Profil Epigenetik dan Fungsi Imun Dihubungkan dengan Post Traumatic Stress Disorder
Dasar-dasar biologis dari gangguan stres pasca trauma (PTSD) belum sepenuhnya dijelaskan. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa perubahan dalam sistem kekebalan tubuh merupakan ciri khas dari gangguan ini. Identifikasi mekanisme biologis yang berkaitan dengan perubahan yang terjadi tersebut dapat memberikan wawasan mendasar ke dalam etiologi dan pengobatan PTSD. Di sini kita mengidentifikasi profil epigenetik tertentu yang mendasari perubahan sistem kekebalan yang terkait dengan PTSD. Penggunakan sampel darah (n = 100) yang diperoleh dari studi epidemiologi prospektif di Detroit, the Detroit Studi Neighborhood Health, kami menerapkan metilasi mikroarray ke situs uji CpG dari lebih dari 14.000 gen antara 23 individu yang terkena PTSD dan 77 individu tidak terkena. Kami menunjukkan bahwa fungsi sistem kekebalan tubuh secara signifikan muncul secara berlebihan yang dihubungkan dengan gen yang tidak termetilasi secara unik pada mereka yang mengalami PTSD. Lebih jauh lagi, kami menunjukkan bahwa gen yang tingkat metilasinya secara signifikan berkorelasi negatif dengan beban traumatis menunjukkan fungsi kekebalan tubuh dengan sinyal yang sama kuat antara individu yang terkena PTSD . Variabilitas epigenetik yang diamati pada fungsi kekebalan tubuh pada PTSD dikuatkan dengan menggunakan sebuah penanda biologis independen dari respon imun terhadap infeksi, yaitu CMV, sebuah tipe laten virus herpes yang aktivitasnya secara signifikan lebih tinggi pada individu dengan PTSD. Laporan epigenomic perifer dan profil CMV terkait dengan penyakit mental menunjukkan model biologis etiologi PTSD di mana sebuah peristiwa traumatis eksternal menginduksi perubahan fungsi kekebalan tubuh dengan mengurangi tingkat metilasi gen yang berkaitan dengan kekebalan tubuh. Gangguan stres pasca trauma (PTSD) adalah respon psikologis dan fisiologis atipikal yang dapat terjadi pada orang yang mengalami kejadian yang berpotensi traumatis/potentially traumatic event (PTE) meliputi ancaman kehidupan, cedera serius ataupun kematian. Untuk memperoleh diagnosis PTSD, reaksi terhadap stresor traumatis harus melibatkan rasa takut, tidak 1
berdaya, atau kengerian. Selain itu, juga harus mengalami tiga gejala berikut yaitu ingatan yang terus berulang atau perasaan mengalami kembali PTE (potentially traumatic event), disertai dengan penderitaan psikologis yang intens atau reaktivitas fisiologis; penghindaran perasaan, pikiran dan aktifitas yang berkaitan dengan trauma yang menetap, yang mungkin melibatkan amnesia atau mati rasa untuk rangsangan eksterna; dan peningkatan gairah yang mungkin melibatkan insomnia, kewaspadan yang berlebihan ,atau respon kejut berlebihan. Gejala tersebut harus dialami minimal satu bulan dan untuk mendapatkan diagnosis PTSD, harus cukup berat untuk mengganggu kehidupan sosial invidu, pekerjaan, atau fungsi interpersonal ( 1 ). Paparan stres traumatik merupakan prasyarat untuk diagnosis PTSD dan membedakannya dari psikopatologi lainnya. Memang, PTSD telah digambarkan sebagai fenotipe tertentu yang berkembang sebagai akibat kegagalan menimbulkan respons stres yang normal (2), mengakibatkan disregulasi dari hipotalamus-hipofisis-adrenal(HPA), salah satu sistem respon stress utama tubuh yang berinteraksi timbal balik dengan sistem kekebalan tubuh untuk mempertahankan homeostasis (3). Individu dengan PTSD dan indivudu tanpa PTSD terbukti memiliki pola ekspresi berbeda dalam gen yang terlibat dalam aktivasi kekebalan tubuh (4,5) dan dalam gen yang mengkode protein neural dan endokrin (4, 6). Penemuan terbaru memperlihatkan bahwa proses perubahan metilasi epigenetic DNA dapat terjadi