Chapter 12
Nederlandse samenvatting voor niet-ingewijden
1
Inleiding
2
Doel
3 Resultaten 4 Conclusies 5 Klinische en therapeutische implicaties
- 189 -
Chapter 12
1
Inleiding
Kanker is tegenwoordig tweede meest voorkomende doodsoorzaak in de westerse wereld. Met name het colorectaal carcinoom (dikke darmkanker) wordt vaak gediagnosticeerd en veel mensen overlijden eraan. De primaire behandeling voor deze vorm van kanker bestaat uit het operatief verwijderen van de tumor en adjuvante (aanvullende) chemotherapie of bestraling. Tumoren bestaan uit verschillende cel typen, tezamen vaak de tumor micro-environment (tumor micro-omgeving) genoemd. Cellen in zowel normale als pathologische condities communiceren met elkaar en zijn afhankelijk van de “ondergrond” waar ze op vastzitten, de zogenaamde extracellulaire matrix (ECM). Communicatie tussen cellen gebeurt door directe contacten tussen de cellen, maar ook door groeifactoren die deze cellen uitscheiden. Deze interacties liggen ten grondslag aan twee processen die bijdragen aan de initiatie (het ontstaan), progressie (vergroting en invasieve groei in omliggend weefsel) en uiteindelijk metastasering (uitzaaiing) van tumoren, te weten myofibroblast differentiatie en angiogenese (bloedvatvorming). Deze processen worden gestuurd door groeifactoren die al aanwezig zijn in de ECM, maar gebonden aan het ECM zijn deze groeifactoren niet actief. Ze moeten gereleased (losgemaakt en geactiveerd) worden, vaak door zogenaamde proteolytische enzymen (eiwit knippende enzymen, die in staat zijn om door een gedeelte van een voorloper eiwit af te knippen en het daardoor te activeren). Een belangrijke groep van deze proteolytische enzymen vormen de matrix metalloproteinasen (MMPs), aangezien die in staat zijn een grote variëteit aan groeifactoren te activeren. In dit proefschrift worden de studies beschreven naar twee groeifactoren (VEGF en TGF-) die ten grondslag liggen aan twee belangrijke tumor stimulerende processen, te weten angiogenese en differentiatie van myofibroblasten. Tumoren worden wel eens vergeleken met een “wond die niet heelt”. Dit geeft aan dat er speciale cel typen zijn, zoals de myofibroblast, die zowel een rol spelen bij wondheling als bij tumorprogressie. Fibroblasten, oftewel bindweefsel cellen, zijn cellen die een ondersteunende rol hebben voor epitheelcellen (epitheel cellen zijn bijvoorbeeld huidcellen en darmwandcellen). Myofibroblasten zijn hyper-geactiveerde fibroblasten en komen in normaal weefsel maar weinig voor, in tumoren daarentegen is hun expressie sterk verhoogd. Waar deze cellen vandaan komen is niet opgehelderd, maar er wordt gedacht dat een groeifactor, uitgescheiden door tumorcellen, wat ook epitheelcellen zijn, de omringende fibroblasten kan hyper-activeren. Deze groeifactor wordt transforming growth factor (TGF) genoemd en is normaal aanwezig als een niet-actieve pro-groeifactor genaamd latent TGF-
- 190 -
Nederlandse samenvatting . Na activatie, door bijvoorbeeld MMPs, kan TGF- vele processen initiëren, zoals het ontstaan van myofibroblasten, verhoging van secretie van andere groei-stimulerende factoren en de inductie van angiogenese via een receptor genaamd Endogline. Angiogenese is van groot belang voor de uitgroei van tumoren. Wanneer tumoren 1-2 mm groot zijn kunnen ze niet verder groeien door een gebrek aan zuurstof (hypoxie) en voedingstoffen tot dat ze hun eigen bloedvatstelsel hebben gecreëerd (angiogenetische switch). Vascular endothelial growth factor (VEGF) wordt beschouwd als een van de belangrijkste initiatoren van angiogenese in tumoren. VEGF wordt na synthese eerst als een inactief molecuul in de ECM vastgezet en moet door proteolytische activiteit geactiveerd (losgeknipt worden van de matrix) worden. Er zijn aanwijzingen dat de proteolytische MMP enzymengroep hierbij een belangrijke rol speelt. Eenmaal geactiveerd kan VEGF ervoor zorgen dat omringende endotheelcellen (bloedvatcellen) uitlopers gaan vormen in de richting van de tumor, waardoor het een eigen bloedvatstelsel krijgt. Beide hierboven beschreven processen omvatten dus de interactie tussen verschillende celtypen, zoals de fibroblasten met de tumorcellen en de endotheelcellen, in het geheel van de tumor micro-omgeving. Deze interacties zijn complex en om dit te bestuderen kan gebruik gemaakt worden van diermodellen, maar die hebben als nadeel dat ze niet representatief hoeven te zijn voor de humane situatie, omdat een muis geen klein mens is. Daarom werd in dit proefschrift gebruik gemaakt van 3-dimensionale celkweek modellen. De situatie in patiënten werd bestudeerd door het bepalen van de groeifactor en proteolytische enzym (MMP) niveaus in een homogenaat (extract) van tumorweefsel. Met behulp van specifieke antilichaamkleuringen is bekeken in welke cellen deze groeifactoren en enzymen voorkomen. Vervolgens werden deze bevindingen vertaald naar een in vitro systeem (de cellen worden los in een laboratorium gekweekt) om het onderliggende mechanisme te kunnen onderzoeken.
