12 Samenvatting voor niet-ingewijden Ruben de Kanter Dirk Meijer Geny Groothuis Groningen University Institute for Drug Exploration, Department of Pharmacokinetics and Drug Delivery, Groningen, Netherlands
Hoofdstuk 12 §1. Inleiding Ons lichaam is goed beschermd tegen indringers zoals bacteriën en giftige stoffen. Naast de fysieke bescherming door de huid etc. is er een uitgekiend opruimmechanisme tegen die ‘stoffen’ die toch zijn binnengekomen. Bacteriën, virussen en lichaamsvreemde eiwitten worden herkend en onschadelijk gemaakt door het afweersysteem. Lichaamsvreemde chemicaliën (zogenaamde xenobiotica) die het lichaam binnen kunnen komen, worden weer uitgescheiden. Dat kan echter alleen als deze xenobiotica goed oplosbaar zijn in water. Dat is meestal echter niet zo. Daarom worden de xenobiotica eerst chemisch afgebroken (gemetaboliseerd) door het lichaam zodat ze wel goed oplosbaar in water worden. Dit gebeurt door de zogenaamde metaboliserende enzymen. Deze metaboliserende enzymen kunnen vrijwel alle xenobiotica die het lichaam binnen dringen omzetten, ook wanneer deze stoffen niet eerder in het lichaam aanwezig zijn geweest. Bovendien hebben deze enzymen samen een grote capaciteit zodat in de meeste gevallen binnendringende chemicaliën snel afgebroken worden voordat ze veel schade (vergiftiging) hebben kunnen aanrichten. Geneesmiddelen zijn vaak ook xenobiotica en worden ook door het lichaam afgebroken en uitgescheiden. Als dat te snel gebeurt is dat echter problematisch omdat we juist willen dat geneesmiddelen een tijdje in ons lichaam blijven om hun geneeskrachtige werking uit te oefenen. Daarom worden geneesmiddelen ondermeer geselecteerd op hun bestendigheid tegen afbraak in het lichaam. Meestal worden stoffen die gemetaboliseerd worden om uitgescheiden te worden tegelijk minder giftig, maar soms worden ze juist giftiger. Daarom zijn metabolisme en giftigheid nauw met elkaar verbonden. De enzymen die geneesmiddelen afbreken zijn het meest aanwezig in de lever, maar ze zijn ook te vinden in andere organen, met name in de longen, in de nieren en in de darmen. Metaboliserende enzymen zijn in alle zoogdieren aanwezig en vertonen nogal wat overeenkomsten tussen de soorten. Toch kunnen er grote verschillen tussen dier en mens bestaan in de afbraakproducten die gevormd worden en in de afbraaksnelheid. Dit kan als gevolg hebben dat een medicijn in de mens op een andere manier wordt afgebroken dan in een dier. De veiligheid van geneesmiddelen wordt getest op proefdieren en de bovengenoemde verschillen tussen proefdieren en mensen kunnen bijvoorbeeld resulteren in geneesmiddelen met vervelende bijwerkingen. Daarnaast is het gebruik van proefdieren om morele redenen minder gewenst. Toch is het gebruik van proefdieren vaak niet te vermijden omdat het nu eenmaal onverantwoord is om nieuwe, zelfs veelbelovende, medicijnen direct op mensen te testen. Een mogelijkheid om het gebruik van proefdieren te verminderen is om bij het testen gebruik te maken van menselijk orgaanweefsel dat bijvoorbeeld vrijkomt bij operaties. Dat heeft bovendien als voordeel dat de veiligheid van geneesmiddelen beter gegarandeerd kan worden omdat de betreffende 154
