PROPAGASI Plasmodium berghei IRADIASI GAMMA LAJU DOSIS TINGGI PADA MENCIT (Mus musculus)

Seminar Nasional Keselamatan Kesehatan dan Lingkungan VII Jakarta, 6-7 Juli 2011

PROPAGASI Plasmodium berghei IRADIASI GAMMA LAJU DOSIS TINGGI PADA MENCIT (Mus musculus) Siti Nurhayati Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi - BATAN ABSTRAK PROPAGASI Plasmodium berghei IRADIASI GAMMA LAJU DOSIS TINGGI PADA MENCIT (Mus musculus)Iradiasi gamma dapat digunakan untuk melemahkan parasit malaria dalam rangka pembuatan vaksin. Dengan radiasi pengion, parasit dapat dinonaktifkan sekaligus dipertahankan sifat-sifat biologik parasit seperti hemoaglutinasi dan antigenisitas. Mencit sebagai inang P. berghei merupakan model yang representatif dalam pengembangan parasit malaria. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui dosis iradiasi gamma. yang mampu melemahkan P berghei dan mampu memicu respon imun. Dalam penelitian ini pengaruh iradiasi terhadap pertumbuhan parasit dievaluasi melalui perhitungan persentase parasitemia menggunakan mikroskop cahaya. Di samping itu dilakukan pengukuran berat badan, organ limpa dan hati mencit. Dosis iradiasi gamma adalah 0, 150, dan 175 Gy pada laju dosis 979,58 Gy/jam dengan sumber Co60. Sebagai kontrol negatif adalah darah tak terinfeksi parasit. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kenaikan parasitemia mulai terjadi pada hari ketujuh pasca imunisasi. Dosis radiasi 150 Gy paling efektif melemahkan P.berghei dibandingkan dosis yang lain karena periode prepaten yang paling panjang dan puncak parasitemia yang paling rendah. Kata kunci: Malaria, propagasi, vaksin, P. berghei, parasitemia, iradiasi gamma

ABSTRACT PROPAGATION OF IRRADIATED Plasmodium berghei AT HIGH DOSE RATE IN MICE (Mus musculus). Gamma irradiation can be utilized to attenuate malaria parasite in order to create a vaccine. With ionizing radiation, parasites can be inactivated as well as maintained their biological properties such as haemaglutination and antigenicity. Mouse as host of P. berghei is representative model in propagating malaria parasites. The aim of this research is to determine gamma rays that effectively attenuate P berghei and elicits immune response. In this research the effects of irradiation to the proliferation of parasite was evaluated by counting the percentage of parasitemia by using light microscope. Beside that the body, lymph and liver weights of mouse were also measured. Gamma irradiation dose used was 0, 150, and 175 Gy at the dose rate of 979.58 Gy/jam of Co-60 source. As negative control was non infected blood. Results showed that there was an increased number of parasitemia started in seventh day post immunization. Irradiation dose of 150 Gy was the most effective in attenuating P. berghei compared to other doses due to longest prepatent period and lowest peak of parasitemia. Keywords: Malaria, propagation, vaccine, P. berghei, parasitemia, gamma irradiation.

PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH

88


nyamuk Anopheles, dan siklus aseksual

I. PENDAHULUAN Plasmodium berghei adalah hemoprotozoa

yang

menyebabkan

penyakit

malaria pada rodensia, terutama rodensia kecil.

Dasar

menyerang

biologi

plasmodium

rodensia

sama

yang dengan

plasmodium yang menyerang manusia seperti siklus hidup maupun morfologinya, genetik dan pengaturan genomenya, fungsi dan struktur pada kandidat vaksin antigen target [1].

Dengan demikian penelitian berbagai

aspek

parasitologi,

imunologi,

pengembangan vaksin

dan

malaria banyak

menggunakan parasit rodensia dan mencit sebagai hospesnya, terutama P. berghei. P. berghei banyak digunakan dalam penelitian dan pengembangan biologi pada parasit malaria

pada

manusia

karena

sudah

tersedianya teknologi pembiakan secara in vitro dan pemurnian pada tahapan siklus hidup, pengetahuan pada susunan genom dan pengaturannya.

