RESPON SELULER DAN EKSPRESI CYTOKINES YANG BERPERAN DALAM KESEMBUHAN DARI INFEKSI VIRUS PENYAKIT JEMBRANA PADA SAPI BALI 1

Buletin Veteriner, BBVet Denpasar, Vol. XXIII, No.79, Desember 2011

ISSN: 0854-901X

RESPON SELULER DAN EKSPRESI CYTOKINES YANG BERPERAN DALAM KESEMBUHAN DARI INFEKSI VIRUS PENYAKIT JEMBRANA PADA SAPI BALI 1 (The cellular responses and expression of cytokines that responsible for the recovery process in Jembrana disease virus-infected Bali cattle) I Wayan Masa Tenaya Balai Besar Veteriner Denpasar ABSTRAK Untuk mengetahui respon seluler dan ekspresi cytokines dalam proses penyembuhan dari infeksi virus penyakit Jembrana (JDV) pada sapi Bali, dilakukan studi menggunakan analisa flowcytometri dan real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Dengan analisa + + flowcytometri diketahui bahwa semua komponen limposit CD4 T-cells, CD8 T-cells dan + + CD21 B-cells menurun selama phase demam dan CD4 T-cells mengalami penurunan yang + paling signifikan (p<0.001). Pada awal kesembuhan, diakhir phase demam, total CD4 T-cells + + masih tetap di bawah nilai normal, namun total CD8 T-cells dan CD21 B-cells meningkat sangat tajam (p<0.001). Analisa RT-PCR membuktikan bahwa terjadi ekspresi proinflammatory cytokines IL-2, INF-gamma, dan TNF-alfa pasca infeksi JDV. Selama phase demam terjadi peningkatan ekpresi mRNA TNF-alfa tetapi setelah demam (awal kesembuhan) terjadi peningkatan sangat signifikan cytokines IL-2 (p<0.05) dan INF-gamma (p< 0.001) disertai penurunan RNA JDV secara sangat signifikan (p<0.001) sampai dengan tingkat tidak terdeteksi pada phase ini, yang menandakan cytokines tersebut mempunyai + peranan penting dalam proses penyembuhan. Peningkatan yang signifikan CD8 T-cells selama phase kesembuhan berkaitan langsung dengan ekspresi gen IL-2 dan INF-gamma yang juga meningkat selama phase ini. Hal ini mengindikasikan bahwa ke dua cytokines + tersebut di produksi oleh CD8 T-cells dan memperkuat hipotesa bahwa cell-mediated immune response berperan dalam proses kesembuhan akibat infeksi JDV. Kata kunci: Cytokines, Jembrana disease virus, real time-PCR.

ABSTRACT Flow cytometric analyses and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) were applied to investigate the cellular responses and the expression of cytokines that were responsible for the recovery process after the infection of Jembrana disease virus (JDV) in Bali cattle respectively. The flow cytometric analyses showed that although all of the lymphocytes + + + components CD4 T-cells, CD8 T-cells and CD21 B-cells dropped drastically during the acute + phase of the disease, CD4 T-cells were the most significally reduce (p<0.001). At the end of + the febrile phase, the absolute number of CD4 T-cells remained under the normal values but + + those CD8 T-cells and CD21 B-cells increased significantly (p<0.001). RT-PCR analyses indicated that the pro-inflammatory cytokines IL-2, INF-gamma, dan TNF-alfa were expressed after JDV infection. During the acute stages of the disease progression, only mRNA TNF-alfa was significantlly expressed but during the early recovery phases, both IL-2 and INF-gamma were expressed significantly (p<0.05) and (p< 0.001) respectively. This 1

Hasil penelitian merupakan bagian dari thesis S3, Universitas Murdoch 2010

77


ISSN: 0854-901X

condition coincided with a significant reduction of RNA JDV (p<0.001) until to undetectable values after the end of the acute stage, suggesting that the cytokines involved in the recovery + process. The significant increased of total number of the CD8 T-cells at the end of the acute stages correlated well with the up regulation of the two genes, IL-2 and INF-gamma, which + suggested that the two cytokines were produced by the CD8 T-cells, and it strengthen the hypothesis that cell-mediated immune response may play important rules during the recovery process after infection with JDV. Key words: Cytokines, Jembrana disease virus, real time-PCR.

immune responses. Sel sel CD4+ T adalah sumber utama cytokines, yang terbagi menjadi tipe Th1 (menghasilkan IL-2, IFN-γ and TNF-α) dan tipe Th2 (menghasilkan IL-4, Il-5, IL-6 dan IL-10) (Mosmann and Sad, 1996; Mosmann dkk., 1986).

PENDAHULUAN Patogenesis infeksi JDV pada sapi Bali belum di ketahui secara pasti. Proses penyakit ini tidak seperti virus lenti lainnya, yaitu menyebabkan infeksi akut setelah masa inkubasi singkat, 5-7 hari dengan kesembuhan cukup tinggi (~80%) dan tidak ada dilaporkan munculnya kembali penyakit ini (relapse) dari hewan yang pernah terserang JDV. Ada keterlambatan pembentukan antibodi pada saat kondisi kritis sampai beberapa bulan setelah infeksi (Dharma dkk., 1994; Hartaningsih dkk., 1994) yang mungkin terkait dengan replikasi JDV di dalam sel sel B (Moira Desport, dkk 2009). Keterlambatan terbentuknnya antibodi pada infeksi JDV namun sebagian besar hewan menjadi sembuh, menandakan keterlibatan T-cell-mediated immunity, yang di perkuat oleh peningkatan signifikan sel sel CD8+ T, yang diduga berperan besar dalam proses kesembuhan akibat infeksi JDV.