sepanjang hidup dan mengubah daripada profil ekspresi gen. Penelitian ini memiliki harapan besar untuk mempelajari PTSD mengingat terdapat hubungan langsung antara sebuah pengalaman (yaitu PTE) dengan manifestasi fisiologis dari penyakitnya. Namun, berdasarkan pengalaman kami tidak ada penelitian yang mencatat perbedaan pola metilasi epigenetik antara orang-orang dengan PTSD dibandingkan dengan orang-orang yang tidak pernah mengalami PTSD, meskipun penelitian genetic pada tikus dan manusia yang memakai aksis HPA menunjukan bahwa ada hubungan yang antara proses tersebut dengan adanya kelainan yang terjadi. Secara khusus, itu memberi gambaran kasar hubungan antara PTSD dengan perubahan dalam system kekebalan tubuh, sesuatu yang wajar bila PTSD dihubungkan dengan perubahan epigenetic dalam system kekebalan tubuh terkait gen klaster. Jika ini benar maka akan memberi petunjuk untuk membuktikan suatu mekanisme yang menghubungkan sebuah trauma dapat mengubah ekspresi gen, sehingga mengubah funsi kekebalan tubuh dan perubahan fisiologis lain yang mungkin. 2
Disini kami menampilakan hasil dari suatu penyidikan berskala besar mengenai metilasi epigenetic dan fungsi system kekebalan tubuh antara orang yang mengalami PTSD dengan orang yang tidak mengalami PTSD, sumber diperoleh dari Detroid Neighborhood Heath Study (DNHS). DNHS menggunakan sebuah studi longitudinal epidedemiologi untuk menemukan korelasi antara PTSD dan gangguan jiwa lainnya di Kota Detroit. Di tahap pertama dari penelitian ini, ditemukan prevalensi dari
gangguan depresi berat (MDD) dan gangguan
kecemasan menyeluruh (GAD) sejalan dengan kejadian yang terjadi secara nasional; namun prevalensi PTSD terakhir lebih banyak dua kali daripada sebuah studi epidemiologi lain yang dilaporkan sebelumnya (14,4% dan 10,0% vs 6,8% dan 3,5%). Temuan ini mungkin tepat mengingat meningkatnya kekerasan fisik, yang dikatkan dengan resiko untuk terjadi PTSD pada kasus ini lebih tinggi daripada jenis trauma lain. Pengalaman dengan kekerasan fisik dialami oleh 50,8% sampel survey DNHS, ini dialami lebih banyak pada masyarakat suburban yang tinggal di pinggiran kota Detroit sama dengan yang dilaporkan pula pada masyarakat suburban di pinggiran kota lainnya di Amerika Serikat. Temuan ini menunjukan bahwa adanya PTE dapat bervariasi diberbagai lingkungan social yang berbeda. Kejadian yang realtif tinggi pada PTSD yang berhubungan dengan psikopatologi pada populasi sample DNHS menawarkan kesempatan menarik untuk menilai korelasi epigenetic gangguan ini, yang mungkin, dalam jangka panjang membantu upaya-upaya intervensi yang efektif.
Hasil Kami menggunakan DNA yang berasal dari seluruh komponen darah 100 individu, 23 di antaranya memenuhi kriteria lifetime PTSD, yang berpartisipasi dalam gelombang 1 DNHS. Dengan menggunakan humanmethylation27 (HM27) DNA Analysis Bead Chip oleh Illumina, kami menilai profil metilasi lebih dari 27.000 situs CpG yang mencakup lebih dari 14.000 gen (rincian tambahan mengenai protokol eksperimental dan determinasi PTSD
tersedia dalam
lampiran 1). Individu-individu yang terkena dampak PTSD dan yang tidak terpengaruh PTSD, tidak berbeda secara signifikan sehubungan dengan usia, seks, ras, atau hitung sel mononuklear darah periferal (tabel S1), dan keseratus individu tersebut telah terpapar dengan setidaknya satu PTE. 3
Kami fokus pada upaya awal kami mengidentifikasi gen yang ada di antara individu ptsdaffected methylated atau unmethylated vs -unaffected. Nilai DNA methylation beta berupa variabel yang kontinu antara 0 (unmethylated komplit) dan 1 (methylated komplit). Dalam analisis ini , kami mengklasifikasikan penyelidikan dengan nilai beta < 0.2 sebagai unmethylated dan penyelidikan dengan nilai beta > 0,8 sebagai methylated . Walau hingga saat ini tidak ada konsensus mengenai cara terbaik untuk membuat data methylation ( 14 ) , Nilai-nilai ini lebih rendah dibandingkan dengan cut off lain yang sebelumnya pernah digunakan untuk membedakan situs methylated dan unmethylated HM27 BeadChip
