Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016
SKRINING AWAL BAKTERI PENGHASIL BIOSURFAKTAN YANG DIISOLASI DARI WAIGEO RAJA AMPAT PAPUA Preliminary Screening Of Biosurfactan Producing Microorganisms Isolated Waigeo Districts Raja Ampat Papua Rini Riffiani and Nunik Sulistinah Microbiology Division Research Center for Biology-Indonesian Institute of Sciences Cibinong Science Center Jl. Jakarta-Bogor Km 46, Cibinong Email:
[email protected] Abstrak Biosurfaktan merupakan senyawa aktif yang disintesa oleh mikroorganisme yang dieksresikan secara ekstraselular, mengandung gugus hidrophilik dan hidprophobik yang dapat menurunkan tegangan permukanan. Selain itu biosurfaktan secara ekstraselular menyebabkan emulsifikasi hidrokarbon sehingga hidrokarbon dapat larut dalam air. Saat ini biosurfaktan telah diaplikasikan untuk bioremediasi daerah tercemar logam berat, perairan yang terkontaminasi oleh limbah minyak, zat penambah pada kosmetik dan sebagai biokontrol. Pada penelitian ini sampel diperoleh dari beberapa daerah di Waigeo Raja Ampat, yang diduga saat ini mulai tercemar tumpahan minyak dari kegiatan transportasi. Untuk menghindari terjadinya degradasi jumlah bakteri dan kematian bakteri pada sampel dilakukan pengayaan menggunakan media artificial seawater mineral salt medium (ONR7a) yang ditambahkan cruide oil. Sebanyak 25 isolat bakteri berhasil diisolasi dan ditumbuhkan pada media marine agar. Masing-masing isolate kemudian diuji kemampuan menghasilkan biosurfactan menggunakan metode emulsifikasi menggunakan parafin, oil spreading dan tes. Hasil menunjukkan ada 3 isolat yang mampu menghasilkan biosurfaktan . Berdasarkan analisis penjajaran urutan nukleotida parsial gen pengkode 16S rDNA menggunakan program BLAST, ketiga bakteri tersebut mempunyai tingkat kesamaan tertinggi dengan Bacillus pumilus strain ZH1-6 16S, Rhodobacteraceae bacterium F9, Marine bacterium MBIC1357. Kata Kunci: Biosurfaktan, Waigeo, emulsifikasi, oil spreading , tes parafin, 16S rDNA Abstract Biosurfactants are unique class of compounds produced by microorganism, that have been show to have a variety of potential application in remediation of organic and metal contaminated sites, in enhanced oil recovery, as cosmetic additives, and in biological control. Biosurfactants can reduce surface tension between aqueos solutions and hydrocarbonmixtures. In this study we collected seawater samples from different area in Waigeo Raja Ampat and then cultured by enriching with artificial seawater salt medium (ONR7a) and crude oil. Twenty five bacterial strains were isolated and culture in marine agar. Each isolated was sampling to confirm the ability in biosurfactan production. These were conducted using emulsification, oil spreading technique and paraffin test. The result reveal that three strain of bacteria presented positive activity can produce biosurfactant. Molecular identification of the isolates based on 16S rRNA gene sequences. Three isolates of bacteria producing biosurfactdan were obtained from Raja Ampat Island. These isolates of bacteria had the highest similarity with Bacillus pumilus strain ZH1-6 16S, Rhodobacteraceae bacterium F9, Marine bacterium MBIC1357 Key Words: Biosurfactant, Waigeo, emulsification, oil spreading, paraffin test
740
Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016
PENDAHULUAN Pencemaran lingkungan oleh senyawa hidrokarbon minyak terus mengalami peningkatan dan telah menimbulkan dampak yang berarti bagi kesehatan organism hidup (Atlas, 1991). Sejalan dengan peningkatan daerah tujuan wisata yang semakin mendunia, Kepulauan Raja Ampat telah mengalami perubahan karena meningkatnya kegiatan transportasi menggunakan kapal, eksploitasi sumber daya perairan dan hampir 99% mata pencaharian warga ada di laut. Umumnya warga setempat memiliki kendaraaan laut yang menggunakan bahan bakar minyak yang dapt mencemari perairan laut ( Kadarusman, 2007). Biodegradasi hidrokarbon oleh mikroorganisme telah diketahui sebagai mekanisme dalam proses eliminasi senyawa