Banyak hasil penelitian menunjukkan bahwa efek antiviral sel sel CD8+ T menyebabkan sel sel yang terinfeksi virus menjadi lisis (Binder and Kundig, 1991; Kagi dkk., 1994). Tetapi, seperti juga sel sel CD4+ T, sel sel CD8+ T juga menghasilkan banyak cytokines seperti IFN-γ, TNF-α, IL2, GM-CSF, RANTES, MIP-1α dan MIP-1β selama infeksi virus (Kristensen dkk., 2004; Paliard dkk., 1988). Tiga dari cytokines tersebut yaitu IFN-γ, TNF-α dan IL-2, di teliti secara luas terkait aspek infeksi. IFN-γ juga di produksi oleh natural killer cell (NK) dan natural killer T-cells sebagai respon immune awal seperti menghambat replikasi virus, mengontrol tumor, mengaktifkan macrophage dan meningkatkan aktivitas histocompatibility complex (MHC) class I dan II (Boehm et al., 1997; Rosenzweig and

Cytokines memegang peranan penting dalam mengatur respon adaptasi kekebalan dan sel sel T merupakan sumber cytokines yang bersifat primer ataupun memory

78


ISSN: 0854-901X

pada infeksi HIV, penurunan jumlah sel sel CD4+ T menyebabkan disfungsi sel sel CD8+ T, natural killer cells dan sel sel B yang menyebabkan tingginya titer virus pada phase infeksi kronis (AIDS) (Flint dkk., 2004b). Pada infeksi virus lainnya, sel sel CD8+ T berperan penting pada awal infeksi (Jin dkk., 1999; Matano dkk., 1998; Pantaleo dkk., 1997a) dan juga pada stadium kronis yang menandakan sel sel tersebut menghasilkan zat zat antivirus (Copeland dkk., 1995; Migueles dkk., 2002).

Holland, 2005). TNF-α terutama di produksi oleh macrophages, mast cells dan sel sel T, dengan fungsi utamanya mengatur sel sel imunitas, merangsang apoptosis kematian sel, aktivasi macrophages dan cytotoxic cells, menyebabkan reaksi radang, perkembangan tumor dan merangsang replikasi virus (Corral dkk., 1999; Locksley dkk., 2001). Sedangkan IL-2 di buat oleh sel sel T dengan peran utama membantu perkembangan sel sel T cytotoxic CD8+, CD4+ T sel sel B, meningkatkan daya bunuh macrophages dan mengatur perbanyakan sel sel T (Karasuyama dkk., 1989; Roitt dkk., 2001b).

Dalam studi ini dipaparkan hasil investigasi ekpresi cytokines IL-2, IFN-α dan TNF-α di dalam sel sel limposit setelah infeksi JDV untuk mengetahui hubungan antara + hyperplasia sel sel CD3 T di dalam jaringan lymphoid dengan peningkatan populasi sel sel CD8+ T di dalam darah selama phase kesembuhan sebagaimana ditunjukan oleh analisa flow cytometri.

Di dalam melawan infeksi virus yang berbeda, setiap subkelompok sel sel T juga berperan berbeda beda. Pada infeksi lymphocytic choriomeningitis virus, sel sel CD4+ T tidak diperlukan dalam proses penyembuhan (Marker dkk., 1995). Sebaliknya

MATERI DAN METODE

cytometri dan real time PCR (RTPCR).

1.Hewan percobaan dan pengambilan sample sel sel limposit.

2. Analisa Flow cytometri

Lima ekor sapi Bali awalnya di inokulasi dengan JDV strain JDVTab/87 sesuai standard. Dari ke lima sapi tersebut sampel darah (limposit) diambil setiap hari selama 19 hari sejak infeksi JDV, menggunakan tabung berisi EDTA (Greiner Bio-One). Di dalam studi ini digunakan dua analisa: flow

Analisa ini dilakukan untuk mengetahui peningkatan atau penurunan sub-populasi limposit di dalam darah. Pertama, dari ke lima hewan percobaan, sel sel limposit di isolasi menggunakan FicollPaque plus (Amersham Biosciences) sesuai protokol dari perusahan, lalu dicuci 2 kali

79


ISSN: 0854-901X

3. a. Primers

dengan FACS buffer (Dulbecco’s phosphate-buffered saline [Thermo Scientific] mengandung 5% heat inactivated foetal calf serum (FCS; Bovogen Biologicals) dan 0.05% sodium azide [Sigma-Aldrich]). Sel sel limposit kemudian dilarutkan ke dalam FACS buffer dengan konsentrasi 1 x 107 cells/ml, dan direaksikan dengan salah satu dari antibodi: 2.5 µg/ml mouse antibovine CD4 MAb (Serotec), 5 µg/ml mouse anti-bovine CD8 MAb (Serotec) atau 20 µg/ml mouse anti-bovine CD21 MAb (Santa Cruz), a B-cell marker dengan konjugate An Alexa Fluor (AF488) kemudian di deteksi dengan goat anti-mouse cross absorbed secondary antibody (Invitrogen). Pewarnaan dilakukan dengan teknik single-colour analysis seperti protokol yang dipublikasi (Foster dkk., 2007; Rocchi dkk., 2007). Semua sampel di analisa dengan alat BD CellQuest Pro V5.2 (BD Biosciences) dengan perangkat lunak FACSCalibur. Pengolahan data dilakukan dengan FlowJo V7.2.5 (Tree Star Inc., USA) flow cytometry analysis software.

