Prognostické a prediktivní faktory u glioblastoma multiforme

MASARYKOVA UNIVERZITA

Lékařská fakulta

Prognostické a prediktivní faktory u glioblastoma multiforme

Disertační práce

Brno 2011

MUDr. Radek Lakomý

Disertační práce byla vypracována na Lékařské fakultě Masarykovy univerzity v Brně, a to v rámci kombinované formy doktorského studia, v oboru – Onkologie 5103V041. Prohlašuji, že jsem tuto práci pod vedením svého školitele vypracoval samostatně a nepoužil jsem jinou než citovanou literaturu. Se zapůjčováním disertační práce souhlasím.

Uchazeč: MUDr. Radek Lakomý Klinika komplexní onkologické péče Masarykův onkologicky ústav, Brno Lékařská fakulta Masarykovy univerzity, Brno Školitel: prof. MUDr. Rostislav Vyzula, CSc. Klinika komplexní onkologické péče Masarykův onkologický ústav, Brno Lékařská fakulta Masarykovy univerzity, Brno

1

Poděkování Děkuji svému školiteli prof. MUDr. Rostislavu Vyzulovi, CSc. za odborné vedení, cenné rady a připomínky, které mi během studia věnoval.

Dále děkuji svým kolegům za spolupráci při řešení jednotlivých úkolů předkládané práce (dle abecedního pořadí).

MUDr. Renata Belanová MUDr. Leoš Křen, Ph.D MUDr. Eva Lžičařová RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D Prof. MUDr. Martin Smrčka, Ph.D MUDr. Marek Svoboda, Ph.D Mgr. Jiří Šána MUDr. Ivana Šiková Prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc.

Brno 2011

MUDr. Radek Lakomý

2

OBSAH 1. ÚVOD ..................................................................................................................... 5 2. TEORETICKÁ ČÁST .......................................................................................... 7 2.1.

Epidemiologie ................................................................................................... 7

2.2.

Etiologie a patogeneze....................................................................................... 8

2.3.

Klinické příznaky onemocnění a stanovení diagnózy ....................................... 11

2.4.

Základní principy primární léčby ...................................................................... 12

2.4.1. Chirurgie ......................................................................................................... 12 2.4.2. Radioterapie .................................................................................................... 13 2.4.3. Chemoterapie .................................................................................................. 14 2.4.4. Cílená léčba..................................................................................................... 17 2.5.

Základní principy léčby recidivy/progrese onemocnění ................................... 17

2.6.

Současné prognostické faktory.......................................................................... 19

2.6.1. Prognostické faktory ve vztahu k pacientovi .................................................. 19 2.6.2. Prognostické faktory ve vztahu k nádoru ....................................................... 20 2.6.3. Prognostické faktory ve vztahu k léčbě .......................................................... 25 2.7.

Laboratorní metody ke stanovení metylace MGMT genu a miRNA ................ 27

2.7.1. Bisulfitová konverze DNA a HRM analýza ................................................... 27 2.7.2. Reverzní transkripce a kvantitativní PCR v reálném čase .............................. 28 3. CÍLE PRÁCE ........................................................................................................ 30 3.1.

Studie A – klinická část ..................................................................................... 30

3.2.

Studie B – laboratorní část ................................................................................ 30

4. MATERIÁL A METODY .................................................................................... 31 4.1.

Studie A – klinická část ..................................................................................... 31

4.1.1. Soubor pacientů .............................................................................................. 31 4.1.2. Léčebný režim a sledování pacientů ............................................................... 31 4.1.3. Statistická analýza........................................................................................... 32 4.2.

Studie B – laboratorní část ................................................................................ 33

4.2.1. Soubor pacientů .............................................................................................. 33 4.2.2. Metodika bisulfitové konverze DNA a HRM analýzy ................................... 33 4.2.3. Metodika reverzní transkripce a kvantitativní real-time PCR ........................ 37 4.2.4. Statistická analýza........................................................................................... 40

3

5. VÝSLEDKY ........................................................................................................... 41 5.1.

Studie A – klinická část ..................................................................................... 41

5.1.1. Výsledky primární léčby ................................................................................. 41 5.1.2. Výsledky léčby recidivy/progrese .................................................................. 46 5.1.3. Toxicita léčby ................................................................................................. 49 5.2.

Studie B – laboratorní část ................................................................................ 50

5.2.1. Stanovení míry metylace promotoru genu pro MGMT a korelace s klinickými parametry a léčebnými výsledky u pacientů s glioblastomy .......................... 51 5.2.2. Stanovení expresních hladin vybraných miRNA a jejich vztah k prognóze pacientů s glioblastomy .................................................................................. 52 6. DISKUZE ............................................................................................................... 54 6.1.

Studie A – klinická část ..................................................................................... 54

6.2.

Studie B – laboratorní část ................................................................................ 56

7. ZÁVĚR ................................................................................................................... 59 8. SOUHRN ................................................................................................................ 61 9. SUMMARY............................................................................................................ 63 10. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ................................................................. 65 11. SEZNAM ZKRATEK ........................................................................................... 74 12. SEZNAM OBRÁZKŮ........................................................................................... 76 13. SEZNAM TABULEK ........................................................................................... 77 14. SEZNAM PUBLIKACÍ DOKTORANDA .......................................................... 78 15. SEZNAM PŘÍLOH ............................................................................................... 81

4

1.

ÚVOD Primární nádory centrálního nervového systému (CNS) představují velmi heterogenní

skupinu onemocnění, s rozdílným biologickým chováním. Patří sem nádory potenciálně kurabilní (např. meduloblastom, nádory z germinálních buněk), ale také nádory s nepříznivou prognózou (gliomy), u kterých má dnešní léčba převážně paliativní charakter. Současné terapeutické metody mají u většiny zhoubných nádorů CNS limitovanou účinnost a signifikantní toxicitu. I v případě vyléčení mají pacienti často reziduální neurologický a kognitivní deficit, který do určité míry ovlivňuje jejich další život. V běžné klinické praxi se nejčastěji setkáváme s nádory, které mají původ v neuroektodermu (neuroglie) a jsou obecně označovány jako gliomy. Tyto nádory představují více jak 50 % všech primárních nádorů CNS a z nich se ve více jak v 50 % případů jedná o glioblastom. Prognóza pacientů s glioblastomy je i přes velký pokrok v radiodiagnostice, neurochirurgii, radioterapii a chemoterapii stále špatná a za posledních 20 let se zlepšila relativně málo. Je to dáno především biologickým chováním tohoto typu nádoru, jeho lokalizací a stále omezenou účinností jednotlivých léčebných modalit. Klinický výzkum se dnes zaměřuje na „cílenou léčbu“. Výsledky u některých preparátů jsou povzbudivé, nicméně u většiny zatím nenaplnily naše očekávání. Během posledních desetiletí se všechny zúčastněné medicínské obory také aktivně zapojily do hledání a popisu prognostických a prediktivních faktorů. Snad nejlépe a v relativně vysoké shodě mezi jednotlivými týmy a pracovišti na světě jsou zdokumentovány klinické prognostické faktory jako věk v době diagnózy, stav fyzické zdatnosti, rozsah resekce a další. Podobně jako u jiných diagnóz, je dnes velké úsilí věnováno výzkumu na buněčné a molekulární úrovni. Obory jako patologie či molekulární biologie jsou schopny dobře popsat změny na úrovni genů, chromozomů či produkovaných proteinů a objasnit možnou patogenezi nádoru. Zatím se ale nedaří dostatečně identifikovat ty molekulární faktory, které mají jasný vztah k prognóze onemocnění a predikci léčebné odpovědi. Studií u glioblastomů a z nich publikovaných závěrů je obrovské množství a další informace exponenciálně přibývají. Bohužel výsledky jsou často nejednoznačné, někdy protichůdné, jindy podmíněné dalšími faktory. Určitou limitací bývá také malá velikost a heterogenita souborů. Většina těchto prací je ukončena dodatkem, že dané závěry je třeba ověřit na větším souboru pacientů, nejlépe v rámci velké randomizované klinické studie. Dnes je proto velmi těžké se v dané problematice dobře a rychle orientovat.

5

Pro klinika má zatím většina informací o potenciálních molekulárních prognostických a prediktivních faktorech jen okrajový význam. Poznatky nejsou natolik přesvědčivé, aby měly vliv na rozhodování při volbě léčebného postupu. Další výzkum je ale nutné podporovat, protože jinak se naše možnosti a prognózy našich pacientů nemohou zlepšit. Problematikou primárních nádorů mozku se zabývám již mnoho let, v podstatě od svého příchodu na Masarykův onkologický ústav v roce 2002. Od roku 2004 jsem členem komise pro nádory CNS. Aktivně se podílím na rozhodovacím procesu, léčbě, výzkumu, publikační a přednáškové aktivitě týkající se této problematiky.

6

2.

TEORETICKÁ ČÁST

Glioblastoma multiforme patří k primárním mozkovým nádorům, které mají původ v neuroglii a jsou obecně nazývány gliomy. Jedná se o prognosticky nejhorší formu gliomu a svojí incidencí bohužel patří k nejčastějším primárním nádorům mozku vůbec. Název tohoto zákeřného onemocnění pochází již z 20. let minulého století, kdy ho poprvé použili lékaři Percival Bailey a Harvey Cushing v klasifikaci gliálních nádorů mozku [1]. Vážná prognóza pacientů s glioblastomy je dána biologickým chováním onemocnění – rychlý a invazivní charakter růstu a absencí kurativní metody. Medián přežití pacientů s glioblastomy se za posledních 20 let prodloužil řádově o měsíce a to i přes pokrok, kterého bylo v onkologii dosaženo. Jde o další diagnózu, která vyžaduje intenzivní výzkum jak na poli diagnostiky, tak i léčby.

2.1.

Epidemiologie

Primární mozkové nádory představují pouze 2 % všech malignit u dospělých. Cca 50 % z nich jsou gliomy a ve více jak v 50 % případů se jedná o glioblastom. Zjednodušeně řečeno, dnes každý 4. pacient s diagnózou primárního nádoru mozku onemocněl glioblastomem. Incidence primárních mozkových nádorů se za posledních 30 let zdvojnásobila, dnes se pohybuje mezi 2-3 případy na 100 000 obyvatel za rok. Celosvětově má 2 vrcholy, první do 10 let věku a druhý podstatně výraznější mezi 55-70 lety (až 4 případy/100 000 obyvatel/rok). Více než 80 % pacientů je v době stanovení diagnózy starší jak 50 let. V roce 2008 byla incidence primárních nádorů mozku v ČR u dospělé populace (nad 20 let) 7,09/100 000 obyvatel; mortalita 5,66/100 000 obyvatel; mírně převažovali muži (7,75 vs 6,55/100 000), viz Obrázek 1 [2].

7

Obrázek 1: Incidence a mortalita primárních mozkových nádorů u dospělých v ČR [2].

2.2.

Etiologie a patogeneze

Etiologie primárních mozkových nádorů je pravděpodobně multifaktoriální a u většiny případů je neznámá. Za jasně prokázaný vyvolávající faktor je považováno ionizující záření (až 22x zvýšené riziko vzniku gliomu po profylaktické radioterapii kránia u dětí s akutní lymfoblastickou leukémií) a dlouhodobá imunosuprese (infekce HIV, imunosupresivní léčba po transplantacích) [3]. Ostatní potenciální etiologické faktory nebyly studiemi jasně potvrzeny (úrazy hlavy, kouření, elektromagnetické pole, aromatické uhlovodíky a další). Velký zájem vyvolaly klinické studie zaměřené na riziko dlouhodobého používání mobilních telefonů. Jejich možný podíl na zvýšené incidenci gliomů nebyl dosud vyloučen a rozhodně bude toto téma předmětem dalšímu výzkumu [4]. U cca 5 % pacientů můžeme pozorovat familiární výskyt maligních gliomů. V cca 1 % případů vznikají gliomy v rámci známých genetických syndromů (např. Li-Fraumeni syndrom, Turcotův syndrom, neurofibromatóza, tuberozní sklerosa) [5]. V případě familiárního výskytu je známo, že příbuzní 1. stupně mají 2-3x vyšší riziko, že onemocní stejným mozkovým nádorem. V patogenezi gliomů se uplatňují somatické mutace v genech důležitých pro kontrolu buněčného růstu a proliferace [6,7]. V případě glioblastomu bylo zjištěno, že toto onemocnění může vznikat dvěmi cestami. Buďto glioblastom vzniká „de novo“, pak je označován jako primární (90 % glioblastomů), nebo vzniká postupnou maligní transformací z astrocytomu grade (G) 2 nebo G3 (nejčastěji během 4-5 let) a pak se jedná o glioblastom sekundární. Primární glioblastom se vyskytuje častěji u pacientů starších jak 50 let, typická je krátká anamnéza potíží (často méně jak 3 měsíce) a horší prognóza.

8

Primární a sekundární glioblastomy se liší profilem genetických změn. Pro primární glioblastom je charakteristická amplifikace genu pro EGFR (40 % případů) a/nebo jeho overexprese (60 %), PTEN mutace (30 %), p16INK4a delece (30-40 %), MDM2 amplifikace (< 10 %) a/nebo overexprese (50 %), a v 50-80 % případech ztráta heterozygozity (LOH) chromosomu 10. Naopak u sekundárních glioblastomů, které se vyskytují u mladších pacientů (kolem 40 let) a vznikají transformací z astrocytomu G2 nebo G3 nacházíme často mutaci genu p53 (60 % případů) a RB genu, častá je i LOH chromosomů 19q a 10q, ale gen pro EGFR nebývá alterován [8-11]. Z klinického pohledu je dělení glioblastomů na primární a sekundární zatím spíše akademickou otázkou. Léčebný postup se u obou forem nijak neliší. Klasická TNM klasifikace se dnes pro mozkové nádory nepoužívá. Nevypovídala dostatečně o prognóze onemocnění, protože v případě nádorů CNS má větší prognostickou sílu histologický typ než velikost nádoru. V současnosti se všeobecně akceptuje WHO klasifikace z roku 2007 [12]. Ta dostatečně rozděluje nádory dle histologického typu a diferenciace, což lépe charakterizuje onemocnění z hlediska prognózy. V případě astrogliomů se používá čtyřstupňový systém, kde multiformní glioblastom (neboli astrocytom G4) představuje jejich nejagresivnější formu. Dle definice WHO je glioblastom anaplastický gliom, s typickou nukleární variabilitou a vysokou mitotickou aktivitou. Proliferační aktivita bývá úsekově variabilní, v průměru obvykle 15-20 % jader. Výrazně vyšší bývá u malobuněčného glioblastomu. Dalšími určujícími znaky jsou početné mikrovaskulární proliferace s vrstvením endotelií, případně přítomnost ložisek nekrózy. U glioblastomů je možná regionální heterogenita. Ta může být příčinou diagnostických rozpaků při hodnocení limitovaného množství nádorové tkáně ze stereotaktických biopsií, kdy v některých úsecích jsou ložiska vzhledu diferencovaného astrogliomu (G2), nebo oligodendrogliální komponenta. K základnímu barvení tkáně glioblastomu se dnes používá barvení hematoxylin-eosin, které je znázorněno na Obrázku 2.

9

Obrázek 2: Barvení hematoxylin-eosin, zvětšení 200x.

Imunohistochemické barvení s protilátkou proti GFAP (glial fibrillary acidic protein), což je strukturální a funkční bílkovina z kategorie intermediárních filament, se používá ke znázornění gliálních elementů CNS, včetně buněk gliálních tumorů (Obrázek 3). Pro srovnání negativní okrsek cévních struktur v pravém horním rohu.

Obrázek 3: GFAP (klon 6F2), zvětšení 200x.

Imunohistochemické barvení Ki67 (nukleární protein asociovaný s aktivní fází buňky) slouží jako ukazatel proliferující frakce nádorových buněk. Hodnota se udává v procentech a ukazuje počet buněk v aktivní růstové fázi z celkového počtu buněk. Stanovuje se za pomocí morfometrické analýzy z počtu 300-700 jader (Obrázek 4).

10

Obrázek 4: Ki 67 (klon SP6), zvětšení 400x.

2.3.

Klinické příznaky onemocnění a stanovení diagnózy

Klinické příznaky mozkových nádorů obecně závisí na jejich lokalizaci a rychlosti růstu. V případě glioblastomu bývá často vyjádřen syndrom nitrolební hypertenze, dále mohou být přítomny mentální změny, fokální neurologický deficit, méně často epileptické záchvaty. Příznaky onemocnění jsou odrazem infiltrace a útlaku mozkové tkáně při růstu nádoru s perifokálním edémem. Pro glioblastom je typická krátká anamnéza potíží, řádově několik týdnů. Na základě klinických potíží je nejčastěji neurologem indikováno CT nebo MR vyšetření. V případě glioblastomu nacházíme po intravenózní aplikaci kontrastní látky heterogenní, expanzivně se chovající útvar, obvykle utlačující komory a přetlačující středočárové struktury. Často se setkáváme s prstenčitým zvýšením denzity na okraji centrálně uložených nekrotických oblastí přecházející do okolního edému, viz Obrázek 5 a Obrázek 6. Asi 50 % glioblastomů postihuje více jak jeden lalok hemisféry nebo jsou bilaterální. Nejčastější lokalizací je temporální lalok (31 %), dále parietální (24 %), frontální (23 %) a okcipitální (16 %) [13]. Podezřelý nález na CT nebo MR vyšetření je indikací k neurochirurgickému výkonu s cílem histologické verifikace procesu. Důležité je vyloučení neonkologické příčiny (např. absces, ischémie, toxoplazmóza), v případě potvrzení malignity pak odstranění nádorové tkáně. Další pomocné zobrazovací metody nejsou předmětem této práce, proto je zde podrobněji nerozvádím.

11

Obrázek 5: MR vyšetření – T1 zobrazení.

2.4.

Obrázek 6: MR vyšetření – T2 zobrazení.

Základní principy primární léčby

Standardním léčebným postupem u glioblastomu je dnes maximální resekční výkon se zachováním kvality života

následovaný kombinací radioterapie a chemoterapie

s temozolomidem (konkomitantně a v adjuvantním podání po ukončení radioterapie). U pacientů nad 70 let nebo u pacientů v horším klinickém stavu bývá častěji indikována méně intenzivní léčba (samotná radioterapie nebo chemoterapie, nebo jejich sekvenční podání). Léčebná strategie, zvláště pooperační, by měla být určena multidisciplinárním týmem, optimálně ve složení: neurochirurg, radiační a klinický onkolog, radiodiagnostik, neurolog a patolog.

2.4.1. Chirurgie Cílem neurochirurgického výkonu je maximální odstranění nádorové masy bez poškození funkčně důležitých oblastí mozku. Tím dosáhneme zmírnění nebo odstranění příznaků onemocnění, histologické verifikace procesu, zlepšení podmínek pro následnou léčbu a zvýšení šancí na prodloužení života se zlepšením jeho kvality. Neurochirurgický výkon s odstraněním více jak 90 % nádoru má dle četných retrospektivních studií ve srovnání s méně rozsáhlou resekcí nebo biopsií pozitivní vliv na délku života pacientů a patří k všeobecně uznávaným pozitivním prognostickým faktorům [14,15]. Odstranění 100 % nádorové tkáně je pro infiltrativní charakter růstu bohužel nemožné. Dle sekčních nálezů jsou nádorové buňky často nalézány až 2-3 cm od viditelné hranice nádoru. Navíc

12

peroperační odlišení nádorové a zdravé mozkové tkáně bývá často velmi problematické až nemožné. Ammirati a kol. již v roce 1987 publikovali, že makroskopická totální resekce signifikantně zvyšuje pravděpodobnost dvouletého přežití ve srovnání se subtotální resekcí (19 vs. 0 %) [16]. Dle další studie se 416 pacienty autoři také poukazují na superioritu totální resekce (zde definováno > 98 % resekce dle MR kontroly) nad subtotálním resekčním výkonem, medián celkové doby přežití (OS) takto léčených pacientů byl 13,0 vs 8,8 měsíců [17]. Podobné výsledky potvrdila i rozsáhlá metaanalýza 28 studií, kde medián OS u pacientů po totální resekci (součást multimodální léčby) byl 14,0 vs 11,0 měsíců po resekcích subtotálních [18]. Podobné závěry vycházejí i z dalších klinických studií [19-21]. Díky moderním zobrazovacím a funkčním metodách jako funkční MR, stereonavigace, peroperační neurofyziologický monitoring, awake surgery a peroperační fluorescence s 5aminolevulovou kyselinou (5-ALA) jsme dnes schopni za příznivých okolností odstranit až 98 % nádoru nebo bezpečněji operovat v elokventních zónách bez vážného poškození pacienta [22]. Kde je chirurgický výkon rizikový z poškození důležitých struktur, tam je alespoň snaha indikovat stereotaktickou biopsii s cílem získat dostatečné množství tkáně k histologické diagnostice. U nádorů uložených hluboko v kmeni, kde je i stereotaktická biopsie zatížena vysokým rizikem morbidity a mortality je diagnóza výjimečně stanovena jen na základě zobrazovacích metod a klinického průběhu. Vzhledem k infiltrativnímu charakteru růstu glioblastomů, jejich nepřesnému ohraničení od zdravé mozkové tkáně a častému postižení elokventních zón nemůže být samotný chirurgický výkon dostačující a musí následovat radioterapie (3D konformní radioterapie nebo IMRT – radioterapie s modulovanou intenzitou) a pokud možno i chemoterapie. Medián OS se u pacientů s glioblastomy po samotném resekčním výkonu, bez další léčby, pohybuje kolem 4-6 měsíců. Větší benefit operace lze očekávat u mladých pacientů, v dobrém celkovém stavu. U pacientů, kteří nepodstoupí ani chirurgický výkon je pravděpodobná délka života kolem 3 měsíců.

