamky byl napipetován 1 ml buněčné suspenze o koncentraci 7*104 buněk/ml. Po 24 hodinách inkubace při standardních kultivačních podmínkách bylo médium odsáto a nahrazeno čerstvým obsahujícím testované látky. Buňky byly kultivovány 12 hodin. Poté bylo médium odsáto, buňky byly 3x promyty PBS a fixovány 3% nahřátým paraformaldehydem (SigmaAldrich) po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Následně byl paraformaldehyd odsát, buňky byly opět 3x promyty PBS a bylo přidáno 50 μl roztoku DAPI (4,6-diamino-2-fenylindol; Sigma-Aldrich) v koncentraci 1 μg/ml na každé sklíčko. Destička byla inkubována 5 minut ve tmě při pokojové teplotě. Poté byly buňky 3x promyty PBS. Sklíčka byla promyta v destilované vodě a přenesena na podložní sklo do montovacího média (Vectashield; Vector laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA). Jádra buněk značená DAPI byla analyzována pomocí fluorescenčního mikroskopu (Leica DMI4000 B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).
44
4.9. Fluorescenční mikroskopie Buňky linie A-375 byly vysety na mikroskopická sklíčka v koncentraci 1*105 buněk/ml. Po 24 hodinách kultivace při standardních kultivačních podmínkách byl k buňkám přidán 10x zředěný zásobní roztok (1 mg/50 μl DMSO) obsahující testované látky. Buňky byly ihned pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem (Leica DMI4000 B, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) za použití UV filtru BP 340-380.
4.10. Statistická analýza Data získaná vždy ze tří nezávislých pokusů byla statisticky vyhodnocena pomocí Studentova t-testu. Za statisticky významné byly zvoleny 1% (p < 0,01) a 5% (p < 0,05) hladiny významnosti.
45
5. Výsledky 5.1. Stanovení cytotoxicty izochinolinových alkaloidů Cytotoxicita byla testována testem
metabolické aktivity
(MTT)
a testem
životaschopnosti buněk (PI exclusion assay).
5.1.1. Test metabolické aktivity MTT test je založen na detekci metabolicky aktivních buněk, konkrétně aktivity mitochondriální sukcinát dehydrogenázy. Snížení metabolické aktivity je úměrné toxicitě testovaných látek. Při testování byla použita buněčná linie maligního melanomu A-375. Počáteční screening byl proveden u deseti alkaloidů v koncentraci 30 a 60 μg/ml a pro další testování byly použity pouze čtyři z nich, ostatní byly málo toxické. Testovány byly tyto alkaloidy: CAL, COL, CRP, CRS, ESD, ESL, FAG, HOM, JATR a PAL. Pro další studium jsme vybrali tyto: CRS, ESL, FAG a HOM (Obr. 11). 120,0
% kontroly
100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0
koncentrace [μg/ml]
46
120,0
% kontroly
100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0
koncentrace [μg/ml]
Obr. 11: Test metabolické aktivity alkaloidů. Výsledek MTT testu buněčné linie A-375 ovlivněné alkaloidy v koncentracích 30 a 60 μg/ml. Buňky byly kultivovány s danými alkaloidy 48 hodin. DMSO sloužil jako negativní kontrola, neboť v něm byly alkaloidy rozpuštěny.
Antiproliferační účinek je vyjádřen jako IC50, tj. koncentrace, která vyvolává 50% inhibici metabolické aktivity ve srovnání s kontrolní skupinou. Hodnota IC50 je u CRS přibližně 37 μg/ml, u FAG 13 μg/ml a u HOM 30 μg/ml (Obr. 12). Vzhledem k příliš nízké toxicitě nemohly být odečteny hodnoty IC50 u ostatních alkaloidů.
Hodnoty IC50 120
% kontroly
100 80 60
CRS
40
FAG
20
HOM
0 0
10
20
30
40
50
60
70
koncentrace testovaných látek [μg/ml]
Obr. 12: Test metabolické aktivity vybraných alkaloidů. Výsledek MTT testu buněčné linie A-375 ovlivněné alkaloidy v koncentracích 1, 10, 30 a 60 μg/ml. Buňky byly kultivovány s danými alkaloidy 48 hodin. Hodnota IC50 je přibližně u CRS 37 μg/ml, u FAG 13 μg/ml a u HOM 30 μg/ml.
47
5.1.2. Test životaschopnosti buněk A-375 Test životaschopnosti buněk je určen pro rozlišení živých a mrtvých buněk použitím fluorochromu PI. Mrtvé buňky zůstávají zbarvené, zatímco živé buňky aktivně vylučují PI ven. Viabilita byla testována na buněčné linii A-375 u čtyřech vybraných alkaloidů. Nejtoxičtější ze všech se jevil FAG a to v koncentraci 30 i 50 μg/ml (Obr. 13). Naopak
% mrtvých buněk
nejnižší toxicita je viditelná u ESL, a to i přes nejvyšší použitou koncentraci 70 μg/ml. 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
**
** **
*
**
koncentrace [μg/ml]
Obr. 13: Viabilita buněk A-375 po účinku vybraných alkaloidů. Výsledek cytometrické analýzy PI exclusion assay u buněk A-375 ovlivněné alkaloidy CRS v koncentraci 30 a 60 μg/ml, ESL 30 a 70 μg/ml, FAG 30 a 50 μg/ml a HOM 30 a 60 μg/ml po dobu 48 hodin. Nejvíce toxický je FAG následovaný HOM. *p < 0,05 buňky ovlivněné alkaloidy vs. neovlivněné buňky (kontrola). ** p < 0,01 buňky ovlivněné alkaloidy vs. neovlivněné buňky (kontrola).
5.1.3. Účinek alkaloidů na různé typy buněčných linií Alkaloidy jsme testovali i na dalších buněčných liniích za účelem porovnání citlivosti těchto linií k toxickému účinku alkaloidů. V prvním experimentu byla použita melanomová buněčná linie IPC-298, která byla porovnána s buněčnou linií A-375. Byly použity stejné koncentrace alkaloidů jako v předešlém pokusu. Z grafu (Obr. 14) je zřejmé, že u ESL a FAG je citlivější linie A-375. U HOM je cytotoxický účinek na obě linie srovnatelný. Pouze v případě kultivace buněk s CRS se jeví citlivější linie IPC-298.
48
% mrtvých buněk
100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
*
**
**
*
A-375 IPC-298
koncentrace [μg/ml]
Obr. 14: Viabilita melanomových buněk po účinku vybraných alkaloidů. Výsledek cytometrické analýzy PI exclusion assay u melanomových buněčných linií A-375 a IPC-298 ovlivněných alkaloidy CRS v koncentraci 30 a 60 μg/ml, ESL 30 a 70 μg/ml, FAG 30 a 50 μg/ml a HOM 30 a 60 μg/ml po dobu 48 hodin. V případě CRS je citlivější linie IPC-298, u ESL a FAG je naopak citlivější linie A375 a účinek HOM je u obou linií srovnatelný. *p < 0,05 buněčná linie IPC-298 vs. buněčná linie A-375. ** p < 0,01 buněčná linie IPC-298 vs. buněčná linie A-375.
V dalším experimentu byla testována cytotoxicita alkaloidů na nenádorovou buněčnou linii HFF-1. Buňky byly ovlivněny alkaloidy CRS a HOM v koncentraci 60 μg/ml, ESL v koncentraci 70 μg/ml a FAG v koncentraci 50 μg/ml. Z grafu (Obr. 15) je patrné, že linie HFF-1 je nejméně citlivá u látek CRS a FAG, což dokazuje i statistická významnost, na rozdíl od ESL a HOM, u nichž tomu tak není. Účinek HOM je téměř stejný na všechny tři použité buněčné linie.
49
% mrtvých buněk
100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
A-375 IPC-298
**
** * kontrola DMSO
Crs 60
Esl 70
HFF-1
Fag 50 Hom 60
koncentrace [μg/ml]
Obr. 15: Viabilita melanomových a nenádorových buněk po účinku vybraných alkaloidů. Výsledek cytometrické analýzy PI exclusion assay u melanomových buněčných linií A-375 a IPC-298 a nenádorové buněčné linie lidských fibroblastů HFF-1 ovlivněných alkaloidy CRS v koncentraci 60 μg/ml, ESL 70 μg/ml, FAG 50 μg/ml a HOM 60 μg/ml po dobu 48 hodin. Buněčná linie HFF-1 je nejméně citlivá pouze u CRS a FAG. *p < 0,05 buněčná linie HFF-1 vs. buněčná linie A-375. *p < 0,05 buněčná linie HFF-1 vs. buněčná linie IPC-298. **p < 0,01 buněčná linie HFF-1 vs. buněčná linie A-375. **p < 0,01 buněčná linie HFF-1 vs. buněčná linie IPC-298.
5.2. Mechanismus působení alkaloidů 5.2.1. Vliv alkaloidů na buněčný cyklus Analýza buněčného cyklu umožňuje studovat procentuální zastoupení buněk ve specifické fázi, včetně sub-G1 fáze, která koresponduje s apoptotickými a nekrotickými buňkami. Buňky linie A-375 byly kultivovány s alkaloidy CRS, ESL, FAG, HOM a COL po dobu 24 hodin a poté byly analyzovány průtokovou cytometrií. Kontrolní buňky vykazují normální rozložení buněčného cyklu (Obr. 16A). U buněk ovlivněných CRS v koncentraci 50 μg/ml dochází pouze k nepatrnému zvýšení G2/M fáze (Obr. 16B). FAG působící v koncentraci 30 μg/ml zastavuje dělení buněk patrně v S fázi (Obr. 16C) a HOM v koncentraci 50 μg/ml způsobuje zástavu buněčného cyklu patrně v G2/M fázi (Obr. 16D). Buňky kultivované s ESL (16E) a COL (16F) rovněž v koncentraci 50 μg/ml nevykazovaly žádné změny v rozložení jednotlivých fází ve srovnání s kontrolou.
50
A
B
C
D
E
F
intenzita fluorescence Obr. 16: Analýza buněčného cyklu. Výsledek cytometrické analýzy buněčného cyklu. Buňky linie A-375 byly kultivovány 24 hodin v přítomnosti CRS (B), HOM (D), ESL (E), COL (F) v koncentraci 50 μg/ml a FAG v koncentraci 30 μg/ml (C). Neovlivněné buňky představují kontrolu (A).
51
5.2.2. Detekce apoptózy K detekci
apoptózy
jsme
použili
metodu
Western
blot
(WB).
Jedním
z charakteristických znaků apoptózy je štěpení poly(ADP-ribóza) polymerázy (PARP) a štěpení neaktivní prokaspázy 3 na aktivní kaspázu (CASP-3). Buněčná linie A-375 byla kultivována s CRS, ESL, HOM v koncentraci 30 μg/ml a FAG v koncentraci 20 μg/ml po dobu 8, 12 a 24 hodin. Byla provedena WB analýza štěpeného PARPu (c-PARP) a štěpené kaspázy-3 (c-CASP-3). Oba proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Štěpený PARP byl
A
B
HOM (24 h)
FAG (24 h)
ESL (24 h)
CRS (24 h)
kontrola (24 h)
HOM (12 h)
FAG (12 h)
ESL (12 h)
CRS (12 h)
kontrola (12 h)
HOM (8 h)
FAG (8 h)
ESL (8 h)
CRS (8 h)
kontrola (8 h)
detekován pouze u FAG po 24 hodinách kultivace (Obr. 17).
c-PARP
C
PCNA Obr. 17: WB analýza štěpeného proteinu PARP. Výsledek WB analýzy štěpeného proteinu PARP. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A), 12 (B) a 24 (C) hodinách v přítomnosti CRS, ESL, HOM v koncentraci 30 μg/ml a FAG v koncentraci 20 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Štěpený PARP byl detekován pouze u FAG po 24 hodinách kultivace.
Štěpenou CASP-3 se podařilo jen slabě detekovat rovněž u FAG po 24 hodinách
A
B
C
HOM (24 h)
FAG (24 h)
ESL (24 h)
CRS (24 h)
kontrola (24 h)
HOM (12 h)
FAG (12 h)
ESL (12 h)
CRS (12 h)
kontrola (12 h)
HOM (8 h)
FAG (8 h)
ESL (8 h)
CRS (8 h)
kontrola (8 h)
kultivace (Obr. 18).
c-CASP-3 PCNA
Obr. 18: WB analýza štěpené kaspázy-3. Výsledek WB analýzy štěpené CASP-3. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A), 12 (B) a 24 (C) hodinách v přítomnosti CRS, ESL, HOM v koncentraci 30 μg/ml a FAG v koncentraci 20 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Štěpená CASP-3 byla jen slabě detekována u FAG po 24 hodinách kultivace.
