Sample & Assay Technologies

2008 július

EZ1® DSP Virus Kit Használati utasítás

48

2. verzió

Az EZ1 DSP Virus Kit a QIAGEN BioRobot EZ1 DSP-vel vagy az EZ1 Advanced DSPvel együtt egy olyan rendszer, amely mágneses gyöngy technológiát használ virális nukleinsavak izolálására és tisztítására humán plazma, szérum vagy agy-gerincvelői folyadék mintából diagnosztikai eljárásokban való felhasználáshoz.

In vitro diagnosztikai felhasználásra

62724 1050257HU QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D-40724 Hilden R1

1050257HU

Sample & Assay Technologies

QIAGEN Sample and Assay Technologies A QIAGEN vezető gyártója különböző innovatív minta és analízis technológiának, mely lehetővé teszi bármilyen biológiai mintából azok összetevőinek izolálását és detektálását. A fejlett technológiát tartalmazó, kitűnő minőségű termékek és szolgáltatások biztosítják a sikert a mintától az eredményig. A QIAGEN etalon a következő technológiákban: DNS, RNS és fehérjék tisztítása Nukleinsav és fehérje assay-k microRNS kutatás és RNSi Minta és analízis technikák automatizálása Küldetésünk, hogy lehetővé tegyük a felhasználóink számára kiemelkedő sikerek és áttörő eredmények elérését. További információért kérjük, látogassa meg a www.qiagen.com honlapot.

Tartalomjegyzék Kit összetevõk

4

Jelölések

4

Tárolás

5

A felhasználás célja

6

A felhasználás korlátai

6

Termék és elégedettségi garancia

7

Technikai segítségnyújtás

7

Biztonsági információk

7

Minőségbiztosítás

9

Bevezetés

10

Elv és módszer

10

Teljesítményjellemzők

13

Eszközök és Reagensek, amelyeket a felhasználónak kell biztosítania

22

Fontos megjegyzések

23

Szérum, plazma és CSF minták előkészítése

23

Carrier RNS elkészítése (CARRIER)

23

Belső kontroll (IC) használata

24

Az EZ1 munkaállomásokkal történő munka

25

Virális nukleinsavak tárolása

31

Protokoll: Virális DNS és RNS tisztítása szérumból, plazmából vagy CSF-ből 32 Hibakeresési útmutató

35

„A” Függelék: Kijelzett üzenetek

39

„B” Függelék: A belső kontroll (IC) mennyiségének kiszámítása

53

„C” Függelék: Minta adatlap a BioRobot EZ1 DSP használatához

56

„D” Függelék: Példa egy EZ1 Advanced Riport file-ra

57

Referenciák

58

Rendelési információk

59

EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

3

Kit összetevõk

EZ1 DSP Virus Kit Katalógusszám

62724

Tesztek száma

48

RCV

Reagent Cartridges, Virus*† (Reagens kazetta)

48

DTH

Disposable Tip Holders (Eldobható pipettahegy tartó)

50

DFT

Disposable Filter-Tips (Eldobható pipettahegyek)

50

ST

Sample Tubes (2 ml) (Minta csövek)

100

ET

Elution Tubes (1.5 ml) (Elúciós csövek)

100

CARRIER Carrier RNA (hordozó RNS)

310 µg

Elution Buffer† (elúciós puffer)

3 x 2 ml

AVE

(48)

Q-Card‡

1

Handbook (Kézikönyv)

1

*Guanidin sókat tartalmaz. Nem kompatibilis fehérítőszereket tartalmazó fertőtlenítőkkel. További információért lásd a 7. oldalt. †Tartósítószerként nátrium-azidot tartalmaz. ‡ A Q-Card-on található vonalkóddal kódolt információ szükséges a reagens adatkövetéshez az EZ1 Advanced munkaállomással történő használathoz.

Jelölések Összesen 48 minta kezeléséhez szükséges reagenst tartalmaz Felhasználásra …. által Orvosi eszköz in vitro diagnosztikához Katalógusszám

4


Tétel szám Anyag szám Összetevők Szám Térfogat Hőmérséklet határértékek

Jogos gyártó Fontos figyelmeztetés Csak …..-tal/val való használatra Tartalmaz Guanidin-izotiocianát Guanidin-hidroklorid Etanol Izopropanol Proteináz K A doboz felnyitásakor ez az oldal legyen lefele

Tárolás A reagens kazettát (RCV) szobahőmérsékleten (15-25°C) tároljuk. A reagens kazettában (RCV) lévő mágneses szemcsék aktívak maradnak, amennyiben ezen a hőmérsékleten történik a tárolás. Ne fagyasszuk le a reagens tartókat (RCV). Amennyiben megfelelő körülmények között tároljuk a reagens kazettákat (RCV), akkor azok a cimkén, a Q-card-on és a dobozon feltüntetett lejárati ideig stabilak maradnak. A liofilizált hordozó RNS (CARRIER RNA) szobahőmérsékleten tárolva a dobozon feltüntetett lejárati ideig stabil marad.


5

A felhasználás célja Az EZ1 DSP Virus Kit a QIAGEN BioRobot EZ1 DSP-vel vagy az EZ1 Advanced DSP-vel együtt egy olyan rendszer, amely mágneses gyöngy technológiát használ virális nukleinsavak izolálására és tisztítására humán plazma, szérum vagy agy-gerincvelői folyadék mintából diagnosztikai eljárásokban való felhasználáshoz. EDTÁ-val és citráttal (mint antikoaguláns) kezelt vérminták használhatók a plazma preparációhoz. Friss és fagyasztott minta egyaránt használható, feltéve, hogy felolvasztás után nem lett újrafagyasztva a minta. A terméket csak képzett felhasználók használhatják, technikusok, orvosok, akik a molekuláris biológiai technikákban járatosak. Bármilyen a mintafeldolgozással kapcsolatos diagnosztikai eredmény a további alkalmazások eredményeivel egyetemben, csak az egyéb klinikai és laboratóriumi eredmények figyelembevételével történhet.

A felhasználás korlátai A rendszer nem alkalmas RNS és DNS izolálására és tisztítására humán teljes vér mintákból, szövetből, csontvelőből baktériumokból és tenyésztett sejtekből. A rendszer légzőszervi mintákból, vizeletből és széklet szuszpenzióból történő virális, bakteriális és parazita nukleinsav izolálásának hatékonyságát nem vizsgálták. Anyai eredetű plazmából történő magzati DNS izolálásának és tisztításának hatékonyságát nem vizsgálták. Az EZ1 DSP Virus rendszer teljesítményét HIV-1, HCV, HBV, CMV és parvovírus B19-cel határozták meg a kézikönyvben (később) leírtak szerint. A felhasználó felelős azért, hogy megfelelő EZ1 DSP Virus működési feltételeket állapítson meg a további DNS és RNS alapú vírus kimutatásokhoz. A diagnosztikai eredményt negatívan befolyásoló körülmények minimalizálása érdekében, belső kontrollok (IC) használata ajánlott a mintaelőkészítés, amplifikáció és detektálás (a használt downstream alkalmazásnak megfelelően) során. Továbbá javasolt a pozitív és negatív kontrollok használata, hogy a negatív hatásokat a lehető legnagyobb mértékben ki lehessen küszöbölni. További validáláshoz az International Conference on Harmonization of Technical Requirements (ICH) megjelent: ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and terminology and ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology által meghatározott vezérfonal használata javasolt. A termék használata során a lehető legnagyobb figyelemmel járjunk el. Javasoljuk minden QIAGEN terméket használó részére az NIH rekombináns DNS kísérletekhez kifejlesztett vezérfonalához való ragaszkodást, vagy bármilyen vonatkozó szabvány betartását.

6


Termék és elégedettségi garancia A QIAGEN garantálja az összes termék működését úgy, ahogyan az a termék leírásában szerepel. A vásárló feladata meghatározni, hogy a termék egy bizonyos alkalmazásra megfelelő-e. Bármelyik termék nem megfelelő működése esetén – kivéve, ha nem a kézikönyvben leírtaknak megfelelő módon használták azt – a QIAGEN ellenszolgáltatás nélkül kicseréli vagy a vásárlási árat visszatéríti. A QIAGEN fenntartja a jogát arra, hogy lecserélje, megváltoztassa vagy módosítsa bármelyik termékét annak érdekében, hogy azok minősége javuljon (akár kit működés, akár készülék tervezés). Ha egy QIAGEN termék nem felel meg az igényeknek, egyszerűen hívja a helyi technikai segítségnyújtó helyet vagy forgalmazót (Biomarker Kft.). A termék árát – döntésétől függően – jóváírjuk számláján vagy kicseréljük a terméket. Más feltételek vonatkoznak a QIAGEN tudományos műszereire, szervíz termékeire és azokra a reagensekre, amelyeket szárazjégen szállítanak. További információért kérjük, érdeklődjön a helyi QIAGEN képviseletnél (Biomarker Kft.). A QIAGEN kondíciós lista másolata elérhető külön kérésre illetve szerepel számláink hátoldalán. Amennyiben a termék specifikációkkal és minőséggel kapcsolatos kérdései merülnek fel, hívja a QIAGEN technikai segítségnyújtás számát vagy a helyi forgalmazót (Biomarker Kft., valamint a kézikönyv hátoldala és a www.qiagen.com honlap).

Technikai segítségnyújtás A QIAGEN-nél büszkék vagyunk az általunk nyújtott technikai segítségnyújtás elérhetőségére és minőségére. A technikai segítségnyújtási osztályokon a mintakezelési és analízis technikákban kiterjedt gyakorlati és elméleti ismeretekkel rendelkező tapasztalt tudósok állnak rendelkezésre. Ha bármilyen kérdése merülne fel, az EZ1 DSP Virus Kit-tel kapcsolatos probléma esetén vagy a QIAGEN termékekkel kapcsolatban lenne általános kérdése, észrevétele kérjük, vegye fel a kapcsolatot velünk. A QIAGEN felhasználók köre a legfőbb információs forrás termékeink fejlett szintű vagy speciális felhasználására. Ez az információ segítség más tudósok számára is éppúgy, mint a QIAGEN kutatói részére. Ezért mindenképp bátorítjuk felhasználóinkat arra, hogy bármilyen a termék felhasználásával, teljesítményével kapcsolatos tapasztalatát illetve termékeink új alkalmazásokra és technikákra való használatát, javaslataikat osszák meg velünk, azokat köszönettel fogadjuk. Technikai segítségnyújtáshoz kérjük keresse a QIAGEN technikai támogatási központot a www.qiagen.com/support oldalon vagy hívja a QIAGEN egyik technikai szerviz osztályát vagy a helyi forgalmazót (Biomarker Kft., lásd a hátoldalt vagy a www.qiagen.com honlapot).

Biztonsági információk Amennyiben kémiai anyagokkal dolgoznak, mindig viseljenek megfelelő védőköpenyt, egyszerhasználatos védőkesztyűt és védőszemüveget. További információért kérjük, tanulmányozza a megfelelő biztonsági adatlapot


7

(MSDS). Ezek online elérhetők kényelmes és tömör PDF formátumban a www.qiagen.com/support/MSDS.aspx oldalról, ahol minden QIAGEN Kit és kit összetevő biztonsági lapját (MSDS) letöltheti. FIGYELMEZTETÉS: NE ADJUNK fehérítőszert vagy savas oldatokat közvetlenül a mintakezelés után maradt hulladékhoz.

