QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA kézikönyv 2 96 (katalógusszám: )

QuantiFERON®-TB Gold (QFT®) ELISA kézikönyv 2×96 (katalógusszám: 0594-0201) 20×96 (katalógusszám: 0594-0501)

ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) peptid antigénekre adott válaszok mérésére szolgáló teljes vér IFN-γ teszt

In vitro diagnosztikai célra

0594-0201, 0594-0501 Cellestis, QIAGEN Company Level 2, Office Tower 2, Chadstone Centre 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148, Ausztrália Tel.: (Ausztrália) +613-9840-9800 QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1 40724 Hilden, Németország 1075115HU 01 ver.

www.QuantiFERON.com

www.QuantiFERON.com

Tartalom 1.

Rendeltetés

4

2.

A teszt összefoglalása és kifejtése

4

A teszt alapelve

5

A teszt elvégzéséhez szükséges idő

5

Összetevők és kiszerelések

6

Szükséges, de nem tartozék eszközök

7

Tárolás és kezelés

8

Figyelmeztetések és óvintézkedések

9

In vitro diagnosztikai célra

9

Figyelmeztetések

9

3.

4.

Óvintézkedések

10

5.

Mintavétel és a minta kezelése

11

6.

Alkalmazási útmutató

13

1. fázis – A vér inkubálása és a plazma elválasztása

13

2. fázis – Humán IFN-γ ELISA

14

Számítások és a teszt értelmezése

18

Standardgörbe létrehozása

18

A teszt minőségi felülvizsgálata

18

8.

Korlátok

21

9.

Teljesítményjellemzők

21

Klinikai vizsgálatok

21

7.

10. Technikai tudnivalók

24

Határozatlan eredmények

24

Alvadt plazmaminták

24

Hibaelhárítási útmutató

25

11. Bibliográfia

27

12. Technikai ügyfélszolgálat

29

13. Rövidített teszteljárás

30

1. fázis – a vér inkubálása

30

2. fázis – IFN-γ ELISA

30

Jelentős módosítások

32

QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

3

1.

Rendeltetés

A QuantiFERON-TB Gold (QFT®) egy in vitro diagnosztikai teszt, amelyben ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) proteineket szimuláló peptidkeverék stimulálja a sejteket a heparinizált teljes vérben. Az interferon-γ (IFN-γ) enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálattal (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA) történő észlelését használják a Mycobacterium tuberculosis fertőzéssel összefüggő peptid antigénekre adott in vitro válaszok azonosításához. A QFT az M. tuberculosis fertőzés (illetve megbetegedés) közvetett tesztje, amely rendeltetése szerint kockázatelemzésre, radiográfiára, valamint egyéb orvosi és diagnosztikai értékelésre szolgál.

2.

A teszt összefoglalása és kifejtése

A tuberkulózis az M. tuberculosis komplex organizmusok (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) okozta fertőző betegség, amely rendszerint cseppfertőzéssel terjed az új gazdára a légzőszervi tuberkulózis betegséggel fertőzött páciensekről. Az újonnan megfertőződött személy hetekkel vagy hónapokkal később megbetegedhet, de a legtöbben továbbra is jól érzik magukat. Egyes személyeknél lappangó tuberkulózis fertőzés (latent tuberculosis infection – LTBI), egy nem fertőző, tünetmentes állapot maradhat fenn, majd hónapokkal vagy évekkel később tuberkulózis betegség alakulhat ki. Az LTBI diagnosztizálásának legfőbb célja megállapítani, szükséges-e kezelést alkalmazni a tuberkulózis betegség kialakulásának megakadályozására. A legutóbbi időkig az LTBI diagnosztizálásának egyetlen rendelkezésre álló módja a tuberkulin bőrpróba (tuberculin skin test – TST) volt. A tuberkulinra való bőrérzékenység 2–10 héttel a fertőzés után alakul ki. Előfordul viszont, hogy egyes fertőzöttek, például a számos különféle immunműködést elnyomó állapot valamelyikében érintettek, sőt esetenként mások is nem reagálnak a tuberkulinra. Ugyanakkor egyes, bizonyára nem M. tuberculosis fertőzött egyének mégis érzékenységet mutatnak a tuberkulinra, és pozitív TST eredményt adnak Bacille Calmette-Guérin (BCG) oltást követően, M. tuberculosis komplextől eltérő mycobacteriumos fertőzés esetén, illetve más ismeretlen tényezők miatt. Az LTBI állapotot meg kell különböztetni a tuberkulózis betegségtől, amely egy rendszerint a tüdőt és az alsó légutakat, de esetenként más szerveket is érintő, bejelentés-köteles állapot. A tuberkulózis betegség a kórelőzményből és a fizikális, radiológiai, szövettani és mycobacteriológiai vizsgálati eredményekből diagnosztizálható. A QFT a mycobacteriális proteineket szimuláló peptid antigénekre adott sejtmediált immunválaszokat (cell-mediated immune – CMI) vizsgáló teszt. Ezek a proteinek – az ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) – az összes BCG- törzsből és a legtöbb nem tuberkulózisos mycobacteriumból hiányoznak az M. kansasii, M. szulgai és M. marinum kivételével.(1) Az M. tuberculosis komplex organizmusokkal fertőzöttek vérében rendszerint a fenti és egyéb mycobacteriális antigéneket felismerő limfociták találhatók. Az antigének felismerése IFN-γ citokin termelődésével és kiválasztásával jár. Jelen teszt alapja az IFN-γ észlelése, majd mennyiségi meghatározása. A QFT során használt antigének az ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) proteineket szimuláló peptidkeverék. Számos vizsgálat kimutatta, hogy ezek a peptid antigének M. tuberculosis fertőzötteknél kiváltják a T-sejtekben az IFN-γ-válaszokat, míg a nem fertőzött, illetve a BCG oltást kapott, betegség és LTBI kockázata nélküli személyek esetében általában nem.(1–32) Az immunműködést megzavaró kezelések, illetve állapotok azonban okozhatják az IFN-γ-válaszok csökkenését. Bizonyos egyéb mycobacteriális fertőzésben szenvedő páciensek szintén reagálhatnak az ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) proteinekre, mivel az ezeket kódoló gének az M. kansasii, M. szulgai és M. marinum esetén is jelen vannak.(1, 23) A QFT teszt alkalmas az LTBI kimutatására, valamint hasznos segítséget nyújt az M. tuberculosis komplex fertőzés diagnosztizálásában a beteg páciensek esetén. A pozitív eredmény alátámasztja a tuberkulózis 4

QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

betegség diagnózisát, de pozitív eredményt egyéb mycobacteriumos (pl. M. kansasii) fertőzés is okozhat. A tuberkulózis betegség megerősítésére vagy kizárására további orvosi és diagnosztikai értékelést kell végezni.

A teszt alapelve A QFT rendszer speciális vérvételi csöveket használ a teljes vér levételéhez. A vért a csövekben 16–24 órán keresztül inkubálják, a plazmát elválasztják, majd a peptid antigénekre válaszul létrejövő IFN-γ jelenlétére tesztelik. A QFT teszt kétfázisú. Először teljes vért kell levenni a QFT mindhárom vérvételi csövébe: a nullcsőbe, a TB-antigén csőbe és a mitogén csőbe. A mitogén cső a QFT teszt pozitív kontrolljaként szolgál. Ennek különösen akkor lehet jelentősége, ha az alany immunállapota bizonytalan. A mitogén cső továbbá a helyes vérkezelés és inkubálás kontrolljára is alkalmas. A csöveket a lehető leghamarabb, de legkésőbb a vérvételtől számított 16 órán belül inkubálni kell 37 °C-on. A 16–24 órás inkubálást követően a csöveket centrifugálják, a plazmát eltávolítják, majd az IFN-γ (IU/ml) mennyiségét ELISA teszttel megmérik. A teszt olyan IFN-γ-válasz esetén számít pozitívnak, amikor a TB-antigén cső szerinti érték jelentősen meghaladja a nullcső IFN-γ IU/ml értékét. Felhasználása esetén a mitogén cső plazmamintája az IFN-γ pozitív kontrolljaként szolgálhat az egyes tesztelt minták esetén. A gyenge (0,5 IU/ml alatti) mitogén reakció akkor jelent határozatlan eredményt, ha a vérminta TB-antigénekre adott válasza is negatív. Ilyen eredményt akkor kaphatunk, ha elégtelen a limfociták száma, gyenge a limfocitatevékenység, mert helytelenül kezelték a mintát, hibásan töltötték vagy keverték a mitogén csövet, illetve ha a páciens limfocitái képtelenek IFN-γ előállítására. A nullminta a vérben jelenlévő háttérérték, a heterofil antitestek okozta hatások, illetve a nem specifikus IFN-γ érték kompenzálására szolgál. A nullcső IFN-γ-szintjét kivonják a TB-antigéncső IFN-γ-szintjéből, valamint (használata esetén) a mitogén csőéből.