Bahkan

hasil

analisis

molekuler menyampaikan bahwa P. berghei sama seperti plasmodium yang menginfeksi manusia.

Dengan model ini kemungkinan

dapat dilakukan manipulasi pada hospes sehingga

dapat

dipelajari

perubahan

imunologis yang terjadi selama infeksi malaria [2]. Siklus hidup semua spesies parasit malaria pada manusia atau rodensia adalah sama,

yaitu

mengalami

stadium

yang

berpindah dari vektor nyamuk ke manusia atau rodensia dan kembali ke nyamuk lagi. Siklus seksual (sporogoni) berlangsung pada

berlangsung pada manusia atau rodensia, terdiri dari siklus eritrosit (erythrocytic schizogony) dan siklus yang berlangsung di dalam parenkim sel hati (exo-erythrocytic schizogony).

Siklus

eritrositik

dimulai

dengan keluarnya merozoit dari skizon matang di dalam hati ke dalam sirkulasi darah.

Setelah merozoit masuk ke dalam

eritrosit

parasit

membesar

menjadi

sel

tunggal yang disebut tropozoit, kemudian mengalami pembelahan inti dan berkembang membentuk beberapa merozoit yang disebut proses skizogoni. Setelah proses skizogoni selesai, eritrosit akan pecah dan melepaskan merozoit ke dalam plasma dan selanjutnya akan menyerang eritrosit lain dan memulai siklus baru.

Proses patologi pada malaria

adalah akibat siklus eritrosit. Beratnya penyakit

malaria

berhubungan

dengan

densitas parasit, serta berhubungan dengan kemampuan parasit bermultiplikasi baik di dalam hati maupun di dalam eritrosit. Siklus eritrositik ini menimbulkan tanda dan gejala karakteristik dan tidak mereda sampai hospes tersebut mati atau mengaktifkan respon imun yang mampu membunuh atau menekan pertumbuhan parasit [3]. Pelemahan (atenuasi) mikro-organisma patogen

merupakan

strategi

untuk

pengembangan vaksin sejak pertama kali vaksin ditemukan oleh Louis Pasteur [4]. Radiasi gamma dapat digunakan untuk menginaktifkan preparasi


mikroorganisma

vaksin,

disamping

untuk metode

89


Plasmodium

falciparum

inaktifasi secara pemanasan atau kimia. Pada

melemahkan

malaria ada beberapa kemungkinan strategi

stadium sporozoit adalah antara 150 – 200

untuk pembuatan vaksin malaria yaitu: 1)

Gy [7].

Vaksin pre-eritrositik yang dirancang untuk

Tujuan penelitian ini adalah untuk

mengaktifkan respon imun untuk membunuh

mendapatkan dosis radiasi gamma yang

atau menginaktifkan sporozoit, 2) vaksin

optimal

stadium darah dengan target merozoit bebas

Plasmodium

untuk mencegah invasi merozoit ke eritrosit

secara in vivo.

untuk

melemahkan

berghei

parasit

stadium

eritrositik

atau sel darah merah yang terinfeksi sehingga dapat mencegah infeksi yang terjadi menjadi

II. BAHAN DAN TATA KERJA

penyakit, 3) vaksin penghambat transmisi,

Parasit

yang dibuat untuk menghancurkan bentuk

Plasmodium berghei strain ANKA

gametosit sehingga dapat mencegah transmisi

diperoleh dari Lembaga Biologi Molekuler

dari strain resisten yang mungkin lolos dari

Eijkman dan Pusat Biomedis dan Teknologi

sistem imun [5]. Iradiasi gamma digunakan

Dasar Kesehatan, Kemetrian Kesehatan -

untuk melemahkan parasit malaria dalam

Jakarta. Pengembang biakan parasit secara

stadium

in

darah

untuk

preparasi

vaksin

vivo

dilakukan

dengan

cara

stadium darah yang sehingga diharapkan

menginfeksikannya ke dalam tubuh mencit

dapat menghambat pertumbuhan dan per-

strain

kembangan plasmodium di dalam eritrosit

Biomedika PTKMR.