Apoptózu jsme se také pokusili zachytit analýzou jader značených DAPI za použití fluorescenční mikroskopie. Buňky linie A-375 byly kultivovány po dobu 12 hodin s CRS
52
v koncentraci 60 μg/ml, ESL 70 μg/ml, FAG 30 μg/ml a HOM 60 μg/ml. U kontrolních buněk jsou vidět neporušená pravidelná jádra (Obr. 19A). U buněk ovlivněných CRS dochází k fragmentaci jader (Obr. 19B). V přítomnosti FAG je pozorovatelná kondenzace chromatinu (Obr. 19C), mohlo by jít o počátek apoptózy. Buňky kultivované s ESL a HOM nevykazovaly rozdíl ve struktuře jader ve srovnání s kontrolou. A
B
C
Obr. 19: Detekce apoptózy pomocí značení jader DAPI. Výsledek mikroskopické analýzy jader u buněk linie A-375, které byly kultivovány 12 hodin v přítomnosti CRS v koncentraci 60 μg/ml, ESL 70 μg/ml, FAG 30 μg/ml a HOM 60 μg/ml. Kontrolní buňky mají pravidelná neporušená jádra (A). U buněk ovlivněných CRS je pozorovatelná apoptotická fragmentace jader (B). V přítomnosti FAG je vidět kondenzace chromatinu, která může znamenat počátek apoptózy (C). Měřítko – 32 μm.
5.2.3. Mechanismy indukce apoptózy Jeden z mechanismů, jak mohou alkaloidy indukovat apoptózu, je snížení hladiny antiapoptotických proteinů. Zaměřili jsme se tedy na snížení antiapoptotického proteinu BclxL a antiapoptotického faktoru XIAP u vybraných alkaloidů. Buňky linie A-375 byly kultivovány s CRS, ESL, HOM v koncentraci 50 μg/ml a FAG v koncentraci 30 μg/ml po dobu 8 a 24 hodin. CAMPT v koncentraci 1 μM sloužil jako pozitivní kontrola. Ke snížení 53
hladiny proteinu Bcl-xL došlo u všech testovaných alkaloidů po 24 hodinách kultivace a u ESL a FAG i po 8 hodinách kultivace (Obr. 20). Antiapoptotický faktor XIAP se nepodařilo
A
HOM (24 h)
FAG (24 h)
ESL (24 h)
CRS (24 h)
CAMPT (24 h)
kontrola (24 h)
HOM (8 h)
FAG (8 h)
ESL (8 h)
CRS (8 h)
CAMPT (8 h)
kontrola (8 h)
detekovat ani u jednoho ze vzorků.
Bcl-xL
B
PCNA 1,0
1,1
1,0
0,8
0,9
1,1
1,0
0,1
0,4
0,5
0,7
0,3
Obr. 20: WB analýza antiapoptotického proteinu Bcl-xL. Výsledek WB analýzy antiapoptotického proteinu Bcl-xL. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A) a 24 (B) hodinách v přítomnosti CRS, ESL, HOM v koncentraci 50 μg/ml a FAG v koncentraci 30 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Snížení hladiny Bcl-xL je pozorovatelné u všech alkaloidů po 24 hodinách kultivace a u ESL a HOM i po 8 hodinách kultivace.
5.2.4. Poškození DNA působením alkaloidů Alkaloidy jsou schopny interagovat s DNA, což nás vedlo k tomu otestovat, zda studované alkaloidy poškozují DNA. Jedním z ukazatelů poškození DNA je detekce fosforylace histonu H2AX (γH2AX). Buňky linie A-375 byly kultivovány s CRS, ESL, HOM v koncentraci 50 μg/ml a FAG v koncentraci 30 μg/ml po dobu 8 a 24 hodin. Jako pozitivní kontrola byl opět použit CAMPT v koncentraci 1 μM. γH2AX byl detekován u všech testovaných alkaloidů po 8 i 24 hodinách kultivace (Obr. 21), přičemž je pozorovatelné, že jeho hladina se s časem zvýšila. Ke zvýšení hladiny γH2AX došlo u všech látek po 8 hodinách kultivace kromě CRS. Po 24 hodinách byla zvýšená hladina histonu detekována pouze u CAMPT a FAG.
54
HOM (24 h)
FAG (24 h)
ESL (24 h)
CRS (24 h)
CAMPT (24 h)
kontrola (24 h)
HOM (8 h)
FAG (8 h)
ESL (8 h)
CRS (8 h)
CAMPT (8 h)
kontrola (8 h)
A
γH2AX
B
PCNA 1,0
3,7
1,0
1,7
1,3
1,4
1,0
2,2
0,9
1,0
1,1
0,7
Obr. 21: WB analýza fosforylovaného histonu H2AX. Výsledek WB analýzy fosforylované formy histonu H2AX. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A) a 24 (B) hodinách v přítomnosti CRS, ESL, HOM v koncentraci 50 μg/ml a FAG v koncentraci 30 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Zvýšená hladina γH2AX byla kromě CRS detekována u všech alkaloidů po 8 hodinách kultivace a u CAMPT a FAG po 24 hodinách kultivace.
Klíčovou roli v reakci na poškození DNA hraje protein p53, jehož aktivita zabraňuje progresi buněčného cyklu v případě poškození DNA a tím brání nádorové transformaci. Mutace v genu p53 vede ke ztrátě aktivity proteinu a nachází se přibližně u 50% všech lidských nádorů. Protein byl detekován u všech vzorků (Obr. 22), přičemž pouze u CAMPT a FAG došlo ke stabilizaci p53. K mírnému zvýšení hladiny p53 došlo také působením CRS a
A
HOM (24 h)
FAG (24 h)
ESL (24 h)
CRS (24 h)
CAMPT (24 h)
kontrola (24 h)
HOM (8 h)
FAG (8 h)
ESL (8 h)
CRS (8 h)
CAMPT (8 h)
kontrola (8 h)
HOM oproti neovlivněným buňkám. Přítomnost ESL naopak vedla ke snížení hladiny p53.
p53
B
PCNA 1,0
2,0
1,2
0,9
1,6
1,1
1,0
2,2
1,1
0,8
1,4
0,9
Obr. 22: WB analýza proteinu p53. Výsledek WB analýzy proteinu p53. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A) a 24 (B) hodinách v přítomnosti CRS, ESL, HOM v koncentraci 50 μg/ml a FAG v koncentraci 30 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Ke stabilizaci p53 došlo u CAMPT a FAG.
5.2.5. Studium různých typů buněčné smrti FAG se z hlediska aktivity jevil jako nejzajímavější, proto jsme podrobněji studovali, jaký typ buněčné smrti spouští – apoptózu, nekroptózu nebo autofagii. K tomu byly použity inhibitory buněčných smrtí: 10 mM z-VAD-fmk (inhibitor apoptózy), 20 mM Nec-1 (inhibitor nekroptózy) a 0,25 M 3-MA (inhibitor autofagie). Po tříhodinové preinkubaci buněk A-375 s inhibitory byl přidán FAG o koncentraci 20 μg/ml a buňky byly kultivovány dalších 55
45 hodin. Následně byla provedena PI exclusion assay. Po ovlivnění buněk samotným FAG bylo přes 60 % mrtvých buněk (Obr. 23). Mírné snížení procenta mrtvých buněk nastalo
% mrtvých buněk
v kombinaci se z-VAD-fmk, 3-MA a z-VAD-fmk+Nec-1. 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
Obr. 23: Typy buněčných smrtí u FAG. Výsledek cytometrické analýzy PI exclusion assay u buněk A-375. Buňky byly nejprve 3 hodiny preinkubovány s příslušnými inhibitory buněčných smrtí: z-VAD-jmk (10 mM), Nec-1 (20 mM), 3-MA (0,25 M) a kombinací zVAD-fmk+Nec-1. Poté byly kultivovány 45 hodin v přítomnosti FAG v koncentraci 20 μg/ml. Statisticky nevýznamný pokles % mrtvých buněk nastal v kombinaci FAG se z-VAD-fmk, 3-MA a v kombinaci dvou inhibitorů z-VAD-fmk+Nec-1.
5.3. Testování schopnosti alkaloidů inhibovat ABC transportéry Testem akumulace DOXO jsme studovali schopnost alkaloidů ovlivnit aktivitu P-gp. Byla použita leukemická buněčná linie HL-60/MDR nadměrně exprimující P-gp. Buňky byly nejprve 15 minut preinkubovány s testovanými látkami. Po přidání DOXO, cytostatika, které ABC transportéry vylučují z buněk, byly buňky kultivovány dalších 60 minut. Pomocí průtokového cytometru byla následně měřena intenzita fluorescence DOXO, který zůstal uvnitř buněk. Testovali jsme všech deset alkaloidů: CAL, COL, CRP, CRS, ESD, JAT a PAL v koncentraci 30 μg/ml a ESL, FAG a HOM v koncentraci 10 μg/ml. Jako pozitivní kontrolu jsme použili verapamil v koncentraci 20 μM. Zvýšená akumulace DOXO oproti kontrole byla patrná pouze u CAL, COL a CRS (Obr. 24). Z grafu je zřejmé, že CRS vykazuje více než 2x vyšší intenzitu fluorescence oproti verapamilu. Vzhledem k tomu, že CRS má fluorescenční
56
vlastnosti (Obr. 26), ověřili jsme, že toto zvýšení je dáno právě autofluorescencí CRS. Proto jsme pro další testování vybrali pouze CAL a COL. 350,0
% kontroly
300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0
koncentrace [μg/ml]
Obr. 24: Test akumulace DOXO po účinku alkaloidů. Výsledek cytometrické analýzy leukemické buněčné linie HL-60/MDR ovlivněné alkaloidy CAL, COL, CRP, CRS, ESD, JAT a PAL v koncentraci 30 μg/ml a ESL, FAG a HOM v koncentraci 10 μg/ml. Verapamil v koncentraci 20 μM byl použit jako pozitivní kontrola. Zvýšená intenzitra fluorescence naznačující vyšší akumulaci DOXO nastala pouze u CAL a COL. V případě CRS jde o autofluorescenci samotného alkaloidu.
V dalším experimentu jsme testovali pouze dva dříve zmíněné alkaloidy – CAL a COL v koncentraci 30 μg/ml. Výsledky tří nezávislých experimentů ukázaly, že zvýšená intenzita fluorescence nenastala již u žádného z alkaloidů a výsledky ani nejsou statisticky významné (Obr. 25).
57
% kontroly
200,0 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 kontrola
DMSO
Verapamil
Cal 30
Col 30
koncentrace [μg/ml]
Obr. 25: Test akumulace DOXO po účinku CAL a COL. Výsledek cytometrické analýzy buněčné linie HL-60/MDR ovlivněné alkaloidy CAL a COL v koncentraci 30 μg/ml. Verapamil v koncentraci 20 μM byl použit jako pozitivní kontrola. Zvýšená intenzita fluorescence nenastala u žádného z alkaloidů a výsledky nejsou statisticky významné.
5.4. Fluorescenční vlastnosti alkaloidů Vzhledem k předchozímu experimentu jsme se rozhodli otestovat, zda CRS vykazuje fluorescenční vlastnosti. Buňky linie A-375 byly vysety na mikroskopická sklíčka a kultivovány 24 hodin. Poté k nim byl přidán 10x zředěný zásobní roztok (1 mg/50 μl DMSO) CRS a buňky byly ihned pozorovány pod fluorescečním mikroskopem, kde svítily zelenou barvou (Obr. 26). Na obrázku je viditelné, že CRS proniká nejen do cytoplazmy buněk, ale i do jádra a především do jadérek, což naznačuje vazbu na RNA.
58
A
B
C
Obr. 26: Fluorescence CRS. Mikroskopická analýza buněk značených CRS. Buňky linie A-375 byly ovlivněné 10x zředěným zásobním roztokem (1 mg/50 μl DMSO) CRS a ihned pozorovány pod mikroskopem. Jednotlivé obrázky znázorňují fluorescenci CRS (A), buňky pod procházejícím světlem (B) a překryv dvou předchozích obrázků (C). Měřítko – 32 μm.
Také jsme prokázali, že i PAL vykazuje fluorescenci a buňky rovněž svítily zeleně (Obr. 27). Též byl použit 10x zředěný zásobní roztok PAL (1 mg/50 μl DMSO). Z obrázku je zřejmé, že PAL se váže především na RNA.
Obr. 27: Fluorescence PAL. Mikroskopická analýza buněk značených PAL. Buňky linie A-375 byly ovlivněné 10x zředěným zásobním roztokem (1 mg/50 μl DMSO) PAL a ihned pozorovány pod mikroskopem. Měřítko – 32 μm.
59
5.5. Stanovení cytotoxicity flavonoidů Cytotoxicita flavonoidů byla rovněž testována testem metabolické aktivity (MTT) a testem životaschopnosti buněk (PI exclusion assay).