Samenvatting afbraak producten van een medicijn in menselijk materiaal kan worden geïdentificeerd. De mate en soort van omzetting en de eventuele giftigheid kunnen zo worden voorspeld in vitro (in de reageerbuis) voordat het nieuwe middel aan mensen (in vivo) wordt gegeven. Het onderzoek dat in dit proefschrift beschreven wordt, gaat over de ontwikkeling van een model om de afbraak (metabolisme) en giftigheid (toxiciteit) van geneesmiddelen te bestuderen in de belangrijkste organen van de mens. Hiervoor werden plakjes weefsel ter grootte van ongeveer een eurocent, zogenaamde slices, gebruikt. Hierbij is de gedachte dat slices dezelfde eigenschappen hebben als het intacte orgaan in het lichaam, maar alleen op kleinere schaal. Het idee van het maken van slices is dat het weefsel zo dun (omstreeks een kwart millimeter) gesneden wordt dat alle cellen in de plakjes voldoende bereikbaar zijn voor voedingsstoffen en zuurstof. Dat is nodig omdat het fijnvertakte vaatstelsel dat normaal in het weefsel hiervoor zorgt, niet doorstroomd wordt in de slices. Voordelen van slices zijn onder andere dat alle celtypes van het desbetreffende orgaan aanwezig blijven in het preparaat en dat slices van verschillende organen en van verschillende diersoorten op dezelfde, relatief eenvoudige, manier te maken zijn. In hoofdstuk 1 van dit proefschrift wordt een overzicht van de literatuur gegeven over het gebruik van orgaanplakjes (slices), met nadruk op het gebruik van long, nier en darmslices omdat over het gebruik van leverslices al eerder in uitstekende overzichten beschreven is.
§2. Het bewaren van orgaan slices (hoofdstuk 2, 3 en 4) Operaties waarbij bruikbaar menselijk weefsel vrijkomt voor onderzoek, worden niet zo vaak gedaan en gebeuren dan ook nog onregelmatig. Het gaat hierbij om het gebruik van weefsel dat om een medische redenen verwijderd wordt (bijvoorbeeld rondom een gezwel) en dat normaal als chirurgisch afval wordt weggegooid. Voordat het weefsel door de chirurg vrij wordt gegeven voor onderzoeksdoeleinden wordt altijd op een duidelijk voorgeschreven manier toestemming gevraagd aan de patiënt of de familie. Verder wordt het onderzoek getoetst door een medisch-ethische toetsingscommissie (METC) van het ziekenhuis. Wanneer er weefsel beschikbaar komt voor onderzoek, is de hoeveelheid materiaal vaak veel groter dan direct gebruikt kan worden in het experiment. Het is uiteraard zonde om het niet-gebruikte, kostbare en schaarse weefsel weg te doen. Om dat weefsel efficiënter te gebruiken, en om experimenten te kunnen doen wanneer er geen vers menselijk weefsel beschikbaar is, is het nodig om het weefsel te bewaren zonder kwaliteitsverlies. Ook orgaanweefsel van b.v. apen en honden komt maar zelden beschikbaar en de mogelijkheid om weefsel(slices) te bewaren betekent een besparing van proefdieren omdat weefsel dan efficiënter gebruikt kan worden als het beschikbaar komt, bijvoorbeeld als de dieren opgeofferd worden voor een andere reden. 155
Hoofdstuk 12 Bewaren van weefsel kan op twee manieren: invriezen of koel bewaren. Het invriezen en (in principe oneindig) bewaren van weefsel bij een temperatuur van bijna –200°C heet cryopreservatie. We hebben onderzocht of het mogelijk is om leverslices te cryopreserveren (zie hoofdstuk 2). Hierbij werden vers geprepareerde en ontdooide slices vergeleken wat betreft hun vitaliteit en metabolisme van xenobiotica. Het bleek dat leverslices die erg snel worden ingevroren in de aanwezigheid van een bepaald beschermend oplosmiddel hun vitaliteit en metaboliserende functies goed behouden. Dat was erg verassend omdat in de meeste studies, juist langzaam invriezen als optimaal werd gezien. Deze nieuwe methode van snel invriezen werd vervolgens toegepast op leverslices van apen, honden, hamsters, konijnen en op slices gemaakt van menselijk lever weefsel (zie hoofdstuk 2, 3 en 4). Steeds bleek dat de snel ingevroren leverslices na ontdooien weliswaar een deel van hun vitaliteit verliezen, maar wèl heel goed hun metaboliserende karakteristieken behouden. De conclusie is dan ook dat gecryopreserveerde leverslices goed gebuikt kunnen worden voor metabolisme onderzoek van xenobiotica. Wanneer het mogelijk zou zijn om een ‘bank’ aan te leggen van ingevroren