Salmonella a gastrointestinální trakt člověka

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Salmonella a gastrointestinální trakt člověka (Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie – směr Mikrobiologie)

Petra Pospíšilová Brno 2009

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma: „Salmonella a gastrointestinální trakt člověka“ zpracovala sama a uvedla jsem všechny použité prameny.

V Brně dne 10. 5. 2009

Ráda bych poděkovala vedoucímu bakalářské práce Ing. Martinu Krskovi, CSc., za cenné rady při tvorbě práce a konzultantce MVDr. Renatě Karpíškové, Ph.D., za čas věnovaný praktickým ukázkám a taktéž za užitečné rady.

Obsah Obsah ....................................................................................................................................... 1 Seznam zkratek ........................................................................................................................ 3 1.

Úvod ................................................................................................................................. 4

2.

Cíl práce ........................................................................................................................... 6

3.

Historie............................................................................................................................. 7

4.

Charakteristika salmonel .................................................................................................. 8

5.

4.1.

Morfologie a kultivační podmínky .......................................................................... 8

4.2.

Biochemie ................................................................................................................ 8

4.3.

Antigenní struktura .................................................................................................. 9

Výskyt salmonel............................................................................................................. 11 5.1.

Výskyt salmonel u drůbeže .................................................................................... 11

5.2.

Výskyt salmonel u prasat ....................................................................................... 12

5.3.

Výskyt salmonel v rostlinném materiálu ............................................................... 12

5.3.1. 5.4. 6.

Salmonely jako fytopatogen........................................................................... 14

Výskyt salmonel u lidí ........................................................................................... 16

Průběh salmonelové infekce u lidí ................................................................................. 18 6.1.

Vstup salmonel do organizmu................................................................................ 18

6.2.

Interakce s hostitelem............................................................................................. 19

6.3.

Klinické příznaky salmonelózy .............................................................................. 20

6.4.

Následky infekce .................................................................................................... 21

7.

Průběh salmonelové infekce u zvířat ............................................................................. 22

8.

Diagnostika .................................................................................................................... 23 8.1.

Kultivační metody .................................................................................................. 23

8.2.

Alternativní metody ............................................................................................... 26

8.2.1.

ELISA ............................................................................................................ 26

1

8.2.2. 9.

PCR ................................................................................................................ 26

Léčba .............................................................................................................................. 28

10.

Prevence nákazy......................................................................................................... 29

10.1. 10.1.1.

Snižování počtu baktérií v prvovýrobě .............................................................. 29 Program tlumení výskytu salmonel................................................................ 29

10.2.

Ozonizace a použití UV záření u rostlinných produktů ..................................... 29

10.3.

Hygienické návyky ............................................................................................ 30

10.4.

Vakcinace ........................................................................................................... 31

11.

Diskuze ...................................................................................................................... 33

12.

Závěr .......................................................................................................................... 35

Seznam literatury ................................................................................................................... 36

2

Seznam zkratek ECDC - European Centre for Disease Prevention and Control EFSA - European Food Safety Agency ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay EPA – Environmental Protection Agency FDA – Food and Drug Administration FVHE – Fakulta veterinární hygieny a ekologie PCR – Polymerase Chain Reaction SZÚ – Státní zdravotní ústav WHO – World Health Organization WHOSIS – World Health Organization Statistical Information System

3

1. Úvod Alimentární onemocnění jsou celosvětově jedním z nejrozšířenějších zdravotních problémů. Je známo mnoho mikroorganizmů (baktérií, virů a parazitů) způsobujících onemocnění zažívacího traktu, případně dalších zdravotních komplikací, které mohou v některých případech končit i smrtí. Mezi nejčastější etiologická agens patří u alimentárních infekcí jednoznačně bakteriální rody Salmonella a Campylobacter, v méně vyvinutých zemích i rody Vibrio a Shigella. Přestože se Světová zdravotnická organizace snaží o eliminaci zdravotních rizik spojených s kontaminovanou potravou, je tento proces velice pomalý, a to především z důvodu nedostatku zdrojů nezávadné vody pro přípravu potravin, zejména v rozvojových zemích. V celosvětovém měřítku jsou alimentární choroby stále velkým problémem, v rozvinutých částech světa se daří pomocí příslušných hygienických norem a nařízení v potravinářských provozech rizika snižovat. Většina infekčních střevních chorob samovolně odeznívá i bez antibiotické terapie. Pokud ale není zahájena podpůrná léčba – rehydratace organismu a dodávání ztracených živin, minerálů a vitaminů, mohou tato onemocnění končit až vyčerpáním organismu, oběhovým selháním a smrtí. Mírnění průběhu nemoci pomocí rehydratace

organismu

přineslo

celosvětové

snížení

úmrtí

způsobených

alimentárními onemocněními (Kosek a kol., 2003). Přesto je stále počet úmrtí spojených s alimentárními infekcemi vysoký. Nejpostiženější skupinou jsou děti, průměrný počet úmrtí ročně u dětí do pěti let je 3 miliony (Casburn-Jones a Farthing, 2004). Takto vysoký počet úmrtí je ovšem nerovnoměrně rozdělen, kdy ve vyspělých zemích je úmrtnost dětí do pěti let v průměru 0-1 %, kdežto v zemích rozvojových 15-20 % (WHOSIS, 2000). Salmonelóza je jedním z nejčastějších alimentárních onemocnění ve vyspělých státech světa. Většinou se nejedná o nemoc s fatálními následky, přináší však ročně vysoké socioekonomické ztráty. Salmonelóza je typickou zoonózou (Sedlák a Tomšíčková, 2006) a její výskyt je úzce propojen s chovy hospodářských zvířat, zejména drůbeže. V České republice bylo v roce 2008 hlášeno 10 158 infekcí způsobených salmonelami (EPIDAT, SZÚ,

4

2009). Takto vysoký počet nákaz činí ze salmonely jednu z nejčastějších zoonóz v ČR (Sedlák a Tomšíčková, 2006). Tento počet prodělaných infekcí není úplný, protože salmonelóza může mít asymptomatický průběh, kdy je daná osoba pouze bacilonosičem, ale nevykazuje žádné klinické příznaky (Podstatová, 2001). Na druhou stranu je z údajů jasné, že počet infekcí na území ČR má klesající tendenci. Ve srovnání s 50 826 případy z roku 1998 se jedná o obrovský pokles (EPIDAT, SZÚ, 2009). Především v rozvojových zemích, kde je laboratorní diagnostika na nízké úrovni, jsou tyto infekce těžko odlišitelné od jiných průjmových onemocnění, včetně virových (např. rotaviry, Norwalk a Norwalk-like viry). V ČR se tato onemocnění diagnostikují až v posledním desetiletí. Celosvětový odhad je takový, že hromadné akutní gastroenteritidy jsou ze 40-50 % způsobovány právě viry (Vacek, 2002). Baktérie rodu Salmonella způsobují i v rozvinutých zemích velké problémy. Například v USA způsobí ročně až 1 300 000 onemocnění, ze kterých je 556 smrtelných (Nestle, 2003). Zdrojem infekcí jsou především slepičí vejce, která mohou být kontaminována buď na povrchu skořápky zbytky trusu obsahujícími tyto baktérie, nebo uvnitř vejce, kam se baktérie dostanou při jeho tvorbě (Rosický a kol., 1994). Přestože je kontaminováno průměrně jen jedno z 10 000 vajec, v konečném součtu to pak při roční produkci v USA dělá 4,5 milionu vajec, které jsou potenciálním zdrojem infekce. Známý je případ z roku 1994, kdy se v USA nakazilo více než 220 000 lidí ve 41 státech. Jako zdroj infekce byla později označena balená zmrzlina (Nestle, 2003). Tento případ dobře ilustruje, jak v případě salmonel může být jednou chybou ve výrobě zasažen velký počet konzumentů. V USA je také častým původcem hromadných onemocnění arašídové máslo. Za poslední dobu bylo zaznamenáno kolem 600 takových případů (Crum-Cianflone, 2008). Je tedy zřejmé, že salmonely jsou mikroorganismy rozšířené, které většinou nezpůsobují vážná onemocnění, ale průběh infekce vyřazuje člověka z běžného života.

5

2. Cíl práce Problematika salmonel a salmonelóz je široce diskutovaná, a to především protože se týká nejen mikrobiologie, veterinární medicíny, farmakologie a dalších vědeckých odvětví, ale stejně tak každodenního života. Vysoký počet nákaz v celém světě způsobuje každým rokem socioekonomické ztráty, což činí téma stále vysoce aktuálním. Ve své práci bych ráda provedla literární rešerši poznatků týkajících se interakce salmonel s jejich teplokrevnými hostiteli, především pak s člověkem. Budou popsány možné zdroje infekce z živočišné i rostlinné produkce. Dále se budu věnovat průběhu onemocnění a jeho diagnostice. V neposlední řadě bude nastíněna problematika prevence onemocnění.