5.5.1. Test metabolické aktivity Také u flavonoidů byl proveden MTT test pro stanovení metabolicky aktivních buněk. Při testování byla použita buněčná linie maligního melanomu A-375. Experiment byl proveden u sedmi flavonoidů v koncentracích 10 a 50 μg/ml. Testovány byly tyto flavonoidy: 3´-O-methyldiplakon (F1), 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakon (F2), mimulon (F3), acteosid (F4), 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon (F5), 3´-O-methyldiplakol (F6) a kudraflavon B (F7). Pro další studium byly použity všechny kromě F4, neboť byl málo toxický (Obr. 28). 120,0
% kontroly
100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 F7 50
F7 10
F6 50
F6 10
F5 50
F5 10
F4 50
F4 10
F3 50
F3 10
F2 50
F2 10
F1 50
F1 10
DMSO
kontrola
0,0
koncentrace [μg/ml]
Obr. 28: Test metabolické aktivity flavonoidů. Výsledek MTT testu buněčné linie A-375 ovlivněné flavonoidy v koncentracích 10 a 50 μg/ml. Buňky byly kultivovány s danými alkaloidy 48 hodin. DMSO sloužil jako negativní kontrola, neboť v něm byly flavonoidy rozpuštěny.
Dále byla odečtena hodnota IC50, což je koncentrace, která vyvolává 50% inhibici metabolické aktivity. Hodnota IC50 u F1 je přibližně 12 μg/ml, F2 6 μg/ml, F3 9 μg/ml, F5 13 μg/ml, F6 16 μg/ml a F7 15 μg/ml (Obr. 29).
60
Hodnoty IC50 120
% kontroly
100 80 60
F1
40
F5
20 0 0
10
20
30
40
50
60
koncentrace testovaných látek [μg/ml]
Hodnoty IC50 120
% kontroly
100 80 60
F2
40
F3
20 0 0
10
20
30
40
50
60
koncentrace testovaných látek [μg/ml]
Hodnoty IC50 120
% kontroly
100 80 60
F6
40
F7
20 0 0
10
20
30
40
50
60
koncentrace testovaných látek [μg/ml]
Obr. 29: Test metabolické aktivity vybraných flavonoidů. Výsledek MTT testu buněčné linie A-375 ovlivněné flavonoidy v koncentracích 1, 3, 5, 10, 20, 30 a 50 μg/ml. Buňky byly kultivovány s danými flavonoidy 48 hodin. Hodnota IC50 je přibližně u F1 12 μg/ml, F2 6 μg/ml, F3 9 μg/ml, F5 13 μg/ml, F6 16 μg/ml a F7 15 μg/ml.
61
5.5.2. Test životaschopnosti buněk A-375 Viabilita byla testována na buněčné linii A-375 u šesti vybraných flavonoidů. Nejtoxičtější byl F2 a to jak v koncentraci 10, tak i 20 μg/ml (Obr. 30). Také F7 a F3 vykazovaly velmi vysokou toxicitu v koncentraci 20 μg/ml. Naopak nejnižší toxicita byla
% mrtvých buněk
viditelná u F5 v koncentraci 20 μg/ml a F1 v koncentraci 10 μg/ml. 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
** * * * *
koncentrace [μg/ml] Obr. 30: Viabilita buněk A-375 po účinku vybraných flavonoidů. Výsledek cytometrické analýzy PI exclusion assay u buněk A-375 ovlivněných flavonoidy v koncentracích 10 a 20 μg/ml po dobu 48 hodin. Nejvíce toxický byl F2 v obou použitých koncentracích, dále F7 a F3 v koncentraci 20 μg/ml. *p < 0,05 buňky ovlivněné flavonoidy vs. neovlivněné buňky (kontrola). **p < 0,01 buňky ovlivněné flavonoidy vs. neovlivněné buňky (kontrola).
5.5.3. Účinek flavonoidů na různé typy buněčných linií Flavonoidy jsme také testovali na dalších buněčných liniích. V prvním experimentu byla použita melanomová buněčná linie IPC-298. Byly použity stejné koncentrace flavonoidů jako v předešlém pokusu. Z grafu (Obr. 31) je zřejmé, že u flavonoidů je citlivější linie A375, kromě F2, F3 a F7 v koncentraci 20 μg/ml. Méně citlivá, u všech flavonoidů v koncentraci 10 μg/ml, je linie IPC-298, zvláště výrazný rozdíl v citlivosti je ve srovnání s linií A-375 viditelný u F2.
62
A-375
*
IPC-298 F7 20
F7 10
F6 20
* F6 10
F5 10
F3 20
F3 10
* F2 20
F2 10
F1 20
F1 10
DMSO
*
F5 20
*
kontrola
% mrtvých buněk
100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
koncentrace [μg/ml]
Obr. 31: Viabilita melanomových buněk po účinku vybraných flavonoidů. Výsledek cytometrické analýzy PI exclusion assay u melanomových buněčných linií A-375 a IPC-298 ovlivněných flavonoidy v koncentraci 10 a 20 μg/ml po dobu 48 hodin. V případě F2, F3 a F7 v koncentraci 20 μg/ml je citlivější linie IPC-298, jinak se jeví citlivější linie A-375. *p < 0,05 buněčná linie IPC-298 vs. buněčná linie A-375.
V dalším experimentu byla testována cytotoxicita flavonoidů na nenádorovou buněčnou linii lidských fibroblastů HFF-1. Buňky byly ovlivněny flavonoidy F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 20 μg/ml. Z grafu (Obr. 32) je patrné, že linie HFF-1 je u všech látek
% mrtvých buněk
nejméně citlivá, což dokazuje i statistická významnost. 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
**
** ** ** **
*
A-375 IPC-298
*
*
HFF-1
koncentrace [μg/ml]
Obr. 32: Viabilita melanomových a nenádorových buněk po účinku vybraných flavonoidů. Výsledek cytometrické analýzy PI exclusion assay u melanomových buněčných linií A-375 a IPC-298 a nenádorové buněčné linie HFF-1 ovlivněných flavonoidy v koncentraci 20 μg/ml po dobu 48 hodin. U všech látek je nejméně cilitvá buněčná linie HFF-1. *p < 0,05 buněčná linie HFF-1 vs. buněčná linie A-375. *p < 0,05 buněčná linie HFF-1 vs. buněčná linie IPC-298. **p < 0,01 buněčná linie HFF-1 vs. buněčná linie A-375. **p < 0,01 buněčná linie HFF-1 vs. buněčná linie IPC-298.
63
5.6. Mechanismus působení flavonoidů 5.6.1. Vliv flavonoidů na buněčný cyklus Analýza buněčného cyklu byla provedena u všech flavonoidů, ale pouze tři z nich vykazovaly odlišné rozložení fází cyklu ve srovnání s kontrolou. Buňky linie A-375 byly kultivovány s danými flavonoidy po dobu 24 hodin a poté byly analyzovány průtokovou cytometrií. Kontrolní buňky vykazují normální rozložení buněčného cyklu (Obr. 33A). Z výsledků analýzy buněčného cyklu je viditelné zvýšené procento buněk v sub-G1 fázi po účinku F2 (Obr. 33B) a F7 (Obr. 33D) v koncentraci 20 μg/ml. Sub-G1 fáze zobrazuje apoptotické nebo nekrotické buňky. V dalším experimentu jsme tedy prověřili schopnost flavonoidů indukovat apoptózu. U buněk ovlivněných F5 (Obr. 33C) dochází patrně k aneuploidii. A
B
C
D
intenzita fluorescence Obr. 33: Analýza buněčného cyklu. Výsledek cytometrické analýzy buněčného cyklu. Buňky linie A-375 byly kultivovány 24 hodin v přítomnosti F2 (B), F5 (C) a F7 (D) v koncentraci 20 μg/ml. Neovlivněné buňky představují kontrolu (A).
64
5.6.2. Detekce apoptózy K detekci apoptózy u flavonoidů jsme rovněž použili metodu WB. Buněčná linie A375 byla kultivována s F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 15 μg/ml po dobu 8, 12 a 24 hodin. Byly analyzovány stejné proteiny jako u alkaloidů, a to c-PARP a c-CASP-3. Oba proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Štěpený PARP byl detekován jen slabě pouze u F3 po 24 hodinách kultivace (Obr. 34). Štěpenou CASP-3 se nepodařilo detekovat po účinku
A
B
F7 (12 h)
F6 (12 h)
F5 (12 h)
F3 (12 h)
F2 (12 h)
F1 (12 h)
kontrola (12 h)
F7 (8 h)
F6 (8 h)
F5 (8 h)
F3 (8 h)
F2 (8 h)
F1 (8 h)
kontrola (8 h)
ani jednoho z testovaných flavonoidů.
c-PARP
C
F7 (24 h)
F6 (24 h)
F5 (24 h)
F3 (24 h)
F2 (24 h)
F1 (24 h)
kontrola (24 h)
PCNA
c-PARP PCNA
Obr. 34: WB analýza štěpeného proteinu PARP. Výsledek WB analýzy štěpeného proteinu PARP. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A), 12 (B) a 24 (C) hodinách v přítomnosti F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 15 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Štěpený PARP byl detekován pouze u F3 po 24 hodinách kultivace.
Apoptózu jsme se také pokusili zachytit analýzou jader značených DAPI. Buňky linie A-375 byly kultivovány jako u alkaloidů po dobu 12 hodin s F1, F3, F5, F6 v koncentraci 20 μg/ml, F2 a F7 v koncentraci 10 μg/ml. U kontrolních buněk jsou vidět neporušená pravidelná jádra (Obr. 35A). U buněk ovlivněných F2 (Obr. 35C), F6 (Obr. 35E) a F7 (Obr. 35F) dochází k fragmentaci jader. V přítomnosti F1 (Obr. 35B) a F5 (Obr. 35D) je pozorovatelná kondenzace chromatinu, mohlo by jít o počátek apoptózy. Buňky kultivované s F3 nevykazovaly žádnou fragmentaci jader a byly srovnatelné s kontrolou.
65
A
B
C
D
E
F
Obr. 35: Detekce apoptózy pomocí značení jader DAPI. Výsledek mikroskopické analýzy jader u buněk linie A-375, které byly kultivovány 12 hodin v přítomnosti F1, F3, F5, F6 v koncentraci 20 μg/ml, F2 a F7 v koncentraci 10 μg/ml. Kontrolní buňky mají pravidelná neporušená jádra (A). U buněk ovlivněných F2 (C), F6 (E) a F7 (F) je pozorovatelná apoptotická fragmentace jader. V přítomnosti F1 (B) a F5 (D) je vidět kondenzace chromatinu, která může znamenat začátek apoptózy. Měřítko – 32 μm.
66
5.6.3. Mechanismy indukce apoptózy U flavonoidů jsme se také zaměřili na snížení hladiny antiapoptotických proteinů, kterými jsou Bcl-xL a XIAP. Buňky linie A-375 byly kultivovány s F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 20 μg/ml po dobu 8 a 24 hodin. CAMPT v koncentraci 1 μM sloužil jako pozitivní kontrola. Antiapoptotický faktor XIAP se nepodařilo detekovat ani u jednoho ze vzorků. K výraznému snížení hladiny proteinu Bcl-xL došlo u F2, F3 a F7 po 8 i 24 hodinách kultivace (Obr. 36), přičemž u těchto tří flavonoidů bylo méně proteinů i v kontrole (PCNA) i přesto, že v připravených lyzátech byla u všech vzorků naměřena stejná koncentrace proteinů. Vzorek F7 po 24 hodinách kultivace nebylo možné hodnotit vůbec vzhledem k nulové detekci. Důvodem nestejného množství proteinů ve vzorcích kontroly (PCNA) může být metodická chyba nebo tyto flavonoidy mohou ovlivňovat i samotnou PCNA. Snížená detekce Bcl-xL byla znatelná ještě u F1 a F5 po 8 hodinách kultivace a F1 a F6 po 24 hodinách
A
F7 (24 h)
F6 (24 h)
F5 (24 h)
F3 (24 h)
F2 (24 h)
F1 (24 h)
CAMPT (24 h)
kontrola (24 h)
F7 (8 h)
F6 (8 h)
F5 (8 h)
F3 (8 h)
F2 (8 h)
F1 (8 h)
CAMPT (8 h)
kontrola (8 h)
kultivace.
Bcl-xL
B
PCNA 1,0
0,6
0,8
0,1
0,4
0,8
1,1
0,2
1,0
0,2
0,9
0,2
0,2
1,0
0,9
Obr. 36: WB analýza antiapoptotického proteinu Bcl-xL. Výsledek WB analýzy antiapoptotického proteinu Bcl-xL. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A) a 24 (B) hodinách v přítomnosti F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 20 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Výrazné snížení hladiny Bcl-xL nastalo u F2, F3 a F7 po 8 i 24 hodinách kultivace.