Informasi dan pemilihan oligonucleotide primers untuk gen cytokine IL-1, IL-2, Il-6, TNF-alfa dan IFN-gamma, dan glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) sebagai kontrol internal di dapat dari publikasi sebelumnya (Konnai dkk., 2003; Leutenegger dkk., 2000). Semua sequences oligonucleotide primer (Table 1) di confirmasi memakai program BLASTIN (Zhang and Madden, 1997). Oligonucleotide primers untuk kuantitatif JDV RNA juga di dapat dari publikasi sebelumnya (Stewart dkk., 2005). 3. b. Ekstraksi RNA Total RNA (tRNA) di ekstraksi dari limposit menggunakan kit RNeasy Plus with genomic DNA (gDNA) eliminator columns (Qiagen), sesuai protokol pabrik. Untuk menghilangkan secara total sisa genomic DNA (gDNA), total RNA (tRNA) yang di ektraksi direaksikan dengan 1 Unit DNAase (Promega) per 1 ug tRNA pada suhu 37oC selama 30 min dilanjutkan dengan inaktivasi enzyme dengan DNAase Stop solution pada suhu 65oC selama 10 min. Konsentrasi tRNA yang sudah direaksikan dengan enzyme tersebut kemudian di ukur dengan spectrometer (Nano-drop 1000), lalu di simpan pada suhu 80oC. Prosedur normalilasi digunakan untuk mengkoreksi kesalahan percobaan dan ektraksi RNA, sebagai dilaporkan (Bustin, 2000, 2002; Bustin and Nolan,

3. Analisa real time PCR Analisa ini bertujuan untuk mengetahui terjadinya ekspresi cytokines selama infeksi JDV. Sebagian sample limposit dari ke lima hewan percobaan pada analisa flow ctyometri atas, juga digunakan dalam analisa ini. Sampel limposit disimpan pada suhu -80oC sampai isolasi RNA.

80


2004). Untuk setiap reaksi amplifikasi RT-PCR, sejumlah 40 ng /rekasi sample tRNA digunakan sebagai template.

ISSN: 0854-901X

protokol pabrik. Sample plasma terlebih dulu di sentrifuge (8,000 x g selama 5 min), lalu RNA JDV di isolasi dimana 140 ul plasma dilarutkan dalam 50 ul elution buffer (AVE buffer; QIAGEN), dan di simpan pada suhu -80oC sampai diuji.

Untuk mengetahui titer RNA dari JDV selama infeksi, RNA dari JDV tersebut di isolasi dari sample plasma menggunakan kit QIAamp Viral Mini Kit (Qiagen) sesuai

Tabel 1. Daftar sequence of oligonucleotide primers untuk real-time RT-PCR. Gene IL-2b TNF-αc INF-γ c GAPDH c JDV pold a

Primer sequences (5’-3’) (forward & reverse) TTTT TAC GTC CCC AAG GTT AA CGT TTA CTG TTG CATCATCA TCTTCTAAGCCTCAAGTAACAAGT CCATGAGGGCATTGGCATAC TGGATATCATCAAGCAAGACATGTT ACGTCATTCATCATCACTTTCATGAGTTC GGCGTGAACCACGAGAAGTATAA CCCTCCACGATGCCAAAGT GGGAGACCCCGTCAGATGTGGA TGGGAAGCATGGACAATCAG b

c

Length Primer(bp)a Product (bp) 20 20 N/A

217

N/A

151

N/A

120

N/A

121

bp: base pairs Konnai dkk. (2003). Leutenegger dkk. (2000).

3. c. Pembuatan cDNA dari RNA

d

103

Stewart dkk. (2005).

2.5 % selama 2 jam pada 65 V. Pita DNA bands di visualisasi dengan pewarnaan SYBR Green (Promega) dan di potong dari gel untuk ektraksi DNA memakai QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) sesuai protocol pabrik. DNA yang sudah di isolasi dan dimurnikan, lalu di clone ke dalam pCR 2.1 memakai TA Cloning System (Invitrogen) sesuai protokol pabrik. Setelah ditransformasikan ke dalam E. coli, koloni warna putih di seleksi dan di tumbuhkan dengan media YT pH 7.2 berisi 10 g bacto-yeast extract, 5 g NaCl

Sebanyak 1 ug sample tRNA di proses untuk membuat cDNA memakai SuperScript III RT (Invitrogen) sesuai protokol pabrik. Sintesis cDNA dibuat menggunakan pasangan primer (Table1), dan hasil PCR nya di sequencing untuk verifikasi spesifisitasnya memakai prosedur sequencing standard (Applied Biosystems 3730 DNA sequencer). 3.d. Cloning cDNA Sampel DNA pasca sequencing di electrophoresis pada gel agorose

81


dalam 1 l DH2O. Plasmid DNA kemudiam dimurnikan dari sel sel bakteri memakai kit QIAamp DNA Mini (Qiagen) sesuai protokol pabrik. Plasmids kemudian di screening untuk memilih target inserts yang tepat memakai Eco RI digestion (Promega), sesui protokol pabrik. Untuk analisa sequence lebih lanjut dan persiapan curve standard yang diperlukan dalam RT-PCR quantitatif, DNA plasmid di amplifikasi dengan PCR. Singkatnya, 2 ul DNA plasmid di campur dengan 2.5 ul 10X buffer, 1.25 ul of 25 mM MgCl2, 0.2 ul of 2.5 mM DNTPs, 1 ul of 20 pM forward and reverse primers, 0.125 ul Taq polymerase (5.5 unit/ul) yang dibuat menjadi total 25 ul dengan penambahan air untuk PCR. Reaksi PCR dijalankan dengan kondisi: 3 menit denaturasi pada 94oC, 35 cycles , 94oC o selama 30 detik, 52 C selama 1 menit, 72oC selama 1 menit, 72oC selama 10 menit, dan lalu 14oC. Setelah visualisasi DNA pada gel agarose, pita DNA di potong dan diektraksi dari gel dan konsentrasinya di ukur dengan spectrophotometer pada 260 nm, dan konsentrasinya di ukur