orgaanslices van verschillende diersoorten en van menselijk weefsel, kan het metabolisme van een bepaald geneesmiddel in deze species trefzeker vergeleken worden door enkele van deze slices te ontdooien en dan enige tijd in contact te brengen met het geneesmiddel. Zo’n vergelijking is ook belangrijk voor het maken van een rationele keuze in de proefdiersoort voor veiligheidsonderzoek van geneesmiddelen. Immers, er kan op basis van de uitkomst van de metabolisme proeven met slices van meerdere dieren een diersoort gekozen worden die het meest op de mens lijkt. Dit is proefdier besparend omdat verkeerde keuzes vermeden worden, en bovendien leidt het tot veiliger geneesmiddelen. Een andere manier voor het bewaren van slices is het bewaren ervan bij 0°C in een speciale bewaarvloeistof. Deze ‘bewaar’ vloeistof, UW genaamd, werd ontwikkeld voor het bewaren van donor organen bij transplantaties. Op deze wijze overbrugt men de periode die ligt tussen de uitname van het orgaan uit de donor en de eigenlijke transplantatie. De maximale bewaartijd is ongeveer 24 uur, maar tijdens het bewaren treedt er dikwijls toch schade op aan het orgaan. Ideaal zou zijn om de organen twee weken te kunnen bewaren zonder schade. Dan zouden de schaarse donor organen veel efficiënter over patiënten verdeeld kunnen worden. Het onderzoek met slices van verschillende organen zoals beschreven in de discussie van het proefschrift kan een bijdrage leveren aan een verdere optimalisering van deze bewaartechnieken. Dit ook omdat er tegelijkertijd meer variabelen getest kunnen worden (er worden vaak tientallen plakjes per orgaan gemaakt). Uit deze experimenten bleek dat er tijdens koud bewaren schade kan optreden in slices van darmen van ratten en mensen, met name na 24 uur koud bewaren. Daarentegen blijft de vitaliteit van long- en nierslices van ratten en mensen bij gekoeld bewaren redelijk goed behouden. 156
Samenvatting §3. Vergelijking van metabolisme in de lever, long, nier en darm van rat en mens (hoofdstuk 5 en 6) Hoewel de lever in het algemeen als het belangrijkste orgaan voor metabolisme gezien wordt, kunnen met name de longen, nieren en darmen ook xenobiotica metaboliseren. Daarom is het nodig ook voor deze organen een methode te hebben om het metabolisme te kunnen bestuderen. In het in hoofdstuk 5 en 6 beschreven onderzoek werden plakjes van deze organen gemaakt en werd hun vitaliteit en metabolisme capaciteit bestudeerd. De vitaliteit ervan werd vastgesteld door het meten van de hoeveelheid van de energierijke verbinding ATP in de geprepareerde slices. Het bleek dat het ATP nivo in lever-, long- en nierslices van ratten en mensen gedurende de eerste drie uur van het experiment steeg en daarna gedurende 24 uur constant bleef. Het ATP nivo in darmslices was echter laag en daalde ook nog gedurende het experiment. Hieruit werd geconcludeerd dat lever, long- en nierslices vitaal zijn, maar darmslices veel minder. Naast de vitaliteit werd ook de metaboliserende activiteit van de slices van ratten en mensen onderzocht. Daarvoor werden slices van lever, long, nier en darm blootgesteld aan vier modelstoffen. Na afloop werden de afbraakproducten, de zogenaamde metabolieten, van deze vier stoffen geanalyseerd. Het bleek voor drie stoffen dat leverslices de meeste metaboliserende activiteit vertoonden. Voor één stof waren het met name de longslices die de meeste metabolieten produceerden. Voor twee stoffen werd gevonden dat zowel nier- als darmslices half zoveel metabolieten maakten als leverslices. De verhoudingen in de geproduceerde metabolieten van alle vier onderzochte stoffen waren erg verschillend tussen de onderzochte organen. Bovendien werden ook grote verschillen gevonden tussen slices van