5.6.4. Poškození DNA působením flavonoidů U flavonoidů jsme rovněž pomocí WB testovali jejich schopnost poškodit DNA, a to detekcí fosforylace H2AX. Buňky linie A-375 byly kultivovány s F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 20 μg/ml po dobu 8 a 24 hodin. Jako pozitivní kontrola byl opět použit CAMPT v koncentraci 1 μM. Zvýšená hladina tohoto proteinu byla detekována u CAMPT, F2 a F6 po 8 i 24 hodinách kultivace a u F3 po 24 hodinách kultivace. Výrazná exprese γH2AX byla pozorována u F7 po 8 hodinách kultivace i přesto, že v kontrole (PCNA) bylo proteinů značně méně (Obr. 37). Možné příčiny rozdílného množství proteinů ve vzorcích s PCNA již byly
67
zmíněny. Snížená hladina γH2AX byla zaznamenána u F1, F3, F5 po 8 hodinách a u F1 a F5
γH2AX
B
A
F7 (24 h)
F6 (24 h)
F5 (24 h)
F3 (24 h)
F2 (24 h)
F1 (24 h)
CAMPT (24 h)
kontrola (24 h)
F7 (8 h)
F6 (8 h)
F5 (8 h)
F3 (8 h)
F2 (8 h)
F1 (8 h)
CAMPT (8 h)
kontrola (8 h)
po 24 hodinách kultivace.
PCNA 1,0
4,3
0,2
1,6
0,1
0,1
3,5
30,0
1,0
2,3
0,1
2,1
1,9
0,4
1,2
Obr. 37: WB analýza fosforylovaného histonu H2AX. Výsledek WB analýzy fosforylované formy histonu H2AX. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A) a 24 (B) hodinách v přítomnosti F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 20 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Nejvyšší hladina γH2AX byla detekována u F7 po 8 hodinách kultivace a následně u F6 a F2 po 8 i 24 hodinách kultivace.
WB analýzou jsme sledovali rovněž hladinu proteinu p53, který je známý jako „strážce genomu“ a při poškození DNA dochází ke zvýšení jeho hladiny. Buňky byly kultivovány s flavonoidy v koncentraci 15 μg/ml po dobu 8, 12 a 24 hodin. Protein byl detekován u všech vzorků (Obr. 38), přičemž jeho zvýšená hladina byla zaznamenána u F1 po 8 a 12 hodinách, F2 a F3 po 24 hodinách, F5 po 8 a 24 hodinách a u F6 a F7 po 12 a 24 hodinách kultivace. K mírnému snížení došlo u F1 po 24 hodinách, F2 a F3 po 8 a 12 hodinách, F5 po 12 hodinách kultivace, F6 po 8 hodinách kultivace a k výraznému snížení hladiny proteinu došlo u F7 po 8 hodinách kultivace. Avšak pouze u F6 a F7 je viditelné, že postupem času se zvyšuje exprese proteinu p53.
68
F7 (12 h)
F6 (12 h)
F5 (12 h)
F3 (12 h)
F2 (12 h)
F1 (12 h)
kontrola (12 h)
F7 (8 h)
F6 (8 h)
F5 (8 h)
F3 (8 h)
F2 (8 h)
F1 (8 h)
kontrola (8 h)
A
p53
B
PCNA 0,1
1,0
1,6
0,9
0,8
0,9
1,3
1,2
F7 (24 h)
0,8
F6 (24 h)
1,1
F5 (24 h)
0,9
F3 (24 h)
0,9
F2 (24 h)
1,2
F1 (24 h)
kontrola (24 h)
1,0
p53
C
PCNA 1,0
0,8
1,6
1,2
1,3
1,4
1,6
Obr. 38: WB analýza proteinu p53. Výsledek WB analýzy proteinu p53. Analýza byla provedena u buněk linie A-375 po 8 (A), 12 (B) a 24 (C) hodinách v přítomnosti F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 15 μg/ml. Proteiny byly separovány na 10% SDS gelu. Zvýšená hladina p53 byla detekována u F1 po 8 a 12 hodinách kultivace, F2 a F3 po 24 hodinách, F5 po 8 a 24 hodinách a u F6 a F7 po 12 a 24 hodinách kultivace.
5.6.5. Studium různých typů buněčné smrti Nejzajímavější výsledky v předchozích experimentech vykazoval F3, proto jsme se rozhodli zjistit kterou ze 3 typů buněčných smrtí (apoptózu, nekroptózu nebo autofagii) indukuje. Buňky A-375 byly opět 3 hodiny preinkubovány s inhibitory buněčných smrtí: 10 mM z-VAD-fmk (inhibitor apoptózy), 20 mM Nec-1 (inhibitor nekroptózy) a 0,25 M 3-MA (inhibitor autofagie). Poté k nim byl přidán F3 o koncentraci 15 μg/ml a buňky byly kultivovány dalších 45 hodin. Následně byla provedena PI exclusion assay. Po ovlivnění buněk samotným flavonoidem bylo přes 80 % mrtvých buněk (Obr. 39). Mírné snížení procenta mrtvých buněk nastalo v kombinaci s Nec-1.
69
% mrtvých buněk
100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0
Obr. 39: Typy buněčných smrtí. Výsledek cytometrické analýzy PI exclusion assay u buněk A-375. Buňky byly nejprve 3 hodiny preinkubovány s příslušnými inhibitory buněčných smrtí: z-VAD-fmk (10 mM), Nec-1 (20 mM), 3-MA (0,25 M) a kombinací z-VAD-fmk+Nec-1. Poté byly kultivovány 45 hodin v přítomnosti F3 v koncentraci 15 μg/ml. Pokles % mrtvých buněk nastal v kombinaci F3 s Nec-1, avšak výsledek není statisticky významný.
5.7. Testování schopnosti flavonoidů inhibovat ABC transportéry Také u flavonoidů jsme na buňkách HL-60/MDR testovali, zda mají schopnost inhibovat ABC transportéry. Testovali jsme všech 7 flavonoidů: F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 10 μg/ml a F4 v koncentraci 30 μg/ml. Jako pozitivní kontrolu jsme opět použili verapamil v koncentraci 20 μM. Z grafu je patrné, že intracelulární akumulace DOXO byla zvýšená pouze v přítomnosti F1 a F5 (Obr. 40), proto jsme se rozhodli dále testovat jen tyto dvě látky.
70
% kontroly
200,0 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0
koncentrace [μg/ml]
Obr. 40: Test akumulace DOXO po účinku flavonoidů. Výsledek cytometrické analýzy leukemické buněčné linie HL-60/MDR ovlivněné flavonoidy F1, F2, F3, F5, F6 a F7 v koncentraci 10 μg/ml a F4 v koncentraci 30 μg/ml. Verapamil v koncentraci 20 μM byl použit jako pozitivní kontrola. Zvýšená intenzita fluorescence naznačující vyšší akumulaci DOXO nastala pouze u F1 a F5.
V dalším experimentu jsme testovali již pouze dva dříve zmíněné flavonoidy – F1 a F5 v koncentraci 10 μg/ml. Výsledky 3 nezávislých experimentů ukázaly, že oba flavonoidy zvýšily intracelulární hladinu DOXO, ačkoli méně účinně než verapamil (Obr. 41). Účinek F1
% kontroly
a F5 nebyl statisticky významný. *
200,0 180,0 160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0 kontrola
DMSO
Verapamil
F1 10
F5 10
koncentrace [μg/ml] Obr. 41: Test akumulace DOXO po účinku F1 a F5. Výsledek cytometrické analýzy leukemické buněčné linie HL-60/MDR ovlivněné flavonoidy F1 a F5 v koncentraci 10 μg/ml. Verapamil v koncentraci 20 μM byl použit jako pozitivní kontrola. Zvýšená intenzita fluorescence nastala u obou látek, avšak není statisticky významná.
71
6. Diskuze Diplomová práce se zabývá screeningem alkaloidů a flavonoidů na vlastnosti, které jsou významné pro využití v protinádorové terapii. Screening je zaměřen na hledání látek s antiproliferační aktivitou a látek se schopností překonat mnohočetnou lékovou rezistenci blokádou P-glykoproteinu. V této práci bylo studováno 10 alkaloidů z 3 skupin: FAG a HOM patřící do skupiny benzofenanthridinů, COL, CRP, CRS, ESD, JAT a PAL, které se řadí mezi protoberberiny a CAL a ESL, což jsou alkaloidy pavinanové. Jedná se o látky, o jejichž biologické aktivitě je velmi málo publikací. Nejvíce prostudovaným alkaloidem je FAG, méně informací je pak o COL, CRP, JAT a PAL. O dalších pěti alkaloidech, HOM, CRS, ESD, CAL a ESL, nejsou dosud dostupné informace o jejich biologické aktivitě. Publikované studie jsou však spíše zaměřeny na antibakteriální, protizánětlivé, antioxidační a antiplasmodiální účinky. V naší laboratoři jsme se zaměřili na účinky protinádorové. Cytotoxicita byla testována pouze u FAG na myších leukemických buňkách L1210 (Prado et al., 2004) a lidských leukemických buňkách K562. Byly použity koncentrace 1 – 10 μM. Při koncentraci 6 μM nepřevyšovala smrt buněk 5 %. Se stoupající koncentrací alkaloidu docházelo k inhibici růstu buněk, která dosahovala zhruba kolem 80 % (Dupont et al., 2005). V naší práci jsme pro testování využili linii lidského maligního melanomu A-375. FAG byl nejtoxičtějším alkaloidem. Procento mrtvých buněk dosahovalo téměř k 50 % při koncentraci 50 μg/ml, což odpovídá zhruba 140 μM. Dílčím cílem této diplomové práce bylo zjistit, jakým mechanismem působí alkaloidy, které vykázaly antiproliferační aktivitu, na nádorové buňky. O FAG bylo známé, že v koncentraci 3,5 μM inhibuje proliferaci leukemických buněk K562 jejich akumulací v pozdní S a G2 fázi buněčného cyklu. Analýza byla provedena po 24, 48, 72 a 96 hodinách inkubace, přičemž k ustálení účinku FAG došlo po 48 hodinách inkubace. Se zvyšující se dobou inkubace docházelo i ke zvyšování množství buněk v dané fázi cyklu (Comoë et al., 1988). U myších leukemických buněk L1210 bylo prokázáno, že FAG v koncentraci 25 μM zastavuje buněčných cyklus v G2/M fázi (Prado et al., 2004). V obou případech byly použity opět nižší koncentrace, než byly účinné v našich experimentech. V našem experimentu prováděném na buňkách A-375 došlo u FAG v koncentraci 30 μg/ml (≈ 85 μM) k akumulaci
72
buněk patrně v S fázi po 24 hodinách inkubace. Tudíž jsme potvrdili, že FAG způsobuje zástavu buněčného cyklu u nádorových buněk. Také u CHLD bylo prokázáno, že ovlivňuje buněčný cyklus a způsobuje zástavu buněk v G2/M fázi po 24 hodinách inkubace u šesti buněčných linií důsledkem inhibice polymerizace tubulinu. V experimentu byly použity dvě linie normálních, nenádorových buněk (z opičích ledvin a Hs27), dvě linie transformovaných buněk (Vero a Gragam 293) a dvě nádorové linie (WHCO5 a HeLa) (Panzer et al., 2001). V této práci jsme prokázali, že i derivát CHLD, HOM, v koncentraci 50 μg/ml (≈ 135 μM) způsobuje akumulaci buněk patrně v G2/M fázi u melanomové buněčné linie A-375 rovněž po 24 hodinách inkubace. U COL bylo prokázáno, že má inhibiční účinek na proliferaci metastatických buněk osteosarkomu U2OS a jeho působením dochází ke zvýšení buněčné populace v G2/M fázi buněčného cyklu po 48 hodinách inkubace (Bao et al., 2012). Na melanomové buněčné linii A-375 se nám to však potvrdit nepodařilo. Analýzu na průtokovém cytometru jsme testovali po 24 hodinách inkubace. Hlavními diagnostickými znaky apoptózy jsou přítomnost c-PARP, c-CASP-3 a snížená exprese antiapoptotických faktorů (např. XIAP a Bcl-xL). c-PARP a c-CASP-3 byly detekovány pouze u FAG, hladina proteinu Bcl-xL byla po působení FAG snížená, ale antipoptotický faktor XIAP nebyl detekován vůbec. Tyto výsledky nás vedly k závěru, že FAG by mohl být induktorem apoptózy. U ostatních alkaloidů (CRS, ESL a HOM) nebyl detekován c-PARP, c-CASP-3, ani XIAP, ale došlo ke snížení hladiny proteinu Bcl-xL se zvyšující se dobou inkubace buněk s alkaloidy. Některé z alkaloidů interagují s DNA (Slaninová et al., 2007; Urbanová et al., 2009), proto jsme zjišťovali, zda dochází i k poškození DNA vlivem působení těchto látek. U FAG bylo navíc prokázáno, že inhibuje aktivitu topoizomerázy I a II, které jsou zodpovědné za jednořetězové i dvouřetězové zlomy v DNA (Larsen et al., 1993). Použili jsme detekci histonu γH2AX, který prokazuje dvouřetězové zlomy v DNA a detekci proteinu p53. Zvýšená hladina γH2AX byla zjištěna u FAG, u ESL a HOM byla detekována pouze po kratší době inkubace s buňkami. Protein p53 byl aktivován u CRS a FAG. U HOM došlo při kratší době expozice s buňkami ke zvýšené expresi tohoto proteinu, ale při delší době inkubace byla detekce p53 snížená. Z hlediska aktivity FAG jsme se zaměřili na studium mechanismu buněčné smrti, abychom zjistili, zda tento alkaloid spouští apoptózu, nekroptózu nebo autofagii. K tomu jsme