(15 ) dan dibandingkan dengan nilai
referensi persentase methylation analog yang seringkali diadopsi dalam penelitian kanker untuk mewakili gen unmethylated dan methylated, masing-masingnya ( misalnya ref . 16 ) . Kami merata-ratakan tingkat metilasi untuk masing-masing gen di setiap kelompok dan kemudian ditentukan jumlah bersama dan khusus gen methylated/unmethylated dalam setiap perbandingan (gambar 1). Jumlah gen khusus unmethylated tidak berbeda secara signifikan antara individu yang PTSD-affected dan unaffected
(χ2=0.49, 1 df, P = 0.485);namun
bagaimanapun juga terdapat perbedaan yang signifikan antara dua kelompok sehubungan dengan jumlah gen khusus methylated ((χ2 = 46.10, 1 df, P < 0.0001). Analisis ekspresi gen dari gen methylated dan unmethylated pada kedua kelompok itu menyatakan bahwa secara umum bagian gen methylated sesuai dengan tingkat ekspresi gen yang lebih rendah dan sebaliknya bagian gen unmethylated sesuai dengan tingkat ekspresi gen yang lebih tinggi. Pyrosequencing dan DNA target dari lokus selektif (n = 5) mengkonfirmasi arah dari hasil methylation awal dari HM27 Bead Chip dan keberadaan dari urutan invariant pada pemeriksaan daerah sasaran (lampiran S1). Untuk mendapatkan wawasan tentang pentingnya biologis gen unik methylated dan unmethylated, kami melakukan analisis fungsional penjelasan clustering (FAC). Tabel 1 menyajikan hasil tiga teratas dari FACs yang ditentukan dari gen unik methylated dan unmethylated di masing-masing dua kelompok (hasil tersedia dalam tabel S2, tabel S3, table S4, dan Tabel S5). Gambar
2A dan
b menggambarkan dua sampel FACs, dan gen yang
dikandungnya, ditentukan dari kelompok PTSD terpengaruh. Cluster diidentifikasikan dengan memilih penjelasan yang mewakili makna biologi yang luas untuk masing-masing FAC. Konsisten
dengan
hasil
temuan
sebelumnya
tentang
ekspresi
gen
dan
kajian
psychoeneuroimmunologis (3), masing-masing dari tiga teratas FACs ditentukan dari uniknya 4
unmethylated gen antara individu-individu yang terkena dampak PTSD menunjukkan tanda kuat keterlibatan sistem kekebalan tubuh. Tanda ini termasuk gen dari sistem imun bawaan (e.g.,TLR1 andTLR3), serta dari gen yang mengatur proses sistem imun bawaan dan adaptif (misalnya, IL8, LTA dan KLRG-1, sebaliknya
jalur dan proses yang relevan dengan
perkembangan organisme secara umum dan neurogenesis khususnya, ditemukan gambaran gen unik unmethylated yang sangat banyak dalam kelompok PTSD yang tidak terpengaruh. Terutama, cluster serupa yang diperoleh dengan menggunakan pendekatan alternatif yang didasarkan pada perbedaan gen methylated antara dua kelompok dengan p<0,01, dengan penjelasan lima teratas FACs yang mencakup sinyal, proliferasi sel, perkembangan proses, proses sistem neorologis, dan respons peradangan.
PTSD sering terjadi bersamaan dengan penyakit mental lainnya, khususnya depresi dan gangguan kecemasan lain(17).Untuk menyelidiki efek yang comorbid yang mungkin pada hasil penelitian kami, kami menilai apakah terdapat perbedaan yang signifikan terhadap gen methylated antara mereka yang terpengaruh hanya oleh ptsd ( n = 8 ), mereka yang dipengaruhi oleh ptsd dan satu atau lebih dari MDD and GAD ( n = 15 ) , dan mereka tidak terpengaruh oleh salah satu dari tiga psychopathologies ( n = 53 ). Tes ANOVA menegaskan bahwa ada perbedaan 5