2.4.2. Radioterapie Radioterapie má nezastupitelné místo v komplexní léčbě glioblastomů. V léčebném algoritmu navazuje na neurochirurgický výkon. Její jednoznačný benefit pro pacienty s high-grade gliomy je podložen prospektivními klinickými studiemi již ze 70. let minulého století. Jednou z nich je studie Walkera a kol., ve které byl medián OS u pacientů v rameni

13

s pooperační radioterapií (60 Gy, WBRT – radioterapie celého mozku) 35 týdnů, kdežto v rameni jen s podpůrnou léčbou po neurochirurgickém výkonu 14 týdnů [23]. Podobné výsledky publikoval také Kristiansen a kol., pacienti v rameni s pooperační radioterapií žili podstatně déle než v rameni s nejlepší podpůrnou léčbou (10,8 vs 5,2 měsíce) [24]. Dle výsledků výše uvedených i současných studií lze uvést, že pooperační radioterapie může prodloužit OS na 8-12 měsíců. Následně proběhla řada prospektivních klinických studií, jejichž cílem bylo upřesnit základní parametry pro léčbu zářením (cílový objem, celková dávka, počet frakcí, dávka na frakci a další) [25-27]. Zkoušena byla také role radiochirurgického boostu (15-24 Gy) aplikovaného po konvenční radioterapii (60 Gy). Navýšení dávky se ale jasně nepromítlo do prodloužení OS, navíc bylo zatíženo vyšší lokální toxicitou [28]. Podobně dopadly i studie s brachyradioterapií s využitím radioizotopu I-125 [29]. Standardním postupem je dnes frakcionovaná zevní radioterapie (3D konformní radioterapie nebo IMRT) v celkové dávce 54-60 Gy (1,8-2,0 Gy na frakci) na cílový objem (nádorový objem + 2-3 cm lem) [30]. U pacientů ve vyšším věku nebo v horším klinickém stavu je možné použít šetrnější hypofrakcionační režimy (30-35 Gy/10 frakcí, 40 Gy/15 frakcí). Dle prospektivních klinických studií bylo prokázáno, že OS u takto léčených pacientů je stejné jako při konvenčním režimu 60 Gy/30 frakcí [31,32].

2.4.3. Chemoterapie Postavení chemoterapie v rámci pooperační léčby u high-grade astrocytomů a tedy i glioblastomu bylo dlouho kontroverzní. Klinické studie zkoušející potenciál chemoterapie v této indikaci probíhají již od 70. let minulého století, bohužel často s protichůdnými závěry. Některé neprokázaly statisticky signifikantní vliv přidané chemoterapie na prodloužení života [33,34], jiné naopak zaznamenaly mírné zlepšení OS u pacientů léčených kombinací chirurgie, radioterapie a chemoterapie [35,36]. Zejména metaanalýza 12 studií (GMT Group, 2002) zahrnující přes 3000 pacientů léčených pooperačně samotnou radioterapií nebo současným podáním radioterapie a chemoterapie zjistila absolutní zvýšení jednoletého přežití ze 40 na 46 % a prodloužení mediánu OS o 2 měsíce v případě, že k léčbě byla přidána chemoterapie. Při cytostatické léčbě, založené nejčastěji na derivátech nitrosourey však docházelo k významnému navýšení toxicity. V roce 2002 byla v USA schválena indikace lokální chemoterapie, aplikované do lůžka nádoru po resekci (BCNU – polymer wafers - Gliadel). Prodloužení OS však nebylo nijak přesvědčivé

14

(13,8 vs. 11,6 měsíce u placeba), pooperační komplikace nebyly zcela zanedbatelné, což pravděpodobně zabránilo masovějšímu používání [37]. Role pooperační chemoterapie v léčbě glioblastomu byla zásadně přehodnocena na základě výsledků randomizované multicentrické klinické studie fáze III - EORTC 22981/26981, které byly publikovány Stuppem a kol. v roce 2005 [38]. Pooperační chemoradioterapie s temozolomidem statisticky signifikantně prodloužila OS i přežití bez progrese onemocnění (PFS). Medián OS u pacientů v rameni s konkomitantní chemoradioterapií byl 14,6 vs. 12,1 měsíců bez chemoterapie, dvouleté přežití bylo 26 vs. 10 % bez chemoterapie. Výsledky OS ve vztahu k radikalitě operačního výkonu a charakteru následné léčby zobrazuje Tabulka 1. Tabulka 1: Celkové přežití podle rozsahu operace a následné léčby [39].

Použitá léčba a celkové přežití (%) Čas

Totální resekce

Parciální resekce

Biopsie

CHT/RT

RT

CHT/RT

RT

CHT/RT

RT

2 roky

38,4

15

23,7

9,4

10,4

4,6

3 roky

21,4

5,3

14,3

3,7

7,8

4,6

4 roky

15,9

4,4

11,3

2,5

5,2

0

5 roků

9,9

2,9

11,3

1,2

5,2

0

Medián OS (měsíce)

18,8

14,2

13,5

11,7

9,4

7,8

Zkratky: RT – radioterapie, CHT/RT – chemoradioterapie, OS – celkové přežití

Nejlepší léčebné výsledky byly popsány ve věkové skupině pacientů mladších 50 let. Zde se pěti let dožívalo po kombinované terapii 17 % pacientů, v případě samostatné radioterapie jen 4,9 %. U pacientů nad 50 let byly výsledky znatelně horší, pět let po léčbě chemoterapií a radioterapií žilo 6,4 %, po samotné radioterapii pouze 0,7 % [39]. Součástí Stuppovy analýzy bylo také vyhodnocení léčebných výsledků u pacientů, kteří podstoupili jen biopsii. U pacientů, kteří absolvovali kombinovanou chemoradioterapii (48 pacientů), bylo pozorováno pětileté přežití u 5,2 %. Bohužel ve skupině s následnou samotnou radioterapií (45 pacientů) již ve čtvrtém roce sledování nežil žádný pacient (Tabulka 1) [39].

15

Díky studii byla na základě retrospektivního hodnocení také potvrzena role nového molekulárního prognostického faktoru – metylace promotoru genu pro O6-metylguaninDNA-metyltransferázu (MGMT). Aktivita tohoto DNA reparačního enzymu je spojena s rezistencí nádoru k léčbě, protože enzym odstraňuje alkylační skupiny z O6 pozice guaninu. Inaktivace enzymu nebo pokles produkce při metylaci promotoru jeho genu vede k vyšší účinnosti léčby a v konečném důsledku k prodloužení celkového přežití. Dle této studie měli pacienti s prokázanou metylací promotoru genu pro MGMT delší OS, bez ohledu na podanou léčbu. Jednoznačně nejlepších výsledků ale dosáhli pacienti s metylací MGMT a s podanou konkomitantní chemoradioterapií a adjuvantní chemoterapií, což svědčí i o prediktivním potenciálu tohoto markeru ve vztahu k efektivitě přidané chemoterapie s alkylačním účinkem (temozolomid), podrobně viz Tabulka 2. Tabulka 2: Celkové přežití ve vztahu k použité léčbě a stavu metylace MGMT genu [39].

Celkové přežití (%) Čas

Metylovaný MGMT gen

Nemetylovaný MGMT gen

CHT/RT

RT

CHT/RT

RT

2 roky

48,9

23,9

14,8

1,8

3 roky

27,6

7,8

11,1

0

4 roky

22,1

7,8

11,1

0

5 roků

13,8

5,2

8,3

0

Medián OS (měsíce)

23,4

15,3

12,6

11,8

Zkratky: RT – radioterapie, CHT/RT – chemoradioterapie, MGMT – O6-metylguanin-DNA metyltransferáza, OS – celkové přežití

Stuppův režim se tak díky jasně potvrzenému benefitu adjuvantní chemoterapie stal novým léčebným standardem, který je platný dodnes. Obdobné výsledky publikovali i Mirimanoff a kol. [40], Athanassiou a kol. [41] a řada dalších. Problémy se standardizací metody k vyšetřování stavu metylace promotoru genu pro MGMT jsou zatím jedním z hlavních důvodů, které brání plnému využití tohoto dominantního prognostického a do jisté míry i prediktivního molekulárního markeru v běžné praxi.

16

2.4.4. Cílená léčba Podobně jako u jiných nádorových onemocnění i u glioblastomu proběhla a probíhá řada klinických studií zkoumající efekt „cílené léčby“. Metody založené nejčastěji na monoklonálních protilátkách a tyrosinkinázových inhibitorech v monoterapii nebo v kombinaci se standardním způsobem léčby se zkouší jak u nově diagnostikovaných glioblastomů, tak i v léčbě recidiv. Nejčastěji se jedná o léčiva zaměřená proti mechanismům angiogeneze, signálním drahám receptorů pro růstové faktory, m-TOR, proteinkináze C a integrinům. V tomto směru dosud nejnadějnějších výsledků dosáhl bevacizumab, který je v USA a ve Švýcarsku již schválen k léčbě rekurentních high-grade gliomů, v monoterapii nebo v kombinaci s chemoterapií [42-44]. Začlenění bevacizumabu do první linie léčby ke konkomitantní chemoradioterapii s temozolomidem je nyní předmětem probíhajících klinických studií fáze III (AVAglio, RTOG 0825) [45]. Mezi další perspektivní látky se dnes řadí inhibitor integrinů αvβ3 a αvβ5 – cilengitid. Výsledky z klinických studií fáze II u pacientů s přítomnou metylací MGMT jsou velmi povzbudivé, nyní očekáváme výsledky ze studie fáze III (CENTRIC) [46]. Výsledky klinických studií s dalšími preparáty cílenými na VEGFR (cediranib), EGFR (cetuximab, gefitinib, erlotinib), PDGFR (imatinib), m-TOR (everolimus, temsirolimus), proteinkinázu Cβ2 (enzastaurin) jsou dosud málo uspokojivé [47-52]. Samotná problematika vzniku a dalšího vývoje glioblastomu je natolik složitá, že nemůže být vyřešena jednou léčebnou metodou. V budoucnu budeme pravděpodobně kombinovat moderní cílenou léčbu se standardní cytostatickou léčbou, což se již odráží v designu aktuálně probíhajících a připravovaných klinických studiích. Nové možnosti pravděpodobně nabídne i imunoterapie a genová léčba.

2.5.

Základní principy léčby recidivy/progrese onemocnění

Ve více jak 80 % případů dochází k recidivě glioblastomu do 2-3 cm od okrajů primárního nádoru, multifokální rekurence se objevuje u cca 5-6 % pacientů. Léčba rekurentních glioblastomů je podmíněna více faktory a musí být individuálně zvážena, ideálně cestou multidisciplinární komise pro mozkové nádory. Rozhodování je závislé na věku pacienta, přidružených onemocněních, celkové fyzické zdatnosti, odpovědi na primární léčbu, délce období bez relapsu od primární léčby a také na velikosti a lokalizaci recidivy.

17

V první řadě má být posouzena možnost reoperace. Ve správně indikovaných případech může operační výkon významně prodloužit délku života a zlepšit jeho kvalitu. Pokud operační výkon není možný nebo je příliš rizikový, pak lze zvážit reiradiaci. Limitací je ale často velikost recidivy, již aplikovaná dávka ozařování a časový interval od předchozí radioterapie. Ve vybraných případech můžeme s výhodou využít možnosti stereotaktické radioterapie nebo radiochirurgie [53,54]. Pokud není operace ani reiradiace vhodná, pak lze pacientovi nabídnout paliativní chemoterapii. Většina režimů pro léčbu rekurentních glioblastomů je založena na derivátech nitrosourey (karmustin, lomustin, kombinovaný režim PCV), derivátech platiny, vepesidu nebo cyklofosfamidu. Problémem je ale nízký počet léčebných odpovědí (RR) kolem 10 % a jejich krátké trvání. Medián PFS se pohybuje mezi 3-6 měsíci a pravděpodobnost šestiměsíčního přežití bez progrese (PFS-6) mezi 15-29 % [55-57]. Zatím nebylo studiemi prokázáno, že by kombinovaná chemoterapie byla v případě rekurentních glioblastomů účinnější než monoterapie nitrosoureou [55]. V posledních

létech

bylo

publikováno

velké

množství

prací

s „dose-dense“

a metronomickými režimy s temozolomidem. Medián PFS se dle studií pohyboval mezi 3-4 měsíci a medián délky života od recidivy/progrese mezi 5-9 měsíci, viz Tabulka 3 [58-60]. Nevýhodou dose-dense režimů může být častější selektivní CD4+ lymfopenie, která je rizikovým faktorem pro rozvoj oportunních infekcí (např. Pneumocystová pneumonie) [61,62]. Tabulka 3: Dose-dense a metronomické režimy s temozolomidem [58-60]. Režim 7/14 21/28 28/28

Dávka temozolomidu 150 mg/m2 75-100 mg/m2 50 mg/m2

Dny podávané chemoterapie D 1-7 D 1-21 D 1-28 (kontinuální)

Dávkový interval

PFS-6

14 dní 28 dní 28 dní

48 % 17-30 % 27-35 %

Zkratky: PFS-6 – šestiměsíční přežití bez progrese onemocnění, D – den

Výsledky s metronomickými režimy jsou velmi zajímavé. Problém zatím je, že nejsou podloženy daty z větších klinických studií fáze III. Dle studie fáze II – RESCUE mohou z návratu k temozolomidu v metronomickém režimu profitovat především pacienti, kteří na tomto léku v minulosti nezprogredovali [58].

18

Podobně je na tom i bevacizumab, který má zatím nejlepší výsledky v léčbě rekurentních glioblastomů. Ve studiích byl zkoušen jak v monoterapii, tak v kombinaci s chemoterapií, nejčastěji s irinotecanem. V monoterapii se PFS-6 pohyboval mezi 29-42 % a medián přežití od recidivy byl kolem 7-9 měsíců. V kombinaci s chemoterapií byly výsledky podobné (PFS-6: 30-50 %, medián přežití od recidivy: 8,7-9,8 měsíců) [42-44]. Tolerance léčby byla velmi dobrá. Četnost a závažnost nežádoucích účinků jako krvácení do CNS, trombózy, embolizace, hypertenze nebo proteinurie nebyly odlišné od léčby s bevacizumabem u jiných diagnóz. Problémem je zatím schválení jeho indikace pro léčbu rekurentních glioblastomů v Evropské unii, podmínkou je ověření účinnosti léku v rámci klinické studie fáze III. Jiné preparáty z oblasti cílené léčby se u rekurentních glioblastomů zatím neprosadily a stále jsou předmětem klinického zkoušení. Nejdále je pravděpodobně inhibitor integrinů – cilengitid, který má zajímavé výsledky především u podskupiny pacientů s přítomnou metylací MGMT genu. Svoji účinnost musí ale také potvrdit v klinické studii fáze III [46].

2.6.

Současné prognostické faktory

Prognóza pacientů s glioblastomy je i při použití všech dostupných léčebných metod nepříznivá. Medián celkového přežití se dnes pohybuje kolem 12 měsíců a jen cca 5 % pacientů žije déle než 3 roky. Prognostické faktory můžeme rozdělit do 3 základních skupin. 1. Prognostické faktory ve vztahu k pacientovi 2. Prognostické faktory ve vztahu k nádoru 3. Prognostické faktory ve vztahu k léčbě 2.6.1. Prognostické faktory ve vztahu k pacientovi K obecně uznávaným a klinicky podloženým prognostickým faktorům, které mají vliv na délku života pacientů s glioblastomy patří: Věk – platí, že mladší věk je pozitivním prognostickým faktorem. Dle klinických studií není jasná shoda na věkové hranici, některé uvádí hranici 40 let, jiné 45 let, většina ale uznává hranici 50 let. U pacientů mladších 40 let lze očekávat, že pravděpodobnost 18měsíčního přežití je cca 50 %, ve věku mezi 40-60 lety kolem 20 % a u pacientů starších 60 let jen cca 10 %. Význam věku jako prognostického faktoru potvrdil i Stupp a kol. [38]. 19

Stav celkové fyzické zdatnosti – podobně jako věk, má významný vliv na délku života pacientů. Velkou mírou ovlivňuje léčebnou strategii jak u nově diagnostikovaných pacientů, tak i v případě rekurence. Dnes používáme 2 hodnotící škály – dle Karnofského (KPS) 100-0 a dle ECOG nebo WHO (PS) 0-5. Hodnocení fyzické zdatnosti je důležitou součástí uznávaných prognostických klasifikací, viz níže [94-96]. Stav mentálních funkcí pacienta – kritérium hodnotící stav kognitivních funkcí, orientaci místem, časem, paměťové funkce, afázii, apraxii a další. Maximální hodnota bodů dle hodnotící škály – Mini-Mental Status Examination (MMSE), kterou pacient může dosáhnout je 30. Hodnota 26 bodů a méně je spojena se signifikantně horší prognózou [63,64]. Přítomnost neurologického deficitu a délka příznaků – úzce souvisí se stavem fyzické zdatnosti a mají vliv na intenzitu léčby. Krátké trvání příznaků (< 3 měsíce) svědčí o rychlém růstu a agresivitě nádoru a znamená horší prognózu [94-96]. 2.6.2. Prognostické faktory ve vztahu k nádoru Histologický typ a grade – glioblastom (astrocytom G4) představuje nejagresivnější formu gliomu, sama histologická jednotka je negativní prognostický faktor. I přesto v rámci glioblastomu rozlišujeme prognosticky horší histologické podjednotky (např. sarkomatoidní varianta) [12]. Velikost nádoru a lokalizace – jsou klasické klinické prognostické faktory ovlivňující možnosti multimodální léčby glioblastomu (radikalita resekce, možnosti aplikace cílené radioterapie). Molekulárně-genetické faktory – molekulární a genetické abnormality u gliomů jsou zkoumány již řadu let [6-11,65-69]. Podařilo se popsat patogenezi primárního a sekundárního glioblastomu a základní rozdíly mezi těmito podjednotkami. Dobře byly prozkoumány aberantně aktivované signální cesty (kaskáda RAS a PI3K cesta) jejichž důsledkem je nekontrolovaná buněčná proliferace a růst nádoru, potlačení apoptózy a vystimulovaná angiogeneze. Tyto poznatky jsou základem pro další klinický výzkum s cílenou léčbou.

20



Ztráta heterozygozity (LOH) 10q: je velmi častá genetická porucha u primárních i sekundárních glioblastomů, objevuje se v 60-90 % případů.



Mutace genu p53: gen p53 je tumor supresorový gen a jeho mutace patří k prvním genetickým alteracím u astrocytárních nádorů. Mutace nebo delece se vyskytuje u 2560 % glioblastomů. Hraje důležitou roli především v patogenezi sekundárního glioblastomu, je proto častější u mladších pacientů.



Mutace a amplifikace genu pro EGFR: gen pro EGFR (receptor pro epidermální růstový faktor) se podílí na kontrole buněčné proliferace. Overexprese a aktivační mutace jsou časté u primárních glioblastomů, kde se objevují až ve 40-50 %. Důsledkem je nekontrolovaný buněčný růst. Mutační varianta trvale aktivovaného EGFR (EGFRvIII) je dnes považována za slibný cíl pro peptidové vakcíny [66,67].



Amplifikace a overexprese genu pro MDM2: MDM2 je inhibitor p53. Důsledkem je únik před kontrolními mechanismy proteinu P53. Overexprese MDM2 se vyskytuje v cca 10-15 %.



Amplifikace a overexprese genu pro PDGFR: stimulace PDGFR (receptor pro destičkový růstový faktor) má mitogenní efekt na gliální buňky. Hraje důležitou roli v patogenezi sekundárních glioblastomů (vyskytuje se až v 60 % případů).



Mutace genu pro PTEN: gen se nachází na chromozomu 10q23.3 a má funkci nádorového supresoru. Jeho vyřazení vede k nadměrné aktivitě AKT signální dráhy jejíž důsledkem je nadměrná buněčná proliferace. PTEN mutace se vyskytuje cca u 2030 % glioblastomů, častěji u primárních. Výše uvedené genetické změny jsou nedílnou součástí složité patogeneze glioblastomu.

Klinické studie zaměřené na prognostický význam těchto faktorů ve vztahu k přežití však dosud nepřinesly jednoznačné výsledky. 

Mutace genu pro IDH1: gen pro IDH1 (isocitrát-dehydrogenáza 1) je lokalizovaný na chromosomu 2q33. IDH1 je nezbytná pro tvorbu NADPH (redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát) v cytoplazmě, který je důležitý pro regeneraci glutathionu, důležitého buněčného antioxidantu. Mutace genu pro IDH1 se častěji vyskytuje u mladších pacientů s glioblastomy, se současnou mutací genu p53, u low-grade gliomů a u sekundárních glioblastomů. Dle práce Sansona a kol. byla potvrzena silná korelace mezi přítomností mutací genu IDH1 a diferenciací gliomu (77 % u gliomů G2, 55 % u gliomů G3, ale jen 6 % mutací u gliomů G4 – glioblastomů). Dle statistické analýzy

21

na podskupině 183 pacientů s glioblastomy autoři prokázali signifikantní rozdíl v OS (27,4 měsíce s mutací IDH1 vs. 14,0 měsíce bez mutace, P < 0,01) a svoje zjištění uzavírají tím, že mutace genu pro IDH1 je silný nezávislý příznivý prognostický faktor u léčených gliomů [70]. Závěry však budou předmětem dalších klinických studií. Nevýhodou se zdá být nízká četnost mutací u glioblastomů (kolem 10 %). 