73
použili nízkomolekulární inhibitory drah buněčných smrtí: z-VAD-fmk, Nec-1 a 3-MA. Avšak ani jeden z inhibitorů nebyl příliš účinný a nedošlo k výraznému snížení toxicity FAG. Druhou oblastí, na kterou jsme se zaměřili, bylo ovlivnění ABC transportérů. ABC transportéry jsou již dlouho studovány, neboť mají schopnost pumpovat léčiva ven z buněk a tím přispívají k rezistenci nádorových buněk vůči chemoterapii. Použití látek, které blokují tyto transportéry v kombinaci s cytostatiky, umožňuje překonat mnohočetnou lékovou rezistenci. Proto jsme se rozhodli otestovat, zda tyto alkaloidy by mohly působit jako inhibitory P-glykoproteinu, což je nejznámější ABC transportér. K tomuto experimentu jsme použili buněčnou linii HL-60/MDR, která nadprodukuje P-glykoprotein. V tomto testu žádný z alkaloidů nevykázal pozitivní efekt, až na CRS, ale je nutno podotknout, že šlo o falešnou pozitivitu, neboť jsme zjistili, že vykazuje autofluorescenci, proniká do jadérek a patrně značí nejen DNA, ale i RNA. Fluorescenční vlastnosti a schopnost značit RNA jsme pozorovali i u PAL. V dnešní době se již používá jako fluorescenční sonda DNA a RNA (Li et al., 2009; Islam et al., 2009; Hirakawa et al., 2005). Druhou skupinou látek, kterou jsme se zabývali, byly flavonoidy. Bylo studováno 7 flavonoidů: 3´-O-methyldiplakon (F1), 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakon (F2), mimulon (F3), acteosid (F4), 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon (F5), 3´-O-methyldiplakol (F6) a kudraflavon B (F7). O těchto látkách je také velmi málo informací, co se týče jejich biologické aktivity. Nejvíce prostudovaným flavonoidem je patrně kudraflavon B, ostatní byly dosud zkoumány méně. Cytotoxicita byla již dříve testována u všech flavonoidů na liniích různého histologického původu, převážně na lidských leukemických liniích, a v různých časových intervalech. IC50 3´-O-methyldiplakonu (F1) se pohybovalo v rozmezí 9,2 – 80 μM (Šmejkal et al., 2007; Šmejkal et al., 2008a; Šmejkal et al., 2010). IC50 3´-O-methyl-5´-Ohydroxydiplakonu (F2) se u nádorových buněk pohybovalo mezi 5,5 – 7,4 μM, u nenádorové linie lidských fibroblastů 4,7 μM (Šmejkal et al., 2008a; Šmejkal et al., 2010). IC50 u mimulonu (F3) se pohybovalo v rozmezí 13 – 93 μM (Šmejkal et al., 2007; Šmejkal et al., 2008a; Murphy et al., 2005; Yoder et al., 2007). IC50 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakonu (F5) se pohybovalo v rozmezí 24 – 62 μM, u 3´-O-methyldiplakolu (F6) mezi 21 – 89 μM (Šmejkal et al., 2008a). Na nenádorovou linii lidských fibroblastů nevykazovaly flavonoidy F1, F5 a F6 žádnou toxicitu. Bylo zjištěno, že ortho-dihydroxy substituce na kruhu B (F5) zvyšuje cytotoxický účinek. Naopak para-hydroxy (F3) a methoxy substituce na kruhu B (F1,
74
F2, F6) snižuje cytotoxický účinek (Šmejkal et al., 2008a). IC50 u acteosidu (F4) se pohybovalo v rozmezí 30 – 42 μM (Šmejkal et al., 2008a; Papoutsi et al., 2006). Hodnota IC50 kudraflavonu B (F7) byla zjištěna v rozmezí 12,5 – 24,3 μM (Kollar et al., 2013; Zou et al., 2004; Arung et al., 2010). Je zřejmé, že toxicita jednotlivých flavonoidů je různá v závislosti na buněčné linii (Šmejkal et al., 2010; Zou et al., 2004). V naší laboratoři jsme testovali cytotoxicitu flavonoidů na melanomové buněčné linie A-375 a IPC-298 a na nenádorovou linii fibroblastů lidské předkožky HFF-1. Nejtoxičtější ze všech pro obě nádorové linie byl 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakon (F2; IC50 = 6 μg/ml, což odpovídá zhruba 13 μM), což se shoduje s informacemi z publikací, kde se tento flavonoid jevil také jako nejtoxičtější. Z výsledku vyplývá, že melanomové linie jsou pravděpodobně méně citlivé na působení tohoto alkaloidu. Stejně jako u alkaloidů, také u flavonoidů jsme studovali, zda mají vliv buněčný cyklus. Pouze u 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakonu (F2) a kudraflavonu B (F7) došlo ke zvýšení procenta buněk A-375 v sub-G1 fázi v koncentraci 20 μg/ml (± 46 μM u obou látek). Kollar a kol. však dříve popsal, že kudraflavon B od koncentrace 10 μM způsobuje akumulaci THP-1 buněk v G1 fázi po 24 hodinovém působení a inhibuje jejich vstup do S fáze (Kollar et al., 2013). Také u acteosidu (F4) bylo známo, že jeho účinkem dochází k zástavě buněk HL60 v G1 fázi při koncentraci 30 μM po 48 hodinové inkubaci (Lee et al., 2007). Na buňkách A-375 se nám zástava buněčného cyklu nepodařila po 24 hodinové inkubaci prokázat ani v koncentraci 20 μg/ml (≈ 32 μM) a 50 μg/ml (≈ 80 μM). U buněk inkubovaných s 3´-Omethyl-5´-O-methyldiplakonem (F5) došlo patrně k aneuploidii. V dalším experimentu jsme chtěli prověřit, zda mají flavonoidy schopnost indukovat apoptózu. K detekci jsme opět použili štěpený protein PARP a štěpenou CASP-3, ale i antiapoptotické faktory XIAP a Bcl-xL. c-CASP-3 a XIAP nebyly detekovány ani u jednoho z flavonoidů. c-PARP byl detekován pouze u mimulonu (F3). U kudraflavonu B (F7) bylo již dříve prokázáno, že u buněk THP-1 po 24 hodinové inkubaci došlo k detekci c-PARPu i cCASP-3 až po použité koncentraci 20 μM (Kollar et al., 2013). V naší laboratoři byla na buňky A-375 použita koncentrace vyšší (15 μg/ml ≈ 36 μM) a přesto jsme neprokázali zvýšenou expresi ani jednoho z proteinů. Sníženou hladinu proteinu Bcl-xL jsme detekovali u 3´-O-methyldiplakonu (F1), 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakonu (F2) a mimulonu (F3). U 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakonu (F5) a kudraflavonu B (F7) došlo
75
k poklesu tohoto proteinu po kratší době inkubace, u 3´-O-methyldiplakolu (F6) naopak po delší době inkubace. U flavonoidů nebylo dosud popsáno, zda jsou schopné interakce s DNA, a tak jsme se pokusili zjistit, zda jejich účinkem dochází k poškození DNA. Opět jsme použili detekci histonu γH2AX a proteinu p53. Zvýšená hladina γH2AX na buňkách A-375 byla zaznamenána u 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakonu (F2) a 3´-O-methyldiplakolu (F6). U kudraflavonu B (F7) došlo ke zvýšení hladiny pouze po 8 hodinách inkubace, u mimulonu (F3) po 24 hodinách inkubace. Zvýšená fosforylace γH2AX u kudraflavonu B byla dříve prokázána u buněk linie THP-1 po 24 hodinovém treatmentu při koncentraci 20 μM (Kollar et al., 2013). Protein p53 byl detekován u všech látek a k jeho upregulaci došlo u všech flavonoidů, a to v závislosti na délce inkubace s buňkami. U 3´-O-methyldiplakonu (F1) byla zvýšená hladina p53 pouze po 8 a 12 hodinách inkubace, u dalších flavonoidů byla zvýšená hladina tohoto proteinu detekována po 24 hodinách inkubace, u 3´-O-methyldiplakolu (F6) a kudraflavonu B (F7) rovněž i po 12 hodinách inkubace. Tyto výsledky ukazují na různou dynamiku účinku jednotlivých flavonoidů. Z hlediska aktivity mimulonu (F3) jsme se dále zaměřili na studium mechanismu buněčné smrti, abychom zjistili, zda tento flavonoid spouští apoptózu, nekroptózu či autofagii. K tomu jsme opět použili inhibitory buněčných smrtí: z-VAD-fmk, Nec-1 a 3-MA. Avšak ani jeden z inhibitorů nebyl příliš účinný a nedošlo k výraznému snížení toxicity. Překonání mnohočetné lékové rezistence nádorových buněk vůči chemoterapii blokací ABC transportérů jsme předpokládali především u flavonoidů, neboť u některých už to bylo prokázáno (Di Pietro et al., 2002; Ji et He, 2007; Yoo et al., 2007). Proto jsme se rozhodli otestovat i námi testované flavonoidy. Opět jsme použili buněčnou linii HL-60/MDR nadprodukující P-glykoprotein. Pozitivní účinek se projevil pouze u dvou flavonoidů: 3´-Omethyldiplakonu (F1) a 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakonu (F5).
76
7. Závěr Diplomová práce se zabývá studiem biologických účinků vybraných alkaloidů a flavonoidů na nádorové buněčné linie. Jedná se o látky, jejichž vlastnosti nebyly doposud podrobně prozkoumány. Výsledky práce ukazují u některých látek významnou biologickou aktivitu, která by mohla být předmětem podrobnějšího studia zaměřeného na využití těchto látek v protinádorové terapii. 1. Alkaloidy CRS, FAG a HOM a flavonoidy 3´-O-methyldiplakon (F1), 3´-O-methyl5´-O-hydroxydiplakon (F2), mimulon (F3), 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon (F5), 3´-O-methyldiplakol (F6) a kudraflavon B (F7) vykazují antiproliferační a cytotoxické účinky na buňky maligního melanomu. Nejtoxičtějším alkaloidem byl FAG, flavonoidem 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakon (F2). Účinek látek na jednotlivé buněčné linie se liší. 2. Bylo zjištěno, že některé alkaloidy i flavonoidy ovlivňují rozložení fází buněčného cyklu. FAG způsobil akumulaci buněk patrně v S fázi, HOM v G2/M fázi. U 3´-Omethyl-5´-O-hydroxydiplakonu (F2) a kudraflavonu B (F7) byl identifikován sub-G1 pík značící apoptotické nebo nekrotické buňky. Účinek 3´-O-methyl-5´-Omethyldiplakonu (F5) patrně způsobil aneuploidii. 3. Buněčná smrt indukovaná FAG a mimulonem (F3) je zprostředkována pravděpodobně apoptózou. CRS, ESL, FAG, HOM, 3´-O-methyldiplakon (F1), 3´-O-methyl-5´-Ohydroxydiplakon (F2), mimulon (F3), 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon (F5), 3´-Omethyldiplakol (F6) a kudraflavon B (F7) snižovaly hladiny proteinu Bcl-xL. 4. Významným faktorem indukujícím apoptózu je také poškození DNA, které bylo prokázáno u FAG detekcí γH2AX i p53. Zvýšenou hladinu γH2AX jsme rovněž prokázali u ESL a HOM, zvýšenou hladinu p53 u CRS a HOM. Poškození DNA u flavonoidů bylo prokázáno u 3´-O-methyl-5´-O-hydroxydiplakonu (F2), mimulonu (F3), 3´-O-methyldiplakolu (F6) a kudraflavonu B (F7). Protein p53 patrně hraje roli v odpovědi na všechny flavonoidy. 5. Jako nejzajímavější z hlediska potenciálních inhibitorů P-glykoproteinu se jevily 3´-Omethyldiplakon (F1) a 3´-O-methyl-5´-O-methyldiplakon (F5). 6. Alkaloidy CRS a PAL vykazují autofluorescenční vlastnosti a váží se na RNA a patrně i na DNA.