A reagens kazettában (RCV) lévő pufferek guanidin-hidrokloridot/guanidinizotiocianátot tartalmaznak, amelyek veszélyes és nagymértékben reaktív elegyet képezhetnek a fehérítőszerekkel. Ha olyan folyadékot öntünk ki, amely ezeket a puffereket is tartalmazza, akkor a kiömlés helyét alkalmas laboratóriumi detergenssel és vízzel tisztítsuk fel. Ha fertőző ágenst tartalmazó folyadék kerül az EZ1 munkaállomásra, akkor fertőtlenítsük a készüléket az EZ1 készülékhez kapott kézikönyvben található fertőtlenítőszerek egyikével. A törött vagy szivárgó reagens kazettát (RCV) a helyi biztonsági előírásnak megfelelően kell kezelni és hulladékként eltávolítani. Ne használjunk sérült reagens kazettát (RCV) vagy más kit összetevőt, mert ezek használata rossz és megbízhatatlan eredményhez vezethet. A QIAGEN nem ellenőrizte az EZ1 DSP Virus eljárás használatakor hulladékként keletkező folyadékokat a maradék fertőző ágens tekintetében. A visszamaradt hulladékban lévő fertőző anyag jelenléte nagyon valószínűtlen, azonban az ilyen folyadékokat, mindig fertőző folyadékként kezeljük és a helyi eljárási szabályok szerint kezeljük és távolítsuk el. A következő veszélyességi és biztonsági jelzések vonatkoznak az EZ1 DSP Virus Kit összetevőire:

8


Reagens kazetta, Virus (RCV) F, Xn Etanolt, guanidin-hidrokloridot, guanidin-izotiocianátot, izopropanolt és proteináz K-t tartalmaz: erősen gyúlékony, ártalmas, irritáló és túlérzékenységet kiváltó. Veszélyességi és biztonsági jelzők*: R11-20/21/2232-36/38-42/43, S13-26-36/37/39-46 24 órás elsősegély információ Sürgősségi orvosi információ Angolul, Franciául és Németül napi 24 órában érhető el a következő helyről: Mérgezési Információs Központ, Mainz, Németország T: +49-6131-19240

Minőségbiztosítás A QIAGEN ISO-minősített minőségellenőrzési rendszerének megfelelően az EZ1 DSP Virus Kit minden egyes gyártási tételét leellenőrzik, hogy az megfelel-e az előírt paramétereknek, ezzel biztosítják a kit egyenletes és kifogástalan minőségét.

R11: Nagyon gyúlékony; R20/21/22: Ártalmas belélegzéssel, bőrre kerülve és lenyelve; R32: savakkal érintkezve nagyon erősen mérgező gázok keletkeznek; R36/38: szemre és bőrre irritáló hatású; R42/43: Érzékenységet válthat ki belélegzéssel és bőrrel való érintkezéskor; S13: Tartsuk távol élelmiszertől, italtól és állati takarmányoktól; S26: Szembe jutás esetén azonnal bő vízzel öblítsük a szemet, majd forduljunk orvoshoz; S36/37/39: Viseljünk megfelelő védőköpenyt, védőszemüveget és arc/szemvédő szemüveget/maszkot; S46: ha lenyeltük azonnal forduljunk orvoshoz és mutassuk meg a doboz feliratát vagy a címkéjét az orvosnak.


9

Bevezetés Az EZ1 DSP Virus Kit teljesen automatizált módszert szolgáltat virális DNS és RNS szimultán tisztítására szérumból, plazmából és agy-gerincvelői folyadékból (cerebro-spinális folyadék, CSF) az EZ1 Advanced vagy BioRobot EZ1 DSP munkaállomással. A kit alkalmas nukleinsavak tisztítására DNS és RNS vírusok széles köréből. A kit teljesítménye azonban nem garantálható minden vírus fajra. A kit alkalmasságát egy bizonyos fajra a felhasználónak kell meghatároznia. A mágneses gyöngy technológia jó minőségű nukleinsavakat szolgáltat, amelyek mentesek proteinektől, nukleázoktól és más szennyeződésektől. A tisztított nukleinsavak alkalmasak nagy érzékenységű detektáló rendszerekhez, mint pl. amplifikáció vagy más enzimes reakció. Az EZ1 Advanced vagy BioRobot EZ1 DSP a mintakezelés összes lépését végrehajtja, egyszerre maximum 6 mintán.

Elv és módszer A mágneses gyöngy technológia kombinálja a hatékony szilika bázisú DNS tisztítást és a gyors és kényelmes mágneses elválasztást. A módszert úgy tervezték, hogy potenciálisan fertőző mintákat biztonságosan és reprodukálhatóan lehessen kezelni és a nukleinsav izoláláshoz felhasználni. A tisztítási lépés 4 lépésből áll: lízis, kötés, mosás és eluálás (lásd alább, valamint a folyamatábrát a 12. oldalon). Lízis Proteináz K-val A szérum, plazma vagy CSF mintában a proteolízis erősen denaturáló körülmények között magas hőmérsékleten történik. A lízis proteináz K jelenlétében, lízis pufferben megy végbe, mely együttesen biztosítja a virális köpenyfehérje emésztését és az RNázok inaktiválását. Kötés a mágneses részecskékhez A lizált mintához kötőpuffer kerül, amely a kötéshez megfelelő körülményeket hozza létre. A lizátum alaposan összekeveredik a mágneses részecskékkel, ezzel biztosítva a hatékony virális DNS és RNS kötését a szilika felszínhez. A pufferben található sók (koncentráció) és a megfelelő pH biztosítja, hogy proteinek és más szennyezőanyagok – amelyek a PCR reakciót vagy további enzimes reakciókat gátolhatnák – ne kötődjenek a mágneses részecskékhez. Kötött nukleinsavak mosása Míg a virális DNS és RNS a mágneses részecskékhez kapcsolódik, a szennyezőanyagok hatékonyan lemoshatók az egymás után következő mosási lépésekben. A mosás mosópuffer 1-gyel, mosópuffer 2-vel majd etanollal történik.

10


Tiszta nukleinsav leoldás (elúció) A nagytisztaságú virális DNS és RNS egy lépésben kerül leoldásra az elúciós pufferben (AVE). A leoldott, tisztított nukleinsavak közvetlenül használhatók a további reakciókhoz illetve tárolhatók későbbi felhasználás esetén.


11

Az EZ1 DSP Virus procedúra Szérum, plazma vagy CSF Lízis proteináz K-val lízis pufferben Mágneses részecskék és kötőpuffer kerülnek a mintába

A nukleinsavak kötnek a mágnesesrészecskékhez

Mágneses elválasztás

Mosás mosópuffer 1-gyel, mosópuffer 2-vel, majd etanollal


Leoldás elúciós pufferrel (AVE)

Tiszta, jó minőségű virális nukleinsavak

12


Teljesítményjellemzők Lineáris tartomány Az EZ1 DSP Virus Kit lineáris tartományát HCV és HIV-1 RNS és HBV DNS vírusokkal határozták meg. A teszteket a mennyiségileg jellemzett víruspanelek higításával határozták meg HBV, HCV és HIV-1 negatív humán plazmában. Hat különböző vírus titert teszteltek mindegyiket 12 ismétlésben. Az EZ1 DSP Virus Kit módszer lineáris tartományát HBV, HCV és HIV-1 vírusra az Abbott RealTime virális terhelési vizsgálattal határozták meg (1. táblázat, 1. ábra). RealTime belső kontrollokat (IC) adtak (17 µl egyenként) minden egyes HIV-1 vagy HCV mintához az extrakció előtt. A RealTime HBV esetén 3,4 µl RealTime HBV belső kontroll (IC) hordozó RNS-sel (carrier RNS) kombinálva került az egyes mintákba. A virális nukleinsavakat 400 µl mintából, 90 µl elúciós pufferben (AVE) vették fel. A PCR-t az Abbot m200rt-n végezték el. 1. táblázat. Minta forrás és downstream vizsgálatok az EZ1 DSP Virus protokoll hozam lineáris tartományának megállapításához Downstream vizsgálat

Vizsgálati kézikönyv

Vírus

Forrás

HIV-1

BBI (Boston Biomedica, Inc., Abbott RealTime Boston, USA) defektív HIV, HIV-1 (Abbott MoBBI rekalcifikált plazma lecular Inc.)

Abbott RealTime HIV-1

HCV

ProMedDx (ProMedDx LLC Norton, MA, USA) páciens minta, pool-ozott normál humán szérum

Abbott RealTime HCV (Abbott Molecular Inc.)

Abbott RealTime HCV

HBV

Teragenix (Teragenix Copo- Abbott RealTime rate, Ft. Lauderdale, FL, HBV (Abbott MoUSA) páciens minta, rekal- lecular Inc.) cifikált humán plazma

Abbott RealTime HBV


13

Tapasztalt (log kópia/ml)

A

Várt (log kópia/ml)


B

Várt (log kópia/ml)


C

Várt (log kópia/ml) 1. ábra. A hozamok lineáris tartománya az EZ1 DSP Virus protokollal. Az EZ1 DSP Virus protokoll lineáris tartományát vírus higítási sorokkal határozták meg az Abbott RealTime vizsgálattal (1. táblázat) A HIV-1, B HCV és C HBV.

14


Precizitás A HIV-1, HCV és HBV higítási sorok standard deviációja (SD) és variancia koefficiense (VK) került meghatározásra a megfelelő downstream alkalmazás lineáris tartományában. A precíziós vizsgálathoz, ugyanazt a downstream alkalmazást használták, mint a lineáris tartomány meghatározásához (1. táblázat, 13. oldal). Az egyes vizsgálatok közötti precíziós adatokat a 2-4. táblázatokban tüntettük fel. Minden panelből 12 ismétlésben történt az izolálás, 12 különböző BioRobot EZ1 DSP futtatás során. A PCR-t 2 futtatásban végeztük el (6-6 ismétlés eredményének vizsgálatához) az Abbott m2000rt készüléken. 2. táblázat. Az EZ1 DSP Virus protokoll vizsgálatok közötti pontossága az Abbott RealTime HIV-1 vizsgálattal VK (%)

log kópia/ml

SD (log kópia/ml)

148

40

2,17

0,17

12

426

26

2,63

0,13

3

12

1082

14

3,03

0,06

4

11

11.506

14

4,06

0,06

5

12

116.145

15

5,07

0,07

6

12

1.300.669

16

6,11

0,08

Panel tag

n

1

12

2

Kópia/ml

3. táblázat. Az EZ1 DSP Virus Protokoll vizsgálatok közötti pontossága az Abbott RealTime HCV vizsgálattal VK (%)

log IU/ml

SD (log IU/ml)

39

56

1,59

0,27

12

122

22

2,09

0,10

3

12

2331

16

3,37

0,08

4

11

51.582

12

4,71

0,05

5

12

357.547

23

5,55

0,11

6

12

5.505.964

24

6,74

0,10

Panel tag

n

1

12

2

IU/ml


15

4. táblázat. Az EZ1 DSP Virus Protokoll vizsgálatok közötti pontossága az Abbott RealTime HBV vizsgálattal VK (%)

log kópia/ml

SD (log kópia/ml)

22

60

1,34

0,34

12

357

16

2,55

0,07

3

12

2835

7

3,45

0,03

4

11

280.221

10

5,45

0,05

5

12

3.311.311

12

6,52

0,05

6

12

40.040.547

14

7,60

0,06

Panel tag

n

1

12

2

Kópia/ml

A detektálási határérték Az EZ1 DSP Virus rendszer detektálási határértékét a 95%-os probit érték alapján határozták meg a 97/656-as HIV-1 WHO nemzetközi vírus standard, a 97/746-os HBV WHO nemzetközi vírus standard és a kvantifikált CMV sejtkultúra alapján. A detektálási küszöbérték meghatározása a megfelelő vírus higítási sorából történő izolálással történt. A vírusok higítása HIV negatív, HBV negatív és CMV negatív normál humán EDTA kezelt és poolozott plazmában történt. Minden egyes higítás legalább 3 független futtatásban és legalább 6 ismétlésben történt higításonként. 400 µl plazmát használtak kiindulási anyagként a BioRobot EZ1 DSP készüléken az izoláláshoz, amelyben az eluáció 60 µl-ben történt. A HBV DNS kimutatásához az artus ® HBV, a CMV DNS kimutatáshoz az artus CMV PCR kitet használták. A mintákat a LightCycler ® 1.2 készüléken (Roche), Rotor-Gene™ 3000 (Corbett-Research) és az ABI PRISM ® 7000 SDS (Applied Biosystems) készüléken analizálták. A COBAS ® Amplicor ® HIV1Monitor ® Test (1.5 verzió) felhasználásával detektálták a HIV-1 RNS-t a COBAS ® Amplicor ® Analyzer készüléken. Minden minta kombinált adatát probit anlízissel értékelték ki. Az adatok az 5-6. táblázatban találhatók a jellemző probit grafikonokkal együtt 2-3. ábra.