2 Doel Het doel van de studies beschreven dit proefschrift was om de interacties tussen verschillende celtypen (fibroblasten, tumorcellen, endotheel) door proteolytische activatie van latente groeifactoren in de colorectale tumor micro-omgeving te onderzoeken. Hierbij staan twee processen centraal, het ontstaan van myofibroblasten en het proces van initiatie van angiogenese door tumoren.
- 191 -
Chapter 12
3 Resultaten In hoofdstuk 3 werd de hoeveelheid latent en actief TGF- in een groep patiënten met maagtumoren bepaald. De belangrijkste resultaten waren dat alhoewel zowel de hoeveelheid latent als actief TGF- verhoogd is in tumoren, met name het actieve TGF- belangrijk is voor de prognose van de patiënten. Patiënten met hoge actieve TGF- niveaus hebben een slechtere prognose (kortere overleving). Kleuringen op weefsel van deze patiënten toonden aan dat de TGF- activiteit met name gezien wordt in de myofibroblasten. Deze data werden in hoofdstuk 4 bevestigd op een grote groep colorectaal tumor patiënten. Uit deze resultaten bleek tevens dat de toename van latent TGF- al zichtbaar is in pre-maligne (goedaardige) poliepen, terwijl actief TGF- alleen verhoogd is in tumoren (maligne, kwaadaardig) en dus een grote rol zou kunnen spelen in de maligne ontaarding van goedaardige poliepen. Verder staat in dit hoofdstuk de ontwikkeling van een bepaling om de hoeveelheid myofibroblasten te kunnen vaststellen in deze monsters beschreven. Uit de resultaten bleek dat er een relatie is tussen de hoeveelheid TGF- activiteit en de hoeveelheid myofibroblasten in deze patiënten. Om dit mogelijk causale verband te onderzoeken staat in hoofdstuk 5 de vertaling van de observaties in patiënten naar een in vitro cel kweek systeem beschreven. Er werd aangetoond dat de interactie tussen tumorcellen en omringende fibroblasten leidt tot activatie van het latent TGF- en daarop volgend het ontstaan van myofibroblasten (hyperactivatie). De interactie tussen deze twee cel typen was van cruciaal belang voor initiatie van dit proces. Deze cellen sterk hebben tevens verhoogde uitscheiding van TGF- en MMPs die vervolgens in staat zijn om invasie van tumoren te veroorzaken. Dus de interactie tussen de cellen leidt tot hyperactivatie van de fibroblasten, maar die beïnvloeden op hun beurt weer de tumor cellen tot verhoogde secretie van groeifactoren en MMPs. Gevolg is dat na hyperactivatie er meer TGF- komt, wat weer meer hyperactivatie geeft en dus meer TGF-, waardoor een vicieuze cirkel ontstaat. De myofibroblasten geven ook een verhoogde secretie van MMP-9, waarvan beschreven is dat er een mogelijk verband bestaat met de angiogenetische switch. Vandaar dat in hoofdstuk 6 de studie naar de rol van MMP-9 in de angiogenetische switch is beschreven. Analyse van patiënten materiaal liet zien dat er een verband is tussen de hoeveelheid VEGF in de circulatie (bloed) en MMP-9 niveaus in de tumoren. Kleuringen lieten zien dat VEGF uit de tumorcellen komt en MMP-9 uit de fibroblasten en immuuncellen. Deze bevindingen werden vervolgens vertaald naar een 3 dimensionaal in vitro model wat zo samengesteld was dat het zo goed als mogelijk overeenkwam met de situatie in de patiënten. De colon tumor
- 192 -