A teszt elvégzéséhez szükséges idő A QFT teszt elvégzéséhez szükséges becsült idő, valamint a több minta egyidejű tesztelésének időigénye: A vért tartalmazó csövek 37 °C-os inkubálása:

16–24 óra

ELISA:

Egy ELISA-lemez esetén kb. 3 óra (28–44 személy) 1 munkaóránál kevesebb Minden további lemezre újabb 10–15 percet kell számolni


5

3.

Összetevők és kiszerelések 300 cső

200 cső

100 cső

T0590-0301

0590-0201

T0593-0201

100

100

100

QuantiFERON Nil Tube (nullcső; szürke kupak, fehér gyűrű)

100 cső

100 cső

QuantiFERON TB Antigen Tube (TB-antigén cső; piros kupak, fehér gyűrű)

100 cső

100 cső

QuantiFERON Mitogen Tube (mitogén cső; lila kupak, fehér gyűrű)

100 cső

Blood Collection Tubes (vérvételi csövek)* Katalógusszám Készítmények száma

QFT vérvételi csövek kézikönyve

100 cső

1

1

1

300 cső

100 cső

100 cső

T0590-0505

0590-0501

T0593-0501

QuantiFERON HA Nil Tube (nullcső; szürke kupak, sárga gyűrű)

100 cső

100 cső

QuantiFERON HA TB Antigen Tube (TB-antigén cső; piros kupak, sárga gyűrű)

100 cső

100 cső

QuantiFERON HA Mitogen Tube (mitogén cső; lila kupak, sárga gyűrű)

100 cső

High Altitude (HA) Blood Collection Tubes (vérvételi csövek nagy tengerszint feletti magasságra; 1020–1875 m)* Katalógusszám

QFT vérvételi csövek kézikönyve

1

100 cső 1

1

* Nem minden országban kapható az összes termékkombináció. A megrendelhető termékkombinációkról a QIAGEN vevőszolgálat nyújt további tájékoztatást (elérhetőségét lásd: www.qiagen.com).

6


ELISA összetevők

2 lemezes ELISA készlet

Referencia laborcsomag

0594-0201

0594-0501

2 készlet 12×8 lyukú mikrolemezcsík

20 készlet 12×8 lyukú mikrolemezcsík

1 cső (8 IU/ml rehidratálva)

10 cső (8 IU/ml rehidratálva)

1×30 ml

10×30 ml

Katalógusszám Mikrolemezcsíkok (12×8 lyukú) bevonva egér antihumán IFN-γ monoklonális antitesttel Humán IFN-γ standard, liofilizált (tartalma: rekombináns humán IFN-γ, szarvasmarha-kazein, 0,01%[m/V] thimerosal) Green Diluent (zöld hígító; tartalma: szarvasmarhakazein, normál egérszérum, 0,01%[m/V] thimerosal) Conjugate 100X Concentrate (konjugátum 100× koncentrátum, liofilizált; egér anti-humán IFN-γ HRP, 0,01%[m/V] thimerosalt tartalmaz)

1×0,3 ml (rehidratálva) 10×0,3 ml (rehidratálva)

Wash Buffer 20X Concentrate (mosó puffer 20× koncentrátum; pH 7,2; 0,05%[V/V] ProClin® 300-at tartalmaz)

1×100 ml

10×100 ml

Enzyme Substrate Solution (enzimszubsztrátoldat; tartalma: H2O2, 3,3’, 5,5’ tetrametil-benzidin)

1×30 ml

10×30 ml

Enzyme Stopping Solution (enzimleállító oldat; tartalma: 0,5M H2SO4)†

1×15 ml

10×15 ml

1

1

QFT ELISA kézikönyv †

Kénsavat tartalmaz. (Az óvintézkedéseket lásd itt: 10. oldal)

Szükséges, de nem tartozék eszközök       

37 °C inkubátor. CO2 nem szükséges Kalibrált, változtatható térfogatú pipetták 10–1000 µl közti mennyiségekhez, eldobható véggel Kalibrált, többcsatornás pipetták 50–100 µl közti mennyiségekhez, eldobható véggel Mikrolemez-rázó gép Ioncserélt vagy desztillált víz, 2 liter Mikrolemez-mosó (automatikus mosó ajánlott) 450 nm-es szűrőjű mikrolemez-olvasó 620–650 nm-es referenciaszűrővel


7

Tárolás és kezelés Vérvételi csövek



A vérvételi csöveket 4 és 25 °C közt kell tárolni.

Reagensek a készletben

 

A készletben lévő reagenseket hűtve, 2 °C és 8 °C között kell tárolni. Az enzimszubsztrátoldatot mindig napfénytől védett helyen kell tartani.

Rehidratált és maradék reagensek A reagensek rehidratálási útmutatóját a 6. fejezet tartalmazza (14. oldal)



A készletben lévő standard rehidratálva 2–8 °C-on tárolható maximum 3 hónapig. Jegyezze fel a készletben lévő standard rehidratálásának dátumát.



A maradék rehidratált konjugátum 100× koncentrátumot vissza kell hűteni 2–8 °C-os tárolási hőmérsékletre, és 3 hónapon belül fel kell használni. Jegyezze fel a konjugátum rehidratálásának dátumát.

 

8

A készre hígított konjugátumot elkészítése után 6 órán belül fel kell használni. A készre hígított mosó puffer szobahőmérsékleten tárolható legfeljebb 2 hétig.


4.

Figyelmeztetések és óvintézkedések

In vitro diagnosztikai célra Figyelmeztetések  A negatív QFT eredmény nem zárja ki teljesen az M. tuberculosis fertőzés, illetve a tuberkulózis betegség esélyét: hamis negatív eredményt okozhat az adott fertőzöttségi stádium (ha pl. a mintavétel megelőzte a sejtimmunválasz kialakulását), az immunműködésre ható komorbid állapotok, a vérvételi csövek szabálytalan kezelése a vérvételt követően, a teszt szabálytalan elvégzése, illetve egyéb immunológiai változók.  A pozitív QFT eredmény nem szolgálhat az M. tuberculosis fertőzés megállapításának egyedüli vagy végleges alapjául. A teszt szabálytalan végrehajtása is okozhat hamis pozitív eredményt.  A pozitív QFT eredményt további orvosi vizsgálatoknak és az aktív tuberkulózis betegség diagnosztizálásának kell követnie (például saválló baktérium kimutatása köpetvizsgálattal és tenyésztéssel, illetve mellkasröntgen).  Bár az ESAT-6, CFP-10 és TB7.7(p4) az összes BCG törzsből és a legtöbb ismert nem tuberkulózisos mycobacteriumból hiányzik, mégis előfordulhat, hogy a QFT eredményt M. kansasii, M. szulgai vagy M. marinum fertőzés okozza. Ha ilyen fertőzések gyanúja merül fel, akkor más vizsgálatok elvégzése szükséges.


9

Óvintézkedések Csak in vitro diagnosztikai célra Vegyszerek használatakor mindig viseljen megfelelő laboratóriumi köpenyt, eldobható kesztyűt és védőszemüveget. A további tudnivalókat a megfelelő biztonsági (SDS) adatlapok tartalmazzák. Az egyes QUIAGEN készletek és összetevők biztonsági adatlapjai praktikus és kisméretű PDF fájl formájában megtalálhatók, megtekinthetők és kinyomtathatók a www.qiagen.com/safety oldalon.

VIGYÁZAT: Az emberi vér kezelése fertőzésveszéllyel jár. A vonatkozó vérkezelési előírásokat be kell tartani. A QuantiFERON-TB Gold ELISA készlet összetevőire az alábbi R és S mondatok vonatkoznak. QuantiFERON enzimleállító oldat

Xi

Kénsavat tartalmaz: Maró hatású. R és S mondatok:∗ R36/38, S26-36/37/39



A zöld hígító normál egérszérumot és kazeint tartalmaz, amelynek az allergiás reakciók veszélye miatt nem szabad bőrrel érintkeznie.