6

3. Historie Rod Salmonella dostal své jméno v roce 1900 pro původce onemocnění prasat a byl kodifikován roku 1933. Baktérie byla ovšem objevena dříve. Prvním objevem byla tyfová salmonela. V roce 1880 ji spatřil v lymfatických orgánech zemřelého pacienta bakteriolog Karl Joseph Eberth. Původní jméno tedy znělo Eberthella typhi. První kultivace byla provedena v roce 1884. Ve stejném roce americký veterinární lékař Daniel Elmere Salmon a americký patolog Theobald Smith baktérii popsali v odborné literatuře. Popsán byl druh, který je dnes znám jako Salmonella Choleraesuis (Macela a kol., 2006). Jeden z dnes nejrozšířenějších sérovarů S. Typhimurium byl izolován o něco později, a to v roce 1989. V roce 1914 bylo známo pouze 14 z dnešních 2579 sérotypů (Rosický a kol., 1994, Grimont a kol., 2007).

7

4. Charakteristika salmonel Rod Salmonella je zařazen do kmene Proteobacteria. Tento kmen čítá 5 tříd bakterií

–

Alfaproteobacteria,

Betaproteobacteria,

Gammaproteobacteria,

Deltaproteobacteria a Epsilonproteobacteria. Rod Salmonella se řadí do třídy gamaproteobaktérií, která je v rámci kmene poměrně rozsáhlá a klinicky významná. V této třídě zaujímá místo v čeledi Enterobacteriaceae (Sedláček, 2007). Je tedy řazena po boku dalších střevních bakterií, často také patogenů lidského a zvířecího gastrointestinálního

traktu

(např.

rody

Shigella,

Escherichia).

Čeleď

Enterobacteriaceae zahrnuje organismy všudypřítomné. Vyskytují se po celém světě, v prostředích, jako je voda, půda, rostlinná vegetace a střevní mikroflóra zvířat i člověka (Murray a kol., 2002). Salmonella je rod, který obsahuje pouhé dva druhy (Salmonella enterica a Salmonella bongori). Druh Salmonella enterica se dále dělí do 6 poddruhů a více než 2579 sérotypů (Grimont a kol., 2007). Sérotypy budou dále popsány v kapitole Antigenní struktury.

4.1.

Morfologie a kultivační podmínky

Morfologie a fyziologie rodu je typická patogenní. Jedná se o gramnegativní pohyblivou tyčku s kultivačním optimem 37 °C (Sedláček, 2007). Růst byl prokázán při teplotách 6-50 °C a salmonely jsou také schopné přežívat zmrazení, tudíž jedinou jejich bezpečnou eliminaci lze provést při teplotě nad 66 °C (Rosický a kol., 1994). Pohyb je zajišťován peritrichálně umístěnými bičíky, charakteristickými obecně pro většinu druhů z čeledi Enterobacteriaceae. V mikroskopickém preparátu jsou po obarvení dle Grama vidět jasně gramnegativní krátké rovné tyčky (Sedláček, 2007).

4.2.

Biochemie

Biochemicky jsou salmonely poměrně aktivní. Jsou to organismy chemoorganotrofní,

fakultativně

anaerobní

a

jako

většina

rodů

čeledi

Enterobacteriaceae mají metabolismus jak respiratorní, tak fermentatorní. V testech vychází jako kataláza pozitivní (jsou schopny rozkládat peroxid vodíku na vodu a kyslík) a oxidáza negativní (nedisponují enzymem oxidoreduktáza, který katalyzuje

8

reakci přenosu elektronů ze substrátu na kyslík pomocí cytochromu c). Vyznačují se okyselováním glukózy s tvorbou plynu a dále produkcí sirovodíku. Jejich metabolismus je tímto velice podobný dalšímu rodu čeledi Enterobacteriaceae, rodu Trabulsiella (Sedláček, 2007). Od rodu Escherichia se odlišuje schopností využívat citrát jako zdroj uhlíku a slabší schopností až neschopností využívat laktózu (Šilhánková, 2002). Dalším významným znakem je produkce H2S a schopnost tvorby plynu z glukózy (kromě sérotypu Typhi) (Spicer, 2000).

4.3.

Antigenní struktura

Sérotypy jsou určeny kombinací dvou typů antigenů – somatických a bičíkových. Pro sérotyp Typhi je charakteristický pouzdrový Vi antigen, na kterém je založena i jedna z vakcín (Votava a kol., 2003). Molekulárně biologickými metodami bylo zjištěno, že jednotlivé sérotypy mezi sebou dosahují homologie 16S rRNA a provozních genů 96-98 %, jsou si tedy velice podobné. Nejedná se tedy o jednotlivé druhy, jak bylo dříve myšleno (Macela a kol., 2006). Ne všechny sérotypy jsou stejně invazivní a ne všechny sdílejí stejné hostitele. U některých sérotypů je zajímavé, že vyvolávají onemocnění pouze u člověka. Takové salmonely řadíme do skupiny tyfoidních salmonel, jejichž výskyt je však ve vyspělých zemích ojedinělý. Jmenovitě se jedná o druhy Salmonella enterica subsp. enterica sv. Typhi a Paratyphi. Tyto sérotypy jsou rozšířeny v méně vyspělých státech jihovýchodní Asie, Jižní Ameriky a Afriky. Klinický průběh i inkubační doba se liší od běžných salmonelóz, také úmrtnost postižených osob je vyšší. Druhou skupinu tvoří non-tyfoidní salmonely, které řadíme mezi zoonózy, jsou tedy schopné vyvolat onemocnění jak u lidí, tak u zvířat. K epidemiologicky nejvýznamnějším sérotypům patří S. Typhimurium a S. Enteritidis, a to jak v České republice, tak ve všech vyspělých zemích světa (Graf 1).

9

Graf č. 1: Zastoupení epidemiologicky významných sérotypů izolovaných v zemích EU. Upraveno dle: EFSA, 2006

10

5. Výskyt salmonel Salmonely jsou mikroorganizmy široce rozšířené, a to díky své schopnosti přežívat v rozmanitém prostředí. Tímto prostředím může být voda, vzduch, půda, rostliny, krmiva a odpad. Z těchto zdrojů pak mohou být infikována zvířata v hospodářských chovech i člověk (Rosický a kol., 1994). Vedle surovin a potravin živočišného původu získávají jako vehikula infekce v poslední době na významu i potraviny rostlinného původu (Buck a kol., 2003)

5.1.

Výskyt salmonel u drůbeže

Rezervoárem některých sérotypů salmonel (zejména S. Enteritidis) je hrabavá drůbež a v České republice je prevalence pozitivních chovů nosnic v porovnání s ostatními evropskými zeměmi vysoká. Přestože v některých zemích EU jsou postupně zaváděny ozdravné programy na snižování počtu na salmonely pozitivních chovů drůbeže, stále jsou vejce a drůbeží maso nejčastějším zdrojem nákaz. V ČR byl ozdravný program zaveden podle vyhlášek EU od začátku roku 2009, dále bude tento problém diskutován v kapitole o prevenci onemocnění. V zemích EU se počet vzorků čerstvého kuřecího masa v prodeji kontaminovaných salmonelou pohybuje od 2,2 % po 18,2 % - toto vysoké procento kontaminovaného masa vykázal v roce 2006 Kypr. Salmonely byly objeveny i v testovaných vzorcích krůtího masa. Zde se rozpětí pozitivních vzorků pohybovalo od 0 do 11 % (ECDC, 2007). Dále bylo zjištěno, že z drůbežích produktů jsou velmi častým zdrojem infekce kuřecí nugety. Tento produkt bývá prodáván jako polotovar, tedy již v předsmažené formě. Tato forma navozuje u spotřebitele klamný dojem již hotového pokrmu, a přesto mohou takové výrobky vykazovat pozitivní nálezy salmonel. Pokud tedy v procesu domácí přípravy není dosaženo teploty nad 70°C v celém objemu, pak je riziko infekce značné (Bucher a kol., 2008). Ke kontaminaci vajec dochází u nosnic v kloace nebo při průchodu vejce vejcovodem. Tato kontaminace je povrchová, ovšem těsně po snášce se obsah vejce smršťuje, což má za příčinu nasávání povrchové mikroflóry a s ní i možných salmonel přes pórovitou skořápku (Rosický a kol., 1994).

11

Kontrola výskytu salmonel ve vejcích se provádí testováním v chovech nosnic. Testování v letech 2001 až 2005 ukázalo všeobecné snižování pozitivních vzorků, a to téměř ve všech zemích EU. Pět zemí dokonce nezaznamenalo žádné pozitivní nálezy (EFSA, 2006).

5.2.

