Prof. Dr. Ir. H. M. Rachimoellah, Dipl. Est NIP

SKRIPSI– TK141581 EKSTRAKSI SENYAWA BIOAKTIF DARI RIMPANG CURCUMA MANGGA MENGGUNAKAN PELARUT RAMAH LINGKUNGAN NATURAL DEEP EUTECTIC SOLVENT (NADES) Oleh : Nurhasanah NRP. 2314 106 019 Umra Misli Saktia NRP. 2314 106 020 Dosen Pembimbing : Orchidea Rachmaniah, S.T., M.T NIP. 1978 02 14 2003 12 2001 Prof. Dr. Ir. H. M. Rachimoellah, Dipl. Est NIP. 1949 11 17 1976 12 1001 DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2017

FINAL PROJECT– TK141581 EXTRACTION OF CURCUMA MANGGA’S BIOACTIVE COMPOUNDS USING NATURAL DEEP EUTECTIC SOLVENT (NADES) AS A GREEN SOLVENT Students Name : Nurhasanah NRP. 2314 106 019 Umra Misli Saktia NRP. 2314 106 020 Advisors : Orchidea Rachmaniah, S.T., M.T NIP. 1978 02 14 2003 12 2001 Prof. Dr. Ir. H. M. Rachimoellah, Dipl. Est NIP. 1949 11 17 1976 12 1001 CHEMICAL ENGINEERING DEPARTMENT FACULTY OF INDUSTRIAL TECHNOLOGY SEPULUH NOPEMBER INSTITUTE OF TECHNOLOGY SURABAYA 2017

EKSTRAKSI SENYAWA BIOAKTIF DARI RIMPANG CURCUMA MANGGA MENGGUNAKAN PELARUT RAMAH LINGKUNGAN NATURAL DEEP EUTECTIC SOLVENT (NADES) Nama / NRP : 1. Nurhasanah (2314106019) 2. Umra Misli Saktia (2314106020) Jurusan : Teknik Kimia FTI-ITS Pembimbing : 1. Orchidea Rachmaniah, S.T., M.T 2. Prof. Dr. Ir. H. M. Rachimoellah, Dipl.Est ABSTRAK Curcuma mangga atau yang lebih dikenal sebagai kunir putih telah diketahui mengandung senyawa-senyawa bioaktif antikanker berupa curcuminoid (curcumin (C), demethoxycurcumin (DMC) dan bisdemethoxycurcumin (BDMC)). Secara umum, senyawa bioaktif tersebut diektraksi menggunakan pelarut organik seperti etanol, metanol, heksana, ataupun secara steam distillation menggunakan uap air. Dalam penelitian ini digunakan green solvent yaitu Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) sebagai pengganti pelarut-pelarut organik. Penelitian ini bertujuan untuk memanfaatkan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) sebagai pelarut dalam ekstraksi senyawa-senyawa bioaktif berupa curcuminoid terutama curcumin dari Curcuma mangga serta mendapatkan perolehan yield senyawa bioaktif tersebut dan membandingkannya dengan metode konvensional, ekstraksi soxhlet dan maserasi dengan etanol sebagai pelarut. Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) jenis netral, asam, dan basa dipilih sebagai pelarut dalam proses ekstraksi

ii

senyawa bioaktif dari Curcuma mangga. Ekstraksi senyawa bioaktif menggunakan NADES dilakukan dengan menambahkan serbuk Curcuma mangga 2±0,1 mg ke dalam 2,00±0,1 g NADES dan diaduk pada suhu 40 oC dalam 5 mL botol sampel amberlite tertutup. Pengadukan dilakukan selama 1x24 jam. Ekstraksi Soxhlet dan maserasi menggunakan etanol adalah metode ekstraksi konvensional pembanding yang dipilih untuk mengetahui efektifitas penggunaan pelarut alternatif, NADES, guna ekstraksi senyawa bioaktif dari Curcuma mangga. Metode Analisa yang digunakan yaitu analisa kualitatif secara Thin Layer Chromatography (TLC) dan analisa kuantitatif secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Hasil analisa menunjukkan bahwa ekstraksi dengan NADES, FS-H2O (2:1:32), dapat mengambil ekstrak curcuminoid lebih baik dibandingkan dengan etanol (96%) dan air. Perolehan yield curcuminoid pada ekstraksi dengan NADES (FS-H2O = 2:1:32) sebagai pelarut dapat mengekstraksi curcuminoid lebih banyak dibandingkan etanol (96%) baik secara ekstraksi-soxhlet ataupun maserasi; FS-H2O (2:1:32) memberikan selektifitas curcumin yang lebih tinggi (98%-berat) dibandingkan etanol (96%); yang mana etanol hanya mampu mengektrak 60-61% curcumin, 22-23% DMC, dan sisanya BDMC. Sedangkan BDMC dan DMC kurang selektif terekstrak pada penggunaan FS-H2O (2:1:32) sebagai pelarut. Kata kunci : curcumin, DMC, BDMC, kunir putih, green solvent

iii

EXTRACTION OF CURCUMA MANGGA’S BIOACTIVE COMPOUNDS USING NATURAL DEEP EUTECTIC SOLVENT (NADES) AS A GREEN SOLVENT Name / NRP Department Advisor

: 1. Nurhasanah (2314106019) 2. Umra Misli Saktia (2314106020) : Teknik Kimia FTI-ITS : 1. Orchidea Rachmaniah, S.T., M.T 2. Prof. Dr. Ir. M. Rachimoellah, Dipl.Est ABSTRACT

