PROGRAM SESTER A LABORANTŮ
ZVLÁŠTNOSTI PÉČE O DĚTSKÉ ALERGIKY J. Šimoníčková Oddělení dětské alergologie a klinické imunologie Dítě není zmenšeninou dospělého, v různých věkových obdobích má své zvláštnosti, které se projevují ve zdraví i nemoci. Klinické projevy alergie jsou odlišné v závislosti na věku dítěte. V raném období to bývá především ekzém (se sklonem ke generalizaci) a symptomy potravinové alergie (mléko, vejce). V předškolním věku astma, často s atypickými projevy, jako jsou záchvaty kašle a opakované obstrukční bronchitidy. Proto bývají i obtíže s diagnostikou tohoto onemocnění. Až později nabývá na významu alergická rýma (sezonní i celoroční). U školáků se setkáváme s alergií na hmyz a event. i symptomy alergie kontaktní. Péče o dětské alergiky závisí na intenzitě a charakteru projevů alergie. V obecných pravidlech se neliší od dospělých. Existují však zvláštnosti v diagnostických postupech: Do 2 let se neprovádějí kožní testy (snížená reaktivita kůže), vyšetřují se jen specifiské IgE protilátky, funkční vyšetření plic (spirometrie) lze provést většinou až od 5-6 let. U menších a hůře spolupracujících dětí je však možné provádět vyšetření impulsní oscilometrie (IOS). PEF možno měřit většinou od 4 let. Jsou i zvláštnosti v léčbě: K dispozici je menší spektrum léků (limitace použití - od 2, 6, 12 let), inhalace práškových forem je možná až od 5-6 let, u aerosolů je nutnost používání nástavců. Alergenová imunoterapie se nezahajuje před 3-4 rokem, má v dětství větší efekt, než když je indikována až v dospělosti. Nezanedbatelný význam má i klimatická léčba. Je důležitý specifický psychologický přístup k dítěti a edukace jeho i rodičů. V tomto směru sehrávají nezastupitelnou roli kluby dětských alergiků a astmatiků, vznikající např. při jednotlivých pracovištích alergologie a klinické imunologie, jako součást „Sdružení na pomoc chronicky nemocným dětem“. Klub existuje také při našem pracovišti (Klub AA Homolka). Vydává pravidelně Zpravodaj Motýlek, ve kterém jsou rodiče i děti informováni o nejrůznějších aktivitách klubu. Největší akcí klubu je léčebný přímořský pobyt. Je organizován pro 72 dětí vždy na 3 týdny, s odborným doprovodným personálem. Každá rodina získává zdarma časopis Alergie, astma, bronchitida. Jsou organizovány edukační přednášky pro rodiče, výlety do aquaparku, návštěvy divadelních představení, výlety do zoo, předvánoční setkání a další akce. Tím se vytváří možnost neformálních setkávání rodičů, pacientů i zdravotníků, při kterých se dají lépe společnými silami řešit jednotlivé problémy. Péče o dětské alergiky je úspěšná, pokud jsou ze strany zdravotníků respektovány její odlišnosti a rodiče i děti aktivně spolupracují.
ASTMA V DĚTSKÉM VĚKU – ÚLOHA SESTRY V PÉČI O DĚTSKÉHO ASTMATIKA J. Kaňková
OAKI FNKV, Praha Asthma bronchiale je chronické zánětlivé onemocnění dýchacích cest. Zánětu se účastní eozinofilní granulocyty a žírné buňky, méně pak neutrofilní a bazofilní granulocyty. Zánět zvyšuje hyperreaktivitu průdušek, jejímž důsledkem jsou projevy bronchiální obstrukce. Prevalence astmatu stoupá a těžiště výskytu se posouvá do nižších věkových skupin. Úspěch léčby astmatu závisí na včasném stanovení diagnózy, na včasné odpovídající léčbě a správné edukaci pacienta. Včasnost stanovení diagnózy v prvních letech života je spojeno s obtížemi a z toho vyplývá, že se léčba mnohdy opožďuje. Při léčbě dětského astmatika a volbě inhalačního systému je třeba postupovat individuálně podle vyspělosti dítěte. Na třech kazuistikách budou prezentovány výsledky ošetřovatelské péče a správně vedená edukace dítěte astmatika.
EDUKACE V PRAXI M. Krommerová Ústav imunologie a alergologie, FN, Plzeň Cílem edukace pacienta je jeho další plnohodnotný život jako u zdravého jedince. Edukace vychází ze vstupní analýzy dosavadních znalostí pacienta, jeho zdravotního stavu a ze stanovení nejbližších nutných cílů. Smyslem edukace je pacientovo osvojení poznatků, dovedností a postojů vzhledem k jeho zdraví. V případě alergií jsou lékem i informace, které nemocnému pomáhají zrevidovat jeho dosavadní způsob života a provést změny z důvodů nově objevených skutečností. Podstatou edukace je upozornění na rizikové faktory v okolí pacienta a dodržování zásad bezalergenového režimu. Důležité je nepodceňovat opakované ověřování toho, jak pacient dodržuje navržená opatření a jak umí používat získané dovednosti v souvislosti s užíváním inhalačních pomůcek. Osvědčilo se nám, že pacient má po odchodu z ordinace možnost konzultovat režimová opatření se speciálně školenou edukační sestrou. Svůj význam má také vzdělávání a informovanost veřejnosti formou publikace odborných článků a dostupnost různých edukačních materiálů.