yang signifikan dalam tingkat metilasi ditiga kelompok pada gen 345 (p<0,01). Namun, hanya tiga gen menunjukan tingkat metilasi yang sangat berbeda, pada tingkat alpha ini antara mereka yang terkena hanya oleh ptsd dan orang-orang yang dipengaruhi ptsd dan gangguan lain menyatakan bahwa comorbicity itu tidak terlalu mempengaruhi hasil kami. PTSD didiagnosis dengan merujuk pada suatu peristiwa traumatis spesifik daripada beberapa kejadian potensial . Bagaimanapun juga, studi epidemiologi telah menunjukkan bahwa, di antara ekspos PTE , mayoritas individu terpapar peristiwa traumatik lebih dari satu kali (12, 13) dan bahwa pemaparan beberapa kali dapat berkorelasi dengan beratnya gejala(18). Untuk menyelidiki apakah efek kumulatif trauma berhubungan dengan profil metilasi khas di antara PTSD affected vs – unaffected, kami menilai korelasi antara jumlah PTE dan tingkat metilasi untuk setiap bagian CpG yang diwakili dalam HM27 microarray. Dibandingkan dengan orang yang tidak terkena dampak PTSD , orang yang terkena dampak PTSD menunjukkan hampir enam kali lebih banyak gen ( 176 vs. 30 ) dengan ( p < 0,01 ) korelasi negatif dari jumlah PTE yang dialami dan hampir tujuh kali lebih banyak gen ( 170 vs. 25 ) korelasi positif dari jumlah PTE yang dialami ( jangkauan dari koefisien korelasi Spearman) ρ:−0.698 to−0.526 and 0.527 to 0.736 diantara PTSD affected; and −0.460 to −0.295 and 0.292 to 0.389 diantara PTSD unaffected.. Hasil dari analisis FAC yang dilakukan pada empat set gen ini disajikan dalam tabel 2 . Di sini kami melihat sebuah tanda yang berbeda dari profil metilasi terkait imun di antara kelompok ptsd-affected saja . Lebih khusus , kami melihat profil metilasi yang sugestif dari aktivasi imun pada orang-orang dengan pemaparan PTE yang lebih dalam gen yang secara signifikan berkorelasi dengan peningkatan jumlah PTE, suatu pola refleksi dari gen unmethylated khas yang diobservasi dalam grup yang sama. Untuk menguatkan temuan terkait kekebalan ini dengan penanda fisiologis fungsi kekebalan tubuh independen, kami menilai kadar antibodi terhadap CMV. CMV adalah virus herpes persisten sangat lazim dalam populasi manusia (19). Infeksi CMV menyebabkan banyak perubahan yang berhubungan dengan penuaan pada sistem kekebalan tubuh (20), dan nilainya sebagai biomarker sentinel menunjukkan penekanan sistem kekebalan semakin jelas (21). Jika PTSD, seperti yang dihipotesiskan disini, adalah manifestasi fisiologis penghinaan traumatis yang menghasilkan perubahan epigenetik dan pola ekspresi gen berikutnya yang mengubah fungsi kekebalan tubuh, akan lebih masuk akal untuk mengharapkan perubahan dalam respon 6
kekebalan terhadap CMV diantara orang yang terkena dampak dibandingkan yang tidak terpengaruh oleh PTSD. Dalam studi ini, titer antibodi spesifik CMV, sebagaimana tercermin rasio kepadatan inoptical, antara individu terkena dampak dan tidak terpengaruh PTSD secara signifikan berbeda (mean rasio 3,37 dan 2,32, masing-masing, statistik t Welch = 2,48, 37 df, P = 0,016; Gambar. 3). Hasil ini menunjukkan bahwa PTSD berhubungan dengan reaktivitas penekanan imun terhadap CMV.
Diskusi Berdasarkan pada studi epidemiologi yang unik dan sedang berlangsung, kami telah mendokumentasikan tanda-tanda yang berbeda mencerminkan aktivasi kekebalan antara PTSD terkena dampak yang, menggunakan kedua penanda epigenetik dan penanda indikasi dari sistem yang dikompromikan respon kekebalan antibodi terhadap CMV. Meskipun awalnya, temuan di sini adalah konsisten dengan model dimana paparan PTE menyebabkan perubahan dalam profil metilasi di antara beberapa orang dan bahwa hasil perubahan perubahan dalam ekspresi gen terkait dengan fungsi kekebalan tubuh yang berubah, menunjukkan bahwa melalui perbedaan dalam respon kekebalan terhadap CMV. Epigenomic Fenotip Individu Terkena Dampak vs Yang Tidak Terkena Dampak PTSD.