16


5. táblázat. A HBV és CMV DNS detektálási határétékei az EZ1 DSP Virus rendszerrel és az artus PCR Kit használatával Találatok (LightCycler)

Találatok (Rotor-Gene)

Találatok (ABI PRISM)

45,7

14,4

13,2

28–102

9,5–26,5

9,0–23,1

95% probit érték (kópia/ml)

67,2

21,8

38,3

Megbízhatósági intervallum (kópia/ml)

41,8–142

14,5–44,1

21,5–89,8

Vírus

Bevitt titer

HBV

95% probit érték (IU/ml) Megbízhatósági intervallum (IU/ml)

CMV

2. ábra. Probit vizsgálat a CMV DNS detektálására az EZ1 DSP Virus rendszerrel és az artus CMV RG PCR Kit-tel. A virális nukleinsav tisztítása az EZ1 DSP Virus rendszerrel történt. A CMV DNS detektálását az artus CMV PCR RG Kit-tel végezték a Rotor-Gene 3000-rel. A 95%-os probit érték 21,8 kópia/ml.


17

6. táblázat. A HIV DNS detektálási határétéke az EZ1 DSP Virus rendszerrel és a COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Teszttel, 1.5-ös verzió Bevitt titer (IU/ml)

Találatok

95% probit érték (IU/ml)

114,5

Megbízhatósági intervallum (IU/ml)

82,9–194,3

3. ábra. Probit vizsgálat a HIV RNS detektálására az EZ1 DSP Virus rendszerrel és a COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Teszt, 1.5-ös verziójával. A virális nukleinsav tisztítása az EZ1 DSP Virus rendszerrel történt 400 µl mintával 60 µl elúciós térfogatban. A HIV RNS detektálása a COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Teszt használatával a COBAS Amplicor Analyzer gépen történt. A 95%-os probit érték 114,5 IU/ml.

Minta kereszt-kontamináció kizárása Annak kiértékelésére, hogy az EZ1 DSP Virus rendszerben (az izolálás során és az izolálások között) milyen veszélye lehet a minta keresztkontaminációnak 9 futtatást végeztek a BioRobot EZ1 DSP munkaállomáson. A tesztet egy kvantifikált B19 parvovírusos beteg mintájával végezték el. A pozitív mintákban a vírus titer 1,0x10 8 IU/ml volt. A pozitív minták higításához és negatív kontrollnak humán B19 parvovírus negatív, EDTÁ-val kezelt plazma pool-t használtak fel. A minta keresztfertőzés detektálásához 2 futtatást végeztek el váltakozó sakktábla elrendezésben negatív és erősen pozitív mintákkal. Minden 3. futtatásban csak negatív mintát használtak a lehetséges futások közötti keresztfertőzések kimutatásához. Ez a minta összeállítás 3 ismétlésben került végrehajtásra, amelynek eredménye a 9 futtatás. A B19 parvovírus DNS kvantitatív meghatározásához a CE-IVD jelöléssel rendelkező artus Parvo B19 RG PCR Kit-et használták a Rotor-Gene 3000-rel. Az artus Parvo B19 RG PCR Kit analitikai detektálási küszöbértéke 0,2 IU/µl-nek adódott az

18


eluátumban (p = 0,05). Ez azt jelzi, hogy 95% annak a valószínűsége, hogy az eluátumban 0,2 IU/µl vírus detektálásra kerül. Minden erősen pozitív minta pozitív volt az artus Parvo B19 RG PCR Kit-tel. Minden negatív minta a sakktábla elrendezésben és a csak negatív minták futtatásakor negatívnak adódott (7. táblázat). Ezek a kísérletek azt demonstrálják, hogy az EZ1 DSP Virus protokoll használata nem eredményez minta keresztfertőződést a fenti kisérleti elrendezésben. 7. táblázat. Kereszt-kontamináció kísérleti elrendezés és a CT értékek a B19 parvovírus DNS detektálására Pozíció 1

2

3

4

5

6

1

15,47

X

15,41

X

15,36

X

2

X

15,48

X

15,53

X

15,32

3

X

X

X

X

X

X

4

15,35

X

15,2

X

15,27

X

5

X

15,21

X

15,13

X

15,43

6

X

X

X

X

X

X

7

15,62

X

15,48

X

15,23

X

8

X

15,31

X

15,83

X

15,62

9

X

X

X

X

X

X

Futtatás

CT középérték minden mintára = 15,40 ± 0,18 (VK = 1,14%) X: 45 PCR ciklusig nincs jel

Stabilitás Az EZ1 DSP Virus Kit-tel izolált virális RNS és DNS stabilitását meghatározták. Humán EDTÁ-val kezelt plazmát fertőztek 1x10 3 IU/ml HCV AcroMetrix OptiQuant ® HCV RNS-sel és Parvo B19 VQC standard anyaggal. Tesztenkénti inkubációs idők és körülmények: 18 ismétlésben nukleinsavat izoláltak az EZ1 DSP Virus rendszerrel. A Parvo B19 DNS-t és HCV RNS-t tartalmazó eluátumokat különböző körülmények között inkubálták: legalább 6 óráig 30°C-on, 14 napig 4°C-on, 12 hétig -20°C-on és 9 hónapig -80°C-on. A vizsgálat jelenleg is tart. Az eluátumokat validált házon belüli HCV RT-PCRrel és az artus Parvo B19 RG PCR kit-tel tesztelték. A 18 ismétlésből egy RTPCR hiba fordult elő HCV RNS-sel 14 napos 4°C-on történő inkubálás után (4. ábra).


19

HCV RNS (log IU/ml)

A

Óra 30°C-on

Nap 4°C-on

Hét -20°C

Hónap -80°C-on

Tárolási körülmények

Parvo B19 DNS (log IU/ml)

B

Óra 30°C-on

Nap 4°C-on

Hét -20°C

Hónap -80°C-on

Tárolási körülmények

4. ábra. Virális nukleinsavak stabilitása. Az EZ1 DSP Virus Kit-tel izolált virális RNS és DNS stabilitása A HCV RNS és B Parvo B19 DNS esetén.

20


Reprodukálhatóság Az eredmények reprodukálhatóságának meghatározásához 3 BioRobot EZ1 DSP munkaállomást használtak, melyeket 3 különböző napon futtattak (lásd a 8. táblázatot). Minden egyes teszthez (A-G), 12 ismétlést kezeltek 2 futtatásban a BioRobot EZ1 DSP készüléken. Humán EDTÁ-val kezelt plazmát használtak, melyet 1x10 4 IU/ml AcroMetrix OptiQuant HCV RNS-sel és 1x10 3 IU/ml AcroMetrix OptiQuant HBV DNS-sel fertőztek. A HBV DNS-t az artus HBV RG PCR Kit-tel, a HCV RNS-t egy validált házon belüli HCV RTPCR vizsgálattal határozták meg. Az automatizált módszer nagymértékben reprodukálhatónak bizonyult, amelyet 3 különböző napon és 3 különböző BioRobot EZ1 DSP munkaállomással végzett virális nukleinsav tisztítás során kapott hasonló eredmény bizonyít. 8. táblázat. Reprodukálhatósági kisérleti összeállítás Teszt elrendezés

1. nap

2. nap

3. nap

BioRobot EZ1 DSP I

A teszt

D teszt

F teszt

BioRobot EZ1 DSP II

B teszt

E teszt

BioRobot EZ1 DSP III

C teszt

G teszt

5 ábra. Reprodukálhatóság. A reprodukálhatóság három különböző BioRobot EZ1 DSP munkaállomáson, 3 különböző napon meghatározva.


21

Eszközök és Reagensek, amelyeket a felhasználónak kell biztosítania Amennyiben kémiai anyagokkal dolgoznak mindig viseljenek megfelelő laboratóriumi védőköpenyt, egyszer használatos védőkesztyűt és védőszemüveget. További információért tanulmányozza a megfelelő biztonsági adatlapot (MSDS), amelyet a gyártótól vagy forgalmazótól szerezhet be. Minden protokollhoz

Pipetták* és steril, RNáz-mentes pipettahegyek Lágy törlőpapír Víz 70% etanol Opcionális: Keverő* (ha a fagyasztott szérum vagy plazma keverése szükséges)

Az EZ1 Advanced felhasználóknak EZ1 Advanced munkaállomás * (kat. szám 9001411) EZ1 Advanced DSP Virus Card (kat. szám 9018305) Minta követéshez az alábbiak közül az egyik szükséges: PC (monitorral) az EZ1 Advanced Communicator szoftverrel felszerelve (kat. szám 9017759) EZ1 Advanced Communicator szoftver (kat. szám 9018529) saját PC-vel való használatra Nyomtató (kat. szám 9018464) és nyomtató kiegészítők (kat. szám 9018465) BioRobot EZ1 felhasználóknak BioRobot EZ1 DSP munkaállomás* (kat. szám 9001360) EZ1 DSP Virus Card (kat. szám 9017713)

* Biztosítsuk, hogy a készülékeket rendszeresen ellenőrzik, karbantartják és kalibrálják a gyártó utasításai alapján.

22


Fontos megjegyzések Szérum, plazma és CSF minták előkészítése A tisztítási folyamatot 100 µl, 200 µl vagy 400 µl szérum, plazma vagy CSF mintára optimalizálták. EDTA-val vagy citráttal, mint antikoagulánssal kezelt vérminták használhatók plazma készítésére. A minták lehetnek frissek vagy fagyasztottak, feltéve, hogy nem lettek visszafagyasztva a felolvasztás után. Az összegyűjtés és centrifugálás után a plazma, szérum vagy CSF minták 2-8 °C-on akár 6 órán keresztül tárolhatók. Hosszabb tárolás esetén az alikvótok lefagyasztását ajánljuk -20 °C-on vagy -80 °C-on. A mintákat szobahőmérsékleten (15-25 °C) olvasszuk fel és rögtön dolgozzuk fel, amint szobahőmérsékletre melegedtek. A felolvasztás után ne fagyasszuk vissza az alikvótokat. Az ismételt fagyasztás-felolvasztás a fehérjék denaturálásához és kicsapódásához vezet, amely csökkenti a vírus titert, és ezáltal a virális nukleinsavak kinyerését. Ha a mintákban fagyasztás hatására keletkező csapadék látható, centrifugáljuk le 6800 x g fordulaton 3 percig, a csapadék felzavarása nélkül vigyük át a felülúszót új csőbe és azonnal kezdjük meg a tisztítási folyamatot.

Carrier RNS elkészítése (CARRIER) A Carrier RNS (CARRIER) két célt szolgál a tisztítási folyamat során. Az első, hogy megnöveli a virális nukleinsavak megkötődését a mágneses részecskék szilika felületére, különösen akkor, ha a minta nagyon kevés célmolekulát tartalmaz. A második, hogy a nagy mennyiségű carrier RNS (CARRIER) hozzáadása csökkenti annak az esélyét, hogy a virális nukleinsavak degradálódjanak abban a ritka esetben ha az RNázok nem denaturálódnának a lízis pufferben lévő kaotróp sóktól és detergenstől. Ha nem adunk carrier RNS-t (CARRIER) a reakcióhoz, a virális DNS vagy RNS kinyerése csökkenhet. A kitben található liofilizált carrier RNS (CARRIER) 48 minta elkészítésére elégséges. A tisztítási folyamatban használt carrier RNS (CARRIER) koncentrációja lehetővé teszi, hogy az EZ1 DSP Virus kitet, mint általános tisztítási rendszert használjuk, amely sok különböző amplifikációs rendszerrel kompatibilis, és sokféle DNS és RNS vírusból történő nukleinsav tisztításra nyújt lehetőséget. Ugyanakkor az amplifikációs rendszerek hatékonyságukban különböznek a reakcióban jelen lévő teljes nukleinsav mennyiség alapján. Az EZ1 DSP Virus kittel kinyert eluátumok virális nukleinsavat és carrier RNS-t (CARRIER) is tartalmaznak, és a carrier RNS (CARRIER) mennyisége minden egyes eluátumban jóval meghaladja a virális nukleinsavak mennyiségét. Az amplifikációs reakcióhoz szükséges eluátum mennyisége ezért az eluátumban lévő carrier RNS (CARRIER) mennyiségétől kell, hogy függjön. Hogy az amplifikációs reakciókban a legnagyobb érzékenységet érjük el, szükséges lehet a carrier RNS (CARRIER) oldat mennyiségének beállítása.


