RNDr. Ludmila Tvrzová, PhD. Oddělení mikrobiologie ÚEB, PřF MU
Školní pokusy z mikrobiologie
V učebnicích biologie pro střední školy se nesetkáváme s dostatečnou nabídkou nenáročných studentských pokusů z oblasti mikrobiologie. Výjimku tvoří např. Biologie pro střední školy gymnázijního typu (praktická část), Jelínek a Zicháček, 1996. Mikrobiologie se přitom dotýká řady oblastí praktického života a s minimálním vybavením je možno demonstrovat řadu mikroorganismů a jejich významných aktivit. Zde předkládáme několik nenáročných pokusů, jejichž provedení je reálné ve školních podmínkách, přičemž nabízíme, díky obrazové dokumentaci, možnost porovnání výsledků pokusů provedených studenty ve škole s výsledky pokusů provedených v našich podmínkách vybavené mikrobiologické laboratoře. K pozorování jsou vybrány neškodné a snadno dostupné mikroorganismy, např. Saccharomyces cerevisiae, případně mikroorganismy, které se běžně vyskytují v potravinách či v přírodě kolem nás. K mikroskopickému pozorování stačí mikroskop vybavený objektivem zvětšujícím 40x. K přípravě živných médií je možno použít tlakový hrnec, ev. média zakoupit již připravená na miskách.
1. Pozorování kvasinek pekařského droždí (Saccharomyces cerevisiae) Úvod: Kvasinky jsou jednobuněčné houby. Rozmnožují se zpravidla nepohlavně pučením. Za určitých podmínek, zmenší-li se například obsah živných látek v prostředí, se rozmnožují pohlavně. Vitální test je založen na poznání, že živé buňky mají cytoplazmatickou membránu polopropustnou (semipermeabilní), nepropouštějící barvivo vůbec nebo jen nepatrně. Odumřelé buňky mají membránu pro barvivo zcela propustnou (permeabilní). Používají se netoxická barviva, např. metylenová modř.
Úkol: 1. Zhotovte nativní preparát kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Zakreslete pučící buňky. 2. Proveďte vitální test a popište pozorovaný jev. 3. Proveďte test na přítomnost bílkovin a glykogenu v buňkách kvasinek.
Pomůcky: pekařské droždí (kvasnice), kostka nebo lžička cukru, 0,01% vodný roztok metylenové modři, Lugolův roztok, vodovodní voda, baňka či libovolná nádobka, pomůcky k mikroskopování – mikroskop, podložní a krycí sklíčka, ev. imerzní olej
Postup: 1. Do baňky nalijeme asi 100 ml vlažné vody a rozmícháme v ní cukr a 2 g droždí. Suspenzi necháme několik minut stát. Naneseme kapku na podložní sklíčko a přiložíme krycí sklíčko. Pozorujeme objektivy zvětšujícími 20x a 40x a případně následně imerzním objektivem (pokud je k dispozici).
2. Kapku suspenze smícháme s kapkou methylenové modři na podložním skle. Přiložíme krycí sklíčko a pozorujeme. 3. Zhotovíme preparát jako v úloze 1. Ze strany krycího sklíčka přikápneme Lugolův roztok a prosajeme filtračním papírem.
Pozorování: 1. Pozorujeme oválné buňky, které se liší svou velikostí. U některých buněk můžeme pozorovat různá stadia pučení.
2. Mrtvé buňky se barví intenzivně modře, živé jsou nezbarvené.
3. Mladé buňky obsahují hodně bílkovin, a proto se barví žlutě. Ve starších buňkách se hromadí glykogen a barví se hnědě.
2. Pozorování vláknitých hub Úvod: Štětičkovec (Penicillium) a kropidlák (Aspergillus) patří mezi houby vřeckovýtrusné, rozkládající organické zbytky. Rozmnožují se nepohlavně konidiemi, které jsou roznášeny vzdušným prouděním, což umožňuje jejich všeobecné rozšíření. Povlaky těchto hub nacházíme na nejrůznějších potravinách, uskladněném ovoci, zelenině.
Úkol: Pozorujte vláknité houby, jež rostou na plesnivějícím chlebě a citrónu. Pomůcky: "plesnivějící" potraviny - chleba, citrón (popř. zavařenina), voda (popř. laktofenol), potřeby k mikroskopování
Postup: Pomocí preparačních jehel přeneseme část podhoubí do kapky vody (nebo laktofenolu) na podložním skle a zhotovíme preparát (opatrně překryjeme krycím sklem). Pozorujeme objektivy zvětšujícími 20x, 40x a ev. 100x.
Pozorování: Nárůst plísní (mikroskopických vláknitých hub) bývá různě zbarven – žlutě, hnědozeleně, černě, modrozeleně. Mnohobuněčná vlákna se větví v pravidelných intervalech. Jsou rozdělena přepážkami a jsou mnohojaderná. Konidie se nacházejí v charakteristickém uspořádání na konidioforech. U rodu Aspergillus jsou konidie v jednočlenných až tříčlenných řetízcích na krátkých článcích, obklopujících paličkovitě se rozšiřující nosič (konidiofor).