Výskyt salmonel u prasat

Na rozdíl od drůbeže se u prasat obvykle detekují jiné sérotypy než S. Enteritidis. Jedná se například o sérotypy Typhimurium, Derby, Agona, Ohio. Sérotyp Typhimurium je jedním z nejčastějších izolátů při infekcích a je spojován především s živočišnou produkcí, zejména tedy vepřovým masem (Tab. 1). V roce 2008 byl hlášen z Dánska výskyt kontaminovaného vepřového masa, pozitivního právě na výskyt baktérií salmonel sérotypu Typhimurium. Ve stejném měsíci se objevily kontaminované vzorky i v Norsku s podezřením na stejný zdroj, dánská jatka (ECDC, 2008). Nicméně procentuální vyjádření celkového počtu pozitivních vzorků z vepřového masa je výrazně nižší než u drůbeže nebo vajec. Průměrně se v evropských chovech jedná o desetiny procent. Přesto se v některých zemích EU zavádí v chovech prasat monitorovací programy.

Tabulka 1: Výskyt sérotypu Salmonella Typhimurium (Upraveno dle: EFSA, 2007) Zdroj infekce Vepřové maso a produkty z něj Sýr Vejce a vaječné produkty Maso brojlerů a produkty z něj Ostatní (pekařské výrobky, ryby atd.) Neznámý zdroj Hovězí maso a produkty z něj Ostatní nebo míchané červené maso a produkty z něj Bufetová jídla

5.3.

Počet případů 364 225 201 71 38 37 36

Procento z celkového počtu případů 35,4 21,9 19,6 6,9 3,7 3,6 3,5

32 23

3,1 2,3

Výskyt salmonel v rostlinném materiálu

Již v úvodu bylo popsáno, že méně častým, ovšem stejně nebezpečným zdrojem salmonel jsou i rostlinné produkty, syrové ovoce a zelenina. Vlivem změny životního stylu v posledních několika letech výrazně stouplo riziko nákazy střevními

12

patogeny. Došlo ke zvýšení spotřeby tepelně nezpracované zeleniny a ovoce a hojně bývá využíváno salátových barů. Tento trend s sebou ovšem nese riziko infekce. Syrová zelenina může být kontaminována buňkami salmonel, listérií nebo vysoce virulentním druhem E. coli O157:H7. Produktů s pozitivním výskytem některého rodu střevních baktérií nebo virů je poměrně velké množství. Kontaminace se týkají např. listů salátu, špenátu, melounu, jahod, rajčat, květáku, nepasterovaného jablečného a pomerančového džusu atd. (Buck a kol., 2003). Příležitostí ke kontaminaci rostlinných produktů je před, v průběhu i po sklizni mnoho, a proto je většinou velice obtížné určit primární inokulum. Často jsou kontaminována už semena a klíčky rostlin. Dalším zdrojem kontaminace může být půda, zavlažovací voda, prach, výkaly živočichů a hmyz. V neposlední řadě může být na vině nesprávná posklizňová manipulace se zemědělskými produkty a kontaminace přímo sběrači nebo osobami manipulujícími s produkty (Buck a kol., 2003). Jak bylo uvedeno výše, sérotypy izolované z rostlinného materiálu jsou většinou odlišné od těch izolovaných ze zdrojů živočišných. Jedná se například o sérotypy Havana, Infantis, Senftenberg, Newport a další (Buck a kol., 2003). V roce 2008 byl přes Evropské centrum pro prevenci a kontrolu chorob hlášen ve Španělsku a Francii nárůst izolovaných sérotypů Thompson a Napoli se zjištěním, že kontaminovanou potravinou byl salát rukola dovezený z Itálie (ECDC, 2008). Saláty bývají častým vehikulem střevních infekcí, ať se jedná o infekci druhem Escherichia coli nebo Salmonella enterica. Jak bylo zjištěno, tyto patogeny dokážou při optimálním množství vody přežívat na listech salátu (Lactuca sativa). Větší množství buněk bylo detekováno na mladých listech, a to především kvůli vyššímu obsahu dusíku a uhlíku. Přítomná voda je pak vhodným rozpouštědlem pro tyto látky (Brandl a Amundson, 2008). Kromě přímé konzumace syrové zeleniny a ovoce mohou být zdrojem i některé produkty vyrobené ze zemědělských plodin, jako je např. arašídové máslo. Tento produkt byl v nedávné době zodpovědný za velké rozšíření infekce po celých Spojených státech. V lednu 2009 onemocnělo 529 lidí ve 43 státech. Izolován byl sérotyp S. Typhimurium. Naneštěstí kontaminované arašídové máslo a arašídová pasta pocházely od velkovýrobce, tudíž byly distribuovány mnoha firmám jako polotovar. Tak došlo k velkému rozšíření do většiny států USA (INFOSAN, 2009).

13

Patogenní baktérie se na povrchu zemědělským plodin vyskytují společně s ostatní mikroflórou jako součást biofilmu, který je díky svým jedinečným vlastnostem těžko zničitelný pouhým omytím povrchu. Otázkou zůstává, jakým způsobem by se dalo těmto infekcím předejít. Tradičním řešením je tepelná úprava zeleniny, což není z nutričního hlediska zcela akceptovatelné. Je tedy nutné hledat další způsoby ošetření zeleniny a ovoce před patogeny, které ovšem nebudou snižovat kvalitu a nutriční hodnoty dané plodiny. Dobré výsledky poskytuje například ozonizace zeleniny a ovoce, jak bude dále popsáno v kapitole o možnostech prevence vzniku onemocnění. Salmonely přežívají v prostředí dlouhou dobu, u půdních kontaminant bývá uváděno až 900 dní (Schikora a kol., 2008). Salmonela je schopna také přežívat, a dokonce se množit v buňkách zástupců říše Protozoa. Podle výzkumu TezcanMerdola jsou buňky druhu Salmonella enterica schopny se pomnožovat uvnitř améby Acanthamoeba rhysodes. Jako nejefektivnější sérotyp při množení byl prokázán sérotyp Dublin (Tezcan-Merdol a kol., 2004). 5.3.1. Salmonely jako fytopatogen

Salmonely nejsou vázané pouze na gastrointestinální trakt člověka, častým stanovištěm je i půda, do které se dostává hnojením organickými hnojivy nebo kontaminovanou vodou z přírodních nádrží a řek. Přestože o možnosti přežívání salmonel v půdě po více jak 900 dní se vědělo i dříve, nebyla předpokládána možnost její aktivní patogenity pro kořeny a jiné části rostlin. Ze všech experimentů, které se prováděly dříve, byla brána jako pasivní součást půdní mikroflóry, samozřejmě s možným nebezpečím pro člověka při kontaminaci povrchu zeleniny a jejím nedostatečném umytí. V roce 2008 ovšem přišla vídeňská laboratoř molekulární biologie rostlin ve spolupráci s francouzskou laboratoří k závěru, že salmonely jsou schopné aktivně pronikat z půdy do kořenových vlásků, a tak se chovat jako typický patogen rostlin. Tento fakt byl zjištěn obarvením bakteriálních buněk barvivem GFP (green fluorescent protein) a následným průkazem baktérií mikroskopicky. Pomocí sérologických metod bylo dále zjištěno, že imunitní systém rostliny začne spouštět 15 minut od infekce imunitní kaskády typické pro boj s fytopatogenem. Při pokusu s Arabidopsis thaliana se jednalo o proteinkinázy a kyselinu salycilovou a

14

jasmonovou. Pokud by salmonela byla typickým fytopatogenem, pak by tato reakce měla být dostatečná k její eliminaci z pletiv. Systém obrany proti rostlinnému patogenu však není tak účinný proti patogenu lidskému a zvířecímu, kterým jsou salmonely, proto se baktérii daří imunitní systém rostliny obcházet. Při pokusu byly list a sazenice huseníčku infikovány bakteriálním roztokem a sledovány po dobu jednoho měsíce. Po 2 dnech bylo možné pozorovat znatelné rozmnožení buněk uvnitř sazenice. U listů byla po 5 dnech viditelná chloróza a celkové vadnutí. Po několika dnech list úplně odumírá. Překvapivé je, že apikální meristém rostliny je schopen vyhnat nové listy, ovšem i tyto obsahují určité množství bakteriálních buněk, a přestože je toto množství mnohonásobně nižší než v listech původních, značí, že salmonely jsou schopny v rostlině přežívat a úspěšně se vyhýbat jejím obranným reakcím (Schikora a kol., 2008). Tímto zjištěním se objevují další možné zdroje infekce člověka i zvířat, zdroje velmi nenápadné a těžce kontrolovatelné. I když bude přísná hygiena dodržována v celém procesu přípravy jídla, nelze vyloučit přítomnost baktérií uvnitř pletiv rostlin. V tomto případě pak nepomůže ani dezinfekce povrchu potravin. Jedinou bezpečnou úpravou pak zůstává vaření a další tepelné úpravy. Odhad, kolik z celkového počtu celosvětových onemocnění salmonelou je způsobeno infekcí z rostlin, je velmi nepřesný, zvláště pak kvůli tomu, že pacienti většinou přesně nedokážou sumarizovat obsah jídelníčku ve dnech před vypuknutím nákazy. V USA byly prokázány nákazy salmonelou z rajčat. Onemocnění bylo způsobeno požitím rajčat z farem, které používaly k hnojení organické zbytky obsahující i salmonely a další enterobaktérie. Od roku 1998 byla v USA tato kontaminovaná rajčata zodpovědná za celkem dvanáct hromadných onemocnění (Barak a Liang, 2008). Dříve byly infekce přičítány nedostatečné hygieně při přípravě jídla, dnes už je jasné, že na vině může být i přítomnost buněk uvnitř plodu nebo listu rostlin. V USA tedy muselo dojít k přísné kontrole hnojiv používaných k pěstování plodin dodávaných do obchodů. Byly popsány i případy onemocnění po konzumaci listů salátu (například rukola, jak bylo popsáno výše). Experiment provedený na modelové rostlině A. thaliana tedy odpovídá příkladům z praxe.