23

Oldja fel a carrier RNS-t (CARRIER) 310 µl elúciós (AVE) pufferben, ossza szét kényelmes mennyiségű alikvótokba, és -20 °C-on tárolja. Ne olvasszafagyassza vissza az alikvótokat kettőnél többször. Minden egyes feldolgozandó mintához 3,6 µl carrier RNS (CARRIER) törzsoldatot higítson ki 60 µl végtérfogatra elúciós (AVE) pufferrel (és/vagy belső kontroll oldattal). Ebből a carrier RNS-elúciós puffer (CARRIER-AVE) oldatból 50 µl-t vigyen át a lízis keverékbe, amelyben így a carrier RNS (CARRIER) mennyisége 3 µg-nak felel meg. Ha belső kontrollt (IC) szeretne használni, nézze meg a „Belső kontroll (IC) használata” részt lejjebb. A tisztítási folyamat úgy optimalizált, ha fejenként 3 µg carrier RNS-t (CARRIER) adunk a mintákhoz. Amennyiben egy specifikus amplifikációs rendszer esetén jobb eredményt hozott más mennyiségű carrier RNS (CARRIER) használata, változtassa meg az elúciós (AVE) pufferrel kevert carrier RNS (CARRIER) oldat mennyiségét, vagy használjon más koncentrációjú oldatot. A carrier RNS-elúciós puffer (CARRIER-AVE) oldat össztérfogata 60 µl kell, hogy legyen, amelyből 50 µl-t viszünk át a lízis keverékbe. A különböző mennyiségű carrier RNS (CARRIER) használatát minden egyes mintatípusra és analízisre validálni kell.

Belső kontroll (IC) használata Az EZ1 DSP Virus Kit különböző, a piacon elérhető amplifikációs rendszerekkel történő kombinált használata megkövetelheti egy belső kontroll (IC) bevezetését a tisztítási folyamatba annak érdekében, hogy a minta elkészítésének hatékonyságát ellenőrizzük. A belső DNS vagy RNS kontrollt a carrier RNS (CARRIER) oldattal kell vegyíteni egy keverékben. Mintánként a carrier RNS-belső kontroll (CARRIER-belső kontroll) keveréknek 60 µl-nek kell lennie, amelyből 50 µl-t visz át a készülék a lízis keverékbe. Ez a mennyiség 3 µl carrier RNS (CARRIER) oldatnak és 47 µl elúciós (AVE) puffernek és/vagy belső kontroll oldatnak felel meg. Ha a belső kontroll (IC) stabil a plazmában, szérumban vagy CSF-ben (pl. armored RNS), akár a mintához is adhatjuk közvetlenül a minta előkészítése előtt. Hivatkozzon a gyártó utasításaira a belső kontroll (IC) optimális mennyiségének megállapításához a specifikus alkalmazásokban. Az ajánlottnál kevesebb mennyiség használata csökkentheti az amplifikálás hatékonyságát. Hogy az EZ1 DSP Virus protokollhoz szükséges belső kontroll (IC) mennyiségét meghatározza, az eluátum térfogatát kell figyelembe vennie. Nézze meg a „B Függelék: A Belső kontroll mennyiségének kiszámítása” részt a 53. oldalon a részletes utasításokért a belső kontroll (IC) helyes mennyiségének kiszámításához. A belső kontrollok (IC) nincsenek benne az EZ1 DSP Virus Kitben.

24


Az EZ1 munkaállomásokkal történő munka Az EZ1 Advanced és BioRobot EZ1 munkaállomások legfőbb jellemzői: Futásonkénti 1-6 mintából történő kitűnő minőségű nukleinsav tisztítás Kis helyigényű, hogy spóroljon a laboratóriumi férőhellyel Az előre programozott EZ1 DSP Kártyák tartalmazzák a felhasználásra kész protokollokat a nukleinsav tisztításhoz Előre töltött és lezárt reagens kazetták használatával könnyű, biztonságos és gyors EZ1 munkaelőkészítés A nukleinsav tisztítás teljes automatizálása a reagens kazetták nyitásától a nukleinsavak eluálásáig, kézi centrifugálási lépések nélkül Az EZ1 Advanced további jellemzői: Vonalkód olvasás és minta nyomkövetés Kit adat követés a kithez tartozó Q-Card segítségével UV lámpa a futásonkénti esetleges mintaátvitel kiküszöbölésére, valamint a munkafelület dekontaminálására Az UV dekontamináció segít lecsökkenteni az esetleges patogén szennyeződéseket az EZ Advanced munkafelületekről. Az inaktiválás hatékonyságát mindegyik specifikus élőlényre meg kell határozni és függ pl. a mintatípustól és a rétegvastagságtól. A QIAGEN nem tudja garantálni a specifikus patogének teljes megsemmisítését. EZ1 DSP Virus Kártya vagy EZ1 Advanced DSP Virus Kártya A virális nukleinsav tisztítására szolgáló protokollok az előre programozott EZ1 Advanced DSP Virus Kártyán vagy az EZ1 DSP Virus Kártyán találhatók. A felhasználó egyszerűen behelyezi az EZ1 Advanced DSP Kártyát az EZ1 Advanced gépbe vagy az EZ1 DSP Kártyát a BioRobot EZ1 DSP gépbe és a munkaállomás készen is áll a protokoll futtatására (6. és 7. ábra).


25

6. ábra. A protokoll beállítás könnyedsége EZ1 Advanced DSP Kártyával. A protokollt tartalmazó EZ1 Kártya behelyezése az EZ1 Advanced gépbe.

A munkaállomást csak az EZ1 DSP Kártya behelyezése után kapcsoljuk be. Győződjön meg róla, hogy az EZ1 DSP Kártya teljesen be lett tolva a gépbe. Ellenkező esetben fontos gépadatok veszhetnek el, ami memóriahibához vezethet. Az EZ1 Advanced DSP Kártya ill. az EZ1 Kártya nem cserélhető ki, amíg a gép bekapcsolt állapotban van.

7. ábra. Az Advanced Kártya teljesen betolva az EZ1 Kártya nyílásba.

Az EZ1 DSP Virus kit EZ1 DSP Virus Kártya vagy az EZ1 Advanced DSP Virus Kártya használatát igényli, amely a protokollokat tartalmazza szérum, plazma és CSF mintából virális nukleinsavak izolálására. Reagens kazetták (RCV) Az egy mintából származó nukleinsavak izolálásához szükséges reagenseket egyetlen reagens kazetta (RCV) (8. ábra, következő oldal) tartalmazza. A kazetta (RCV) minden egyes tubusa egyedi reagenst tartalmaz, mint pl.

26


mágneses gyöngyök, lízis puffer, mosó puffer vagy RNáz-mentes elúciós puffer (AVE). Mivel minden tubus csak a szükséges reagens mennyiséget tartalmazza, kiküszöböli az esetleges felesleges reagens maradványok keletkezését az izolálás végére. Az EZ1 DSP Virus Kitben szállított reagens kazetták (RCV) minden, a virális nukleinsav izoláláshoz szükséges reagenst tartalmazzák, kivéve a carrier RNS-t (CARRIER). A carrier RNS (CARRIER) és a belső kontroll (IC) (opcionális) egy, a reagens kazettán (RCV) kívüli tubusban található.

A

B

8. ábra. A munkaállomás beállításának könnyedsége a reagens kazettákkal (RCV). A Egy lezárt és előre töltött reagens kazetta (RCV). A reagens kazetta (RCV) típusától függően a tubusok töltöttségi szintje változik. B A reagens kazetták (RCV) behelyezése a kazettatartóba. A kazettatartón nyíl formájában egy jelzés található, amely a reagens kazetták (RCV) behelyezésének irányát mutatja.


27

Munkaasztal Az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP munkaasztala az a hely, ahová a felhasználó a mintákat és az EZ1 DSP Virus Kit komponenseit helyezi (9. ábra). A munkaasztal beállításának részletei az EZ1 Advanced vákuum fluoreszcens kijelzőjén (VFD) ill. a BioRobot EZ1 DSP folyadékkristályos kijelzőjén (LCD) kerülnek feltüntetésre, amikor a felhasználó megkezdi a munkaasztal beállítását. A gép kijelzője a protokoll állapotát is jelzi az automatizált izolálási folyamat alatt.

28


9. ábra. Az EZ1 Advanced ill. a BioRobot EZ1 DSP munkaasztala 1.

Az Elúciós tubusok (ET) (1,5 ml) az első sorba kerülnek.

2.

Az eldobható pipettahegy-tartók (DTH), amelyek az eldobható filteres pipettahegyeket (DFT) tartalmazzák, a második sorba kerülnek.

3.

A tubus (ET) (1,5 ml), amely a carrier RNS-t (CARRIER) és a belső kontrollt (IC) (ha használjuk) tartalmazza az elúciós (AVE) pufferben, a harmadik sorba kerül.

4.

A Mintatubusok (ST) (2 ml) a negyedik sorba kerülnek.

5.

Reagens kazetták (RCV) a kazettatartóban.

6.

Fűtőblokk 2 ml-es csövekkel (ST) a reagens kazettában a lízishez.

Mintakövetés az EZ1 Advanced géppel Az EZ1 Advanced a különböző adatok teljes követését teszi lehetővé a megnövelt folyamatellenőrzés és megbízhatóság érdekében. A protokoll kezdetén az EZ1 DSP Kit gyártási számának és lejárati idejének bevitele történik meg a Q-Card vonalkódjának használatával. Egy felhasználói azonosítót és a Q-Card vonalkódját vagy manuálisan billentyűzettel visszük be, vagy a vonalkód olvasó használatával olvassuk be a vonalkódokat. A


29

minta és analízis információk is opcionálisan bevihetők a protokoll kezdeténél. A protokoll futás végén automatikusan elkészül egy riport file. Az EZ1 Advanced akár 10 riport file-t is képes tárolni és az adatok egy PC-re továbbíthatók vagy közvetlenül kinyomtathatók egy nyomtatón (rendelési információkért nézze meg a „Eszközök és Reagensek, amelyeket a felhasználónak kell biztosítania” részt a 24 és 59. oldalon). Hogy az adatokat egy PC-n megkapjuk az EZ1 Advanced Communicator szoftvert kell installálnunk. A szoftver megkapja a riport file-t és az általunk meghatározott mappában tárolja. Miután a PC megkapta a riport file-t, azt felhasználhatjuk és feldolgozhatjuk akár a LIMS (Laboratory Information Management System), akár más programok segítségével. A riport file-okban az EZ1 Advanced 6 pipettázó csatornáját elnevezték balról jobbra A-tól F-ig (csatornák). Amikor a felhasználói azonosítót vagy a Q-Card-ot beolvassuk a vonalkód olvasóval, egy csipogás jelzi az adatbevitelt. Miután az információ 2 másodpercre megjelent a kijelzőn, automatikusan mentésre kerül és a következő üzenet kerül kijelzésre. Amikor a minta azonosítóját, az analízis kit azonosítóját vagy megjegyzéseket olvassuk be egy csipogás jelzi az adatbevitelt, az információ kijelzésre kerül és egy üzenet kérni fogja a következő információs adat bevitelét. Miután beolvastuk a minta azonosítóját, az analízis kit azonosítóját vagy a megjegyzéseket, nyomjuk meg az „ENT”-et egyszer, hogy megerősítsük, a bevitt információ helyes. Ha például egy rossz minta vonalkód került beolvasásra, nyomjuk meg az „ESC”-et és olvassuk be újra a minta vonalkódokat a kijelző utasításai szerint. A felhasználói azonosítót és a megjegyzéseket billentyűzet használatával is bevihetjük, vagy saját vonalkódot is generálhat ezen számok bekódolására.