EDUKACE DOMÁCÍ PÉČE U NEMOCNÉHO S CYSTICKOU FIBRÓZOU J. Zelenková Centrum alergologie a klinické imunologie DFN, Motol Cílem mé přednášky je seznámit kolegyně s domácí péčí o pacienta s touto diagnózou. Myslím, že by to mohlo být pro ně zajímavé téma, protože díky možnostem moderní léčby se tito pacienti dožívají stále vyššího věku a je tedy nutné vědět, co jim jejich onemocnění přináší za problémy, při jejichž řešení jim můžeme pomáhat. Na našem pracovišti jsme několik let ambulantně pečovali o tyto děti do věku tří let. Od letošního roku je ošetřují v Národním centru pro diagnostiku a léčbu CF ve FN, Motol. V domácí péči je nutné se zaměřit na: 1. Podávání naordinovaných léků v předepsaných dávkách a intervalech.
2. Podávání pravidelné, vysokokalorické potravy bohaté na tuky a cukry alespoň 6x denně. 3. Hodně solit, zvláště v horku, či při zvýšené tělesné zátěži, malátnosti, zvracení. 4. Péče o domácí prostředí - pečlivý úklid, dezinfekce chloraminem, likvidace plísní. 5. Absolvovat všechna doporučená očkování, hlavně proti spalničkám. 6. Respirační fyzioterapie, která se provádí po probuzení. Během dne dle potřeby a pak večer před spaním. Musí se stát nezbytnou součástí každodenního programu a měla by být pro dítě spíš zábavou, než povinností. Vodítkem pro intenzitu a častost rehabilitačních technik je určování aktuálního stavu dechových rezerv. Kojenec, který pláče hlasitě, jasně a vytrvale, nemá zcela jistě dýchací obtíže! U kojence používáme pasivní rehabilitační techniky jako jsou polohování, kontaktní dýchání, manuální vibrace při výdechu, otřesy, masážní hlazení mezižeberních prostor, mobilizace hrudníku na fyzio míči. U větších dětí je nutné nacvičit smrkání, plivání a nosní sprchu slanou vodou. Dále pak sem patří technika správného vdechu a výdechu, zadržení a přerušení dechu, cvičení hrudní pružnosti, technika silového výdechu, huffing, používání flutteru, dýchání s PEP maskou, ústní brzda, mobilizačnní dechová gymnastika a kondiční tělesná cvičení. 7. Provádění inhalací mukolytik, antibiotik, rekombinantní Dnázy (Pulmozynu). 8. Odsávání - nutné provádět několikrát denně, podle potřeby, ale vždy před jídlem, a po provedení rehabilitačních technik. 9. Je možno zapojit se v Klubu rodičů a přátel nemocných CF-tel. 224 436 184. Literatura 1. Vávrová, V. et al. Cystická fibróza v praxi. Praha: Kreace, 1999. Schumacher, H. Léčebná rehabilitace u cystické fibrózy. Praha: Výbor dobré vůle, 1998.
PÉČE O PACIENTY S ALERGIÍ NA HMYZÍ BODNUTÍ – EXPOZIČNÍ TEST A. Voříšková, J. Zardová Oddělení alergologie a klinické imunologie, FN Královské Vinohrady, Praha S alergií na jed blanokřídlého hmyzu se na našich alergologických pracovištích setkáváme ne tak často jako s ostatními typy alergického onemocnění. Pro závažnost reakce, která v mnohých případech končí systémovou, anafylaktickou reakcí s bezvědomím, je toto onemocnění velice sledované jak zdravotníky, tak zejména pacienty, kteří tuto zkušenost prožili. Klinické projevy systémové reakce jsou rozděleny podle závažnosti na: a) mírná - kdy se objeví u pacienta erytém, pruritus, urtikarie, angioedém, rinitida, nauzea; b) střední – angioedém a bolesti břicha; c) těžká - otok laryngu nebo bronchospasmus, kolaps, hypotenze, bezvědomí, šok. Diagnostické vyšetření pacientů je prováděno jednak podrobnou anamnézou o vzniku a průběhu reakce a zjištění agens. Je velkou výhodou, pokud pacienta provází i lékařská dokumentace s ohodnocením reakce, kde jsou zřetelně popsány symptomy a průběh reakce. Jsou provedeny kožní testy a/nebo kvantitativní
stanovení specifického IgE na hmyzí alergen k pozitivnímu prokázání přecitlivělosti I. typu. Cílem práce alergologické sestry je opakovaná edukace pacienta k získání co nejvíce informací o léčbě a prevenci tohoto onemocnění. Prevence - omezení pravděpodobnosti píchnutí hmyzem. ¨ omezit pobyt v rizikových oblastech (sady, kvetoucí zahrady) ¨ vyvarovat se barevných oděvů ¨ výrazných vůni, parfémů ¨ opatrnost při konzumaci potravin – ovoce, odpadní kontejnery ¨ omezit v blízkosti hmyzu prudké pohyby ¨ nechodit bosí ¨ opatrnost při jízdě na kole a v dopravních prostředcích ¨ nácvik s autoinjektorem ¨ identifikační karta pacienta Prevence a další léčba anafylaxe je závislá na včasném podání Adrenalinu, proto jedna z dalších edukačních činností je prověření vědomostí pacienta při práci s autoinjektorem (Epipen, Anakit...) Zkontrolování zda pacient u sebe nosí identifikační kartičku s označením alergie a dalším postupem v případě bodnutí hmyzem.