15

5.4.

Výskyt salmonel u lidí

Salmonelóza je infekční choroba, která může mít původ ojedinělý nebo hromadný. Pro případ odhalení hromadných nákaz a určení zdroje a cest šíření mají lékaři v ČR ze zákona povinnost hlásit případy salmonelóz do elektronického systému EPIDAT, který spravuje Státní zdravotní ústav (SZÚ). Ve srovnání s jinými zeměmi Evropské unie hlásí ČR nejvyšší počty nákaz (Graf 2). Systém hlášení salmonelóz v ČR je na velice vysoké úrovni, a to i oproti ostatním členským zemím EU. Tím je tedy možno vysvětlit trend vysokého počtu nahlášených infekcí v ČR oproti klesajícímu trendu v ostatních členských zemích. Tento průměrný pokles činí 9,5 % (EFSA, 2006). Ve Švédsku byl v roce 2005 proveden experiment snažící se odhadnout množství infekcí v dané zemi podle počtu infekcí přivezených obyvateli Švédska domů po návratu ze zahraničních pobytů z daných zemí v Evropě. V tomto experimentu vyšlo nejhůře Bulharsko s počtem infekcí 2741 na 100 000 obyvatel, dále Turecko (2344/100 000) a Malta (2141/100 000). Paradoxem je, že právě tyto státy hlásí nejnižší počty případů onemocnění salmonelózou. Nejčastěji izolovaný sérotyp byl i při této studii S. Enteritidis (De Jong, Ekdahl, 2006). Nejrizikovější skupinou onemocnění jsou děti od narození do 4 let věku, u kterých bylo diagnostikováno 21 % ze všech zjištěných infekcí. Tato skupina je následována věkovou skupinou dětí 5-14 let – 15 % případů (EFSA, 2006). V celé Evropě počet nákaz kulminuje v letních měsících, především pak v srpnu. Toto roční období je pro salmonely příznivé z hlediska vyšších teplot, při kterých se velice dobře množí. Ve většině případů je obtížné dopátrat se místa původu infekce. Proto 43 % případů zůstává místně neurčeno, není tedy jasné, jestli byly získány z domácích zdrojů nebo přivezeny ze zahraničí. Ve zbylých 57 % připadá pouhých 7 % na infekce importované ze zahraničí, což znamená, že polovina případů všech infekcí je doma získaných (EFSA, 2006).

16

Graf č. 2: Počet hlášených infekcí přes síť Enter-net v roce 2006 Upraveno dle: ECDC, 2007

17

6. Průběh salmonelové infekce u lidí Salmonelové infekce se u člověka mohou projevit ve třech formách. Prvním typem je salmonelóza v užším slova smyslu, tedy fakticky akutní gastroenteritida, projevující se především průjmy a zvracením. Dalším, méně obvyklým projevem je septikémie, která je častěji spojována se sérotypem Typhi. Tento sérotyp také způsobuje horečnaté tyfoidní infekce. Při těchto infekcích se buňky salmonel dostávají do makrofágů, kde jsou schopné přežívat. Poslední formou je bezpříznakové bacilonosičství neboli asymptomatická kolonizace, kdy je pacient rezervoárem, ale bez viditelných příznaků. Tato forma je také častá u sérotypu Typhi, kdy se salmonely usadí ve žlučníku a jsou společně se žlučí neustále vylučovány z organizmu stolicí. Takový člověk je pak zdrojem infekce pro své okolí (Murray a kol., 2002). Existují také faktory, které zvyšují pravděpodobnost projevu střevní infekce. Mezi tyto faktory patří zejména snížená produkce žaludeční kyseliny, léčba žaludečních vředů antacidy, antibiotická terapie, která narušuje složení normální střevní mikroflóry a malnutrice (McKane, Kandel, 1996).

6.1.

Vstup salmonel do organizmu

Jak bylo již dříve popsáno, salmonela vstupuje do organizmu alimentární cestou, tedy kontaminovanou potravou nebo vodou. Infekční dávka je obvykle 104 106 virulentních buněk. Velice však záleží na zdravotním stavu postižené osoby, protože bývá uváděno, že k infekci postačuje mnohem nižší počet, někdy až jedna buňka (Rosický a kol., 1994). Projevy salmonelové infekce jsou indikovatelné v průměru 6-48 hodin po konzumaci kontaminované potravy nebo vody (Macela a kol., 2006). Délka inkubační doby také závisí na více faktorech, a to především na přijaté infekční dávce, virulenci daného typu a stavu infikovaného jedince (Podstatová, 2001). Mikrob tedy prochází gastrointestinálním traktem až k místu svého působení, kterým je tenké střevo, přesněji Peyerovy pláty. Peyerovými pláty rozumíme systém lymfatických uzlin v tenkém střevě (Macela a kol., 2006). Při průchodu trávicí soustavou musí salmonely odolávat působení žaludeční kyseliny. K tomuto účelu se

18

v genomu salmonel nacházejí ATR geny (acid tolerance response), které zajišťují obranu proti této kyselině (Murray a kol., 2002).

6.2.

Interakce s hostitelem

Salmonely jakožto střevní parazité musí v hostiteli svádět boj s původním osídlením střeva, tedy s hostitelskou střevní mikroflórou. Jakým způsobem dokáže patogen přemoci obranné chování mikrofóry, zůstává zatím neobjasněno, ale poslední studie ukazují, že salmonely dokážou využít ve svůj prospěch zánět, který v hostitelském organizmu indukují. Tímto zánětem dojde k narušení vyváženosti původního střevního osídlení, což otvírá cestu patogenu a následné infekci. Tento krok výrazně usnadňuje mikroflóra již předem narušená, například antibiotiky. Studie byla provedena na myších, ale vzhledem k tomu, že střevní mikroflóra myší a člověka se příliš neliší, pak je pravděpodobné, že salmonely působí na stejném principu i v lidském organizmu (Stecher a kol., 2007). Vzniklý zánět také vyvolává zvýšenou sekreci a sníženou schopnost střeva absorbovat, z čehož vzniká hlavní klinický příznak infekce – průjem (Nester a kol., 1998). Salmonela je intracelulární parazit, a je tedy schopna pronikat do buněk hostitelského organizmu za účelem svého začlenění a čerpání živin. Invaze probíhá do buněk fagocytů a to pomocí sekrečního systému typu III, který je pro salmonely charakteristický a je kódován v lokusu SPI – Salmonella pathogenicity island 1. Tento systém zajišťuje translokaci sady bakteriálních proteinů do cytosolu hostitele. Zasaženy jsou tedy cytosol a buněčná membrána. Tyto úkony vedou k včlenění patogenu do hostitelské buňky. Interakce patogenu s hostitelem není časově neomezená. Vzhledem k tomu, že dochází k postupnému vyčerpávání živin z okolí buňky a zároveň jsou zapojovány obranné mechanismy hostitele, je pro patogen nutné buňku včas opustit. Takto je ovšem učiněno pouze pokud je zajištěno pokračování infekce dostatečným počtem virulentních jednotek v okolí (Macela a kol., 2006). Opuštění buňky provádí salmonela pomocí apoptózy hostitelské buňky, kterou indukuje. Apoptóza a její základní schéma jsou kódovány v hostitelské buňce. Mikrob tedy tyto procesy pouze uvádí do chodu. Protože je apoptóza proces pro buňku přirozený a regulovaný, nedochází při ní k poškozování okolních buněk ani tkání (Macela a kol., 2006).

19

6.3.