77
8. Seznam použitých zkratek A-375
buněčná linie odvozená od lidského maligního melanomu; z angl. human amelanotic melanoma cell line
ABC transportéry
z angl. ATP-binding cassette transporters
APS
persulfát amonný; z angl. ammonium persulfate
A-T
adenin-thymin
ATCC
z angl. American Type Culture Collection
ATP
adenosintrifosfát; z angl. adenosine triphosphate
BA
benzofenanthridinové
alkaloidy;
z angl.
benzo[c]phenanthridine
alkaloids Bcl-xL
antiapoptotický protein; z angl. B-cell lymphoma-extra large
BCRP
z angl. breast cancer resistance protein
BER
berberin/berberine
c-CASP-3
štěpená kaspáza-3; z angl. cleaved-Caspase-3
c-PARP
štěpená poly(ADP-ribóza) polymeráza; z angl. cleaved-poly(ADPribose) polymerase
CAMPT
kamptotecin; z angl. Camptothecin
CAL
kalifornidin/californidine
COL
kolumbamin/columbamine
CRP
korypalmin/corypalmine
CRS
korysamin/corysamine
DAPI
4,6-diamino-2-fenylindol
DMEM
z angl. Dulbecco´s modified Eagle´s medium
DMSO
dimethylsulfoxid
DNA
deoxyribonukleová kyselina; z angl. deoxyribonucleic acid
DOXO
doxorubicin
78
ECAC
Evropská sbírka živočišných kultur; European Collection of Animal Culture
ECL
z angl. enhanced chemiluminescent substrate
EDTA
kyselina ethylendiamintetraoctová; z angl. ethylenediaminetetraacetic acid
ESD
escholidin/escholidine
ESL
escholtzin/escholtzine
FAG
fagaronin/fagaronine
G-C
guanin-cytosin
γH2AX
fosforylovaný histon H2AX; z angl. H2A histone family, member X
HCl
kyselina chlorovodíková; z angl. hydrochloric acid
HFF-1
buněčná linie odvozená od fibroblastů z předkožky; z angl. human foreskin fibroblast
HL-60
buněčná linie lidské promyeloidní leukémie; z angl. human promyelotic leukemia cell line
HL-60/MDR
rezistentní buněčná linie lidské promyeloidní leukémie; z angl. human promyelocytic leukemia multidrug-resistance cell line
HOM
homochelidonin/homochelidonine
HRP
křenová peroxidáza; z angl. horseradish peroxidase
CHE
chelerytrin/chelerythrine
CHL
chelilutin/chelilutine
CHLD
chelidonin/chelidonine
CHR
chelirubin/chelirubine
IPC-298
buněčná linie maligního melanomu
JAT
jatrorrhizin/jatrorrhizine
MA
makarpin/macarpine
3-MA
3-methyladenin
79
MDR
mnohočetná léková rezistence; z angl. multidrug resistance
MRP2
z angl. multidrug resistance-associated protein 2
MTT
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
NaCl
chlorid sodný; z angl. sodium chloride
Nec-1
Necrostatin-1
NF-κB
jaderný faktor interagující s enhancerem genu pro lehký řetězec kappa u aktivovaných B lymfocytů; z angl. nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells
NPs
přírodní produkty; z angl. natural products
PA
protoberberinové alkaloidy; z angl. protoberberine alkaloids
PAL
palmatin/palmatine
PARP
poly(ADP-ribóza) polymeráza; z angl. poly(ADP-ribose) polymerase
PBS
fosfátový pufr; z angl. phosphate buffered saline
PCNA
proliferační buněčný jaderný antigen; z angl. proliferating cell nuclear antigen
P-gp
P-glykoprotein
PI
propidium jodid
QBA
kvartérní
benzofenanthridinové
alkaloidy;
z
angl.
quaternary
benzo[c]phenanthridine alkaloids QPA
kvartérní protoberberinové alkaloidy; z angl. quaternary protoberberine alkaloids
RIP1
z angl. receptor-interacting protein 1
RNA
ribonukleová kyselina; z angl. ribonucleic acid
RPM
otáčky za minutu; z angl. revolutions per minute
RPMI
z angl. Roswell Park Memorial Institute medium
SA
sanguinarin/sanguinarine
SDS
dodecylsulfát sodný; z angl. sodium dodecyl sulfate
80
SDS-PAGE
elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného; z angl. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SL
sanguilutin/sanguilutine
SR
sanguirubin/sanguirubine
TBS
z angl. Tris-buffered saline
TEMED
N,N,N´,N´-tetramethylethylendiamin
TNFα
tumor nekrotizující faktor α; z angl. tumour necrosis factor α
WB
z angl. western blot
XIAP
antiapoptotický protein (inhibitor kaspázy-9 a kaspázy-3); z angl. Xlinked inhibitor of apoptosis
z-VAD-fmk
inhibitor kaspáz; z angl. benzyloxycarbonyl-valyl-alanyl-aspartyl-(Omethyl)-fluoromethylketone
81
9. Seznam použité literatury Adhami V. M., Aziz M. H., Reagan-Shaw S. R., Nihal M., Mukhtar H., Ahmad N. 2004. Sanguinarine causes cell cycle blockade and apoptosis of human prostate carcinoma cells via modulation of cyclin kinase inhibitor-cyclin-cyclin-dependent kinase machinery. Mol Cancer Ther. 3 (8): 933–940. Ahmad N., Gupta S., Husain M. M., Heiskanen K. M., Mukhtar H. 2000. Differential Antiproliferative and apoptotic response of sanguinarine for cancer cells versus normal cells. Clin Cancer Res. 6 (4): 1524–1528. Alvarez A. I., Real R., Pérez M., Mendoza G., Prieto J. G., Merino G. 2010. Modulation of the Activity of ABC Transporters (P-Glycoprotein, MRP2, BCRP) by Flavonoids and Drug Response. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (2): 598–617. Androutsopoulos V. P., Papakyriakou A., Vourloumis D., Tsatsakis A. M., Spandidos D. A. 2010. Dietary flavonoids in cancer therapy and prevention: Substrates and inhibitors of cytochrome P450 CYP1 enzymes. Pharmacology & Therapeutics. 126 (1): 9–20. Asai T., Hara N., Kobayashi S., Kohshima S., Fujimoto Y. 2008. Geranylated flavanones from the secretion on the surface of the immature fruits of Paulownia tomentosa. Phytochemistry. 69 (5): 1234–1241. Arcamone F., Animati F., Capranico G., Lombardi P., Pratesi G., Manzini S., Supino R., Zunino F. 1997. New developments in antitumour anthracyclines. Pharmacol Ther. 76 (1–3): 117–124. Argyropoulou A., Aligiannis N., Trougakos I. P., Skaltsounis A-L. 2013. Natural compounds with anti-ageing activity. Nat. Prod. Rep. 30: 1412–1437. Arung E. T., Yoshikawa K., Shimizu K., Kondo R. 2010. Isoprenoid-substituted flavonoids from wood of Artocarpus heterophyllus on B16 melanoma cells: Cytotoxicity and structural criteria. Fitoterapia. 81 (2): 120–123. Bai L-P., Zhao Z-Z., Cai Z., Jiang Z-H. 2006. DNA-binding affinities and sequence selectivity of quaternary benzophenanthridine alkaloids sanguinarine, chelerythrine, and nitidine. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 14 (16): 5439–5445.
82
Bailly C. 2000. Topoisomerase I poisons and suppressors as anticancer drugs. Curr Med Chem. 7 (1): 39–58. Baker D. D., Chu M., Oza U., Rajgarhia V. 2007. The value of natural products to future pharmaceutical discovery. Nat. Prod. Rep. 24: 1225–1244. Bao M., Cao Z., Yu D., Fu S., Zhang G., Yang P., Pan Y., Yang B., Han H., Zhou Q. 2012. Columbamine suppresses the proliferation and neovascularization of metastatic osteosarcoma U2OS cells with low cytotoxicity. Toxicology Letters. 215: 174–180. Barron D., Ibrahim R. K. 1996. Isoprenylated Flavonoids – A Survey. Phytochemistry. 43 (5): 921–982. Bentley K. W. 1998. The Isoquinoline Alkaloids. Harwood Academic Publishers, Amsterdam. pp. 1–362. Bentley K. W. 1999. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep. 16: 367–388. Bentley K. W. 2000. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep. 17: 247–268. Bentley K. W. 2001. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep. 18: 148–170. Bentley K. W. 2002. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep. 19: 332–356. Bentley K. W. 2003. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep. 20: 342–365. Bentley K. W. 2004. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep. 21: 395–424. Bentley K. W. 2005. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep. 22: 249–268. Bentley K. W. 2006. β-Phenylethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep. 23: 444–463. 83
Bhadra K., Maiti M., Kumar G. S. 2007. Molecular recognitiion of DNA by small molecules: AT base pair specific intercalative binding of cytotoxic plant alkaloid palmatine. Biochimica et Biophysica Acta. 1770 (7): 1071–1080. Butler M. S. 2008. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Nat. Prod. Rep. 25: 475–516. Cahlíková L., Macáková K., Kunes J., Kurfürst M., Opletal L., Cvacka J., Chlebek J., Blundene G. 2010. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitory compounds from Eschscholtzia californica (Papaveraceae). Nat. Prod. Commun. 5 (7): 1035–1038. Chen C-N., Wu C-L., Lin J-K. 2004. Propolin C from propolis induces apoptosis through activating caspases, Bid and cytochrome c release in human melanoma cells. Biochemical Pharmacology. 67 (1): 53–66. Chen H-Y., Ye X-L., Cui X-L., He K., Jin Y-N., Chen Z., Li X-G. 2012. Cytotoxicity and antihyperglykemic effect of minor constituents from Rhizoma Coptis in HepG2 cells. Fitoterapia. 83 (1): 67–73. Chen J-W., Zhu Z-Q., Hu T-X., Zhu D-Y. 2002. Structure-activity relationship of natural flavonoids in hydroxyl radical-scavenging effects. Acta. Pharmacol. Sin. 23 (7): 667–672. Colombo M. L., Bosisio E. 1996. Pharmacological activities of Chelidonium majus L. (Papaveraceae). Pharmacological Research. 33 (2): 127–134. Colombo M. L., Bugatti C., Mossa A., Pescalli N., Piazzoni L., Pezzony G., Menta E., Spinelli S., Johnson F., Gupta R. C., Dasaradhi L. 2001. Cytotoxicity evaluation of natural coptisine and synthesis of coptisine from berberine. Il Farmaco. 56: 403–409. Comoë L., Carpentier Y., Desoize B., Jardilier J-C. 1988. Effect of fagaronine on cell cycle progression of human erythroleukemia K562 cells. Leukemia Research. 12 (8): 667– 672. Cragg G. M., Newman D. J. 2013. Natural products: a continuing source of novel drug Leeds. Biochimica et Biophysica Acta. 1830: 3670–3695. Cragg G. M., Grothaus P. G., Newman D. J. 2014. New Horizons for Old Drugs and Drug Leads. J. Nat. Prod. 77:703–723.
84
Debiton E., Madelmont J. C., Leqault J., Barthomeuf C. 2003. Sanguinarine-induced apoptosis is associated with an early and severe cellular glutathione depletion. Cancer Chemother Pharmacol. 51 (6): 474–482. Di Pietro A., Conseil G., Pérez-Victoria J. M., Dayan G., Baubichon-Cortay H., Trompier D., Steinfels E., Jault J. M., de Wet H., Maitrejean M., Comte G., Boumendjel A., Mariotte A. M., Dumontet C., McIntosh D. B., Goffeau A., Castanys S., Gamarro F., Barron D. 2002. Modulation by flavonoids of cell multidrug resistance mediated by Pglycoprotein and related ABC transporters. Cell. Mol. Life. Sci. 59 (2): 307–322. Dostál J., Slavík J. 2000. Recent Knowledge on Sanguinarine and Related Alkaloids. Chem Listy. 94: 15–20. Dostál
J.,
Slavík
J.
2002.
Some
aspects
of
the
chemistry
of
quaternary
benzo[c]phenanthridine alkaloids. Studies in Natural Products Chemistry. 27: 155–184. Dupont C., Couillerot E., Gillet R., Caron C., Zeches-Hanrot M., Riou J-F., Trentesaux C. 2005. The Benzophenanthridine Alkaloid Fagaronine Induces Erythroleukemic Cell Differentiation by Gene Activation. Planta Med. 71: 489–494. Filipits M. 2004. Mechanisms of cancer: multidrug resistance. Drug Discovery Today: Disease Mechanisms. 1 (2): 229–234. Geraets L., Haegens A., Brauers K., Haydock J. A., Vernooy J. H., Wouters E. F., Bast A., Hageman G. J. 2009. Inhibition of LPS-induced pulmonary inflammation by specific flavonoids. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382 (3): 598–603. Gewirtz D. A. 1999. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumour effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin. Biochem Pharmacol. 57 (7): 727–741. Gözler B., Lantz M. S., Shamma M. 1983. The Pavine and Isopavine Alkaloids. J. Nat. Prod. 46 (3): 293–309. Grothaus P. G., Cragg G. M., Newman D. J. 2010. Plant Natural Products in Anticancer Drug Discovery. Current Organic Chemistry. 14: 1781–1791.