Metylace promotoru genu pro MGMT: metylace promotoru genu tohoto reparačního enzymu je dnes považována za nejvýznamnější molekulární prognostický marker u glioblastomů. Tumor supresorový gen pro MGMT se nachází na chromozomu 10q26. Úkolem tohoto DNA reparačního enzymu je odstraňovat alkylační skupiny z O6 guaninu, významného místa působení alkylačních látek včetně cytostatik jako deriváty nitrosourey nebo temozolomid. V normálních tkáních MGMT působí jako supresor mutací a karcinogeneze. Pokud má buňka nedostatek MGMT, poškozená DNA s navázanými alkylačními skupinami se nemůže opravit a buňka následně podléhá apoptóze. Nádory s vysokou aktivitou MGMT jsou proto nádory chemorezistentní, především vůči cytostatikům s alkylačním účinkem, protože navázané alkylační skupiny

jsou

záhy

pomocí

MGMT

odstraňovány.

Výsledný

efekt

léčby

s temozolomidem tak může záviset na množství aktivní MGMT a na míře inaktivace (metylace) promotorových sekvencí genu pro MGMT. Ke stanovení metylace MGMT genu se nejčastěji používá metoda polymerázové řetězové reakce (PCR). Bohužel, rozdílné výsledky mezi pracovišti při použití této metody zatím brání v rutinním vyšetřování tohoto markeru v klinické praxi a jsou i podnětem pro vývoj nových citlivějších metod, jako např. bisulfitová konverze DNA a HRM (high resolution melting) analýza [71]. Pozitivní vliv metylace MGMT genu na délku PFS i OS u pacientů s glioblastomy, kteří podstoupili léčbu radioterapií a chemoterapií s alkylačními cytostatiky potvrdilo mnoho klinických studií fáze II. Na jejich výsledky pak navázala dosud nejvýznamnější Stuppova studie s adjuvantní konkomitantní chemoradioterapií s temozolomidem z roku 2005. Na podskupině 206 pacientů byla retrospektivně pomocí PCR stanovena hladina metylované MGMT a analyzovány léčebné výsledky. Přítomnost metylace MGMT genu byla zjištěna u cca 45 % pacientů. Ve skupině pacientů s metylací MGMT byl medián OS 18,2 vs 12,2 měsíce bez metylace a to bez ohledu na podanou léčbu (P < 0,001) [72]. Ještě výraznější rozdíl byl zaznamenám v rameni s konkomitantní chemoradioterapií s temozolomidem, medián OS u pacientů s metylací byl 23,4 vs. 12,6 měsíce bez metylace. Naopak se samotnou pooperační radioterapií nebyly rozdíly tak evidentní, medián OS u pacientů s metylací 22

byl 15,3 vs. 11,8 měsíce bez metylace, viz Tabulka 2. Metylace MGMT je proto většinou odborné veřejnosti považována i za pozitivní prediktivní faktor účinnosti systémové terapie s temozolomidem. Rovněž další práce potvrzují, že inaktivace MGMT genu díky metylaci jeho promotoru vede k prodloužení přežití a zvýšení účinku léčby s temozolomidem a BCNU u pacientů s maligními gliomy [73,74]. O významu metylace MGMT, jako faktoru, který přispívá k vyšší chemosenzitivitě glioblastomu svědčí i vyšší četnost metylací MGMT u pacientů s pseudoprogresí, která je projevem vyšší účinnosti léčby (66 vs 34 % bez metylace) [75]. Vyšší procento metylací MGMT je popisováno i u dlouhodobě žijících pacientů po prodělané léčbě s radioterapií a chemoterapií (70-80 vs 40-50 % u nově diagnostikovaných glioblastomů) [76,77]. Stav metylace promotoru genu pro MGMT je dnes považován za tak zásadní prognostický faktor, že je automaticky vyšetřován v rámci všech významných klinických studií u glioblastomů, včetně studií s cílenou léčbou. Byla publikována řada prací s inhibitory MGMT jako O6 - benzylguanin nebo O6 - (4-bromothenyl)guanin, jejichž úkolem bylo eliminovat aktivní MGMT a tím zvýšit účinnost použité chemoterapie. Přípravky se však v praxi zatím neuplatnily, protože významně zvyšují toxicitu chemoterapie také u zdravých buněk [78]. 

MikroRNA: tvoří velkou skupinu krátkých nekódujících RNA (18-25 nukleotidů), které posttranskripčně regulují genovou expresi. Mají schopnost inhibovat translaci onkogenů a nádorových supresorů a tím se podílet na regulaci buněčné proliferace, diferenciace, apoptózy a dalších pochodů [79-81]. Pro glioblastomy bylo zatím identifikováno několik významných mikroRNA (miRNA), ale výzkum v této oblasti je natolik intenzivní, že další rychle přibývají. MiRNA nepodléhají degradaci ve formalinem fixovaném materiálu a proto umožňují rozsáhlý retrospektivní výzkum na tkáních z parafinových bloků. 

miR-21 – se podílí na negativní regulaci apoptózy. Při její zvýšené expresi dochází k inhibici genů zodpovědných za apoptózu (aktivovaných cestou proteinu P53 při poškození DNA např. cytostatickou léčbou) a tím dochází k inhibici apoptózy [82]. MiR-21 může také přispívat k vyšší invazivitě gliomů tím, že potlačuje produkci inhibitorů matrix metalloproteináz, což jsou důležité enzymy k degradaci extracelulární matrix [83].



miR-221/222 – mají také funkci onkogenů. Potlačují produkci proteinu P27, který inhibuje cyklin dependentní kinázy (CDK) [84].

23



miR-181a/181b – mají funkci nádorových supresorů. Inhibují růst a invazi nádorových buněk, podporují apoptózu [85].



miR-128a – má funkci nádorového supresoru. Potlačuje proliferaci nádorových buněk cestou inhibice transkripčního faktoru E2F3a [86].



miR-195/196a/b – mají pravděpodobně funkci onkogenů. Vyšší hladiny bývají spojeny s rezistencí k temozolomidu a kratším přežitím [87,88].

Výše uvedené poznatky jsou základem pro klinický výzkum. Proběhla řada klinických studií jejichž cílem bylo zjistit, jak tyto genetické odchylky a molekulární markery korelují s klinickými parametry, použitou léčbou, její účinností a křivkami přežití. Zásadním problémem je skutečnost, že i přes obrovské množství informací, které dnes máme, jsou výsledky těchto studií zatím nejednoznačné a slibně se jeví jen několik z nich. Příkladem může být velká prospektivní klinická studie Wellera a kol. na souboru 301 pacientů s glioblastomy z roku 2009. Jednalo se o pacienty, kteří po operaci podstoupili standardní radioterapii, eventuelně i v konkomitanci s chemoterapií (temozolomid). Na tomto souboru byla studována mutace genu p53, amplifikace genu pro EGFR, CDK4, MDM2, delece genu pro CDKN2A, delece 1p, 9p, 10q a 19q a kodelece 1p/19q, stav metylace promotoru genu pro MGMT a mutace genu pro IDH1. Dle multivariační analýzy jen mladší věk (< 60 let), KPS

70, metylace MGMT genu a podání konkomitantní

chemoradioterapie s temozolomidem byly nezávislými příznivými prognostickými faktory pro OS. Mutace genu pro IDH1 měla signifikantní vliv jen na delší PFS a pouze trend k prodloužení OS. U ostatních 10 genetických a molekulárních faktorů nebyl prokázán vliv ani na PFS, ani na OS [89]. Podobné výsledky, kdy se nepodařilo objevit silné prognostické faktory pro přežití a prediktory léčebné odpovědi ve vztahu k molekulárním a genovým markerům můžeme nalézt i v dalších studiích [90-92].

24

2.6.3. Prognostické faktory ve vztahu k léčbě K příznivým prognostickým faktorům související s léčbou patří: 

Chirurgický výkon s maximální radikalitou bez poškození funkčně důležitých částí mozku [39].



Aplikace konkomitantní radioterapie a chemoterapie s temozolomidem, který dále pokračuje v adjuvantní léčbě [38-41,89].



Léčba recidivy/progrese onemocnění (vybrané případy) [53-60].

Komentáře k jednotlivým léčebným metodám jsou uvedeny výše – viz kapitola 2.4. a 2.5. Mezinárodní pracovní skupina zabývající se léčbou high-grade gliomů pod záštitou RTOG (Radiation Therapy Oncology Group) vytvořila na základě klinických, histologických a terapeutických prognostických faktorů (věk, KPS, neurologický deficit, histologická diagnóza, délka trvání příznaků, rozsah resekce a aplikovaná dávka radioterapie) tzv. RPA klasifikaci (recursive partitioning analysis), dle které je pacient zařazen do jedné ze 6 prognostických tříd [93,94]. Pacienti ve RPA třídě I mají nejlepší prognózu, pacienti v RPA VI nejhorší. Pro glioblastomy je vyčleněna RPA třída III-VI. Čím je pacient v prognosticky horší skupině, tím má i menší benefit z konkomitantní chemoradioterapie vs samotné radioterapie a také pravděpodobnost kratšího OS (RPA III – 17,9 měsíců, RPA IV – 11,1 měsíců, RPA V – 8,9 měsíců, RPA VI – 4,6 měsíců), viz Tabulka 4. Signifikantní benefit z konkomitantní léčby u glioblastomu lze očekávat u pacientů v RPA třídě III a IV, u RPA V je vliv přidané chemoterapie na prodloužení délky života již hraniční. Ve Stuppově studii (EORTC 26981/22981) byla pro glioblastomy provedena modifikace RPA klasifikace. Karnofského performance status byl nahrazen PS dle WHO (PS 0-2) a neurologický deficit byl podrobněji hodnocen pomocí škály MMSE, viz Tabulka 5 [95].

25

Tabulka 4: RPA klasifikace maligních gliomů dle RTOG [94]. RTOG třída III

Charakteristika pacientů s glioblastomem věk < 50 let, KPS 90-100

IV věk V

VI

věk

Medián přežití (v měsících) 17,9

věk < 50 let, KPS < 90 50 let, resekce, bez neurologického deficitu

11,1

50 let, KPS 70-100, resekce s neurologickým deficitem nebo jen biopsie následovaná RT minimálně 54,4 Gy věk 50 let, KPS < 70, bez neurologického deficitu

8,9

věk

4,6

50 let, KPS 70-100, jen biopsie, RT < 54,4 Gy věk 50 let, KPS < 70, neurologický deficit

Zkratky: RT – radioterapie, KPS – Karnofského performance status, Gy – Gray, RTOG – Radiation Therapy Oncology Group

Tabulka 5: Modifikace RPA klasifikace pro pacienty s glioblastomy podstupující chemoradioterapii s temozolomidem dle EORTC/NCIC [95]. EORTC třída III

Charakteristika pacientů s glioblastomem věk < 50let, WHO PS 0

IV věk

V

věk < 50let, WHO PS 1-2 50let, totální/velká resekce, MMSE

věk

Medián přežití (v měsících) 17

15 27

50let, jen biopsie, MMSE < 27

10

Zkratky: PS - performance status, MMSE - Mini-Mental Status Examination, EORTC - European Organisation for Research and Treatment of Cancer

Na základě hlavních prognostických faktorů, které vyplynuly z četných subanalýz Stuppovy studie jako typ podané léčby, věk, rozsah resekce, PS, MMSE a stav metylace MGMT genu byly sestrojeny nomogramy, které nám mohou pomoci odhadnout prognózu pacienta s nově léčeným glioblastomem (pravděpodobnost dvouletého a celkového přežití) [96]. Nomogramy jsou volně přístupné: http://www.eortc.be/tools/gbmcalculator.

26

2.7.

Laboratorní metody ke stanovení metylace MGMT genu a miRNA

2.7.1. Bisulfitová konverze DNA a HRM analýza Ke stanovení metylace promotoru genu pro MGMT se nejčastěji užívá metoda PCR. Problémy se standardizací postupu a rozdílnost výsledků mezi pracovišti vedou k vývoji nových metod. Jednou z nich je i bisulfitová konverze DNA s následnou analýzou křivek tání s vysokým rozlišením (HRM – high-resolution melting).  Bisulfitová konverze DNA Metoda je založena na rozdílné reakci mezi bisulfitem sodným s nemetylovaným a metylovaným cytosinem. Zjednodušeně řečeno, v případě nemetylovaného cytosinu dochází po přidání bisulfitu a následné desulfonaci ke konverzi cytosinu na uracil. Metylovaný cytosin na rozdíl od nemetylovaného této přeměně nepodléhá, tedy zůstává dále cytosinem, viz Obrázek 7 [97]. Reakce probíhá na jednovláknové DNA (po předchozí denaturaci dvouvláknové DNA).

Poznámka – nukleotidy v modré barvě jsou původně nemetylované cytosiny, které podlehly bisulfitové konverzi na uracily; nukleotidy v červené barvě jsou metylované cytosiny, které konverzi nepodléhají

Obrázek 7: Bisulfitová konverze nemetylovaného cytosinu na uracil, princip metody [97].

 HRM analýza křivek tání DNA Po bisulfitové

konverzi

je

DNA amplifikována

pomocí

PCR s interkalací

fluorescenčního barviva. Tím je připravena k následné HRM analýze. Při postupném zahřívání dochází k denaturaci DNA (rozvolnění dvoušroubovice) a tím uvolnění fluorescenčního barviva, což vede k poklesu intenzity fluorescence, která je snímána přístrojem pro HRM [97]. Výsledkem je „křivka tání“. Křivky tání jednotlivých vzorků 27

DNA se liší podle míry metylace. DNA s původně nemetylovaným cytosinem, který podlehl bisulfitové konverzi na uracil, má nižší bod tání než DNA s metylovaným cytosinem. Při postupném zahřívání tak dochází k dřívější denaturaci DNA s uracilem s uvolněním zářiče a následně k rychlejšímu poklesu intenzity fluorescence, viz křivky tání (Obrázek 8). Na základě porovnání křivek zkoumaných DNA s křivkou referenční DNA pak můžeme stanovit míru jejich metylace.

Obrázek 8: Normalizované křivky tání promotoru genu pro MGMT.

2.7.2. Reverzní transkripce a kvantitativní PCR v reálném čase Ke stanovení miRNA je dnes využívána TaqMan technologie. U této metody dochází k propojení reverzní transkripce (RT) a kvantitativní PCR v reálném čase (real-time PCR).  MiRNA-specifická reverzní transkripce Reverzní transkripce každé miRNA probíhá za použití specifického stem-loop RT primeru s vlásenkovou strukturou, jehož úkolem je zajistit, aby produkt reverzní transkripce (cDNA) byl dostatečně dlouhý a mohl sloužit jako templát pro kvantitativní PCR (Obrázek 9) [98].

28

Obrázek 9: Reverzní transkripce a polymerázová řetězová reakce v reálném čase (Applied Biosystems) [98].

 Stanovení exprese vybraných miRNA pomocí kvantitativní PCR v reálném čase Metoda real-time PCR je založena na principu klasické PCR, ale amplifikovaná DNA je měřena po každém cyklu. Metoda využívá speciálně připravených TaqMan-MGB (minor groove binder) sond. Na 5´ konci každé sondy je navázán zářič (reporter – R), na 3´ konci jeho zhášeč (quencher – Q). U sondy v klidovém stavu je záření pohlcováno zhášečem. Na konci každé syntetické fáze PCR dochází k exonukleázovému rozštěpení TaqMan-MBG sondy TaqMan polymerázou, čímž je narušeno pohlcování záření zhášečem a fluorescenční záření je pak možné zaznamenat analyzátorem (Obrázek 10). S každým cyklem tak narůstá intenzita záření. Z kalibrační křivky paralelně amplifikovaného vnitřního standardu, pak můžeme stanovit koncentraci miRNA studovaného genu [98].

Obrázek 10: Polymerázová řetězová reakce, rozštěpení TaqMan-MBG sondy TaqMan polymerázou s následným uvolněním fluorescenčního záření [98].

29

3.

CÍLE PRÁCE Prvním cílem mé disertační práce bylo ověřit známé prognostické a potenciální

prediktivní klinické faktory a molekulární markery. Druhým cílem bylo pokusit se pomocí analýzy vybraných miRNA definovat nové biomarkery ve vztahu k prognóze pacientů a predikci léčebné odpovědi.

3.1.

Studie A – klinická část

Charakteristika a vliv potenciálních klinických prognostických faktorů a použité léčby na základní parametry přežití u pacientů s glioblastomy. 

Zhodnocení vlivu klinických faktorů a použité léčby na základní parametry přežití.



Zhodnocení toxicity léčby.

3.2.

Studie B – laboratorní část

Stanovení míry metylace promotoru genu pro reparační enzym MGMT a analýza exprese vybraných miRNA a jejich korelace s klinickými parametry a léčebnými výsledky u pacientů s glioblastomy. 

Stanovení míry metylace promotoru genu pro MGMT a analýza exprese vybraných

miRNA v nádorové tkáni. 

Posouzení vzájemných vztahů mezi metylací promotoru genu pro MGMT, vybranými

miRNA v nádorové tkáni a přežitím pacientů s glioblastomy. Pomocí biostatistických metod pak stanovení prognostického a prediktivního potenciálu zkoumaných biomarkerů.

30

4.

MATERIÁL A METODY

4.1.

Studie A - klinická část

4.1.1. Soubor pacientů Do retrospektivního hodnocení bylo zařazeno celkem 86 pacientů. Jednalo se o všechny pacienty starší jak 18 let s histologicky potvrzeným glioblastomem, kteří v období od ledna 2003 do prosince 2009 zahájili po chirurgickém zákroku konkomitantní chemoradioterapii s temozolomidem s následným záměrem podání 6 cyklů adjuvantní chemoterapie. Téměř všichni pacienti byli operováni na Neurochirurgické klinice Fakultní nemocnice Brno, následná léčba pak probíhala v Masarykově onkologickém ústavu. Resekce primárního nádoru byla považována za makroskopicky totální (bez přítomnosti evidentního rezidua) pokud bylo dosaženo shody neurochirurga i pooperační zobrazovací metody. V ostatních případech byl rozsah resekce vyhodnocen buď jako subtotální (reziduum do 20 %) nebo parciální (reziduum nad 20 %). 4.1.2. Léčebný režim a sledování pacientů  Schéma konkomitantní chemoradioterapie a adjuvantní chemoterapie Konformní radioterapie byla prováděna standardní frakcionací (5x1,8-2,0 Gy/týden, celková dávka 60 Gy za 6 týdnů). Nejčastěji byla použita technika dvou laterolaterálních nebo konvergentních polí brzdného záření lineárního urychlovače o energii 6 MV a 18 MV. Plánovací cílový objem zahrnoval lůžko nádoru a reziduum s bezpečnostním lemem 2-3 cm. Po 4 týdnech léčby (aplikovaná dávka 20x1,8-2,0 Gy) byl bezpečnostní lem zmenšen na 1-2 cm a bylo pokračováno v radioterapii (10x1,8-2,0 Gy) do celkové dávky 60 Gy. Konkomitantní temozolomid byl podáván v dávce 75 mg/m2, den 1.-42., p.o., po celou dobu radioterapie, včetně víkendů. Adjuvantní léčba s temozolomidem v monoterapii byla indikována po ukončení konkomitantní chemoradioterapie (za 4-6 týdnů po ukončení ozařování) v dávce 150-200 mg/m2, p.o., den 1.-5., interval 28 dní, celkem 6 cyklů nebo do progrese onemocnění. Léčebné schéma bylo totožné s postupem, který ve své studii použili Stupp a kol. [38].

31

 Sledování pacientů v průběhu léčby a po jejím ukončení K hodnocení velikosti pooperačního rezidua bylo prováděno časné CT nebo MR vyšetření (do 72 hodin po výkonu). Další CT nebo MR vyšetření k hodnocení efektu proběhlé konkomitantní chemoradioterapie bylo standardně indikováno za 4-6 týdnů po jejím ukončení. V průběhu adjuvantní chemoterapie s temozolomidem a/nebo následného sledování bylo CT nebo MR prováděno každé 3 měsíce, pokud aktuální stav pacienta nevyžadoval kontrolu dříve. Ze zobrazovacích metod bylo vždy jednoznačně preferováno MR vyšetření, CT bylo použito v případech, kdy nebylo MR dostupné nebo nebylo z medicínských důvodů možné. Odborné neurologické vyšetření atestovaným neurologem bylo standardně prováděno před zahájením konkomitantní chemoradioterapie, dále za 4-6 týdnů po jejím ukončení a poté každé 3 měsíce. V případě klinických potíží byl neurolog konzultován kdykoliv mimo původní plán. V případě progrese onemocnění (progrese velikosti tumoru o 25 % a více, nové satelitní léze, klinické zhoršení pacienta s nutností navýšení kortikosteroidů) byl další postup posouzen multidisciplinární komisí pro mozkové nádory [99]. Zde byly zváženy alternativy následné léčby: operace, reiradiace (včetně stereotaktické radioterapie a radiochirurgie), paliativní chemoterapie nebo symptomatická léčba. Toxicita léčby byla stanovena na základě klasifikace dle National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events (NCI-CTCAE) version 3.0 [100].  Sledované parametry přežití  přežití bez progrese onemocnění (PFS) - doba od operace do recidivy/progrese nádoru nebo úmrtí pacienta  celkové přežití (OS) - doba od operace do úmrtí pacienta  přežití od zjištění recidivy/progrese do úmrtí pacienta 4.1.3. Statistická analýza K základní charakteristice dat byly použity běžné statistické funkce (např. medián, procentuální vyjádření výsledku). V analýzách přežití byla při porovnání přežívání jednotlivých skupin pacientů využita Kaplan-Meierova metoda. Hladiny významnosti mezi jednotlivými skupinami pacientů byly vypočteny pomocí log-rank testu, případně GehanWilcoxonovým testem. Křivky přežití byly sestrojeny klasickou Kaplan-Meierovou metodou. Za statisticky signifikantní byly považovány hodnoty P ≤ 0,05. Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno pomocí programu MedCalc, verze 9.3.9.0. Práce byla 32

zpracována programovými produkty společnosti Microsoft (Microsoft Word, Microsoft Excel).