Klinické příznaky salmonelózy

Jak bylo zmíněno výše, klinické příznaky se mohou vyskytovat v různých formách. Nejčastější formou, která je chápána pod pojmem salmonelóza, je akutní gastroenteritida. Tato se projevuje po krátké inkubační době, výše zmíněných 6-48 hodinách. Má poměrně rychlý nástup s bolestmi břicha, průjmem, někdy i zvracením. Tyto příznaky většinou odezní do 2 dnů až jednoho týdne samovolně, bez medikace (Nester a kol., 1998). V průběhu akutní infekce je vylučována až miliarda buněk na gram stolice (Atlas, 1995). I non-tyfoidní salmonelózy však mohou mít těžší průběh a v těchto případech dochází například k metastatickým infekcím kloubních protéz a hnisavým artritidám (Votava a kol., 2003). Asi v 5 % případů dochází k bakteriémii, většinou se jedná o imunodeficientní pacienty (Hohmann, 2001). Tyfoidní infekce se vyznačují pomalejším nástupem, inkubační doba se pohybuje od 10 do 14 dnů. Je způsobena sérotypem charakteristickým pouze pro člověka a její průběh je vážnější než průběh běžných salmonelóz. Od běžných salmonelóz se odlišuje nástupem vysoké horečky bez průjmových příznaků (Macela a kol., 2006). V České republice jsou v posledních několika letech hlášeny případy tyfové nákazy pouze ojediněle, obvykle u cizinců nebo českých občanů navracejících se z pobytu v rizikových destinacích. Infekce způsobené sérotypem Typhi jsou obvykle velmi vážné, lehčí případy tyfoidních forem onemocnění nastávají při nákaze sérotypem Paratyphi (Macela a kol., 2006). Z tyfoidních forem onemocnění se také v 1-5 % případů rozvine chronické nosičství, při kterém se baktérie usadí ve žlučníku a jsou tak nosičem kontinuálně vylučovány. Taková osoba se pak stává rezervoárem infekce pro své okolí (Macela a kol., 2006). Asymptonní průběh se neprojevuje žádnými příznaky, tudíž jediným nebezpečím je infikovaný jedinec pro své okolí, jakožto bacilonosič. Nicméně bezpříznakové infekce jsou častější u zvířat, kdy se zvíře stává i na dlouhou dobu salmonelami kolonizováno, aniž by projevovalo jakékoliv známky onemocnění.

20

6.4.

Následky infekce

V případě salmonelóz v užším slova smyslu, tedy infekcí způsobených nontyfoidními formami, odezní většinou onemocnění bez dlouhodobých následků. Jak bylo již ale nastíněno výše, jedná se o intracelulárního parazita schopného pronikat hlouběji do tkání i krve (Nester a kol., 1998). Pokud se tedy jedná o těžší případy infekce, pak jsou možné následky v podobě artritid (Votava a kol., 2003). Dlouhodobé bacilonosičství je naopak charakteristické pro sérotyp Typhi, u kterého je možná perzistence v některém z vnitřních orgánů, nejčastěji žlučníku, i několik let (Macela a kol., 2006).

21

7. Průběh salmonelové infekce u zvířat Jak bylo již výše zmíněno, bezpříznakové nosičství probíhá častěji u zvířat než u lidí. V tomto případě tedy samotné zvíře netrpí žádnými klinickými příznaky, ale je dlouhodobě baktérií kolonizováno a je potenciálním zdrojem infekce pro okolí (Sedlák a Tomšíčková, 2006). Infekce probíhá příznakově především u mláďat nebo oslabených jedinců. Pak probíhá jako akutní onemocnění a průjmy, záněty kloubů a u mláďat i vysokou úmrtností (Sedlák a Tomšíčková, 2006).

22

8. Diagnostika Diagnostika salmonel je prováděna především z klinických vzorků a vzorků potravin. Diagnostikován může být však jakýkoliv materiál, ve kterém je podezření na možný výskyt patogenu. Klasickými mikrobiologickými metodami jsou metody kultivační, které zahrnují detekci, konfirmaci a sérotypizaci, a dále metody alternativní, což jsou rychlé metody detekce pomocí PCR (Polymerase Chain Reaction) nebo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

8.1.

Kultivační metody

Kultivační metody jsou základem při diagnostice salmonel. Vzhledem k tomu, že se salmonely detekují většinou ve vzorcích potravin nebo v klinickém materiálu, není potřeba znát přesný počet buněk, ale jen pozitivní nebo negativní detekci. Detekce se tedy provádí jako stanovení kvalitativní. U potravin se toto stanovení většinou provádí v daném množství vzorku, 25 g nebo 25 ml. Průkaz zahrnuje čtyři stupně, kdy se nejprve buňky nechají pomnožit v neselektivní tekuté půdě (pufrovaná peptonová voda) za aerobních podmínek při 37 °C po dobu 16-20 hodin. Tímto krokem je získán dostatečný počet buněk pro další postup, pokud jich nebylo v původním vzorku dostatečné množství pro další kultivaci. Dále se pracuje již s půdami selektivními. Kultura se přeočkovává do dvou typů selektivních tekutých půd (RVS médium – Rappaport Vassiliadis sója médium a MKTTn médium – Mueller-Kauffman tetrathionát novobiocin médium). Každé z uvedených médií má také svůj způsob kultivace. U RVS média je to aerobně při 42 °C po dobu 24 hodin a MKTTn klasicky při 37 °C rovněž po dobu 24 hodin. Ze selektivních tekutých médií se provádí naočkování na selektivní tuhá média, aby bylo možné detekovat charakteristické morfologie kolonií salmonel. K tomuto účelu jsou využívány XLD agar – agar s xylózou, lyzinem a dezoxycholátem, médium BGA a chromogenní agar – Rambach agar. Tento agar byl vytvořen v roce 1990 Alainem Rambachem právě pro jednoduché odlišení rodu Salmonella od jiných rodů čeledi Enterobacteriaceae, především pak od rodu Proteus, se kterým sdílí dvě významné vlastnosti – oba rody produkují sirovodík a

23

neutilizují laktózu. Médium je tedy založeno na detekci kyseliny vytvořené z propylen glykolu (Rambach, 1990). Tyto jsou kultivovány při 37 °C po dobu 24-48 hodin. Při vyhodnocování jednotlivých selektivních půd se hledají suspektní kolonie, které odpovídají charakteristické morfologii salmonel pro dané médium. Na XLD agaru lze detekovat salmonely jako průsvitné kolonie s černým středem (černý střed je způsoben produkcí sirovodíku (Obr. 1). BGA (agar s briliantovou zelení) je médium, které odliší salmonely, které neutilizují laktózu, od koliformních baktérií, které ji utilizují. Ve smíšené kultuře lze díky změně barvy média snadno odlišit laktóza negativní a laktóza pozitivní rody. Růst salmonel tady znamená zachování původní růžové barvy média, růst jiných, laktóza pozitivních rodů, znamená změnu barvy do žluta (Obr. 2). Na Rambach agaru se salmonely projevují jako jasně červené kolonie s průměrem kolem 1,5 mm. Koliformní baktérie se projevují nárůstem kolonií zbarvených vínově až fialově (Obr. 3). Nevýhodou selektivních půd je občasný výskyt falešně pozitivních reakcí. U médií XLD a BGA se jedná například o chybnou detekci baktérie Citrobacter freundii (Warburton a kol., 1994). Po průkazu buněk salmonel musí být provedena konfirmace, která spočívá ve sledování nárůstu kolonií na selektivních půdách a následném přeočkování pěti kolonií z každé půdy na masopeptonový agar (MPA).

24

Obrázek č. 1: XLD médium

Obrázek č. 2: BGA médium

Upraveno dle: SZÚ

Upraveno dle: SZÚ

Obrázek č. 3: Rambach agar Upraveno dle: SZÚ

Konfirmace může být provedena taktéž biochemicky, kdy jsou standardně prováděny následující testy: růst na TSI agaru (Triple Sugar Iron), průkaz štěpení močoviny, průkaz lyzin dekarboxylázy, průkaz β-galaktozidázy (ONP test), VP test a průkaz tvorby indolu (Tab. 2). Pokud jsou vyšetřovány vzorky klinické, bývá předpokladem dostatečně vysoký počet buněk ve vzorku, aby mohla být provedena kultivace bez předchozího pomnožení. Základem je použití selektivních médií, aby byla oddělena normální střevní mikroflóra od patogenů (Atlas, 1995). K tomuto účelu slouží buď Salmonella-Shigella agar (SS agar) nebo Hektoen (HE) (Votava, 1999).

25

Pokud se jedná o detekci sérotypu Typhi, je používáno SM ID médium bohaté na žlučové soli, kde právě hledaný sérotyp tvoří kyselinu z glukuronátu sodného (Votava, 1999).