dan menyebabkan reduksi parsial parasitemia. Pemanfaatan teknologi radiasi dalam bidang vaksin malaria telah digunakan sejak tahun 1967 dimana Nusszweinzig melakukan iradiasi pada nyamuk [6]. telah

diiradiasi

Nyamuk yang

digigitkan

ke

mencit

percobaan. Setelah dilakukan uji tantang dengan menyuntikkan sporozoit yang hidup ke dalam tubuh mencit, hasilnya 60% mencit memberikan proteksi terhadap sporozoit. Percobaan ini merupakan titik awal dari pengembangan

vaksin

malaria

menggunakan teknik nuklir.

dengan Hoffman

menyatakan bahwa dosis optimal untuk

Swiss

di

laboratorium

hewan

Hewan coba Mencit (Swiss Webster) jantan yang berumur sekitar 2 bulan dengan berat 25 hingga 35 gram Toksikologi

diperoleh dari Bidang Balitbangkes-Kementrian

Kesehatan. Mencit dipelihara di dalam sangkar plastik dengan tutup kawat. Mencit diberi makan pelet dan minum

secara ad

libitum (secukupnya). Iradiasi P. berghei P. berghei disuntikkan ke mencit secara intra peritoneal dan setiap hari dilakukan pemeriksaan jumlah parasit dengan membuat apusan darah tipis. Bila jumlah P. berghei sudah mencapai parasitemia > 10%,


90


mencit segera dianastesi dengan ether dan

dengan menggunakan mikroskop cahaya

darahnya diambil langsung dari jantung

dengan

menggunakan syringe 1 ml yang berisi anti

pengamatan berat organ limpa, organ hati

koagulan citrat phospat dextrose/CPD [8].

dan berat badan dilakukan dengan cara

Darah dibagi dalam beberapa kelompok.

pembedahan yang sebelumnya dianastesi

Selanjutnya dilakukan iradiasi menggunakan

dengan ether.

pembesaran

1000x.

Untuk

iradiator gamma Co-60, di PATIR-BATAN. Penelitian ini dilakukan dengan variasi dosis 0 Gy (kontrol positif), 150 Gy, 175 Gy, dan kontrol negatif dengan laju dosis 979,58 Gy/jam.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN Pertumbuhan parasit ditandai dengan meningkatnya

jumlah

atau

kepadatan

(densitas) parasit dalam sirkulasi darah tepi.

Inokulasi P. berghei

Densitas pertumbuhan parasit di dalam darah

Inokulum adalah P. berghei yang telah

dinyatakan

dengan

persen

parasitemia.

dilemahkan dengan sinar gamma, dengan

Persen parasitemia menunjukkan jumlah

dosis bervariasi. Inokulasi dilakukan dengan

eritrosit yang terinfeksi parasit.

menyuntikkan

yang

minimum mulai dari masuknya parasit dalam

P. berghei stadium

tubuh sampai dengan pertama terlihatnya

eritrositik secara intraperitoneal. Jumlah sel

merozoit di dalam eritrosit adalah periode

darah

prepaten.

Periode prepaten dan persen

parasitemia

dipengaruhi

0,2

mengandung ±1 x 10 merah

ml 7

inokulum

dihitung

menggunakan

hemositometer.

virulensi

parasit. Virulensi parasit salah satunya

Pengamatan Pengamatan dilakukan pada hari ke-3 hingga 21 paska inokulasi meliputi angka parasitemia, berat organ limpa, berat organ hati dan berat mencit. Parasitemia pada mencit diamati setiap tiga hari sekali dengan mengambil darah perifer dari

ujung ekor.

Darah yang diperoleh kemudian dibuat sediaan apus darah tipis. Apusan dibiarkan mengering

oleh

Waktu

kemudian

difiksasi

dengan

metanol selama 30 detik. Apusan diwarnai dengan 10 % larutan Giemsa dan dibiarkan selama 20 menit [9].

Preparat diamati

ditentukan daya multiplikasi parasit dan daya invasi parasit [10].