U rodu Penicillium se nosič štětičkovitě větví. Na koncových článcích jsou řetízky konidií.
3. Mikroorganismy v jogurtu Úvod: Mléčné bakterie jsou v přírodě velmi rozšířené. Vyskytují se v mléce, kde vyvolávají přirozené kysání, dále v půdě, na travinách, ve vodě, v ústech i zažívacím traktu teplokrevných živočichů. Protože mléčná kyselina zastavuje rozmnožování hnilobných bakterií a stafylokoků, využívá lidstvo činnosti mléčných bakterií odedávna pro konzervaci zeleniny, zelí, kvašených okurek, v Orientě též ovoce. V mlékárenském průmyslu se používají při přípravě sýrů. Některé druhy se používají pro přípravu acidofilního mléka a jogurtů. Mezi nejčastější organismy jogurtových kultur patří druhy Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus a Bifidobacterium bifidum.
Úkol: Pozorujte mikrooganismy přítomné v jogurtu. Pomůcky: bílý jogurt s živými jogurtovými kulturami, voda, roztok metylenové modři, směs alkoholu a etheru (1:1), potřeby k mikroskopování
Postup: Trochu jogurtu zředíme vodou. Suspenzi rozetřeme na podložním sklíčku. Necháme zaschnout a pak preparát fixujeme v plameni (třikrát protáhneme nesvítivou částí plamene, nátěrem nahoru). Na 1 minutu převrstvíme preparát směsí etanol-éter. Omyjeme vodou a poté převrstvíme na 10 minut metylenovou modří. Preparát opláchneme, osušíme a pozorujeme pod imerzí, objektivem zvětšujícím 100x.
Pozorování: Mezi zbytky jogurtu vidíme modře zbarvené řetízky mléčných bakterií. V tomto případě se jedná o zástupce rodu Streptococcus.
4. Mléčné kvašení Úvod: Mléčné kvašení je známé od doby, kdy člověk začal chovat skot a konzumovat mléko. Teprve L. Pasteur vysvětlil, proč k mléčnému kvašení dochází, ačkoli čistou kulturu mikroba způsobujícího zkvašení (zkysání) mléka získal až o dvacet let později význačný propagátor antiseptických metod v chirurgii J. Lister. K pozorování bakterií mléčného kvašení použijeme zkyslé mléko. Syrové nebo pasterizované mléko zkysne při pokojové teplotě asi za 24 hodin.
Úkol: Zhotovte fixovaný preparát ze zkyslého mléka a pozorujte přítomné organismy.
Pomůcky: zkyslé mléko, směs alkohol-éteru (1:1), metylenová modř nebo karbolfuchsin, kahan, potřeby k mikroskopování
Postup: Ze zkyslého mléka odebereme syrovátku, která vystupuje nad okraj sedliny. Syrovátku rozetřeme kličkou po ploše podložního skla. Po zaschnutí fixujeme v plameni (třikrát protáhneme nesvítivou částí plamene). Přelijeme směsí alkohol-éter a necháme ji působit 1 minutu. Tím se odstraní tuk, který by ztěžoval barvení preparátu. Opláchneme vodou. Pak 10 minut barvíme metylenovou modří nebo karbolfuchsinem. Barvivo opláchneme, preparát osušíme a pozorujeme pod imerzí.
Pozorování: Určitě bude přítomen Streptococcus lactis, vlastní původce mléčného kvašení, tvořící krátké řetízky, dvojice, popř. izolované oválné buňky. Přítomnost dalších bakterií je pravděpodobná, ale k jejich identifikaci jen mikroskopická prohlídka nestačí.
5. Mikroorganismy na prstech ruky Úvod: Na prstech ruky je přítomna řada mikroorganismů. Při poranění používáme různé dezinfekční prostředky ke zničení těchto mikroorganismů, aby se nedostaly do rány a dále do vnitřního prostředí těla.
Úkol: Zjistěte, jak jsou účinné běžné dezinfekční prostředky, které používáme při ošetřování poraněných míst.
Pomůcky: 2 Petriho misky s živnou půdou pro bakterie, Septonex (případně další dezinfekční prostředky), popisovač na sklo
Postup: Prsty jedné ruky přiložíme na živnou půdu pro bakterie v Petriho misce (otvíráme ji na co nejkratší dobu a co nejméně). Prsty si postříkáme dezinfekčním prostředkem (např. Septonexem). Necháme několik sekund působit a opět prsty přiložíme na živnou půdu, ale do nové misky. Misky popíšeme a necháme kultivovat 3 - 7 dní. Pokud máme k dispozici termostat, kultivujeme při teplotě 30°C. Jinak při pokojové teplotě. Misky si prohlédneme a zhodnotíme. Pokus můžeme modifikovat srovnáním otisků prstů před mytím rukou a po něm, ev. použít umytí pouze vodou a umytí mýdlem.