30


Az EZ1 DSP Virus működtetésének folyamata Helyezze be az EZ1 Advanced DSP Virus Kártyát vagy az EZ1 DSP Virus Kártyát az EZ1 Kártyanyílásába

↓ Kapcsolja be az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP gépet

↓ Kövesse a kijelző üzenetét a mintakövetéshez*

↓ Kövesse a kijelző üzenetét a munkaasztal beállításához

↓ Indítsa el a protokollt

↓ Gyűjtse össze az izolált nukleinsavakat

↓ UV dekontamináció* *Csak az EZ1 Advanced esetében

Virális nukleinsavak tárolása Rövid idejű tárolás esetén maximum 24 óráig, az izolált virális DNS és RNS tárolását 2-8 °C-on ajánljuk. Hosszabb idejű, 24 órát meghaladó tárolásra -20 °C-ot ajánlunk.


31

Protokoll: Virális DNS és RNS tisztítása szérumból, plazmából vagy CSF-ből A kezdés előtti fontos pontok Amennyiben először használja az EZ1 DSP Virus Kitet, olvassa el a „Fontos megjegyzések” részt a 23. oldalon A reagens kazetták (RCV) guanidin sókat tartalmaznak, ezért nem kompatibilisek fehérítőt (hypo) tartalmazó fertőtlenítő szerekkel. Használatukkor tegyen megfelelő óvintézkedéseket és használjon védőkesztyűt. A biztonsági információkért nézze meg a 7. oldalt. A protokoll minden egyes lépését szobahőmérsékleten végezze (1525 °C). Az összekészítés alatt gyorsan dolgozzon. Miután a kitet kézhez kapta, ellenőrizze, hogy az összetevők nem sérültek-e. Ha a reagens kazetták (RCV) vagy a kit egyéb összetevői sérültek, keresse meg a QIAGEN technikai szervízét vagy a helyi forgalmazót. Folyadék kiömlés esetén nézze meg a „Biztonsági információk” részt (7. oldal). Ne használjon sérült reagens kazettákat (RCV) vagy egyéb kit összetevőket, ugyanis ezek alacsony kit hatékonysághoz vezethetnek. A folyamat néhány lépésénél 2 választás lehetséges. Válassza a S (kéket) ha az EZ1 Advanced gépet használja; válassza a z (pirosat) ha a BioRobot EZ1 DSP-t használja. A kezdés előtti teendők A reagens kazettákban (RCV) lévő lízis pufferben a tárolás során csapadék képződhet. Amennyiben szükséges, 30-40°C-on történő melegítéssel oldja fel, majd tegye szobahőmérsékletre. Készítse elő a szérum vagy plazma mintákat a „Szérum, plazma és CSF minták előkészítése” rész alapján (23. oldal). Ha a mintákban a fagyasztás hatására csapadék látható, centrifugáljuk le 6800 x g fordulaton 3 percig, a csapadék felzavarása nélkül vigyük át a felülúszót új csőbe és azonnal kezdjük meg a tisztítási folyamatot. Készítse el a carrier RNS (CARRIER) törzsoldatot (az opcionális belső kontrollal [IC]) mielőtt először használná. Oldja fel a liofilizált carrier RNS-t (CARRIER) 310 µl elúciós (AVE) pufferben (a kit tartozéka) és keverje össze a belső kontrollal (IC) (opcionális), ahogy az a „Carrier RNS elkészítése (CARRIER)” és „Belső kontroll (IC) használata” részekben le van írva (23-25. oldal).

32


Folyamat 1.

Minden egyes mintához készítsen 60 µl oldatot, amely 3,6 µl feloldott carrier RNS-t (CARRIER) tartalmaz (opcionálisan belső kontrollal [IC]) egy 1,5 ml-es tubusba (ET) (a kit tartozéka). Az oldat 10-szeri pipettázásával enyhén keverje össze. Ne vortexelje. A 1,5 ml-es tubus (ET) a harmadik sorba kerül, ahogy azt a kijelző utasításai is részletezik. Győződjön meg róla, hogy a carrier RNS (CARRIER) oldat a 1,5 ml-

es tubus (ET) alján található, hogy a megfelelő mennyiséget tudja majd átvinni az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP. 2.

Mérje át a 100 µl, 200 µl vagy 400 µl szérumot vagy plazmát a 2 ml-es mintacsőbe (ST) és ekvilibrálja szobahőmérsékleten (15-25 °C), mielőtt a munkaasztalra helyezi. Ha fagyasztott mintákat használ, olvassza fel és ekvilibrálja szobahőmérsékleten és vortexeléssel keverje össze. Az optimális működés miatt a kitben található 2 ml-es tubusok (ST)

használata elengedhetetlen. Ne fagyassza vissza a felolvasztott mintákat vagy ne tárolja 6 óránál

tovább 2-8 °C-on, mivel ezek a virális nukleinsavak kinyerésének nagymértékű csökkenéséhez vezetnek. 100 µl, 200 µl vagy 400 µl mennyiségű plazma és szérum használatát javasoljuk. Ha kevesebb mintát akar használni, egészítse ki a térfogatot 100, 200 vagy 400 µl-re a megfelelő mennyiségű elúciós (AVE) pufferrel (külön elúciós [AVE] puffer nem a kit tartozéka; külön kapható). Ne használjon 100, 200 vagy 400 µl-nél nagyobb mintatérfogatot. A

lízis és a virális nukleinsavak mágneses részecskékhez való kötődése után, a lizátum egy adagját a gép a minta tubusokba (ST) viszi át, hogy a megmaradt vírusokat inaktiválja. Ezért bármilyen, a mintaátvitel után még a minta tubusban (ST) maradt minta el fog veszni. 3.

Helyezze be S az EZ1 Advanced DSP DNA Virus Kártyát az EZ1 Advanced gép EZ1 Advanced kártyanyílásába vagy z az EZ1 DSP DNA Virus Kártyát a BioRobot EZ1 DSP gép EZ1 kártyanyílásába.

4.

Kapcsolja be az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP munkaállomást. A be-/kikapcsoló gomb a gép hátulján található

5.

Nyomja meg a „START”-ot, hogy elkezdje a munkaasztal beállítását az EZ1 DSP Virus protokollhoz.

6.

Nyissa fel a munkaállomás ajtaját.

7.

Fordítsa fel-le az 1-6 reagens kazettát (RCV) háromszor, hogy a mágneses részecskéket összekeverje. Azután kocogtassa meg a reagens kazettákat (RCV), hogy a reagensek összegyűljenek a tubusok aljába.


33

8.

Kövesse a kijelzőn olvasható utasításokat a munkaasztal beállításához, a protokoll kiválasztásához és a S mintakövetéshez. Miután becsúsztatta a reagens kazettát (RCV) a kazettatartóba, nyomja le a kazettát, amíg be nem pattan a helyére. Ha 6 reagens kazettánál (RCV) kevesebbet használ, bármilyen sorrendben behelyezheti őket. Ebben az esetben a többi laboreszköz behelyezésénél is kövesse a kazetták sorrendjét. S Amennyiben használja a mintakövetési opciót, győződjön meg róla, hogy a minta-azonosító is a minták sorrendjét követi a munkaasztalon, hogy elkerülje a minták összekeveredését.

9.

Csukja be a munkaállomás ajtaját.

10. Nyomja meg a „START”-ot a protokoll kezdéséhez. 11. Amikor a protokoll befejeződött, a kijelzőn a „Protocol finished” felirat jelenik meg. SNyomja meg az „ENT”-et, hogy riport file-t készítsen. SAz EZ1 Advanced akár 10 riport file-t is tud tárolni. Ezeket közvetlenül ki lehet nyomtatni egy hozzákapcsolt nyomtatóval, vagy továbbítani egy számítógépre. 12. Nyissa fel a munkaállomás ajtaját. 13. Gyűjtse össze az izolált virális nukleinsavakat tartalmazó elúciós csöveket (ET) az első sorból. Dobja ki az elhasznált laboreszközöket.* 14. S Opcionális: Kövesse a kijelző utasításait a munkaasztal felületének UV dekontaminálásához. 15. Végezze el az EZ1 munkaállomáshoz csomagolt kézikönyvben szereplő időszakos karbantartási lépéseket. Az időszakos karbantartás minden protokollfuttatás után kötelező. Magában foglalja a lyukasztó egység és a munkaasztal felületek megtisztítását. A lyukasztó javasoljuk.

egység

hegyes.

Dupla

védőkesztyű

használatát

16. Még egy protokoll futtatásához nyomja meg a „START”-ot, végezze el a protokoll 1. és 2. lépéseit és folytassa az 5. lépéssel. Egyéb esetben kétszer nyomja meg „STOP”-ot, hogy a kijelző nyitóképéhez visszatérjen, csukja be a munkaállomás ajtaját és kapcsolja ki az EZ1 munkaállomást. A 3. és 4. lépések elvégzése nem szükséges, ha másik protokollt futtatna. Ugorja át ezeket. * A minta hulladék guanidin sókat tartalmaz, ezért az nem kompatibilis a fehérítőszerekkel. Lásd a 7. oldalt a biztonsági információkért.

34


Hibakeresési útmutató Ez a hibakeresési útmutató az esetlegesen felmerülő problémák megoldásában segíthet. További információért, nézze meg gyakran feltett kérdések lapot a technikai segítség központunk honlapján: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. A QIAGEN technikai szervíz kutatói szívesen segítenek a kérdései megválaszolásában, akár ebben a kézikönyvben található információkkal vagy protokollokkal, akár a minta és analízis technológiákkal kapcsolatban (további információért nézze meg a hátoldalt vagy keresse fel a www.qiagen.com oldalt). Észrevételek és javaslatok Általános működtetés Hibaüzenet a berendezés kijelzőjén

Hivatkozzon az EZ1 berendezéshez szállított kezelési útmutatóra.

Alacsony virális DNS és RNS kinyerés a) a mágneses részecskék nem teljesen feloldottak

b) nem elégséges reagens felszívása

c) a reagensek rossz sorrendben kerültek a munkaasztalra

d) A carrier RNS (CARRIER) nem lett hozzáadva

Győződjön meg róla, hogy a mágneses részecskéket felszuszpendálta, mielőtt a reagens kazettákat (RCV) a kazettatartóba csúsztatta. Miután fel-le fordította a reagens kazettákat (RCV) hogy felszuszpendálja a mágneses részecskéket, győződjön meg róla, hogy megkocogtatta a reagens kazettákat (RCV), hogy a reagenseket a tubusok aljába gyűjtse. Győződjön meg róla, hogy mindegyik tubus (ET, ST) és a pipettatartók (DTH) a pipettahegyekkel (DFT) a helyes sorrendben kerültek betöltésre a munkaasztalra. Ismételje meg a tisztítási folyamatot új mintákkal. Oldja fel a liofilizált carrier RNS-t (CARRIER) 310 µl elúciós (AVE) pufferben. Minden egyes mintához 3,6 µl carrier RNS (CARRIER) törzsoldatot használjon összekeverve a belső kontrollal (IC) (opcionális) és az elúciós (AVE) pufferrel kiegészítve 60 µl-re a végtérfogatot, ahogy az a „Carrier RNS elkészítése (CARRIER)” és „Belső kontroll (IC) használata” részekben le van írva (23-25. oldal). Ismételje meg a tisztítási folyamatot új mintákkal.


35

Észrevételek és javaslatok e) A carrier RNS (CARRIER) és az elúciós (AVE) puffer nem lett elég jól összekeverve f) Az RNS degradált

g) A reagens kazetta tubusainak aljában kicsapódás látható

Keverje össze a carrier RNS-t (CARRIER), a belső kontrollt (IC) (opcionális) és az elúciós (AVE) puffert legalább 10-szeri pipettázással. Az RNS az eredeti plazma vagy szérum mintákban lévő RNázoktól degradálódhatott. Győződjön meg róla, hogy a minták rögtön a mintagyűjtés után vagy a tárolás befejezése után feldolgozásra kerülnek. Helyezze a reagens kazettákat (RCV) rázóinkubátorba és akár 2 órán keresztül inkubálja finom rázás mellett 30-40 °C-on. Amennyiben a csapadék nem oldódott fel, ne használja a reagens kazettákat (RCV).

Az RNS vagy a DNS nem megfelelően használható az izolálást követő enzimatikus reakciókban a) Nincs vagy kevés nukleinsav van az eluátumban

b) A fagyott szérum vagy plazma minták a felolvasztás után nem megfelelően lettek összekeverve c) A mintákban lévő nukleinsavak már az izolálás előtt degradálódtak

d) Elégtelen minta lízis

e) Sóátvitel az elúció során

36

Nézze meg az „Alacsony virális DNS és RNS kinyerés” részt az esetleges okokért. Növelje meg az izolálás utáni enzimatikus reakcióba bevitt eluátum térfogatát, ha lehetséges. Olvassza fel a minákat szobahőmérsékleten (15-25 °C) és vortexeléssel keverje össze 15 mp-ig.