EXPOZIČNÍ TEST Ráda bych vás seznámila s prací sestry při provádění expozičního testu u pacientů s alergií na jed včely (Hymenopter), kteří byli léčeni na našem oddělení alergenovou imunoterapií (AIT). Imunoterapie jedem hmyzu probíhala dle podmínek pro správně prováděnou injekční AIT a samotný expoziční test byl prováděn na ARO ve FNKV. Expoziční test – význam (ověření) pro zdravotníky ¨ účinnost léčby ¨ argument pro zdravotní pojišťovny (úhrada) pro pacienta ¨ účinnost léčby = vložené úsilí (čas, úhrada léčby) ¨ psychický = jistota Podíl práce sestry na expozičním testu byl v přípravě pacienta před plánovaným expozičním testem, kdy byla pacientům provedena základní vyšetření: Rtg plíce + srdce, EKG, TK, P, spirometrické vyšetření křivka průtok/objem a nezbytná psychologická příprava pacienta.
Psychologická příprava ¨ seznámení s průběhem testu ¨ upozornění na atypické prostředí ARO – napojení na moni- torovací přístroje ¨ zajištění krevního řečiště - zavedení kanyly ¨ uklidnění pacienta ¨ sledování stavu pacienta – monitorování potíží Sestry zúčastněné na tomto výzkumném úkolu mohly být aktivními svědky výsledku dlouholeté kontinuální léčby pacientů s alergií na hmyzí jed a mohly si rozšířit zkušenosti v práci v oboru alergologie a klinické imunologie. Milým překvapením a oceněním naší práce pro mě osobně bylo zjištění, že naši pacienti měli důvěru v tento experiment i přes své dřívější osobní zkušenosti s anafylaktickou reakcí před léčbou.
ÚLOHA SESTRY PŘI VYŠETŘENÍ INDUKOVANÉHO SPUTA M. Melecká Ústav imunologie a alergologie, FN Plzeň Astma bronchiále je definováno jako chronické zánětlivé onemocnění dýchacích cest. K potvrzení diagnózy a zároveň ke kontrole úspěšnosti léčby je možné využít i poměrně nové neinvazivní metody, kterou je vyšetření indukovaného sputa a která je běžně proveditelná během ambulantního vyšetření. Předpokladem je získání vzorku sputa, který po následném laboratorním zpracování vykazuje přítomnost buněk z dýchacích cest, svědčících pro probíhající zánět. Technika odběru spočívá v inhalaci aerosolu 4% roztoku NaCl pomocí ultrazvukového nebulizátoru. Úloha sestry při vyšetření spočívá v instruktáži pacienta o průběhu a způsobu provedení odběru vzorku. Kontroluje zdravotní stav pacienta, plicní funkční parametry před a po inhalaci, v případě výskytu ztíženého dýchání provede kontrolní spirometrické měření a zajistí podání beta-2 mimetik. Motivuje pacienty k expektoraci sputa (po předchozím vypláchnutí úst) do sterilních odběrových zkumavek. Minimální komplikace, jednoduchost provedení, neinvazivnost metody a uspokojivé laboratorní výsledky svědčí pro vhodnost zavedení do praxe.
ZPRACOVÁNÍ INDUKOVANÉHO SPUTA V. Stejskalová Ústav imunologie a alergologie, FN, Plzeň Indukované sputum je získáno v průběhu inhalace 4% Na Cl. Roztok musí být aplikován nebulizérem. Množství indukovaného sputa je velmi individuální. Sputum se musí zpracovat nejdéle do 2 hodin po odběru. Separujeme hutnější částečky, ke vzorku se přidá 0,1% DTT, promíchá a přidá PBS, přefiltrujeme přes sítko. Spočítá se výtěžnost a životnost. Část vzorku odebereme pro cytospin, zbytek se utočí. Sediment se použije k cytometrickému vyšetření, supernatant je uložen v mrazáku k dalšímu zpracování.
VYŠETŘENÍ ANTIBAKTERIÁLNÍ IMUNITY POMOCÍ ELISA METOD ANTI PCP A ANTI HIB J. Kubíková Ústav imunologie a alergologie, FN, Plzeň Na našem pracovišti se stále více zahrnuje do základního imunologického screeningu vyšetření protilátek proti Cpolysacharidu pneumokoků (PCP) a proti C polysacharidu haemophila influenzae (HIB). Obě tato vyšetření se provádí ELISA metodou na setech BINDAZYME firmy The Binding Site. Obě tyto metody slouží k sledování antibakteriální imunity pacientů. Jak na pneumokoka, tak i na haemophila je dnes k dispozici očkovací látka, děti jsou proti haemophilu očkovány dokonce plošně. Je tedy možné zjistit okamžitou odezvu organismu po očkování i postupně sledovat hladinu protilátek v těle pacienta.