Vegyi anyagokkal kapcsolatos vészhelyzetben kiömlés, szivárgás, érintkezés vagy baleset esetén éjjel-nappal hívható a CHEMTREC az USA-ban és Kanadában: 1-800-424-9300 más országban: +1-703-527-3887 (R-beszélgetés kérhető) További tájékoztatás Biztonsági adatlapok: www.qiagen.com/safety

  

 

∗

A QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv utasításaitól való eltérés hibás eredményt idézhet elő. Használat előtt figyelmesen olvassa el az útmutatót. Sérültnek tűnő vagy szivárgó reagenspalackot tartalmazó készletet nem szabad használni. Nem engedélyezett az eltérő QFT készletekbe tartozó mikrolemezcsíkok, humán IFN-γ standardok, zöld hígítók, illetve konjugátum 100× koncentrátumok vegyes felhasználása, illetve összekeverése. A többi reagens (a mosó puffer 20× koncentrátum, enzimszubsztrátoldat és enzimleállító oldat) több készletből vegyesen is használható, ha azok felhasználhatósági ideje még nem járt le, és ha a gyári számokat feljegyzik. A fel nem használt reagensek és biológiai minták hulladékkezelését a helyi, tagállami és uniós előírások szerint kell végezni. A vérvételi csöveket és az ELISA készletet lejárati időn túl nem szabad felhasználni. Gondoskodni kell a laboratóriumi berendezések, például a lemezmosók és -beolvasók kalibrálásáról, illetve hogy azok alkalmazásra hitelesítettek legyenek.

R36/38: Szem- és bőrizgató hatású; S26: Ha szembe jut, bő vízzel azonnal ki kell mosni és orvoshoz kell fordulni; S36/37/39: Megfelelő védőruházatot, védőkesztyűt, szem-/arcvédőt kell viselni.

10


5.

Mintavétel és a minta kezelése

A QFT az alábbi vérvételi csöveket alkalmazza: 1. QuantiFERON nullcsövek (szürke kupak, fehér gyűrű; tengerszint és 810 m közötti alkalmazásra) 2. TB-antigén csövek (piros kupak, fehér gyűrű; tengerszint és 810 m közötti alkalmazásra) 3. QuantiFERON mitogén csövek (lila kupak, fehér gyűrű; tengerszint és 810 m közötti alkalmazásra) Csövek nagy tengerszint feletti magasságra (HA): 4. QuantiFERON HA nullcsövek (szürke kupak, sárga gyűrű; 1020–1875 m között használható) 5. HA TB-antigén csövek (piros kupak, sárga gyűrű; 1020–1875 m között használható) 6. QuantiFERON HA mitogén csövek (lila kupak, sárga gyűrű; 1020–1875 m között használható) Az antigének a vérvételi csövek belső falán, szárítva találhatók meg, ezért fontos, hogy a csövek tartalma teljesen összekeveredjen a vérrel. A csöveket a lehető leghamarabb, de legkésőbb a vérvételtől számított 16 órán belül 37 °C-os inkubátorba kell helyezni.

Az optimális eredmény érdekében az alábbi eljárást kell követni: 1.

Vegyen le alanyonként 1 ml vénás vért közvetlenül az egyes QFT vérvételi csövekbe. Ezt az eljárást vérvételre kiképzett személynek kell végeznie. • 810 méteres tengerszint feletti magasságig normál QFT vérvételi csöveket kell használni. 1020 és 1875 méter között nagy tengerszint feletti magasságra készült (HA) vérvételi csöveket kell használni. • Ha ezektől eltérő tengerszint feletti magasságon történik a QFT vérvételi csövek használata, vagy ha a levett vér mennyisége túl alacsony, akkor a vér fecskendővel is levehető, majd 1-1 ml azonnal áthelyezhető mindhárom csőbe. Biztonsági okokból ennek legjobb módja a fecskendő tűjének biztonságos eltávolítása, a 3 QFT-cső kupakjának eltávolítása, majd 1-1 ml vér betöltése (a cső oldalán található fekete jelzésig). A csövek kupakját gondosan vissza kell zárni, majd az alább ismertetett módon keverést kell végezni. • Mivel az 1 ml-es csövek a vért viszonylag lassan veszik fel, a cső látszólagos telítődése után még 2-3 másodpercig tartsa a csövet a tűn, hogy a megfelelő mennyiség biztosan meglegyen. Az 1 ml-es töltési mennyiséget a cső oldalán feltüntetett fekete jel mutatja. A QFT vérvételi csövek névleges térfogattartománya 0,8–1,2 ml. Ha valamely csőben a vér szintje nincs a jelzővonal közelében, ajánlatos új vérmintát venni. • Ha a vérvétel pillangótűvel történik, akkor a QFT csöveinek megtöltése előtt egy üres csövet kell használni, hogy az összekötő csövek biztosan megteljenek a vérrel. • A másik lehetőség, hogy vért egy általános, antikoagulánsként lítium heparint tartalmazó vérvételi csőbe veszik, és innen töltik át a QFT csövekbe. Csak lítium heparin használható a vérben antikoagulánsként, mivel más antikoagulánsok megzavarják a tesztet. Töltsön fel egy vérvételi csövet (minimum 5 ml mennyiséggel), és a cső többszöri átfordításával végezzen óvatos keverést a heparin eloszlatására. A vért szobahőmérsékleten (22±5 °C-on) kell tárolni addig, amíg a QFT csövekbe nem töltik inkubálásra, amelyet feltétlenül meg kell kezdeni a vérvételt követő 16 órán belül.


11

2.

A csöveket közvetlenül a megtöltésüket követően rázza meg tíz (10) alkalommal éppen olyan erősen, hogy a cső teljes belső felszínére eljutó vér leoldja a csőfalon található antigéneket. • Miközben vérrel tölti meg a csöveket, azok hőmérsékletének 17–25 °C között kell lennie. • A túlságosan erős rázás a gél felszakadását okozhatja, aminek köszönhetően téves eredményeket kaphatunk. • Ha levételkor a vér heparinos csőbe került, akkor a mintát a QFT-csövekbe áttöltés előtt egyenletesen fel kell keverni. A vér alapos felkeverése óvatos átfordításokkal mindig közvetlenül az áttöltést megelőzően történjen. Töltsön (QFT csövenként egy-egy) pontosan 1,0 ml-es mennyiséget a megfelelő null-, TB-antigén és mitogén csőbe. Ezt legjobb aszeptikusan végezni, a megfelelő biztonsági eljárásokat betartva. Távolítsa el mindhárom QFT cső kupakját, majd töltsön mindegyikbe 1-1 ml vért (a cső oldalán található fekete jelzésig). A csövek kupakját gondosan vissza kell zárni, majd a fenti módon keverést kell végezni.

3.

A csöveket megfelelően feliratozza. • Gondoskodni kell arról, hogy az egyes csövek (null-, TB-antigén, mitogén) a kupakjuk eltávolítása után is azonosíthatók maradjanak a címkéjük alapján vagy más módon.

4.

A feltöltést, felrázást és címkézést követően a csöveket a lehető leghamarabb, de legkésőbb a vérvételtől számított 16 órán belül 37±1 °C-os inkubátorba kell helyezni. Inkubálás előtt a csöveket szobahőmérsékleten (22±5 °C-on) kell tartani. A vérmintákat nem szabad hűteni vagy fagyasztani.

12


6.

Alkalmazási útmutató

1. fázis – A vér inkubálása és a plazma elválasztása Tartozék eszközök



QFT vérvételi csövek (lásd: 3. fejezet).

Szükséges (de nem tartozék) eszközök



Lásd: 3. fejezet.

Eljárás Ha a vért nem azonnal a levételt követően inkubálják, akkor a csöveket közvetlenül az inkubálás előtt 10-szer átfordítva újra kell keverni. 2. A csöveket ÁLLÍTVA, 37±1 °C hőmérsékleten kell inkubálni 16–24 órán keresztül. Inkubáláskor sem CO2, sem párásítás nem szükséges. 3. A 37 °C-os inkubálás után és a centrifugálás előtt a vérvételi csövek 4–27 °C-on, legfeljebb 3 napig tárolhatók. 4. A 37 °C-os inkubálás után a csöveket a plazma elválasztása céljából 2000–3000 g RCF fordulatszámon 15 percig kell centrifugálni. A géldugó elkülöníti a sejteket a plazmától. Ennek hiányában a csövek centrifugálását nagyobb sebességen kell megismételni. • A plazma centrifugálás nélkül is elválasztható, de fokozottan ügyelni kell arra, hogy közben a vérsejtek ne keveredjenek fel. 1.

5.

A plazmamintákat csak pipettával szabad elválasztani. • A centrifugálás és az elválasztás között el kell kerülni a plazma felkeverését a pipetta fel-le mozgatásával vagy bármilyen más módon. A teljes folyamat során gondosan meg kell őrizni a gélfelület sértetlenségét. • A plazmaminták közvetlenül a centrifugált vérvételi csövekből tölthetők át a QFT ELISA lemezbe, automatikus ELISA munkaállomás használata esetén is. • A plazmaminták 2–8 °C között maximum 28 napig, illetve elválasztva –20 °C alatt hosszú ideig megőrizhetők. • Megfelelő tesztmintát legalább 150 µl plazma elválasztásával lehet nyerni.