Pozorování: Na misce, kde byly otisknuty prsty neošetřené Septonexem vidíme souvislý nárůst mikroorganismů. Účinkem Septonexu došlo k usmrcení mikroorganismů na povrchu prstů, a tak na druhé misce žádný nárůst nepozorujeme.
Poznámka: Tento pokus jsme opět rozšířili. Na obrázku vidíte pro srovnání otisky po ošetření Septonexem a po ošetření Softaseptem. Dále jsme použili čisté kultury Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus a zkoušeli jsme jejich citlivost na různé dezinfekční prostředky.
Vždy na dvě misky jsme na jednu polovinu misky kápli kapku ajatinu, na druhou polovinu kapku inciduru (místa vyznačená fixem a označená A, I) a nechali kultivovat v termostatu při dané teplotě.
Septonex a Softasept jsou detergentní, kationaktivní sloučeniny. Jsou užívány jako antiseptika (jemný netoxický dezinfekční prostředek užívaný na pokožku, sliznice a rány) v nejrůznějších lékových formách. V nižších koncentracích nepůsobí spolehlivě na některé bakterie, nejsou účinné na spory, mykobakterie a viry. Vodný roztok ajatinu se pro malou účinnost na G- bakterie přestal užívat. Ajatin ve formě 3% tinktury se užívá na ošetření oděrek a poranění. Incidur se používá na plošnou dezinfekci podlah.
6. Důkaz aktivity celulolytických bakterií Úvod: Podstatnou součástí buněčných stěn rostlinných buněk
je celulóza. V rostlinném materiálu je zpravidla doprovázena dalšími hůře využitelnými průvodními látkami hemicelulózami, ligninem, pektinovými a tukovými látkami. Na jejich rozkladu se podílí celá řada mikroorganismů schopných hydrolyticky štěpit celulózu na celobiózu a dále na glukózové jednotky. Kromě hub se na těchto procesech podílí aerobní celulolytické bakterie. Jejich zastoupení v půdě je jedním z ukazatelů úrodnosti. V intenzivně obdělávaných půdách se vyskytují zástupci rodů Cytophaga, Cellvibrio, Cellfalcicula, Sporocytophaga a další. Ve slabě obdělávaných a zvláště kyselých půdách převládají mikroskopické houby.
Úkol: Dokažte přítomnost celulolytických bakterií Pomůcky: Vzorky zeminy z různých stanovišť, Petriho misky (nebo jiné misky), filtrační papír, buničina, noviny, voda
Postup: Jednotlivé vzorky půd zbavíme kamínků a naplníme jimi Petriho misky do poloviny. Pokud není vzorek půdy dostatečně vhlký, ovhlčíme ho vodou. Do každé Petriho misky položíme 3 proužky papíru a to proužek z potištěného papíru (např. novinový), z filtračního papíru a z buničiny. Petriho misky kultivujeme při pokojové teplotě asi 4 týdny. Hodnotíme vždy po týdnu.
Pozorování: Během doby kultivace pozorujeme změny na vzorcích papíru. Přítomnost celulolytických bakterií se projevuje zbarvením filtračního papíru (kruhové skvrny, žluté, oranžové, žluto-zelené, hnědé) a jeho postupným rozkladem na napadených místech. Zahradní půda:
Srovnáme jak se lišil rozklad na jednotlivých typech půd a na jednotlivých vzorcích papíru.
Výsledek: Nejrychleji se bude rozkládat buničitá vata, potom filtrační papír a nakonec novinový papír (který obsahuje tiskařskou čerň, ta inhibuje aktivitu rozkladačů). Celulolytická aktivita bakterií v jednotlivých vzorcích se liší a závisí na konkrétním vzorku půdy.
Příloha Živné médium pro bakterie – masopeptonový agar (MPA) = nutrient agar Složení: Masový výtažek (10,0 g), pepton (10,0 g), NaCl (5,0 g), destilovaná voda (1 000,0 ml), agar (15 g). Postup přípravy: 1. Jednotlivé složky nebo základ pro NUTRIENT AGAR (Hi-Media, Oxoid) rozpustíme v destilované vodě, upravíme pH (6,8 – 7,2) 1M NaOH a 1M HCl, pokud připravujeme z jednotlivých složek, přidáme agar. 2. Sterilizujeme v talkovém hrnci 30 minut. 3. Rozlijeme do sterilních Petriho misek (skleněných sterilizovaných teplem nebo plastových, které jsou dodávány sterilní). Misky plníme do výšky 3 – 4 mm. Otvíráme jen po nezbytně nutnou dobu. 4. Necháme tuhnout ve vodorovné poloze. 5. Převrácené (dnem nahoru) uchováváme v chladničce.