ETICKÉ A SOCIÁLNĚ PSYCHOLOGICKÉ PROBLÉMY SOUVISEJÍCÍ S DAROVÁNÍM KRVETVORNÝCH BUNĚK H. Jedličková, L. Kupková, R. Cimburková, I. Kolaříková, E. Ivašková Český registr dárců kostní dřeně, Praha Cílem sdělení je informování veřejnosti o užší problematice darování krvetvorných buněk. Každoročně proběhne ve sdělovacích prostředcích několik informačních kampaní ukazujících na potřebnost darování kostní dřeně. Téměř nikde se však nehovoří o tom, jak toto darování probíhá a co to znamená pro potenciálního dárce. Tyto informace jsou však velmi důležité. Záměrem registrů je mít dostatečný počet dárců, kteří budou ochotni v registru setrvat dlouhá léta a na požádání se kdykoliv dostavit na příslušná odběrová pracoviště. Ta bývají často velmi vzdálená. Celkový čas nutný k celému výkonu je přibližně 14 dní. Důležitá je také otázka zdravotního stavu potenciálního dárce, jeho fyzické a morální připravenosti snášet nejen bolest a psychickou zátěž, vyplývající se setkávání se stavem možného úmrtí či uzdravení pacienta. To je obtížné hlavně proto, že se jedná o cizí, nepříbuzné lidi, a tedy o to, že to vlastně nemusí podstupovat. Výsledek cílených informací je získávání kvalitních členů registrů, protože každý z nich má právo kdykoliv z registru vystoupit. Celá tato problematika je velice drahá a investovat naději, finanční prostředky a spoustu administrativní práce do dárců, kteří se sice přihlásí, ale dále již nespolupracují, si nemůže dovolit žádný registr na světě a ani ten náš - Český registr dárců kostní dřeně.
TRANSPLANTACE LEDVIN ZE ŽIVÉHO DÁRCE Z POHLEDU HLA LABORATOŘE R. Cimburková, A. Slavčev, H. Sajdlová Imunologické pracoviště, oddělení imunogenetiky, IKEM, Praha V současné době, kdy celosvětově klesá počet kadaverozních dárců, se přistupuje k dárcovství ledvin ze žijících, příbuzných, nebo emotivně spřízněných osob. Pro pacienty, kteří jsou zařazeni v čekací listině, se tak zvyšuje pravděpodobnost získání orgánu v poměrně krátké době. Podle literárních údajů je přežívání těchto orgánů lepší, než z dárců kadaverózních. Kromě podrobných klinických a psychologických vyšetření potenciálního dárce a příjemce jsou v naší laboratoři prováděna imunogenetická vyšetření, která jsou důležitá pro provedení transplantace. U těchto
dvojic provádíme HLA typizaci I. třídy serologicky, HLA typizaci II. třídy pomocí DNA metodik, autologní cross-match (záchyt autoprotilátek). Pro provedení transplantace důležitými vyšetřeními jsou: cross-match příjemce proti dárci - aktuální cross-match bez a s přidáním DTT (záchyt protilátek třídy IgM) a prodloužený cross-match (inkubace při 4 °C - záchyt chladových protilátek, inkubace při 22 °C) a FACS cross-match (metoda citlivější - záchyt protilátek příjemce proti dárci). Na našem pracovišti se začala tato vyšetření provádět rutinně v roce 1997 a doposud bylo vyšetřeno vyšetřeno 169 dvojic. Z toho bylo do konce roku 2001 transplantováno 52 dvojic a pro pozitivní cross-match kontraindikováno 10 dvojic. V roce 2002 bylo dosud vyšetřeno 44 dvojic, transplantováno 8 a kontraindikováno 7 dvojic.