ISSN: 0854-901X

menjadi 1 ug DNA/ml dan kembali di sequence untuk konfirmasi. 3. e. Persiapan curve standard dan analisa kuantitatif. Untuk mengetahui kuantitas ekpresi cytokine mRNA, diperlukan curve kalibrasi dengan mengukur fluorescence dari dilusi bertingkat (10-fold dilutions) dari 10-2 (0.01 ng/ml) sampai 10-6 cDNA yang konsentasinya sudah ditentukan sebelumnya (1 ug DNA/ml) dan konsentrasi dari sampel yang diuji dibagi nilai curve standard. Berat massa dari setiap plasmid (Tabel 2) dirubah dalam bentuk mole dikalikan dengan nilai Avogadro, untuk mengestimasi jumlah copy setiap cytokines dalam setiap reaksi. Jumlah copy setiap cytokine yang terdeteksi pada setiap reaksi secara otomatis ditentukan memakai perangkat lunak software package (SYBRgreen, Corbett Research). Pembuatan curve standard dan analisa regresi di buat memakai program Rotor-Gene (Corbett Research). Curve standard untuk kuantitasi JDV RNA di buat berdasarkan informasi dari publikasi sebelumnya (Stewart dkk., 2005).

82


ISSN: 0854-901X

Table 2. Massa plasmid yang digunakan untuk estimasi jumlah copy cytokine. Gene IL-2 INF-gamma TNF-α GAPDH

Ukuran Gene Ukuran vector Total size Jumlah copy (bp) (bp) (bp) RNA (x108/µl) 217 3015 3232 2.87 151 3015 3166 2.93 103 3015 3118 2.97 120 3015 3136 2.96

3.f. Analisa ekpresi cytokine dari sapi Bali menggunakan real-time PCR

HASIL Analisa flow cytometri. Ada perbedaan yang sangat nyata terhadap jumlah absolute sel sel limposit di dalam 3 katagori phase infeksi: normal (sebelum hewan di infeksi JDV), demam dan awal kesembuhan/ pasca demam. Selama demam total sel sel CD4+ T turun drastis secara signifikan (p<0.001) dan berlangsung sampai akhir phase demam (Tabel 3). Sebaliknya total sel sel CD8+ T sedikit turun selama phase demam tetapi meningkat tajam secara signifikan (p<0.001) setelah phase demam. Keadaan ini menyebabkan ratio sel sel CD4+:CD8+ T menurun secara signifikan (p<0.05). Jumlah sel sel B yang dilabel dengan CD21+ Bjuga sedikit turun selama phase demam dan meningkat lagi secara signifikan (p<0.001) Nilai dalam lajur dengan angka berbeda menunjukkan perbadaan yang signifikan dengan uji Tukey’s HSD (p<0.05). Pasca demam sebagai mana yang terjadi untuk sel sel CD8+ T. Perbandingan terhadap sub-set limposit selama tiga phase penyakit Jembrana di muat dalam gambar 1.

RT-PCR dikerjakan memakai alat Rotor-Gene 3000 (Corbett Research) sesuai protokol perusahan. Reaksi RT-PCR memakai pewarna SYBR Green di formulasi dengan mencampur 2 u RNA mengandung 40 ng of DNAase-treated RNA sebagai templet dengan 8 u reaction mix berisi 5 u of 2X SYBR Green RTPCR reaction mix (Bio-Rad), 1 u of 300 nM of each primer, 0.2 u iScript RT 1 step RT-PCR (BioRad) and 0.8 ul nuclease-free water (Bio-Rad). Reaksi PCR dilakukan duplo dan curve standard di buat triplikat. 4. Analisa Statistik Untuk mengkalkulasi perbedaan kelompok terhadap uji flowcytometri dan ekpresi cytokine, digunakan analisa one-way ANOVA (SPSS® 17.0) dan perbedaan di antara waktu pengambila sample sesuai periode perkembangn penyakit JDV, digunakan analisa Bonferroni’s multiple comparison. Nilai p < 0.05 di nilai sebagai perbedaan yang signifikat untuk semua analisa.

83


ISSN: 0854-901X

Table 3. Perbandingan sub-set limposit selama 3 periode penyakit Jembrana. Mean absolute number cells/ml ± SD Pre-infection +

Post-febrile

b

2418 ±277 1210±206 b 1799 ± 404 b

45 ±10 b 3187±601 a 4225 ± 841 a

176± 171 768±489b 2065±823b

5000

42.00

4000

41.00

o

3

T-helper cells, CD4 Cytotoxic T-cells,CD8+ B-cells, CD21+

Lymphocyte counts/cm

Febrile phase

a

Rectal temperature ( C)l

Lymphocyte population

3000 40.00 2000 39.00

1000 0

38.00 0

2

4

5

6

7

9

19

Days post-infection Mean CD4

Mean CD8

Mean CD21

Mean Temp.

Gambar 1. Perubahan sub-set limposit pada infeksi JDV. Ada peningkatan suhu tubuh meningkat (garis merah) hari 5-9 pasca infeksi (phase demam) dan jumlah sel sel CD4+ T turun tajam secar signifikan (p<0.001) sampai awal kesembuhan. Total sel sel CD8+ T (garis hujau) sedikit turun pada awal demam, lalu naik secar signifikan (p<0.001) selama dan pasca demam. Sel sel CD21+ B (garis hitam) sedikit meningkat sebelum demam, turun selama phase demam dan meningkat secara signifikan (p<0.001) setelah demam. Data ini rata rata (± SD) dari 5 ekor sapi.