13

2. fázis – Humán IFN-γ ELISA Tartozék eszközök



QFT ELISA készlet (lásd: 3. fejezet).

Szükséges (de nem tartozék) eszközök



Lásd: 3. fejezet.

Eljárás 1.

2.

3.

Felhasználás előtt a konjugátum 100× koncentrátum kivételével minden plazmamintát és reagenst szobahőmérsékletre (22±5 °C-ra) kell hozni. A hő kiegyenlítődésre legalább 60 percet kell hagyni. Vegye ki a keretből a szükségtelen csíkokat, ezeket zárja vissza a fóliatasakba, majd felhasználásig helyezze vissza a hűtött tárolóba. A QFT standardoknak legalább 1 csíkot kell biztosítani, valamint a tesztelt alanyok számának megfelelő csíkot (a 3 csöves formátumot lásd a 2A ábrán, a 2 csöveset a 2B ábrán). Használat után a többi csík számára őrizze meg a keretet és a fedelet. Rehidratálja a készletben lévő liofilizált standardot az standardüveg címkéjén feltüntetett mennyiségű ioncserélt vagy desztillált vízzel. Óvatosan, minimális habképződéssel keverje, amíg teljesen fel nem oldódik. A standard megadott térfogatra rehidratálása 8,0 IU/ml koncentrációjú oldatot képez. Megjegyzés: A készletben lévő standard rehidratálási térfogata tételenként eltérő. Használja rehidratálva a készletben lévő standardot az IFN-γ 1:4 arányú hígítási sorozatának elkészítéséhez zöld hígítóban (GD) (lásd: 1. ábra). Az S1 (1. standard) tartalma 4 IU/ml, az S2 (2. standard) tartalma 1 IU/ml, az S3 (3. standard) tartalma 0,25 IU/ml és az S4 (4. standard) tartalma 0 IU/ml (csak zöld hígító). A standardokat legalább duplán kell tesztelni. Ajánlott eljárás a dupla standardokhoz

Ajánlott eljárás a tripla standardokhoz

a. Címkézzen fel 4 csövet: S1, S2, S3, S4.

a. Címkézzen fel 4 csövet: S1, S2, S3, S4.

b. Töltsön 150 µl zöld hígítót az S1, S2, S3, S4 csövekbe.

b. Töltsön 150 µl zöld hígítót az S1 csőbe.

c.

Töltsön 150 µl standardot az S1 csőbe, és alaposan keverje össze.

c.

Töltsön 210 µl zöld hígítót az S2, S3, S4 csövekbe.

d. Töltsön át 50 µl-t az S1-ből az S2 csőbe, és alaposan keverje össze.

d. Töltsön 150 µl standardot az S1 csőbe, és alaposan keverje össze.

e. Töltsön át 50 µl-t az S2-ből az S3 csőbe, és alaposan keverje össze.

e. Töltsön át 70 µl-t az S1-ből az S2 csőbe, és alaposan keverje össze.

f.

f.

A zöld hígító magában nullstandardként szolgál (S4).

Töltsön át 70 µl-t az S2-ből az S3 csőbe, és alaposan keverje össze.

g. A zöld hígító magában nullstandardként szolgál (S4).

14


150 µl 50 µl

Rehidratált standard

Standard 1 4,0 IU/ml

50 µl



Standard 4 0 IU/ml (zöld hígító)

1. ábra A standardgörbe elkészítése. Minden ELISA munkamenethez friss hígítást kell készíteni a készletben lévő standardból. 4.

Rehidratálja a liofilizált konjugátum 100× koncentrátumot 0,3 ml ioncserélt vagy desztillált vízzel. Óvatosan, minimális habképződéssel keverje, hogy a konjugátum teljesen feloldódjon. A konjugátum készre hígításához a Konjugátumkészítés című 1. táblázat szerint hígítsa fel a kívánt mennyiségű rehidratált konjugátum 100× koncentrátumot zöld hígítóval.

1. táblázat Konjugátumkészítés Csíkok száma

A konjugátum 100× koncentrátum mennyisége

A zöld hígító mennyisége

2

10 µl

1,0 ml

3

15 µl

1,5 ml

4

20 µl

2,0 ml

5

25 µl

2,5 ml

6

30 µl

3,0 ml

7

35 µl

3,5 ml

8

40 µl

4,0 ml

9

45 µl

4,5 ml

10

50 µl

5,0 ml

11

55 µl

5,5 ml

12

60 µl

6,0 ml

•

Keverje meg alaposan, de óvatosan, hogy ne habosodjon fel.

•

Az esetleg megmaradó összes konjugátum 100× koncentrátumot azonnal vissza kell hűteni 2–8 °C-ra.

•

Csak zöld hígítót használjon.


15

5.

A vérvételi csövekből elválasztott, majd lefagyasztott vagy a tesztelés előtt 24 óránál hosszabb ideig tárolt plazmamintákat az ELISA lyukakba töltés előtt alaposan fel kell keverni. • A közvetlenül a centrifugált QFT csövekből áttöltött plazmaminták esetén a plazma keverését teljesen kerülni kell.

6.

Töltsön 50 µl frissen készre hígított konjugátumot a szükséges ELISA lyukakba többcsatornás pipettával. A többcsatornás pipettával töltsön 50 µl teszt plazmamintákat a megfelelő lyukakba (az ajánlott lemezelrendezés a 2A és 2B ábrán látható). Végül töltsön 50 µl mennyiséget 1-től 4-ig az összes standardba.

7.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1N

1A

1M

S1

S1

S1

13N

13A

13M

21N

21A

21M

B

2N

2A

2M

S2

S2

S2

14N

14A

14M

22N

22A

22M

C

3N

3A

3M

S3

S3

S3

15N

15A

15M

23N

23A

23M

D

4N

4A

4M

S4

S4

S4

16N

16A

16M

24N

24A

24M

E

5N

5A

5M

9N

9A

9M

17N

17A

17M

25N

25A

25M

F

6N

6A

6M

10N

10A

10M

18N

18A

18M

26N

26A

26M

G

7N

7A

7M

11N

11A

11M

19N

19A

19M

27N

27A

27M

H

8N

8A

8M

12N

12A

12M

20N

20A

20M

28N

28A

28M

2A ábra Ajánlott mintaelrendezés null-, TB-antigén és mitogén csövekhez (28 teszt lemezenként). •

S1 (1. standard), S2 (2. standard), S3 (3. standard), S4 (4. standard)

•

1N (1. minta nullplazma), 1A (1. minta TB-antigén plazma), 1M (1. minta mitogén plazma) 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1N

5N

9N

13N

17N

S1

S1

25N

29N

33N

37N

41N

B

1A

5A

9A

13A

17A

S2

S2

25A

29A

33A

37A

41A

C

2N

6N

10N

14N

18N

S3

S3

26N

30N

34N

38N

42N

D

2A

6A

10A

14A

18A

S4

S4

26A

30A

34A

38A

42A

E

3N

7N

11N

15N

19N

21N

23N

27N

31N

35N

39N

43N

F

3A

7A

11A

15A

19A

21A

23A

27A

31A

35A

39A

43A

G

4N

8N

12N

16N

20N

22N

24N

28N

32N

36N

40N

44N

H

4A

8A

12A

16A

20A

22A

24A

28A

32A

36A

40A

44A

2B ábra Ajánlott mintaelrendezés null- és TB-antigén csövekhez (44 teszt lemezenként)

8. 9.

16

•

S1 (1. standard), S2 (2. standard), S3 (3. standard), S4 (4. standard)

•

1N (1. minta nullplazma), 1A (1. minta TB-antigén plazma)

Keverje alaposan a konjugátumot és a plazmamintákat vagy standardokat mikrolemezrázóval 1 percig. Helyezzen minden lemezre fedelet, és végezzen 120±5 perces inkubálást szobahőmérsékleten (22±5 °C-on). • A lemezeket inkubálás alatt nem érheti közvetlen napfény. QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

10. Az inkubálás alatt hígítson egy rész mosó puffer 20× koncentrátumot 19 rész ioncserélt vagy desztillált vízzel, és keverje meg alaposan. 2 liter készre hígított mosó puffer elkészítéséhez elegendő mosó puffer 20× koncentrátumot mellékeltünk. A lyukakat 400 µl készre hígított mosó pufferrel kell mosni legalább 6 cikluson keresztül. Automatikus lemezmosó használata ajánlott. •

A teszt minősége érdekében nagyon fontos az alapos mosás. Ügyeljen arra, hogy minden lyuk színültig telítődjön a mosó pufferrel minden mosási ciklusban. Ajánlott legalább 5 másodperces áztatási időt hagyni az egyes ciklusok között.

