Stichting Kwaliteitsbewaking Medische Laboratoriumdiagnostiek
Project Microalbumine in Combi Urine 2010
Aldy Kuypers, Robert de Jonge, Cas Weykamp Mei 2010
Achtergrond Tijdens de beleidsavond van de Sectie Algemene Chemie in februari 2009 is besloten om de rondzending Combi Urine te evalueren. Deze doelstelling is nader ingevuld door Aldy en Robert en in hun rapport van juni 2009 richtten zij zich vooral op microalbumine en de commuteerbaarheid van de monsters. Bottum-line: door patienten uitgescheiden albumine zou in immunochemische testen wel eens anders kunnen reageren dan serum albumine of “albumine uit een potje” waarmee gespiked wordt. Voorts zou filtreren van urine door een 22 micrometer filter waarmee neerslag, cellen en bacterieen verwijderd worden mogelijk invloed kunnen hebben. Als dit waar is impliceert dit dat de huidige combi-monsters niet commuteerbaar zijn en de waargenomen (excellente) interlabvariatie een te rooskleurig beeld schetst van de werkelijkheid. Om deze veronderstelling te toetsen is in juli 2009 in samenwerking met Cas een project ontworpen dat ingebouwd is in de Combi Urine 2010.
Vraagstelling die onderzocht is: a. Gedraagt gespiked albumine zich anders dan door patienten uitgescheiden albumine? b. Is de manipulatie van monsters (invriezen, filtreren, vriesdrogen) van invloed op de meting van albumine? c. Is de manipulatie van monsters van invloed op een van de andere analytes?
Hoofdlijn Project Vanuit dezelfde urinepool (albumine van 100 mg/L, kreatinine van 8 mmol/L) worden 4 monsters gemaakt en opgenomen in de rondzending: a. 2010.1A:vloeibaar verzonden b. 2010.1B: gefiltreerd en vloeibaar verzonden c. 2010.1C:gefiltreerd en ingevroren verzonden d. 2010.1D: gefiltreerd en gevriesdroogd Voorts zijn de data van een met humaan albumine gespiked monster (2009.1B) bij de analyse betrokken. Dit monster is net als monster 2010.1D gefiltreerd en gevriesdroogd en verschilt dus alleen van 2010.1D doordat albumine gespiked en niet natief is.
Gedraagt gespiked albumine zich anders dan door patienten uitgescheiden albumine? Om deze vraag te beantwoorden zijn in tabel 1 de gemiddeld gemeten waarden en de interlab CV van het monster met natieve albumine (2010.1D) en het gespikete albumine (2009.1B) opgenomen. Daarbij wordt in drie aggregatielagen gewerkt: overall, gesplitst naar nefelometrie en turbidimetrie en gesplitst naar analytisch systeem.
Tabel 1. Gemiddeld gemeten microalbumine en interlab CV in monsters met een natief en een gespiked albumine Methode N Gemiddeld Gemeten Interlab CV Zoals bij 2010.1D in gebruik (2010.1D) Gespiked Natief Gespiked Natief Albumine Albumine Albumine Albumine 2009.1B 2010.1D 2009.1B 2010.1D Overall 141 200 110 7% 6% Nefelometrie Turbidimetrie Nefelometrie Beckman Array Beckman Immage Beckman Unicel DxC 800 Siemens BN II Siemens ProSpec Roche Modular** Turbidimetrie Abbott Aeroset Abbott architect Siemens ADVIA Beckman DxC600 Beckman DxC800 Beckman LX 20 Beckman Synchron Siemens Dimension Olympus Roche Cobas 6000 Roche Integra Roche Modular
Ratio Spike/Natief Spike/Natief X 100 X 100 Herleid 100 182 100
14 127
198 201
110 110
8% 7%
7% 6%
180 183
99 101
3 2 1 2 2 4
186* 179 185 219 214 200
116 99 105 114 109 107
8% 2% 4% 1% 3% 2%
2% 6% 1% 9% 1%
160 181 176 192 196 187
88* 99 97 105 108 103
2 14 1 4 7 10 2 5 2 40 10 30
199 211 194 191 191 199 182 229 212 201 182 204
118 120 112 112 106 113 107 114 114 107 109 109
8% 3% 4% 5% 8% 8% 3% 4% 8%* 4%
2% 3% 6% 4% 8% 1% 5% 5% 6% 3% 4%
169 176 173 171 180 176 170 201 186 188 167 187
93 97 95 94 99 97 93 110 102 103 92 103
* statistisch significante verschillen (95% niveau) ** Methode zoals aangegeven door deelnemers; voor zover ons bekend is de Roche Modular evenwel een turbidimetrische methode
