Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian
Sampel air kolam, usus ikan nila dan endapan air kolam ikan.
Str Seleksi BAL potensial (uji antagonis)
Isolasi dan Karakteristik Bakteri Asam Laktat
Isolat Potensial
Pembentukan
pada berbag (plastik Identifikasi Isolat Terpilih
dan
pengamatan h
Isolat Bakteri Asam Laktat murni
Produksi Senyawa Antibakteri
Pengendalian Biofilm S. agalactiae tertua pada permukaan plastik dan sisik ikan oleh senyawa antibakteri potensial 100% pada pengamatan waktu kontak 60 menit
Universitas Sumatera Utara
Karakterisa Karakteristi Karakteristi
Lampiran 2.
Bagan Alir Isolasi Bakteri Asam Laktat
Air Kolam
10 ml air kolam diencerkan pada pengenceran 10-4 hingga 10-8 CFU/mL dengan PBS diambil 0.1 mL dari pengenceran 10-4 hingga 10-8 CFU/mL diinkubasi suhu 30oC selama 24-48 jam dimurnikan pada media MRSA dengan metode kuadran gores setiap koloni dengan morfologi yang berbeda, diinkubasi pada suhu 30oC selama 2448 jam
Kultur aktif
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 3. Bagan Alir Seleksi BAL Potensial Terhadap S.agalactiae
Kultur uji S. agalactiae Gigi usia 24 jam
1-2 ose dibuat suspensi cair dalam 9 mL akuades steril diukur kekeruhannya dengan spektrofotometer hingga OD = 0,5 pada panjang gelombang 600 nm dicelupkan cotton bud steril dalam suspensi dan diusapkan pada media MHA telah mengeras ditotolkan 1 ujung tumpul tusuk gigi steril kultur 24 jam kandidat BAL diinkubasi 24-48 jam pada suhu 28oC . Zona bening disekitar cakram
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 4. Bagan Alir Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Air Kolam
Identifikasi BAL - ditumbuhkan pada media NB - diinkubasi pada suhu 30 oC selama 24 jam
Uji Morfologi
Pewarnaan Gram
- membuat preparat ulas isolat - difiksasi di atas Bunsen - ditetesi dengan kristal ungu - diamkan selama 1 menit - dicuci dengan air mengali - ditetesi dengan safranin - diamkan selama 30 detik - dicuci kembali dengan air mengalir - preparat dikeringkan - diamati dibawah mikroskop -
diamati bentuk koloni diamati tepi koloni diamati elevasi koloni diamati warna koloni
Uji (+) sel berwarna ungu terhadap kandidat genus BAL
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 5. Bagan Alir Kurva Pertumbuhan BAL Potensial
L. plantarum
diinokulasikan sebanyak 10 ose kedalam 50 ml NB diinkubasi pada suhu 30oC diukur kekeruhannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm dilakukan perhitungan berulang rentang 3 jam selama 24 jam
setiap
Kurva OD terhadap rentang waktu 3 jam
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 6. Bagan Alir Pembentukan Sel Biofilm S. agalactiae pada Permukaan Sisik dan Plastik
Lempeng Permukaan Padat dibentuk masing-masing seluas 1 cm2 dicuci dengan detergen selama 15 menit.pada bak sonikator, kemudian bilas dengan akuades steril disterilkan dengan autoklaf 121oC. dimasukkan media NB sebanyak 50 mL menumbuhkan hingga 108 CFU/mL isolat S. agalactiae di dalam botol uji dimasukkan lempeng padat pada masing-masing botol. digoyang pada kecepatan 120 rpm pada suhu 30oC selama 1, 3 dan 5 hari. dibilas 3x dengan akuades steril sebanyak 10 mL untuk masing-masing jenis lempeng. dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0.9 % dan 0.5 g serbuk kaca (glass bead). divortek selama 2 menit untuk melepas biofilm tersisa dilakukan pengenceran berseri dari tiap pengenceran berseri disebar 1 mL dari pada media PCA diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam dihitung jumlah koloni yang tumbuh
Biofilm
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 7. Produksi Senyawa Antibakteri BAL
Kultur AK5
diinokulasikan sebanyak kedalam 50 mL NB
10
ose
diinkubasi pada suhu 30 oC selama 15 jam dipipet sebanyak 10 mL ke dalam masing-masing tabung sentrifugasi disentrifugasi 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 15 menit dipipet supernatan yang terpisah dengan peletnya ke dalam botol steril disimpan pada suhu 4oC dan botol tidak tembus cahaya jika tidak langsung digunakan
Senyawa antibakteri BAL
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 8. Bagan Alir Pengendalian Biofilm S. agalactiae Lempeng Biofilm
dipreparasi berdasarkan jumlah berdasarkan perlakuan sebelumnya
sel
tertinggi
dibilas 3x dengan akuades steril untuk melepas sel planktonik dimasukkan dalam masing-masing tabung steril, ditambahkan 9 mL formulasi 100% senyawa antibakteri BAL digoyang pada kecepatan 120 rpm. dibilas 3x dengan akuades steril untuk melepas planktonik yang masih tersisa dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0.9 % dan 0.5 g serbuk kaca (glass bead). divortek selama 2 menit untuk melepas biofilm tersisa dilakukan pengenceran berseri dari tiap pengenceran berseri disebar 1 mL dari pada media PCA diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam dihitung jumlah koloni yang tumbuh Jumlah sel biofilm yang tersisa
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 9. Bagan Alir Aktivitas Senyawa Anti Bakteri terhadap pH
Senyawa Antibakteri Ekstrak Kasar BAL AK 5 555GB55%555%5% dipipet 2 mL kedalam tabung reaksi diatur pH dengan menambahkan HCl 0,1 N dan NaOH 0,1N secara terpisah sehingga mencapai variasi pH 2, 4, 6, 8, 10 dan 12 dipipet sebanyak 15 µl suspensi pada kertas cakram steril diamati sensitifitasnya dengan metode cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae . Zona hambat
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 10 . Bagan Alir Aktivitas Senyawa Anti Bakteri terhadap Suhu
Senyawa Antibakteri Ekstrak Kasar BAL AK 5
dipipet 2 ml kedalam tabung reaksi di inkubasi pada inkubator termofil suhu 280C, 40 0C, 60 0C, 80 0C selama 15 menit. dipipet sebanyak 15 µl suspensi pada kertas cakram steril diamati sensitifitasnya dengan metode cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae Zona hambat
.
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 11. Bagan Alir Aktivitas Senyawa Antibakteri terhadap Surfaktan
Senyawa Antibakteri Ekstrak Kasar BAL AK 5
dipipet 1 mL kedalam tabung reaksi dipipet 0,1 mL surfaktan EDTA dan Tween 80 masing-masing tabung reaksi dipipet sebanyak 15 µl suspensi pada kertas cakram steril diamati sensitifitasnya dengan metode cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae Zona hambat
.
Universitas Sumatera Utara
Lampiran 12. Foto Bahan Penelitian
Glassbeads (manik-manik kaca) Isolat S. agalactiae
Lempeng sisik ikan
Lempeng plastik PVC
Universitas Sumatera Utara