Curcuma mangga or more popular as white turmeric has been known to contain anticancer bioactive compounds such as kurkuminoid (curcumin (C), demetoxycurcumin (DMC) and bisdemetoxycurcumin (BDMC)). Generally, these bioactive compounds extracted using organic solvents such as ethanol, methanol, hexane, or by steam distillation using water vapor. This study used a green solvent that is Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) as solvent substitute for organic solvents. This research aims to uses Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) as a solvent in the extraction of bioactive compounds such as curcuminoid especially curcumin from Curcuma mangga and gets the yield of bioactive compounds mentioned and compare with the conventional method, soxhlet extraction and maceration with ethanol as a solvent. Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) type of neutral, acid and alkali that are chosen as a solvent in the extraction process of bioactive compounds from Curcuma mangga. Extraction of bioactive compounds using NADES done by adding powdered Curcuma mangga 2±0.1 mg in 2.00±0.1 g NADES and stirred at a temperature of 40 °C in 5 mL sample bottle Amberlite closed. Stirring is done for 1x24 hours. Soxhlet extraction and

iv

maceration using ethanol is a comparison of conventional extraction methods that are chosen to determine the effectiveness of the use of alternative solvents, NADES, to the extraction of bioactive compounds from Curcuma mangga. The analysis method used is qualitative analysis by Thin Layer Chromatography (TLC) and quantitative analysis High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The analysis shows that the extraction with NADES, FSH2O (2:1:32), can be extracted curcuminoid better than ethanol (96%) and water. Result yield curcuminoid on extraction with NADES (FS-H2O = 2:1:32) as the solvent can extract curcuminoid more than ethanol (96%), either soxhlet extraction or maceration; FS-H2O (2:1:32) giving curcumin higher selectivity (98%-weight) than ethanol (96%); where ethanol is only able extracted 60-61% curcumin, 22-23% DMC, and remaining BDMC. While BDMC and DMC less selectively extracted on the use of FS-H2O (2: 1: 32) as the solvent. Keywords: curcumin, DMC, BDMC, white turmeric, green solvent

v

KATA PENGANTAR Alhamdulillah puji syukur penyusun panjatkan kepada Allah SWT yang telah melipahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penyusun dapat menyelesaikan laporan skripsi yang berjudul ”Ekstraksi Senyawa Bioaktif Dari Rimpang Curcuma Mangga Menggunakan Pelarut Ramah Lingkungan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES)” Laporan skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan studi program S-1 di Jurusan Teknik Kimia, FTI - ITS. Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan laporan skripsi ini dapat selesai atas bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini kami ingin mengucapkan kasih kepada : 1. Orang tua dan seluruh keluarga yang telah memberikan doa dan dukungan kepada penyusun. 2. Bapak Juwari, S.T., M.Eng., Ph.D, selaku Kepala Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS. 3. Ibu Orchidea Rachmania, S.T., M.T dan Bapak Prof. Dr. Ir. M. Rachimoellah, Dipl. Est selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan saran dan masukan. 4. Ibu Dr. Lailatul Qadariyah, S.T., M.T, selaku koordinator Tugas Akhir dan Skripsi Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS. 5. Bapak dan Ibu Dosen Pengajar serta seluruh karyawan Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS. 6. Teman-teman di Laboratorium Biomassa dan Konversi Energi, serta para teman-teman LJ Genap 2014 yang telah memberikan saran dan motivasi. Penyusun menyadari bahwa laporan ini masih berada jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penyusun mengharapkan adanya kritik dan saran yang bersifat konstruktif dari semua pihak bagi kesempurnaan laporan ini. Surabaya, 23 Januari 2017 Penyusun

vi

DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL LEMBAR PENGESAHAN ....................................................... i ABSTRAK ................................................................................ ii ABSTRACT .............................................................................. iv KATA PENGANTAR............................................................... vi DAFTAR ISI ............................................................................. vii DAFTAR GAMBAR ................................................................ x DAFTAR TABEL ..................................................................... xiii BAB I PENDAHULUAN ..................................................... 1 I.1 Latar Belakang...................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ................................................ 4 1.3 Tujuan .................................................................. 6 1.4 Manfaat ................................................................ 6 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................ 7 II.1 Kunyit/ Kunir Putih (Curcuma Mangga) ............ 7 II.2 Curcuminoid ........................................................ 9 II.3 Ekstraksi .............................................................. 10 II.4 Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) ........... 12 II.5 Metode Analisa Curcuminoid ............................ 14 II.5.1 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) .................................................. 14 II.5.2 Thin Layer Chromatography (TLC) ..... 18 II.6 Studi Hasil Penelitian Sebelumnya ................... 20 BAB III METODE PENELITIAN.......................................... 23 III.1 Bahan-bahan yang digunakan ............................ 23 III.2 Alat-alat yang digunakan ................................... 23 III.3 Variabel Penelitian ............................................. 23 III.3.1 Variabel Tetap pada Ekstraksi menggunakan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) ............................. 23

vii

III.3.2 Variabel Bebas pada Ekstraksi menggunakan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) ............................. 23 III.3.3 Variabel Respon................................... 24 III.4 Metode Penelitian ............................................ 24 III.4.1 Pembuatan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) ........................................... 24 III.4.2 Ekstraksi Senyawa Bioaktif menggunakan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) ............................................ 26 III.4.3 Ekstraksi Senyawa Bioaktif dengan Soxhlet dan Maserasi .......................... 27 III.4.4 Analisa Kuantitatif secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ............................................. 30 III.4.5 Analisa Kualitatif secara Thin Layer Chromatography (TLC) ..................... 30 III.5 Diagram Alir Metode Penelitian ..................... 32 III.5.1 Diagram Alir Penelitian secara Keseluruhan ........................................ 32 III.5.2 Diagram Alir Pembuatan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) ................ 33 III.5.3 Diagram Alir Ekstraksi Senyawa Bioaktif menggunakan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) .............................. 34 III.5.4 Diagram Alir Ekstraksi Senyawa Bioaktif secara Konvensional ......................... 35 III.5.5 Metode Analisa .................................... 37 III.5.5.1 Analisa Kuantitatif secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ......... 37 III.5.5.2 Analisa Kualitatif secara Thin Layer Chromatoghraphy (TLC) ......... 38

viii

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................... 41 IV.1 Pembuatan dan Kestabilan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) .......................................... 41 IV.2 Ekstraksi Curcuma mangga dengan Soxhlet dan Maserasi ........................................................... 48 IV.3 Ekstraksi Curcuma mangga dengan Natural Deep Eutectic Solvents NADES ...................... 50 IV.3.1 Kalibrasi Curcuminoids menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) .................. 50 IV.3.2 Ekstraksi Curcuma mangga menggunakan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) ........................................... 55 IV.4 Sifat-sifat Fisik Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) ......................................................... 64 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................... 67 V.1 Kesimpulan ....................................................... 67 V.2 Saran ................................................................. 67 DAFTAR PUSTAKA................................................................ xiv LAMPIRAN

ix

DAFTAR GAMBAR Gambar II.1 Gambar III.1

Gambar III.2 Gambar III.3 Gambar III.4 Gambar IV.1 Gambar IV.2 Gambar IV.3 Gambar IV.4