Ez akkor fordulhat elő, ha a mintákat már egyszeri felolvasztás után újrafagyasztották vagy túl sokáig tárolták szobahőmérsékleten. Mindig friss vagy csak egyszer felolvasztott mintát használjunk. Ismételje meg a tisztítási folyamatot új mintákkal. Ez akkor fordulhat elő, ha a reagens kazettákat (RCV) túl hosszú ideig tárolták megemelt hőmérsékleten, ami miatt a proteináz K inaktiválódott. Ismételje meg a tisztítási folyamatot új mintákkal és reagens kazettákkal (RCV). A legjobb eredmények érdekében győződjön meg róla, hogy a reagens kazetták (RCV) 20-30 °C-on vannak.


Észrevételek és javaslatok f) Túl sok vagy túl kevés carrier RNS (CARRIER) az eluátumban g) Túl sok az eluátum az amplifikációs reakcióban

h) Az izolált nukleinsavak változó viselkedése az izolálás utáni analízisben

i) Az érzékenység hiánya inhibitor anyagok miatt

j) A reverz transzkriptáz és a Taq polimeráz új kombinációja

Határozza meg azt a maximális carrier RNS (CARRIER) mennyiséget, amennyi az amplifikációs reakcióban megfelelő. Állítsa be a carrier RNS (CARRIER) oldat koncentrációját. Határozza meg azt a maximális eluátum mennyiséget, amennyi az amplifikációs reakcióban megfelelő. Csökkentse az amplifikációs rekacióba bevitt eluátum térfogatát vagy az elúciós térfogatot növelje. Amennyiben szükséges, egy pozitív kontrollt vihetünk be az eluátumba, hogy az elutátum hatását meghatározzuk az amplifikációs reakcióban. A reagens kazetta (RCV) 1-es vagy 2-es mosópufferében a só és etanol összetevők szétváltak a hosszú tárolás miatt. Mindig alaposan rázza fel a reagens kazettákat (RCV) és aztán kocogtassa meg a tisztítási folyamat megkezdése előtt. Növelje meg az elúciós térfogatot. Amennyiben szükséges, egy pozitív kontrollt vihetünk be az eluátumba, hogy az elutátum hatását meghatározzuk az amplifikációs reakcióban. Ha enzime(ke)t váltunk, szükséges lehet újra beállítani az elúciós (AVE) pufferhez adott carrier RNS (CARRIER) és a felhasznált eluátum mennyiségét.


37

Észrevételek és javaslatok k) A mágneses részecskék átvitele

38

A mágneses részecskék elátumba történő átvitele nem befolyásolja a legtöbb izolálás utáni alkalmazást, többek közt az RT-PCR-t sem. Amennyiben a mágneses récsecskék átvitelének minimalizálása szükséges (pl. olyan alkalmazásoknál, mint a real-time PCR), először tegyük az eluátumot tartalmazó tubusokat egy megfelelő mágnesre (pl. 12-Tube Magnet [kat. sz: 36912]) 1 percig majd vigyük át az eluátumokat tiszta tubusokba. Ha nem áll rendelkezésünkre megfelelő mágnes, centrifugáljuk le az eluátumokat tartalmazó tubusokat mikrocentrifugában 1 percig teljes sebességen, hogy a leülepítsük az esetlegesen korábban átvitt mágneses részecskéket, majd a felülúszókat vigyük át tiszta tubusokba.


„A” Függelék: Kijelzett üzenetek Az üzeneteket, amelyeket a gép ad a munkaasztal összeállítás, a protokoll futtatása alatt és a futtatás után a 9. táblázatban foglaltuk össze az EZ1 Advanced és a 10. táblázatban az BioRobot EZ1 DSP készülékhez. Az üzenetek száma a táblázatban megfelel a készülék szoftvere által adott üzenet számának. Az általános hibaüzeneteket az EZ1 Advanced vagy a BioRobot EZ1 DSP készülékkel adott kézikönyvben találhatjuk meg. 9. táblázat. Az EZ1 Advanced DSP Virus procedúra üzenetei Üzenet száma

Üzenet típusa

EZ1 Advanced üzenet szövege

Magyar megfelelő

Nincs

Útmutatás

Date/Time START: Run

Dátum/Idő START: futtatás

1: UV

1: UV

2: Man

2: Man

3: Test

3: Teszt

4: Setup

4: Beállítás

Key: START, 1, 2, 3, 4

Bill.: START, 1, 2, 3, 4

1

Útmutatás

EZ1 Advanced DSP Virus Version 1.0

2

Adatkövetés

Scan/enter user ID

Vonalkód olvasóval vagy kézzel vigyük be a felhasználó azonosítót

3

Adatkövetés

Scan/enter Q-Card bar code

Vonalkód olvasóval vagy kézzel vigyük be a Q-Card vonalkódját

4

Útmutatás

Wrong kit!

Rossz kit!

Please load EZ1 DSP Virus Kit

Töltse be az EZ1 DSP Virus kitet

ENT: back

ENT: Vissza


39

Üzenet száma

Üzenet típusa


Magyar megfelelő

5

Útmutatás

Kit expired

Kit lejárt

ENT: Use new kit

ENT: Használjon új kitet

ESC: Stop protocol

ESC: Stop protokoll

Use Q-Card data with sample no. 1 to

Használja a Q-Card adatokat az 1. mintától a . mintáig

Enter 1 to 6

Vigye be 1 -6

Do you want to process more samples with another

További mintákat is akar kezelni másik tételszámú kittel?

6

7

Adatkövetés

Útmutatás

kit lot

8

Adatkövetés

ENT: Yes, ESC: No

ENT: Igen, ESC: Nem

Do you want to add sample ID?

Akar hozzátenni minta azonosítót?

ENT: Yes

ENT: Igen

ESC: No

ESC: Nem

9

Adatkövetés

Scan/enter sample ID sample no. [x]

Vonalkóddal vagy kézzel vigye be a minta azonosítót az [x.] mintára

10

Adatkövetés

ID1:

Azonosító 1:

ID2:

2:

ID3:

3:

Next=ENT

ENT=Következő

ID1:

Azonosító 1:

ID2:

2:

ID3:

3:

Next=ENT, ID1-3=Up

ENT=Következő, UP/FEL=Azonosító 1-3

11

40

Adatkövetés


Üzenet száma

Üzenet típusa


Magyar megfelelő

12

Adatkövetés

Do you want to add assay information?

Hozzá akar adni vizsgálati info-t?

ENT: Yes, ESC: No

ENT: Igen, ESC: Nem

13

Adatkövetés

Scan/enter assay ID sample no. [x]

Vonalkóddal vagy kézzel vigye be a [x.] mintához a vizsgálat azonosítót

14

Adatkövetés

Do you want to add notes?

Hozzáad megjegyzést?

ENT: Yes

ENT: Igen

ESC: No

ESC: Nem

15

Adatkövetés

Scan/enter notes sample no. [x]

Vonalkóddal vagy kézzel vigye be a [x.] mintához a megjegyzést

16

Útmutatás

Select sample volume:

Válasszon mintatérfogatot:

1: 100μl

1: 100μl

2: 200μl

2: 200μl

3: 400μl

3: 400μl

Select elution volume:

Válasszon elúciós térfogatot:

1: 60μl

1: 60μl

2: 90μl

2: 90μl

3: 120μl

3: 120μl

4: 150μl

4: 150μl

17

Útmutatás


41

Üzenet száma

Üzenet típusa


Magyar megfelelő

18

Útmutatás

You have chosen:

A választás:

Sample volume: [xxx] μl

Mintatérfogat: [xxx]μl

Elution volume: [yyy] μl

Elúciós térfogat: [yyy] μl

Next=Any, Prev=Esc 19

Útmutatás

Load cartridges at same positions as sample


21

22

Útmutatás

Útmutatás

Útmutatás

Töltse be a kazettákat a mintáknak megfelelő pozícióba Következő=Bármely gomb, Előző=Esc

Load empty 2.0 ml tubes at heating block

Tegyen üres 2,0 ml-es csövet a fűtőblokkba

Next=Any, Prev=Esc

Következő=Bármely gomb, Előző=Esc

Load elution tubes (1.5 ml) into first row

Tegyen elúciós csövet (1,5 ml) az első sorba

Next=Any, Prev=Esc


Load tip holders (DTH) and tips (DFT) into second row Next=Any, Prev=Esc

42


Tegyen be a hegy tartókat (DTH) és hegyeket (DFT) a második sorba Bármely gomb=Tovább, ESC=Előző


Üzenet száma

Üzenet típusa


Magyar megfelelő

23

Útmutatás

Load 1.5 ml tubes containing cRNA and IC in third

Tegyen be 1,5 ml csöveket vivő RNS-sel és belső kontrollal (IC) a 3. sorba

row

24

Útmutatás

Next=Any, Prev=Esc

Bármely gomb=Tovább, ESC=Előző

Load 2.0 ml tubes (ST) with sample in fourth row

Tegyen 2,0ml-es csövet (ST) a mintákkal a 4. sorba

Next=Any, Prev=Esc

Bármely gomb=Tovább, ESC=Előző 25

Útmutatás

Loading finished. Close door and press START

Betöltés vége. Csukja be az ajtót és nyomja meg a START gombot.

Prev=Esc

ESC=Előző (lépés)

26

Útmutatás

Please close door!

Kérem csukja be az ajtót!

27

Útmutatás

Checking temperature

Hőmérsékletellenőrzés Beállított:

Set:

Aktuális:

Cur: 28

Státusz

Protocol started

Protokoll elkezdve

29

Státusz

Piercing Foil

Fólia lyukasztás

30

Státusz

Collecting Elution Buffer AVE

Elúciós puffer (AVE) felszívása

31

Státusz

Collecting cRNA + IC

Vivő RNS és belső kontroll felszívása


43

Üzenet száma

Üzenet típusa


Magyar megfelelő

32

Státusz

Collecting Lysis Buffer

Lízis puffer felszívása

33

Státusz

Collecting Sample

Minta felszívása

34

Státusz

Collecting Proteinase K

Proteináz K felszívása

35

Státusz

Mixing Lysae

Lizátum keverése

36

Státusz

15 min Incubation [x] of 43 min left

15 perces inkubálás [x] perc maradt a 43-ból

Kick

Blokk melegítés

[x] of 43 min left

[x] perc maradt a 43ból.

Collecting Binding Buffer

Kötőpuffer felszívása

[x] of 43 min left




[x] of 43 min left


Collecting Beads

Gyönygök felszívása

[x] of 43 min left


37

38

39

40

41

42

44

Státusz

Státusz

Státusz

Státusz

Státusz

Státusz

Resuspension of Beads in Binding Buffer

Gyöngyök felszuszpendálása kötőpufferben

[x] of 43 min left


Transferring Lysate

Lizátum átrakása

[x] of 43 min left



Üzenet száma

Üzenet típusa


Magyar megfelelő

43

Státusz

Binding

Kötés

Magnetic Separation


[x] of 43 min left


Wash 1

1. mosás, mágneses elválasztás, [x] perc maradt a 43-ból.

44

Státusz

Magnetic separation [x] of 43 min left 45

Státusz

Wash 2 Magnetic separation [x] of 43 min left

46

Státusz

Wash 3 Magnetic separation [x] of 43 min left

47

48

Státusz

Státusz

Státusz

Gyöngyök szárítása

[x] of 43 min left


Rinse

Öblítés, [x] perc maradt a 43-ból.

Elution [x] of 43 min left

50

Útmutatás


Dry Beads

[x] of 43 min left 49


Check transfer of cRNA + IC (row 3) Next=Any

Elúció, [x] perc maradt a 43-ból. Ellenőrizze a vivő RNS és belső kontroll átvitelét Bármely gomb=Tovább

51

Útmutatás

Check transfer of sample (row 4)

Ellenőrizze a minta átvitelét (4. sor)

Next=Any

Bármely gomb=Tovább


45

Üzenet száma

Üzenet típusa


Magyar megfelelő

52

Útmutatás

Protocol finished

Protokoll befejezve

53

Útmutatás

Transfer Report file, attempt no.