PŘÍNOS PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE K TRANSPLANTACÍM KMENOVÝCH BUNĚK M. Strejcová1, D. Vokurková1, M. Bláha2, J. Matysová1, B. Musilová2 1 2
Ústav klinické imunologie a alergologie, FN, Hradec Králové Oddělení klinické hematologie, FN, Hradec Králové
V současné době zaznamenaly transplantace hematopoetických progenitorových buněk velký rozmach. Indikací k léčbě jsou maligní lymfomy, leukémie, útlumy krvetvorby, některé solidní nádory, defekty imunity i metabolické poruchy. V budoucnu se očekává i možnost transplantace hematopoetických buněk s vnesenými geny – genová terapie. Důvodem nárůstu počtu jak autologních, tak také alogenních transplantací periferních progenitorových buněk jsou výhody: odběr je pro pacienta příjemnější, lze ho opakovat, a tak získat více progenitorů, a to i při kostní dřeni již poškozené tumorem nebo zářením, ale zvláště „recovery hematopoesy“ (doba zotavení krvetvorby) je kratší, takže je méně komplikací v období pancytopenie po transplantaci (klesají i náklady za léčbu infekcí). V širokém spektru stanovení prováděné na průtokovém cytometru v naší laboratoři pro celou FN HK a spádovou oblast se tedy samozřejmě řadí i spolupráce na transplantačním programu. Pro určení kmenových buněk napomáhá detekce povrchové membránové molekuly zařazené jako CD 34. Poměrně jednoduchým, rychlým a přesným stanovením pomocí monoklonální protilátky získáme po změření na průtokovém cytometru procentuální zastoupení CD34 pozitivních buněk. Existují různé typy klonů znaku CD34 na povrchu hematopoetických buněk, pro které jsou komerčně vyráběné monoklonální protilátky. Je potřeba používat stále stejný typ monoklonální protilátky, protože naměřené hodnoty se mohou lišit podle typu reagencie. Ve spolupráci s hematoonkologickou klinikou jsme zavedli měření hematopoetických buněk podle severského protokolu, kde se gatují buňky FS vs SS a měří se exprese znaku CD34 na těchto vybraných buňkách. Používáme monoklonální protilátku značenou fykoerytrinem. Nastavení parametrů pro měření jednotlivých vzorků provádíme podle izotypové kontroly IgG1 značenou stejným fluorochromem. Erytrocyty odstraňujeme lyzačním roztokem. Pro stanovení CD34 analyzujeme 50 000 buněk. V první polovině roku 2002 jsme pro transplantační středisko OKH FN HK vyšetřili 21 pacientů, vloni pro
73 transplantovaných kolem 150 vyšetření. Po šestiletých zkušenostech z měření CD34 pozitivních buněk metodou průtokové cytometrie můžeme konstatovat, že toto imunologické vyšetření je nezbytné při provádění transplantací a vykazuje velmi dobrou korelaci s výsledky kultivačního vyšetření. Množství CD34+ buněk je ukazatelem kvality transplantátu, a to jedním z rozhodujících.
STANOVENÍ PROTEINŮ VYHODNOCENÍ
V
LIKVORU
-
KVANTITATIVNÍ
A
KVALITATIVNÍ
K. Stoklasová, Z. Petanová Krajská hygienická stanice - Imunologický odbor, Ústí nad Labem Likvor je extracelulární tekutina chudá na buňky s nízkým obsahem proteinů. Vyplňuje mezibuněčné prostory CNS. Ve srovnání s krevní plazmou má nižší obsah proteinů. K základnímu vyšetření likvoru patří posouzení vzhledu, cytologie a stanovení definovaných biochemických a některých imunologických parametrů. Kvalitativní a kvantitativní stanovení proteinů (imunoglobuliny, proteiny akutní fáze) v likvoru lze většinou zařadit do skupiny nadstavbových neakutních vyšetření. Kvantitativně se stanovují hladiny celkové bílkoviny (CB), albuminu, imunoglobulinů i proteinů akutní fáze zánětu. Koncentrace CB v likvoru orientačně informuje o těsnosti či propustnosti hematolikvorové bariéry (BCB). Pro stanovení funkce BCB má zásadní význam albumin, který je, stejně jako proteiny akutní fáze (PAF), syntetizovaný v játrech a do likvoru se dostává pouze přestupem přes BCB. Propustnot BCB lze posoudit pomocí poměru likvorových a sérových hladin albuminu, albuminový kvocient (Qalb), jehož zvýšené hodnoty svědčí o poruše BCB. Pro stanovení koncentrací imunoglobulinů a PAF v likvoru je nutné použít metodu imunonefelometrie, lze použít např. analyzátory firem Dade Behring nebo Beckman Coulter. Nefelometricky je možné stanovit i velmi nízké koncentrace proteinů (1 mg/l). Imunoglobuliny pronikají do likvoru přestupem přes BCB nebo jsou syntetizovány lokálně při zánětlivém procesu. Pro průkaz probíhající imunitní reakce v kompartmentu CNS spojené se syntézou Ig se využívá také poměrů likvorových a sérových hladin IgG, IgA, resp. IgM (kvocienty QIgG, A, M). Lze využít grafického vyjádření závislosti Qalb na QIg pro posouzení stavu BCB a přítomnosti intratekální syntézy Ig. Intratekální syntézu IgG prokazujeme nejčastěji u roztroušené sklerózy, IgA u parazitárních onemocněních CNS nebo při mozkovém abscesu, IgM u chronických infekcí. Ze spektra PAF stanovujeme v likvoru hladiny CRP (zvýšení u hnisavých zánětů a meningitid), haptoglobinu, transferinu (markery zánětu), prealbuminu (zvýšené hladiny u některých degenerativních onemocnění) a orosomukoidu (marker nádorového onemocnění). Speciálním případem proteinové likvorové diagnostiky je stanovení b-trace proteinu, bílkoviny, jejíž koncentrace je v mozkomíšním moku několikanásobně vyšší než v séru. Z tohoto důvodu se jeho stanovení používá k odlišení likvoru od jiných tělních tekutin. Pro průkaz syntézy Ig v CNS lze využít i fyzikálně-chemické charakteristiky Ig syntetizovaného v různých tělních kompartmentech (aktivace různých klonů Ig-syntetizujících buněk), např. metodou izoelektrické fokusace (IEF). Nález tzv. oligoklonálních pásů na foreogramu mozkomíšního moku, které nemají příslušné koreláty v séru, svědčí pro intratekální syntézu IgG. Závěrem lze konstatovat, že jediným objektivním kritériem průkazu syntézy imunoglobulinů (především IgG) v CNS je nález oligoklonálního IgG metodou IEF. Stanovení proteinů PAF v likvoru je v současnosti ve stadiu klinického výzkumu (především v ČR).