Pada

penelitian ini,

terlihat pada kelompok mencit kontrol yaitu parasit

yang

tidak

diiradiasi

sebelum

diinfeksikan dengan kelompok yang diberi perlakuan terjadi perbedaan periode prepaten (Gambar 1). Seperti disebutkan oleh Tork dalam Landau bahwa penundaan

periode

paten hingga 2 hari sudah signifikan [10]. Hal

ini

menunjukkan

iradiasi

dapat

melemahkan parasit sehingga daya invasi parasit menurun.


91


30 25 20 15 10 5 0 3

6

7

8

kontrol (+)

9

12

15

150 Gy

18

21

175 Gy

Gambar 1. Densitas P. berghei dalam mencit setelah disuntik parasit yang dilemahkan dengan dosis radiasi 0 Gy, 150 Gy, 175 Gy pada laju dosis 979,58 Gy/jam. Pada hari ke-7 pasca infeksi persen

bahwa dosis 150 Gy merupakan dosis yang

parasitemia terlihat meningkat secara cepat.

efektif dalam melemahkan parasit. Menurut

Hal ini menunjukkan pada stadium tersebut

Wellde [12] derajat resisten terhadap malaria

belum ada mekanisme imunitas dari tubuh

yang diperoleh mencit sebanding dengan

yang bekerja. Hal ini terlihat pada mencit

besar dosis iradiási dan jumlah dosis

kontrol dan dosis 175 Gy,

daya infeksi

imunisasi. Vaksin stadium darah efektif

dilemahkan, sehingga

dalam mereduksi morbiditas dan mortalitas

parasit yang tidak

pertumbuhan parasit didalam darah tidak

mencit

walapun vaksin ini tidak dapat

terhambat. Hal ini terlihat pada Gambar 1,

mengeliminasi semua parasit.

dosis kontrol (0 Gy) dan 175 Gy, terjadi

Parasit darah yang bersekuestrasi ke

kurva kenaikan parasitemia yang terus

jaringan lain menyebabkan patologi berat

meningkat tajam hingga mencapai puncaknya

pada inang hingga mengakibatkan gangguan

pada hari ke-21 dengan parasitemia 27% dan

pada organ utama, yaitu hati dan limpa.

23%.

Pengaruh pertumbuhan parasitemia terhadap Kurva densitas

parasit pada dosis

organ

hati

dilakukan

dengan

cara

iradiási 150 Gy meningkat pada hari ke-8,

penimbangan berat organ, warna dan tekstur.

tetapi kemudian menurun terus hingga hari

Pengambilan

ke-21 (Gambar 1).

melakukan

pembedahan

terjadi adanya mekanisme imunitas tubuh

sebelumnya

dianastesi

yang

Perbesaran organ hati ini

bekerja

Hal ini kemungkinan

menekan

pertumbuhan

hati

dilakukan

dengan

mencit dengan

yang ether.

disebabkan

parasit[11]. Dari data ini menunjukkan


92


terjadinya perubahan sel hepatosit akibat

banyak terjadi pada organ dalam (hati, limpa,

pertumbuhan parasitemia yang tinggi.

dan

sumsum

tulang)

danmenyebabkan

Terlihat pada Gambar 2 dan 3 dimana

kelainan patologis pada organ tersebutyang

dosis radiasi kontrol (0 Gy) dan 175 Gy,

sering ditandai adanya pigmen malaria yang

mengalami kenaikan berat organ hati dan

dideposit di organ dan menyebabkan warna

limfa dibandingkan dosis 150 Gy dan kontrol

organ

negatif. Hal ini disebabkan terjadinya invasi

proliferasi sel retikulo-endotelial, blokade

P berghei ke dalam organ tersebut yang

kapiler oleh eritrosit terinfeksi, perdarahan

merupakan organ target infeksi P berghei

perivaskular akibat kerusakan endotel dan

pada hewan pengerat (rodensia). Pembesaran

degenerasi parenkim pada organ hati.

organ hati dan limfa pada dosis 0 Gy dan 175 Gy

menjadi

Pada

kelabu

penderita

atau

kehitaman,

malaria,

limpa

kemungkinan disebabkan terjadinya

berfungsi sebagai filter untuk menghilangkan

perubahan sel hepatosit pada hati dan

eritrosit dan produknya yang terinfeksi pada

limfosit B pada organ limfa yang disesbst

aliran

parasitemia yang tinggi

difagositosis/dimakan

Seperti halnya P falciparum, P berghei

darah.

