Protinádorová imunita a nové přístupy při léčení nádorových onemocnění Prof. RNDr. Blanka Říhová, DrSc. Mikrobiologický ústav Akademie věd ČR
[email protected] T
HTT
T
H
Nádorová onemocnění stále patří mezi závažné zdravotní problémy a hlavní příčinu morbidity a mortality jak dospělých tak bohužel i dětí. Nádory způsobuje nekontrolované dělení a rozsev klonů nádorově transformovaných buněk. Růst maligních nádorů závisí v prvé řadě na dělící schopnosti (proliferační kapacitě) nádorových buněk a také na jejich schopnosti usazovat se v místech vzdálených od původního (primárního) nádoru, říkáme že metastazují. Kromě toho existují důkazy o tom, že maligní nádory používají řadu pasivních i aktivních mechanizmů tak, aby unikly pozornosti hostitelské obrany. Hypotéza tzv. imunitního dohledu byla poprvé vyslovena Sirem Macfarlanem Burnetem v padesátých letech minulého století. Předpokládala, že fyziologická funkce imunitního (obraného) systému spočívá v rozpoznání a včasném odstranění potenciálně nebezpečných transformovaných buněk před tím než vytvoří nádor a pokud k tomu přeci jenom dojde, tak k jeho odstranění. Existence tohoto imunitního dohledu nebyla nikdy definitivně ani potvrzena ani vyvrácena proto, že jeho
1
uplatnění může být u různých nádorových onemocnění různé. V současné době však nikdo nezpochybňuje fakt, že imunitní systém mnohé nádory rozpoznává a reaguje proti nim. Ale stejně jako je tomu u infekčních chorob, tato imunitní reakce je někdy nedokonalá a onemocnění nezabrání.
1 Nádorové buňky často (ale ne vždycky) obsahují specificky změněné, pro organizmus cizí nádorové antigeny. Většinou to jsou bílkoviny (proteiny), glykoproteiny nebo karbohydráty kterými na sebe nádorová buňka imunitní systém upozorňuje (obrázek č. 1). Normální zdravá buňka totiž na svém povrchu stále vystavuje buňce/tělu vlastní bílkoviny v komplexu s tzv. MHC (Major Histocompatibility Complex) glykoproteiny I. třídy. Jsou to transplantační antigeny, povrchové receptory imunokompetentních buněk které tak dávají tělu signál, že buňka obsahuje jen vlastní proteiny, není nebezpečná a není třeba ji likvidovat. V případě nádorové změny (maligní transformace) buňky dochází často (ale ne vždycky) k mutační změně vlastních bílkovin, vzniká pro nádor specifický protein, nádorový antigen. Jakmile je takový cizí, tělu neznámý protein vystaven na povrchu buňky v komplexu s MHC glykoproteiny I. třídy, je tato cytotoxickými CD8 + T lymfocyty (CTL) rozpoznána jako PPP
P
nebezpečná a zlikvidována. Cytotoxické lymfocyty jsou pro tento účel vybaveny řadou zabíjecích mechanizmů navozujících buněčnou smrt, apoptózu a cytolýzu.
2
2 Dnes nejenom víme, že organizmy se nádorům brání, ale víme také které buňky imunitního systému se této obranné reakce zúčastňují. Základní pokus je ilustrován na obrázku č. 2. U myší lze chemickým karcinogenem, methylcholantrenem (MCA) vyvolat typ nádoru, který je označován jako sarkom. Proteiny nádorových buněk takového sarkomu, který můžeme označit jako typ A, jsou jiné než proteiny sarkomu B. Sarkom A lze chirurgicky odstranit a transplantovat ho zpátky na čtyři různé druhy hostitelů. U původního hostitele nádor neporoste. Je to důkaz toho, že se u něho během primárního růstu vyvinula rezistence, která vedla k odhojení sekundárního nádoru. Mluvíme o tzv. imunologickém odhojení (rejekci). Je-li ale stejný nádor transplantován na naivního hostitele, to znamená na myš která se před tím se sarkomem A nikdy nesetkala, nádor poroste. Pokud jsou geneticky identické (inbrední, syngenní) myši nejprve podány zabité buňky sarkomu A, pak následná transplantace živých buněk pocházejících ze sarkomu A ke vzniku nádoru nepovede. Je to důkaz toho, že zabité buňky myš imunizovaly, aktivovaly její imunitní systém, který vzniku nádoru zabránil. Opět došlo k imunologickému odhojení (rejekci). Pokud ale jsou geneticky identické myši nejprve podány zabité buňky nepříbuzného sarkomu B, následná transplantace sarkomem A povede ke vzniku nádoru. Je to důkaz specificity imunologické odpovědi.