ANALÝZA POLYMORFIZMŮ GENŮ KÓDUJÍCÍCH CYTOKINY A JEJICH RECEPTORY U AUTOIMUNITNÍCH CHOROB Z. Cimburek, Š. Růžičková , I. Nováková, J. Vencovský Revmatologický ústav, Praha Úvod: Cytokiny jsou důležitými regulátory imunitního systému. Jsou produkovány predevším leukocyty, ale také jinými buňkami v těle a působí prostřednictvím vazby na specifické buněčné receptory. Nejdůležitější biologickou a biochemickou vlastností cytokinu a jejich receptorů je schopnost regulace transkripce jiných genů a mezibuněčných interakcí. Účinek je pleiotropní a často kaskádový. Cytokiny jsou heterogenní skupinou zahrnující interleukiny, chemokiny a interferony. Je pravděpodobné, že polymorfizmy v těchto genech ovlivňují funkčnost cytokinu a příslušných receptorů. Tím by určité alelické kombinace mohly jedince geneticky předisponovat k rozvoji autoimunitní choroby, a tak zvyšovat riziko vzniku onemocnění. Je také možné, že některé alelické kombinace mohou být korelovány s určitými klinickými formami autoimunitních onemocnění. Cíl: Cílem práce byla analýza polymorfizmů v genech pro interleukiny a chemokinové receptory a korelace frekvence jednotlivých polymofrizmů u pacientů s autoimunitními chorobami. Metodika: DNA byla izolována z periferní krve pacientů a zdravých dárců, kvalita byla ověřována spektrofotometricky a elektroforeticky. Výchozí technikou pro stanovení jednotlivých polymorfizmů bylo PCR, v některých případech doplněné restrikčním štěpením PCR produktu. Produkty reakcí byly analyzovány pomocí gelové agarózové elektoroforézy za použití velikostního standardu. Statistická analýza byla provedena pomoci Fischerova testu nebo c2–testu. Výsledky: Byly analyzovány polymorfizmy v následujících genech pro interleukiny a chemokinové receptory: IL-1alfa -889, IL-1beta promotor, IL-1beta exon 5, IL-1RA intron 2, IL-4 intron 3, CCR5 d32 a CCR2-64i. Uvedené variability byly studovány u pacientů s těmito autoimunitními onemocněními: revmatoidní artritida (RA), juvenilní chronická artritida (JCA), psoriatická revmatoidní artritida (PSA), systémový lupus erytematodes (SLE), dermato/polymiositida (DM/PM) a ankylozující spondyloartritida (ASA). Výsledky byly porovnávany se souborem zdravých kontrol. Významně nejvyšší frekvence byla zjistěna u IL1RA alely 2 v souboru pacientů s PSA (30,1 % vs. 15,4 % u kontrol, p = 0,0019). Zvýšený výskyt T alely u IL1beta promotorového polymorfismu byl nalezen u pacientů s PSA (39,0 %), DM/PM (40,1 %), ASA (41,3 %) a SLE (43,7 %). Nejvyšší frekvence deleční varianty CCR5 genu (CCR5d32) byla nalezena u pacintů s PSA (90,7 %) a ASA (90,7 %). Závěr: Studium polymorfizmů v genech pro cytokiny a jejich receptory je důležité pro pochopení jejich role v patogenezi autoimunitních chorob a k definování genu přímo zodpovědných za vnímavost jedince k těmto onemocněním a genu s přídavným modulačním významem. K tomuto účelu je nutné mít k dipozici co nejlépe klinicky definované soubory pacientů.
HLA TYPIZACE PRO POTŘEBY PŘÍBUZENSKÉ TRANSPLANTACE KRVETVORNÝCH BUNĚK - VYBRANÉ PŘÍPADY E. Slavíková, M. Skotalová, Z. Ambrůzová, F. Mrázek, J. Drábek, M. Petřek HLA laboratoře, Ústav imunologie LF UP a FN, Olomouc Úvod: Nezbytnou podmínkou pro správný výběr dárce pro transplantaci krvetvorných kmenových buněk (KKB) je HLA typizace nejbližší rodiny nemocného. Určení dědičnosti HLA haplotypů může být komplikováno u přibližně 1 % rodin rekombinací mezi mateřskými a otcovskými chromozomy (crossing over), kdy dochází k výměně části genové oblasti HLA systému. V této práci jsou prezentovány případy
rodin s rekombinací vybrané z rodinných studií provedených v naší laboratoři v období leden 1997 až červen 2002. Metody: HLA antigeny I. třídy byly určeny u nemocných a jejich příbuzných sérologickou metodou (NIH mikrolymfocytotoxický test). Typizace HLA II. třídy a indikovaná typizace HLA I. třídy na úrovni vysokého rozlišení byla provedena DNA technikou (polymerázová řetězová reakce se sekvenčně specifickými primery, PCR-SSP). Výsledky: Z celkového počtu 266 rodinných studií z uvedeného období byla prokázána rekombinace postihující genovou oblast HLA ve 4 případech (1,5 %). Rekombinace byla nalezena ve dvou případech u pacientů (lokalizace mezi lokusy HLA-C a HLA-A) a u dvou sourozenců nemocných (mezi lokusy HLA-B a HLA-DRB1*). Tento typ rozsáhlé rekombinace u sourozenců zpravidla vylučuje jejich využití jako vhodných dárců KKB pro nemocného. Závěry: Přes nízkou frekvenci výskytu ovlivňuje rekombinace genové oblasti HLA významně přístup k výběru vhodného dárce KKB. Možná rekombinace by měla být před doporučením sourozence nemocného k transplantaci testována i s využitím doplňující HLA typizace DNA technikami.