Gambar IV.5 Gambar IV.6

Gambar IV.7 Gambar IV.8

Gambar IV.9

Gambar IV.10

Struktur Curcuminoid ................................... 9 Skema Pembuatan NADES dengan Menggunakan Metode Pemanasan Kombinasi freeze-dry ...................................................... 25 Skema Ekstraksi Senyawa Bioaktif dari Curcuma Mangga Menggunakan NADES ... 26 Skema Ekstraksi Soxhlet ............................... 28 Skema Ekstraksi Maserasi............................. 29 FS- H2O (2:1:19 dan 2:1:11) Tidak Stabil .... 41 FG-H2O (1:1:4) ............................................. 42 NADES yang dihasilkan FS-H2O (2:1:32) dan FG- H2O (1:1:10) .......................................... 42 Kombinasi BG-H2O (5:2:5) dan BS-H2O (1:1:6) tidak terbentuk NADES (terbentuk kristal maupun terbentuk endapan) ............... 43 Perubahan Warna CAS-H2O dan MAS-H2O 45 FTIR Spektra MAS- H2O jernih/tidak berubah warna (a); MAS- H2O yang berubah warna (b); sukrosa padat (c); dan malic acid padat (d) .. 47 FTIR Spektra CAS-H2O berubah warna (a); sukrosa padat (b); dan citric acid padat ........ 47 Kromatogram Curcumnioid standard pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography) pada konsentrasi curcuminoid 25,7 ppm (BDMC=0,785 ppm; DMC=4,750 ppm dan C=20,166 ppm) ......... 50 Spektrum dari atas ke bawah: Bisdemethoxycurcumin (BDMC), Demethoxycurcumin (DMC) dan Curcumin (C) ................................................ 51 Kurva Kalibrasi Bisdemethoxycurcumin (BDMC) ........................................................ 52

x

Gambar IV.11 Gambar IV.12 Gambar IV.13

Gambar IV.14

Gambar IV.15

Gambar IV.16

Gambar IV.17

Kurva Kalibrasi Demethoxycurcumin (DMC) ........................................................... 53 Kurva Kalibrasi Curcumin (C) ...................... 53 Kromatogram Curcuminoid standar pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography) pada konsentrasi curcuminoid 0,028 ppm (BDMC=0,001 ppm; DMC = 0,005 ppm dan C= 0,022 ppm) .............................................. 54 Kromatogram Curcuminoid standar pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography) pada konsentrasi curcuminoid 0,0102 ppm (BDMC=0,0003 ppm; DMC = 0,002 ppm dan C= 0,008 ppm) .............................................. 54 Bentuk curcumin pada berbagai pH: berbentuk terprotonisasi pada lingkungan asam (pH<1); berbentuk netral pada pH 1-7; dan berbentuk deprotonisasi pada pH>7,5 (Salem et al., 2014; Fagundes et al., 2015) ................................... 60 Penampakan lempeng Thin Layer Chromatography (TLC): (1) disemprot menggunakan 20% H2SO4 dalam etanol (v/v); (2) penampakan bercak pada 365 nm. Legenda: S = standar curcuminoids, E = ekstrak etanol, dan A= ekstrak air. Ekstraksi dilakukan menggunakan 5 mg serbuk Curcuma mangga/ 2 gr pelarut, 1x24 jam, 40oC, sampel yang ditotolkan ± 50μL ......................................... 62 Penampakan lempeng Thin Layer Chromatography (TLC): (1) disemprot menggunakan 20% H2SO4 dalam etanol (v/v); (2) penampakan bercak pada 365 nm; (3) penampakan bercak pada 254 nm. Legenda: S = standar curcuminois M = ekstrak MAS-H2O (1:1:11), dan C= ekstrak CAS-H2O (1:2:16). Ekstraksi dilakukan menggunakan 5 mg serbuk

xi

Gambar IV.18

Curcuma mangga/ 2 gr pelarut, 1x24 jam, 40oC, sampel yang ditotolkan ± 50μL ................... 63 Penampakan lempeng Thin Layer Chromatography (TLC): (1) setelah dilakukan penyemprotan bercak dengan 20% H2SO4 dalam etanol (v/v). Legenda: S = standar curcuminoids, F1 = ekstrak FS-H2O 1x24 jam, F2 = ekstrak FS-H2O 2x24 jam, F3 = ekstrak FS-H2O 3x24 jam, F4 = ekstrak FS-H2O 4x24 jam. Ekstraksi dilakukan menggunakan 5 mg serbuk Curcuma mangga/ 2 gr pelarut, 1x24 jam, 40oC, sampel yang ditotolkan ± 50μL ... 63

xii

DAFTAR TABEL Tabel II.1 Spesifikasi Kunyit/ Kunir Putih (Curcuma Mangga) (Hutapea, 1993) ....................................... 8 Tabel II.2 Nama Kimia dan Berat Molekul dari Curcuminoid (Pushpakumari et al., 2014) ................................... 10 Tabel II.3 Daftar Natural ILs dan DES (Choi et al., 2011)..... 13 Tabel II.4 Beberapa Metode Analisa Curcuminoid secara HPLC ..................................................................... 16 Tabel II.5 Beberapa Metode Analisa Curcuminoid secara TLCmenggunakan silica plate sebagai fase diam ... 19 Tabel IV.1 NADES yang digunakan dalam penelitian ini ........ 45 Tabel IV.2 Yield Curcuminoid (mg/g) yang diekstrak Menggunakan Metode Konvensional ...................... 49 Tabel IV.3Hasil Ekstraksi Curcuma mangga dengan NADES . 56 Tabel IV.4 LOD dan LOQ pada kondisi analisa HPLC ............ 57 Tabel IV.5 Yield Curcuminoid (mg/g) pada Berbagai Metode Ekstraksi .................................................................. 59 Tabel IV.6 Pengukuran pH NADES ......................................... 61 Tabel IV.7 Densitas NADES..................................................... 65