3
3 Experimentálně lze také prokázat, které z mnoha buněk imunitního systému jsou za imunologickou rejekci hlavně zodpovědné. Pokus ilustruje obrázek č. 3. Opět vyjdeme ze sarkomu A, který byl vyvolán methylcholantrenem. Z myši nesoucí nádor lze chirurgicky odstranit slezinu a z ní izolovat buňky označované jako CD8 + T lymfocyty. Jsou to ony P
P
cytotoxické T lymfocyty (CTL). Ty lze transplantovat do naivního, geneticky identického (syngenního) příjemce a současně mu transplantovat sarkom A, který však neporoste. Přenosem CD8 + T buněk (CTL) specifických pro sarkom A byl hostitel chráněn. Pokud P
P
ovšem jako kontrolu vezmeme geneticky identického příjemce kterému ochranné CTL transplantovány nebyly, nádor samozřejmě poroste.
4
Jak již bylo uvedeno, ačkoliv nádory pocházejí z vlastních tkání, vystavují často na svém povrchu mutacemi změněné molekuly, nádorové antigeny. Ty mohou, ale nutně nemusí souviset s maligní transformací. Velmi zjednodušeně lze nádorové antigeny rozdělit do pěti základních skupin. Jsou to a) produkty mutovaných onkogenů a supresorových genů nádorů. Jako příklady lze uvést Ras, p53 nebo Bcr-Abl. Takto změněné proteiny jsou přímo odpovědné za malignitu. Vznikají bodovými mutacemi, delecemi, chromosomálními translokacemi nebo inzercí virových geonomů do proto-onkogenů nebo supresorových genů nádorů. Mění tím jejich funkci. Z proto-onkogenů, kontrolujících buněčné dělení se stávají onkogeny neschopné dělení kontrolovat, mutované produkty supresorových genů nepředávají signalizaci nutnou pro navození apoptózy nebezpečné buňky. Protože tyto změněné proteiny se v normálních buňkách nevyskytují a ani se nikdy nevyskytovaly, mohou stimulovat imunitní odpověď b) produkty dalších mutovaných genů. Podstatné u nich je, že nejsou přímo zodpovědné za malignitu, jen maligní transformaci doprovázejí. Patří mezi ně například tzv. tumor-specifické transplantační antigeny (TSTA), které se typicky vyskytují u chemicky (MCA) indukovaných nádorů c) produkty nemutovaných genů, které jsou sice produkovány i normálními tkáněmi, ale v daleko menším množství než je tomu u nádorů. Těchto antigenů je v současné době známa celá řada, zejména u lidských nádorů (například melanomový antigen MAGE). Slouží zejména k zpřesnění diagnostiky d) antigeny kódované genomy onkogenních DNA a RNA virů. Do skupiny DNA virů patří například virus Epstein-Barrové (EBV) dávaný do souvislosti s B buněčnými lymfomy a nasofaryngeálními karcinomy nebo lidský papillomavirus (HPV) zmiňovaný v souvislosti s nádorem čípku. Jediný dobře definovaný lidský onkogenní RNA virus je lidský T lymfotropní virus-1 (HTLV-1) považovaný za etiologické agens (příčinu) lidské T buněčné leukémie/lymfomu dospělých (ATL). Ačkoliv virové antigeny vyvolávají specifickou imunitní reakci není zcela jisté, zda tato imunitní reakce před onemocněním skutečně chrání e) onkofetální antigeny. Nejznámější z nich jsou alfa-fetoprotein (AFP) a karcinoembryonální antigen (CEA). Jsou to bílkoviny, které jsou produkovány hlavně během
5
embryonálního života a u dospělých se objevují ve zvýšeném množství jen v souvislosti s patologickými stavy, nádory nebo i nespecifickými záněty.