Maakt het nu verschil of er natief albumine (uitgescheiden door een patiënt) of kunstmatig albumine (gespiked met humaan albumine uit een potje) in de rondzendmonsters zit? Reden om dit onderzoek te starten was de verrassend lage interlab CV zoals we die in monsters met gespiked albumine zagen (2009.1B). Wellicht zou het er met natief albumine (met mogelijk andere moleculaire vormen) slechter uitzien. De resultaten bevestigen deze veronderstelling niet: waar in het gespikete monster overall interlab CV 7% is deze bij gebruik van natief albumine 6%. Ook als we kijken naar de beide meetprincipes (nefelometrie en turbidimetrie). Bekeken per methode is er een keer een significant verschil: bij Roche Integra is de spreiding in het gespikete monster significant hoger. Maar bij een waarschijnlijkheid van 95% zul je een significant verschil vinden bij 1 op de 20 testen. Conclusie: de spreiding tussen de labs is bij gespiked albumine niet anders dan bij natief albumine. Andere vraag is die naar de commuteerbaarheid. Als de Overall Interlab CV’s geen verschillen laten zien is de kans gering dat er matrix effecten zijn maar het is toch goed om hier met een specifieke methode naar te kijken. Dat kan eerst met het oog van de timmerman: simpelweg kijken of er met enige methode in monster 2009.1B duidelijk een andere gemiddelde meetwaarde wordt gevonden dan in monster 2010.1D. Ofwel: kijken naar kolommen 3 en 4. Er springt niets in het oog maar het is lastig vergelijken: het concentratieniveau in de monsters is verschillend. Dat kan vergemakkelijkt worden door met ratio’s te gaan werken (kolommen 7 en 8). Per methode wordt de verhouding tussen 2009.1B en 2010.1D uitgerekend (kolom 7). Om het nog gemakkelijker te maken wordt deze ratio herleid tot 100 (door de overall ratio op 100 te stellen). Voorbeeld: Beckman Immage meet laag in het gespikete monster (179); is dat een matrix effect? Kijken we naar de meting in het natieve monster dan zien we ook een lage waarde (99). Of wel deze methode meet in beide typen monsters laag. De lage meetwaarde in het gespikete monster is niet het gevolg van een commuteerbaarheidsprobleem maar een gevolg van de calibratie van de methode. Dit is ook in een ratio uit te drukken: 179/99 = 181 en herleid naar de overall ratio van 182 is dit 181/182 = 99. Voor Olympus geldt het spiegelbeeld: hoog in beide monsters (212 en 114) met een ratio van 212/114 = 186 wat dan herleid 186/182 = 102 is. Een herleide ratio van 100 is totaal matrixvrij. Hoe dichter de herleide ratio’s van een methode bij 100 liggen hoe geringer de kans op een matrix effect. De herleide getallen 99 voor Beckman en 102 voor Olympus liggen beide dicht bij 100 en hier is dus geen matrix probleem. Statistici zullen hier graag een objectief bewijs van zien. Dat kan met de ttest. Een verschil is significant in relatie tot de gecombineerde standaardafwijking en het aantal vrijheidsgraden (Skoog and West; fundamentals of Anlytical Chemistry). Kwalitatief: hoe groter de standaardafwijking, hoe groter de afwijking van 100 mag zijn om niet significant te zijn; en hoe groter het aantal meetwaarden (aantal labs) hoe minder de ratio van een methode mag afwijken van 100 om significant te zijn. Deze test is toegepast op het 95% niveau en scoort alleen bij de Beckman Array een significant verschil (herleide ratio is 88 en mag maximaal 90 zijn). Ook hier geldt weer: in 1 op de 20 gevallen zul je per definitie een significant verschil vinden. Slotconclusie: op grond van gemeten concentraties en interlaboratoriumvariatie is er bij de meting van microalbumine geen verschil aantoonbaar tussen monsters met natief en kunstmatig albumine.