xiii

BAB I PENDAHULUAN I.1

Latar Belakang Saat ini, kanker telah menjadi masalah kesehatan yang signifikan di dunia. Kanker menduduki peringkat kedua penyebab kematian di dunia setelah penyakit jantung (tahun 2000-2010) dan terus akan meningkat dan menduduki peringkat pertama penyebab kematian di tahun 2030 (Atun et al., 2013). Phytochemical merupakan senyawa-senyawa bioaktif yang salah satu manfaatnya adalah mencegah dan/atau melindungi tanaman dari penyakit/hama ataupun serangga. Senyawa bioaktif yang dihasilkan tanaman tidak hanya berguna untuk melindungi diri mereka sendiri tetapi juga diindikasikan berpotensi sebagai senyawa obat bagi manusia. Telah banyak penelitian yang dilakukan terhadap senyawa-senyawa bioaktif yang berasal dari tanaman terutama tentang pemanfaatannya sebagai senyawa aktif obat untuk manusia, khususnya penyakit jantung dan kanker, dua penyakit penyebab kematian tertinggi di dunia. Salah satu senyawa bioaktif yang berpotensi sebagai obat anti kanker yaitu curcumin (Pushpakumari et al., 2014). Curcumin telah memasuki uji klinis ilmiah di fase I dan fase II hanya dalam 10-15 tahun terakhir. Di samping efek antikanker, curcumin telah dilaporkan memiliki efek menguntungkan pada alergi, asma, penyakit jantung dan diabetes. Efek tersebut mungkin disebabkan kemampuannya untuk memodulasi sistem kekebalan tubuh. Walaupun penyerapan curcumin dalam tubuh setelah dikonsumsi rendah, beberapa penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi fisiologis dari curcumin cukup untuk kemopreventif dan aktivitas kemoterapi. Dengan demikian, curcumin memiliki beberapa manfaat (terapi multitargeted) yang diperlukan untuk pengobatan penyakit. Curcumin dikenal murah dan aman dalam uji klinis pada manusia. Meskipun khasiat dan keamanannya baik, saat ini curcumin belum disetujui sebagai agen terapeutik. Kesenjangan antara tingginya studi pra-klinis 1

dengan keterbatasan penggunaannya secara klinis disebabkan oleh rendahnya kelarutan curcumin dalam air serta rendahnya bioavailabilitas curcumin itu sendiri sehingga menyebabkan banyak ketidakpastian dalam efek terapeutik (Bar-Sela G et al., 2010). Curcumin telah dilaporkan aman dikonsumsi hingga dosis 12 gram/hari. Namun, karena curcumin mengalami metabolisme yang cepat dalam tubuh sehingga bioavailabilitasnya rendah. Curcumin yang telah dikonsumsi dalam jumlah banyak hanya sedikit terdeteksi dalam tubuh sebagaimana dilaporkan oleh Salem et al. (2014). Total curcumin yang dikonsumsi (3,6 gram/hari) hanya terdeteksi dalam jumlah nanomolar pada 1 jam dihari pertama, hari kedua, kedelapan, dan keduapuluh sembilan. Curcumin adalah suatu curcuminoid yang diketahui terdapat dalam Curcuma. Curcuma mangga atau yang lebih dikenal sebagai kunir putih telah diketahui mengandung senyawasenyawa bioaktif antikanker berupa curcuminoid (curcumin (C), demethoxycurcumin (DMC) dan bisdemethoxycurcumin (BDMC)), polisakarida, caretonoid, ataupun minyak-minyak essensial (Fagundes et al., 2015). Secara umum, senyawa bioaktif tersebut diektraksi menggunakan pelarut organik seperti etanol, metanol, heksana, ataupun secara steam distillation menggunakan uap air. Ekstraksi adalah salah satu proses kimia yang tidak ramah lingkungan karena melibatkan senyawa organik yaitu solvent/zat pelarut itu sendiri. Oleh sebab itu, upaya untuk meminimalkan, mengganti atau bahkan menghilangkan penggunaan pelarut organik yang mudah menguap (Volatile Organic Carbon, VOC) dalam proses ekstraksi terus dikembangkan. Upaya ini harus mengarah pada penghematan biaya baik untuk pembuangan limbah dan pemanfaatan energi. Penggunaan senyawa kimia dalam proses ekstraksi senyawa-senyawa obat akan memperbesar resiko terdapatnya residu senyawa kimia di dalam ekstrak kasar obat-obatan yang diperoleh. Resiko lebih lanjut, terdepositnya senyawa kimia tersebut didalam tubuh jika dikonsumsi dalam 2

jangka waktu tertentu. Oleh sebab itu, perlu digunakan pelarut ramah lingkungan yang aman bagi kesehatan dan kebersihan lingkungan pada proses ekstraksi senyawa-senyawa obat. Pelarut eutektik (Deep Eutectic Solvent, DES) serta cairan ionik (Ionic Liquids, ILs) adalah dua kandidat green solvent yang banyak diteliti di samping cairan superkritis (Supercritical Fluids, SCF). Namun, ILs menghadapi beberapa tantangan untuk aplikasi dalam skala besar seperti berbiaya produksi tinggi, masalah toksisitas, stabilitas jangka panjang yang belum sepenuhnya diketahui, dan viskositas ILs yang relatif tinggi. Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) merupakan bagian dari DES yang ramah lingkungan dan dibuat dari senyawa-senyawa metabolit primer yang alami dan aman seperti asam-asam amino, monosakarida, disakarida, polisakarida, asam asetat, asam laktat, kolin klorida dll dengan perbandingan mol ratio tertentu. Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) akan digunakan sebagai pelarut pengganti pelarut-pelarut organik yang selama ini digunakan dalam penelitian ini mengingat keunggulannya yang terbuat dari bahan-bahan alam yang ramah lingkungan. Selain itu Dai et al. (2013) menunjukkan kesesuaian NADES seperti proline-malic acid (PMA), sucrose-choline chloride (SCC), glucose-choline chloride (GCC), sorbitol-choline chloride (SoCC), 1,2-propanediol-choline chloride (PCC), fructose-glucose-sucrose (FGS), dan lactic acid-glucose (LAG) untuk ekstraksi senyawa-senyawa fenolat seperti cartormin dan carthamin dari safflower (Flos Carthami) dan corolla dari Carthamus tinctorius L. Hasil ekstraksi menunjukkan kelarutan cartormin dan carthamin yang tinggi di dalam NADES: Sucrosecholine chloride (SCC), PMA, dan LAG. Kelarutan senyawa fenolat yang tinggi di dalam NADES juga diikuti oleh senyawasenyawa lain: rutin, quercetin, asam sinamat, carthamin, taxol, dan ginkgolide B dalam NADES (Dai et al, 2013). Bervariasinya senyawa-senyawa bioaktif yang dapat larut dalam NADES, baik makromolekul maupun mikromolekul, menunjukkan besarnya potensi yang dimiliki NADES sebagai pelarut-multi komponen 3