4 Organizmy se před nádory chrání všemi dostupnými, dosud popsanými efektorovými mechanizmy mezi které řadíme T lymfocyty (pomocné T h a cytotoxické CTL), protilátky, BBB
B
přirozené zabíječe (Natural Killer cells, NK buňky) a makrofágy. Nádory se však případné imunitní reakci brání jak pasivně tak aktivně. Typickým příkladem takové obrany je ztráta povrchových transplantačních antigenů, MHC glykoproteinů I. třídy, která bývá důsledkem infekce některými onkogenními adenoviry (obrázek č. 4). Jak již bylo řečeno, MHC glykoproteiny I. třídy jsou mimořádně důležité povrchové molekuly, které tím že vystavují cizí změněné proteiny upozorňují imunitní systém, jmenovitě CTL, na cizorodost a tedy
6
i potenciální nebezpečnost příslušné buňky. Pokud MHC glykoproteiny I. třídy na buňkách chybí, k stimulaci CTL nedochází, cytotoxická imunitní reakce se nerealizuje a potenciálně nebezpečné, onkogenním virem infikované, buňky nejsou odstraněny. Existují ale působky jako je například interferon-γ (IFN-γ), cytokin, který dokáže expresi povrchových MHC glykoproteinů I.třídy obnovit a tím i obnovit cytotoxickou imunitní reakci. IFN-γ je dnes poměrně často používán při léčbě vybraných nádorových onemocnění. Právě popsaná schopnost je ale jenom jednou z mnoha protinádorových funkcí uvedeného cytokinu. Existuje mnoho dalších mechanizmů, které nádory využívají tak, aby případnou imunitní reakci hostitele blokovaly.
7
5
6
I když léčba nádorových onemocnění zaznamenala v posledních desetiletích nebývalý pokrok, ještě příliš mnoho pacientů tomuto onemocnění podlehne a je proto třeba vyhledávat nové a účinnější způsoby cytostatické léčby moderně kombinované i s imunoterapií. Mezi taková nadějná léčiva nové generace patří tzv. směrovaná léčiva, jejichž podstatu formuloval již v roce 1906 geniální německý lékař Paul Ehrlich, ale dlouhá léta nebyly k dispozici metody, které by jeho myšlenku realizovaly Směrovaná léčiva v podání Ehrlicha byla léčiva určená k léčení infekčních onemocnění, v současné době se spíše uvažuje o jejich využití v protinádorové léčbě. Optimálně by měla působit jen na nemocnou tkáň či orgán a nepoškozovat ostatní zdravé tkáně/orgány pacienta (obrázek č. 5 a 6). Prvním nebo skoro prvním pokusem o směrovaná léčiva byly imunotoxiny (obrázek č. 7). Jsou to v podstatě monoklonální protilátky (imunoglobuliny) namířené proti vybranému znaku (nádorovému antigenu, receptoru) na povrchu nádorových buněk na které je chemickou nebo-li kovalentní vazbou připojeno léčivo. Do imunotoxinů se na počátku
7
osmdesátých let minulého století vkládala obrovská naděje, která byla ale splněna jen částečně. Jejich klinické použití přináší totiž některé nežádoucí vedlejší příznaky nehledě na to, že přímá vazba léčiva na citlivé monoklonální protilátky vede často k poškození jejich rozeznávací schopnosti a v důsledku toho i k omezení jejich směrující schopnosti. 8 Některé problémy imunotoxinů řeší použití nosiče, na který je navázáno jak léčivo tak směrující protilátky. Světové laboratoře používají nejrůznější polymerní nosiče jak přirozené tak syntetické; dextrany, polygalakturonovou kyselinu, polyglutamovou kyselinu, poly(ethylen glykol), poly-L-lysin a v neposlední řadě také československý patent N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA). Jedná se o vodorozpustný syntetický kopolymer, na který je pomocí definované oligopeptidické spojky (většinou GlyPheLeuGly) kovalentní vazbou navázáno jak léčivo tak směrující molekula. Směrující molekulou nemusí být nutně jen