•

A szennyvíztartályba normál laboratóriumi fertőtlenítőszert kell tölteni, és a potenciálisan fertőző anyagot a szabályos eljárások szerint ártalmatlanítani kell.

11. A lemezeket lefordítva nedvszívó, szálmentes kendőre kell ütögetni, hogy a maradék mosó puffer eltávozzon. Töltsön 100 µl enzimszubsztrátoldatot minden lyukba, és végezzen alapos keverést mikrolemez-rázóval. 12. Helyezzen minden lemezre fedelet, és végezzen 30 perces inkubálást szobahőmérsékleten (22±5 °C-on). • A lemezeket inkubálás alatt nem érheti közvetlen napfény. 13. A 30 perces inkubálás elteltével töltsön 50 µl enzimleállító oldatot minden lyukba, és végezzen keverést. • Az enzimleállító oldatot a szubsztrátum 11. lépésben leírt adagolásakor alkalmazott sorrendben és közel hasonló sebességgel töltse ki. 14. A reakció leállítását követő 5 percen belül mérje meg az összes lyukban az optikai denzitás (OD) értékét egy 450 nm-es szűrőjű és 620–650 nm-es referenciaszűrőjű mikrolemez-olvasóval. A teszteredményeket az OD értékekből kell kiszámolni.


17

7.

Számítások és a teszt értelmezése

A nyers adatok elemzése és az eredmények kiszámítása a QFT Analysis szoftverrel történik. Ez beszerezhető a www.QuantiFERON.com webhelyen. Ügyeljen rá, hogy mindig a szoftver legújabb verzióját használja. A szoftver az Eredmények értelmezése című fejezetben leírtak szerint elvégzi a teszt minőségi felülvizsgálatát, létrehozza a standardgörbét, és kiszámítja az egyes alanyok teszteredményét. A QFT Analysis szoftver alkalmazása helyett az eredmények az alábbi módon is megállapíthatók.

Standardgörbe létrehozása (QFT Analysis szoftver nélkül) Határozza meg minden tálcán a standardok átlagos OD értékeit. Szerkesszen egy log(e)–log(e) standardgörbét, amely az átlagos OD log(e) értékét ábrázolja (y tengely) a standardok IU/ml-ben mért IFN-γ-koncentrációs értékének log(e) függvényében (x tengely), a nullstandardot a számításból kihagyva. Számítsa ki regresszió-analízissel a standardgörbe legjobban illeszkedő vonalát. Állapítsa meg a standardgörbe segítségével az egyes teszt plazmaminták IFN-γ koncentrációját (IU/ml) a hozzájuk tartozó OD értékből. Ezeket a számításokat a mikrolemez-olvasóhoz tartozó szoftvercsomagokkal, valamint hagyományos táblázatkezelő vagy statisztikai szoftverekkel (például Microsoft® Excel®) végezheti el. Ajánlatos ezeket a csomagokat használni a regresszióanalízis, valamint a standardokra vonatkozó ingadozási együttható (%CV) és a standardgörbe korrelációs együtthatójának (r) kiszámításához.

A teszt minőségi felülvizsgálata A teszteredmények pontossága attól függ, hogy mennyire sikerült pontos standardgörbét létrehozni, ezért a minták adatainak értelmezését megelőzően felül kell vizsgálni a standardokból származó eredményeket. Az ELISA teszt érvényességének feltételei:

   

Az 1. standardra vonatkozó OD átlagnak ≥0,600 értékűnek kell lennie. Az 1. és 2. standardok ismétlődő OD értékeihez tartozó %CV ≤15% lehet. A 3. és 4. standardok ismétlődő OD értékei nem mutathatnak 0,040 optikai denzitási egységnél nagyobb szórást az átlagértéktől. A standardok átlagos abszorpciós értékeiből számított korrelációs együtthatónak (r) ≥0,98 értékűnek kell lennie.

A QFT Analysis szoftver kiszámolja ezeket a minőség felülvizsgálati paramétereket, és jelentést készít róluk. Ha a fenti követelmények nem teljesülnek, akkor a teszt érvénytelen, és meg kell ismételni. A nullstandardhoz (zöld hígító) tartozó átlagos OD érték ≤0,150 lehet. Ha az átlagos OD érték >0,150, akkor a lemezmosási munkafolyamatot kell felülvizsgálni.

18


Az eredmények értelmezése A QFT eredményeit az alábbi követelmények szerint kell értelmezni: Megjegyzés: A tuberkulózis betegség diagnosztizálásához, illetve kizárásához, valamint az LTBI valószínűségének megállapításához a QFT eredményeinek értelmezésénél figyelembe kell venni az epidemiológiai, kórelőzményi, orvosi és diagnosztikus eredmények összességét (2. és 3. táblázat). 2. táblázat Null-, TB-antigén és mitogén cső használata esetén Null (IU/ml)

≤8,0

§

>8,0

TB-antigén mínusz null (IU/ml)

Mitogén mínusz null (IU/ml)*

QFT eredménye

<0,35

≥0,5

Negatív

≥0,35 és kisebb a nullérték 25%-ánál

≥0,5

Negatív

≥0,35 és eléri a nullérték 25%-át

Bármely

Pozitív†

<0,35

<0,5

Határozatlan


<0,5

Határozatlan‡

Bármely

Határozatlan‡

Bármely

Lelet/értelmezés

M. tuberculosis fertőzés NEM valószínű M. tuberculosis fertőzés NEM valószínű M. tuberculosis fertőzés valószínű ‡

Az eredmény nem meghatározó a TB-antigének válaszkészségére nézve Az eredmény nem meghatározó a TB-antigének válaszkészségére nézve Az eredmény nem meghatározó a TB-antigének válaszkészségére nézve

* A mitogén pozitív kontrollra kapott válaszértékek gyakran (a TB-antigéneknél időnként) meghaladhatják a mikrolemez-olvasó méréshatárát. Ez a teszteredményeket nem befolyásolja. † Ha az M. tuberculosis fertőzés gyanúja nem áll fenn, az először kapott pozitív eredményeket alá lehet támasztani az eredeti plazmamintáknak a QFT ELISA készülékben végzett dupla ismételt tesztelésével. A vizsgált személyt akkor lehet teszt pozitívnak minősíteni, ha az ismételt teszteléskor legalább az egyik minta pozitív. ‡ A lehetséges okokat a Hibaelhárítás című fejezet tárgyalja. §

A klinikai vizsgálatokban az alanyoknak kevesebb mint 0,25%-a mutatott >8,0 IU/ml IFN-γ értéket nullértékként.

A mért IFN-γ-szint magnitúdója nem mutat korrelációt a fertőzés stádiumával vagy előrehaladtával, az immunválasz-készség mértékével vagy az aktív betegséggé fejlődés valószínűségével. Nem

Értelmezés

TB-antigén – null ≥0,35 IU/ml Igen

Nem

TB-antigén – null ≥ a null IU/ml értékének 25%-a Igen

Validálás

Mitogén – null <0,50 IU/ml és/vagy null >8,0 IU/ml

Igen

Nem

Határozatlan

Null ≤8,0 IU/ml

Nem

Igen

Negatív

Pozitív

3. ábra Értelmezési folyamatábra null-, TB-antigén és mitogén cső használata esetén. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

19

3. táblázat Csak QuantiFERON null- és TB-antigén cső használatakor Null (IU/ml)

≤8,0

†

>8,0

TB-antigén mínusz null (IU/ml)

QFT eredménye Lelet/értelmezés

<0,35

Negatív

M. tuberculosis fertőzés NEM valószínű


Negatív

M. tuberculosis fertőzés NEM valószínű

≥0,35 és eléri a nullérték 25%-át

Pozitív*

M. tuberculosis fertőzés valószínű

Bármely

Határozatlan

‡

Az eredmény nem meghatározó a TB-antigének válaszkészségére nézve

* Ha az M. tuberculosis fertőzés gyanúja nem áll fenn, az először kapott pozitív eredményeket alá lehet támasztani az eredeti plazmamintáknak a QFT ELISA készülékben végzett dupla ismételt tesztelésével. A vizsgált személyt akkor lehet teszt pozitívnak minősíteni, ha az ismételt teszteléskor legalább az egyik minta pozitív. † ‡

A klinikai vizsgálatokban az alanyoknak kevesebb mint 0,25%-a mutatott >8,0 IU/ml IFN-γ-értéket nullértékként. A lehetséges okokat a Hibaelhárítás című fejezet tárgyalja.

