Regulace enzymových aktivit
Regulace enzymových aktivit: Změny množství enzymu v kompartmentu, buňce, orgánu: - změna exprese, degradace atd. - změna lokalizace „Skutečné“ regulace: - aktivace/inhibice nízkomolekulárními ligandy - aktivace/inhibice inter- a intramolekulárními interakcemi protein-protein, komplementace - limitovaná proteolysa - kovalentní modifikace - regulace fysikálními podmínkami
Aktivace/inhibice nízkomolekulárními ligandy: Běžné buněčné nízkomolekulární regulátory: cAMP, cGMP, diacylglycerol, IP3 Ca2+ prostaglandiny, NO, CO, H2S ethylen, ppGpp ATP, GTP, AMP, ADP metabolity
Aktivace/inhibice nízkomolekulárními ligandy: aktivace lidské cystathionin-β-synthasy S-adenosylmethioninem
CBS
Aktivace/inhibice nízkomolekulárními ligandy: aktivace lidské cystathionin-β-synthasy S-adenosylmethioninem
4L3V
Aktivace/inhibice nízkomolekulárními ligandy: aktivace lidské cystathionin-β-synthasy S-adenosylmethioninem
SAM
4L3V
PLP hem
Aktivace/inhibice nízkomolekulárními ligandy: Studium interakcí protein-ligand: - přímé měření, radiometrické stanovení, afinitní chromatografie - NMR - rovnovážná dialysa
- diferenční spektrofotometrie/spektrofluorimetrie
Aktivace/inhibice nízkomolekulárními ligandy: Studium interakcí protein-ligand: - isotermální titrační kalorimetrie
vzorek - FRET
- jiné metody založené na fluorescenci - biologická odezva, reportérové systémy - měření inhibiční konstanty - protein-ligand docking
ref.
Aktivace/inhibice inter- a intramolekulárními interakcemi protein-protein, komplementace Cyklin-dependentní kinasy
cyklin A
cyklin A
P
CDK2
CDK2
CDK2
1JSU
p27 INK4
cyklin A
Aktivace/inhibice inter- a intramolekulárními interakcemi protein-protein, komplementace Adaptérové domény SH3
SH2
Src-kinasa SH2
SH2
PTPLC (proteinfosfatasa) PLCγ1
PH
EF-hand
(fosfolipasa) Ras-aktivátor (aktivuje GTPasu)
PH
SH2 SH3
SH2 SH3
SH2
SH2
SH2 SH3
SH2 SH3 Crb2
C2
PH
Vav – guanine nucleotide exchange protein C-Crk
PH
SH3
SH2
SH2
SH2
SH2
Aktivace/inhibice inter- a intramolekulárními interakcemi protein-protein, komplementace Adaptérové domény - http://pawsonlab.mshri.on.ca
Aktivace/inhibice inter- a intramolekulárními interakcemi protein-protein, komplementace Adaptérové domény - SH2 doména (Src-homology type 2) proteinkinasy, proteinfosfatasy, fosfolipasy, regulační proteiny atd. -pY–x–x–Φ- SH3 doména (Src-homology type 3) proteinkinasy, proteinfosfatasy, fosfolipasy, regulační proteiny, myosin, spektrin atd. -R/K–x–x–P–x–x–P-x–P–x–x–P–x–R/K- PH doména (Pleckstrin-homology) fosfolipasy, proteinkinast atd. Inositolfosfáty (PIP2, PIP3) - EH2 doména (Eps15-homology type 2) clathrin adapter proteins -S/T–N–P–F–Φ- PDZ doména (nesmyslná zkratka) C-terminální peptidy
Aktivace/inhibice inter- a intramolekulárními interakcemi protein-protein, komplementace Studium interakcí protein-protein: - dvouhybridní systémy
- fágový display
- povrchová plasmonová resonance
- FRET - afinitní chromatografie, pull-down - mikroskopie atomárních sil
Limitovaná proteolysa Apoptosa – caspasy - cysteine-dependent aspartate-directed proteases
Apoptosom FAS receptor cyt. c
Caspase 9 Oxidační stres, radiace atd.
Caspase 3 Caspase 6
Caspase 7
Caspase 8
Limitovaná proteolysa Apoptosa – caspasy - cysteine-dependent aspartate-directed proteases Caspasa 7 – inaktivní 1K88
aktivní 1F1J
Kovalentní modifikace Fosforylace kinasa Protein + ATP
Protein-P + ADP fosfatasa
Protein-P + H2O
Protein + Pi
- ADP-ribosylace, adenylace, methylace, acylace …
Kovalentní modifikace Fosforylace Lidský genom – 518 genů proteinkinas (kinom) Serin/threoninkinasy Proteinkinasa A cAMP Proteinkinasa C DAG, Ca2+ Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) jiné kinasy Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases (CaM kinases) komplex Ca2+-calmodulin fosforylasakinasa PKA, fosfatasa proteinkinasa B (AKT) fosfolipidy, jiné PK, … Tyrosinkinasy Platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) PDGF Epidermal growth factor receptor (EGFR) EGF Insulinový receptor insulin Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) IGF1 Src, Abl, JAK, Lck, Lyn … různé způsoby regulace
Kovalentní modifikace Fosforylace – regulace metabolismu glykogenu
Kovalentní modifikace Fosforylace – metody studia - anti-p-Ser, anti-p-Thr, anti-p-Tyr, další protilátky - 32P - hmotnostní spektrometrie - metalo-afinitní chromatografie
Allosterický jev - homo- / heterotropní - positivní / negativní
Allosterický jev Hillův model
Aldairův model
Koshlandův-Némethyho-Filmerův model Monodův-Wymanův-Changeuxův model
[ A] S= [ A] K S
Vše v jednom – Abl-kinasa 2FO0
SH3 Aktivní místo
Aktivační smyčka
fosforylace
myristyl
SH2
Vše v jednom – Abl-kinasa
SH3
SH3
SH2
kinase domains
SH2 SH3
SH2 SH3 P
SH2
kinase domains
P
kinase domains
SH3 kinase P domains SH2
kinase domains
Vše v jednom – Abl-kinasa Chromosom 22
9
Philadelphia
BCR
SH3
SH2
SH3 kinase domains
BCR
P
SH2
kinase domains
P