protilátka, ale může to být lektin, karbohydrát, růstový faktor nebo jakákoliv jiná liganda, která má na nádorové buňce svůj receptor. Na obrázku č. 8 je znázorněn jeden z konjugátů na bázi HPMA, na který je přes tetrapeptid navázáno jako léčivo doxorubicin a jako směrující molekula monoklonální protilátka. Výběr uvedeného oligopeptidu GlyPheLeuGly nebyl zdaleka náhodný. Z mnoha desítek studovaných di-, tri- i tetrapeptidů byl nakonec vybrán takový který zaručoval, že komplex léčiva s nosičem je stabilní během transportu v krevním oběhu a léčivo se z něho uvolňuje pouze intracelulárně aktivitou lysozomálních enzymů, například katepsinem B. Jinými slovy, kovalentní vazba mezi nosičem a léčivem se štěpí díky enzymatické aktivitě lysozomálních proteáz. Taková nově vyvíjená léčiva se nejprve testují in vitro na buněčných kulturách (nádorových liniích) a teprve když je zřejmé že fungují, přistupuje se k modelům in vivo, modelovým nádorovým onemocněním. Nejvíce takových modelů je k dispozici u myší, ale používány jsou i modely krysí, králičí, prasečí a některé další. Na obrázku č. 9 je znázorněn typický pokus, kdy byla u myší nejprve vyvolána B buněčná leukémie (označovaná jako BCL1) a 11. den na to jim byly podány tři různé konjugáty na bázi HPMA. Kontrolní neléčené myši zmírají nejpozději do 40. dne. Konjugát označený jako Dox-HPMA-HuIg (doxorubicin navázaný na polymerní nosič na bázi HPMA, na kterém je také navázán nespecifický lidský imunoglobulin jako kontrola) je jen velmi málo účinný. Na druhé straně 8
9
10
jeden ze dvou různých konjugátů (jeden je tzv. klasický
PPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPPP
c P
a druhý hvězdicový * ), které P
P
obsahovaly místo nespecifického imunoglobulinu specifickou monoklonální protilátku namířenou proti povrchovému receptoru B buněk (B1 mAb) vyléčí 100% nemocných myší a druhý kolem 80%. Pokus je typicky ukončen až za několik měsíců kdy je jisté, že se u vyléčených myší znovu původní leukémie neobjeví. Stav imunitního systému vyléčených myší byl sledován tak, že myši znovu dostaly smrtelnou dávku leukemických buněk a následně byly ponechány bez léčení. Výsledek uvádí obrázek č.10. Kontrolní myši opět uhynuly kolem čtyřicátého dne, zatím co polymerním léčivem vyléčené a retransplantované myši ve velkém procentu přežívaly. Je to důkaz toho, že cytostatická léčba směrovaným léčivem na bázi HPMA nejenom že imunitní systém nepoškodila, ale dokonce ho do jisté míry stimulovala a dala tak vznik systémové protinádorové rezistenci. Tento fenomén někdy pracovně označujeme jako autologní vakcinaci jinak také vakcinaci vlastními nádorovými buňkami. Zajímavé bylo pozorování, že účinnější léčba vedla k navození méně výrazné systémové rezistence než méně účinná léčba (srovnej obrázky č. 9 a 10) a také to, že podání usmrcených nádorových buněk rezistenci prakticky nevyvolalo. Podobný výsledek byl získán opakovaně na třech různých nádorových modelech. Bylo tak potvrzeno, že léčba směrovanými léčivy na bázi HPMA má dva efekty, je cytostatická a současně imunoprotektivní až imunostimulační. K tomu, aby se druhá funkce těchto polymerních léčiv mohla dostatečně uplatnit je třeba, aby léčbou nepoškozený imunitní systém byl vystaven po určitou dobu dostatečnému množství nádorových buněk tj. dostatečnému množství nádorových antigenů. Pokud je totiž léčba příliš účinná tj. k odstranění nádoru a tím i jeho antigenů dojde příliš rychle nebo brzy (je podána buď příliš velká dávka nebo příliš brzy po transplantaci nádorových buněk, které se nestačí dostatečně namnožit) systémová rezistence se buď neustaví vůbec nebo jen ve velmi omezeném rozsahu. Kromě toho nesmí být imunitní