A mért IFN-γ-szint magnitúdója nem mutat korrelációt a fertőzés stádiumával vagy előrehaladtával, az immunválasz-készség mértékével vagy az aktív betegséggé fejlődés valószínűségével. Nem

Értelmezés

TB-antigén – null ≥0,35 IU/ml Igen

Nem

TB-antigén – null ≥ a null IU/ml értékének 25%-a Igen Nem

Validálás

Határozatlan

Null ≤8,0 IU/ml

Igen

Negatív

Pozitív

4. ábra Értelmezési folyamatábra null- és TB-antigén cső használatakor

20


8.

Korlátok

A QFT eredményeit az egyes személyek epidemiológiai kórtörténetével együtt, aktuális egészségi állapotával összhangban és az egyéb diagnosztikai szempontok figyelembe vételével kell értékelni. A 8 IU/ml nullértéket meghaladó eredményű személyek a „határozatlan” csoportba tartoznak, mert a TB-antigénekre adott 25%-nál magasabb válasz kívül eshet a vizsgálat mérési tartományán. A megbízhatatlan és határozatlan eredmények lehetséges okai:

  

9.

A QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv által közölt eljárástól való eltérések Túlzott mértékű keringő IFN-γ vagy heterofil antitestek jelenléte 16 óránál hosszabb idő telt el a vérvétel és a 37 °C-os inkubálás között

Teljesítményjellemzők

Klinikai vizsgálatok Mivel a lappangó tuberkulózis fertőzésre (LTBI) nincs meghatározó szabvány, a QFT érzékenységének és specifikusságának becslésére nincs gyakorlati eljárás. A QFT specifikusságát a tuberkulózis fertőzésre alacsony kockázatú betegek (azok, akiknél nem ismeretesek kockázati tényezők) hamis pozitív arányának értékelésével becsülték meg. Az érzékenység becsült értékét tenyésztéssel megerősített aktív TB megbetegedésű pácienscsoportok értékelésével határozták meg.

Specifikusság Egy 866 önkéntesen végzett USA-beli vizsgálatban úgy vettek vért a QFT vizsgálathoz, hogy közben TST volt felhelyezve. A tesztelés idején szabályos felméréssel tájékozódtak a résztvevők demográfiai adatairól és TB-kockázati tényezőiről. 432 ismert M. tuberculosis fertőzési kockázati tényezővel nem rendelkező önkéntes közül 391 esetében állt rendelkezésre a QFT és a TST eredménye. Egyik résztvevő sem kapott korábban BCG oltást. Japánban elvégezték a QFT teszt egy másik vizsgálatát olyan alacsony kockázatú személyek körében, akiknek mintegy 90%-a kapott BCG oltást. A 2 különböző specifikussági vizsgálat eredményét a 4. táblázat tartalmazza. 4. táblázat QFT specifikussága: Bejelentett M. tuberculosis fertőzési kockázat nélküli személyek eredményei Vizsgálat

BCG státus Vizsgáltak száma (beoltottak összesen %-aránya)

QFT határozatlanok száma

QFTpozitívak / érvényesen teszteltek száma

QFT specifikussága (95% CI)

TSTpozitívak / teszteltek száma

TST* specifikussága (95% CI)

USA (nem publikált)

0%

391

1

3/390

99,2% (98–100)

6/391

98,5% (97–99)

Japán (15)

~90%

168

6

2/162

98,8% (95–100)

–

–

Összesen

–

559

7/559 (1,3%)

5/552

99,1% (98–100)

–

–

* 10 mm-es TST bőrpróbával BCG oltást nem kapott személyeknél. A 15 mm-es TST becsült specifikussága 99,1%.


21

Érzékenység aktív TB-re A később tenyésztéssel M. tuberculosis fertőzöttnek bizonyuló USA-beli, ausztráliai és japán TB-gyanús személyeket vizsgáltak meg a QFT érzékenységének megállapítására. Bár a lappangó tuberkulózis fertőzés kimutatására (LTBI) nincs meghatározó szabvány vizsgálat, az M. tuberculosis mikrobiológiai tenyésztése megfelelő helyettesítő, mert a beteg páciensek magától értetődően fertőzöttek. A páciensek a QFT teszthez tartozó vérvétel előtt kevesebb mint 8 nap kezelésben részesültek. Az 5. táblázat foglalja össze a tenyésztés után M. tuberculosis pozitívnak bizonyult páciensek eredményeit. A QFT összesített érzékenysége aktív TB betegségre 89% volt (157/177). 5. táblázat QFT: Tenyésztéssel igazoltan M. tuberculosis fertőzött alanyok Vizsgálat

QFT-pozitívak / érvényesen teszteltek száma

QFT érzékenysége (95% CI)

Japán TB-páciensek (15)

86/92

93% (86–97%)

Ausztrál

24/27

89% (70–97%)

USA-beli

47/58

81% (68–90%)

Összesen

157/177

89% (83–93%)

22


Az LTBI diagnosztizálása Számos olyan vizsgálat került publikálásra, amely a QFT paramétereit mutatta be a különféle LTBI kockázatú populációkban. Egyes válogatott vizsgálatok alapvető eredményeit a 6. táblázat ismerteti. 6. táblázat A QFT tesztre vonatkozó egyes közzétett vizsgálok LTBI kockázatú populációkban Vizsgálat

Vizsgáltak száma összesen

Kimenetel és eredmények

Healthcare workers in India (Pai, et al 2005) (26)

726

Nagyon magas TB-arány. 40% QFT-pozitív és 41% TST-pozitív 10 mm-es teszttel. Nagy konkordancia a TST teszttel, nincs BCGhatás egyik részről sem. Mindkét teszt összefüggést mutat az életkor és az egészségügyben végzett munka időtartama szerinti kockázati tényezővel.

Danish HIV+ patients (Brock, et al 2006) (5)

590

Az LTBI összesített jelenléte a QFT szerint 4,6% (27/590) HIV-pozitív személyeknél. A pozitív eredmények összefüggést mutattak a TB-kockázatokkal. Két QFT-pozitív alanynál aktív TB alakult ki 1 éven belül. A határozatlan válaszok (n=20, 3,4%) jelentős összefüggést mutattak a 100/µl-nél kisebb CD4 számmal.

Hospitalized children in India (Dogra, et al 2006) (10)

105

TB-gyanús, illetve korábban TB-nek kitett gyermekeket vizsgáltak QFT és TST teszttel; az eredmény 10,5% QFT-pozitív és 9,5% TST-pozitív 10 mm-es teszttel. A tesztek közti egyezés 95,2% összesítve és 100% a BCG oltást nem kapottak körében.

Contact investigations in Germany (Diel, et al 2006) (9)

309

15 különféle kiinduló eset szoros kapcsolatát tesztelték: 51% BCG oltást kapott, 27% külföldön született; a BCG oltottak 70%-a és az oltást nem kapottak 18%-a volt TST-pozitív (5 mm), míg 9% és 11% volt QFT-pozitív. A QFT összefüggést mutatott a TB kockázatával. A TST csak a BCG oltással mutatott összefüggést.

Számos más publikáció készült a QuantiFERON-TB Gold kevésbé érzékeny, folyadék antigénes verziójának (a QFT elődjének) paramétereiről, valamint a QFT tesztről is. Ezekben a vizsgálatokban egyaránt végeztek teszt(ek)et aktív TB megbetegedésű (9, 11, 19, 25), gyermek (6–10, 25, 28) és HIV-pozitív pácienseknél (2, 5, 20), egészségügyi dolgozóknál (13, 26, 32), immungyengített pácienseknél (3, 4, 22, 23, 27, 30, 31), valamint TB-gyanús alanyoknál (7, 8, 10, 18) és alacsony kockázatú személyeknél (15).

Megismételhetőség és a TST teszt hatása a későbbi QFT teszteredményekre Az USA-beli specifikussági vizsgálat részeként az önkéntesek egy részét újratesztelték 4–5 héttel az eredeti QFT és TST teszt után. 260 önkéntes QFT eredménye állt rendelkezésre mindkét időpontban, és az egyezés 99,6% (259/260) volt. Az előzetes TST nem indukált pozitív QFT eredményeket.