rat en mens. Verder werd een niet eerder beschreven metaboliet gevonden die voornamelijk gemaakt werd door long, nier- en darmslices van zowel rat als mens (de metaboliet werd geïdentificeerd en EPPA genoemd; hoofdstuk 6). §4. De preparatie van darmslices (hoofdstuk 7) Omdat in hoofdstuk 6 gevonden werd dat het ATP gehalte van darmslices erg laag is, werd een betere methode gezocht om darmslices te maken. De darmslices die in hoofdstuk 6 gebruikt waren, werden gemaakt door de darm open te knippen en de slices uit de darmwand te ‘punchen’. Hierdoor was de dikte van de plakjes in feite hetzelfde als de dikte van de darmwand. Door de darm te vullen met een gel kunnen slices van elke gewenste dikte gemaakt worden. Dit gebeurde met de plakjessnijder, op dezelfde wijze als het maken van lever-, long(wordt ook gevuld met gel) en nierslices. Op die manier ontstaan ringetjes darm (zie de tekening in hoofdstuk 7) waarbij de darmcellen beter toegang tot voedingstoffen en zuurstof hebben. Inderdaad bleek het ATP gehalte van deze darmslices hoger te zijn dan in darm ‘punches’. De metaboliserende eigenschappen waren echter niet zoveel verschillend. Blijkbaar zijn slices met weinig ATP toch in staat om lichaamsvreemde stoffen af te breken. 157
Hoofdstuk 12 §5. Het voorspellen van metabolisme van geneesmiddelen (hoofdstuk 8) Zoals gezegd ziet het lichaam geneesmiddelen als lichaamsvreemde stoffen en worden geneesmiddelen door het lichaam afgebroken en uitgescheiden. De snelheid van eliminatie wordt vaak omschreven met de term ‘klaring’. Dat is het volume bloed dat compleet vrij gemaakt, of ‘geklaard’ wordt van het geneesmiddel per minuut. In het in hoofdstuk 8 beschreven onderzoek is voor zes stoffen onderzocht of de klaring in het lichaam te voorspellen is met behulp van de orgaanslices. Hiervoor werden slices uit organen gebruikt die belangrijk zijn voor het metabolisme op basis van gegevens uit hoofdstuk 6, namelijk slices van lever, long, nier en darm. De ‘verbeterde’ manier van het maken van darmslices uit hoofdstuk 7 werd hierbij toegepast. In hoofdstuk 8 werd de afname van de uitgangsstof gemeten, en niet de vorming van de metabolieten (zoals in de andere hoofdstukken). De klaring die zo gemeten werd in de slices, werd omgerekend naar het hele orgaan en daarna werden de klaringen van de organen opgeteld tot een totale lichaamsklaring. Daarbij werd rekening gehouden met de fysiologie van het lichaam. De bloedvoorziening van de lever is namelijk voor 80% afkomstig van de darmen. Dat betekent dus, dat wanneer er metabolisme (dus: klaring) optreedt in de darmen (hetgeen goed mogelijk is: zie hoofdstuk 6 en 7), de lever minder kan klaren, omdat de lever minder stof krijgt aangevoerd. Hierbij bleek voor sommige modelstoffen dat niet zo zeer de lever, maar vooral de darm het belangrijkste orgaan is voor de klaring. De belangrijkste conclusie was dat de klaring berekend uit de experimenten met slices vrij goed voorspellend was voor de klaring die in levende ratten gemeten werd. De verschillende orgaanslices kunnen in één dag uit een rat (of ander dier) gemaakt worden en dan kan de klaring van meerdere stoffen gemeten worden. Daarentegen zijn voor het bepalen van de klaring in dieren tenminste drie dieren nodig per stof. Het gebruik van slices is dus duidelijk dierproefbesparend en bovendien levert een experiment met slices meer informatie op omdat ook duidelijk wordt welk orgaan het meeste bijdraagt aan de klaring. Heel belangrijk is dat de klaring in mensen voorspeld kan worden door slices van menselijk weefsel te gebruiken. Dit is des te meer relevant omdat we (in hoofdstuk 6) vaststelden dat er grote verschillen tussen proefdieren en de mens kunnen zijn op dit terrein.