Is de manipulatie van monsters (invriezen, filtreren, vriesdrogen) van invloed? In de vorige paragraaf is aangetoond dat spiken van urine met albumine geen bezwaar is. Maar daarbij zijn gevriesdroogde monsters vergeleken. Maar heeft dat vriesdrogen geen effect op de metingen? Dat is uitgezocht door een monster in vier verschijningsvormen te laten analyseren in de rondzending 2010. Een patiëntenurine met een microalbumine van omstreeks 100 is verstuurd: vloeibaar zonder enige behandeling (2010.1A), vloeibaar nadat het monster eerst was gefiltreerd (2010.1B), ingevroren op droogijs verstuurd nadat het monster eerst was gefiltreerd (2010.1C) en gevriesdroogd (2010.1D). Tabel 2 laat de resultaten zien. In opzet lijkt deze tabel op tabel 1 (zie dus in vorige paragraaf voor toelichting)met dien verstande dat alleen de herleide ratio’s zijn opgenomen. Tabel 2. Gemiddeld gemeten microalbumine en interlab CV’s zoals gevonden in 4 typen monsters bereid uit deselfde uitgangsurine. Methode N Gemiddeld Gemeten Microalbumine Interlab CV Herleide Ratio 2010.1B 2010.1A 2010.1B 2010.1C 2010.1D 2010.1A 2010.1B 2010.1C 2010.1D A/B C/B D/B Abbott 16 123 127 121 120 3% 3% 3% 3% 99 95* 96 Siemens ADVIA 1 112 113 115 112 101 102 101 Beckman 29 107 108 109 109 7% 7% 7% 7% 101 101 103 Siemens BN II 2 121 121 118 115 2% 2% 3% 1% 102 98 97 Siemens Pro Spec 2 112 119 116 109 9% 8% 11% 10% 96 97 93 Siemens Dimension 5 113 114 119 116 8% 9% 8% 4% 101 104 104 Olympus 3 112 112 108 105 4% 4% 7% 7% 102 96 96 Overigen 4 115 113 115 114 7% 7% 7% 7% 104 102 103 Roche Cobas 6000 40 107 109 109 106 4% 5% 4% 3% 100 100 99 Roche Integra 10 109 112 113 109 3% 3% 4% 4% 99 101 99 Roche Modular 33 109 112 111 109 5% 4% 4% 4% 99 99 99 Overall 149 110 112 112 110 7% 6% 6% 6% 100 100 100 * statistisch significant 95% niveau Als uitgangspunt bij de ratio’s is de vloeibare gefiltreerde urine (2010.1B) genomen (ongefiltreerde had enkele uitschieters en was ook bij andere parameters (zie volgende pargraaf) “dispersed”. Vergelijk op het oog van de gemiddeld gemeten waarden laat een homogeen beeld zien: alle methoden dicht bij elkaar. Maar toch meet Abbott in elk van de vier monsters aan de hoge kant en Roche Cobas 6000 in alle monsters aan de lage kant. Dat wordt weerspiegeld in herleide ratio’s die alle dicht bij 100 liggen. Objectivering met de t-toets laat alleen een significant verschil zien voor het ingevroren monster zoals gemeten met Abbott. Conclusie: Enige behandeling van de monsters (filtreren, invriezen, vriesdrogen) heeft geen effect op de gemiddeld gemeten albumine concentratie en de interlab CV (met dien verstande dat er bij het vloeibare ongefiltreerde monster enkele uitschieters waren; deze zijn verwijderd alvorens de CV te berekenen).
Is de manipulatie van de monsters van invloed op de andere analytes? Nu de vier typen monsters toch zijn rondgestuurd om het effect van filtreren, invriezen en vriesdrogen op albumine te onderzoeken kan ook naar de andere analytes gekeken worden. Dat is gedaan op dezelfde wijze als voor micro-albumine in de vorige paragraaf. De resultaten zijn niet in extenso opgenomen in dit rapport (desgewenst opvraagbaar) maar samengevat in tabel 3.
Tabel 3. Gemiddelde gemeten waarden en interlab CV’s voor kwantitatieve analytes in de Combi Urine Analyte
Micro albumine Amylase Fosfaat Calcium Chloride Glucose Kalium Kreatinine Magnesium Natrium Osmolaliteit Oxalaat Totaal eiwit Totaal
n
149 114 145 151 120 46 162 165 105 160 76 8 155
Gemiddelde A 110 132 18.7 2.19 90.6 0.71 47.4 8.0 2.74 98.0 534 0.22 0.25
B 112 131 18.8 2.17 90.3 1.73 47.3 8.1 2.73 98.0 532 0.15 0.19
C 112 109 18.8 2.15 89.9 1.80 47.1 8.1 2.67 97.5 532 0.10 0.20
Aantal methoden Ratio <95 of >105
Interlab CV D 110 107 18.4 2.13 87.5 1.80 46.1 7.9 2.63 96.5 525 0.13 0.19
A 7% 6% 6% 5% 6% 70% 4% 5% 8% 2% 3% 32% 20% 14%
B 6% 5% 5% 6% 5% 26% 4% 4% 8% 2% 1% 14% 14% 8%
C 6% 20% 5% 8% 6% 17% 4% 4% 8% 3% 2% 35% 11% 10%
D 6% 3% 5% 6% 5% 9% 4% 4% 8% 3% 1% 22% 12% 7%
A
C
D
Ratio significant Afwijken 100 (95% niveau) A C D 1 0 4 0 0 0 0 0 0 0
0 1 0 0 0 5 0 0 0 0 0
1 7 0 0 0 2 0 0 2 0 0