7
Di antara banyak analisis yang dilakukan dalam pekerjaan ini, fungsi terkait imun yang ditemukan dalam kelompok yang terkena PTSD secara konsisten ditemukan hanya antara gen set dengan tingkat metil yang relatif lebih rendah (Tabel 1 dan 2). Demethylasi sebelumnya telah terbukti berkorelasi dengan peningkatan ekspresi di beberapa sistem kekebalan gen terkait (terakhir di ref. 22), termasuk beberapa diidentifikasi di sini [misalnya, IL8 (23)]. Sebaliknya, profil metil antara PTSD terpengaruh dibedakan oleh neurogenesis terkait penjelasan fungsional. Sel saraf progenitor sebelumnya telah diidentifikasi dalam hippocampus manusia dewasa (24), namun, stres dapat menghambat proliferasi sel dan neurogenesis di wilayah otak (ref terakhir di 25.), Dan karya terbaru menunjukkan bahwa neurogenesis dewasa dapat diatur dengan komponen sistem kekebalan tubuh (terakhir di ref. 26). Jadi, disfungsi kekebalan tubuh antara orang dengan PTSD mungkin dipengaruhi oleh profil epigenetik yang sugestif dari aktivasi kekebalan atau perangkat tambahan dan juga oleh tidak adanya profil epigenetik yang akan konsisten dengan perkembangan yang normal saraf-imun interaksi (27). Di antara gen unik yg mengandung metil pada kelompok PTSD terkena dampak, hal ini mengesankan bahwa kedua yang paling diperkaya cluster-sensori persepsi suara-langsung mencerminkan salah satu dari tiga kelompok gejala utama yang mendefinisikan gangguan (Gambar 3B). Gen dalam FACthatmay ini menjadi sangat penting untuk domain ini termasuk gejala otospiralin (OTOS), yang menunjukkan penurunan ekspresi di kelinci percobaan setelah stres akustik (28) dan (OTOF) otoferlin, mutasi yang telah dikaitkan dengan hilangnya pendengaran nonsyndromic pada manusia (29 ). Respon kejut yang berlebihan akustik, sering dipastikan melalui denyut jantung atau konduktansi kulit setelah terpapar nada, tiba-tiba keras, telah didokumentasikan dengan baik antara yang terkena PTSD (30) dan adalah indikasi dari keadaan hyperarousal yang mencirikan domain ini gejala. Terutama, studi prospektif telah menunjukkan bahwa respon kejut tinggi adalah konsekuensi dari memiliki PTSD, karena responsewas tidak hadir segera setelah terpapar trauma tapi kali developedwith antara korban trauma yang mengembangkan gangguan (30, 31). Meskipun pekerjaan yang lebih baru menunjukkan bahwa reaksi tersebut dapat dipengaruhi oleh hipersensitivitas sudah ada ancaman kontekstual (32), temuan ini umumnya konsisten dengan hipotesis kami bahwa paparan PTE dapat menyebabkan perubahan epigenetik yang menghasilkan perubahan fisiologis antara individu yang terkena dampak PTSD. 8
Penilaian Komorbiditas. Penemuan kami bahwa level metilasi tidak berbeda secara signifikan diantara orang-orang yang terkena dampak PTSD saja vs orang-orang yang terkena dampak PTSD serta gangguan mood-ansietas lainnya mendukung temuan epidemiologi sebelumnya. Penelitian berbasis populasi telah memperlihatkan bahwa setelah sesorang terpapar suatu peristiwa yang bersifat traumatis, meskipun ada prevalensi yang lebih tinggi untuk penyakit gangguan jiwa lainnya, PTSD adalah diagnosis yang mengikuti, jarang sebuah gangguan jiwa setelah suatu peristiwa traumatis tidak diikuti dengan diagnosis PTSD. Dari segi biologis, sangat sedikit gen memperlihatkan perbedaan nyata tingkat metilasi antara individu yang mengalami PTSD saja dibandingkan individu yang mengalami PTSD dengan gangguan komorbid lain, menunjukan suatu hipotesis biologis yang mendasari daripada PTSD itu sendiri (yaitu, Paparan PTE perubahan epigenetic perubahan ekspresi gen PTSD) terjadi pada semua orang dengan gangguan tersebut, tanpa memandang apakah mereka mempunyai gangguan jiwa lain pada axis I. sebuah penelitian di masa depan harus memverifikasi hasil temuan ini dengan cara yang lain, studi kohort independent menggunakan tambahan syarat-syarat komorbiditas.
9
Pemeliharaan Metilasi DNA dan Cetakan Gen. Pola metilasi DNA dibuat dan dipertahankan oleh DNA metil-transferase, sebuah enzim, yang pada mamalia, megkatalisis transfer grup metil ke residu cytosine secara predominan, tapi tidak secara eksklusif (34), pada tempat CpG dinukleotida (35). Mesin enzimatis ini menyusun pola metilasi dan mempertahankannya melalui pembagian sel somatic sepanjang umur hidp seseorang. Dalam konteks ini, patut dicatat bahwa sebuah gen yang mengkode salah satu dari enzim-enzim ini (DNMT3B) secara unik diunmethylated dan menunjukkan secara signifikan metilasi yang lebih sedikit (P<0,017) pada grup yang terkena dampak PTSD; dan bahwa sebuah gen lainnya yang berhubungan cukup dekat (DNMT3L) , secara signifikan lebih termetilasi (P=0,037) diantara orang dengan vs orang-orang tanpa PTSD. Meskipun sejumlah besar aktivitas gen-gen ini terjadi pada awal perkembangan (36), penelitian terbaru menyebutkan bahwa produk-produk enzimatiknya juga daapt berperan 10
pada pemeliharaan metilasi DNA selama pembelahan sel somatik (35). Hal ini memberi kesan bahwa “machinery” pokok yang bertanggung jawab membuat dan mempertahankan pola metilasi dapat berfungsi secara berbeda pada orang-orang dengan vs orang-orang tanpa PTSD, fenotip hilir dengan dimensi patofisiologis dan psikopatologis.