85
Grycová L., Dostál J., Marek R. 2007. Quaternary protoberberine alkaloids. Phytochemistry. 68: 150–175. Guédon D., Cappelaere N., Simanek V. 1990. HPLC Analysis of the main alkaloids from Eschscholtzia Californica cham. Phytochemical Analysis. 1 (2): 77–82. Hammerová J., Uldrijan S., Táborská E., Slaninová I. 2011. Benzo[c]phenanthridine alkaloids exhibit strong anti-proliferative activity in malignant melanoma cells regardless of their p53 status. Journal of Dermatological Science. 62: 22–35. Hammerová J., Uldrijan S., Táborská E., Vaculová A. H., Slaninová I. 2012. Necroptosis modulated by autophagy is a predominant form of melanoma cell death induced by sanguilutine. Biol. Chem. 393: 647–658. Hirakawa K., Kawanishi S., Hirano T. 2005. The mechanism of guanine specific photooxidation in the presence of berberine and palmatine: activation of photosensitized singlet oxygen generation through DNA-binding interaction. Chem Res Toxicol. 18 (10): 1545–1552. Hošek J., Závalová V., Šmejkal K., Bartoš M. 2010. Effect of Diplacone on LPS-Induced Inflammatory Gene Expression in Macrophages. Folia Biologica. 56: 124–130. Hošek J., Bartos M., Chudík S., Dall’Acqua S., Innocenti G., Kartal M., Kokoška L., Kollár P., Kutil Z., Landa P., Marek R., Závalová V., Žemlička M., Šmejkal K. 2011. Natural Compound Cudraflavone B Shows Promising Anti-inflammatory Properties in Vitro. J. Nat. Prod. 74: 614–619. Imai Y., Tsukahara S., Asada S., Sugimoto Y. 2004. Phytoestrogens/flavonoids reverse breast cancer resistance protein/ABCG2-mediated multidrug resistance. Cancer Res. 64 (12): 4346–4352. Ingrid H., Kurt S. 1968. Antifungal aktivity of radix Colombo [calumba Jatrorrhiza palmate, root] components. Pharm. Ztg. 113: 50–945. Islam M. M., Chowdhury S. R., Kumar G. S. 2009. Spectroscopic and Calorimetric Studies on the Binding of Alkaloids Berberine, Palmatine and Coralyne to Double Stranded RNA Polynucleotides. J. Phys. Chem. B. 113 (4): 1210–1224.
86
Ivanovska N., Philipov S. 1996. Study on the anti-inflammatory action of Berberis vulgaris root extract, alkaloid fractions and pure alkaloids. Int. J. Immunopharmacol. 18 (10): 553– 561. Iwasa K., Kim H.-S., Wataya Y., Lee D.-U. 1998a. Antimalarial activity and structureactivity relationships of protoberberine alkaloids. Eur. J. Med. Chem. 33: 65–69. Iwasa K., Lee D.-U., Kang S.-I., Wiegrebe W. 1998b. Antimicrobial activity of 8-alkyl- and 8-phenyl-substituted berberines and their 12-bromo derivatives. J. Nat. Prod. 61 (9): 1150– 1153. Iwasa K., Moriyasu M., Nader B. 2000. Fungicidal and herbicidal activities of berberine related alkaloids. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64 (9): 1998–2000. Ji B. S., He L. 2007. CJY, an isoflavone, reverses P-glycoprotein-mediated multidrugresistance in doxorubicin-resistant human myelogenous leukaemia (K562/DOX) cells. J. Pharm. Pharmacol. 59 (7): 1011–1015. Jiang T-F., Du X., Shi Y-P. 2004. Determination of Flavonoids from Paulownia tomentosa (Thunb) Steud by Micellar Electrokinetic Capillary Electrophoresis. Chromatographia. 59 (34): 255–258. Jordan M. A., Thrower D., Wilson L. 1991. Mechanism of Inhibition of Cell Proliferation by Vinca Alkaloids. Cancer Research. 51: 2212–2222. Kang K. H., Jang S. K., Kim B-K., Park M. K. 1994. Antibacterial phenylpropanoid glycosides from Paulownia tomentosa Steud. Arch. Pharm. Res. 17 (6): 470–475. Kikuchi T., Nihei M., Nagai H., Fukushi H., Tabata K., Suzuki T., Akihisa T. 2010. Albanol A from the Root Bark of Morus alba L. Induces Apoptotic Cell Death in HL60 Human Leukemia Cell Line. Chem. Pharm. Bull. 58 (4): 568–571. Kokoška L., Polesný Z., Rada V., Nepovim A., Vaněk T. 2002. Screening of some Siberian medicinal plants for antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 82: 51–53. Kollar P., Bárta T., Hošek J., Souček K., Müller Závalová V., Artinian S., Talhouk R., Šmejkal K., Suchý Jr. P., Hampl A. 2013. Prenylated Flavonoids from Morus alba L. Cause Inhibition of G1/S Transition in THP-1 Human Leukemia Cells and Prevent the
87
Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Response. Evid. Based Complement. Alternat. Med. 13. Kovář J., Šimek K., Kožoušková E., Klukanová H., Slavík J. 1985. Fluorescence properties of some isoquinoline alkaloids. Collect. Czech. Chem. Commun. 50: 1312–1328. Kumazawa S., Ueda R., Hamasaka T., Fukumoto S., Fujimoto T., Nakayama T. 2007. Antioxidant Prenylated Flavonoids from Propolis Collected in Okinawa, Japan. J. Agric. Food Chem. 55: 7722–7725. Kuo C. L., Chou C. C., Yung B. Y.-M. 1995. Berberine complexes with DNA in the berberine-induced apoptosis in human leukemic HL-60 cells. Cancer Letters. 93: 193–200. Larsen A. K., Grondard L., Couprie J., Desoize B., Comoe L., Jardillier J. C., Riou J. F. 1993. The antileukemic alkaloid fagaronine is an inhibitor of DNA topoisomerases I and II. Biochem Pharmacol. 46 (8): 1403–1412. Lee K-W., Kim H. J., Lee Y. S., Park H-J., Choi J-W., Ha J., Lee K-T. 2007. Acteoside inhibits human promyelotic HL-60 leukemia cell proliferation via inducing cell cycle arrest at G0/G1 phase and differentiation into monocyte. Carcinogenesis. 28 (9): 1928–1936. Lee S-S., Liu Y-C., Chen C-H. 1990. Neocaryachine, a new pavine alkaloid from Cryptocarya chinensis, and NMR spectral properties of related alkaloids. Journal of Natural Products. 53 (5): 1267–1271. Leng S. H., Lu F. E., Xu L. J. 2004. Therapeutic effects of berberine in impaired glucose tolerance rats and its influence on insulin secretion. Acta Pharmacol. Sin. 25 (4): 496–502. Lerchen H. G. 2002. Milestones in camptothecin research. Drugs Fut. 27 (9): 869. Li J., Shuang S., Dong C. 2009. Study on the phosphorescence characterizations of palmatine chloride on the solid substrate and its interaction with ctDNA. Talanta. 77 (3): 1043–1049. Li T.-K., Bathory E., LaVoie E. J., Srinivasan A. R., Olson W. K., Sauers R. R., Liu L. F., Pilch D. S. 2000. Human Topoisomerase I Poisoning by Protoberberines: Potential Roles for Both Drug–DNA and Drug–Enzyme Interactions. Biochemistry. 39: 7107–7116.
88
Li W.-Y., Lu H., Xu C.-X., Zhang J.-B., Lu Z.-H. 1998. Spectroscopic and Binding Properties of Berberine to DNA and Its Aplication to DNA Detection. Spectroscopy Letters. 31 (6): 1287. Li Y., Fang H., Xu W. 2007. Recent advance in the research of flavonoids as anticancer agents. Mini Rev. Med. Chem. 7 (7): 663–678. Lin N., Sato T., Takayama Y., Mimaki Y., Sashida Y., Yano M., Ito A. 2003. Novel antiinflammatory actions of nobiletin, a citrus polymethoxy flavonoid, on human synovial fibroblasts and mouse macrophages. Biochem. Pharmacol. 65 (12): 2065–2071. Liu H. L., Jiang W. B., Xie M. X. 2010. Flavonoids: recent advances as anticancer drugs. Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 5 (2): 152–164. Liu X., Hu Z., Shi Q., Zeng H., Shen Y., Jin H., Zhang W. 2010. Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of compounds from Tinospora sagittata (Oliv.) Gagnep. Arch. Pharm. Res. 33 (7): 981–987. Maiti M., Kumar G. S. 2007. Molecular aspects on the interaction of protoberberine, benzophenanthridine, and aristolochia group of alkaloids with nucleic acid structures and biological perspectives. Med. Res. Rev. 27 (5): 649–695. Maurya S., Srivastava J. S., Jha R. N., Pandey V. B., Singh U. P. 2002. Efficacy of Alkaloid (-)-Corypalmine against Spore Germination of Some Fungi. Folia Microbiol. 47 (3): 287–290. Messmer W. M., Tin-wa M., Fong H. H. S., Bevelle C., Farnsworth N. R., Abraham D. J., Trojánek J. 1972. Fagaronine, a new tumour inhibitor isolated from Fagara zanthoxyloides lam. (rutaceae). Journal of Pharmaceutical Sciences. 61 (11): 1858–1859. Middleton E., Jr., Kandaswami Ch., Theoharides T. C. 2000. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacological Reviews. 52 (4): 673–751. Misík V., Bezáková L., Máleková L., Kostálová D. 1995. Lipoxygenase inhibition and antioxidant properties of protoberberine and aporphine alkaloids isolated from Mahonia aquifolium. Planta Med. 61 (4): 372–373.
89
Molinski T. F., Dalisay D. S., Lievens S. L., Saludes J. P. 2009. Drug development from marine natural products. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (1): 69–85. Mukherjee A. K., Basu S., Sarkar N., Ghosh A. C. 2001. Advances in Cancer Therapy with Plant Based Natural Products. Current Medicinal Chemistry. 8 (12): 1467–1486. Murphy B. T., Cao S., Norris A., Miller J. S., Ratovoson F., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I. 2005. Cytotoxic Flavanones of Schizolaena hystrix from the Madagascar Rainforest. J. Nat. Prod. 68 (3): 417–419. Navrátilová A., Schneiderová K., Veselá D., Hanáková Z., Fontana A., Dall´Acqua S., Cvačka J., Innocenti G., Novotná J., Urbanová M., Pelletier J., Čížek A., Žemličková H., Šmejkal K. 2013. Minor C-geranylated flavanones from Paulownia tomentosa fruits with MRSA antibacterial activity. Phytochemistry. 89: 104–113. Newman D. J., Cragg G. M., Battershill C. N. 2009. Therapeutic agents from the sea: biodiverzity, chemo-evolutionary insight and advances to the end of Darwin’s 200th year. Diving and Hyperbaric Medicine. 39 (4): 216–225. Newman D. J., Cragg G. M. 2012. Natural Products As Sources of New Drugs over the 30 Years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products. 75 (3): 311–335. Orfila L., Rodríguez M., Colman T., Hasegawa M., Merentes E., Arvelo F. 2000. Structural modification of berberine alkaloids in relation to cytotoxic aktivity in vitro. Journal of Ethnopharmacology. 71 (3): 449–456. Ozben T. 2006. Mechanisms and strategies to overcome multiple drug resistance in cancer. FEBS Letters. 580 (12): 2903–2909. Pahl H. L. 1999. Activators and target genes of Rel/NF-κB transcription factors. Oncogene. 18: 6853–6866. Panzer A., Joubert A. M., Bianchi P. C., Hamel E., Seegers J. C. 2001. The effects of chelidonine on tubulin polymerisation, cell cycle progression and selected signal transmission pathways. European Journal of Cell Biology. 80: 111–118.
90
Papoutsi Z., Kassi E., Mitakou S., Aligiannis N., Tsiapara A., Chrousos G. P., Moutsatsou P. 2006. Acteoside and martynoside exhibit estrogenic/antiestrogenic properties. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 98 (1): 63–71. Peterson J., Dwyer J. 1998. Flavonoids: Dietary occurrence and biochemical activity. Nutrition Research. 18 (12): 1995–2018. Prado S., Michel S., Tillequin F., Koch M., Pfeiffer B., Pierré A., Léonce S., Colson P., Baldeyrou B., Lansiaux A., Bailly C. 2004. Synthesis and cytotoxic activity of benzo[c][1,7] and [1,8]phenanthrolines analogues of nitidine and fagaronine. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 12: 3943–3953. Rivaud M., Mendoza A., Sauvain M., Valentin A., Jullian V. 2012. Short synthesis and antimalarial activity of fagaronine. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 20: 4856–4861. Robinson T. 1974. Metabolism and Function of Alkaloids in Plants. Science. 184 (4135): 430–435. Rolland A., Fleurentin J., Lanhers M.-C., Younos C., Misslin R., Mortier F., Pelt J. M. 1991. Behavioural Effects of the American Traditional Plant Eschscholtzina californica: Sedative and Anxiolytic Properties. Planta Med. 57 (3): 212–216. Schmeller T., Latz-Brüning B., Wink M. 1997. Biochemical activities of berberine, palmatine and sanguinarine mediating chemical defence against microorganism and herbivores. Phytochemistry. 44 (2): 257–266. Schneiderová K., Šmejkal K. 2014. Phytochemical profile of Paulownia tomentosa (Thunb.) Steud. Phytochem Rev. 1–35. Schrickx J., Lektarau Y., Fink-Gremmels J. 2006. Ochratoxin A secretion by ATPdependent membrane transporters in Caco-2 cells. Arch. Toxicol. 80 (5): 243–249. Sen A., Maiti M. 1994. Interaction of sanguinarine iminium and alkanolamine form with calf thymus DNA. Biochem. Pharmacol. 48 (11): 2097–2102. Sethi M. L. 1985. Comparison of inhibition of reverse transcriptase and antileukemic activities exhibited by protoberberine and benzophenanthridine alkaloids and structureactivity relationships. Phytochemistry. 24 (3): 447–454.