hidrokarbon di laut. Alternatif lain untuk meningkatan biodegradasi hidrokarbon pada crude oil adalah penggunaan biosurfaktan. Bio-surfaktan adalah kelompok molekul yang memiliki sifat aktif permukaan. Sifat ini disebabkan biosurfaktan merupakan molekul kompleks yang memiliki gugus hidrofilik dan hidrofobik, sehingga dapat menurunkan tegangan permukaan pada ruang antar air dan minyak (Vater et al.,2002). Biosurfaktan dapat berperan dalam melarutkan senyawa hidrofobik seperti minyak bumi dengan membentuk struktur micelle (Al-Tahhan et al., 2000). Hal ini menyebabkan tingkat dispersi dan emulsifikasi minyak bumi meningkat dalam air. Dalam upaya mengoptimalkan bioremediasi lingkungan perairan di Indonesia, pencarian strain lokal yang mempunyai kapasitas tinggi dalam mendegradasi senyawa pencemar dan menghasilkan biosurfaktan sangat diharapkan. Diharapkan dari penelitian ini dapat diperoleh bakteri unggulan dan metode yang tepat dalam skrining bakteri penghasil biosurfaktan yang dapat digunakan sebagai landasan untuk pengembangan teknologi bioremidiasi hidrokarbon di lepas pantai. BAHAN DAN METODE PENELITIAN Sampling Sampel penelitian ini diambil dari Waigeo Raja Ampat Papua Eksplorasi dan pengumpulan sampel yang dilakukan berasal dari air laut. Sampel air yang diambil sebanyak 100 mL. Untuk menghindari terjadinya degradasi jumlah bakteri bahkan kematian bakteri pada sampel, dilakukan metode pengayaan atau enrichment pada sampel air laut. Proses pengayaan ini menggunakan Medium ONR7a yang ditambahkan crude oil. Media ONR7a yang digunakan dibuat dengan komposisi per liter: 22,79 g NaCl, 3,99 g Na2SO4, 0,72 g KCl, 83 mg NaBr, 31 mg NaHCO3, 27 mg H3BO3, 2.6 g NaF, 0,27 g NH4Cl, 83 mg Na2HPO4, 1,3 g TAPSO, 11,18 g MgCl2, 1,46 g CaCl2, 24 mg SrCl2, 2 mg FeCl2 (Sheryl et al, 1995). Isolasi mikroba penghasil biosurfaktan 1. Teknik Oil Spreading Mikroba penghasil biosurfaktan diisolasi dengan menggunakan medium SW yang diaugmentasi dengan crude oil. Koloni yang membentuk zona bening disekitar koloni yang tumbuh diprediksi menghasilkan biosurfaktan. Media SW yang digunakan dibuat dengan komposisi per liter : 1 g NH4NO3, 0,2 g KH2PO4, 20 mg Feric Sitrat, 20 mg yeast extract, 19 gr agar. 741
Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016 Uji Konfirmasi
Uji konfirmasi dilakukan untuk memastikan kemampuan biak terseleksi dalam menghasilkan biosurfaktan. Pada uji konfirmasi dilakukan dengan menginokulasikan kembali biak terseleksi pada medium SW cair dan ditambahkan cruide oil (100 µl/100 ml media SW cair) kemudian diamati kelarutan crude oil dibandingkan dengan kontrol. 2. Teknik Emulsifikasi menggunakan parafin Aktivitas emulsifikasi diukur dengan menggunakan metode Johnsons et al.(1992). Sebanyak 4,5 ml supernatan ditambah dengan 0,5ml hidrokarbon uji (1 gr parafin padat). Setelah divorteks selama 1 menit, campuran tersebut diukur kestabilan emulsinya dengan mengukur nilai OD campuran setelah inkubasi selama 2 jam, pada panjang gelombang 610nm. Kontrol terdiri dari air mineral sintetis dan hidrokarbon uji. 3. Uji Drop Collapse Aktivitas biosurfaktan diuji lebih lanjut dengan menggunakan metode collapse drop. Sebanyak 0.1 ml supernatan diteteskan ke atas 0.1 ml hidrokarbon uji yang berbeda (heavy crude-Suratmin) dari ketinggian tertentu. Aktivitas biosurfaktan didasarkan atas penambahan luas permukaan senyawa uji dibandingkan kontrol air laut steril (Plaza et al.2006) Identifikasi Biakan Murni Bakteri Penghasil Biosurfaktan
Identifikasi yang dilakukan adalah identifikasi secara molekular dilakuan dengan 16S rRNA. Analisis molekuler yang dilakukan berupa ekstraksi DNA dan PCR amplifikasi, purifikasi PCR produk dan sekuensing. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengujian bakteri laut penghasil biosurfaktan dengan menggunakan tiga metode adalah sebagai berikut a. Metode Oil Spreading Dengan menggunakan media marine agar, bakteri laut diisolasi dari media pengayaan, didapatkan 25 isolat (Gambar 1) yang akan diuji awal kemampuan menghasilkan biosurfaktan.