Demikian pula, cetakan gen-gen --- gen-gen yang dibungkam melalui mekanisme epigenetik pada awal perkembangan dalam mode yang berasal dari orang tua—seringkali berfungsi menjadi gen-gen rentan penyakit melalui delesi dan/atau inaktivasi loki yang normalnya mengikuti pola ekspresi monoallelik. Mungkin tidak mengejutkan lagi, banyak gen yang telah diketahui terlibat dalam penyakit “pencetakan”, contoh spesifiknya adalah PraederWilli syndrome (PWS) dan Angelmann syndrome (AS), muncul sebagai list gen yang termetilasi dan tidak termetilasi secara unik; yang menarik di sini, adalah pola metilasi kelihatannya mengikuti jejak fenotip PTSD dan fenotip yang dihubungkan dengan masing-masing kelainan tersebut. Dua gen, yaitu NDN dan MAGEL2, dilokalisasikan ke daerah delesi PWS dan secara normal diekspresikan dari alel paternal (37,38). NDN muncul pada list gen tak termetilasi pada orang-orang tanpa PTSD, yang mengesankan kemungkinan ekspresi yang tepat; MAGEL2, di sisi lain, muncul pada list gen termetilasi pada orang-orang dengan PTSD, yang memberi kesan 11
ekspresi yang berkurang, yang sama dengan apa yang terjadi pada PWS. ATP10A, gen yang memetakan region genomic umumnya di-delesi pada AS dan biasanya diekspresikan dari alel maternal (39), dan juga muncul pada list PTSD termetilasi, yang lagi-lagi memberi kesan ekspresi yang berkurang yang terjadi bersamaan dengan AS. Contoh – contoh ini memberi kesan bahwa profil metilasi dari cetakan gen memberi kontribusi pada fenotip terkait PTSD, dalam cara yang masih belum dapat terjelaskan secara penuh. Batasan Penelitian. Penelitian kami memiliki beberapa keterbatasan yang dapat membatasi pengeneralan hasil penelitian ini. Analisis cross-sectional yang dilaporkan di sini membuat kita tidak bisa menyimpulkan apakah profil metilasi khusus yang diobservasi dan level antibodi CMV merupakan konsekuensi/akibat dari PTSD atau apakah kedua hal tersebut mengindikasikan kerentanan biologis yang terdapat pada orang-orang yang terkena PTSD sebelum onset dari penyakit mereka . Ditambah lagi, dengan terbatasnya jumlah penderita PTSD yang dimasukkan dalam penelitian ini, kami tidak dapat menyimpulkan apakah profil metilasi khusus dapat muncul pada grup penderita PTSD yang dapat merefleksikan subtipe khusus dan/atau heterogenitas fenotipik dalam sindrom klinis ini, sebagaimana yang telah disebutkan sebelumnya (2, 40). Selain itu, data epigenetic kami dikumpulkan dari DNA yang berasal dari “whole blood”, yang mengandung campuran heterogenus dari berbagai tipe sel; sehingga kami tidak dapat menaksir perbedaan sel darah spesifik dalam status metilasi, yang seharusnya diperhitungkan ketika mereplikasi penemuan – penemuan terkini dari cohort longitudinal lain. Kesimpulan. PTSD adalah sebuah respon yang tidak biasa terhadap stress. Meskipun hampir 90% manusia mengalami kejadian traumatis selama kehidupannya (13), hanya sebagian kecil yang berkembang menjadi PTSD. Namun, penyakit ini merupakan psikopatologi yang cukup banyak serta melumpuhkan yang terjadi di Amerika Serikat : dengan prevalensi kejadian seumur hidup 6,8% dan prevalensi kejadian 12 bulan sebesar 3,5% (11), pelemahan peran fungsional yang disebabkan PTSD lebih buruk dibandingkan beberapa penyakit kronis yang umum terjadi (41). Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa penduduk Detroit menunjukkan prevalensi kejadian PTSD seumur hidup dan 12 bulan lebih besar dari 2 kali rata-rata nasional, hal ini mengesankan bahwa impairment tekait PTSD dapat terjadi secara disproporsional pada orangorang yang tinggal di lingkungan sosial perkotaan. Identifikasi pondasi biogis dari PTSD akan sangat penting untuk menfasilitasi pengembangan intervensi psikologis dan/atau farmakologis 12
yang tepat, terutama dengan meningkatnya jumlah veteran-veteran militer yang kembali setelah perang di berbagai penjuru dunia.