4.2.

Studie B - laboratorní část

4.2.1. Soubor pacientů Do laboratorní části práce bylo zařazeno celkem 38 pacientů s dostupnou nádorovou tkání. K analýze byla použita formalinem fixovaná tkáň z parafinových bloků. Všechny vzorky byly vyšetřeny 2 nezávislými neuropatology (Fakultní nemocnice Brno a Masarykův onkologický ústav), tím bylo vyloučeno zařazení jiného gliomu nebo gliomu nižšího gradu a zajištěna dostatečná kvalita materiálu (> 90 % nádorové tkáně). Ke stanovení míry metylace promotoru genu pro MGMT byla použita metoda založená na bisulfitové konverzi DNA a HRM analýze, viz kapitola 2.7.1. Ke kvantitativnímu stanovení expresních hladin miRNA byla použita metoda reverzní transkripce a kvantitativní PCR v reálném čase, viz kapitola 2.7.2. K analýze bylo vytipováno 8 miRNA (miR-21, miR-128a, miR-181c, miR-195, miR196a, miR-196b, miR-221, miR-222), které mají dle dostupných literárních zdrojů významný vztah k patogenezi glioblastomu. Jako zdravá kontrola byla použita mozková tkáň odebraná z blízkého okolí operovaných arteriovenózních (AV) malformací – 6 nenádorových vzorků. Dále pro posílení validity studie a ke kontrole našich předchozích závěrů byl tento soubor rozšířen o 4 komerčně dostupné vzorky RNA izolované ze zdravé mozkové tkáně dospělých jedinců (Agilent-Strata gene, 540005 – total brain, 540117 – frontal cortex, 540137 – occipital cortex, 540135 – striatum). 4.2.2. Metodika bisulfitové konverze DNA a HRM analýzy Celý proces probíhá v několika na sebe navazujících krocích. Nejprve je nutno provést izolaci DNA z formalinem fixované tkáně z parafinových bloků, pak následuje bisulfitová konverze a HRM analýza. a) Izolace DNA z formalinem fixované tkáně z parafinových bloků Izolace DNA ze vzorků tkáně byla provedena pomocí QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN)

33



Pomocí skalpelu nakrájet parafínový bloček na velmi drobné části, přenést do 1,5 ml mikrozkumavky, přidat 1 ml xylenu a po důkladném promíchání stočit (max. RPM/2 min./RT), odstranit supernatant



Přidat 1 ml ethanolu (96-100 %), promíchat a stočit (max. RPM/2 min./RT), odstranit supernatant



Otevřít víčko mikrozkumavky a inkubovat (37 0C/10 min.)



Pelet resuspendovat ve 180 ul Buffer ATL, přidat 20 ul proteinázy K a promíchat



Inkubovat (56 0C/1 hod.)



Inkubovat (90 0C/1 hod.)



Přidat 200 ul Buffer AL, 200 ul ethanolu (96-100 %), promíchat a krátce stočit



Přepipetovat lyzát do QIAamp MinElute kolony předem připravené ve sběrné zkumavce (2 ml). Stočit (8000 RPM/1 min.) a odstranit roztok ze sběrných mikrozkumavek



Přidat 500 ul Buffer AW1, stočit (8000 RPM/1 min.) a odstranit roztok ze sběrných mikrozkumavek



Přidat 500 ul Buffer AW2, stočit (8000 RPM/1 min.) a odstranit roztok ze sběrných mikrozkumavek



Stočit (max. RPM/3 min.)



Přemístnit QIAamp MinElute kolonu do čisté sběrné mikrozkumavky (1,5 ml), přidat 50 ul Buffer ATE a inkubovat (RT/1 min.)



Stočit (max. RPM/1 min.), eluovat vyizolovanou DNA

b) Vlastní stanovení míry metylace promotoru genu pro MGMT pomocí metody bisulfitové konverze DNA a HRM analýzy Míra metylace promotoru genu pro MGMT byla u jednotlivých vzorků po bisulfitové konverzi DNA analyzována pomocí metody HRM. Bisulfitová konverze byla provedena s využitím EpiTect Bisulfite Kits (QIAGEN) na termocykleru PTC-200 PJ Research (BIORAD). K přípravě vlastní HRM byl použit kit LightCycler 480 High Resolution Melting Master (ROCHE) s detekčním systémem SYBR Green I. Analýza jednotlivých vzorků proběhla v triplikátech na přístroji LightCycler 480 (ROCHE). Jako referenční DNA byly použity CpGenome Universal Methylated DNA a CpGenome Universal Unmethylated DNA set (MILLIPORE).

34

 Bisulfitová konverze DNA 

Do 200 ul PCR mikrozkumavek pipetovat reagencie dle následujícího rozpisu:  DNA* (2 ug)

20 ul

 Bisulfite Mix

85 ul

 DNA Protect Buffer

35 ul

 Celkové množství

140 ul

*DNA vyizolovaná dle postupu v části Izolace DNA z formalinem fixované tkáně z parafinových bloků (viz výše). 

Provést bisulfitovou konverzi DNA pomocí termocykleru s následujícím nastavením: 5 min.

95 0C

25 min.

60 0C

5 min.

95 0C

85 min.

60 0C

5 min.

95 0C

175 min.

60 0C

 Denaturace  Inkubace  Denaturace  Inkubace  Denaturace  Inkubace  Hold



∞

20 0C

Přepipetovat zkonvertovanou DNA do 1,5 ml mikrozkumavky, přidat 310 ul Buffer BL obsahujícího 10 ul/ml carrier RNA a promíchat



Přidat 250 ul ethanolu (96-100 %), promíchat a stočit



Přepipetovat roztok do EpiTect spin kolon předem připravených ve sběrných mikrozkumavkách a stočit (max. RPM/1 min.), odstranit roztok ze sběrných mikrozkumavek



Do EpiTect spin kolony přidat 500 ul Buffer BW a stočit (max. RPM/1 min), odstranit roztok ze sběrných mikrozkumavek



Do EpiTect spin kolony přidat 500 ul Buffer BD, inkubovat (RT/15 min) a následně stočit (max. RPM/1 min), odstranit roztok ze sběrných mikrozkumavek



Do EpiTect spin kolony přidat 500 ul Buffer BW a stočit (max. RPM/1 min), odstranit roztok ze sběrných mikrozkumavek, tento krok ještě jednou zopakovat



Umístnit EpiTect spin kolonu do nové sběrné mikrozkumavky (2 ml) a stočit (max. RPM/1 min.)



Přemístnit EpiTect spin kolonu s otevřeným víčkem do čisté mikrozkumavky (1,5 ml) a inkubovat (56 0C/5 min.)



Přidat 20 ul Buffer EB a stočením (max. RPM/1 min.) eluovat purifikovanou DNA 35

Poznámka: Stejným způsobem provedeme bisulfitovou konverzi referenčních DNA, ze kterých byla předem naředěna řada 0 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 90 % a 100 % metylované DNA.  High-Resolution Melting analýza 

V 1,5 ml mikrozkumavce umístněné na ledu připravit PCR Mix dle následujícího

rozpisu na jednu reakci:  Master Mix 2x  Primer mix 20x (4 uM)

10 ul 1 ul

 MgCl2 (4nM)

3,2 ul

 Voda

4,8 ul

 Celkové množství

19 ul



Připravený PCR Mix pipetovat po 19 ul do 96ti jamkové bílé destičky (ROCHE)



Do každé jamky přidáme 1 ul příslušné DNA po bisulfitové konverzi



Analýzu provedeme na přístroji LightCycler 480 s následujícím nastavením:  Aktivace

1 cyklus 95 0C

10 min.

 Amplifikace

50 cyklů 0

10 s.

95 C

20 s.

58 0C

20 s.

72 0C

 HRM

1 cyklus 0

1 min.

95 C

1 min.

50 0C

5 s 72 0C 95 0C

zahřívání 30 s

 Chlazení 1 min.

1 cyklus 0

40 C

Poznámka: Primery převzaty z Wojdacz and Dobrovic, 2007 [71] MGMT MS-HRM2

F-GCGTTTCGGATATGTTGGGATAGT R-AACGACCCAAACACTCACCAAA

36

4.2.3. Metodika reverzní transkripce a kvantitativní real-time PCR Celý proces probíhá v několika na sebe navazujících krocích [101]. a) Izolace RNA obohacené o miRNA z parafinových bloků  Deparafinace a trávení – den 1 Vzorek: tkáň z parafinového bločku Pomůcky: skalpel, 1,5 ml eppiny, xylen, 99,8 % ethanol, kit firmy ROCHE Postup: 

Vzorek vložit do eppiny (1,5 ml)



Vzít skalpel a rozřezat vzorek na co nejmenší kousky



Přidat do eppiny ke vzorku 800 ul xylenu a 5 minut v ruce převracet



Přidat 400 ul ethanolu a protřepat, centrifugovat (2 min./max.), odstranit supernatant



Přidat 1ml ethanolu, protřepat a centrifugovat (2 min./max.), odstranit supernatant, sušit na termobloku (10 min./55 0C) (otevřená eppina)



Přidat 100 ul Parafin Tissue Lysin Buffer, 16 ul 10 % SDS, 40 ul proteinasa K, protřepat



Nechat trávit přes noc v termobloku při 55 0C (nejméně 3 hodiny) (zavřená eppina)

 Izolace RNA – den 2 Pomůcky: 2 ml eppiny, 99,8 % ethanol, kit firmy Ambion-mirVanaTM (Ambion, USA) Postup: 

Ke vzorku přidat 600 ul Lysin Binding Buffer, 100 ul microRNA Homogenate additive, důkladně vortexovat



Inkubovat 10 minut na ledu



Přidat 600 ul směsi kyselého fenolu a chloroformu, vortexovat 1 minutu, centrifugovat (5 min./max.)



Přichystat 2 ml kalibrovanou eppinu



Opatrně přenést vodnou fázi do nové 2 ml kalibrované eppiny – změřit objem (objem vynásobit 1,25 – výsledek je objem ethanolu, který přidáme v dalším kroku)



Přidat vypočítané množství ethanolu



Přichystat kolonu se spodní zkumavkou



Ze vzorku odebrat 700 ul (max. objem kolony) a přenést na kolonu, centrifugovat (15 s/10000 RPM/RT), odstranit filtrát



Celé opakovat, dokud nepřefiltrujeme veškerý původní vzorek 37



Přidat 700 ul Wash Solution 1, centrifugovat (5-10 s/10000 RPM/RT), odstranit filtrát



Přidat 500 ul Wash Solution 2/3, centrifugovat (5-10 s/10000 RPM/RT), odstranit filtrát



Opět přidat 500ul Wash Solution 2/3, centrifugovat (5-10 s/10000 RPM/RT), odstranit filtrát



Centrifugovat (bez jakéhokoliv přidaného roztoku) (1 min./10000 RPM/RT), odstranit filtrát



Kolonu přesunout do čisté spodní zkumavky



Přenést potřebné množství Elution Solution do eppiny a zahřát na 95 0C



Co nejrychleji odebrat 50 ul Elution Solution a nalít na kolonu, centrifugovat (30 s/max RPM/RT)



Výsledný filtrát obsahující vyizolovanou RNA obohacenou o mikroRNA dále zpracováváme nebo uchováváme v mrazáku při teplotě –80 0C Koncentrace byla měřena a čistota ověřena UV spektrofotometricky pomocí přístroje

Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, USA) a nekontaminovaná RNA (A260/A280 > 2.0, A260/A230 > 1.8) byla dále zpracována. b) Vlastní miRNA specifická reverzní transkripce a stanovení miRNA pomocí kvantitativní real-time PCR  miRNA specifická reverzní transkripce Ke specifické reverzní transkripci (RT) byl použit TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit a stem-loop RT primery, které jsou součástí TaqMan MicroRNA Assay. Vlastní RT pak proběhla na termocykleru PTC-200 PJ Research (BIO-RAD). Složení RT směsi pro jeden vzorek:  100 mM dNTPs s dTTP

0,15 ul

 MultiScribeTMReverse Transcriptase, 50 U/ul

1,0 ul

 10x Reverse Transcription pufr

1,50 ul

 RNase Inhibitor, 20 U/ul

0,19 ul

 Nuclease-free water

4,16 ul

------------------------------------------------------------------------ Celkový objem RT směsi

7,0 ul

38

Nastavení termocykleru pro reverzní transkripci (teplotní profil doporučený výrobcem):  16 0C/30 min.  42 0C/30 min.  85 0C/5 min.  4 0C/∞

Postup při reverzní transkripci: 

Izolace RNA z parafinových bloků (viz výše)



Jednotlivé složky pro přípravu RT směsi (viz výše) nechat roztát na ledě



Složky RT směsi (viz výše) smíchat v 1,5 ml zkumavce



Mírně směs promíchat, stočit a dát na led



Naředit RNA na koncentraci 10 ng/5 ul



Připravit 0,2 ml stripy a do každého napipetovat 7 ul RT směsi



Do každé mikrozkumavky přidat 5 ul příslušného vzorku



Do každé mikrozkumavky přidat 3 ul příslušného RT primeru



Lehce promíchat a stočit



Inkubovat 5 minut na ledě



Nastavit termocykler dle doporučení výrobcem (viz výše)



Nastavit objem reakce na 15 ul



Spustit reverzní transkripci



Po ukončení vzorky zamrazit při –20 0C nebo pokračovat v PCR amplifikaci

 Stanovení expresních hladin vybraných miRNA pomocí kvantitativní real-time PCR K provedení real-time PCR bylo použito TaqMan 2x Universal PCR Master Mixu a fluorescenčně značených TaqMan MicroRNA Assays. K endogenní kontrole byla použita RNU6B. Měření každého vzorku bylo provedeno v triplikátu na přístroji Applied Biosystems 7500 Sequence Detection system (Applied Biosystems, USA). Výsledná relativní exprese analyzovaných genů byla vyjádřena poměrem mezi průměrným počtem kopií sledovaného a housekeepingového genu.

39

Složení PCR reakční směsi při stanovení miRNA systémem TaqMan – pro jednu reakci:  2x TaqMan Universal PCR Master Mix II

10,00 ul

 TaqMan MicroRNA Assay (20x)

1,00 ul

 Produkt reverzní transkripce

1,33 ul

 RNAse free H2O

7,67 ul

-------------------------------------------------------------------------------- Celkem

20,00 ul

Teplotní profil pro PCR reakci dle doporučení výrobcem:  50 0C/2 min.  95 0C/10 min.  95 0C/15 s. – 40 cyklů  60 0C/1 min. – 40 cyklů

Postup při real-time PCR amplifikaci: 

Připravit 1,5 ml zkumavku pro každý vzorek + negativní kontrolu (NK) pro každou miRNA



Do každé zkumavky napipetovat PCR směs (viz výše), do NK napipetovat místo produktu RT vodu



Jemně promíchat a stočit



Napipetovat každý vzorek v triplikátu po 20 ul do 96 jamkové desky



Překrýt desku folií proti vyschnutí



Stočit, aby nebyly přítomny bublinky



Vložit desku do přístroje (Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System)



Spustit software, zadat nový experiment, zvolit značení sondy (microRNA-FAM) a pojmenovat příslušné jamky



Nastavit podmínky PCR amplifikace - objem 20 ul (viz výše)



Spustit měření



Po skončení analyzovat a exportovat hodnoty CT.

4.2.4. Statistická analýza Statistická analýza ke zhodnocení rozdílů hladin miRNA mezi zdravou a nádorovou tkání a vztahu hladin miRNA k léčebné odpovědi a času do progrese onemocnění (TTP) byla provedena pomocí nonparametrického Mann-Whitneyova U testu. Křivky přežití byly vytvořeny pomocí Kaplan-Meierovy metody a statistická významnost vypočtena pomocí 40

log-rank testu. Byla vyhodnocena senzitivita a specificita a ke zhodnocení významnosti stratifikace pacientů dle hladin miRNA byl využit Fischerův exaktní test. Ke všem statistickým analýzám byl použit počítačový program MedCalc Version 11.4.2.0 (MedCalc Software, Belgie).

5.

VÝSLEDKY

5.1.

Studie A - klinická část

5.1.1. Výsledky primární léčby V době od ledna 2003 do prosince 2009 bylo ke konkomitantní chemoradioterapii s temozolomidem a následné adjuvantní léčbě indikováno celkem 86 pacientů s nově diagnostikovaným glioblastomem. Medián věku pacientů byl 56 let, převažovali muži (60 %). Většina pacientů byla v době zahájení chemoradioterapie v dobrém fyzickém stavu, více než 80 % mělo PS 0-1. U 20 % pacientů byla iniciálně provedena makroskopicky totální resekce nádoru, v 65 % subtotální resekce, v 9 % parciální resekce a v 6 % se jednalo pouze o biopsii (Tabulka 6). Medián PFS v našem souboru byl 7,0 měsíců (2,0-35,5) a medián OS byl 13,0 měsíců (2,5-70,0), viz křivky přežití (Obrázek 11 a Obrázek 12). V prvním a druhém roce od diagnózy choroby žilo 57 a 26 % pacientů, ve stejném období bylo bez progrese onemocnění 29 a 8 % pacientů (Tabulka 7). Což jsou výsledky srovnatelné se zahraničními prácemi.

41

Tabulka 6: Charakteristika souboru a orientační srovnání se Stuppovým souborem [38].

< 50 50 50-60 60

CHT/RT (MOÚ) 86 pacientů n (%) 27 (31 %) 59 (69 %) 37 (43 %) 22 (26 %)

CHT/RT(Stupp) 287 pacientů n (%) 90 (31 %) 197 (69 %)

celkem muži ženy muži ženy

56 (24-69) 56 (28-68) 51 (24-69) 51 (60 %) 35 (40 %)

56 185 (64 %) 102 (36 %)

PS 0 (KPS 100) PS 1 (KPS 90) (KPS 80) PS 2 (KPS 70) (KPS 60)

11 (13 %)

113 (39 %)

64 (74 %) 27 (31 %) 37 (43 %) 11 (13 %) 11 (13 %) 0

136 (47 %)

Totální resekce

17 (20 %)

113 (39 %)

Subtotální a parciální resekce Biopsie

56 (65 %) 8 (9 %) 5 (6 %) 34/86 (40 %) 4 (1-7)

126 (44 %) 48 (17 %) 223/287 (78 %) 3 (0-7)

11/34 (32 %)

47 %

Sledované parametry

Věk (roky)

Medián (roky) Pohlaví Performance status dle WHO a dle Karnofského

Rozsah resekčního výkonu

Adjuvantní CHT Medián cyklů adjuvantní CHT Ukončeno 6 cyklů CHT

38 (13 %)

Zkratky: CHT/RT – chemoradioterapie, CHT – chemoterapie, n – počet, KPS – Karnofského performance status, MOÚ – Masarykův onkologický ústav

Obrázek 11: Kaplan-Meierova analýza – přežití bez progrese onemocnění (PFS).

42

Obrázek 12: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS).

Tabulka 7: Celkové přežití a přežití bez progrese onemocnění, orientační srovnání se Stuppovým souborem [39].

Medián OS (měsíce) OS v 6 měsících 12 měsících 18 měsících 24 měsících 3 letech 4 letech 5 letech

CHT/RT (MOÚ) n = 86 13,0 (%) 84,0 57,0 39,0 26,0 7,0 3,0 3,0

CHT/RT (Stupp) n = 287 14,6 (%) 86,3 61,1 39,4 27,2 16,0 12,1 9,8

Medián PFS (měsíce) PFS v 6 měsících 12 měsících 18 měsících 24 měsících

7,0 (%) 62,0 29,0 15,0 8,0

6,9 (%) 53,9 26,9 18,4 10,7

Zkratky: CHT/RT – chemoradioterapie, n – počet, MOÚ – Masarykův onkologický ústav, OS – celkové přežití, PFS – přežití bez progrese onemocnění

Data přežití byla podrobena analýze z pohledu PS, věku a pohlaví pacienta, lokalizace nádoru,

radikality

neurochirurgického

výkonu,

aplikované

dávce

radioterapie

a chemoterapie. Dle očekávání pooperační PS, rozsah resekce a absolvování plánované konkomitantní léčby bez nutnosti její redukce měly statisticky signifikantní vliv na PFS

43

i OS. Medián PFS a OS byl u pacientů s PS 0, 1 a 2: 22,0; 7,0 a 6,0 měsíců v případě PFS (P = 0,0018) a 32,0; 13,0 a 9,0 měsíců v případě OS (P = 0,0023), viz Obrázek 13.

Obrázek 13: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS) v závislosti na celkovém stavu výkonnosti (PS).

Pacienti, u kterých bylo dosaženo makroskopicky totálního odstranění tumoru ve srovnání s pacienty s jakýmkoliv pooperačním reziduem měli delší PFS (14,0 vs 6,0 měsíců, HR = 0,5688; P = 0,0301, log-rank test) i OS (23,0 vs 12,0 měsíců, HR = 0,4977; P = 0,0093, log-rank test), viz Obrázek 14.

Obrázek 14: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS) v závislosti na přítomnosti pooperačního rezidua tumoru.