Tabulka 2: Výsledky standardních biochemických testů pro druh Salmonella enteritidis Upraveno dle: PLIVA Lachema (EnteroTest24)

Druh testu TSI agar

Výsledek testu Pozitivní

Ureáza Lyzin dekarboxyláza

Negativní Pozitivní

β-galaktozidáza

Negativní

VP Indol

Negativní Negativní

Sérotypizace je pak prováděna pro průkaz antigenů, a to aglutinační reakcí, tedy reakcemi s antiséry (FVHE, 2008).

8.2.

Alternativní metody

Čím dál častěji jsou v mikrobiologii využívány také diagnostické principy molekulárně biologické a imunologické. 8.2.1. ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay je v dnešní době hojně využívaná imunologická metoda založená na detekci protilátek. Pokud je metoda prováděna například u zvířat, pak je detekci podrobeno sérum nebo šťáva z masa. Některé metody ELISA jsou podle typu použitých protilátek schopny rozlišit v chovech infekce chronické od infekcí akutních (Szabó a kol., 2008). 8.2.2. PCR

Metoda založená na amplifikaci charakteristického úseku DNA daného organizmu pomocí matricové DNA, polymerázy a primerů. Pro detekci buněk rodu Salmonella se PCR využívá především jako rychlá, citlivá a spolehlivá metoda při analýze vzorků z potravin. Velkou výhodou proti klasickým kultivačním metodám je 26

právě rychlost PCR. Pro vizualizaci získaných amplikonů se využívá agarózová gelová elektroforéza, při které dojde k rozdělení produktů reakce v elektrickém poli. Tyto jsou následně obarveny speciálním barvivem, například ethidium bromidem (Malorny a kol., 2009).

27

9. Léčba Non-tyfoidní formy onemocnění se obvykle nechávají odeznít bez použití antimikrobní terapie. Použití antimikrobních látek dokonce prodlužuje dobu vylučování salmonel z těla, zhoršuje tedy průběh infekce. Důvodem je zřejmě fakt, že tyto látky působí také na normální střevní mikroflóru, kterou tím také potlačují. Je tedy ničena přirozená bariéra pro boj s patogenem (Votava a kol., 2003). Pokud se ovšem jedná o non-tyfoidní formu onemocnění, která přeroste v bakteriémii, pak je použití antimikrobních látek nevyhnutelné. Nasazovány jsou ampicilin, cefalosporiny nebo chinolin (Hohmann, 2001). V případě onemocnění tyfoidní formou se antibiotická terapie nasazuje. Používanými antibiotiky v boji s tyfovými infekcemi jsou především chloramfenikol a ampicilin. Nesprávným používáním a dávkováním antibiotik došlo i u sérotypu Typhi ke vzniku multirezistentních kmenů, které pak způsobují těžší infekce a výrazně komplikují léčbu (Crump a kol., 2008).

28

10.

Prevence nákazy

10.1.

Snižování počtu baktérií v prvovýrobě

Nejefektivnější redukci salmonelóz by zajistila eliminace bakteriálních buněk přímo u zdroje, tedy v chovech hospodářských zvířat. Tohoto cíle však v současnosti ani blízké budoucnosti není možné dosáhnout. 10.1.1. Program tlumení výskytu salmonel

Tento program byl schválen Evropskou unií v roce 2003 (zde se jedná obecně o tlumení výskytu zoonóz), další upřesnění přišlo v roce 2006 (požadavky na tlumící metody v chovech drůbeže) a nakonec v roce 2007 (přímo snížení výskytu sérotypů Salmonella Enteritidis a Salmonella Typhimurium). Tento program vešel v platnost 1. 1. 2009 a jeho cílem je do konce roku 2011 snížit počet hejn kuřat chovaných na maso, která jsou pozitivní na nález výše zmíněných sérotypů, na maximální hodnotu 1 %. Stejný program probíhá i u chovů nosnic, zde se procento kontaminovaných chovů musí ročně snížit v závislosti na prevalenci z předchozího kontrolovaného období.

Těchto

výsledků

má

být

dosaženo

především

podáváním

nekontaminovaného krmiva, dodržováním hygieny v chovech a dodržováním zásad správné chovatelské praxe (Státní veterinární správa ČR). Monitoring situace rozhodně přispěje k boji s patogenem, protože do nedávné doby žádné pravidelné mapování situace v chovech nebylo prováděno. Následné pozitivní výsledky u chovů mohou být dále řešeny např. vakcinací. Tento program je zaveden pro chovy kuřat na maso, v chovech nosnic produkujících konzumní vejce a v reprodukčních chovech drůbeže (Státní veterinární správa ČR).

10.2.

Ozonizace a použití UV záření u rostlinných produktů

Rostlinné produkty, především tepelně neupravená zelenina a ovoce jsou, co se prevence týká, problematické. Je možné používat chemické látky, například na bázi chlóru, jakožto dezinfekční činidla. Jistou nevýhodou ovšem zůstává, že tyto přípravky mohou uvolňovat potenciálně karcinogenní organické složky. Proto se v posledních letech přešlo ke zkoumání možnosti ozonizace zemědělských produktů,

29

aby se snížil výskyt patogenních organismů na jejich povrchu. Plynný ozon byl díky svým pozitivním účinkům a neexistujícím negativním účinkům schválen EPA (US Environmental Protection Agency) a FDA (Food and Drug Administration) jakožto látka vhodná k přímému použití pro dezinfekci (Selma a kol., 2008) Z experimentu provedeného na plátcích ananasového melounu (cantaloup) je zřejmé, že ozonizace značně redukuje počty patogenů přítomných na povrchu. Byly provedeny i pokusy s nižšími dávkami ozonu po delší dobu, po dobu skladování, což na jednu stranu vedlo k redukci plísní a jiných patogenních mikroorganizmů, na druhou stranu např. u banánů způsobila silná oxidační schopnost ozonu zhoršení kvality produktu – typické hnědé skvrny se objevily po 8 dnech působení plynu (Selma a kol., 2008). Další možností je použití UV pulzů pro dekontaminaci povrchů. Bialka a Demirci ve svém pokusu ošetřovali borůvky UV pulzy a výsledky snížení počtu patogenních mikroorganizmů na povrchu bylo zřetelné. Pouze při použití příliš silných pulzů (3800 V) došlo k poškození plodů (Bialka, Demirci, 2007). U všech výše zmíněných metod je třeba empiricky ověřit optimální časy expozice a sílu působení dekontaminačních prostředků.

10.3.

Hygienické návyky

Salmonelóza je nemoc infekční, a je přenosná i z jedné osoby na druhou, a to fekálně-orální cestou. Pokud tedy například v jedné rodině neonemocní více členů přímo z primárního zdroje, je možné – při nedodržování základních hygienických návyků – předat onemocnění na další osoby právě takto. Pokud se tedy vyskytujeme v prostředí s infikovanou osobou, je potřeba dodržovat pečlivé hygienické návyky zejména po použití toalety nebo při přípravě pokrmů. Samozřejmostí pro prevenci onemocnění je vyhýbání se rizikovým potravinám, a to především v sezóně infekce, tedy v letním období. Nejčastějšími zdroji infekce bývá nedostatečně tepelně opracované kuřecí a vepřové maso a pokrmy obsahující syrová vejce (krémové zákusky, dorty, nepečené cukrářské výrobky). Pokud jsou rizikové potraviny konzumovány, je nutné přísné dodržování hygienických zásad. Salmonely nejsou zabíjeny chlazením ani zmrazením, je pouze prodloužena, respektive pozastavena doba generačního cyklu a nedochází

30

k rychlému množení. U S. Typhimurium je doba generačního cyklu při 15 °C 2,7 hodiny a při 4 °C je cyklus již zastaven, ovšem buňky nejsou devitalizovány. Což znamená, že při rozmrazování pokrmů se buňky při pokojové teplotě opět aktivují. Rozmrazování by tedy mělo probíhat v lednici při teplotě pod 6 °C a potravina pak okamžitě tepelně opracována (Rosický a kol., 1994). Limitujícím faktorem pro buňky salmonel je pH. Pokud jeho hodnota klesne pod 4,5, pak je toto prostředí pro salmonely smrtící. Tohoto faktu se využívá například při výrobě majonéz, kdy je kyselým prostředím zajištěno usmrcení případných patogenů (Rosický a kol., 1994). Pokud tedy člověk dodržuje všechna hygienická doporučení a vyhýbá se rizikovým potravinám, pak je riziko onemocnění salmonelózou poměrně nízké. V zemích s nižší hygienickou úrovní mohou být zdroje infekce i méně nápadné. Falcão a kol. provedli v roce 2002 v jednom z brazilských měst – Araraquara – studii zabývající se kontaminací ledu používaného pro přímou spotřebu a mražení potravin v obchodech. Bylo odhaleno, že vzorky ledu jsou pozitivní na přítomnost nejrůznějších patogenních mikroorganizmů. Vedle rodů Yersinia a Escherichia, byl detekován taktéž rod Salmonella (Falcão a kol., 2002).