baik senyawa-senyawa nonpolar hingga polar. Namun, masih diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai aplikasi dari NADES sebagai pelarut ekstraksi yang ramah lingkungan terhadap senyawa-senyawa bioaktif yang lainnya. Menimbang keunggulan yang dimiliki NADES tersebut di atas dan pentingnya penggunaan ekstrak senyawa obat yang bebas dari residu kimia, berbagai tipe NADES (netral, asam, dan basa) akan digunakan sebagai pelarut dalam mengekstraksi senyawa bioaktif dari Curcuma mangga. Diharapkan, dengan tingginya kemampuan NADES untuk melarutkan senyawasenyawa non polar dan polar tersebut akan meningkatkan kelarutan curcumin di dalam air sehingga kesenjangan antara kebutuhan dan supply curcumin dipasaran untuk uji klinis dapat terpenuhi. Selain tipe NADES, pengaruh kandungan air dalam NADES terhadap perolehan yield curcumin juga turut di teliti dalam penelitian ini. I.2

Rumusan Masalah Penggunaan senyawa-senyawa organik sebagai zat pelarut dalam proses ekstraksi membahayakan keamanan dan kesehatan lingkungan. Oleh sebab itu, perlu dilakukan upayaupaya untuk meminimalkan, mengganti atau bahkan menghilangkan penggunaan pelarut organik yang mudah menguap (Volatile Organic Carbon, VOC) tsb. Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) sebagai salah satu kandidat green solvent dipilih sebagai pelarut alternatif dalam ekstraksi senyawasenyawa bioaktif dalam penelitian ini. NADES terdiri dari campuran senyawa-senyawa metabolit primer seperti gula, gula alkohol, poli-alkohol, basa organik, asam organik, dan asam amino dalam kombinasi molar ratio tertentu yang diyakini aman bagi manusia dan lingkungan. Mengingat senyawa-senyawa metabolit primer merupakan senyawa alami yang ditemukan di semua tanaman, misalnya asam amino, karbohidrat, lipid, lemak, protein, asam nukleat, asam organik dan basa, tersedia dalam skala besar dan berbiaya rendah. Sehingga NADES 4

biodegradable, biokompatibel, lebih mudah dan murah dalam hal pembuangan limbah proses yang dihasilkan. Curcuma mangga atau kunir putih telah dikenal secara luas mengandung senyawa bioaktif antikanker (Anand et al., 2007; Bar-Sela et al., 2010; Salem et al., 2014) yang potensial untuk dikembangkan. Dalam hal pengembangan obat, langkah pertama yaitu metode ekstraksi dan isolasi natural products (NP) adalah sangat penting. Oleh sebab itu, penting untuk mengembangkan metode ekstraksi yang dapat memenuhi semua persyaratan seperti keamanan, yield, dan selektivitas untuk NP target. Penggunaan, green solvent, NADES sebagai pelarut alternatif pengganti metanol ataupun etanol yang selama ini banyak digunakan pada ekstraksi Curcuma mangga diharapkan akan menghasilkan yield, selektifitas, dan efisiensi ekstraksi yang comparable. Sehingga kombinasi zat antikanker yang potensial disertai proses ekstraksi ramah lingkungan tanpa residu bahan kimia akan mampu meningkatkan efektifitas zat antikaker senyawa-senyawa bioaktif tsb. Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) jenis netral, asam, dan basa dipilih sebagai pelarut dalam proses ekstraksi senyawa bioaktif dari Curcuma mangga mengingat curcumin memiliki kelarutan yang berbeda, tergantung pH pelarutnya (pH 3-9) (Salem et al., 2014). Selain itu matriks tanaman, rimpang serbuk Curcuma mangga, donasi dari Sari Herbal (Sukun, Malang, Indonesia) digunakan sebagai bahan baku. Kondisi bahan baku sebelum proses pengeringan dan grounding merupakan batasan penelitian sebagaimana jenis NADES yang digunakan dan dilakukan pula ekstraksi Soxhlet dan maserasi menggunakan etanol untuk mengetahui efektifitas penggunaan pelarut alternatif, NADES, guna ekstraksi senyawa bioaktif dari Curcuma mangga.

5

I.3 



Tujuan Tujuan dari penelitian ini adalah: Memanfaatkan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) sebagai pelarut dalam ekstraksi senyawa-senyawa bioaktif berupa curcuminoid terutama curcumin dari Curcuma mangga. Mendapatkan perolehan yield senyawa bioaktif Curcuma mangga (curcuminoid) secara ekstraksi menggunakan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) dan membandingkannya dengan metode ekstraksi soxhlet dan maserasi dengan etanol sebagai pelarut.

I.4

Manfaat Hasil penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan ekstrak senyawa bioaktif (curcuminoid) dari Curcuma mangga yang aman dan bebas residu kimia sehingga dapat digunakan sebagai bahan dasar pembuatan obat-obatan dan berpotensi untuk dapat dimanfaatkan ataupun dikonsumsi langsung oleh konsumen.