91
Shen S-C., Ko C. H., Tseng S-W., Tsai S-H., Chen Y-C. 2004. Structurally related antitumour effects of flavanones in vitro and in vivo: involvement of caspase 3 activation, p21 gene expression, and reactive oxygen species production. Toxicology and Applied Pharmacology. 197 (2): 84–95. Slaninová I., Táborská E., Bochořáková H., Slanina J. 2001. Interaction of benzo[c]phenanthridine and protoberberine alkaloids with animal and yeast cells. Cell Biology and Toxicology. 17: 51–63. Slaninová I., Slanina J., Táborská E. 2007a. Quaternary Benzo[c]phenanthridine Alkaloids – Novel Cell Permeant and Red Fluorescing DNA Probes. Cytometry Part A. 71A: 700–708. Slaninová I., Slunská Z., Šinkora J., Vlková M., Táborská E. 2007b. Screening of Minor Benzo(c)phenanthridine
Alkaloids
for
Antiproliferative
and
Apoptotic
Activities.
Pharmaceutical Biology. 45 (2): 131–139. Slaninová I., Pěnčíková K., Urbanová J., Slanina J., Táborská E. 2014. Antitumour activities of sanguinarine and related alkaloids. Phytochem. Rev. 13: 9290–9298. Slavík J. 1955. [Papaveraceae alkaloids. I. Chelidonium majus L. substances]. Cesk. Farm. 4 (1): 15–17. Slavík J., Slavíková L. 1975. On alkaloids from the leaves of Bocconia frutescens L. Collection Czechoslov. Chem. Commun. 40: 3206–3210. Slavík J., Slavíková L. 1979. Alkaloids from Corydalis cava (L.) SCHW. et KOERTE. Collection Czechoslov. Chem. Commun. 44: 2261–2274. Slavík J., Picka K., Slavíková L., Táborská E., Věžník F. 1980. Quaternary alkaloids of some species of the Papaveraceae family. Collection Czechoslov. Chem. Commun. 45: 914– 920. Slavík J., Dolejš L., Slavíková L. 1985. Alkaloids from Corydalis solida (L.) SW. Mass spectrometry of quaternary benzylisoquinoline alkaloids. Collection Czechoslov. Chem. Commun. 50: 2299–2309. Slavík J., Slavíková L. 1986. On alkaloids from the aerial parts of three Eschscholtzia species. Collect. Czech. Chem. Commun. 51: 1743–1751.
92
Slavík J., Slavíková L. 1995. Quaternary Isoquinoline Alkaloids and Some Diterpenoid Alkaloids in Plants of the Czech Republic. Collect. Czech. Chem. Commun. 60: 1034–1041. Slobodníková L., Kosťálová D., Labudová D., Kotulová D., Kettmann V. 2004. Antimicrobial activity of Mahonia aquifolium crude extracts and its major isolated alkaloids. Phytother. Res. 18 (8): 674–676. Slunská Z., Gelnarová E., Hammerová J., Táborská E., Slaninová I. 2010. Effect of quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids sanguilutine and chelilutine on normal and cancer cells. Toxicol. In Vitro. 24 (3): 697–706. Soobrattee M. A., Neergheen V. S., Luximon-Ramma A., Aruoma O. I., Bahorun T. 2005. Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: Mechanism and actions. Mutation Research. 579 (1–2): 200–213. Stermitz F. R., McMurtrey K. D. 1969. Alkaloids of the Papaveraceae. X. New alkaloids from Argemone gracilenta. J. Org. Chem. 34 (3): 555–559. Sturm S., Stuppner H. 1998. Analysis of isoquinoline alkaloids in medicinal plants by capillary electrophoresis – mass spectrometry. Electrophoresis. 19: 3026–3032. Šimánek V. 1985. Benzophenanthridine alkaloids. The Alkaloids. 26: 186–191. Šimánek V., Vespalec R., Šedo A., Ulrichová J., Vičar J. 2003. Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids – biological activities. Chemical Probes in Biology. 245– 254. Šmejkal K., Grycová L., Marek R., Lemie`re F., Jankovská D., Forejtníková H., Vančo J., Suchý V. 2007. C-Geranyl Compounds from Paulownia tomentosa Fruits. J. Nat. Prod. 70: 1244–1248. Šmejkal K., Babula P., Šlapetová T., Brognara E., Dall’Acqua S., Žemlička M., Innocenti G., Cvačka J. 2008a. Cytotoxic Activity of C-Geranyl Compounds from Paulownia tomentosa Fruits. Planta Med. 74: 1488–1491. Šmejkal K., Chudík S., Klouček P., Marek R., Cvačka J., Urbanová M., Julínek O., Kokoška L., Šlapetová T., Holubová P., Zima A., Dvorská M. 2008b. Antibacterial CGeranylflavonoids from Paulownia tomentosa Fruits. J. Nat. Prod. 71: 706–709.
93
Šmejkal K., Svačinová J., Šlapetová T., Schneiderová K., Dall´Acqua S., Innocenti G., Závalová V., Kollár P., Chudík S., Marek R., Julínek O., Urbanová M., Kartal M., Csöllei M., Doležal K. 2010. Cytotoxic Activities of Several Geranyl-Substituted Flavanones. J. Nat. Prod. 73: 568–572. Šmejkal K. 2014. Cytotoxic potential of C-prenylated flavonoids. Phytochem. Rev. 13 (1): 245–275. Taiwo O., Xu H-X., Lee S. F. 1999. Antibacterial Activities of Extracts from Nigerian Chewing Sticks. Phytother. Res. 13: 675–679. Tsuchiya H., Iinuma M. 2000. Reduction of membrane fluidity by antibacterial sophoraflavanone G isolated from Sophora exigua. Phytomedicine. 7 (2): 161–165. Urbanová J., Lubal P., Slaninová I., Táborská E., Táborský P. 2009. Fluorescence properties of selected benzo[c]phenanthridine alkaloids and studies of their interaction with CT DNA. Anal Bioanal Chem. 394: 997–1002. van Zanden J. J., van der Woude H., Vaessen J., Usta M., Wortelboer H. M., Cnubben N. H., Rietjens I. M. 2007. The effect of quercetin phase II metabolism on its MRP1 and MRP2 inhibiting potential. Biochem. Pharmacol. 74 (2): 345–351. Vennerstrom J. L., Klayman D. L. 1988. Protoberberine alkaloids as antimalarials. J. Med. Chem. 31 (6): 1084–1087. Vespalec R., Barták P., Šimánek V., Vlčková M. 2003. Electrophoretic investigation of interactions of sanguinarine and chelerythrine with molecules containing mercapto group. Journal of Chromatography B. 798 (1–2): 357–366. Vochyánová Z., Bartošová L., Bujdáková V., Fictum P., Husník R., Suchý P., Šmejkal K., Hošek J. 2015. Diplacone and mimulone ameliorate dextran sulfate sodium-induced colitis in rats. Fitoterapia. 101: 201–207. Walterová D., Ulrichová J., Válka I., Vičar J., Vavrečková C., Táborská E., Harjrader R. J., Meyer D. L., Černá H., Šimánek V. 1995. Benzo[c]phenanthridine alkaloids sanguinarine and chelerythrine: biological activities and dental care applications. Acta Univ. Palacki. Olomuc. Fac. Med. 139: 7–16.
94
Wolff J., Knipling L. 1993. Antimicrotubule Properties of Benzophenanthridine Alkaloids. Biochemistry. 32: 13334–13339. Wright C. W., Marshall S. J., Russell P. F., Anderson M. M., Phillipson J. D., Kirby G. C., Warhurst D. C., Schiff P. L. 2000. In Vitro Antiplasmodial, Antiamoebic, and Cytotoxic Activities of Some Monomeric Isoquinoline Alkaloids. J. Nat. Prod. 63 (12): 1638–1640. Yamamoto S., Seta K., Morisco C., Vatner S. F., Sadoshima J. 2001. Chelerythrine rapidly induces apoptosis through generation of reactive oxygen species in cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 33 (10): 1829–1848. Yazaki K., Sasaki K., Tsurumaru Y. 2009. Prenylation of aromatic compounds, a key diversification of plant secondary metabolites. Phytochemistry. 70 (15–16): 1739–1745. Yoder B. J., Cao S., Norris A., Miller J. S., Ratovoson F., Razafitsalama J., Andriantsiferana R., Rasamison V. E., Kingston D. G. I. 2007. Antiproliferative Prenylated Stilbenes and Flavonoids from Macaranga alnifolia from the Madagascar Rainforest. J. Nat. Prod. 70 (3): 342–346. Yoo H. H., Lee M., Chung H. J., Lee S. K., Kim D. H. 2007. Effects of diosmin, a flavonoid glycoside in citrus fruits, on P-glycoprotein-mediated drug efflux in human intestinal Caco-2 cells. J. Agric. Food. Chem. 55 (18): 7620–7625. Yu R., Mandlekar S., Tan T. H., Kong A. N. 2000. Activation of p38 and c-Jun N-terminal kinase pathways and induction of apoptosis by chelerythrine do not require inhibition of protein kinase C. J. Biol. Chem. 275 (13): 9612–9619. Yu X. Q., Xue C. C., Wang G., Zhou S. F. 2007. Multidrug resistance associated proteins as determining factors of pharmacokinetics and pharmacodynamics of drugs. Curr. Drug Metab. 8 (8): 787–802. Zhang S., Yang X., Coburn R. A., Morris M. E. 2005. Structure activity relationships and quantitative structure activity relationships for the flavonoid-mediated inhibition of breast cancer resistance protein. Biochem. Pharmacol. 70 (4): 627–639. Zhu Z-H., Chao C-J., Lu X-Y., Xiong Y. G. 1986. Paulownia in China: cultivation and utilization. Asian Network for Biological Science and International Development Research
95
Centre,
Chinese
Academy
of
Forestry,
Beijing.
http://idl-
bnc.idrc.ca/dspace/bitstream/10625/8226/1/71235.pdf. (citováno dne 24. 2. 2015) Zima A., Hošek J., Treml J., Muselík J., Suchý P., Pražanová G., Lopes A., Žemlička M. 2010. Antiradical and Cytoprotective Activities of Several C-Geranyl-substituted Flavanones from Paulownia tomentosa Fruit. Molecules. 15: 6035–6049. Zou Y-S., Hou A-J., Zhu G-F., Chen Y-F., Sun H-D., Zhao Q-S. 2004. Cytotoxic isoprenylated xanthones from Cudrania tricuspidata. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 12 (8): 1947–1953.
Seznam internetových zdrojů URL1: Wikimedia Commons: Chelidonium majus. [online]. 2015 [cit. 2015-01-28]. Dostupné z:
. URL2: Flickr: Plume poppy Macleaya cordata. [online]. [cit. 2015-01-28]. Dostupné z: . URL3: Asianflora: Dicranostigma lactucoides. [online]. [cit. 2015-01-28]. Dostupné z: . URL4: Division of forests and lands: Plants of rich mesic forests in New Hampshire. [online]. [cit.
2015-01-28].
Dostupné
z:
lands/bureaus/natural-heritage-bureau/photo-index/richmesicforestplants.aspx>. URL5: Plantthis: Berberis aristata. [online]. 2015 [cit. 2015-01-29]. Dostupné z: . URL6: Gaolongxiao: Coptis chinensis Franch. [online]. [cit. 2015-01-29]. Dostupné z: . URL7: Wikipedia: Eschscholzia californica. [online]. 2015 [cit. 2015-01-29]. Dostupné z: . 96
URL8: Paulownia tomentosa. [online]. [cit. 2015-02-24]. Dostupné z: . URL9: Wikimedia Commons: Morus alba. [online]. 2015 [cit. 2015-02-24]. Dostupné z: . URL10: Wildflowerfinder: Barberry. [online]. 2015 [cit. 2015-04-03]. Dostupné z: . URL11: Chemfaces: Corypalmine. [online]. 2015 [cit. 2015-04-03]. Dostupné z: . URL12: Chemical Trading Guide: Corysamine. [online]. 2015 [cit. 2015-04-23]. Dostupné z: . URL13: Pubchem: Open Chemistry Database. [online]. [cit. 2015-04-23]. Dostupné z: . URL14: Chemical Trading Guide: Escholidine. [online]. 2015 [cit. 2015-04-23]. Dostupné z: . URL15: Pubchem: Open Chemistry Database. [online]. [cit. 2015-04-23]. Dostupné z: .
97