Jelentés file átvitel kísérlet (x).

54

Útmutatás

Report file sent

Jelentés file átküldve ENT=Következő

Next=ENT 55

56

57

Útmutatás

Útmutatás

Útmutatás

Report file could not be sent

Jelentés file átküldése sikertelen

Resend=ENT

ENT=Újraküldés

Perform UV run?

UV tisztítás?

ENT: Yes

ENT: Igen

ESC: No

ESC: Nem

UV DECONTAMINATION

UV FERTŐTLENÍTÉS

Set time min Key:0-9, ENT

Beállítás percben: 0-9-ig majd ENT

58

Útmutatás

UV DECONTAMINATION

UV FERTŐTLENÍTÉS

Time must be between 20-60 min

Az idő 20-60 perc között lehet.

Key:ESC Tovább: ESC 59

Útmutatás

UV DECONTAMINATION

UV FERTŐTLENÍTÉS

Total Time: min Time left: min

Beállított idő: perc Idő maradt: perc

46


Üzenet száma

Üzenet típusa


Magyar megfelelő

60

Útmutatás

Perform regular maintenance after each run

Rendszeresen végezze el a karbantartást minden futtatás után

ESC=Main menu

ESC=Főmenü 61

Útmutatás

UV lamp expires soon

UV lámpa hamarosan lejár

UV runs left

Maradék UV futtatás ENT=Folytatás

ENT= continue 62

63

Útmutatás

Útmutatás

UV lamp is expired

UV lámpa lejárt

ENT=continue

ENT=Folytatás

ESC=abort

ESC=Leállít

Decontamination UV lamp cooling

Fertőtlenítő UV lámpa hűtés folyamatban. Kérjük várjon!

Please stand by

10. táblázat. A BioRobot EZ1 DSP Virus procedúra üzenetei Üzenet

Üzenet

száma Nincs

1

Magyar megfelelő

típusa

BioRobot EZ1 DSP üzenet szövege

Útmutatás

Choose button:

Válasszon gombot

START: Protocols

START: Protokollok

1: Tools

1: Eszközök

2: Tests

2: Teszt

Útmutatás

BioRobot EZ1 DSP Virus Version 1.0


47

Üzenet

Üzenet

száma 2

3

4

Magyar megfelelő

típusa


Útmutatás

Select sample volume:

Válasszon mintatérfogatot:

1: 100μl

1: 100μl

2: 200μl

2: 200μl

3: 400μl

3: 400μl

Select elution volume:

Válasszon elúciós térfogatot:

1: 60μl

1: 60μl

2: 90μl

2: 90μl

3: 120μl

3: 120μl

4: 150μl

4: 150μl

You have chosen:

A választás:

Sample volume: [sample volume] μl

Mintatérfogat: [xxx]μl

Útmutatás

Útmutatás

Elution volume: [elution volume] μl Next=Any, Prev=Esc 5

Útmutatás

Load cartridges (RCV) at same positions as sample


7

48

Útmutatás

Útmutatás

Elúciós térfogat: [yyy] μl Következő=Bármely gomb, Előző=Esc Töltse be a kazettákat (RCV) a mintáknak megfelelő pozícióba Következő=Bármely gomb, Előző=Esc

Load empty 2.0 ml tubes at heating block

Tegyen üres 2,0 ml-es csövet a fűtőblokkba

Next=Any, Prev=Esc


Load elution tubes (1.5 ml) into first row

Tegyünk elúciós csövet (1,5 ml) az első sorba

Next=Any, Prev=Esc



Üzenet

Üzenet

száma

típusa

8

Útmutatás


Magyar megfelelő

Load tip holders (DTH) and tips (DFT) into second

Tegyük be a hegy tartókat (DTH) és hegyeket (DFT) a második sorba

row

9

Útmutatás

Next=Any, Prev=Esc

Bármely gomb=Tovább, ESC=Előző

Load 1.5 ml tubes (ET) with (CARRIER) + IC in third row

Tegyen be 1,5 ml csöveket vivő RNS-sel és belső kontrollal (IC) a 3. sorba

Next=Any, Prev=Esc

10

Útmutatás

Load 2.0 ml tubes (ST) with sample in fourth row Next=Any, Prev=Esc

Bármely gomb=Tovább, ESC=Előző Tegyünk 2,0ml-es csövet (ST) a mintákkal a 4. sorba Bármely gomb=Tovább, ESC=Előző

11

12

Útmutatás

Státusz

Start protocol

Protokoll indítás

Press START

Nyomja meg a START gombot.

Prev=Esc

ESC=Előző (lépés)


Hőmérsékletellenőrzés Beállított: 63,0 [fok]

Set: 63.0 [deg]

Aktuális: [fok]

Cur: [deg] 13

Státusz

Protocol started

Protokoll elkezdve

14

Státusz

Piercing Foil

Fólia lyukasztás

15

Státusz

Collecting Elution Buffer AVE

Elúciós puffer (AVE) felszívása


49

Üzenet

Üzenet


Magyar megfelelő

száma

típusa

16

Státusz

Collecting cRNA (CARRIER) + IC

Vivő RNS és belső kontroll felszívása

17

Státusz



18

Státusz

Collecting Sample

Minta felszívása

19

Státusz

Collecting Proteinase K

Proteináz K felszívása

20

Státusz

Mixing Lysate

Lizátum keverése

21

Státusz

Checking Temperature

Hőmérséklet ellenőrzés

Set: 56.0 [deg]

Beállított: 56,0 [fok]

Cur: [deg]

Aktuális: [fok]

22

Státusz

15 min Incubation

15 perces inkubálás

23

Státusz

Kick

Blokk melegítés

24

Státusz

Collecting Binding Buffer

Kötőpuffer felszívása

25

Státusz



26

Státusz

Collecting Beads

Gyöngyök felszívása

27

Státusz

Resuspension of Beads in Binding Buffer

Gyöngyök felszuszpendálása kötőpufferben

28

Státusz

Transferring Lysate

Lizátum átrakása

29

Státusz

Binding

Kötés

Magnetic Separation


50


Üzenet

Üzenet

Magyar megfelelő

típusa


száma 30

Státusz

Wash 1

1. mosás, mágneses elválasztás

Magnetic separation 31

Státusz

Wash 2 Magnetic separation

32

Státusz

Wash 3


Magnetic separation


33

Státusz

Dry Beads


34

Státusz

Kick

Melegítés

35

Státusz

Dry Beads


36

Státusz

Kick

Melegítés

37

Státusz

Rinse

Öblítés

38

Státusz


Hőmérséklet ellenőrzés

Set: 65.0 [deg]

Beállított: 65,0 [fok]

Cur: [deg]

Aktuális: [fok]

39

Státusz

Elution

Elúció

40

Útmutatás

Check transfer of cRNA (CARRIER) + IC (tube [ET], row 3)

Ellenőrizze a hordozó RNS és belső kontroll átvitelét (ET, 3. sor)

Next=Any


Check transfer of sample (tube [ST], row 4)

Ellenőrizze a minta átvitelét (ST, 4. sor)

Next=Any


41

Útmutatás


51

Üzenet

Üzenet

száma

típusa

42

Útmutatás

52


Magyar megfelelő

Protocol finished! Press ESC to return to Menu

Protokoll befejezve! ESC megnyomásra főmenü.


„B” Függelék: A belső kontroll (IC) mennyiségének kiszámítása A mintakezelés (izolálás, tisztítás) és a további vizsgálatok hatékonyságának ellenőrzéséhez szükség lehet a belsőőkontroll (IC) használatára, amelyet a minta előkészítés során kell a reakcióba juttatni. Az EZ1 DSP Virus protokollhoz szükséges belső kontroll (IC) mennyiségének kiszámításakor figyelembe kell venni a mintához adott belső kontrollt tartalmazó puffer térfogatát és az adott vizsgálathoz tartozó elúciós térfogatot is (mintánként). Az izolálás utáni alkalmazásban lévő belső kontroll (IC) mennyiségének kiszámítása Annak meghatározásához, hogy a downstream alkalmazásban mekkora lesz a belső kontroll térfogata, a következő képletet használjuk:

ICRXN =

ICLB x LBSAM x ELRXN (LBTOT + ICLB) x ELSAM

Ahol: IC RXN IC LB LB SAM EL RXN LB TOT EL SAM

= A belsőő kontroll térfogata =IC) a downstream reakcióban (per reakció) = A belsőő kontroll térfogata (IC) amelyet a lízis pufferhez (LB) adtunk = A lízis puffer (LB) térfogata mintánként = Az eluátum térfogata downstream reakciónként = A lízis puffer (LB) plusz a vivőő RNS (CARRIER) teljes térfogata a protokoll során = Az eluátum térfogata mintánként

Példaként felhasználó 1 – egy korábban meghatározott vizsgálati rendszer használatával – 39 µl belő kontroll oldatot (IC LB ) ad 8,4 ml lízis pufferhez és 140 µl vivő RNS-hez (CARRIER). A vizsgálati rendszerhez adott kézi referencia módszer használatával 625 µl lízis puffert (LB) adunk mintánként (LB SAM ), és elúciós térfogatként 75 µl-t (EL SAM ) használunk. Felhasználó 1 50 µl eluátumot használ fel a downstream reakcióban (EL RXN ) (reakciónként). A belső kontroll oldat térfogata downstream reakciónként (IC RXN ) így a következő:

ICRXN =

39 μl x 625 μl x 50 μl (8540 μl + 39 μl) x 75 μl


= 1,89 μl

53

A végső downstream reakciók az adott assay-hez 1,89 µl belső kontroll oldatot tartalmaznak (reakciónként). A belső kontroll mennyiségének meghatározása, amelyet a kezdés előtt kell bemérni Amennyiben tudja azt a belső kontroll (IC) mennyiséget, amelyet a downstream alkalmazásba be akar vinni (IC RXN ), akkor meg kell határoznia az elúciós pufferrel (AVE) és vivő RNS-sel (CARRIER) higított (IC AVE ) belső kontroll (IC) mennyiségét mielőtt a tisztítást elkezdené. Ennek az értéknek a kiszámításához az alábbi képletet használja:

ICAVE =

ICRXN x ICTOT x ELSAM ICSAM x ELRXN

Ahol: IC AVE IC RXN IC TOT IC SAM EL SAM EL RXN

= A belső kontroll (IC) térfogata az elúciós puffer/hordozó RNS-ben (AVE-CARRIER) = A belső kontroll (IC) térfogata a downstream alkalmazásban = A higított belső kontroll (IC) teljes térfogata az elúciós puffer/hordozó RNS-ben (AVE-CARRIER) futtatásonként = A mintához adott higított belső kontroll (IC) mintánként (50 μl) = Eluátum térfogata mintánként = Az eluátum térfogata downstream reakciónként

Példaként: Felhasználó 2 olyan vizsgálati módszerrel dolgozik, amely 1 μl belső kontroll (IC) alkalmazására lett optimalizálva (IC RXN ) reakciónként 20 μl eluátummal (EL RXN ). Felhasználó 2 követi az EZ1 DSP Virus protokollt és 60 μl elúciós térfogatot (EL SAM ) választ ki. Minden egyes mintához 60 μl higított belső kontrollt (IC) kell bemérni kézzel az 1,5 ml-es csőbe (ET) az EZ1 DSP munkaállomás 3. pozíciójába. A minta izolálás során a készülék azonban csak 50 μl higított belső kontrollt tesz (IC SAM ) a 3. pozícióból a kötő reakcióba. Hat kezelendő mintához egy futtatásban a higított belső kontroll (IC TOT ) teljes térfogata a következő: IC TOT = Minta száma a futtatásban x 60 μl = 6x60 μl= 360 μl A belső kontroll oldat térfogata (IC AVE ) 6 mintára:

ICAVE =

1 μl x 360 μl x 60 μl (50 μl x 20 μl)

= 21,6 μl

Minden egyes mintához 3,6 μl (1 μg/μl-es) horozó RNS (CARRIER) törzs oldatot kell adni a belső kontroll higításhoz. Hat mintához a teljes térfogatot a következőképpen kell kiszámolni:

54


A hordozó RNS törzsoldat teljes térfogata = 6 x 3,6 μl hordozó RNS törzsoldat = 21,6 μl A 360 μl higított belső kontroll (IC) elkészítéséhez a felhasználónak a következő mennyiségű elúciós puffert (AVE) kell hozzáadnia: Elúciós puffer térfogata (AVE) = IC TOT – IC AVE – hordozó RNS (CARRIER) térfogata = 360 μl – 21,6 μl -21,6 μl = 316,8 μl A felhasználónak tehát 21,6 μl belső kontroll oldatot kell hozzámérnie 316,8 μl elúciós pufferhez (AVE) és 21,6 μl hordozó RNS (CARRIER) törzsoldathoz, hogy 360 μl higított belső kontroll (IC) oldatot kapjon. Ebből a higított belső kontrollból 60 μl-t kell manuálisan bemérni minden mintához egy 1,5 ml-es csőbe (ET) a 3. pozícióba az EZ1 Advanced vagy BioRobot EZ1 DSP munkaasztalra az EZ1 DSP Virus protokoll indítása előtt.