6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA Kunyit/ Kunir Putih (Curcuma Mangga) Curcuma mangga adalah ramuan rhizomatous dari keluarga Zingiberaceae. Rimpang C. mangga digunakan di Jawa sebagai bumbu untuk makanan dan pengobatan untuk sakit perut, demam dan penyakit kanker terkait (Malek et al., 2011). Beberapa jenis kunyit telah lama menjadi komoditas perdagangan dunia. Kebutuhan kunyit dunia hingga saat ini mencapai ratusan ribu ton/tahun dan telah dipenuhi oleh negara-negara seperti India, Haiti, Srilanka, Cina, dan Indonesia. Rimpang (rhizome) tanaman kunir putih mengandung senyawa penting untuk pengobatan tradisional dan industri obat-obatan. (Saefudin et al., 2014). Penjelasan tentang spesifikasi kunyit/kunir putih (Curcuma mangga) menurut Hutapea (1993) ditampilkan pada Tabel II.1. Pemanfaatan kunyit umumnya digunakan dalam berbagai industri makanan sebagai pewarna makanan terutama dalam produk susu, minuman, sereal, kembang gula, es krim, roti, dan produk gurih. Kunyit ditambahkan pada jumlah yang lebih tinggi untuk sosis, acar, relishes, saus, campuran kering, dan ikan sebagai bumbu (Jayandran et al., 2015). Kunyit putih telah terbukti memiliki efek farmakologis bersifat hemostatis (menghentikan pendarahan), penambah nafsu makan, antitoksik, dan mempercepat penyembuhan luka baik luka akibat kanker dan tumor. Curcumin yang terkandung dalam rimpang kunyit putih bermanfaat sebagai antitumor dan antiinflamasi (anti-radang). Sementara itu, saponin berkhasiat sebagai antineoplastik (anti-kanker) dan polifenol berfungsi sebagai antioksidan (Mangan, 2003). Kunyit putih telah digunakan di klinik di China untuk pengobatan kanker servik (Windono, 2002). Kunyit putih diketahui mengandung 11 senyawa, yaitu campuran stigmaterol dan β-sitosterol, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin, 1,17-bis (4-hidroksifenil)-1,4,6II.1

7

heptatrien-3-on, 7-hidroksi-6-metoksi kaumarin, curcumin, zerumin B, curcumanggoside, asam-4-hidroksisinamik, -8(17), 12-diene,15,16-dial dan calcalatarin A (Abas, 2005). Tabel II.1 Spesifikasi Kunyit/ Kunir Putih (Curcuma Mangga) (Hutapea, 1993)

Klasifikasi

Divisi Subdivisi Kelas Bangsa Suku Marga Jenis Habitus Batang

Daun

Deskripsi

Bunga

Buah Biji Akar Kandungan kimia

Spermatophyta Angiospermae Monocotyledoneae Zingiberales Zingiberabceae Curcuma Curcuma manga Semak, tinggi 1-2 m Semu, tegak, lunak, batang didalam tanah membentuk rimpang, hijau Tunggal, berpelepah, lonjong, tepi rata, ujung dan pangkal meruncing, pertulangan menyirip, hijau Majemuk, di ketiak daun, bentuk tabung, ujung terbelah, benang sari menempel pada mahkota, putih, putik silindris, kepala putik bulat, kuning, mahkota lonjong, putih Kotak, bulat, hijau kekuningan Bulat, coklat Serabut, putih Rimpang & daun mengandung saponin dan flavonoida, dan daun juga mengandung polifenol

8

Curcuminoid Curcumin dan oleoresin adalah dua komponen utama yang merupakan faktor paling penting untuk signifikansi kunyit (Jayandran, 2015). Curcumin merupakan salah satu zat utama yang ditemukan dalam rimpang Curcuma mangga dan curcuma lainnya. Curcumin (C), demethoxycurcumin (DMC) dan bisdemethoxycurcumin (BDMC) termasuk dalam kelompok diarylheptanoids. Ketiga senyawa ini disebut curcuminoid (Lestari dan Indrayanto, 2014; Pushpakumari et al., 2014; Popuri and Pagala 2013). Curcumin umumnya digunakan sebagai zat pewarna serta additive. WHO makanan menyatakan asupan harian diterima dari curcumin sebagai aditif makanan di kisaran 0-3 mg/kg. Penggunaan terapeutik juga telah diteliti dan dikenal memiliki potensi penggunaan sebagai antikanker (Lestari and Indrayanto, 2014). Struktur kimia dari curcuminoid beserta berat molekulnya ditunjukkan pada (Gambar II.1) dan (Tabel II.2) II.2

Gambar II.1 Struktur Curcuminoid Curcumin memiliki titik leleh 176-177°C, membentuk garam coklat kemerahan dengan alkali, tidak larut dalam air (Nabati et al., 2014), tetapi larut dalam metanol, etanol, alkali, keton, asam asetat, dichloromethane (DCM) atau dimethyl 9

sulfoxide (DMSO) dan kloroform (Bagchi, 2012; Nabati et al., 2014). Mengingat curcumin memiliki kelarutan yang berbeda pada kisaran pH 3-9. Curcumin berada pada kondisi paling stabil pada 10-55 ᵒC dan akan terdegradasi secara total pada 70 ᵒC selama 24 jam membentuk vanilin, asam vanilin, asam ferulat, feruloylmethane, dan p-hydroxybenzaldehyde (Salem et al., 2014). Kunyit mengandung sekitar 4-6%-berat curcuminoid, 24%-berat minyak esensial dan 2-3%-berat karotenoid termasuk turmerone, atlantone, dan zingiberone. Konstituante lain termasuk gula-gula, protein dan resin juga terkandung didalam kunyit (Paulucci et al., 2013; Popuri dan Pagala, 2013). Tabel II.2 Nama Kimia dan Berat Molekul dari Curcuminoid (Pushpakumari et al., 2014) Berat Nama Kimia RumusMolekul Molekul Curcumin C21H20O6 368 (Diferuloyl Methane) Demethoxy curcumin C20H18O5 338 (p-Hydroxy-cinnamoylferuloyl-methane) Bis-demethoxy curcumin (pp’-DihydroxyC19H16O4 308 dicinnamoyl-methane) II.3