23

10. Technikai tudnivalók Határozatlan eredmények A határozatlan eredmény ritka jelenség, és a tesztalany immunállapota mellett számos technikai tényező is okozhatja:

   

16 óránál hosszabb idő telt el a vérvétel és a 37 °C-os inkubálás között A vért az előírt tartományon (17–27 °C) kívül eső hőmérsékleten tárolták Nem megfelelően történt a vérvételi csövek keverése Az ELISA lemez nem megfelelő mosása

A vérminták levételekor vagy kezelésekor elkövetett technikai hibák gyanúja esetén a teljes QFT tesztet meg kell ismételni új vérmintával. Nem megfelelő mosás vagy az előírt ELISA műveletsortól való bármely eltérés gyanúja esetén a stimulált plazmák ELISA tesztelését meg kell ismételni. Az alacsony mitogén értékből vagy magas nullértékből eredő határozatlan eredmények valószínűleg a teszt megismétlésekor sem változnak meg, csak akkor, ha az ELISA teszteléskor történt hiba. A határozatlan értékeket határozatlanként kell leletezni. Az orvos belátása szerint dönthet új minta levételéről vagy más eljárás végrehajtásáról.

Alvadt plazmaminták A plazmaminták hosszú idejű tároláskor kialakuló rögösödés esetén a minta centrifugálásával ülepíthetők a vérrögök, és lehetővé válik a plazma pipettázása.

24


Hibaelhárítási útmutató Ez a hibaelhárítási útmutató bármely felmerülő hiba esetén segíthet a megoldásban. Részletesebb útmutató található a következő honlapon lévő technikai információk között: www.QuantiFERON.com. Az elérthetőségek a hátsó borítón találhatók. ELISA – hibaelhárítás Nem specifikus szín kialakulása Lehetséges ok

Megoldás

a) A lemez nem megfelelő mosása

A tálcát legalább 6 alkalommal kell átmosni lyukanként 400 µl mosó pufferrel. Az alkalmazott mosófolyadéktól függően 6-nál többszöri átmosásra is szükség lehet. Ajánlott legalább 5 másodperces áztatási időt hagyni az egyes ciklusok között.

b) Az ELISA lemez lyukai közötti keresztfertőzés

A kockázat minimalizálása érdekében ügyeljen a minták pipettázásakor és keverésekor.

c) A készlet vagy összetevői lejártak

Ügyeljen arra, hogy a készletet a lejárati időn belül felhasználja. A rehidratált standardot és konjugátum 100× koncentrátumot a rehidratálás dátumát követő három hónapon belül fel kell használni.

d) Az enzimszubsztrátoldat szennyezett

Kékes elszíneződés esetén a szubsztrátumot hulladékba kell helyezni. Ügyeljen a reagenstartály tisztaságára.

e) Elválasztás előtt felkeveredik a plazma a QFT csövekben

A centrifugálás és az elválasztás között el kell kerülni a plazma felkeverését a pipetta fel-le mozgatásával vagy bármilyen más módon. A teljes folyamat során gondosan meg kell őrizni a gélfelület sértetlenségét.

Alacsony leolvasott optikai denzitás a standardoknál Lehetséges ok

Megoldás

a) Standardhígítási hiba

Ellenőrizze, hogy a QFT ELISA kézikönyvben foglaltak szerint történt-e a készletben lévő standard hígítása.

b) Pipettázási hiba

A pipettákat mindig a gyártói utasítások betartásával kell kalibrálni és alkalmazni.

c) Túl alacsony inkubálási hőmérséklet

Az ELISA inkubálását szobahőmérsékleten kell elvégezni (22±5 °C).

d) Túl rövid inkubálási idő

A konjugátumot, a standardokat és a mintákat tartalmazó lemezt 120±5 percen át kell inkubálni. Az enzimszubsztrátoldatot 30 percen át kell a lemezen inkubálni.

e) Nem megfelelő szűrő a lemezbeolvasásnál

A lemezbeolvasásnak 450 nm-en kell történnie 620–650 nm-es szűrővel.

f) Túl hideg reagensek

A konjugátum 100× koncentrátum kivételével minden reagenst szobahőmérsékletre kell hozni a tesztelés megkezdését megelőzően. Ehhez körülbelül 1 óra szükséges.

g) A készlet vagy annak összetevői lejártak

Ügyeljen arra, hogy a készletet a lejárati időn belül felhasználja. A rehidratált standardot és konjugátum 100× koncentrátumot a rehidratálás dátumát követő 3 hónapon belül fel kell használni.


25

ELISA – hibaelhárítás Magas háttérszíneződés Lehetséges ok

Megoldás



b) Túl magas inkubálási hőmérséklet

Az ELISA inkubálását szobahőmérsékleten kell elvégezni (22±5 °C).

c) A készlet vagy összetevői lejártak

Ügyeljen arra, hogy a készletet a lejárati időn belül felhasználja. A rehidratált standardot és konjugátum 100× koncentrátumot a rehidratálás dátumát követő 3 hónapon belül fel kell használni.

d) Az enzimszubsztrátoldat szennyezett

Kékes elszíneződés esetén a szubsztrátumot hulladékba kell helyezni. Ügyeljen a reagenstartály tisztaságára.

Nem lineáris standardgörbe és kétszeres változékonyság Lehetséges ok

Megoldás



b) Standardhígítási hiba

Ellenőrizze, hogy a QFT ELISA kézikönyv utasításai szerint történt-e a standard hígítása.

c) Elégtelen keverés

A reagenseket a lemezre töltésük előtt alaposan fel kell keverni átfordítással vagy óvatos vortexeléssel.

d) Nem egyenletes pipettázás vagy teszt előkészítésének megszakítása

A minták és a standardok kitöltését folyamatosan kell végezni. Minden reagenst elő kell készíteni a teszt megkezdése előtt.

A teszteljárást bemutató videót, valamint a legtöbb technikai probléma megoldását megtalálhatja a Gnowee™ webhelyen, ha regisztrál közvetlenül a www.gnowee.net weblapon az online eléréshez. Terméktájékoztató és technikai útmutató ingyenesen rendelkezésre áll a QIAGEN forgalmazójától, illetve ha felkeresi a www.QuantiFERON.com webhelyet.

26


11. Bibliográfia A Gnowee QuantiFERON referencia könyvtárában (reference library) megtalálható a QFT referenciák átfogó listája a www.gnowee.net webhelyen. 1.

Andersen, P. et al. (2000) Specific immune-based diagnosis of tuberculosis. Lancet 356, 1099.

2.

Balcells, M.E. et al. (2008) A comparative study of two different methods for the detection of latent tuberculosis in HIV-positive individuals in Chile. Int. J. Infect. Dis. 12, 645.

3.

Bartalesi, F. et al. (2009) QuantiFERON-TB Gold and TST are both useful for latent TB screening in autoimmune diseases. Eur. Respir. J. 33, 586.

4.

Bocchino, M. et al. (2008) Performance of two commercial blood IFN-gamma release assays for the detection of Mycobacterium tuberculosis infection in patient candidates for anti-TNF-alpha treatment. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27,907.

5.

Brock, I. et al. (2006) Latent tuberculosis in HIV positive, diagnosed by the M. tuberculosis specific interferon-gamma test. Respir. Res. 7, 56.

6.

Chun, J.K. et al. (2008) The role of a whole blood interferon gamma assay for the detection of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated children. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 62, 389.

7.

Connell, T.G. et al. (2008) A three-way comparison of tuberculin skin testing, QuantiFERON-TB gold and T-SPOT.TB in children. PLoS ONE 3, e2624. doi: 10.1371/journal.pone.0002624.

8.

Detjen, A.K. et al. (2007) Interferon-gamma release assays improve the diagnosis of tuberculosis and nontuberculous mycobacterial disease in children in a country with a low incidence of tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 45, 322.

9.

Diel, R. et al. (2009) Comparative performance of tuberculin skin test, QuantiFERON-TB-Gold In-Tube assay, and T-Spot.TB test in contact investigations for tuberculosis. Chest 135, 1010.