44

V případě

hodnocení

vlivu

dávek

konkomitantně

aplikované

radioterapie

a chemoterapie jsme zjistili, že lepší výsledky léčby měli pacienti, u nichž celková dávka radioterapie přesáhla 54 Gy a počet dnů chemoterapie přesáhl 40. V prvním případě byl PFS 8,0 vs 3,0 měsíce (HR = 0,3313; P = 0,0001, log-rank test) a OS 15,0 vs 5,0 měsíců (HR = 0,1730; P < 0,0001, log-rank test), ve druhém případě byl PFS 8,0 vs 5,0 měsíců (HR = 0,5359; P = 0,0023, log-rank test) a OS 17,0 vs 9,5 měsíců (HR = 0,5943; P = 0,0175, log-rank test), viz Tabulka 8.

Tabulka 8: Parametry přežití ve vztahu k věku, rozsahu resekce, PS, dávce podané radioterapie a počtu dní chemoterapie při konkomitantní fázi léčby.

Věk

Rozsah resekce

Performance

Radioterapie

Chemoterapie

status

(Gy)

(počet dní)

(roky)

(PS)

OS

< 50

50

16,0

11,0

Totální

Netotální

0

1

2

< 54

54

< 40

40

23,0

12,0

32,0

13,0

9,0

5,0

15,0

9,5

17,0

(měsíce) P

P = 0,6159

P = 0,0093

P = 0,0023

P < 0,0001

P = 0,0175

0,8933

0,4977

–

0,1730

0,5943

HR PFS

8,0

6,0

14,0

6,0

22,0

7,0

6,0

3,0

8,0

5,0

8,0

(měsíce) P

P = 0,5217

P = 0,0301

P = 0,0018

P = 0,0001

P = 0,0023

0,8674

0,5688

–

0,3313

0,5300

HR

Zkratky: OS – celkové přežití, PFS – přežití bez progrese onemocnění, P – hladina statistické významnosti, HR – hazard ratio

Naopak věk do 50 let ve srovnání se zahraničními studiemi neměl statisticky signifikantně pozitivní vliv ani na délku PFS (8,0 vs 6,0 měsíce, HR = 0,8674; P = 0,5217, log-rank test) ani na OS (16,0 vs 11,0, HR = 0,8933; P = 0,6259, log-rank test) (Tabulka 8, Obrázek 15).

45

Obrázek 15: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS) v závislosti na věku.

Muži ve srovnání s ženami měli kratší medián celkového přežití (11,0 vs 18,0 měsíce), nicméně rozdíl nedosáhl statistického významu (HR = 0,7172; P = 0,1309). Podobně na tom byla i lokalizace původního nádoru. Vzhledem k relativně vyššímu procentu pacientů, kteří nepokračovali v adjuvantním temozolomidu po ukončené chemoradioterapii nás také zajímalo, zda tento faktor ovlivňuje parametry přežití. Dle statistické analýzy byl PFS u pacientů, kteří pokračovali v adjuvantním temozolomidu signifikantně delší (10,0 vs 5,0 měsíců, HR = 0,6480; P = 0,0393, log-rank test), než ve skupině, která adjuvantní léčbu z různých důvodů neabsolvovala. V případě OS byl sice rovněž patrný rozdíl mezi oběma skupinami, nicméně již nebyl statisticky signifikantní (18,0 vs 11,0 měsíců, HR = 0,6874; P = 0,0896, log-rank test). Výsledky však mohou být ovlivněny velikostí souboru. K hlavním příčinám přerušení léčby již po konkomitantní části patřila progrese onemocnění a toxicita léčby, která byla vyšší než ve Stuppově studii. K adjuvantnímu temozolomidu

byli

indikováni

jen

pacienti,

kteří

absolvovali

konkomitantní

chemoradioterapii bez závažnější G3/4 toxicity, bez jasné progrese nádoru na kontrolním CT nebo MR vyšetření a bez významného zhoršení celkového stavu. 5.1.2. Výsledky léčby recidivy/progrese Na podskupině 67 pacientů, u kterých byla potvrzena recidiva nebo progrese onemocnění zobrazovacími metodami (CT nebo MR) byl hodnocen vliv dalšího postupu na celkové přežití a na čas přežití od zjištění recidivy/progrese. Reoperace byla provedena

46

u 24 % pacientů, v ostatních případech pacienti podstoupili buď paliativní chemoterapii, radioterapii, nebo symptomatickou léčbu. Využití jednotlivých modalit ukazuje Tabulka 9.

Tabulka 9: Léčba recidivy/progrese po chemoradioterapii a adjuvantní chemoterapii.

Léčebná metoda Operace Reiradiace Paliativní chemoterapie

MOÚ n (%) 21 (24%) 8 (9%) 39 (45%)

Stupp [38] n (%) 64 (24%) 13 (5%) 148 (54%)

Zkratky: n – počet, MOÚ – Masarykův onkologický ústav

Přestože je hodnocení výsledků léčby recidivy/progrese značně problematické, neboť charakter progrese významně ovlivňuje celkový stav pacienta a možnost použít protinádorovou léčbu, naše výsledky potvrzují její pozitivní vliv na další vývoj nemoci. Skupina léčených pacientů, bez ohledu na použitou modalitu léčby, měla signifikantně delší přežití od recidivy/progrese než pacienti na symptomatické terapii (7,0 vs 3,0 měsíce, HR = 0,5675; P = 0,0187, log-rank test), viz Obrázek 16.

Obrázek 16: Kaplan-Meierova analýza – čas přežití od recidivy/progrese v závislosti na léčbě.

47

Z pohledu významnosti použité metody měl největší benefit operační výkon. Pacienti, kteří podstoupili reoperaci měli ve srovnání s ostatními pacienty delší přežití od recidivy/progrese (9,0 vs 4,0 měsíce, HR = 0,5855; P = 0,0247, log-rank test) i celkové přežití (24,0 vs 12,5 měsíců, HR = 0,5325; P = 0,0111, log-rank test), viz Obrázek 17 a Obrázek 18.

Obrázek 17: Kaplan-Meierova analýza – čas přežití od recidivy/progrese v závislosti na operabilitě.

Obrázek 18: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS) v závislosti na možnosti chirurgické léčby progrese nemoci.

48

Samostatný vliv paliativní chemoterapie nebo reiradiace na prodloužení délky života od recidivy/progrese nedosáhl statistické významnosti (Tabulka 10).

Tabulka 10: Použitá léčba v době recidivy/progrese a ovlivnění délky života.

n přežití od progrese do úmrtí (měsíce) P HR

Léčba relapsu/progrese ano ne 46 21 7,0 3,0 P = 0,0187 0,5675

Reoperace ano 21 9,0

ne 46 4,0

Reiradiace ano 8 11,0

P = 0,0247 0,5855

ne 59 5,0

P = 0,1207 0,5883

Paliativní chemoterapie ano ne 39 28 6,0 4,5 P = 0,4008 0,8286

Zkratky: n – počet, P – hladina statistické významnosti, HR – hazard ratio

5.1.3. Toxicita léčby Výskyt závažné hematologické a nehematologické toxicity, hodnocené stupněm 3 a 4 (G3/4) dle NCI-CTCAE version 3.0 je uveden v Tabulce 11. U hematologické toxicity byla častěji ve srovnání se Stuppovým souborem zaznamenána trombocytopenie (celkem 8 pacientů, 9 %), ve třech případech s krvácivými projevy s nutností aplikací trombonáplavů. Leukopenie a neutropenie G3/4 byla také častější (celkem 5 pacientů, 6 %), ve dvou případech pro probíhající infekt s nutnou podporou myelopoézy růstovými faktory. Důležité je také poukázat na často podceňovanou G3/4 lymfopenii. V našem souboru se vyskytla u celkem 22 pacientů (25 %), ve 4 případech mohla mít podíl na rozvoji oportunní infekce (bez doprovodné G3/4 neutropenie), i přes profylaxi sumetrolimem u většiny pacientů. U nehematologické toxicity jednoznačně dominovaly trombembolické příhody, z nichž jedna byla fatální. Zanedbatelná nejsou ani dvě úmrtí na pneumocystovou pneumonii, z nichž jedna vznikla v terénu lymfopenie G4. Tento relativně vyšší výskyt toxicity měl zcela jistě vliv na indikaci adjuvantní léčby a tím mohl ovlivnit i medián PFS a OS, a také snížit procento pacientů žijících déle než 2 roky (Tabulka 7). Vyšší stupeň toxicity byl častější především u pacientů s horším PS (PS 2) po operaci. Opačná situace nastala v případě adjuvantní léčby samotným temozolomidem, tj. po ukončení chemoradioterapie, kde se závažná toxicita (G3/4) nevyskytla. Důvodem byla jistě selekce pacientů pro pokračování v adjuvantní léčbě.

49

Tabulka 11: Závažná toxicita (G3/4) dle NCI-CTCAE version 3.0 a komplikace konkomitantní chemoradioterapie (v průběhu a do 1 měsíce od ukončení).

Toxicita Hematologická Anemie Leukopenie Neutropenie Lymfopenie Trombocytopenie Nehematologická Hepatopatie Pneumonie Plicní embolizace + flebotrombózy DKK Úmrtí

G3 (n)

G4 (n)

MOÚ (G3+4) (n)

Stupp (G3+4)[38] (n)

1 1 1 16 4

0 4 4 6 4

1/86 (1 %) 5/86 (6 %) 5/86 (6 %) 22/86 (25 %) 8/86 (9 %)

1 (< 1 %) 7/284 (2 %) 12/284 (4 %) neuvedeno 9/284 (3 %)

3 0 3/86 (3 %) 6/86 (7 %), 4x nekomplikovaná, 2x atypická 4/86 (5 %) 6/86 (7 %)

neuvedeno 3/284 (1 %) 12/284 (4 %)

3/86 (3 %) * 2x atypická pneumonie (Pneumocystis carinii) * 1x plicní embolizace

2/284 (1 %) * krvácení do mozku

Zkratky: G – stupeň toxicity, n – počet, MOÚ – Masarykův onkologický ústav

5.2. Studie B - laboratorní část Z celého souboru 86 pacientů se podařilo získat dostatečně kvalitní tkáň od 38 pacientů. Popis souboru je uveden v Tabulce 12. Tabulka 12: Charakteristika souboru pacientů určených k vyšetření stavu metylace promotoru genu pro MGMT a vybraných miRNA.

Celkem n = 38

%

Věk < 50 50 Medián (rozmezí) Pohlaví Muži Ženy PS 0a1 2 Rozsah resekce Totální Subtotální

14 24 53 (28-67)

37 63

19 19

50 50

36 2

95 5

9 29

24 76

Zkratky: n – počet, PS – performance status

50

5.2.1.

Stanovení míry metylace promotoru genu pro MGMT a korelace s klinickými parametry a léčebnými výsledky u pacientů s glioblastomy

Pomocí metody bisulfitové konverze DNA a HRM analýzy jsme stanovili míru metylace promotoru genu pro MGMT u 38 pacientů. Přítomnost metylace ve výši 25 % byla označena za cut-off hranici k rozdělení souboru na skupinu pacientů s metylací a bez metylace. MGMT promotor byl metylován ve 12 případech (32 %) a nemetylován v 26 případech (68 %). Pacienti s prokázanou metylací MGMT měli signifikantně delší OS (22,5 vs 13,0 měsíce, HR = 0.4012, P = 0.0054; log-rank test) i PFS (14,5 vs 8,0 měsíce, HR = 0.4799, P = 0.0201; log-rank test), viz Tabulka 13 a Obrázek 19. Stav metylace MGMT nebyl dle statistické analýzy v korelaci s žádnou námi hodnocenou miRNA (Tabulka 14). Tabulka 13: Parametry přežití ve vztahu k metylaci MGMT v MOÚ a orientační srovnání se Stuppovou studií [38]. Stav metylace MGMT (MOU) Počet pacientů – n (%)

Stav metylace MGMT (Stupp)

Nemetylovaný

Metylovaný

Nemetylovaný

Metylovaný

26 (68%)

12 (32%)

60 (55%)

8.0 (3.0 – 24.0) 61.5

14.5 (3.0 – 27.0) 83.3

5,3 (5,0 – 7,6) 40,0

10,3 (6,5 – 14,0) 68,9

13.0 (3.0 – 33.0) 11.5

22.5 (6.0 – 62.0) 58.3

12,7 (11,6 – 14,4) 13,8

21,7 (17,4 – 30,4) 46,0

46 (45%)

PFS Medián (měsíce) PFS v 6 měsících (%) OS Medián (měsíce) OS v 24 měsících (%)

Zkratky: PFS – přežití bez progrese onemocnění, OS – celkové přežití, MGMT – O6-metylguaninDNA-metyltransferáza, MOÚ – Masarykův onkologický ústav, n – počet

Obrázek 19: Kaplan–Meierovy křivky přežití – celkové přežití (A) a přežití bez progrese onemocnění (B) dle stavu metylace promotoru genu pro MGMT.

51

5.2.2.

Stanovení expresních hladin vybraných miRNA a jejich vztah k prognóze pacientů s glioblastomy

 Stanovení hladin miRNA v nádorové a nenádorové mozkové tkáni Na souboru 38 pacientů s glioblastomy jsme prokázali zvýšenou hladinu miR-21 a miR196a/b v nádorové tkáni ve srovnání s nenádorovou (celkem 10 vzorků). Naopak v tkáni glioblastomu byly významně snížené hladiny miR-181c, miR-221, miR-222, miR-195 a miR-128a, rozdíly byly statisticky signifikantní. Mediány hodnot zkoumaných miRNA s rozmezím mezi 25 a 75 percentilem u nádorových i nenádorových vzorků, včetně jejich vztahu k metylaci promotoru genu pro MGMT jsou uvedeny v Tabulce 14.

Tabulka 14: Srovnání exprese miRNA v nádorové a nenádorové tkáni a jejich vztah k metylačnímu stavu promotoru genu pro MGMT.

MiRNA

Glioblastom n = 38

Nenádorová mozková tkáň+ n=6+4

P∞

miR-21

78.5814* (33.1469 - 237.7333)

22.7989 (19.2862 – 30.8386)

0.0255

P = 0.4142

miR-128a

0.01534 (0.005892 - 0.05036)

1.1798 (0.7614 - 7.7713)

< 0.0001

P = 0.8494

miR-181c

0.4805 (0.1345 - 0.9141)

2.2363 (0.6974 - 3.1595)

0.0005

P = 0.4232

miR-195

5.4032 (0.8845 - 33.2029)

38.5964 (17.8927 - 46.8118)

0.0290

P = 0.2928

miR-196a

0.1479 (0.06040 - 0.7335)

0.01511 (0.00022 - 0.04707)

0.0021

P = 0.2573

miR-196b

0.09182 (0.01690 - 0.5734)

0.01978 (0.00022 - 0.1102)

0.0330

P = 0.4795

miR-221

2.3737 (1.0943 - 6.7427)

23.2871 (8.2249 - 67.7547)

0.0001

P = 0.9749

miR-222

7.0326 (3.2716 - 14.4534)

46.1839 (18.2944 - 99.2503)

0.0010

P = 0.1092

MGMT asociace

*Mediány expresních hladin miRNA s 25 and 75 percentily; + Nenádorová mozková tkáň z okolí AV malformací (6x) a komerčně dostupné vzorky RNA z dospělé mozkové tkáně (4x); ke metylačnímu stavu promotoru genu pro MGMT (Mann-Whitney U-test); (statistická významnost je určena hodnotou P = 0.05)

52

∞

Vztah miRNA

Mann-Whitney U-test

 Vztah mezi expresí miRNA, prognózou a predikcí léčebné odpovědi Vyšší hladiny miR-195 (HR = 0.4249, P = 0.0124; log-rank test) a miR-196b (HR = 0.5470, P = 0.0492; log-rank test) byly statisticky signifikantně spojeny s delším celkovým přežitím (Obrázek 20). Signifikantně vyšší hladiny miR-181c byly sledovány u pacientů s časem do progrese kratším než 6 měsíců (TTP-6) (P = 0.0010; Mann-Whitney U-test) (Obrázek 21). Podobně i miR-21 byla signifikantně vyšší u pacientů s časnou progresí do 6 měsíců (P = 0.0143; Mann-Whitney U-test) (Obrázek 21). Dle analýzy kombinace miR-181c a miR-21 predikuje signifikantně čas do progrese kratší než 6 měsíců (sensitivita = 92 %, specificita = 81 %, P < 0,0001) (Tabulka 15). U zbývajících miRNA (miR-128a, miR-196a, miR-221 a miR-222) nebyl v našem souboru nalezen žádný prognostický ani prediktivní potenciál.

Obrázek 20: Kaplan–Meierovy křivky přežití – celkové přežití ve vztahu k miR-195 (A) a miR196b (B).

53

Poznámka - Mann-Whitney U test, Central box reprezentuje hodnoty mezi 25 a 75 percentilem. Střední čára představuje medián.

Obrázek 21: MiR-181c (A) a miR-21 (B) a jejich vztah k časné progresi onemocnění do 6 měsíců (TTP-6).

Tabulka 15: Vztah pozitivity miR-21/miR-181c a času do progrese onemocnění v 6 měsících od operace. Pacienti s TTP > 6 měsíců (n) MiR-21 a miR-181c pozitivita 5 MiR-21 a/nebo miR-181c negativita 21

Pacienti s TTP < 6 měsíců (n) 11 1

Zkratky: TTP – čas do progrese, n – počet

6.

DISKUZE

6.1.

Studie A – klinická část

Glioblastoma multiforme je nejčastější a nejagresivnější primární mozkový nádor u dospělých s mediánem přežití kolem 12 měsíců. Vzhledem k lokalizaci onemocnění a jeho biologickému chování nejsme schopni i přes velký medicínský pokrok v posledních 20 letech nepříznivý průběh tohoto onemocnění zvrátit. Dnešním standardním léčebným postupem, podloženým výsledky Stuppovy studie z roku 2005, je maximální resekční výkon s adjuvantní konkomitantní chemoradioterapií a následnou adjuvantní chemoterapií s temozolomidem. Tento postup signifikantně prodloužil medián přežití bez progrese i celkové přežití ve srovnání se samotnou pooperační radioterapií a dosud nebyl překonán. 54

Stuppova studie byla opakovaně podrobena retrospektivním analýzám, jejichž cílem bylo popsat jednotlivé podskupiny pacientů a nalézt zásadní prognostické a prediktivní faktory. Poslední analýza s výsledky pětiletého sledování byla publikována v březnu roku 2009 [39]. Signifikantně pozitivní vliv pooperační chemoradioterapie a následné chemoterapie na parametry přežití byl zaznamenán ve všech analyzovaných podskupinách. Největší benefit z léčby však měli pacienti po makroskopicky totální resekci, mladší 50 let, s PS 0-1 a přítomnou metylací promotoru genu pro MGMT. I přes tento maximální multimodální přístup jsme si vědomi toho, že léčba, kterou pacientovi můžeme dnes nabídnout bude vedena s paliativním záměrem a jejím cílem bude prodloužit život a zajistit jeho dostatečnou kvalitu. Dnešní výzkum zaměřený na primární léčbu glioblastomu se snaží „Stuppův režim“ překonat. Zkouší se alternativní režimy adjuvantního temozolomidu. Na ASCO 2011 byly prezentovány dlouho očekávané výsledky klinické studie fáze III - RTOG 0525 s dosedense režimem temozolomidu, bohužel s negativními výsledky ve srovnání se standardní léčbou a navíc s vyšší toxicitou. Důležité ale je, že tato velká studie (833 pacientů) poprvé v prospektivním hodnocení potvrdila významnou prognostickou úlohu metylace MGMT genu. Ta byla prokázána pouze u cca 30 % pacientů [102]. Další možností, jak zlepšit aktuální léčebné výsledky, je posílení kombinované léčby o nový preparát. S tímto záměrem probíhají studie fáze III zkoumající benefit přidaného bevacizumabu (AVAglio, RTOG 0825) nebo inhibitoru integrinů cilengitidu (CENTRIC) [45,46,103]. Ve své práci jsem se zaměřil na zhodnocení významu klinických prognostických faktorů u skupiny českých pacientů s glioblastomy, kteří byli indikováni ke standardní multimodální léčbě (operace nebo biopsie s následnou konkomitantní chemoradioterapií s temozolomidem). Zajímalo mě i srovnání s publikovanými výsledky Stuppovy studie. V našem souboru jsem potvrdil signifikantní vliv radikality resekce a PS na parametry přežití (PFS i OS). Věk byl jako prognostický faktor nesignifikantní, což mohlo být ovlivněno výběrem pacientů pro léčbu, kdy v souboru výrazně převažovali pacienti s PS 1 (74 %). Pohlaví ani lokalizace nádoru neměly na parametry přežití signifikantní vliv. Při srovnávání s výsledky Stuppova souboru jsme u našich pacientů dosáhli podobného dvouletého přežití, nicméně v pětiletém přežití jsou naše výsledky horší. Příčinou může být menší podíl pacientů po totálních resekcích (20 vs 39 %) a nižší procento pacientů léčených temozolomidem po ukončené konkomitantní chemoradioterapii (40 vs 78 %). Zajímavé je, že dle statistické analýzy pokračování v adjuvantním temozolomidu nemělo signifikantní vliv na medián celkového přežití. Výsledky ale mohly být ovlivněny velikostí souboru. 55

Zajímavé také bylo srovnání výskytu závažné hematologické a nehematologické toxicity. V průběhu konkomitantní chemoradioterapie byla zaznamenána častější hematologická toxicita G3/4, a to především trombocytopenie (9 vs 3 %) a lymfopenie (25 %),

což

opodstatňuje

doporučení

profylaktického

podávání

sumetrolimu.