10.4.

Vakcinace

Vakcinace jako preventivní opatření je v dnešní době prováděna pouze proti sérotypu Typhi. Podle rozsáhlého výzkumu, který v roce 2000 provedli Crump a kol., způsobuje tento sérotyp ročně přes 21 600 000 onemocnění, ze kterých připadá asi 216 000 na infekce končící smrtí. Mezi nejpostiženější oblasti, tj. vykazující incidenci vyšší než 100 případů na 100 000 obyvatel ročně, patří jižní a jihovýchodní Asie (Crump a kol., 2004). V jižní Asii byl v roce 2000 počet případů dokonce 622 na 100 000 obyvatel. V celé Evropě se ve stejném roce vyskytly případy pouze 3 (Whitaker a kol., 2009). Vzhledem k velkému rozvoji cestovního ruchu vydala WHO doporučení vakcinace proti tomuto sérotypu před návštěvou kterékoliv země z dané endemické oblasti (Whitaker a kol., 2009). Dnes jsou používány 2 typy vakcín, obě s poměrně malými vedlejšími účinky. Tyto typy jsou Ty21a a Vi. Ty21a vakcína obsahuje atenuované buňky sérotypu S. Typhi Ty21a a Vi vakcína je založena na kapsulárních antigenech,

31

obsahuje tedy kapsulární polysacharidy S. Typhi. Tento Vi antigen je charakteristický pro S. Typhi a u S. Paratyphi se nenachází, proto tento typ vakcíny nenabízí možnost zkřížené protektivity. Naproti tomu u vakcíny Ty21a byla ve dvou studiích zjištěna i ochrana proti sérotypu Paratyphi B (Whitaker a kol., 2009). Rozdíl mezi vakcínami je nejen ve složení, ale i v podávání. Ty21a se podává ve formě kapslí ve 4 dávkách, Vi vakcína injekčně do svalu. Oba typy vyžadují přeočkování, v případě Ty21a jednou za 5 let, druhý typ jednou za 2-3 roky. Z tohoto důvodu je očkování finančně poměrně náročné a státy ležící v endemických oblastech si často nemohou dovolit ani první očkovací dávku (Whitaker a kol., 2009). Podle výsledků studií mají vakcíny velice proměnlivou účinnost pohybující se v rozmezí 35 % - 96 %, a to v závislosti na očkovacím kalendáři a dodržování doporučeného přeočkování (Whitaker a kol., 2009).

32

11.

Diskuze Přestože v posledních letech došlo ve výrobních podnicích a dalších

provozech ke zlepšení hygienických podmínek, zůstávají salmonelózy mezi nejčastěji se vyskytujícími zoonózami u nás i v celé Evropě. Podle směrnice Evropské komise z roku 2003 patří salmonelóza a její původci mezi osm povinně sledovaných zoonóz v EU (směrnice 2003/99/EU, 2003). Kvůli svému hojnému rozšíření mohou buňky salmonel snadno kontaminovat potraviny a vodu a způsobovat infekce, často epidemického charakteru. Nejlépe lze kontaminacím a následným infekcím zabránit přímo u zdroje, tedy v případě Evropy v chovech. Program na tlumení salmonel v chovech je diktován směrnicemi EU, je tedy pro členské země závazný. Termín pro snížení počtu salmonel na určený limit je pro Českou republiku v roce 2011. Nyní tedy bude nutné sledovat tendence křivek výskytu salmonelóz u lidí a určit míru vlivu kontaminace samotných chovů. Vzhledem k počtu výskytů tyfoidních forem salmonelóz v rozvinutých zemích je zřejmé, že tato forma onemocnění je v posledních letech na ústupu, nepředstavuje už tedy tak vážné riziko. Tento stav je samozřejmě nutné udržet, aby nedošlo k importu tyfoidních forem onemocnění ze zemí méně rozvinutých, především ze zemí jihovýchodní Asie. Při návštěvě některé z rizikových destinací je vhodné se řídit doporučením WHO a nechat se očkovat některou z vakcín proti sérotypu Typhi. Vlivem obrovského nárůstu migrace lidí po celém světě je ovšem zřejmě import nejrůznějších, dosud v Evropě spíše vzácných infekcí nevyhnutelný. Vzhledem k tomu, že epidemie salmonelóz jsou často spojené s lidským faktorem, konkrétně tedy s hygienicky nesprávnou manipulací s potravinami, je také třeba zaměřit pozornost na nejrůznější formy rychlých občerstvení, bufetů a restaurací, především pak v letní sezóně. Důležité je dodržování základních hygienických pravidel pro práci se syrovým masem, jako je nekřížení cest syrového masa a hotových pokrmů, oddělené plochy pro práci se syrovým masem a důkladné propečení masa v celém jeho objemu po dostatečně dlouho dobu. Neméně důležité je správné uchovávání již uvařených pokrmů, které musí být udržovány neustále při

33

teplotě nad 60 °C nebo naopak při chladničkové teplotě, protože jen tehdy nedochází k masivnímu množení potenciálně přítomných patogenů. Živočišné zdroje salmonelóz jsou tedy v dnešní době již poměrně dobře kontrolovány nebo se na jejich bezpečnosti pracuje pomocí nejrůznějších ozdravných programů. Větším problémem se zdá kontrola produktů rostlinných. Přestože je prokázáno, že salmonely přežívají v půdě, jsou schopné kolonizovat rostliny a způsobovat infekce při požití tepelně neupravené zeleniny a ovoce, je toto riziko stále podceňované. Je tedy třeba najít způsob, kterým by se dala zajistit distribuce hygienicky nezávadného ovoce a zeleniny. Jednou z možností může být ozonizace rostlinných produktů. Tato metoda zatím vykazuje pozitivní výsledky, je však poměrně ekonomicky nákladná. Problémem se může stát i narůstající počet multirezistentních kmenů rodu Salmonella, kdy je kmen rezistentní vůči více antimikrobním látkám, například ke kyselině nalidixové, ciprofloxacinu. Takovéto kmeny pak mohou způsobovat těžší infekce s vyšší mírou nutných hospitalizací, popřípadě až úmrtí (Aarestrup a kol., 2007). Tyto multirezistentní kmeny vznikají kvůli používání antibiotik ve snaze o zamezení hromadných infekcí v chovech drůbeže (Atlas, 1995). Celkově by bylo potřeba omezit používání antimikrobních látek na případy, kdy jsou opravdu nutné, a to ve správném dávkování, aby bylo zamezeno vzniku multirezistentních kmenů.

34

12.

Závěr V práci byly popsány zdroje infekce s detailním zaměřením na konkrétní

případy hromadných infekcí, které ilustrují vysoké nebezpečí možnosti nákazy při nedodržování hygienických pravidel. Rod Salmonella způsobuje každoročně, především pak v letní sezóně, velké množství infekcí. Na rozdíl od jiných bakteriálních a virových onemocnění nevykazuje příliš vysokou mortalitu, přesto negativně ovlivňuje socioekonomickou sféru. Svým téměř ubikvitním výskytem zasahují salmonely člověka ve velké míře. Dále byl shrnut mechanizmus interakce baktérie s gastrointestinálním traktem člověka a způsoby diagnostiky klinických vzorků a vzorků z potravin. Naznačen byl i možný způsob preventivní ochrany proti tyfoidním formám nákazy ve formě vakcinace, kde byly porovnány dva používané typy vakcín i s možnými nevýhodami. V neposlední řadě byly popsány i možnosti prevence non-tyfoidních forem salmonelóz, včetně ozdravného programu na snižování počtu salmonel v chovech, který je upraven evropskými normami. Tento souhrn preventivních opatření naznačil, jak by se dalo v příštích letech dosáhnout dalšího snižování počtu onemocnění salmonelózou ve vyspělých státech. Práce taktéž nastínila nejnovější poznatky o rodu Salmonella jakožto potenciálním fytopatogenu. Tyto nejnovější poznatky ukazují na možné komplikace při snaze o eliminaci popisovaného patogenu. Vzhledem k výše uvedenému je tedy možno konstatovat, že cíl práce byl splněn.