84


Analisa RT-PCR.

Konfirmasi keberhasilan cloning dan sequencing

Persiapan sample RNA

Produk DNA yang di buat dengan pasangan primers cytokine (Table 1) dapat di clone dengan baik ke dalam vector pCR 2.1. A targetinserts dari proses cloning ini kemudian di amplifikasi untuk membuat DNA yang selanjutnya lagi di sequence untuk pembuatan kurve standard (Gambar 3). Analisisa sequence dari produk PCR membuktikan identitas asli dari beberapa cytokines gen sapi dengan tingkat homogenesitas 92% - 100% (Gambar tidak ditampilkan).

Genomik DNA (gDNA) adalah DNA dari sel normal yang sangat pengganggu dalam analisa cytokines yang diisolasi dari sel dan dianalisa secara kuantitatif, karena itu harus di eliminasi. Gambar 2 menunjukan bahwa dengan penambahan 40 ng DNAase per reaksi dapat mengeliminasi total gDNA dari sample tRNA.

0.8

0.8

A

B 0.6 N o r m . F lu o r o .

0.6 N o r m . F lu o r o .

ISSN: 0854-901X

0.4

0.2

0.4

0.2

0

0 5

10

15

20 Cycle

25

30

35

40

5

10

15

20 Cycle

25

30

35

40

Gambar 2 Analisa Real-time RT-PCR dari TNF- menunjukkan eliminasi total gDNA dari sample tRNA . A. Contoh standard curve untuk TNF- , menunjukan kurve yang bagus, linear. B. Sampel tRNA tanpa treatment DNAase (tanda panah kiri) dan tRNA yang di treatment DNAase (tanda panah kanan). Tidak ada PCR produk bila RT tidak ditambahkan dalam reaksi, menandakan gDNA dapat dihilangkan secara total. Kondisi reaksi dari gen yang lain adalah sama.

85


1

2

3

4

5

6

7

8

ISSN: 0854-901X

9

10

Gambar 3 Agarose gel electrophoresis produk PCR dari DNA yang di isolasi dari hasil cloning. No. 1 dan 10, 100 bp. DNA ladder (Promega); No. 2, IL-1 (173 bp), No. 3, IL-2 (217 bp), No. 4, IL-6 (236 bp), No. 5, IFN- (151 bp); No. 6, TNF(103 bp), No. 7, GAPDH (120 bp), No. 8, kontrol primer (IL-1 DNA) dan No. 9, kontrol air. Produk DNA sesuai dengan posisi DNA plasmid constructs.

Gejala klinis, RNA-JDV dan respon cytokine pada sapi terinfeksi JDV

IFN-gamma dengan koefisien korelasi hampir sempurna (0.998) ditunjukkan pada gambar 4, yang mengindikasikan tingkat spesifisitas yang hampir sempurna, dan hasil yang sama juga di dapat dari semua uji RT-PCR yang digunakan

RT-PCR digunakan untuk mengkuantifikasi RNA JDV di dalam plasma darah dan ekpresi IL-2, TNF-α dan INF-gamma dalam limposit. Salah satu contoh analisa melting curve dari RT-PCR untuk .

d F /d T

3

2

1

0 75

80

85 deg.

90

95

Gambar 4 Analisa melting curve (kiri) dan koefisien korelasi (kanan) hasil uji

86


RT-PCR untuk ekpresi IFN-gamma dari 1 ekor hewan, menunjukkan puncak tunggal untuk hasil yang sangat spesifik dengan nilai harapan regresi (R) dan gradien (M) yang hampir sempurna, mendekati nilai 1 untuk Regresi (R) dan nilai 4 untuk gradien (M). Hasil yang sama juga di dapat dari semua uji RT-PCR untuk semua cytokine yang di uji. Didapatkan bahwa ada kenaikan RNA-JDV RNA yang sangat signifikan di dalam plasma sesuai perkembangna phase demam dari 4-7 hari setelah infeksi (Gambar 5 A). Puncak tertinggi kadar RNAJDV terlihat 9 hari pasca infeksi, kemudian menurun sampai dengan tidak terdeksi pasca demam. Ekspresi RNA-IL-2 cukup rendah sebelum dan selama masa demam

ISSN: 0854-901X

tetapi sangat meningkat secara signifikan pasca demam (p<0.05) dan bertahan sampai hari ke 21 dimana percobaan sudah dihentikan (Gambar 5B). Ekspresi RNA-TNFexpression tidak meningkat secara signifikan (p=0.284) sebelum dan saat awal demam tetapi sedikit meningkat setelah demam (Gambar 5C). Ekspresi IFN- meningkat secara biphasic: meningkat selama awal demam, lalu menurun tetapi bertahan diatas keadaan normal selama demam, kemudian meningkat lagi secara signifikan (p <0.001) pada akhir demam dan bertahan tinggi sampai again at the end of the febrile phase and remained 16-17 hari pasca infeksi (Gambar 5D).