U nehematologické toxicity dominovaly trombembolické příhody. Dle našich zkušeností byl výskyt závažnějších nežádoucích účinků léčby častější u pacientů s horším PS (PS 2). V případě, že kromě PS 2 jsou přítomny i další negativní prognostické faktory, jako např. četné a závažné interkurence, inoperabilní nádor nebo omezená spolupráce pacienta, pak je vhodnější indikovat pouze samotnou radioterapii. Další důležitou problematikou je léčba recidivy/progrese glioblastomu po předchozí primární léčbě. Pro vybrané pacienty může být metodou volby další neurochirurgický výkon, reiradiace nebo chemoterapie. Výsledky paliativní chemoterapie založené na derivátech nitrosourey v našem souboru nebyly nijak přesvědčivé. Četnost léčebných odpovědí se pohybovala do 10 %, trvání bylo krátkodobé, medián času do progrese se pohyboval kolem 3 měsíců. Podobné výsledky byly dosaženy i v případě opakování radioterapie, jejíž aplikace je omezena předchozím ozařováním. Naopak, i naše zkušenosti jednoznačně potvrzují, že u vhodných pacientů může být významným přínosem reoperace. Proto by každý pacient s recidivou onemocnění měl být prezentován na neurochirurgické komisi, kde mohou být zváženy všechny možnosti léčby.

6.2. Studie B - Laboratorní část Hledání nových molekulárních prognostických a prediktivních markerů je fenoménem dnešní doby a to napříč celou onkologií. Převážná většina publikovaných prací v renomovaných časopisech hodnotí aktuální situaci v této oblasti a snaží se předpovědět vývoj v blízké budoucnosti. Klinické faktory jsou již poměrně dobře zmapovány. V dnešní době máme také plno informací o patogenezi glioblastomu a doprovodných genetických změnách. Bohužel jejich vztah k prognóze a predikci léčebné odpovědi není zcela jasný a proto je jejich využití stále velmi omezené. Za nejvýznamnější prognostický a potenciálně prediktivní molekulární marker je dnes považován stav metylace promotoru genu reparačního enzymu MGMT [104]. Řadou klinických studií (fáze II a III) bylo potvrzeno, že pacienti s přítomnou metylací MGMT genu (cca 35-47 % pacientů) mají signifikantně delší přežití a větší benefit z podané chemoterapie s alkylačním účinkem (temozolomid) ve srovnání s pacienty bez metylace.

56

Protože benefit alkylačního cytostatika u nemetylovaných pacientů je malý, jsou dnes v běhu studie, kdy je temozolomid nahrazován odlišně fungujícím preparátem. Příkladem může být studie Wicka a kol. s 57 pacienty, kde byl temozolomid nahrazen inhibitorem proteinkinázy C – enzastaurinem, zatím bez úspěchu [105]. Je ale vysoce pravděpodobné, že podobných studií bude přibývat a je možné, že díky pozitivním výsledkům budeme mít během několika let účinnější léčbu i pro pacienty s nemetylovaným MGMT genem. Bohužel dnešní problémy se standardizací vyšetřovací metody ke stanovení metylace zatím komplikují zavedení tohoto markeru do rutinní praxe. Cílem laboratorní části práce bylo stanovení míry metylace promotoru genu pro MGMT, změření expresních hladin 8 vytipovaných miRNA v nádorové a nenádorové mozkové tkáni, popsání jejich vzájemných vztahů a korelací s klinickými parametry. V případě stanovení metylace MGMT byla použita relativně moderní metoda bisulfitové konverze DNA a HRM analýza, která je senzitivnější než velmi často používaná PCR. Jde o metodu již běžně užívanou v lékařské genetice. V naší práci se nám podařilo prokázat přítomnost metylace promotoru genu pro MGMT u 32 % pacientů, což je srovnatelné s nejnovější publikovanou studií RTOG 0525 (počet metylovaných pacientů cca 30 %). Významné také je, že přítomnost námi stanovené metylace pozitivně korelovala s delším PFS i OS po chemoradioterapii s temozolomidem. Naše výsledky jsou tak plně ve shodě se zahraničními publikacemi. Dalším cílem mé disertační práce byl výzkum zaměřený na miRNA a jejich potenciální využití k určení prognózy a predikce léčebné odpovědi. Pokrok v této oblasti je v posledních 2-3 letech nebývale rychlý a publikací na toto téma i u glioblastomu narůstá [106]. Předmětem výzkumu v naší studii bylo celkem 8 miRNA, 5 perspektivních bylo identických jako v naší pilotní práci [107], další 3 nové miRNA byly vybrány na základě recentních publikací. Cílem bylo potvrdit naše dřívější závěry, provést korelaci získaných výsledků se stavem metylace MGMT, klinickými faktory a přežitím. K zajímavým miRNA patří miR-196a,b. Guan a kol. prokázal nižší hladiny miR-196a,b v normální mozkové tkáni ve srovnání s nádorovou a popsal vztah mezi vyšší hladinou těchto miRNA a horší prognózou u pacientů s glioblastomy a anaplastickými astrocytomy [88]. Další studie, která se zabývá miR-195, poukazuje na korelaci mezi vyšší hladinou této miRNA a rezistencí buněk glioblastomu k temozolomidu [87]. Na základě těchto publikovaných závěrů jsme očekávali negativní korelace mezi expresí miR-195 a miR-196a,b a celkovým přežitím. Ve shodě s Guanem a kol. jsme potvrdili signifikantně nižší hladiny miR-196a,b ve zdravé mozkové tkáni. Nicméně naše 57

výsledky u miR-195 a miR-196b ve vztahu k prognóze byly opačné. Vyšší hladiny byly spojeny s lepší prognózou, což je ale ve shodě s jinými prácemi u jiných onkologických diagnóz jako kolorektální karcinom, hepatocelulární karcinom nebo adrenokortikální karcinom [108-111]. Hladina miR-196a neměla v našem souboru signifikantní vliv na celkové přežití. Velikost Guanova souboru (39 pacientů) byla podobná našemu. Prognostický význam miR-195 a miR-196a,b bude proto třeba ověřit na větších souborech. Rodina miR-181 má více možných cílů (HOXA11, TCL1, TGFBR1, MAPK1). Může tak ovlivňovat funkci některých genů, které jsou zodpovědné za agresivitu nádoru i citlivost nádorových buněk k chemoterapii a radioterapii [112]. V této studii se nám podařilo prokázat, že vyšší hladiny miR-181c jsou signifikantně spojeny s časnou progresí onemocnění do 6 měsíců od započetí léčby. Tím jsme nepřímo potvrdili naše předchozí závěry z pilotní studie, kde jsme popsali pozitivní korelaci mezi nízkými hladinami miR181c a dobrou odpovědí na chemoradioterapii s temozolomidem [107]. Další velice zajímavou a často vyšetřovanou je miR-21. Tato miRNA bývá zvýšena v buňkách glioblastomu a dle publikovaných prací má funkci onkogenu, protože inhibuje proces apoptózy. V naší studii jsme potvrdili zvýšené hladiny miR-21 v nádorové tkáni ve srovnání s nenádorovou, což bylo také ve shodě s naší pilotní studií i s výsledky ostatních pracovišť [113-116]. Podobně jako u miR-181c, tak i u miR-21 jsou vyšší hladiny spojeny s časnou progresí. Mimo jiné, dle naší analýzy kombinace miR-181c a miR-21 může predikovat progresi onemocnění do 6 měsíců se senzitivitou 92 % a specificitou 81 % a označit tak pacienty s agresivní formou glioblastomu, kteří vyžadují maximálně intenzivní léčbu. V dřívější publikaci jsme popsali sníženou expresi miR-221 a miR-222 u glioblastomu ve srovnání s nenádorovou tkání. V aktuální práci na větším souboru jsme potvrdili předchozí výsledky u miR-221, ale jen hraniční trend u miR-222, který nebyl statisticky významný (P = 0,0555). Nicméně naše výsledky nejsou ve shodě s publikovanými daty, dle kterých byly hladiny miR-221 i miR-222 v buňkách glioblastomu oproti zdravé mozkové tkáni vyšší [113]. Proto jsme vyšetřili tyto miRNA i v komerčně dostupných RNA izolovaných ze zdravé mozkové tkáně. Chtěli jsme tím vyloučit možné ovlivnění našich výsledků volbou nevhodného místa odběru nenádorové tkáně (okolí AV malformací). Výsledky z komerčně dostupných RNA byly velice podobné našim předchozím závěrům, což podporuje správnost našeho postupu. V případě miR-128a jsme také potvrdili naše předchozí závěry i výsledky z publikované studie [86,107]. Opět jsme prokázali výrazně nižší hladiny u glioblastomu 58

ve srovnání nenádorovou tkání, a to přibližně 50x (P < 0,0001), což pravděpodobně souvisí s významnou úlohou této miRNA v patogenezi glioblastomu. Bohužel jsme neprokázali žádný vztah mezi stavem metylace MGMT genu a některé ze zkoumaných miRNA.

7.

ZÁVĚR V souladu s cílem této práce jsem zpracoval aktuální přehled potenciálních

prognostických i prediktivních faktorů. Na souboru 86 pacientů s glioblastomy, kteří podstoupili standardní pooperační chemoradioterapii s temozolomidem byly ve shodě s publikovanými daty potvrzeny základní klinické prognostické faktory jako rozsah resekčního výkonu, stav celkové fyzické zdatnosti po operačním zákroku, úspěšné podání plánované léčby a možnost chirurgického řešení recidiv u vybraných pacientů. Jediným faktorem, který nebyl ve shodě, byl věk v době diagnózy, což bylo pravděpodobně ovlivněno výběrem pacientů, kterým byla léčba indikována. Pohlaví ani lokalizace nádoru neměly na prognózu našich pacientů statisticky signifikantní vliv. Toxicita konkomitantní chemoradioterapie byla vyšší ve srovnání se Stuppovou studií. V laboratorní části práce bylo potvrzeno dominantní postavení metylace promotoru genu pro MGMT jako pozitivního prognostického a v podstatě i prediktivního molekulárního markeru příznivé léčebné odpovědi na alkylační cytostatika. Metylační stav se nám podařilo stanovit na základě moderní metody – bisulfitová konverze DNA a HRM analýza a výsledky stran přežití pacientů (PFS i OS) byly ve shodě s publikovanými zahraničními prácemi. Procentuální zastoupení pacientů s prokázanou metylací MGMT genu v našem souboru bylo velice podobné jako v nejnovější publikované studii fázi III RTOG 0525, kde byl tento marker poprvé hodnocen prospektivně. Dalším cílem mé disertační práce byl výzkum zaměřený na miRNA a jejich potenciální využití k určení prognózy a predikce léčebné odpovědi. Dle našich výsledků se dá říci, že miR-195 a miR-196b mohou být nové pozitivní prognostické faktory, které korelují s delším přežitím pacientů s glioblastomy. MiR-128a má také pravděpodobně významnou úlohu v patogenezi glioblastomu, protože její hladina v nádorové tkáni je přibližně 50x nižší než v nenádorové. MiR-21 a miR-181c lze dle našich výsledků označit za negativní prognostické faktory a jejich kombinací můžeme predikovat časnou progresi onemocnění do 6 měsíců od primární operace s relativně vysokou senzitivitou (92 %) i specificitou (81 %).

59

Bohužel jsme neprokázali žádnou vazbu mezi zkoumanými miRNA a stavem metylace promotoru genu pro MGMT. Naše výsledky jsme publikovali a pokud budou potvrzeny i v jiných studiích, mohly by být v budoucnu využity v rozhodovacím procesu s cílem zlepšit prognózu pacientů s glioblastomy.

Poděkování Tato práce byla podpořena grantem IGA NT/11214-4/2010 a IGA NR 9875-4 Ministerstva zdravotnictví ČR, výzkumným záměrem “FUNDIN” - MZ0MOU2005 Ministerstva zdravotnictví ČR, projektem “CEITEC – Central European Institute of Technology” (CZ.1.05/1.1.00/02.0068) a Operational Programme Research and Development for Innovations (project CZ.1.05/2.1.00/01.0030).

60

8.

SOUHRN

Studie A Východisko: Glioblastoma multiforme je nejčastější a nejmalignější primární nádor mozku u dospělých. Za posledních 20 let došlo jen k mírnému zlepšení léčebných výsledků. Při použití dnešní optimální multimodální léčby zahrnující maximální resekční výkon, následovaný chemoradioterapií s temozolomidem se medián přežití pacientů s glioblastomy pohybuje mezi 12-15 měsíci a méně než 10 % pacientů se dožívá 5 let. Metody: Ke zhodnocení klinických faktorů a posouzení jejich vztahu k léčebným výsledkům a přežitím byl retrospektivně zpracován soubor pacientů s glioblastomy, kteří podstoupili pooperační chemoradioterapii s temozolomidem v období od ledna 2003 do prosince 2009. Výsledky: Do retrospektivní analýzy bylo zařazeno celkem 86 pacientů (medián věku byl 56 let, 60 % mužů). Medián přežití bez progrese (PFS) byl 7,0 měsíců (2,0-35,5), medián celkového přežití (OS) byl 13,0 měsíců (2,5-70). Pooperační performance status, rozsah resekce a podání plánované léčby bez zásadní redukce významně ovlivnily jak PFS, tak i OS. Věk, pohlaví nebo lokalizace nádoru neměly signifikantní vliv na přežití. Léčba recidivy/progrese měla benefit u selektované skupiny pacientů. Největší přínos měl z tohoto pohledu nový resekční výkon. Závěr: Pooperační performance status, rozsah resekce, úspěšné podání plánované chemoradioterapie a chirurgické řešení recidiv u vybraných pacientů se ukázaly jako významné prognostické faktory v našem souboru pacientů. Léčba glioblastomu vyžaduje multidisciplinární přístup. Klíčová slova: glioblastom, chemoradioterapie, temozolomid, přežití

61

Studie B Východisko: Stav metylace promotoru genu pro O6-metylguanin-DNA-metyltransferázu (MGMT) je první laboratorní prognostický marker. Nalezení dalších prognostických a prediktivních biomarkerů je nezbytné ke zlepšení léčebných výsledků a prodloužení přežití pacientů s glioblastomy. Metody: K určení míry metylace MGMT genu byla použita bisulfitová konverze DNA s následnou analýzou křivek tání s vysokým rozlišením (HRM analýza). Ke stanovení expresních hladin 8 miRNA (miR-21, miR-128a, miR-181c, miR-195, miR-196a, miR196b, miR-221 a miR-222) v nádorové a nenádorové mozkové tkáni byla použita kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase. Následně byla provedena statistická analýza míry metylace MGMT genu a expresních hladin vybraných miRNA a byl zhodnocen jejich vzájemný vztah a korelace mezi léčebnými výsledky a přežitím pacientů. Výsledky: Na podskupině 38 pacientů s glioblastomy jsme vyšetřili stav metylace MGMT genu a změřili expresní hladiny 8 vybraných miRNA v nádorové a nenádorové mozkové tkáni. MGMT metylační stav pozitivně koreloval s PFS (P = 0,0201) i s OS (P = 0,0054). MiR-195 (P = 0,0124) a miR-196b (P = 0,0492) měly pozitivní vztah k OS. Kombinace miR-181c a miR-21 nám umožnila identifikovat skupinu pacientů s časnou progresí onemocnění do 6 měsíců od diagnózy s 92 % senzitivitou a 81 % specificitou (P < 0,0001). Závěr: Naše výsledky ukazují, že metylační stav MGMT genu, ale také miR-21, miR-181c, miR-195 a miR-196b korelují s přežitím pacientů s glioblastomy. Mimo jiné z naší práce vyplývá, že kombinací miR-181c a miR-21 jsme schopni s 92 % senzitivitou a 81 % specificitou označit skupinu pacientů s rizikem časné progrese onemocnění po resekčním výkonu. Klíčová slova: glioblastom, chemoradioterapie, temozolomid, MGMT, mikroRNA, přežití

62

9.

SUMMARY

Study A Objectives: Glioblastoma multiforme is the most common and most malignant primary tumor of the brain. Only modest advancements in the treatment of glioblastoma have occurred in the past 20 years. Patients treated with optimal therapy, including maximal surgical resection, radiation therapy, and chemotherapy with temozolomide, have a median survival of approximately 12-15 months and fewer than 10 % of patients survive up to 5 years. Methods: To investigate the correlation between clinical factors, treatment and survival of patients with glioblastoma, who underwent postoperative radiotherapy plus concurrent and adjuvant chemotherapy with temozolomide in the period from January 2003 to December 2009. Results: Eighty-six patients (median age, 56 years; 60 % male) were included. Median progression free survival was 7,0 months (2,0-35,5), median overall survival was 13,0 months

(2,5-70).

Postoperative

performance

status,

the

extent

of

resection,

and administration of planned treatment without reduction had statistically significant influences on progression free survival (PFS) and overall survival (OS). Age, gender and position of tumor had no significant influence. Treatment of progression was useful in selected patients. The most benefit showed the second surgery. Conclusion:

Postoperative

performance

status,

extent

of

resection,

successful

administration of the majority of planned concurrent chemoradiotherapy and possibility of surgical treatment at the time of recurrence correlate with better prognosis for our patients with glioblastoma. Treatment of glioblastoma requires a multidisciplinary team. Key words: glioblastoma, chemoradiotherapy, temozolomide, survival

63

Study B Objectives: O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) promoter methylation is the first prognostic biomarker. Additional prognostic and predictive biomarkers are required to improve survival of patients with glioblastoma. Methods: To investigate methylation status of MGMT promoter by bisulfite conversion and high-resolution melting (HRM) analysis in glioblastomas and expression of eight microRNAs (miR-21, miR-128a, miR-181c, miR-195, miR-196a, miR-196b, miR-221, and miR-222) by real-time PCR in glioblastomas and non-tumor brain tissues. Statistical analysis of the methylation status of MGMT and microRNAs levels, and correlation between these factors, treatment and survival of patients with glioblastoma. Results: On the group of 38 patients with glioblastoma we examined methylation status of MGMT promoter and analysed expression of eight microRNAs. MGMT methylation status positively correlated with PFS (P = 0,0201) and OS (P = 0,0054). MiR-195 (P = 0,0124) and miR-196b (P = 0,0492) have positively correlated with OS. Evaluation of the miR-181c in combination with miR-21 predicted time to progression within six months from diagnosis with 92 % sensitivity and 81 % specificity (P < 0,0001). Conclusion: Our data confirmed methylation status of MGMT but also miR-21, miR-181c, miR-195, and miR-196b to be associated with survival of glioblastomas patients. Above all, we suggested that the combination of miR-181c and miR-21 could be a very sensitive and specific test to identify patients at high risk of early progression after surgery. Key words: glioblastoma, chemoradiotherapy, temozolomide, MGMT, microRNA, survival

64

10. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1. Bailey, P., Cushing, H. A. Classification of tumors of the glioma group on a histogenetic basis with a correlated study of prognosis. Philadelphia: Lippincott, 1926, p. 175. 2. Dusek, L., Muzik, J., Kubasek, M., et al. Epidemiology of malignant tumours in the Czech Republic [online]. Masaryk University, 2005. Available from: http://www.swod.cz. 3. Wrensch, M., Minn, Y., Chew, T., et al. Epidemiology of primary brain tumors: current concepts and review of the literature. Neuro-oncology, 2002, vol. 4, p. 278-99. 4. Hardell, L., Carlberg, M., Söderqvist, et al. Long-term use of cellular phones and brain tumours: increased risk associated with use for > or =10 years. Occup. Environ. Med., 2007, vol. 64, no. 9, p. 626-32. 5. Wrensch, M., Lee, M., Miike, R., et al. Familial and personal medical history of cancers and nervous systém conditions among adults with glioma and controls. Am. J. Epidemiol., 1997, vol. 145, p. 581-93. 6. Rich, J.N., Hans, C., Jones, B., et al. Gene expression profiling and genetic markers in glioblastoma survival. Cancer Res., 2005, vol. 65, no. 10, p. 4051-8. 7. Watanabe, K., Sato, K., Biernat, W., et al. Incidence and timing of p53 mutations during astrocytoma progression in patients with multiple biopsies. Clin. Cancer Res., 1997, vol. 3, no. 4, p. 523-30. 8. Kleihues, P., Ohgaki, H. Phenotype vs genotype in the evolution of astrocytic brain tumors. Toxicol. Pathol., 2000, vol. 28, p. 164-70. 9. Kleihues, P., Ohgaki, H. Primary and secondary glioblastoma: from concept to clinical diagnosis. Neuro-Oncology, 1999, vol. 1, p. 44-51. 10.

Watanabe, K., Tachibana, O., Sata, K., et al. Overexpression of the EGF receptor and p53 mutations are mutually exclusive in the evolution of primary and secondary glioblastomas. Brain Pathol., 1996, vol. 6, no. 3, p. 217-23; discussion p. 23-4.

11.

Ohgaki, H., Kleihues, P. Genetic pathways to primary glioblastoma. Am. J. Pathol., 2007, vol. 170, no. 5, p. 1445-53.

12.

Louis, D.N., Ohgaki, H., Wiestler, O.H., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropatol., 2007, vol. 114, no. 2, p. 97-109.

13.

Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 2005, vol. 64, no. 6, p. 479-89.

14.

Laws, E.R., Parney, I.F., Huang, W., et al. Survival following surgery and prognostic factors for recently diagnosed malignant glioma: data from the Glioma Outcomes Project. J. Neurosurg., 2003, vol. 99, p. 467-473.

15.

Hentschel, S.J., Sawaya, R. Optimizing outcomes with maximal surgical resection of malignant gliomas. Cancer Control, 2003, vol. 10, p. 109-114.

65

and

secondary

16.

Ammirati, M., Vick, N., Liao, Y.L., et al. Effect of the extent of surgical resection on survival and quality of life in patients with supratentorial glioblastomas and anaplastic astrocytomas. Neurosurgery, 1987, vol. 21, no. 2, p. 201-6.