35

Seznam literatury Aarestrup F. M., Hendriksen R. S., Lockett J., Gay K., Teates K., McDermott P. F., White D. G., Hasman H., Sørensen G., Bangtrakulnonth A., Pornreongwong S., Pulsrikarn C., Angulo F. J., Gerner-Smidt P. (2007): International spread of multidrug-resistant Salmonella Schwarzengrund in food products. Emerg. Infect. Dis. 13: 726-731 Atlas R. M. (1995): Microorganisms in our world. Mosby 1995, St. Louis, p. 484, 614-615 Barak J. D., Liang A.S. (2008): Role of soil, crop debris, and a plant pathogen in Salmonella enterica contamination of tomato plants. PLoS ONE 3: e1657 Bialka K. L., Demirci A. (2007): Decontamination of Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica on blueberries using ozone and pulsed UV-light. J. Food. Sci. 72: 391-396. Brandl M. T., Amundson R. (2008): Leaf age as a risk factor in contamination of lettuce with Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica. Appl. Environ. Microb. 74: 2298-2306 Buck J. W., Walcott R. R., Beuchat L. R. (2003): Recent trends in microbiological safety of fruits and vegetables. Plant Health. Progress doi:10.1094/PHP-2003-012101-RV Bucher O., D´Aoust J. -Y., Holley R. A. (2008): Thermal resistance of Salmonella serovars isolated from raw, frozen chicken nuggets/strips, nugget meat and pelleted broiler feed. Int. J. Food. Microbiol. 124: 195-198 Casburn-Jones A. C., Farthing M. J. G. (2004): Management of infectious diarrhoea. J. Gastroen. Hepatol. 53: 296-305 Crum-Cianflone N. F. (2008): Salmonellosis and the gastrointestinal tract: more than just peanut bitter. Curr. Gastroenterol. Rep. 10: 424-431 Crump J. A., Kretsinger K., Gay K., Hoekstra M., Vugia D. J., Hurd S., Segler S. D., Megginson M., Luedeman L. J., Shiferaw B., Hanna S. S., Joyce K. W., Mintz E. D., Angulo F. J., and the Emerging Infections Program FoodNet and NARMS Working Groups (2008): Clinical response and outcome of infection with Salmonella enterica serotype Typhi with decreased susceptibility to fluoroquinolones: A United States FoodNet multicenter retrospective cohort study. Antimicrob. Agents. Ch. 52: 12781284

36

Crump J. A., Luby S. P., Mintz E. D. (2004): The global burden of typhoid fever. Bull. World Health Organ. 82: 346-353 De Jong B., Ekdahl K. (2006): The comparative burden of salmonellosis in the European Union member states, associated and candidate countries. BMC Public Health 6: 1-9 Falcão J. P., Dias A. M. G., Correa E. F., Falcão D. P. (2002): Microbiological quality of ice used to refrigerate food. Food Microbiol. 19: 269-276 Grimont P. A. D., Weill F. -X. (2007): Antigenic formulae of the Salmonella serovars (ninth edition) Institut Pasteur, Paris, p. 197 Hohmann E. L. (2001): Nontyphoidal salmonellosis. Clin. Infect. Dis. 32: 263-269 Kosek M., Bern C., Guerrant R. L. (2003): The global burden of diarrhoeal disease, as estimated from studies published between 1992 and 2000. Bull. World Health Organ. 81: 197-204 Macela A., Stulík J., Trebichavský I., Kroča M., Janovská S. (2006): Infekční choroby a intracelulární parazitismus bakterií. Grada Publishing, Praha, s. 30-31 Malorny B., Huehn S., Dieckmann R., Kra mer N., Helmuth R. (2009): Polymerase chain reaction for the rapid detection and serovar identification of Salmonella in food and feeding stuff. Food Anal. Methods 2: 81-95 McKane L., Kandel J. (1996): Microbiology essentials and applications (second edition). McGraw-Hill Companies, p. 564-571 Murray P. R., Rosethal K. S., Kobayashi G. S., Pfaller M. A. (2002): Medical microbiology (Fourth edition). Mosby 2002, p. 266-274 Nester E. W., Roberts C. E., Pearsall N. N., Anderson D. G., Nester M. T. (1998): Microbiology: A human perspective (Second edition). WCB McGraw-Hill 1998, p. 100, 234, 575, 577, 773-774 Nestle M. (2003): Safe food, bacteria, biotechnology, and bioterrorism. University of California Press, Berkley and Los Angeles, p. 36-37, 45 Podstatová H. (2001): Mikrobiologie, epidemiologie, hygiena. Epava, Olomouc, s. 127-128 Rambach A. (1990): New plate medium for facilitated differentiation of Salmonella spp. from Proteus spp. and other enteric bacteria. Appl. Environ. Microb. 56: 301303

37

Rosický B., Sixl W., Beneš Č., Havlík J., Hubálek Z., Lát J., Matyáš Z., Mikulášková M., Sixl-Voigt B., Thiel W., Wolf A. (1994): Salmonelózy: Aktuální informace pro lékaře, veterinární lékaře a potravinářskou praxi. Scientia Medica, Praha, s. 59, 98104, 160 Sedláček I. (2007): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita, Brno, s. 132, 134 Sedlák K., Tomšíčková M. (2006): Nebezpečné infekce zvířat a člověka. Scientia, Praha, s. 17, 20-27. Selma M. V., Ibánez A. M., Cantwell M., Suslow T. (2008): Reduction by gaseous ozone of Salmonella and microbial flora associated with fresh-cut cantaloupe. Food Microbiol. 25: 558-565 Schikora A., Carreri A., Charpentier E., Hirt H. (2008): The dark side of the salad: Salmonella typhimurium overcomes the innate immune response of Arabidopsis thaliana and shows an endopathogenic lifestyle. PLoS ONE. 3: e2279. Spicer J. W. (2000): Clinical bacteriology, mycology and parasitology. Harcourt Publishers limited (2000), p. 42 Stecher B., Robbiani R., Walker A. W., Westendorf A. M., Barthel M., Kremer M., Chaffron S., Macpherson A. J., Buer J., Parkhill J., Dougan G., von Mering C., Hardt W. D. (2007): Salmonella enterica serovar Typhimurium exploits inflammation to compete with the intestinal microbiota. PLoS Biol 5: 2177-2189 Szabó I., Scherer K., Roesler U., Appel B., Nöckler K., Hensel A. (2008): Comparative examination and validation of ELISA test systems for Salmonella typhimurium diagnosis of slaughtering pigs. Int. J. Food Microbiol. 124: 65-69 Šilhánková Ludmila (2002): Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia 2002, s. 260-262 Tezcan-Merdol D., Ljungström M., Winiecka-Krusnell J., Linder E., Engstrand L., Rhen M. (2004): Uptake and replication of Salmonella enterica in Acanthamoeba rhysodes. Appl. Environ. Microb. 70: 3706-3714 Vacek V. (2002): Alimentární infekce. Galén, Praha, s. 66 Votava M. (1999): Kultivační půdy v lékařské mikrobiologii. Hortus, Brno, s. 173, 220, 232 Votava M., Černohorská L., Heroldová M., Holá V., Mejzlíková L., Ondrovčík P., Růžička F., Dvořáčková M., Woznicová V., Zahradníček O. (2003): Lékařská mikrobiologie speciální. Neptun, Brno, s. 55-56, 60-62

38

Warburton D. W., Bowen B., Konkle A., Crawford C., Durzi S., Foster R., Fox C., Gour L., Krohn G., LaCasse P., Lamontagne G., McDonagh S., Arling V., Mackenzie J., Todd E. C. D., Oggel J., Plante R., Shaw S., Tiwari N. P., Trottier Y., Wheeler B. D. (1994): A comparasion of six different planting media used in the isolation of Salmonella. Int. J. Food Microbiol. 22: 277-289 Whitaker J. A., Franco-Paredes E., del Rio C., Edupuganti S. (2009): Rethinking typhoid fever vaccines: implications for travelers and people living in highly endemic areas. J. Travel. Med. 16: 46-52 Zprávy: Annual epidemiological report on communicable diseases in Europe, European centre for disease preventiv and control, June 2007: 186-193 EPIDAT SZÚ – vybrané infekce v ČR. Dostupné z: http://www.szu.cz/data/infekcev-cr European centre for disease preventiv and control: Urgent inquiry summary December 2008 FVHE – Interaktivní atlas potravinářské mikrobiologie. Dostupné z: http://www.vfu.cz/mikrob-atlas/Main.html INFOSAN Emergency alert update No. 2 : Salmonella in peanut butter, USA, 03 February 2009 Směrnice Evropského Parlamentu a Rady 2003/99/ES ze dne 17. listopadu 2003 o sledování zoonóz a jejich původců, o změně rozhodnutí Rady 90/424/EHS a o zrušení směrnice Rady 92/117/EHS dostupné z: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32003L0099:CS:HT ML SVS ČR – Program tlumení výskytu salmonel, dostupné z: http://www.svscr.cz/index.php?art=1783 The community summary report on trends and sources of zoonozes, zoonotic agents, antimicrobial resistence and foodborne outbreaks in the European Union in 2005, The EFSA journal 2006, 94: 27-81 The EFSA journal 2007 (in print) WHOSIS statistiky salmonelóz u dětí dostupné z: http://www.who.int/whosis/data/Search.jsp?countries=[Location].Members

39