Plasmodium

dan

secara

pigmen

aktif

oleh

makrofag limpa sehingga pada pemeriksaan

adalah plasmodium yang bersifat virulen,

makroskopis

cenderung menginvasi sel darah merah dari

sedangkan

semua

peningkatan jumlah sel makrofag dan pigmen

umur

dan

persentase

sel

yang

terinfeksi dapat melampaui 50%. Skizogoni

limpa secara

tampak mikroskopis

membesar terdapat

yang tersebar.

3,5 3

berat hati/gr

2,5 2 1,5 1 0,5 0 hari ke

3

6 kontrol (-)

9

12 kontrol ( +)

15 150 Gy

18

21 175 Gy

Gambar 2. Hasil pengukuran berat organ hati mencit pasca perlakuan parasit iradiasi.


93


1,6 1,4

berat limfa/gr

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2

0 hari ke

3

6

9

kontrol (-)

12

15

kontrol (+)

18

150 Gy

21 175 Gy

Gambar 3. Hasil pengukuran berat organ limpa mencit pasca perlakuan parasit iradiasi.

barat badan mencit

45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 hari ke

3

6

9

kontrol (-)

12

15

kontrol (+)

150 Gy

18

21 175 Gy

Gambar 4. Rata-rata berat badan mencit setelah diinokulasi P berghei iradiasi. Untuk

berat

signifigant. Pada dosis 0 dan 175 Gy terlihat

Terlihat

kenaikan berat organ limpa yang melonjak

kenaikan berat organ limpa yang sangat

mulai hari ke-6 pasca imunisasi yang

ditampilkan

organ pada

limfa Gambar

data 3.


94


kemungkinan disebabkan adanya perubahan

periode prepaten yang panjang, derajat

pada limfosit B.

parasitemia serta puncak parasitemia yang

Berdasarkan data pengukuran berat

rendah. Untuk mengetahui apakah dosis ini

yang

efektif untuk pelemahan P. berghei sehingga

bermakna akibat pengaruh infeksi parasit

dapat menimbulkan respon imun mencit yang

untuk semua dosis perlakuan dan cenderung

optimal, perlu dilakukan uji tantang.

berfluktuasi.

Mencit mulai memperlihatkan

tantang dilakukan untuk mengetahui respon

gejala penurunan berat badan mulai hari ke-3

protektif dari mencit setelah disuntikkan

paska infeksi, kecuali dosis 150 Gy yang

P.berghei stadium eritrositik yang hidup.

badan,tidak

terdapat

perbedaan

Uji

terlihat stabil mulai hari ke-3. Tidak terlihat kelainan fisik dan klinis pada mencit yang

DAFTAR PUSTAKA

diinokulasi P. berghei yang diiradiasi dengan

1.

LANDAU, I, GAUTRET P., Animal models rodents In: Malaria, Parasites biology, pathogenesis, and protection, Ed: Sherman, I.W. ASM Press, Washington, DC, 401-417, 1998.

2.

LANGHORNE, J., QUIN S.J.,.SANNI L.A, Mouse models of blood stage malaria infections : immune responses and cytokines involved in protection and pathology, Chem Immunol. 8, 204-228, 2002.

3.

TAMBAYONG, E.H., Patobiologi malaria dalam Harijanto P.N., (Ed) Malaria: Epidemiologi, Patogenesis, Manifestasi klinis dan Penanganannya, Penerbit buku kedoketran EGC, 2000.

4.

RAZ EYAL, JOSHUA FERRER, Using gamma radiation preserves T-cell responses in bacteria vaccine, Professor of Medicine at University of California, San Diego (UCSD) School of Medicine, 2006

5.

KOMISAR, JL., Malaria vaccines, Frontiers in Biosciences 12, 3928-3955, 2007.

6.