Metode dan Material Partisipan. Analisis kami menggunakan subset partisipan dari DNHS. Sample untuk penelitian ini terdiri dari 100 DNHS partisipan. 40 laki-laki dan 60 perempuan; 14% kulit putih, 79% Afrika Amerika, dan 7% dari ras lainnya; 14% berpendidikan kurang dari SMU, 86% sekurangkurangnya tamatan SMU; dan usia rata-rata adalah 45,8%. DNHS diakui oleh dewan peninjau institusional Universitas Michigan. Penilaian PTSD. Penilaian secara individual terhadap gejala PTSD dilaksanakan dengan menggunakan checklist PTSD (PCL-C) (42), penilaian 17-item self-report gejala DSM-IV (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorder) (13, 43), dan pertanyaan tambahan tentang durasi, waktu, dan impairment atau kecacatan yang disebabkan gejala-gejala yang terjadi. Partisipan awalnya diminta mengidentifikasi PTE yang dialaminya di masa lalu dari daftar 19 kejadian. Gejala PTSD kemudian dinilai dengan berdasarkan dua kejadian traumatis yang dialami responden : satu kejadian yang dianggap paling buruk oleh partisipan dan satu kejadian dipilih secara acak dari sisa PTE yang dialami responden. Responden dianggap terpengaruh PTSD seumur hidup bila seluruh 6 kriteria DSM IV ditemukan pada kejadian terburuk atau kejadian acak pada pasien. Semua individu dalam penelitian ini memiliki sekurangnya satu PTE; dari semuanya, 23 terpengaruh PTSD dan 77 tidak. Analisis Microarray. Konversi bisulfite dari seluruh sample DNA yang berasal dari whole blood dilakukan dengan menggunakan EZ-96 DNA methylation kit dari Zymo Research. Satu mikrogram dari tiap sample (termasuk kontrol) dilakukan konversi bisulfite sesuai dengan protokol yang direkomendasikan produsen EZ-96 DNA methylation kit. Kontrol penelitian termasuk replika dari 2 sample untuk menilai variasi selama proses penelitian (contoh: dari konversi bisulfite awal melalui analisis microarray), dan 1 sample DNA manusia unmethylated dan methylated, tersedia secara komersial melalui penelitian Zymo, pada masing-masing dari 13
sediaan 96 yang digunakan pada bisulfat. Seluruh kontrol yang bereplikasi diletakkan pada chip microarray yang terpisah, dan sampel sisanya diletakkan pada chip microarray secara acak, tanpa memperhitungkan status PTSD. Sampel DNA-terkonversi-bisulfat ditujukan untuk menunjukkan profil metilasi melalui analisis partikel DNA HM27 oleh illumine berdasarkan protocol yang disarankan pabrik. Menggunakan pedoman ini, level metilasi ditentukan untuk dinukleotida 27578 CpG yang menjabarkan 14495 gen pada masing-masing dari 100 sampel test. Data hasilnya dinormalisasikan pada latar belakang dan dipindahkan untuk analisis tambahan menggunakan paket R v 2.9.0 (440 dan software SAS v 9.2 (45). Koefisien korelasi dari dua sampel yang direplikasi adalah 0.81 dan 0.89, secara berurutan. Nilai rata-rata beta untuk control termetilasi adalah 0.17 dan 0.98, secara berurutan. Analisis inisial difokuskan pada identifikasi gen yang berkaitan dengan peneltian (site CpG) yang secara khusus bermetilasi atau tidak bermetilasi diantara individu yang-terpengaruh PTSD dan yang tidak terpengaruh PTSD. Kami menghitung nilai beta rata-rata dari sampel pada kedua kelompok (terpengaruh PTSD dan yang tidak terpengaruh PTSD) dan mengklasifikasikan penelitian nilai beta rata-rata <0.2 sebagai yang tidak termetilasi dan penelitian dengan nilai beta rata-rata <0.8 sebagai termetilasi. Setiap penelitian diidentifikasi sebagai termetilasi secara unik dan tidak termetilasi secara unik. Jika itu termetilasi – atau tak termetilasi – pada satu kelompok. Karena sangat mugkin bahwa gen berasosiasi dengan lebih dari satu penelitian ada BeadChip HM27, kami membuat dua sub bagian data yang terdiri dari hanya (i) penelitian termetilasi pada salah satu dari kelompok yang terpengaruh PTSD dan tidak terpengaruh, dan (ii) penelitian tidak termetilasi dari kelompok yang terpengaruh PTSD ataupun yang tidak terpengaruh. Kemudian, untuk masing-masing sub bagian kami menyingkirkan catatan yang terduplikasi berdasarkan symbol gen dan status metilasi pada masing-masing grup. Dengan cara ini, gen dengan 2 penelitian atau lebih yang menunjukkan hasil yang serupa ( pada kedua penelitian yang termetilasi secara khusus pada kelompok yang terpengaruh PTSD) tidak dihitung dua kali. Sebaliknya, gen dengan dua atau lebih penelitian yang menunjukkan hasil yang berbeda (misalnya satu penelitian berupa termetilasi secara unik pada kelompok yang terpengaruh PTSD, sedangkan penelitian lain termetilasi secara khusus pada kelompok yang tidak terpengaruh PTSD) dihitung dua kali atau lebih; masing-masing hasil kemudian akan diperhitungkan. Proporsi dari gen yang termetilasi secara unik dan tidak termetilasi diantara individu yang 14