Ekstraksi Ekstraksi yaitu proses pemisahan dan isolasi senyawa target dari suatu raw material dengan penambahan pelarut tertentu untuk mengeluarkan senyawa target dari raw material atau zat cair. Senyawa target yang diinginkan bersifat larut dalam pelarut (solvent) (Wahyuni et al., 2004). Terdapat beberapa teknik ekstraksi padat-cair (leaching) yg tersedia: soxhlet, maserasi, perkolasi, destilasi dengan air/steam. Namun, belum ada metode ekstraksi tunggal dan terstandarisasi untuk memperoleh senyawa bioaktif dari suatu 10

bahan alam. Masing-masing metode ekstraksi menghadirkan kelebihan dan kekurangan. Demikian pula, tidak ada metode ekstraksi tunggal yang mampu mengekstrak semua senyawa bioaktif yang terkandung di dalam bahan alam (Mustaq et al., 2014). Teknik ekstraksi konvensional yang paling umum digunakan adalah ektraksi perendaman (maserasi), ekstraksi soxhlet dan destilasi. (Rastagno dan Prado., 2003) Jenis-jenis metode ekstraksi yang digunakan adalah sebagai berikut : A. Maserasi. Maserasi merupakan metode sederhana yang paling banyak digunakan. Metode ini dilakukan dengan memasukkan serbuk tanaman dan pelarut yang sesuai ke dalam wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar. Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam sel tanaman. Setelah proses ekstraksi, pelarut dipisahkan dari sampel dengan penyaringan. Kerugian utama dari metode maserasi ini adalah memakan banyak waktu, pelarut yang digunakan cukup banyak, dan besar kemungkinan beberapa senyawa hilang. Selain itu, beberapa senyawa mungkin saja sulit diekstraksi pada suhu kamar. Namun di sisi lain, metode maserasi dapat menghindari rusaknya senyawa-senyawa yang bersifat termolabil (tidak tahan panas) (Mukhriani, 2014). B. Soxhlet. Metode ini dilakukan dengan menempatkan serbuk sampel dalam sarung selulosa (dapat digunakan kertas saring) dalam slonsong yang ditempatkan di atas labu dan di bawah kondensor. Pelarut yang sesuai dimasukkan ke dalam labu dan suhu penangas diatur di bawah suhu reflux. Pada Soxhlet konvensional, sampel ditempatkan dalam thimbleholder dan selama beroperasi secara bertahap diisi dengan fresh solvent dari labu distilasi. Ketika cairan mencapai tingkat overflow, secara otomatis dikosongkan oleh siphon kemudian pelarut mengalir kembali ke labu destilasi. Operasi ini diulang sampai ekstraksi selesai dicapai. Keuntungan dari 11

metode ini adalah proses ektraksi yang kontinyu, sampel terekstraksi oleh pelarut murni hasil kondensasi sehingga tidak membutuhkan banyak pelarut dan tidak memakan banyak waktu. Kerugiannya adalah senyawa yang bersifat termolabil dapat terdegradasi karena ekstrak yang diperoleh terus-menerus berada pada titik didih (Mukhriani, 2014). Ekstraksi soxhlet adalah teknik ekstraksi yang sangat sederhana dan umum digunakan sebagai metode pembanding dengan pendekatan efisiensi ekstraksi ~100% (Castro dan Ayuso, 2000). Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) Cairan superkritis (Supercritical Fluids, SFS), yang sebagian besar menggunakan karbon dioksida (CO2), cairan ionik (Ionic Liquids, ILs), dan pelarut eutektik (Deep Eutectic Solvent, DES) adalah kandidat green solvent. Pelarut ini telah diberi label sebagai "green" karena tekanan uapnya diabaikan dan tidak mudah terbakar dibandingkan penggunaan solvent dari golongan volatile organic compounds (VOCs) (Deetlefs dan Seddon, 2010; Domínguez de María dan Maugeri, 2011; Gorke et al., 2010; Wood dan Stephens 2010). Green solvent memiliki efek minimal terhadap kesehatan manusia, aman dan ramah lingkungan dalam hal pemanfaatan, dan pembuangan (Deetlefs dan Seddon, 2010). Cairan ionik dan DES adalah campuran dari garam yang berbentuk cair pada suhu kamar dan memiliki sifat fisik-kimia yang dapat disesuaikan dengan selektivitas yang diharapkan hanya dengan menggabungkan jenis kation dan anion yang berbeda. Cairan ionik terdiri dari kation sintetis khas seperti dialkylimidazolium dan derivatif alkylpyridium, dan anion seperti chloroaluminate dan logam halida lainnya (Domínguez de María dan Maugeri, 2011). Bila perlu, jenis anion yang reaktif terhadap adanya uap air tsb dapat diganti dengan halida atau anion (BF4 atau PF4) yang lebih stabil terhadap kehadiran air dan udara (Gorke et al., 2010). Namun, ILs masih menghadapi tantangan untuk aplikasi skala besar karena mahal dan toksik (Thuy Pham et II.4

12

al., 2010). Cairan ionik (ILs) diproduksi secara sintetis dari komponen yang sangat murni tetapi umumnya masih memerlukan proses pemurnian lebih lanjut karena kehadiran sedikit pengotor dapat mengubah sifat ILs secara signifikan. Campuran metabolit primer seperti gula, gula alkohol, poli-alkohol, basa organik, asam organik, dan asam amino dapat membentuk DES dan disebut sebagai Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) (Choi et al., 2011). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, NADES dibagi dalam tipe-tipe sebagai berikut (Dai et al., 2013): (1) cairan ionik, terdiri dari asam-asam organik (asam sitrat, asam maleat, asam laktat) dan senyawa-senyawa basa (choline chloride, dan betaine); (2) NADES netral, tidak ada konstituen ionik, seperti campuran polyalcohols (gliserol, glisin, 1-2-propandiol); (3) NADES yang bersifat asam, terdiri dari senyawa-senyawa netral (glukosa, fruktosa, sukrosa, maltosa, trehalose) dan senyawa-senyawa asam; (4) NADES yang bersifat basa, yang terdiri dari senyawasenyawa netral dan senyawa-senyawa basa, dan (5) NADES yang bersifat amfoter, kombinasi dari asam amino (-Proline, Alanine) dan gula, polyalcohol, atau senyawa-senyawa asam. Tabel II.3 Daftar Natural ILs dan DES (Choi et al., 2011) Kombinasi Molar Rasio Asam sitrat:choline chloride 1:2, 1:3 Asam maleat:choline chloride 1:1, 1:2, 1:3 Asam maleat:choline chloride 1:1, 1:2, 1:3 Aconitic acid:choline chloride 1:1 Glisin:choline chloride:air 1:1:1 Fruktosa:choline chloride:air 1:1:1 Sukrosa:choline chloride: air 1:1:1 Asam sitrat:Proline 1:1, 1:2, 1:3 Asam maleat:Glisin 1:1 Asam maleat:Fruktosa 1:1 Asam maleat:Sukrosa 1:1 Asam sitrat:Glisin 2:1 13