55

„C” Függelék: Minta adatlap a BioRobot EZ1 DSP használatához Ez a mintalap sablon hasznos lehet a minták kezeléséhez az EZ1 DSP Virus módszer használatakor. A lap fénymásolható és a minták leírása valamint a futtatás részletei feltüntethetők. EZ1 DSP Virus rendszer Dátum/idő:

Kit tételszám:

Kezelő neve:

Futtatás azonosító

Munkaállomás sorozatszáma:

Pozíció

Minta

Betöltés ellenõrzése

Megjegyzés

1 (bal)

Reagens kazetta (RCV) (bal) Mintacsõ (ST) (fûtõblokk hátul) Elúciós csõ (ET) Pipettahegytartó (DTH) heggyel (DFT) Elúciós csõ (ET) hordozó RNS-sel (CARRIER) és belsõ kontroll (IC) Mintacsõ (ST) mintával

2


3


4

5

6 (jobb)

56

Reagens kazetta (RCV) (bal) Mintacsõ (ST) (fûtõblokk hátul) Elúciós csõ (ET) Pipettahegytartó (DTH) heggyel (DFT) Elúciós csõ (ET) hordozó RNS-sel (CARRIER) és belsõ kontroll (IC) Mintacsõ (ST) mintával Reagens kazetta (RCV) (bal) Mintacsõ (ST) (fûtõblokk hátul) Elúciós csõ (ET) Pipettahegytartó (DTH) heggyel (DFT) Elúciós csõ (ET) hordozó RNS-sel (CARRIER) és belsõ kontroll (IC) Mintacsõ (ST) mintával Reagens kazetta (RCV) (bal) Mintacsõ (ST) (fûtõblokk hátul) Elúciós csõ (ET) Pipettahegytartó (DTH) heggyel (DFT) Elúciós csõ (ET) hordozó RNS-sel (CARRIER) és belsõ kontroll (IC) Mintacsõ (ST) mintával


„D” Függelék: Példa egy EZ1 Advanced Riport file-ra Ez a függelék egy tipikus riport file-t mutat meg, amelyet az EZ1 Advanced gép készített. Minden paraméter értéke eltér majd a saját EZ1 Advanced gépével készített riport file-étól. Report File EZ1 Advanced: Serial No. EZ1 Advanced: .................."123456789" User ID: ........................................................"964" Firmware version: ....................................."V 1.0.0" Installation date of instrument: .........................." , " Weekly maintenance done on: ........ "Feb 26, 2008" Yearly maintenance done on:.........."Nov 06, 2007" Date of last UV-run:........................"Mar 03, 2008" Start of last UV-run: ...................................."14:48" End of last UV-run: ....................................."14:52" Status of last UV-run: .................... "UV run aborted" Protocol name: ......................................"Virus DSP" ........................................................."Version 1.0" Date of run: ..................................."Mar 03, 2008" Start of run:................................................"14:54" End of run:................................................."15:40" Status run:...................................................... "o.k" Error Code: ..................................................... "---" Sample input Volume [ul]: ............................." 400" Elution volume [ul]: ........................................" 60" Channel A: Sample ID: ...................................................."717" Reagent Kit number: .............................."9801401" Reagent Lot number: ......................."1181234567" Reagent Expiry date: ...................................."1210" Assay Kit ID: .................................................."717" Note: ............................................................"717" Channel B: Sample ID: ...................................................."393" Reagent Kit number: .............................."9801401" Reagent Lot number: ......................."1181234567" Reagent Expiry date: ...................................."1210" Assay Kit ID: .................................................."393" Note: ............................................................"393" Channel C: Sample ID: ...................................................."163" Reagent Kit number: .............................."9801401" Reagent Lot number: ......................."1181234567" Reagent Expiry date: ...................................."1210" Assay Kit ID: .................................................."163" Note: ............................................................"163" Channel D: Sample ID: ...................................................."149"


57

Reagent Kit number: .............................."9801401" Reagent Lot number: ......................."1181234567" Reagent Expiry date: ...................................."1210" Assay Kit ID: .................................................."149" Note: ............................................................"149" Channel E: Sample ID: ...................................................."719" Reagent Kit number: .............................."9801401" Reagent Lot number: ......................."1181234567" Reagent Expiry date: ...................................."1210" Assay Kit ID: .................................................."719" Note: ............................................................"719" Channel F: Sample ID: ...................................................."407" Reagent Kit number: .............................."9801401" Reagent Lot number: ......................."1181234567" Reagent Expiry date: ...................................."1210" Assay Kit ID: .................................................."407" Note: ............................................................"407" [Checksum E95974AC]

Referenciák A QIAGEN nagy terjedelmű és naprakész online adatbázist tart fent a QIAGEN termékek használatával kapcsolatos tudományos értekezésekből. A széles körű keresési lehetőségek segítenek, hogy az ön által keresett cikket megtalálja akár egy egyszerű kulcsszó alapján, akár az alkalmazást, kutatási területet, címet pontosítva. A teljes referencia lista eléréséhez tekintse meg a QIAGEN Referencia Adatbázist online a www.qiagen.com/RefDB/search.asp oldalon vagy keresse fel a QIAGEN Technikai Szervízt vagy a helyi forgalmazót.

58


Rendelési információk Termék

Tartalom

EZ1 DSP Virus Kit (48)

48 virális nukleinsav tisztításhoz: Elõre töltött reagens kazetták, Egyszer használatos pipettahegy tartó, Egyszer használatos pipettahegy, minta csövek, elúciós csövek, pufferek, hordozó (Carrier RNS)

62724

EZ1 Advanced DSP Virus Card

Elõre programozott kártya az EZ1 DSP Virus protokollal; az EZ1 Advanced munkaállomáson történõ alkalmazásra

9018306

EZ1 DSP Virus Card

Elõre programozott kártya az EZ1 DSP Virus protokollal; a BioRobot EZ1 DSP munkaállomáson történõ alkalmazásra

9017707

EZ1 Advanced

Munkaállomás nukleinsavak automatikus tisztítására az EZ1 kitekkel, 1 év garancia alkatrészekre és javításra*

9001411

Kérjük látogassa meg a www.qiagen.com/products/assays QIAGEN további analízis technikáiért.

Kat. szám

lapot

a

* Ajánlott a Warranty PLUS 2 (Kat. szám. 9237720): 3 éves garancia, 1 megelőző karbantartás évente, 48 órás elsőbbségi válaszidő, minden munka, utazási és javításhoz szükséges alkatrész bennefoglalva.


59

Ez a lap szándékosan lett üresen hagyva

60


Ez a lap szándékosan lett üresen hagyva


61

Védjegyek: QIAGEN®, artus®, EZ1®, (QIAGEN Group); COBAS®, Amplicor® (Roche Molecular Systems Inc., a Roche Diagnostic Systems Inc. részére licenszelve); LightCycler® (Roche); Monitor (Roche Group); OptiQuant® (AcroMetrix Corporation); Rotor-Gene™ 3000 (Corbett-Research).

Korlátozott licensz egyezmény Ennek a terméknek a használatával bármely EZ1 DSP Virus Kit beszerzője és használója egyetért az alábbi feltételekkel: 1.

Az EZ1 DSP Virus Kit kizárólag az EZ1 DSP Virus Kit kézikönyvében foglaltak alapján és a kitben található összetevőkkel használható. A QIAGEN valamennyi szellemi tulajdonjoga alapján nem járul hozzá, hogy felhasználják és beleépítsék a kitben lévő összetevőket a kitben nem megtalálható komponensekkel, kivéve abban az esetben, ha az szerepel az EZ1 DSP Virus Kit kézikönyvben vagy a www.qiagen.com honlapon található további protokollok valamelyikében.

2.

Amennyiben az külön nem kerül megemlítésre a QIAGEN nem vállal garanciát arra, hogy kitjei vagy azok használata harmadik fél jogait nem sérti.

3.

Ezen kitnek és összetevőinek csak egyszeri használata engedélyezett újrahasznosítása, felújítása és újra eladása nem engedélyezett.

4.

A QIAGEN egyértelműen elutasít minden olyan engedélyt (kifejezett vagy szándék szintű) amelyet korábban nem nyilvánított ki.

5.

A kit beszerzője és felhasználója egyetértését adja, hogy sem ő maga nem teszi és senki másnak sem engedélyez semmilyen lépést, amely ahhoz vezet vagy elősegíti a fenti pontok megszegését. Ezen korlátozott licensz egyezményben foglalt korlátozásokat a QIAGEN bármely bíróságon keresztül érvényesítheti, a licensz megszegőjét a nyomozati és bírósági eljárás teljes költségének megtérítésére kötelezheti beleértve, az ügyvédi díjakat olyan eljárásban, amely a korlátozott licenszhez és a kithez és összetevőihez kapcsolódó szellemi tulajdonjoghoz fűződik.

A legújabb licensz feltételekről a www.qiagen.com oldalon tájékozódhat. © 2008 QIAGEN, minden jog fenntartva.

62


www.qiagen.com Australia Orders 03-9840-9800 Fax 03-9840-9888 Technical 1-800-243-066 Austria Orders 0800/28-10-10 Fax 0800/28-10-19 Technical 0800/28-10-11 Belgium Orders 0800-79612 Fax 0800-79611 Technical 0800-79556 Canada Orders 800-572-9613 Fax 800-713-5951 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China Orders 0086 21 3865 3865 Fax 0086 21 3865 3965 Technical 800 988 0325, 800 988 0327 Denmark Orders 80-885945 Fax 80-885944 Technical 80-885942 Finland Orders 0800-914416 Fax 0800-914415 Technical 0800-914413 France Orders 01-60-920-926 Fax 01-60-920-925 Technical 01-60-920-930 Offers 01-60-920-928 Germany Orders 02103-29-12000 Fax 02103-29-22000 Technical 02103-29-12400 Hong Kong Orders 800 933 965 Fax 800 930 439 Technical 800 930 425 Ireland Orders 1800-555-049 Fax 1800-555-048 Technical 1800-555-061 Italy Orders 02-33430411 Fax 02-33430426 Technical 800-787980 Japan Telephone 03-5547-0811 Fax 03-5547-0818 Technical 03-5547-0811 Luxembourg Orders 8002-2076 Fax 8002-2073 Technical 8002-2067 The Netherlands Orders 0800-0229592 Fax 0800-0229593 Technical 0800-0229602 Norway Orders 800-18859 Fax 800-18817 Technical 800-18712 Singapore Orders 65-67775366 Fax 65-67785177 Technical 65-67775366 South Korea Orders 1544 7145 Fax 1544 7146 Technical 1544 7145 Spain Orders 91-630-7050 Fax 91-630-5145 Technical 91-630-7050 Sweden Orders 020-790282 Fax 020-790582 Technical 020-798328 Switzerland Orders 055-254-22-11 Fax 055-254-22-13 Technical 055-254-22-12 UK Orders 01293-422-911 Fax 01293-422-922 Technical 01293-422-999 USA Orders 800-426-8157 Fax 800-718-2056 Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)

1050257HU 130160216

Sample & Assay Technologies

Sample & Assay Technologies

Recommend Documents