Gambar 1. Isolat bakteri uji Mikroba penghasil biosurfaktan diisolasi dengan menggunakan medium SW yang diaugmentasi dengan crude oil. Koloni yang membentuk zona bening disekitar koloni yang tumbuh diprediksi menghasilkan biosurfaktan. Hal ini ditampilkan pada Gambar 2. Pada kontrol tidak terlihat perubahan dan terbentuk zona bening karena tidak ada aktivitas 742
Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016
bakteri. Pada uji konfirmasi dilakukan dengan menginokulasikan kembali biak terseleksi pada medium SW cair dan ditambahkan. Pada uji konfirmasi dilakukan dengan menginokulasikan kembali biak terseleksi pada medium SW cair dan ditambahkan cruide oil (100 µl/100 ml media SW cair) il (100 µl/100 ml media SW cair). Pada gambar 2.B terlihat tabung perlakuan dengan menambahan isolat terseleksi lebih larut bila dibandingkan dengan kontrol. Hal ini kemungkinan adanya pembentukan biosurfaktan oleh bakteri-bakteri. A
B
Gambar 2. Zona bening disekitar koloni bakteri yang diduga menghasilkan biosurfaktan (A), Uji konfirmasi kelarutan crude oil pada perlakuan bila dibandingkan dengan kontrol (B) Pada proses pembentukan biosurfaktan, substrat yang berbentuk cairan akan teremulsi ke luar dan menyebar pada permukaan sel mikroorganisme. Substrat yang terbentuk tersebut merupakan misel. Misel-misel yang terbentuk akan teroksidasi oleh eksoenzim dan diangkut masuk ke dalam sel bakteri untuk digunakan (Martienssens et al., 2003). Dari 25 isolat yang memiliki kemampuan menghasilkan biosurfaktan yaitu 8 isolat. B. Teknik emulsifikasi menggunakan parafin Pada uji menggunakan parafin, hanya 6 isolat yang kemungkinan menghasilkan biosurfaktan, hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya emulsi dan supernatan yang terlihat keruh bila dibandingkan dengan kontrol (Gambar 3 A). Setelah 2 jam, hasil pengukuran OD isolat pada panjang gelombang 610 nm menunjukkan bahwa isolate dengan kode R8 menghasilkan tingkat kekeruhan yang paling tinggi
743
Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016
A
Gambar 3. Uji emulsifikasi menggunakan parafin (A), supernatant yang diukur pada panjang gelombang 610 nm Fungsi biosurfaktan bagi mikroorganisme masih belum jelas. Diduga biosurfactant membantu hidrolisis senyawa yang bersifat hidrophobic menjadi hidrophilic. Membantu akses nutrient untuk mikroba, meningkatkan tingkat adaftasi pada lingkungan kritis, membantu perlekatan sel dan menghambat pertumbuhan bakteri lain ( Maneerat and Phetrong, 2007) C. Uji Drop Collapse Pada uji drop collapse, bila pada supernatan bakteri ditambahkan 1 tetes oil kemudian menjadi mendatar atau melebar (Gambar 4) maka bakteri positif menghasilkan biosurfaktan, bila tetesan bentuknya tetap tidak ada perubahan berarti menunjukkan hasil negatif (Plaza et al, 2006). Pada uji menggunakan Drop Collapse hanya ada 3 isolat yang menunjukkan hasil yang positif.
744
Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016
Gambar. 4. Uji Drop Collapse Hasil Skrining bakteri yang berpotensi menghasilkan biosurfaktan mengggunakan 3 metode tercantum pada table 1 berikut. Dari hasil skrining 3 isolat yaitu R3, R5 dan R8 menunjukkan hasil yang positif pada ketiga macam metode skrining. Tabel 1. Skrining bakteri laut yang berpotensi menghasilkan biosurfaktan menggunakan 3 metode Kode Isolat
Titik Koordinat
Oil spreading
Emulsifikasi menggunakan parafin
Drop Collapse
R-3
S: 00.16.105 E: 130.50.465
+
+
+
R-4
S: 00.13.256 E: 130.46.465
+
+
-
R-5
S: 00.10.411 E: 130.44.086
+
+
+
R-6
S: 00.07.597 E: 130.41.032
+
+
-
R-8
S: 00.05.393 E: 130.40.176
+
+
+
R-9
S: 00.06.322 E: 130.41.038
+
-
-
R-18
S: 00.16.460 E: 130.54.000
+
-
-
S: 00.16.216 + + E: 130.53.583 Ket: (+) menghasilkan biosurfaktan, (-) tidak menghasilkan biosurfaktan R-19
-
Identifikasi Kultur Bakteri Secara Molekuler Ketiga bakteri potensial, yaitu R3, R5 dan R8 yang telah diisolasi DNA genomnya dengan mengunakan Prepman Ultra DNA Isolation Kit, dideteksi dengan metode elektroforesis dan hasilnya didapatkan pita DNA yang berukuran diatas 1500 bp (base pairs). Selanjutnya, hasil isolasi DNA diamplifikasi dengan metode PCR. Hasil amplifikasi 745
Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016
dideteksi dengan menggunakan teknik elektroforesis dimana gen 16S rRNA yang telah berhasil diamplifikasi ditunjukkan berupa pita DNA yang jika disejajarkan dengan penanda ukuran DNA, memiliki ukuran 1500 bp (gambar 5)
Gambar 5. Produk PCR dari DNA bakteri R3, R5, R8 Berdasarkan analisis penjajaran urutan nukleotida parsial gen pengkode 16S rRNA menggunakan program BLAST. Berikut ini adalah tiga bakteri yang memiliki nilai kesamaan tertinggi setelah dibandingkan dengan urutan nukleotida pada program BLAST (tabel 2) Tabel 2. Hasil analisis penjajaran urutan nukleotida parsial gen pengkode 16S rRNA dari 3 kultur bakteri dengan menggunakan program BLAST No Isolat Nilai kesamaan tertinggi (BLAST) Persentase kesamaan (%) 1. 2. 3.