87

800 700 600 500 400 300 200 100 0

41 40 39 38

JDV RNA x106 /ml

42

(oC)

Mean rectal temperature


ISSN: 0854-901X

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Days post-infection JDV RNA

Mean IL-2 RNA /ml

14

800 700 600 500 400 300 200 100 0

12 10 8 6 4 2 0 1

2

3

4

5

6

7

8

Mean JDV RNA 106/ml

Temperature

B

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Days post-infection JDV RNA

400 300 200 100 0 1 2 3

4 5 6

6

800 700 600 500 400 300 200 100 0

500

/ml

Mean TNF-alpha RNA

600

Mean JDV RNA x10 /ml

IL-2-RNA

C

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Days post-infection JDV RNA

800 700 600 500 400 300 200 100 0

12000 10000 RNA/ml

Mean INF-gamma

14000

8000 6000 4000 2000 0

Mean JDV RNA x106/m/

TNF-alpha RNA

D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Days post-infection INF-gamma RNA

JDV RNA

Gambar 5. Ringkasan dari reaksi demam, titer virus dan ekpresi gen dari 5 ekor sapi yang di infeksi JDV strain JDVTab/87. A. Reaksi demam dan titer RNA-JDV, B. Ekpresi IL-2. C. Ekpresi TNF-α, D. Ekpresi IFN- . Hasil ditampilkan berdasarkan nilai rata-rata dari 5 ekor sapi dan error bars serta SD ditunjukkan.

88


PEMBAHASAN

ISSN: 0854-901X

INFsangat berhubungan dengan meningkatnya jumlah sel sel CD8+ T yang terdeksi dengan teknik flow cytometry, menandakan bahwa cytokines tersebut diproduksi oleh sel sel CD8+ T, dan di dalam situasi tidak adanya antibodi sampai beberapa minggu setelah infeksi JDV kejadian ini sangat penting dalam penyembuhan hewan yang menyelamatkan sebagian besar hewan terserang.

Teknologi real-time RT-PCR yang digunakan dalam penelitian ini sudah digunakan secara luas untuk mendeteksi cytokine secara in vivo pada sapi (Konnai dkk., 2003; Usui dkk., 2007; Waldvogel dkk., 2000). Tekni ini sangat sensitive dan sederhana di bandingkan teknik kuantitatif (Blaschke dkk., 2000; Giulietti dkk., 2001). Ada fakta bahwa INFgamma protein dalam plasma yang dideteksi dengan standard ELISA berkorelasi dengan ekpresi gen INF-gamma yang di uji dengan RTPCR (data tidak di publikasi), menandakan bahwa INF-gamma mRNA di trasilasi menjadi protein secara in vivo. Gen GAPDH dipilih sebagai kontrol standard sebagai housekeeping gene secara umum untuk memverifikasi kualitas RNA yang diektraksi dan sebagai pensetandadr uji, dan juga digunakan secara luas sebagai endogenous control gene dalam mengkuantifikasi ekpresi cytokine (Dheda dkk., 2004; Lang and Heeg, 1998).

Peranan jenis sel sel yang lain dalam memproduksi cytokines jenis yang sama adalah juga mungkin, tetapi sangat kecil dari sel sel Th1 CD4+ T, karena jumlah sel sel ini sangat menurun sampai sampai di awal kesembuhan. Tidak diketahui secara jelas mengapa sel sel CD4+ T sangat menurun dalam selama phase demam pada penyakit Jembrana, tetapi pada infeksi HIV, penurunan sel sel CD4+ T sangat dipengahuri oleh IL2 (Ganusov dkk., 2007; Stapleton dkk., 2009). Akan tetapi walapun ekpresi IL-2 sangat meningkat setelah phase demam pada penyakit Jembrana, jumlah sel sel CD4+ T-cell tetap rendah.

Pro-inflammatory cytokines seperti IL-2, INF- nd TNF- diinivestigasi dalam penelitian ini adalah untuk memverifikasi apabila perubahan ekpresinya berhubungan dengan perubahan patologis pada penyakit Jembrana. Pengujian terhadap gen yang lain terutama IL-1 and IL-6 akan sangat menambah informasi secara komprehensif, akan tetapi gen ini tidak di uji dalam penelitian ini karena keterbatasan waktu. Akan tetapi ekpresi yang sangat signifikan dari cytokines IL-2 dan

Cytokines IL-2 and INFsangat dikenal dalam pathogenesis penyakit virus lainnya. IFN-γ utamanya diproduksi oleh sel sel natural killer dan natural killer T sebagai reaksi awal, dan oleh sel sel CD4+ Th1 dan CD8+ cytotoxic ketika spesifik rekasi antigen sudah terbentuk (Schoenborn and Wilson, 2007). Cytokine INFmemegang perana penting dalam proses kekebalan tubuh dengan

89


ISSN: 0854-901X

type hypersensitivity, menimbulan gejala reaksi infeksi pada phase penyakit akut, merangsang kematian sel apoptosis dan menghambat replikasi virus. (Abbas dkk., 1996). Pada penyakit Jembrana kadar TNF-alfa sedikit meningkat selama phase demam dan kesembuhan, hal ini yang mungkin menimbulkan munculnya gejala klinis dan menurunkan titer virus pada akhir phase demam, walaupun bukti ini sangatlah minimal.

merangsang fungsi daya bunuh bakteri oleh macrophages dan menstimulir pembentukan/produksi IgG (Harrington dkk., 2006; Schoeborn and Wilson, 2007). Naiknya kadar IFN-γ selama phase demam penyakit Jembrana dan fungsinya sebagai anti-viral effector function of CD8+ T-cells, sangat berhubunagn dengan penurunan titer RNA JDV selama phase demam (akut). Cytokine IL-2 adalah suatu protein yang bersifat autocrine growth factor dan dihasilkan oleh semua sel sel T pada phase awal pendewasaan dan sangat penting di dalam proliferasi sel sel T, aktifasi macrophages dan cytotoxic CD8+ T-cells, meningkatkan daya bunuhnya (Karasuyama dkk., 1989; Roitt dkk., 2001b). Rendahnya kadar Th IL-2 selama phase demam penyakit Jembrana, dimana titer JDV sangat tinggi, berhubungan dengan jumlah sel sel CD4+ T dan CD8+ T di dalam darah selama periode ini. Sebaliknya naiknya jumlah IL-2 setelah periode demam sangat cocok dengan meningkatnya jumlah sel sel CD8+ T , hal mana mengindikasikan bahwa peranan IL-2 sangat besar dalam meningkatkan sel sel CD8+ T yang penting dalam penyembuhan hewan yang terinfeksi JDV.