§6. Bestuderen van giftigheid van geneesmiddelen (hoofdstuk 9) In het laatste hoofdstuk werd onderzocht of slices bruikbaar zijn om mogelijke giftigheid van geneesmiddelen en xenobiotica te onderzoeken. Eerst werd met behulp van weefselslices uit de rat onderzocht of de pijnstiller paracetamol giftig is voor lever-, long-, nier- en darmslices. Uit de praktijk is de levertoxische werking van paracetamol zeer berucht. Hierbij werd opnieuw het weefsel gehal158
Samenvatting te van ATP gemeten als maat voor de vitaliteit. Precies zoals verwacht bleek dat paracetamol in de gebruikte concentraties het meest giftig is voor leverslices, maar niet voor long-, nier-, of darmslices. Daarna werden naast paracetamol nog drie andere stoffen getest op orgaanslices van menselijke weefsels. Deze stoffen werden geselecteerd op basis van hun bekende specifieke giftigheid in één bepaald orgaan. De volgende stoffen werden geselecteerd: paraquat voor de long, cephaloridine voor de nier en flurbiprofen voor de darm. Hoewel niet alle mogelijke combinaties van deze vier stoffen met slices uit de vier menselijke organen konden worden bestudeerd, kon geconcludeerd worden dat slices van chirurgisch afval weefsel in principe goed bruikbaar zijn om orgaantoxiciteit te voorspellen.
§7. Conclusies Met behulp van weefselplakjes (slices) werd onderzocht hoe organen zoals de lever, long, nier en darmen omgaan met medicijnen. Uit verschillende weefsels, zowel van proefdieren als menselijk weefsel (chirurgisch afval), bleek het mogelijk om op vrijwel dezelfde manier orgaanslices te maken. Ook de wijze van gebruik is vrijwel hetzelfde voor verschillende slices en dit maakt een trefzekere vergelijking tussen proefdierspecies en de mens mogelijk. Leverslices kunnen op een speciale manier worden ingevroren en bewaard bij –196°C voor later gebruik. Lever-, long- en nierslices kunnen ook tot 24 uur ijskoud bewaard worden zonder invriezen. Darmslices bleken erg gevoelig te zijn voor bewaren en zijn eigenlijk alleen maar direct (vers) te gebruiken. De slices breken medicijnen actief af en opvallend genoeg vertonen niet alleen leverslices veel metabolisme maar geldt dat ook voor plakjes van long, nier en darm. Door de activiteiten van de plakjes lever, long, nier en darm op te tellen bleek het mogelijk te zijn om de snelheid van metabole klaring (de afbraak van medicijnen) in het hele lichaam te voorspellen. Ook kon de orgaan-specifieke giftigheid van geneesmiddelen bestudeerd worden door het gebruik van slices. Weefselplakjes blijken dus een bruikbaar alternatief te zijn voor onderzoek in het intacte lichaam. Bovendien kan het gebruik van slices het aantal dierproeven verminderen. Door het gebruik van menselijk weefsel kan in een vroeg stadium inzicht verkregen worden in de afbraak en eventuele giftigheid van geneesmiddelen in de patiënt.
159
160