10. Diel, R. et al. (2008) Predictive value of a whole-blood IFN-γ assay for the development of active TB disease. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177, 1164. 11. Diel, R. et al. (2006) Tuberculosis contact investigation with a new, specific blood test in a low-incidence population containing a high proportion of BCG-vaccinated persons. Respir. Res. 7, 77. 12. Dogra, S. et al. (2007) Comparison of a whole blood interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for the detection of tuberculosis infection in hospitalized children in rural India. J. Infect. 54, 267. 13. Drobniewski, F. et al. (2007) Rates of latent tuberculosis in health care staff in Russia. PLoS Med. 4, e55. 14. Gerogianni, I. et al. (2008) Whole-blood interferon-gamma assay for the diagnosis of tuberculosis infection in an unselected Greek population. Respirology 13, 270. 15. Harada, N. et al. (2008) Comparison of the sensitivity and specificity of two whole blood interferongamma assays for M. tuberculosis infection. J. Infect. 56, 348. 16. Higuchi, K. et al. (2009) Comparison of performance in two diagnostic methods for tuberculosis infection. Med. Microbiol. Immunol. 198, 33. 17. Kang, Y.A. et al. (2005) Discrepancy between the tuberculin skin test and the whole-blood interferon gamma assay for the diagnosis of latent tuberculosis infection in an intermediate tuberculosis-burden country. JAMA 293, 2756. 18. Katiyar, S.K. et al. (2008) Use of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube test to monitor treatment efficacy in active pulmonary tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12, 1146. 19. Kipfer, B. et al. (2008) Tuberculosis in a Swiss army training camp: contact investigation using an Interferon gamma release assay. Swiss. Med. Wkly. 138, 267. 20. Luetkemeyer, A. et al. (2007) Comparison of an interferon-gamma release assay with tuberculin skin testing in HIV-infected individuals. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175, 737. QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA kézikönyv 2013/07

27

21. Mackensen, F. et al. (2008) QuantiFERON TB-Gold - A new test strengthening long-suspected tuberculous involvement in serpiginous-like choroiditis. Am. J. Ophthalmol. 146, 761. 22. Manuel, O. et al. (2007) Comparison of Quantiferon-TB Gold with tuberculin skin test for detecting latent tuberculosis infection prior to liver transplantation. Am. J. Transplant. 7, 2797. 23. Matulis, G. et al. (2007) Detection of latent tuberculosis in immunosuppressed patients with autoimmune diseases performance of a Mycobacterium tuberculosis antigen specific IFN-gamma assay. Ann. Rheum. Dis. 67, 84. 24. Mirtskhulava, V. et al. (2008) Prevalence and risk factors for latent tuberculosis infection among health care workers in Georgia. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 12, 513. 25. Nakaoka, H. et al. (2006) Risk for tuberculosis among children. Emerging Infect. Dis. 12, 1383. 26. Pai, M. et al. (2005) Mycobacterium tuberculosis infection in health care workers in rural India: comparison of a whole-blood, interferon-g assay with tuberculin skin testing. JAMA 293, 2746. 27. Ponce de Leon, D. et al. (2008) Comparison of an interferon-gamma assay with tuberculin skin testing for detection of tuberculosis (TB) infection in patients with rheumatoid arthritis in a TB-endemic population. J Rheumatol. 35, 776. 28. Richeldi, L. et al. (2008) Prior tuberculin skin testing does not boost QuantiFERON-TB results in paediatric contacts. Eur. Respir. J. 32, 524. 29. Rothel, J.S. and Andersen, P. (2005) Diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: is the demise of the Mantoux test imminent? Expert Rev. Anti Infect. Ther. 3, 981. 30. Schoepfer, A.M. et al. (2008) Comparison of interferon-gamma release assay versus tuberculin skin test for tuberculosis screening in inflammatory bowel disease. Am. J. Gastroenterol. 103, 2799. 31. Silverman, M.S. et al. (2007) Use of an interferon-gamma based assay to assess bladder cancer patients treated with intravesical BCG and exposed to tuberculosis. Clin. Biochem. 40, 913. 32. Stebler, A. et al. (2008) Whole-blood interferon-gamma release assay for baseline tuberculosis screening of healthcare workers at a Swiss university hospital. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 29, 681.

28


12. Technikai ügyfélszolgálat A technikai ügyfélszolgálat elérhetősége: www.QuantiFERON.com Asia-Pacific  [email protected] Europe  [email protected] Middle East/Africa  [email protected] USA/Canada  [email protected] Latin America (not including Brazil or Mexico)  [email protected] Mexico  [email protected] Brazil  [email protected]


29

13. Rövidített teszteljárás 1. fázis – a vér inkubálása 1. Vegye le a pácienstől a vért a vérvételi csövekbe, rázza meg a csöveket tíz (10) alkalommal kellő erővel ahhoz, hogy a cső teljes belső felszínére eljutó vér leoldja a csőfalon található antigéneket. 2. A csöveket álló helyzetben inkubálja 37±1 °C-on 16–24 órán keresztül.

3. Inkubálás után centrifugálja a csöveket 15 percig 2000–3000 RCF (g) fordulatszámon, hogy a plazma és a vörösvértestek elváljanak. 4. A centrifugálás és az elválasztás művelete között kerülni kell a pipetta használatát, illetve a plazma bármilyen felkeverését. Végig gondosan meg kell őrizni a gélfelület sértetlenségét.

2. fázis – IFN-γ ELISA 1. Legalább 60 percen keresztül engedje, hogy az ELISA összetevői a konjugátum 100× koncentrátum kivételével felvegyék a (22±5 °C) szobahőmérsékletet. 2. Rehidratálja a készletben lévő standardot 8,0 IU/ml mennyiségre desztillált vagy ioncserélt vízzel. Készítsen négy (4) standard hígítást. 3. Rehidratálja a liofilizált konjugátum 100× koncentrátumot desztillált vagy ioncserélt vízzel. 4. Készítsen készre hígított konjugátumot a zöld hígítóval, majd töltsön 50 µl mennyiséget minden lyukba. 5. Töltsön 50 µl teszt plazmamintát és 50 µl standardot a megfelelő lyukakba. Keverje a rázógéppel. 6. Inkubálja 120±5 percig szobahőmérsékleten. 7. A lyukakat legalább 6 alkalommal mossa át lyukanként 400 µl mosó pufferrel.

30


8. Töltsön 100 µl enzimszubsztrátoldatot a lyukakba. Keverje a rázógéppel. 9. Inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten. 10. Töltsön 50 µl enzimleállító oldatot a lyukakba. Keverje a rázógéppel.

11. Olvassa be az eredményeket 450 nm-en 620–650 nm-es referenciaszűrővel. 12. Elemezze az eredményeket.


31

Jelentős módosítások A QFT ELISA kézikönyv jelen (1075115HU 01 ver.) kiadásában történt jelentős módosítások összefoglaló táblázata: Fejezet

Oldal

4. Figyelmeztetések és óvintézkedések

9–10

12. Technikai ügyfélszolgálat

32

29

Módosítás(ok) Módosítások egyes ELISA összetevők eltérő gyári számú készletben való használatához. A technikai ügyfélszolgálat új e-mail címei.


®

®

®

®

®

®

Védjegyek: QIAGEN , QFT , QuantiFERON (QIAGEN Csoport); Microsoft , Excel (Microsoft); ProClin (Rohm and Haas Co.). A QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA korlátozott licencszerződése A termék használatával a vásárló vagy felhasználó elfogadja a jelen termékre vonatkozó feltételeket: 1.

A terméket kizárólag a hozzá tartozó protokollok és a jelen kézikönyv szerint szabad használni, és csak a készletben szereplő összetevőkkel. A QIAGEN egyetlen szellemi terméke esetén sem engedélyezi, hogy a tartozék összetevőket bármely, a készlethez nem tartozó összetevővel együtt használják, kivéve a termékhez mellékelt protokollok, illetve a jelen kézikönyvben leírtak szerint.

2.

A kifejezetten megemlített licenceken kívül a QIAGEN nem vállal felelősséget azért, hogy a készlet, illetve annak használata nem sérti mások jogait.

3.

Ha a QIAGEN másképp nem rendelkezik, akkor a készletre és összetevőire egyszeri használatra szóló engedély vonatkozik, és tilos újrafelhasználni, felújítani vagy ismét eladni.

4.

A QIAGEN az itt leírtakon kívül kifejezetten kizár minden más konkrét vagy vélelmezett jogot.

5.

A készlet vásárlója és felhasználója elfogadja, hogy tilos olyan lépéseket tennie vagy másvalakinek megengednie, amely a fent tiltott cselekedetek bármelyikét eredményezné vagy elősegítené. A QIAGEN a jelen korlátozott licencszerződésben foglalt tilalmak betartatása érdekében jogosult bármely bírósághoz fordulni, és az azzal kapcsolatos összes vizsgálati és perköltséget behajtani, beleértve a készlethez, illetve annak összetevőihez kapcsolódó, a jelen korlátozott licencszerződésből vagy bármely szellemi termékhez fűződő jog érvényesítéséből eredő ügyvédi költséget.

A legfrissebb licencfeltételek: www.qiagen.com

© 2013 Cellestis, QIAGEN Company, minden jog fenntartva.

Phone: (Australia) +613-9840-9800 E-mail: [email protected]

1075115HU 01 ver.

www.QuantiFERON.com

QuantiFERON -TB Gold (QFT ) ELISA kézikönyv 2 96 (katalógusszám: )

Recommend Documents