Nederlandse samenvatting spheroiden (bolletjes tumorcellen) maken een ECM (matrix) waar VEGF aan gebonden wordt als een inactief molecuul. Wanneer deze werden behandeld met MMP-9 afkomstig van myofibroblasten en infiltrerende immuuncellen (neutrofielen) bleek dat het VEGF geactiveerd wordt door directe degradatie (knippen) van de matrix waaraan het VEGF gebonden zit. Hierdoor wordt het VEGF vrijgemaakt wordt en was het in staat tot vorming van endotheel uitlopers (sprouting) wanneer endotheelcellen hiermee behandeld werden, vergelijkbaar met de angiogenetische switch. Deze resultaten geven wederom aan dat de interactie tussen met name de neutrofielen, tumorcellen en hun ECM en de endotheelcellen belangrijk is voor de initiatie van dit proces. Tevens bleek het knip mechanisme in mensen anders is dan in muizen. Behalve MMP-9 heeft ook een ander proteolytisch enzym uit dezelfde MMP familie, MMP-7, hier een rol in zoals beschreven staat in hoofdstuk 7. Deze MMP komt tot expressie in de uitlopers van endotheelcellen en wanneer MMP-7 geremd wordt, konden er geen uitlopers meer ontstaan. Om dit fenomeen verder te onderzoek is in hoofdstuk 8 de ontwikkeling van een bepaling (bio-activiteits assay, BIA) om MMP-7 niveaus in patiënten materiaal, zoals homogenaten van tumor weefsel, plasma en urine te kunnen meten beschreven. Uit de voorlopige analyses bleek dat, net als bij TGF-, de productie van het inactieve proteolytische enzym al in poliepen verhoogd is, maar dat verhoogde activatie pas plaatsvindt in tumoren. Behalve de voorgenoemde MMPs speelt ook het proteolytische enzym cathepsine S een rol in het activeren van matrix moleculen die angiogenese kunnen induceren (hoofdstuk 9). Verder staan in dit hoofdstuk de studies beschreven naar de aanpassing van een bestaande screenings techniek (faag display) voor de selectie van specifieke remmers voor deze enzymen die na doorontwikkeling mogelijk als medicijn zouden kunnen dienen. Tot slot staat in hoofdstuk 10 beschreven hoe Endogline, een receptor voor TGF-, die sterk tot expressie komt op nieuw gevormde bloedvaten, van deze vaten geknipt wordt en laten zien dat met name een MMP die aan de membranen gebonden zit, MMP-14, hierin een belangrijk rol zou kunnen spelen. Dit “vloeibaar” Endogline komt in de circulatie (bloed) terecht en heeft daar mogelijk een beschermend effect, aangezien het factoren die angiogenese kunnen initiëren kan wegvangen.
4 Conclusies De data beschreven in dit proefschrift onderbouwen de belangrijke rol van de interactie tussen verschillende celtypen en de matrix in de progressie van tumoren. Activatie van TGF- en VEGF is alleen mogelijk waneer er verschillende celtypen aanwezig zijn die elkaar onderling beïnvloeden. De diverse studies laten tevens zien dat humane celkweekmodellen een
- 193 -
Chapter 12 belangrijke toevoeging kunnen zijn voor het onderzoek naar deze processen in de humane model-omgeving.
5 Klinische en therapeutische implicaties Uit dit onderzoek blijkt dat de tumor micro-omgeving een belangrijke rol speelt bij de progressie van tumoren en dat met name de activatie van latente groeifactoren hierin van groot belang is. Uit de data blijkt dat MMPs hierin een belangrijke rol spelen. Op langere termijn, na meer onderzoek zou het specifiek remmen van deze MMPs, gericht op de humane situatie en in een vroeg stadium van tumorontwikkeling een belangrijk therapeutisch perspectief
kunnen
bieden.
Nader
onderzoek,
gebruik
makend
van
de
diverse
celkweekmodellen, kan de voorgenoemde processen verder ophelderen en kunnen nieuwe therapeutische targets geïdentificeerd worden.
.
- 194 -