terpengaruh PTSD vs yang tidak terpengaruh dibandingkan dengan menggunakan tes McNemar’s χ2. Analisis diferensial metilasi antara kelompok yang terpengaruh PTSD dan yang tidak terpengaruh dilakukan pada masing – masing penelitian menggunakan tes Wilcoxon. Kami mengidentifikasi sebuah penelitian sebagai penelitin yang termetilasi diferensial secara signifikan jika P < 0.01. analisis ini dikembangkan untuk menentukan metilasi diferensial diantara partisipan tanpa psikopatologi, merek yang hanya terpengaruh PTSD, dan mereka yang terpengaruh PTSD dan terpengaruh oleh salah satu atau lebih dari MDD dan GAD; untuk analisis ini, ANOVA dilakukan sebagai permulaan dandilanjutkan oleh test Tukey perbedaan signifikan, sebuah tes perbandingan berpasangan post-hoc. Untuk menilai hubungan antara jumlah PTE yang dialami dan level metilasi dari masingmasing probe diantara individu yang terkena dampak PTSD vs individu yang tidak terkena dampak, kami menstratifikasi berdasarkan status PTSD dan menganalisis hubungan antara jumlah PTE seumur hidup dan level metilasi dari tiap probe, terpisah untuk tiap grup (yang terkena dampak PTSD dan yang idak terkena dampak PTSD). Spearman’s rho dihitung untuk tiap prbe, dan hasilny dianggap signifikan bila P<0,01. Probe HM27 yang dianalisa sebagaimana diterangkan di atas, ditugaskan untuk gen yang didasarkan pada file catatan yang tersedia dari Illumina pada 20 Mei 2009. Gen-gen yang diidentifikasi melalui analisa di atas dinilai untuk signifikansi fungsionalnya menggunakan Database untuk Catatan, Visualisasi dan Penemuan Terintegrasi (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery = DAVID) (46, 47). Hasil diperoleh dengan alat FAC dengan pilihan untuk menyetel nilai dasar menggunakan anotasi yang tersedia di DAVID pada bulan juni-agustus 2009. Prosedur Eksperimental: Analisis CMV. Tingkat antibody
CMV dites menggunakan
peralatan ELISA komersial untuk mendeteksi antibody IgG tipe spesifik dalam serum ( Inverness Medical Innovations; 425200CE ). Sampel serum dilarutkan dalam buffer sebelum dipipet dan diduplikasikan ke cairan mikrotiter bersalut-antigen. Melalui beberapa seri langkah pencucian dan inkubasi, antibody CMV pada sampel diletakkan pada piring mikrotiter dan dihubungkan dengan antibody reaktif sekunder. Penyerapan dihitung dengan pembaca 15
microplate yang disetel pada 450nm. Konsentrasi dihitung dengan kepadatan optikal (positif ≥1.10, equivocal 0.91-1.09, negative ≤0.9). level antibody diekspresikan dengan istilah rasio rata-rata kepadatan optikal. Peralatan The Inverness Medical menunjukkan spesifik sebesar 93.9% dan sensitivitas 96.4% ketika dibandingkan dengan CMV yang lain dengan prosedur CMV IgG ELISA lainnya. Pada tes yang dilakukan untuk membandingkan rasio kepadatan optikal (optical density / OD ) antara kedua kelompok. Analisis Ekspresi Gen. Data yang dapat diakses public mengenai ekspresi gen didapat dari National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus (GEO) database. tingkat ekspresi gen dari darah lengkap dari 40 sampel yang didapat dari analisis dari dataset berikut: GDS2952, GDS2519 (48), GDS1331 (49), and GDS596 (50). Semua sampel didapat dri individu control yang sehat pada dataset ini. Penelitian termetilasi dan tidak termetilasi didapat dari data kami yang dipresentasikan dengan warna hijau di gambar 1. Data RefSeqs of the GEO data didapat dari pusat analisis Affymetrix NetAffx pada 27 juli 2009, dan kemudian dicocokkan dengan RefSeqs (accession) pada data illumina untuk tambahan analisis. Nilai ekspresi gen mentah pada penelitian yang umumnya termetilasi dan tidak termetilasi ditransformasikan dan dinormalisasikan dengan pemusatan median. Nilai ini kemudian dirata-ratakan untuk masing – masing penelitian, dan tes t dilakukan untuk membandingkan tingkat ekspresi rata-rata antara kedua kelompok ini.
16