17.

Lacroix, M., Abi-Said, D., Fourney, D.R., et al. A multivariate analysis of 416 patients with glioblastoma multiforme: prognosis, extent of resection, and survival. J. Neurosurg., 2001, vol. 95, no. 2, p. 190-8.

18.

Sanai, N., Berger, M.S. Glioma extent of resection and its impact on patient outcome. Neurosurgery, 2008, vol. 62, no. 4, p. 753-64; discussion p. 264-6.

19.

Chang, C.H., Horton, J., Schoenfeld, D., et al. Comparison of postoperative radiotherapy and combined postoperative radiotherapy and chemotherapy in the multidisciplinary management of malignant gliomas. A joint Radiation Therapy Oncology Group and Eastern Cooperative Oncology Group study. Cancer, 1983, vol. 52. p. 997-1007.

20.

Simpson, J.R., Horton, J., Scott, C., et al. Influence of location and extent of surgical resection on survival of patients with glioblastoma multiforme: results of three consecutive Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) clinical trials. Int. J. Radiat Oncol. Biol. Phys., 1993, vol. 26, p. 239-44.

21.

Wood, J.R., Green, S.B., Shapiro, W.R. The prognostic importance of tumor size in malignant gliomas: a compured tomographic scan study by the Brain Tumor Cooperative Group. J. Clin. Oncol., 1988, vol. 6, p. 338-43.

22.

Stummer, W., Pichlmeier, U., Meinel, T., et al. Fluorescence-guided surgery with 5aminolevulinic acid for resection of malignant glioma: a randomised controlled multicentre phase III trial. Lancet Oncol., 2006, vol. 7, no. 5, p. 392-401.

23.

Walker, M.D., Alexander, E., Jr., Hunt, W.E., et al. Evaluation of BCNU and/or radiotherapy in the treatment of anaplastic gliomas. A cooperative clinical trial. J. Neurosurg, 1978, vol. 49, p. 333-343.

24.

Kristiansen, K., Hagen, S., Kollevold, T., et al. Combined modality therapy of operated astrocytomas grade III and IV. Confirmation of the value of postoperative irradiation and lack of potentation of bleomycin on survival time: a prospective multicenter trial of the Scandinavian Glioblastoma Study Group. Cancer, 1981, vol. 47, p. 649-52.

25.

Shapiro, W.R., Green, S.B., Burger, P.S., et al. Randomized trial of three chemotherapy regimens and two radiotherapy regimens in postoperative treatment of malignant glioma. Brain Tumor Cooperative Group Trial 8001. J. Neurosurg., 1989, vol. 71, no. 1, p. 1-9.

26.

Kita, M., Okawa, T., Tanaka, M., et al. Radiotherapy of malignant glioma: prospective randomized clinical study of whole brain vs local irradiation. Gan No Rinsho (Japanese Journal of Cancer Clinics) 1989, vol. 35, no. 11, p. 1289-1294.

27.

Laperriere, N., Zuraw, L., Cairncross, G., et al. Radiotherapy for newly diagnosed malignant glioma in adults: A systematic review. Radiother. Oncol., 2002, vol. 64, p. 259-273.

28.

Souhami, L., Seiferheld, W., Brachman, D., et al. Randomized comparison of stereotactic radiosurgery followed by conventional radiotherapy with carmustine to conventional radiotherapy with carmustine for patients with glioblastoma

66

multiforme: report of Radiation Therapy Oncology Group 93-05 protocol. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 2004, vol. 60, p. 853-860. 29.

Laperriere, N.J., Leung, P.M., McKenzie, S., et al. Randomized study of brachytherapy in the initial management of patients with malignant astrocytoma. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1998, vol. 41, p. 1005-1011.

30.

Amelio, D., Lorentini, S., Schwarz, M., et al. Intensity-modulated radiation therapy in newly diagnosed glioblastoma: A systematic review on clinical and technical issues. Radiother. Oncol., 2010, vol. 97, no. 3, p. 361-9.

31.

Roa, W., Brasher, P.M., Bauman, G., et al. Abbreviated course of radiation therapy in older patients with glioblastoma multiforme: a prospective randomized clinical trial. J. Clin. Oncol., 2004, vol.22, no. 1583-8.

32.

Keime-Guibert, F., Chinot, O., Taillandier, et al. Radiotherapy for glioblastoma in the elderly. N. Engl. J. Med. 2007, vol. 356, no. 15, p. 1527-35.

33.

Walker, M.D., Green, S.B., Byar, D.P., et al. Randomized comparisons of radiotherapy and nitrosoureas for the treatment of malignant glioma after surgery. N. Engl. J. Med. , 1980, vol. 303, p. 1323-1329.

34.

Medical Research Council Brain Tumor Working Party. Randomized trial of procarbazine, lomustine, and vincristine in the adjuvant treatment of high-grade astrocytoma: a Medical Research Council trial. J. Clin. Oncol., 2001, vol. 19, p. 509518.

35.

Fine, H.A., Dear K.B., Loeffler, J.S., et al. Meta-analysis of radiation therapy with and without adjuvant chemotherapy for malignant gliomas in adults. Cancer, 1993, vol. 71, p. 2585-97.

36.

Stewart, L.A. Chemotherapy in adult high-grade glioma: a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials. Lancet, 2002, vol. 359, p. 1011-1018.

37.

Westphal, M., Ram, Z., Riddle, V., et al. Gliadel wafer in initial surgery for malignant glioma: long-term follow-up of a multicenter controlled trial. Acta Neurochir. (Wien), 2006, vol. 148, no. 3, p. 269-75; discussion p. 275.

38.

Stupp, R., Mason, W.P., van den Bent, M.J., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. , 2005, vol. 352, no. 10, p. 987-996.

39.

Stupp, R., Hegi, M.E., Mason, W.P., et al. European Organisation for Research and Treatment of Cancer Brain Tumor and Radiotherapy Groups; National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol., 2009, vol. 10, no. 5, p. 459-466.

40.

Mirimanoff, R., Mason, W., van den Bent, M., et al. Is long-term survival in glioblastoma possible? Updated results of the EORTC/NCIC phase III randomized trial on radiotherapy (RT) and concomitant and adjuvant temozolomide (TMZ) versus RT alone. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 2007, vol. 69, (3 Suppl), S2, Plenary 3.

41.

Athanassiou, H., Synodinou, M., Maragoudakis, E., et al. Randomised phase II study of temozolomide and radiotherapy compared with radiotherapy alone in newly

67

diagnosed glioblastoma multiforme. J. Clin. Oncol., 2005, vol. 23, no. 10, p. 23722377. 42.

Vredenburgh, J.J., Desjardins, A., Herndon, J.E., et al. Bevacizumab plus irinotecan in recurrent glioblastoma multiforme. J. Clin. Oncol., 2007, vol. 25, no. 30, p. 47224729.

43.

Friedman, H.S., Prados, M.D., Wen, P.Y., et al. Bevacizumab Alone and in Combination With Irinotecan in Recurrent Glioblastoma. J. Clin. Oncol., 2009, vol. 27, no. 28, p. 4733-4740.

44.

Cloughesy, T.F., Prados, M.D., Wen, P.Y. A phase II, randomized, non-comparative clinical trial of the effect of bevacizumab (BV) alone or in combinationwith irinotecan (CPT) on 6-month progressionfree survival (PFS6) in recurrent, treatmentrefractory glioblastoma (GBM). J. Clin. Oncol., 2008, vol. 26, Suppl, 91s.

45.

Radiation Therapy Oncology Group 0825, American College of Radiology. Phase III double-blind placebo-controlled trial of conventional concurrent chemoradiation and adjuvant temozolomide plus bevacizumab versus conventional concurrent chemoradiation and adjuvant temozolomide in patients with newly diagnosed glioblastoma [online]. September 29, 2009. Cited 2010-01-20. Available from: http://www.rtog.org/members/protocols/0825/0825.pdf.

46.

Chamberlain, M. Cilengitide: does it really represent a new targeted therapy for recurrent glioblastoma? J. Clin. Oncol., 2009, vol. 27, p. 1921.

47.

Batchelor, T., Mulholland, P., Neyns, B., et al. A phase III randomized study comparing the efficacy of cediranib as monotherapy, and in combination with lomustine, with lomustine alone in recurrent glioblastoma patients. Ann. Oncol., 2010, vol. 21, Suppl 8, p. viii4.

48.

Neyns, B., Sadones, J., Joosens, E., et al. Stratified phase II trial of cetuximab in patients with recurrent high-grade glioma. Ann. Oncol., 2009, vol. 20, no. 9, p. 1596-1603.

49.

Rich, J.N., Reardon, D.A., Peery, T., et al. Phase II trial of gefitinib in recurrent glioblastoma. J. Clin. Oncol., 2004, vol. 22, no. 1, p. 133-142.

50.

Peereboom, D.M., Shepard, D.R., Ahluwalia, M.S., et al. Phase II trial of erlotinib with temozolomide and radiation in patients with newly diagnosed glioblastoma multiforme. J Neurooncol., 2010, vol. 98, no. 1, p. 93-99.

51.

Galanis, E., Buckner, J.C., Maurer, M.J., et al. Phase II trial of temsirolimus (CCI779) in recurrent glioblastoma multiforme: a North Central Cancer Treatment Group Study. J. Clin. Oncol., 2005, vol. 23, no. 23, p. 5294-5304.

52.

Wick, W., Puduvalli, V.K., Chamberlain, M.C., et al. Phase III study of enzastaurin compared with lomustine in the treatment of recurrent intracranial glioblastoma. J. Clin. Oncol., 2010, vol. 28, no. 7, p. 1168-74.

53.

Butowski, N.A., Sneed, P.K., Chang, S.M. Diagnosis and treatment of recurrent highgrade astrocytoma. J. Clin. Oncol., 2006, vol. 24, no. 8, p. 1273-80.

54.

Combs, S.E., Thilmann, C., Edler, L., et al. Efficacy of fractionated stereotactic reirradiation in recurrent gliomas: long-term results in 172 patients treated in a single institution. J. Clin. Oncol., 2005, vol. 23, no. 34, p. 8863-9.

68

55.

Brandes, A.A., Fiorentino, M.V. The role of chemotherapy in recurrent malignant gliomas: an overview. Cancer Invest., 1996, vol. 14, p. 551-9.

56.

Wong, E.T., Hess, K.R., Gleason, M.J., et al. Outcomes and prognostic factors in recurrent glioma patients enrolled onto phase II clinical trials. J. Clin. Oncol., 1999, vol. 17, p. 2572.

57.

Stupp, R., Hegi, M.E., Gilbert, M.R., el al. A. Chemoradiotherapy in malignant glioma: standard of care and future directions. J. Clin. Oncol. 2007, vol. 25, no. 26, p. 4127-36.

58.

Perry, J.R., Belanger, K., Mason, W.P., et al. Phase II trial of continuous dose-intense temozolomide in recurrent malignant glioma: RESCUE study. J. Clin. Oncol., 2010, vol. 28, no. 12, p. 2051-57.

59.

Wick, A., Pascher, C., Wick, W., et al. Rechallenge with temozolomide in patients with recurrent gliomas. J. Neurol., 2009, vol. 256, no. 5, p. 734-741.

60.

Brandes, A.A., Tosoni, A., Cavallo, G., et al. Temozolomide 3 weeks and 1 week off as first-line therapy for recurrent glioblastoma: phase II study from Gruppo Italiano Cooperativo di Neuro-oncologia (GICNO). Br. J. Cancer, 2006, vol. 95, no. 9, p. 1155-1160.

61.

Su, Y.B., Sohn, S., Krown, S.E., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J. Clin. Oncol., 2004, vol. 22, p. 610-616.

62.

Wick, W., Weller, H. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J. Clin. Oncol., 2005, vol. 23, p. 4235-36.

63.

Buckner, J.C. Factors influencing survival in high-grade gliomas. Semin. Oncol., 2003, vol. 30, suppl 19, p. 10-14.

64.

Folstein, M.F., Folstein, S.E., McHugh, P.R. “Minimental state.“ A practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician. J. Psychiatr. Res., 1975, vol. 12, p. 189-198.

65.

Nečesalová, E., Kuglík, P., Cejpek, P., et al. Studium polyzomie chromozomu 7, monozomie chromozomu 10, amplifikace genu EGFR a delece genu p53 u multiformního glioblastomu pomocí metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Klin. Onkol., 2006, roč. 19, č. 1, s. 9-14.

66.

Sampson, J.H., Heimberger, A.B., Archer, G.E., et al. Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermal growth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newly diagnosed glioblastoma. J. Clin. Oncol., 2010, vol. 28, p. 4722-29.

67.

Pelloski, C.E., Ballman, K.V., Furth, A.F., et al. Epidermal growth factor receptor variant III status defines clinically distinct subtypes of glioblastoma. J. Clin. Oncol., 2007, vol. 25, no. 16, p. 2288-94.

68.

Korkolopoulou, P., Christodoulou, P., Kouzelis, K., et al. MDM2 and p53 expression in gliomas: a multivariate survival analysis including proliferation markers and epidermal growth factor receptor. Br. J. Cancer, 1997, vol. 75, no. 9, p. 1269-78.

69.

Duerr, E.M., Rollbrocker, B., Hayashi, Y., et al. PTEN mutations in gliomas and glioneuronal tumors. Oncogene, 1998, vol. 16, no. 17, p. 2259-64.

69

70.

Sanson, M., Marie, Y., Paris, S., et al. Isocitrate dehydrogenase 1 Codon 132 mutation is an important prognostic biomarker in gliomas. J. Clin. Oncol., 2009, vol. 27, p. 4150-4154.

71.

Wojdacz, T.K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MSHRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res., 2007, vol. 35, p. e41.

72.

Hegi, M.E., Diserens, A.C., Gorlia, T., et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N. Engl. J. Med. , 2005, vol. 352, no. 10, p. 9971003.

73.

Esteller, M., Garcia-Foncillas, J., Andion, E., et al. Inactivation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. N. Engl. J. Med. , 2000, vol. 343, no. 19, p. 1350-4.

74.

Paz, M.F., Yaya-Tur, R., Rojas-Marcos, I., et al. CpG island hypermethylation of the DNA repair enzyme methyltransferase predicts response to temozolomide in primary gliomas. Clin. Cancer Res., 2004, vol. 10, no. 15, p. 4933–8.

75.

Brandes, A.A., Franceschi, E., Tosoni, A., et al. MGMT promoter methylation status can predict the incidence and outcome of pseudoprogression after concomitant radiochemotherapy in newly diagnosed glioblastoma patients. J. Clin. Oncol., 2008, vol. 26, p. 2192-97.

76.

Das, P., Puri, T., Jha, P., et al. A clinical and molecular analysis of glioblastoma multiforme with long-term survival. J. Clin. Neurosci., 2011, vol. 18, p. 66-70.

77.

Krex, D., Klink, B., Hartmann, C., et al. Long-term survival with glioblastoma multiforme. Brain, 2007, vol. 130, p. 2596-2606.

78.

Hegi, M.E., Liu, L., Herman, J.G., et al. Correlation of O6 – methylguanine methyltransferase (MGMT) promoter methylation with clinical outcomes in glioblastoma and clinical strategies to modulate MGMT activity. J. Clin. Oncol., 2008, vol. 26, p. 4189-99.

79.

Esquela-Kerscher, A., Slack, F.J. Oncomirs-microRNAs with a role in cancer. Nat. Rev. Cancer, 2006, vol. 6, p. 259-269.

80.

Novakova, J., Slaby, O., Vyzula, R., et al. MicroRNA involvement in glioblastoma pathogenesis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2009, vol. 386, p. 1–5.

81.

Slabý, O., Krekáč, D., Hrstka, R., et al. Zapojení mikroRNA do patogeneze nádorových onemocnění a možnosti jejich využití v diagnostické a prediktivní onkologii. Čas. Lék. Čes., 2008, roč. 147, s. 25-31.

82.

Chan, J.A., Krichevsky, A.M., Kosik, K.S. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res., 2005, vol. 65, p. 6029-33.

83.

Gabriely, G., Wurdinger, T., Kesari, S., et al. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix matalloproteinase regulators. Mol. Cell. Biol., 2008, vol. 28, p. 5369-80.

84.

Gillies, J.K., Lorimer, I.A. Regulation of p27Kip1 by miRNA 221/222 in glioblastoma. Cell Cycle, 2007, vol. 6, p. 2005-09.

85.

Shi, L., Cheng, Z., Zhang, J., et al. Hsa-mir-181a and hsa-mir-181b function as tumor suppressors in human glioma cells. Brain Res., 2008, vol. 1236, p. 185-193.

70

86.

Zhang, Y., Chao, T., Li, R., et al. MicroRNA-128 inhibits glioma cells proliferation by targeting transcription factor E2F3a. J. Mol. Med., 2009, vol. 87, p. 43-51.

87.

Ujifuku, K., Mitsutake, N., Takakura, S., et al. miR-195, miR-455-3p and miR-10a(*) are implicated in acquired temozolomide resistance in glioblastoma multiforme cells. Cancer Lett., 2010, vol. 296, p. 241-8.

88.

Guan, Y., Mizoguchi, M., Yoshimoto, K., et al. MiRNA-196 is upregulated in glioblastoma but not in anaplastic astrocytoma and has prognostic significance. Clin Cancer Res., 2010, vol. 16, p. 4289-97.

89.

Weller, M., Felsberg, J., Hartmann, Ch., et al. Molecular predictors of progressionfree and overall survival in patients with newly diagnosed glioblastoma: a prospective translational study of the German Glioma Network. J. Clin. Oncol., 2009, vol. 27, p. 5743-50.

90.

Batchelor, T.T., Betensky, R.A., Esposito, J.M., et al. Age-dependent prognostic effects of genetic alterations in glioblastoma. Clin. Cancer Res., 2004, vol. 10, p. 22833.

91.

Rich, J.N., Hans, C., Jones, B., et al. Gene expression profiling and genetic markers in glioblastoma survival. Cancer Res., 2005, vol. 65, p. 4051-58.

92.

Houillier, C., Lejeune, J., Benouaich-Amiel, A., et al. Prognostic impact of molecular markers in a series of 220 primary glioblastomas. Cancer, 2006, vol. 106, p. 2218-23.

93.

Curran, Jr, W.J., Scott, C.B., Horton, J., et al. Recursive partitioning analysis of prognostic factors in three radiation therapy oncology group malignant glioma trials. J. Natl. Cancer Inst., 1993, vol. 85, p. 704-10.

94.

Scott, C.B., Scarantino, C., Urtasun, R., et al. Validation and predictive power of Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) recursive partitioning analysis classes for malignant glioma patients: A report using RTOG 90-60. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 1998, vol. 40, p. 51-55.

95.

Mirimanoff, R.O., Gorlia, T., Mason, W., et al. Radiotherapy and temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: recursive partitioning analysis of the EORTC 26981/22981-NCIC CE3 phase III randomized trial. J. Clin. Oncol., 2006, vol. 24, p. 2563-9.

96.

Gorlia, T., van den Bent, M.J., Hegi, M.E., et al. Nomograms for predicting survival of patients with newly diagnosed glioblastoma: prognostic factor analysis of EORTC and NCIC trial 26981/22981/CE.3. Lancet Oncol., 2008, vol. 9, no. 1, p. 29-38.

97.

Kudláček, T. Stanovení metylace v promotoru genu BRCA1 u vybraného souboru karcinomů prsu. Brno, 2010. Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta MU, Ústav experimentální biologie. Vedoucí práce Roman Hrstka. S. 23-24.

98.

Slabý O. Využití DNA čipů a profilování mikroRNA ve výzkumu nádorů tlustého střeva a konečníku. Brno, 2008. Dizertační práce. Lékařská fakulta MU, Masarykův onkologický ústav. Vedoucí práce Rostislav Vyzula. S. 55-57, 64.

99.

Macdonald, D.R., Cascino, T.L., Schold, S.C., et al. Response criteria for phase II studies of supratentorial malignant glioma. J. Clin. Oncol., 1990, vol. 8, p. 1277-80.

100.

Trotti, A., Colevas, A.D., Setser, A., et al. CTCAE v3.0: development of a comprehensive grading system for the adverse effects of cancer treatment. Semin. Radiat. Oncol., 2003, vol. 13, no. 3, p. 176-181.

71

101.

Faltejsková, P. Identifikace a studium funkce mikroRNA s prediktivním a prognostickým významem u pacientů s kolorektálním karcinomem. Brno, 2011. Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta MU, Ústav biochemie. Vedoucí práce Ondřej Slabý. S. 57-59.

102.

Gilbert, M.R., Wang, M., Aldape, K.D., et al. RTOG 0525: A randomized phase III trial comparing temozolomide (TMZ) with a dose-dense (dd) schedule in newly diagnosed glioblastoma (GBM). J. Clin. Oncol., 2011, vol. 29, abstract 2006.

103.

Chinot, O.L., Wick, W., Saran, F., et al. AVAglio: A phase III trial of bevacizumab added to standard radiotherapy and temozolomide in patients with newly diagnosed glioblastoma. J. Clin. Oncol., 2011, vol. 29, abstract TPS136.

104.

Hegi, M.E., Diserens, A.C., Godard, S., et al. Clinical trial substantiates the predictive value of O-6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter methylation in glioblastoma patients treated with temozolomide. Clin. Cancer Res., 2004, vol. 10, no. 6, p. 1871-74.

105.

Wick, W., Steinbach, J., Combs, S.E., et al. Enzastaurin (ENZ) before and concomitant with radiation therapy (RTX) followed by ENZ maintenance therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma (GBM) without hypermethylation of the O6-methylguanyl DNA-methyltransferase (MGMT) promoter: a multicenter, open-label, uncontrolled phase II study. J. Clin. Oncol., 2011, vol. 29, abstract 2007.