1 1 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 1 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
7 13
0 12
1 4
1 1
0 4
0 0
Waarnemingen: - Bij amylase meet een aantal labs geen enkele activiteit; ook wanneer deze labs verwijderd worden is de interlab CV veel hoger dan in de andere monsters. Door invriezen en vriesdrogen verdwijnt een deel van de activiteit. Kleinste interlabvariatie bij gevriesdroogde monster. - Bij glucose meet een aantal labs geen glucose in het vloeibare ongefiltreerde monster; worden deze labs eruit gelaten dan is het gemiddelde in dit monster lager en de interlab CV veel hoger dan in de andere monsters. De kleinste interlab CV wordt gezien bij het gevriesdroogde monster. - Oxalaat lijkt in het ongefiltreerde monster wat hoger uit te vallen; bij alle monsters een slechte interlab CV (maar ook door lage concentratie)
-
Totaal eiwit laat in vloeibare ongefiltreerde urine een wat hogere waarde zien maar ook een hogere interlab CV. Kijken we naar het aantal methode/analyte combinaties met een ratio die meer dan 5% afwijkt van 100 dan zijn dat er 13 bij het vloeibare ongefiltreerde monster (vooral door glucose en totaal eiwit), 12 bij het ingevroren monster (amylase de boosdoener) en 4 bij gevriesdroogde. Statistisch significante verschillen zijn er 1 in het vloeibare ongefiltreerde monster, 4 in het ingevroren monster en geen in het gevriesdroogde monster.
Conclusie: Vloeibare ongefiltreerde urine heeft problemen met glucose en totaal eiwit. Vloeibare gefiltreerde urine heeft een probleem met glucose. Ingevroren gefiltreerde urine laat vreemde dingen zien bij amylase. Geen significante nadelen voor gevriesdroogde urine.
Kwalitatieve testen Tot slot is ook een analyse gemaakt van de performance van de vier typen monster bij de kwalitatieve testen. Ook hier is er weer voor gekozen om een samenvattende tabel (tabel 4) te maken (detail tabellen zijn opvraagbaar). Tabel 4. Overview resultaten kwalitatieve testen met 4 typen monsters in Combi Urine Ongefiltreerd Gefiltreerd Analyte n Vloeibaar Verzonden Vloeibaar Verzonden Monster 2010.1A Monster 2010.1B + spoor + spoor Aceton 113 100 100 Acetylacetaat 15 100 100 Bilirubine 100 100 100 Zwangerschap 112 1 99 100 Glucose 120 3 1 96 6 22 72 Eiwit 119 18 60 22 13 67 20 Urobilinogeen 76 15 85 16 84
Gefiltreerd Ingevroren Verzonden Monster 2010.1C + spoor 100 100 100 2 98 3 15 82 10 69 21 19 81
Gefiltreerd Gevriesdroogd Monster 2010.1D + spoor 100 100 1 99 100 6 15 79 12 72 26 18 82
In de tabel is het getal het percentage van de gerapporteerde uitslagen in de categorieën positief, spoor en negatief. Voorbeeld: voor eiwit in het ongefiltreerde vloeibaar verzonden monster rapporteert 18% van de labs “positief”, 60% een “spoor” en 22% “negatief”. Afgezien van glucose (minder positief in ongefiltreerde monster) zijn er geen opvallende verschillen.
Samenvatting a. Er is bij de meting van microalbumine geen verschil tussen natief en kunstmatig albumine in monsters b. Verschil in behandeling van de monsters (filtreren, invriezen, vriesdrogen) leidt niet tot verschil bij de meting van microalbumine c. Bij de overige analytes geeft het gevriesdroogde monster als enige geen enkel probleem
Aanbeveling Gelet op de in dit experiment getoonde performance en gelet op het gemak in de dagelijkse praktijk (verzending, opslag, mogelijkheid voor een ontwerp met samenhangende monsters) is gebruik van gevriesdroogde monsters in de Combi Urine rondzending van de SKML aan te bevelen. Anders uitgedrukt: deze experimenten hebben de validiteit van het gebruik van gevriesdroogde monsters aangetoond. Het streven van de Sectie Algemene Chemie is om te komen tot uniforme gestructureerde rondzendingen met commuteerbare, getargete monsters. Met dit onderzoek is de commuteerbaarheid van de in de Combi Urine gevriesdroogde urines aangetoond. De structuur is al die welke we nastreven: paren monsters die een lineariteitsreeks vormen met enkele casuistische monsters. We kunnen nu gaan werken aan de resterende punten: doelwaarde invoeren (de wijze waarop is een punt van discussie (inweeg/consensus/referentielab/afijken op getarget serum), score en jaarrapport met jaarbrief.