R3 R5 R8
Bacillus pumilus strain ZH1-6 16S, Rhodobacteraceae bacterium F9 Marine bacterium MBIC1357.
99 100. 99
KESIMPULAN Tiga bakteri penghasil biosurfaktan dari kepulauan Raja Ampa telah diisolasi menggunakan 3 macam teknik isolasi, masing-masing adalah Bacillus pumilus strain ZH16 16S, Rhodobacteraceae bacterium F9, Marine bacterium MBIC1357. UCAPAN TERIMAKASIH Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. I Made Sudiana dan Arif Nurkanto, MSi, Neil Priharto, yang telah memberikan kontribusi yang besar selama penelitian. DAFTAR PUSTAKA Al-Tahhan RA, Sandrin TR, Badour AA, and. Maier RM. 2002. Rhamnolipid-Induced removal of lipopolysccharide from Pseudomonas aeruginosa: Effect on cell surface Properties and Interaction with Hydrophobic substrates. J. Appl. Environ. Microbiol 66: 3262-3268 Atlas R.M. 1991.Microbial Hydrocarbon Degradation Bioremidation of Oil Spil. J. Chem. Tech Biotechnol 52: 149-156 746
Prosiding Seminar Nasional II Tahun 2016, Kerjasama Prodi Pendidikan Biologi FKIP dengan Pusat Studi Lingkungan dan Kependudukan (PSLK) Universitas Muhammadiyah Malang Malang, 26 Maret 2016
Francy DS. Thomas JM, Raymond RL and Ward CH, 1991. Emulsification of Hydrocarbon by Surface Bacteria. J. Ind Microbiol 8:234-246 Johnsons V. Sigh M, Saini VS, Andikari DK, Sista V and Yadav NK. 1992. Bioemulsifer Production Using non Aseptic Fermentation of Mixed Cultures. J Biotechnol and Bioeng 44:661-666 Kadarusman, 2007. Studi Awal Pengeboman Ikan di Raja Ampat, Suatu Ancaman Megadiversitas, Jantung Segitiga Karang Dunia. Factsheet Apsor: www.aprordkp.com. Akademi Perikanan Sorong-DKP Sorong, Papua. Martienssen, M., Reichel,O., and Scheimer, M. 2003. Use of surfactants to improve the biological degradability of petroleum hydrocarbons. Chemie Ingenieur Teck 75 (11): 1749-1755 Maneerat S. and Phetrong Kulnaree. 2007. Isolation of Biosurfactant-producing marine bacteria and characteristics of selected biosurfactant. J.Sci. Technol. 29(3): 781791 Plaza, G.A., Zjawiony, I & Banat, I.M. 2006. Use of different methods for detection of thermophilic biosurfactant-producing bacteria from hydrocarbon-contaminated and bioremediated soils. Journal of Petroleum Science and Engineering 50: 71-77 Sheryl, E Dykstershouse, James P. Gray, Russell P. Herwig, Canolara and James T. Staley. 1995. Cycloclasticus pugetii gen. Nov, sp. Nov, on Aromatic HydrocarbonDegrading Bacterium from Marine Sadiments. International Journal of Systematic Bacteriology. 116-123. Vater J, Kablitz B, Wilde C, Franke P, Mehta N, and Cameotra SS. 2002. Matrix assisted Laser Desorption Ionization-time of Flihgt Mass Spectrometry of Lipopeptide biosurfactant in Whole Cell and Culture Filtrates of Bacillus subtilis C-1 Isolated from Petroleum Slude. J. Appl. Environ. Microbiol 68: 6210-6219.
747