106.

Sana, J., Hajduch, M., Michalek, J., et al. MicroRNAs and glioblastoma: roles in core signaling pathways and potential clinical implications. J. Cell. Mol. Med., 2011, vol. 15, no. 8, p. 1636-44.

107.

Slaby, O., Lakomy, R., Fadrus, P., et al. MicroRNA-181 family predicts response to concomitant chemoradiotherapy with temozolomide in glioblastoma patients. Neoplasma, 2010, vol. 57, p. 264-9.

108.

Wang, X., Wang, J., Ma, H., et al. Downregulation of miR-195 correlates with lymph node metastasis and poor prognosis in colorectal cancer. Med. Oncol., 2011, Mar 10. [Epub ahead of print]

109.

Xu, T., Zhu, Y., Xiong, Y., et al. MicroRNA-195 suppresses tumorigenicity and regulates G1/S transition of human hepatocellular carcinoma cells. Hepatology, 2009, vol. 50, p. 113-21.

110.

Liu, L., Chen, L., Xu, Y., et al. microRNA-195 promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity of human colorectal cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 2010, vol. 400, p. 236-40.

111.

Soon, P.S., Tacon, L.J., Gill, A.J., et al. miR-195 and miR-483-5p Identified as Predictors of Poor Prognosis in Adrenocortical Cancer. Clin. Cancer Res., 2009, vol. 15, p. 7684-92.

112.

Shi, L., Cheng, Z., Zhang, J., et al. Hsa-mir-181a and hsa-mir-181b function as tumor suppressors in human glioma cells. Brain Res., 2008, vol. 1236, p. 185-93.

113.

Ciafre, S.A., Galardi, S., Mangiola, A., et al. Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma. Biochem. Biophys Res. Commun., 2005, vol. 334, p. 1351-8.

114.

Papagiannakopoulos, T., Shapiro, A., Kosik, K.S. MicroRNA-21 targets a network of key tumor-suppressive pathways in glioblastoma cells. Cancer Res., 2008, vol. 68, p. 8164-72. 72

115.

Chen, Y., Liu, W., Chao, T., et al. MicroRNA-21 down-regulates the expression of tumor suppressor PDCD4 in human glioblastoma cell T98G. Cancer Lett., 2008, vol. 272, p. 197-205.

116.

Chan, J.A., Krichevsky, A.M., Kosik, K.S. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells. Cancer Res., 2005, vol. 65, p. 6029-33.

73

11.

SEZNAM ZKRATEK

A-ALA

5-aminolevulová kyselina (5-aminolevulinic acid)

ASCO

American Society of Clinical Oncology

AV

arteriovenózní

BCNU

karmustin

CCNU

lomustin

CD

označení povrchových antigenů (cluster of differentiation)

cDNA

komplementární deoxyribonukleová kyselina (complementary deoxyribonucleic acid)

CNS

centrální nervový systém

CT

výpočetní tomografie (computered tomography)

DNA

deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid)

ECOG

Eastern Cooperative Oncology Group

EGFR

receptor pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor)

EORTC

European Organisation for Research and Treatment of Cancer

GBM

glioblastoma multiforme

GFAP

glial fibrillary acidic protein

Gy

jednotka absorbované dávky záření (Gray)

HIV

virus lidského imunodeficitu I (human immunodeficiency virus)

HR

hazard ratio

HRM

high resolution melting

IDH1

isocitrát dehydrogenáza 1

IMRT

radioterapie s modulovanou intenzitou (intensity modulated radiotherapy)

KPS

stav celkové fyzické zdatnosti dle Karnofského (Karnofsky performance status)

LOH

ztráta heterozygozity (loss of heterozygosity)

MGMT

O6-metylguanin-DNA-metyltransferáza

miRNA

mikroRNA, krátké nekódující RNA

m-TOR

savčí rapamycinový cílový receptor (mammalian target of rapamicine)

74

NADPH

redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)

NCI-CTCAE

National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events

OS

celková doba přežití (overall survival)

PCR

polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

PCV

procarbazin + lomustin + vinkristin

PDGFR

receptor pro destičkový růstový faktor (platelet derived growth factor receptor)

PFS

přežití bez progrese onemocnění (progression free survival)

PFS-6

šestiměsíční přežití bez progrese onemocnění (six-month progression free survival)

PI3K

kináza (phosphatidylinositol 3 kinase)

PS

stav celkové fyzické zdatnosti (performance status)

PTEN

fosfatáza (phosphatase and TENsin homolog)

RAS

protein účastnící se přenosu mitogenního signálu (Rous adenosarcoma)

RB

retinoblastomový gen

real-time PCR

polymerázová řetězová reakce v reálném čase (real-time polymerase chain reaction)

RNA

ribonukleová kyselina (ribonucleic acid)

RPA

recursive partitioning analysis

RR

počet léčebných odpovědí (response rate)

RT

reverzní transkripce (reverse transcription)

RTOG

Radiation Therapy Oncology Group

TNM

klasifikace popisující anatomický rozsah nádorové choroby

TTP

čas do progrese (time to progression)

TTP-6

šestiměsíční čas do progrese (six-month time to progression)

VEGFR

receptor pro vaskulární endoteliální růstový faktor (vascular endothelial growth factor receptor)

WBRT

radioterapie celého mozku (whole brain radiotherapy)

WHO

Světová zdravotnická organizace (World Health Organization)

75

12.

SEZNAM OBRÁZKŮ

Obrázek 1:

Incidence a mortalita primárních mozkových nádorů u dospělých v ČR.

Obrázek 2:

Barvení hematoxylin-eosin, zvětšení 200x.

Obrázek 3:

GFAP (klon 6F2), zvětšení 200x.

Obrázek 4:

Ki 67 (klon SP6), zvětšení 400x.

Obrázek 5:

MR vyšetření - T1 zobrazení.

Obrázek 6:

MR vyšetření - T2 zobrazení.

Obrázek 7:

Bisulfitová konverze nemetylovaného cytosinu na uracil, princip metody.

Obrázek 8:

Normalizované křivky tání promotoru genu pro MGMT.

Obrázek 9:

Reverzní transkripce a polymerázová řetězová reakce v reálném čase (Applied Biosystems).

Obrázek 10: Polymerázová řetězová reakce, rozštěpení TaqMan-MBG sondy TaqMan polymerázou s následným uvolněním fluorescenčního záření. Obrázek 11: Kaplan-Meierova analýza – přežití bez progrese onemocnění (PFS). Obrázek 12: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS). Obrázek 13: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS) v závislosti na celkovém stavu výkonnosti (PS). Obrázek 14: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS) v závislosti na přítomnosti pooperačního rezidua tumoru. Obrázek 15: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS) v závislosti na věku. Obrázek 16: Kaplan-Meierova analýza – čas přežití od recidivy/progrese v závislosti na léčbě. Obrázek 17: Kaplan-Meierova analýza – čas přežití od recidivy/progrese v závislosti na operabilitě. Obrázek 18: Kaplan-Meierova analýza – celkové přežití (OS) v závislosti na možnosti chirurgické léčby progrese nemoci. Obrázek 19: Kaplan–Meierovy křivky přežití – celkové přežití (A) a přežití bez progrese onemocnění (B) dle stavu metylace promotoru genu pro MGMT. Obrázek 20: Kaplan–Meierovy křivky přežití – celkové přežití ve vztahu k miR-195 (A) a miR-196b (B). Obrázek 21: MiR-181c (A) a miR-21 (B) a jejich vztah k časné progresi onemocnění do 6 měsíců (TTP-6).

76

12.

SEZNAM TABULEK

Tabulka 1:

Celkové přežití podle rozsahu operace a následné léčby.

Tabulka 2:

Celkové přežití ve vztahu k použité léčbě a stavu metylace MGMT genu.

Tabulka 3:

Dose-dense a metronomické režimy s temozolomidem.

Tabulka 4:

RPA klasifikace maligních gliomů dle RTOG.

Tabulka 5:

Modifikace RPA klasifikace pro pacienty s glioblastomy podstupující chemoradioterapii s temozolomidem dle EORTC/NCIC.

Tabulka 6:

Charakteristika souboru a orientační srovnání se Stuppovým souborem.

Tabulka 7:

Celkové přežití a přežití bez progrese onemocnění, orientační srovnání se Stuppovým souborem.

Tabulka 8:

Parametry přežití ve vztahu k věku, rozsahu resekce, PS, dávce podané radioterapie a počtu dní chemoterapie při konkomitantní fázi léčby.

Tabulka 9:

Léčba recidivy/progrese po chemoradioterapii a adjuvantní chemoterapii.

Tabulka 10: Použitá léčba v době recidivy/progrese a ovlivnění délky života. Tabulka 11: Závažná toxicita (G3/4) dle NCI-CTCAE version 3.0 a komplikace konkomitantní chemoradioterapie (v průběhu a do 1 měsíce od ukončení). Tabulka 12: Charakteristika souboru pacientů určených k vyšetření stavu metylace promotoru genu pro MGMT a vybraných miRNA. Tabulka 13: Parametry přežití ve vztahu k metylaci MGMT v MOÚ a orientační srovnání se Stuppovou studií. Tabulka 14: Srovnání exprese miRNA v nádorové a nenádorové tkáni a jejich vztah k metylačnímu stavu promotoru genu pro MGMT. Tabulka 15: Vztah pozitivity miR-21/miR-181c a času do progrese onemocnění v 6 měsících od operace.

77

14.

SEZNAM PUBLIKACÍ DOKTORANDA (publikace související s tématem disertační práce)

Články v časopisech s IF 1. Burkoň, P., Lakomý, R., Burkoňová, D., Fadrus, P. Konkomitantní chemoradioterapie a cílená biologická léčba u glioblastoma multiforme. Česká a slovenská neurologie a neurochirurgie, 2010, roč. 73/106, č. 5, s. 503-509. (IF 0,393) 2. Kren, L., Slaby, O., Muckova, K., Lzicarova, E., Sova, M., Vybihal, V., Svoboda, T., Fadrus, P., Lakomy, R., Vanhara, P., Krenova, Z., Sterba, J., Smrcka, M., Michalek, J. Expression of immune-modulatory molecules HLA-G and HLA-E by tumor cells in glioblastomas: Anunexpected prognostic significance? Neuropathology, 2011, vol. 31, no. 2, p. 129-134. (IF 2010: 1.605) 3. Kren, L., Muckova, K., Lzicarova, E., Sova, M., Vybihal, V., Svoboda, T., Fadrus, P., Smrcka, M., Slaby, O., Lakomy, R., Vanhara, P., Krenova, Z., Michalek, J. Production of immune-modulatory nonclassical molecules HLA-G and HLA-E by tumor infiltrating ameboid microglia/macrophages in glioblastomas: a role in innate immunity? Journal of neuroimmunology, 2010, vol. 220, no. 1-2, p. 131-5. (IF 2,901) 4. Lakomy, R., Sana, J., Hankeova, S., Fadrus, P., Kren, L., Lzicarova, E., Svoboda, M., Dolezelova, H., Smrcka, M., Vyzula, R., Michalek, J., Hajduch, M., Slaby, O. MiR195, miR-196b, miR-181c, miR-21 expression levels and MGMT methylation status are associated with clinical outcome in glioblastoma patients. Cancer science, 2011, Sep 5. [Epub ahead of print] (IF 2010: 3,846) 5. Slaby, O., Lakomy, R., Fadrus, P., Hrstka, R., Kren, L., Lzicarova, E., Smrcka, M., Svoboda, M., Dolezalova, H., Novakova, J., Valik, D., Vyzula, R., Michalek, J. MicroRNA-181 family predicts response to concomitant chemoradiotherapy with temozolomide in glioblastoma patients. Neoplasma, 2010, vol. 57, no. 3, p. 264-9. (IF 1,449) 6. Šlampa, P., Smrčka, M., Bolješíková, E., Lakomý, R., Kramář, F., Přibáň, V., Malinová, B., Štěrba, J., Pajdlhauser, R. Závěry „Winter Glio Track Meeting“ 2008. Česká a slovenská neurologie a neurochirurgie, 2008, roč. 71/104, č. 2, s. 234-235. (IF 0,319) Články v recenzovaných časopisech bez IF 1. Fadrus, P., Lakomý, R., Hübnerová, P., Slabý, O., Keřkovský, M., Svoboda, T., Vybíhal, V., Neuman, E., Kryštofová, S., Sova, M., Smrčka, M. Intrakraniální nádory - diagnostika a terapie. Interní medicína, 2010, roč. 12, č. 7 a 8, s. 376-381. 2. Lakomý, R., Burkoň, P., Burkoňová, D., Jančálek, R. Nové možnosti léčby glioblastoma multiforme. Klinická onkologie, 2010, roč. 23, č. 6, s. 381-387. 3. Lakomý, R., Fadrus, P., Šlampa, P., Svoboda, T., Křen, L., Lžičařová, E., Belanová, R., Šiková, I., Poprach, A., Schneiderová, M., Procházková, M., Šána, J., Slabý, O., Smrčka, M., Vyzula, R., Svoboda, M. Výsledky multimodální léčby glioblastoma multiforme: Konsekutivní série 86 pacientů diagnostikovaných v letech 2003–2009. Klinická onkologie, 2011, roč. 24, č. 2, s. 112-120.

78

4. Šlampa, P., Smrčka, M., Belan, V., Ehrmann, J., Kramář, F., Vorlíček, J., Malinová, B., Kalita, O., Lakomý, R.Vybrané diagnosticko-léčebné problémy u vysoce maligních gliomů - závěry multidisciplinárního 04. pracovního setkání. Klinická onkologie, 2009, roč. 22, č. 2, s. 80- 81. 5. Šlampa, P., Smrčka, M., Belan, V., Ehrmann, J., Kramář, F., Vorlíček, J., Malinová, B., Kalita, O., Lakomý, R.Vybrané diagnosticko-léčebné problémy u vysoce maligních gliomů - závěry multidisciplinárního 04. pracovního setkání. Onkólogia (Bratislava), 2009, roč. 4, č. 2, s. 1-2. 6. Šlampa, P. Smrčka, M. Bolješíková, E. Lakomý, R. Kramář, F. Přibáň, V. Malinová, B. Štěrba, J. Pajdlhauser, R. Závěry Winter Glio Track Meeting. Klinická onkologie, 2008, roč. 21, č. 2, s. 74-75. 7. Šlampa, P., Smrčka, M., Bolješíková, E., Lakomý, R., Kramář, F., Přibáň, V., Malinová, B., Štěrba, J., Pajdlhauser, R. Závěry „Winter Glio Track Meeting“ 2008. Onkológia (Bratislava), 2008, vol. 3, no. 1, s. 62. Kapitoly v knihách 1. Fadrus, P., Hynková, L., Lakomý, R., Smrčka, M. Nádory mozku. In Adam, Z. [et al.] Speciální onkologie: příznaky, diagnostika a léčba maligních chorob. Praha: Galén, 2010, s. 7-16 2. Nádory centrální nervové soustavy. [R. Lakomý - člen autorského kolektivu, spoluautor kapitoly.] In Šlampa, P. a kol. Radiační onkologie v praxi. 2. aktualizované vyd. Brno: MOÚ, 2007, kap. 10, s. 171-191. 3. Šlampa, P., Komínek, L. Kudláček, A., Lakomý, R. Vysoce maligní (high grade) gliomy. In Šlampa, P. a kol. Radiační onkologie v praxi. 3. aktualizované vyd. Brno: MOÚ, 2011, s. 204-209. Abstrakta ve sbornících 1. Fadrus, P., Smrčka, M., Garčic, J., Hynková, L., Čoupková, I., Lakomý, R., Šlampa, P., Šiková, I., Svoboda, T., Neuman, E. Kombinace chirurgické léčby se stereotaktickou radiochirurgií v terapii mnohočetných metastáz mozku. In Edukační sborník: XXXIV. Brněnské onkologické dny a XXIV. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno, 2010, č. 52. 2. Fadrus, P., Vybíhal, V., Lakomý, R., Slabý, O., Svoboda, T., Šlampa, P., Keřkovský, M., Michálek, J., Smrčka, M., Neuman, E., Šiková, I. Současné možnosti v terapii high grade gliomů mozku. In Edukační sborník: XXXIV. Brněnské onkologické dny a XXIV. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, Brno, 2010, č. 89. 3. Fadrus, P., Lakomý, R., Hrstka, R., Lžičařová, E., Šlampa, P., Křen, L. Stanovení metylace genu kódujícího O6-metylguanin DNA metyltransferázu (MGMT) u pacientů s glioblastomem - pilotní studie. In Pracovní dny České neurochirurgické společnosti a Pracovní skupiny intervenční neuroradiologie. Ústí nad Labem, 2008. Česká a slovenská neurologie a neurochirurgie, 2008, roč. 71/104, suppl 2, s. 58. (IF 0,319)

79

4. Fadrus, P., Slabý, O., Lakomý, R., Lžičařová, E., Šlampa, P., Svoboda, T., Smrčka, M. Určení stupně metylace genu kódujícího O6-metylguanin DNA metyltransferázu (MGMT) u pacientů s glioblastomem - pilotní studie. In Edukační sborník: XXXIII. Brněnské onkologické dny a XXIII. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, 2009, s. 33, č. 8. 5. Křen, L., Múčková, K., Lžičařová, E., Sova, M., Vybíhal, V., Svoboda, T., Fadrus, P., Smrčka, M., Slabý, O., Lakomý, R., Vaňhara, P., Michálek, J. Produkce imunomodulatorních neklasických molekul HLA-G a HLA-E tumor infiltrující améboidní mikroglií u glioblastomů:role v protinádorové imunitě? In Edukační sborník: XXXIV. Brněnské onkologické dny a XXIV. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, 2010, č. 49. 6. Lakomý, R., Fadrus, P., Šlampa, P., Poprach, A., Svoboda, T., Vybíhal, V., Křen, L., Belanová, R., Šiková, I., Slabý, O. Glioblastoma multiforme - naše zkušenosti s léčbou v letech 2003-2008. In Edukační sborník: XXXIV. Brněnské onkologické dny a XXIV. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, 2010, č. 48. 7. Lakomý, R. Postavení chemoterapie v léčbě nádorů CNS. In XXXIX. Neurofarmakologické sympozium, Lísek - Bystřice nad Pernštejnem, 2007, Sborník přednášek ze sympozia. 8. Slabý, O., Hrstka, R., Nováková, J., Cibulková, K., Lžičařová, E., Lakomý, R., Křen, L., Fadrus, P., Smrčka, M., Michálek, J. Prediktivní význam vybraných mikroRNA a metylačního stavu promotoru MGMT u pacientů s multiformním glioblastomem In Dny diagnostické, prediktivní a experimentální onkologie, Olomouc, 2008, Sborník, s. 19. 9. Šlampa, P., Fadrus, P., Garčic, J., Čoupek, P., Hynková, L., Čoupková, I., Steiner, M., Princ, D., Lakomý, R. Výsledky stereotaktické radioterapie nádorů CNS. In XIII. dny prof. Vl. Staška, Praha, 2008, Sborník témat a přednášek, s. 88. 10. Šlampa, P., Smrčka, M., Belan, V., Ehrmann, J., Kramář, F., Vorlíček, J., Malinová, B., Kalita, O., Lakomý, R. Závěry multidisciplinárního pracovního setkání „Winter GLIO TRACK Meeting“ 2009. In Edukační sborník: XXXIII. Brněnské onkologické dny a XXIII. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, 2009, s. 124-125. 11. Vybíhal, V., Fadrus, P., Smrčka, M., Lakomý, R., Šprláková-Puková, A., Křen, L. Gangliogliom: 2 kazuistiky s výsledky MR a PET vyšetření. In Edukační sborník: XXXIII. Brněnské onkologické dny a XXIII. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, 2009, s. 229. 12. Vybíhal, V., Fadrus, P., Smrčka, M., Lakomý, R., Šprláková-Puková, A., Lžičařová, E. Gliomatosis cerebri: stereobioptická diagnostika a léčba radioterapií. In Edukační sborník: XXXIII. Brněnské onkologické dny a XXIII. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky, 2009, s. 231.

80

15.

SEZNAM PŘÍLOH

1. Lakomy, R., Sana, J., Hankeova, S., Fadrus, P., Kren, L., Lzicarova, E., Svoboda, M., Dolezelova, H., Smrcka, M., Vyzula, R., Michalek, J., Hajduch, M., Slaby, O. MiR195, miR-196b, miR-181c, miR-21 expression levels and MGMT methylation status are associated with clinical outcome in glioblastoma patients. Cancer science, 2011, Sep 5. [Epub ahead of print] (IF 2010: 3,846) 2. Slaby, O., Lakomy, R., Fadrus, P., Hrstka, R., Kren, L., Lzicarova, E., Smrcka, M., Svoboda, M., Dolezalova, H., Novakova, J., Valik, D., Vyzula, R., Michalek, J. MicroRNA-181 family predicts response to concomitant chemoradiotherapy with temozolomide in glioblastoma patients. Neoplasma, 2010, vol. 57, no. 3, p. 264-9. (IF 1,449) 3. Lakomý, R., Fadrus, P., Šlampa, P., Svoboda, T., Křen, L., Lžičařová, E., Belanová, R., Šiková, I., Poprach, A., Schneiderová, M., Procházková, M., Šána, J., Slabý, O., Smrčka, M., Vyzula, R., Svoboda, M. Výsledky multimodální léčby glioblastoma multiforme: Konsekutivní série 86 pacientů diagnostikovaných v letech 2003–2009. Klinická onkologie, 2011, roč. 24, č. 2, s. 112-120.

81