STANOVENÍ PROTILÁTEK PROTI Cag A VE TŘÍDĚ IgG A IgA – SROVNÁNÍ DVOU SOUPRAV V. Golembievská, A. Kloudová Odbor imunologie a alergologie, KHS, Ostrava Osídlení žaludeční sliznice lidí Helicobacter pylori (Hp) se ve světě pohybuje mezi 20-80 % a je zřejmě závislé na životním stylu a prostředí. Většina osob osídlených Hp nemá žádné klinické potíže. Je-li však Hp přítomen u pacientů trpících dyspepsií nebo duodenálními vředy, stává se významným faktorem v rozvoji těchto onemocnění. Některé kmeny Hp tvoří vedle cytotoxinu také protein, který je produktem tzv. s cytotoxinem asociovaného genu A (cytotoxin – asociated gene A) – CagA. Protein Cag A je silně imunogenní a stimuluje organizmus hostitele Hp k produkci specifických protilátek. Pro tyto vlastnosti se ho využívá jako markeru virulence. Cílem práce bylo zjistit, kolik pacientů trpících dyspeptickými potížemi má protilátky proti proteinu Cag A. Vyšetření některých vzorků bylo prováděno paralelně na dvou soupravách a byla vyhodnocena shoda výsledků dosažených jednotlivými testy. U většiny pacientů byly také v rámci řešení výzkumného úkolu stanoveny v séru protilátky proti Hp ve třídě IgG a IgA (Test Line), antigen Hp ve stolici (HpSA, Meridian) a provedeny dechové testy (UBT, INFAI). Rovněž zde jsme hledali, jaká je korelace mezi výsledky dosaženými jednotlivými testy. Séra 61 osob (pacienti s dyspeptickými problémy a jejich příbuzní) byla testována na přítomnost protilátek proti Cag A ve třídě IgG a IgA soupravou Helicobacter pylori p120 ELISA –VIVA (dodává firma Test Line). Pozitivita ve třídě IgG byla nalezena u 60,66 %, negativita u 37,70 %, hraniční hodnoty u 1,64 %. Pozitivita ve třídě IgA byla stanovena u 11,48 % pacientů, negativita u 72,13 % a hraniční hodnoty u 16,39 %. Celkem 44 z těchto 61 vzorků bylo testováno také soupravami CagA-Ag IgA, resp. IgG - DIA.PRO (dodává firma LABO SERV). Shoda mezi oběma soupravami po vyloučení hraničních hodnot byla ve třídě IgG u 87,5 % a ve třídě IgA u 90,9 % analyzovaných vzorků. Zatímco ve třídě IgG byly vyloučeny jako hraniční pouze 4 vzorky ze 44, ve třídě IgA muselo být vyloučeno plných 22 vzorků. Pět z 22 pacientů negativních na celkové IgG protilátky v séru bylo pozitivních na anti-Cag A IgG a 6 z 37 na celkové IgG anti-Hp pozitivních pacientů bylo negativních na anti-Cag IgG. Z celkově hodnocených 61 pacientů bylo po vyloučení 2 pacientů s hraničními hodnotami 81,36 % pacientů shodně pozitivních nebo
negativních jak na celkové anti-HP IgG protilátky tak na anti-Cag A IgG. IgG protilátky proti Cag A dávaly shodné výsledky s dechovým testem i s testy na průkaz antigenu Hp ve stolici shodně v 80 % testovaných případů. Stanovení protilátek proti Cag A nemělo na našem souboru pacientů výrazný diagnostický přínos ve srovnání se stanovením celkových protilátek proti Hp, stanovením HpSA nebo UBT. Výsledky získané soupravami různých výrobců se mohou lišit.