9
systém bojem s nádorem příliš vyčerpán. Například léčba zahájená u BCL1 leukémie až patnáctý den po transplantaci nádorových buněk také nevede k ustavení výrazné rezistence zřejmě proto, že v této době je kapacita imunitního systému v podstatě vyčerpána. 11
Jak již bylo řečeno v úvodu této přednášky, imunitní systém má řadu ejektorových mechanizmů, pomocí kterých se snaží nádorů zbavit. Takový přehled uvádí obrázek č. 11. Patří mezi ně jak elementy přirozené imunity (makrofágy, dendritické buňky, přirození zabíječi tzv. NK buňky) tak imunity specifické (pomocné CD4 + Th lymfocyty, cytoP
P
toxické CD8 + CTL a konečně i plasmatické
12
P
P
buňky produkující protilátky. Prokázali jsme, že na pozorované systémové rezistenci se rozhodujícím způsobem sice podílí CTL, ale důležitou roli hrají i NK a LAK tj. lymfokinem aktivované killer (zabíječi). Porovnávali jsme jejich aktivitu ve slezině myší nesoucích lidský kolorektální karcinom SW 620 (nádor tlustého střeva). Obrázek č. 12 jasně dokumentuje nízkou NK aktivitu u myší kontrolních a myší léčených volným tj. nemodifikovaným doxorubicinem, zatím co aktivita NK buněk u myší léčených polymerním konjugátem byla významně vyšší. V tomto případě ale šlo o polymerní konjugát (makromolekulární léčivo), který neobsahoval směrující složku (Dox-HPMA) a přesto byl účinnější než původní léčivo. Proč? 10
13
14
Směrování nemusí být jen aktivní, to je to které bylo právě popsáno, kdy léčivo je k cíli přiváděno směrující molekulou pro kterou existuje na cílové nádorové tkání odpovídající receptor. Výzkum ukázal, že kromě aktivního směrování se na účinku polymerních léčiv ještě podílí nespecifická pasivní akumulace/směrování (obrázek č. 13), které se říká EPR (Enhanced Permeation and Retention) efekt. Co to je? Endotel nebo-li výstelka krevních vlásečnic nádorové tkáně je defektní v tom smyslu, že je propustná i pro vysokomolekulární látky, které výstelkou normálních krevních vlásečnic neprojdou. Proto se z krevního oběhu do nádorů snadno dostávají i polymerní léčiva. Nádorová tkáň má ale ještě další zvláštnost. Lymfatická drenáž je díky překotnému růstu nádorů velmi nedokonalá a neodvádí z nádorové tkáně všechno to co by měla, tedy ani akumulovaná polymerní léčiva. Tímto způsobem se makromolekuly v nádorové tkáni hromadí a pokud mají cytotoxické účinky nádorovou tkáň lokálně zničí. Tento jev s výhodou využily všechny skupiny vyvíjející polymerní cytostatika. Pokud je totiž účinná již polymerní forma léčiva a pro účinek není absolutně nezbytná aktivně směrující složka, značně to zjednodušuje studované systémy a urychluje jejich možné zavedení do klinické praxe. Aktivní směrující systémy, které jsou samozřejmě ještě účinnější, budou logickým, ale výrobně daleko složitějším pokračováním výzkumu. Léčivo nemusí být na polymerní nosič navázáno jen proteolyticky štěpitelnou vazbou, kterou jsme právě probrali (obrázek č. 8). Další z mnoha jiných možností je vazba hydrazonová, která umožňuje hydrolytické uvolňování navázaného léčiva při nízkém pH (5.0 – 5.5) tedy takovém, jaké je v endosomech či lysozomech. Podobně jako proteolyticky 11
štěpitelný konjugát také hydrolyticky štěpitelný konjugát je proto stabilní během transportu krevním řečištěm (pH krve je neutrální kolem 7.2) a je uvolňován pouze intracelulárně díky nízkému pH endosomů a nebo lysozomů (obrázek č. 14).