NUSSENZWEIZIG, RS., VANDENBERG, J., MOST, H. & ORTON C., Protective immnunity produced by the injection 0f irradiated sporozoit of Plasmodium berghei, Nature 216, 160 – 162, 1967.

7.

HOFMAN, S., GOH L, LUKE, T., SCHNEIDER, I., Le T, DOOLAN, D,

dosis yang bervariasi. Iradiasi

adalah

sebuah

proses

sederhana secara teknik dapat menahan struktur

mikroorganisme

patogen

tanpa

menghancurkan antigen alamiah atau adjuvan intrinsik.

Dengan demikian respon imun

yang kuat dapat diinduksi pada inang yang divaksinasi. Imunitas protektif yang tinggi diinduksi oleh imunisasi dengan sporozoit yang diiradiasi pada dosis subletal [7]. Hal ini

berarti

bahwa

mempertahankan

parasit

yang lemah

kemampuannya

untuk

masuk dan sebagian berkembang dalam hepatosit tetapi tidak secara penuh matang sehingga mempunyai kemampuan untuk menginduksi pertahanan selular dari inang. Sporozoit yang mati tidak mempunyai efek ini dan tidak memberikan proteksi. IV. KESIMPULAN DAN SARAN Dosis iradiasi 150 Gy merupakan dosis dan

laju

dosis

yang

efektif

untuk

melemahkan parasit. Hal ini ditandai dengan


95


SACCI, J, DE LA VEGA, P, DOWLER, M, PAUL, C, STOUTE, J, CHURCH, L., SEDEGAH M, HEPPNER, D, BALLOU, W, RICHIE, T., Protection of human against malaria by immunization with radiation-attenuated Plamodium falciparum sporozoites, J infect Dist 185 (8); 1155-1164, 2002. 8.

9.

DARLINA, DEVITA,T., Daya infeksi Plasmodium berghei yang diirradiasi sinar gamma, Prosiding seminar nasional keselamatan, kesehatan dan lingkungan III, 200- 206, 2007. LJUNGSTROM I., PERLAMAN,H.,. SCHILCHTHERLE, M., SHERE, A., and WAHLGREEN, M., Methods In Malaria Research, MR4/ATCC, Manassas Virginia, 2004.

10. LANDAU, J., BOULARD,Y., Life cycles and morphology, In: Rodent Malaria, R. KILLICK-KENDRICK (Ed.), Academic Press, London, 1978, 53 – 157.

manusia. Kami menggunakan hewan coba mencit dan monyet, kami juga belum bias memprediksikan kapan vaksin malaria iradiasi akan dapat diaplikasikan. Mudah-mudahan tidak terlalu lama. 2. Penanya : Mukh Syaifudin Pertanyaan : - Faktor apa saja yang mempengaruhi propagasi? Jawaban :  Faktor yang mempengaruhi propagasi adalah. Secara In Vivo: - Daya imunitas dan infektifitas Plasmodium serta inangnya (mencit atau monyet) - Cara penyuntikan (intravena, intraperitonia, intramuskular) Secara In Vitro: - Sterilitas Biological Safety Cabinet (BSC) - Sterilitas medium (RPMI dll)

11. ANGUS, B.J., CHOTIVANICH, K., UDOMSANGPETCH, R., and WHITE, N J., Invivo removal malaria parasites from red blood cells without their destruction in acute falciparum malaria, Blood 90, 2037-2040, 1997. 12. WELLDE, B.T. AND SADUN, E..H., Resistance produced in rats and mice by exposure to irradiated Plasmodium berghei, Experimental parasitology 21, 310-324, 1967.

TANYA JAWAB 1. Penanya : Agustono Pertanyaan :  Apakah vaksin malaria yang ibu teliti sudah siap dipasarkan? Kalau belum kapan kira-kira dapat digunakan? Jawaban :  Penelitian vaksin adalah penelitian yang memakan waktu cukup lama dengan tahapan yang tidak mudah. Saat ini masih dicari bahan vaksin yang mirip dengan bahan vaksin untuk


96

PROPAGASI Plasmodium berghei IRADIASI GAMMA LAJU DOSIS TINGGI PADA MENCIT (Mus musculus)

Recommend Documents