KESIMPULAN Respon seluler dan ekpresi cytokines yang berperan dalam proses kesembuhan dari infeksi virus penyakit Jembrana telah dilakukan secara komprehensif. Diketahui bahwa, kuantifikasi ekspresi cytokine gen seperti TNFalfa, IL-2 dan utamanya IFNgamma sangat berhubungan dengan ekspansi sel sel CD8+ T selama phase demam dan awal kesembuhan. Hal ini menandakan bahwa ekspansi sel sel CD8+ T sangat berperan dalam proses pembersihan JDV dari dalam darah dan menyebabkan kesembuhan sebagian besar hewan yang pernah terinfeksi JDV. Studi lebih lanjut perlu dilakukan untuk mempelajari ekspresi gen cytokine lainnya yang mungkin berperan dalam penyembuhan penyakit Jembrana.

Peranan TNF-alfa pada penyakit Jembrana tidak jelas. TNFdi percaya berperan dalam cellmediated immunity atau delayed-

90


ISSN: 0854-901X

G. (1999). Differential cytokine modulation and T cell activation by two distinct classes of thalidomide analogues that are potent inhibitors of TNF-alpha. J Immunol 163, 380-386.

DAFTAR PUSTAKA Abbas, A. K., Murphy, K. M. and Sher, A. (1996). Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 383, 787-793.

Dharma, D. M., Ladds, P. W., Wilcox, G. E. and Campbell, R. S. (1994). Immunopathology of experimental Jembrana disease in Bali cattle. Vet Immunol Immunopathol 44, 31-44.

Binder, D. and Kundig, T. M. (1991). Antiviral protection by CD8+ versus CD4+ T cells. CD8+ T cells correlating with cytotoxic activity in vitro are more efficient in antivaccinia virus protection than CD4dependent IL. J Immunol 146, 4301-4307.

Dheda, K., Huggett, J. F., Bustin, S. A., Johnson, M. A., Rook, G. and Zumla, A. (2004). Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in realtime PCR. Biotechniques 37, 112-114, 116, 118-119.

Blaschke, V., Reich, K., Blaschke, S., Zipprich, S. and Neumann, C. (2000). Rapid quantitation of proinflammatory and chemoattractant cytokine expression in small tissue samples and monocytederived dendritic cells: validation of a new real-time RT-PCR technology. J Immunol Methods 246, 79-90.

Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R. and Skalka, A. M. (2004b). Human immunodeficiency virus pathogenesis. In nd Principles of Virology, 2 edn, pp. 623653. Washington, DC: ASM Press. Flint, S. J., Enquis, L. W., Krug, R. M., Rancaniello, V. R. and Skalka, A. M. (2000). Virus Offense Meets Host nd Defense. In Principles of Virology, 2 edn. pp. 478-515. Washington DC: ASM Press.

Boehm, U., Klamp, T., Groot, M. and Howard, J. C. (1997). Cellular responses to interferon-gamma. Annu Rev Immunol 15, 749-795. Bustin, S. A. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 25, 169193.

Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K. and Whitton, J. L. (2007). Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol Chapter 6, Unit 6 24.

Bustin, S. A. (2002). Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 29, 23-39. Bustin, S. A. and Nolan, T. (2004). Pitfalls of quantitative real-time reversetranscription polymerase chain reaction. J Biomol Tech 15, 155-166.

Ganusov, V. V., Milutinovic, D. and De Boer, R. J. (2007). IL-2 regulates expansion of CD4+ T cell populations by affecting cell death: insights from modeling CFSE data. J Immunol 179, 950-957.

Copeland, K. F., McKay, P. J. and Rosenthal, K. L. (1995). Suppression of activation of the human immunodeficiency virus long terminal repeat by CD8+ T cells is not lentivirus specific. AIDS Res Hum Retroviruses 11, 1321-1326.

Giulietti, A., Overbergh, L., Valckx, D., Decallonne, B., Bouillon, R. and Mathieu, C. (2001). An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression. Methods 25, 386-401.

Corral, L. G., Haslett, P. A., Muller, G. W., Chen, R., Wong, L. M., Ocampo, C. J., Patterson, R. T., Stirling, D. I. and Kaplan,

Harrington, L. E., Mangan, P. R. and Weaver, C. T. (2006). Expanding the effector CD4 T-cell repertoire: the Th17 lineage. Curr Opin Immunol 18, 349-356.

91


ISSN: 0854-901X

activated T cells regulate expression of adhesion molecules on endothelial cells in sites of infection. J Neuroimmunol 62, 3542.

Hartaningsih, N., Wilcox, G. E., Kertayadnya, G. and Astawa, M. (1994). Antibody response to Jembrana disease virus in Bali cattle. Vet Microbiol 39, 1523.

Matano, T., Shibata, R., Siemon, C., Connors, M., Lane, H. C. and Martin, M. A. (1998). Administration of an anti-CD8 monoclonal antibody interferes with the clearance of chimeric simian/human immunodeficiency virus during primary infections of rhesus macaques. J Virol 72, 164-169.