14
15
12
Lze snadno prokázat, že výsledek léčby je významně ovlivněn zvoleným dávkováním. Jedna velmi vysoká dávka (1 x 75 mg polymerního doxorubicinu/kg tělesné váhy) vyléčí prakticky všechny myši, dávky nižší, i když opakovaně podané, jsou méně účinné. Obrázky č. 15 a 16, které dokumentují účinek hydrazonového konjugátu doxorubicinu a HPMA na myším T buněčném lymfomu EL 4 ukazují navíc zřetelně, že myši lze zbavit nádoru i volným
16
17
13
léčivem (doxorubicinem). Je však třeba volit velmi vysokou tzv. maximálně tolerovanou dávku (MTD). Vyšší dávku by už experimentální myši nepřežily.
Zajímavé ale bylo
porovnání výsledků retransplantace a dalšího osudu myší vyléčených polymerním anebo nemodifikovaným léčivem. Výsledek uvádí obrázek č. 17. Myši vyléčené rychle a ve vysokém procentu velmi vysokou dávkou polymerního léčiva vykazují jen omezenou systémovou rezistenci. Podobně jako tomu bylo u aktivně směrovaných léčiv navázaných proteolyticky štěpitelnou vazbou, méně účinná léčba nesměrovaným hydrazonovým konjugátem také navozuje vyšší rezistenci. Zdá se tedy že jde o obecnou zákonitost. Pozoruhodný je ale výsledek u myší vyléčených volným doxorubicinem. Také u nich lze pozorovat vznik systémové rezistence (obrázek č. 16) , ale nakonec celá pokusná skupina nejpozději do 90 dne vymírá (obrázek č. 17). Příčinou je pozdní toxicita vyvolaná terapeuticky nezbytnou vysokou dávkou léčiva, MTD. Je třeba zdůraznit, že se jedná o experiment, který dokumentuje stejnou nebo i vyšší účinnost polymerních léčiv při zachování bezpečnosti léčby. Je samozřejmé, že v klinické praxi onkolog nepoužije tak vysokou dávku cytostatika, aby ohrozil život pacienta.
18
19 Bezpečnost nové léčby polymerními makromolekulárními cytostatiky dokumentuje obrázek č. 18. Je na něm porovnávána jedna z důležitých vedlejších toxicit, a to myelotoxicita neboli poškozování kmenových buněk kostní dřeně. Jednou z metod, kterou lze k tomu použít je průkaz existence ve slezině přítomných tzv. kolonie-tvořících buněk (colony-forming units/spleen; CFU-s). Myším, u kterých chceme prokázat myelotoxicitu nějaké látky (v našem případě porovnat klasický doxorubicin a jeho polymerní formu) opakovaně podáme studovanou látku a těsně po posledním podání je utratíme a izolujeme kmenové buňky z kostní dřeně. Ty přeneseme (transplantujeme) do mírně (subletálně) ozářených příjemců tj. geneticky identických, syngenních myší a počkáme několik dní. Přenesené buňky tvoří v některých orgánech ozářeného příjemce (a také ve slezině) pouhým okem viditelné buněčné kolonie, které lze spočítat. Volíme obvykle takovou koncentraci buněk, aby u kontrol vyrostlo 14
ve slezině kolem 35 kolonií. Jestli-že pak u myší, které dostaly klasický doxorubicin je počet kolonií nízký je to důkaz toho, že látka je myelotoxická tj. poškozuje buňky kostní dřeně, zatím co nezměněný nebo dokonce vyšší počet kolonií u myší, které dostaly jeho polymerní formu (A-PH-Dox) dokazuje jeho bezpečnost. Kromě myelotoxicity je u polymerních léčiv také snížena nefrotoxicita, hepatotoxicita, kardiotoxicita a toxicita vůči brzlíku neboli thymu. Vyvinout a uvést do klinické praxe nové léčivo představuje dlouhodobý a náročný vývoj. Podle statistik světových farmaceutických firem jen asi desetina z 50 000 nově objevených látek úspěšně projde testy in vitro. Z nich zase jen asi desetina vyhoví testům in
vivo. Do náročného klinického testování se po předklinických zkouškách dostane jen asi jedna setina nově testovaných látek, které prošly na zvířecích modelech in vivo. Z nich se většinou tak jedna z pěti nakonec uplatní v klinické praxi (obrázek č. 19).
15