ORGÁNOVĚ NESPECIFICKÉ AUTOPROTILÁTKY – LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA O. Jůzová Oddělení alergologie a kl. imunologie, FN Královské Vinohrady, Praha Jedná se o autoprotilátky především proti strukturám buněčného jádra. Výskyt těchto protilátek je častý u pacientů se systémovými a orgánově specifickými autoimunitními chorobami. Základní metodou stanovení těchto autoprotilátek je metoda imunofluorescence na tkáňových nebo buněčných substrátech. ANA protilátky se vyšetřují na substrátu HEp-2 buněk, jedná se o linii lidských nádorových epiteliálních buněk. Protilátky ds-DNA se vyšetřují na substrátu Crithidia luciliae. Vyšetření ve fluorescenčním mikroskopu umožňuje nejen stanovení typu protilátek, ale také kvantifikaci pomocí titru pozitivity. Vyšetření ENA (extrahovatelné nukleolární antigeny) se provádí metodami ELISA, imunoblot, imunodot, imunoprecipitace. Tato vyšetření slouží ke zpřesnění nálezu imunofluorescenční metody. Vyšetřením ENA lze identifikovat antigeny: SS-A, SS-B, Scl – 70, U1 – RNP, Sm, Jo – 1, CENP, PCNA, Ku atd. Laboratorní diagnostika antinukleárních protilátek, anti - DNA protilátek a ENA profilu patří mezi základní imunologická vyšetření. Laboratorní výsledky slouží nejen k potvrzení klinické diagnózy, ale napomáhají ve sledování progrese onemocnění a účinnosti léčby. Trendy v současné laboratorní imunologii směřují ke standardizaci těchto vyšetření a jejich automatizaci. Na závěr prezentujeme zajímavé laboratorní nálezy a jejich korelaci s klinickou diagnózou.
IMUNOFENOTYPIZAČNÍ VYŠETŘENÍ broncho- ALVEOLÁRNÍ LAVÁŽE L. Lédlová, D. Landová Imunologický odbor KHS, Ústí nad Labem Úvod: Vyšetření bronchoalveolární laváže (BAL) zaujímá stále významnější místo v diferenciální diagnostice, monitorování terapie a sledování aktivity plicních onemocnění. Vedle cytologického vyšetření se v posledních letech s výhodou využívá imunofenotypizace buněk průtokovou cytometrií, jejíž přínos je především u onemocnění, kde předpokládáme charakteristické zastoupení buněčných resp. lymfocytárních subpopulací. Výhodou této metody je možnost zpracování velkého počtu buněk spolu s podrobnější analýzou buněčných subpopulací. Cíl: Od počátku zavedení imunofenotypizačního vyšetření BAL v naší laboratoři (1996) bylo naším cílem najít a využívat optimální způsob zpracování a vyhodnocování těchto vzorků.
Metodika: Obecnou zásadou je zpracování materiálu v co nejkratším časovém intervalu od odběru s použitím minimálního počtu kroků, což snižuje buněčné ztráty. Bronchoalveolární laváží rozumíme opakovaný výplach bronchů fyziologickým roztokem, který umožňuje získat buňky, prachové částice, nebuněčné složky a případně i původce onemocnění z bronchoalveolárního prostoru. Pro průtokovou cytometrii zpracováváme obvykle obsah čtvrtého výplachu (4. porci). V prvním kroku jsou odstraněny případné agregáty a nečistoty filtrací celé frakce přes gázu, následuje centrifugace 5min., 400g, opatrné slití supernatantu, jemná resuspendace sedimentu. Stanovení absolutního počtu buněk, ověření životnosti (vitální barvení). Odebrání vzorku pro mikroskopický preparát (sedimentační komůrka, Papenheimovo panoptické barvení). Značení monoklonálními protilátkami (MP) – 50µl vzorku (optim. 250 tis. buněk, min. 100 tis. buněk) + 5 µl MP, inkubace 20 min. ve tmě. Lýza erytrocytů (lyzační roztok fi Becton Dickinson- 2ml), lze vynechat v případě čirého vzorku. V této metodice používáme trojí značení (MP konjugované s fluorescenčním barvivem FITC nebo PE a CD45 konjugovaná s PerCP), které umožňuje vyloučení detritu a erytrocytů z leukocytárního okna a tímto přesnější identifikaci leukocytární populace. V základním panelu jsou zahrnuty kombinace CD16/CD14/CD45, izotypová kontrola/CD45, CD3/CD19 /CD45, CD3/CD4/CD45, CD3/CD8/CD45, CD3/HLA-DR/CD45, CD8/CD28/CD45, CD15/CD33/CD45. Měření v programu CELLQUEST, 15-20 tis. buněk, využití logického gatu FSC vs SSC a CD45+ vs SSC, z kterého identifikujeme „čistou“ leukocytární populaci (CD45+) a leukocytární subpopulace dle velikosti a granularity. Stanovení cytometrického diferenciálu z kombinace CD16/CD14/CD45. CD14+ makrofágy, CD16+CD14- neutrofily a NK buňky (v lymfocytární oblasti), CD16-CD14- lymfocyty a eozinofily (lze rozlišit dle odlišného SSC a vyšší autofluorescence u eozinofilů). Závěr: Imunofenotypizační vyšetření BAL, přestože nepatří mezi základní vyšetřovací metody v pneumologii, může v některých případech významně přispět ke stanovení diagnózy. Mezi onemocnění s charakteristickým buněčným zastoupením lze zahrnout např. sarkoidózu s vyšším podílem lymfocytů a dominancí CD4+ lymfo, exogenní alergickou aveolitidu s převahou lymfocytů CD3+CD8+ a idiopatickou plicní fibrózu s posunem ve prospěch PMN (převážně neutrofilů). Metoda trojího značení zajišťuje dokonalejší analytické zpracování materiálu a minimalizaci nepřesnosti způsobené ostatními elementy přítomnými v BAL.