Jin, X., Bauer, D. E., Tuttleton, S. E., Lewin, S., Gettie, A., Blanchard, J., Irwin, C. E., Safrit, J. T., Mittler, J. and other authors (1999). Dramatic rise in plasma viremia after CD8(+) T cell depletion in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Exp Med 189, 991-998.

Migueles, S. A., Laborico, A. C., Shupert, W. L., Sabbaghian, M. S., Rabin, R., Hallahan, C. W., Van Baarle, D., Kostense, S., Miedema, F. and other authors (2002). HIV-specific CD8+ T cell proliferation is coupled to perforin expression and is maintained in nonprogressors. Nat Immunol 3, 10611068.

Kagi, D., Ledermann, B., Burki, K., Seiler, P., Odermatt, B., Olsen, K. J., Podack, E. R., Zinkernagel, R. M. and Hengartner, H. (1994). Cytotoxicity mediated by T cells and natural killer cells is greatly impaired in perforin-deficient mice. Nature 369, 3137. Karasuyama, H., Tohyama, N. and Tada, T. (1989). Autocrine growth and tumorigenicity of interleukin 2-dependent helper T cells transfected with IL-2 gene. J Exp Med 169, 13-25.

Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A. and Coffman, R. L. (1986). Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 136, 2348-2357.

Konnai, S., Usui, T., Ohashi, K. and Onuma, M. (2003). The rapid quantitative analysis of bovine cytokine genes by realtime RT-PCR. Vet Microbiol 94, 283-294.

Mossman, S. P., Bex, F., Berglund, P., Arthos, J., O'Neil, S. P., Riley, D., Maul, D. H., Bruck, C., Momin, P. and other authors (1996). Protection against lethal simian immunodeficiency virus SIVsmmPBj14 disease by a recombinant Semliki Forest virus gp160 vaccine and by a gp120 subunit vaccine. J Virol 70, 1953-1960.

Kristensen, N. N., Madsen, A. N., Thomsen, A. R. and Christensen, J. P. (2004). Cytokine production by virusspecific CD8(+) T cells varies with activation state and localization, but not with TCR avidity. J Gen Virol 85, 17031712. Lang, R. and Heeg, K. (1998). Semiquantitative determination of human cytokine mRna expression using TaqMan RT-PCR. Inflammopharmacology 6, 297309.

Paliard, X., de Waal Malefijt, R., Yssel, H., Blanchard, D., Chretien, I., Abrams, J., de Vries, J. and Spits, H. (1988). Simultaneous production of IL-2, IL-4, and IFN-gamma by activated human CD4+ and CD8+ T cell clones. J Immunol 141, 849-855.

Locksley, R. M., Killeen, N. and Lenardo, M. J. (2001). The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell 104, 487-501.

Pantaleo, G., Soudeyns, H., Demarest, J. F., Vaccarezza, M., Graziosi, C., Paolucci, S., Daucher, M., Cohen, O. J., Denis, F. and other authors (1997a). Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during

Marker, O., Scheynius, A., Christensen, J. P. and Thomsen, A. R. (1995). Virus-

92


primary HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 9848-9853.

ISSN: 0854-901X

Schoeborn, J. R. and Wilson, C. B. (2007). Regulation of Interferon-gamma During Innate and Adaptive Immune Responses. Advances in Immunology 96, 41-100.

Pantaleo, G., Demarest, J. F., Schacker, T., Vaccarezza, M., Cohen, O. J., Daucher, M., Graziosi, C., Schnittman, S. S., Quinn, T. C. and other authors (1997b). The qualitative nature of the primary immune response to HIV infection is a prognosticator of disease progression independent of the initial level of plasma viremia. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 254-258.

Stapleton, J. T., Chaloner, K., Zhang, J., Klinzman, D., Souza, I. E., Xiang, J., Landay, A., Fahey, J., Pollard, R. and other authors (2009). GBV-C viremia is associated with reduced CD4 expansion in HIV-infected people receiving HAART and interleukin-2 therapy. Aids 23, 605610.

Rocchi, M. S., Anderson, M. J., Eaton, S. L., Hamilton, S., Finlayson, J., Steele, P., Barclay, G. R. and Chianini, F. (2007). Three-colour flow cytometric detection of PrP in ovine leukocytes. Vet Immunol Immunopathol 116, 172-181.

Usui, T., Konnai, S., Ohashi, K. and Onuma, M. (2007). Interferon-gamma expression associated with suppression of bovine leukemia virus at the early phase of infection in sheep. Vet Immunol Immunopathol 115, 17-23.

Roitt, I., Brostoff, J. and Male, D. (2001b). Cell-Mediated Cytotocixicity. In Immunology, 6 edn, pp. 163-172. Mosby: Elsiver Limited.

Waldvogel, A. S., Hediger-Weithaler, B. M., Eicher, R., Zakher, A., Zarlenga, D. S., Gasbarre, L. C. and Heussler, V. T. (2000). Interferon-gamma and interleukin4 mRNA expression by peripheral blood mononuclear cells from pregnant and nonpregnant cattle seropositive for bovine viral diarrhea virus. Vet Immunol Immunopathol 77, 201-212.

Rosenzweig, S. D. and Holland, S. M. (2005). Defects in the interferon-gamma and interleukin-12 pathways. Immunol Rev 203, 38-47.

93

RESPON SELULER DAN EKSPRESI CYTOKINES YANG BERPERAN DALAM KESEMBUHAN DARI INFEKSI VIRUS PENYAKIT JEMBRANA PADA SAPI BALI 1

Recommend Documents