Asam sitrat:trihalose Asam sitrat:Sukrosa Asam maleat:Glisin Asam maleat:Sukrosa Glisine:Fruktosa Fruktosa:Sukrosa Glisine:Sukrosa Sukrosa:Glisin:Fruktosa

2:1 1:1 4:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1:1

Meskipun memiliki viskositas tinggi, NADES masih berwujud cair pada suhu kamar dan bahkan pada suhu rendah. Viskositas akan menurun secara signifikan dengan penambahan sejumlah kecil air. Selain itu, NADES memiliki cakupan polaritas dalam rentang yang lebar, mulai lebih polar daripada air hingga polaritas sama dengan metanol. NADES terbukti menjadi pelarut yang sangat baik untuk berbagai metabolit dengan polaritas rendah sampai menengah yang tidak atau sukar larut dalam air. Makromolekul seperti DNA, protein dan polisakarida juga larut dalam NADES. NADES yang tidak beracun dan ramah lingkungan digunakan untuk berbagai aplikasi pada bidang makanan, kosmetik, agrokimia dan industri farmasi sebagai media baru Green Technology (Dai et al., 2013). II.5 Metode Analisa Curcuminoid II.5.1 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode analisis kuantitatif yang didasarkan konsep kimia dan fisika-kimia. HPLC termasuk metode analisis terbaru: suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam padat. Metode ini memiliki banyak keunggulan jika dibandingkan dengan metode lainnya, antara lain (Putra, 2004): • mampu memisahkan senyawa-senyawa target dari suatu campuran • mudah melaksanakannya 14

• • • • • •

kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis memiliki resolusi yang baik dapat menggunakan bermacam-macam detektor kolom dapat digunakan kembali mudah melakukan "sample recovery"

Metode analisa curcuminoids: curcumin (C), demethoxycurcumin (DMC) dan bisdemethoxycurcumin (BDMC) secara kromatografi telah banyak dikembangkan. Metode analisis curcuminoids secara HPLC menawarkan keuntungan, yang mana pemisahan dan penentuan kandungan dari curcuminoids dapat dilakukan secara simultan. Selain itu, metode ini memiliki ketelitian yang tinggi dan rendahnya detection limit (Zhang et al., 2013) Sejumlah penelitian telah dilakukan untuk dapat memisahkan pigmen curcuminoid antara lain: secara thin layer chromatography (TLC), high performance thin layer chromatography (HPTLC), dan column chromatography (CC). Metode HPLC sensitif, tepat, dan akurat untuk deteksi dan kuantifikasi curcuminoid dalam ekstrak rimpang Curcuma. Pemisahan dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dilakukan sebagian besar menggunakan kolom fase terbalik (reversed-phase column) menggunakan mobile phase campuran air, asetonitril, etanol, dan metanol. Karena pigmen curcuminoid bervariasi dalam struktur kimia maka karakteristik fisika-kimia serta sifat fungsional akan bervariasi pula (Revathy et al., 2011). Beberapa metode analisa kuantitatif curcuminoid secara HPLC ditampilkan pada Tabel II.4.

15

Tabel II.4 Beberapa Metode Analisa Curcuminoid secara HPLC.

Stationary phase/ fase diam

Mobile Phase/ fase bergerak

Thermo Scientific Accucore Polar Premium (100 × 3,0 mm ID, 2,6 m)

Metanol : 10 mM phosphoric acid = 80:20 (v/v)

Thermo Scientific Acclaim RSLC PA2 (50× 2,1 mm ID, 3 m)

100 nM phosphate buffer (pH 3) : metanol = 25:75 (v/v)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (50 mm× 2,1 mm ID,1,8 m)

0.1%phosphoric acid dalam air : asetonitril = 60:40 (v/v)

Metode Analisa - Isokratik mobile phase - Volume injeksi sampel 6,0 L - Flow rate 0,8 mL/min - UV-DAD deteksi pada 428 nm; 40 ᵒC - Total running time = 4 menit - Isokratik mobile phase - Volume injeksi sampel 2,0 L - Flow rate 0,4 mL/min - UV-DAD deteksi pada 426 nm - Total running time = 3 menit - Isokratik mobile phase - Volume injeksi sampel 1,0 L - Flow rate 1,0 mL/min - UV-DAD deteksi 16

Referensi

(Tracy, 2013)

(Zhang et al., 2013)

(Horkey, 2013)

pada 425 nm; 35 ᵒC - Total running time = 2 menit

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (250 mm× 4,6 mm ID,5 m)

Asetonitril : metanol : air (pH 3) = 40:20:40 (v/v/v)

Alltect Alltima C18 (150 × 4,6 mm ID, 5 m)

Asetonitril : 2% asam asetat dalam air = 40:60 (v/v)

Water bondapack C18 (300 × 4,6 mm ID)

Metanol (A) : 2% asam asetat (B) : asetonitril (C) (gradient system)

- Isokratik mobile phase - Volume injeksi sampel 25 L - Flow rate 1,5 mL/min - UV-DAD deteksi pada 370 nm; - 35 ᵒC - Total running time = 9 menit - Isokratik mobile phase - Volume injeksi sampel 20 L - Flow rate 2,0 mL/min - UV-DAD deteksi pada 425 nm; 33 ᵒC - Total running time = 16 menit - Gradien sistem mobile phase: linier selama 0-15 menit dengan 45-65% asetonitril dalam B; gradien 65-45% asetonitril dalam B selama 15-20 menit; dan konstan 5% untuk A selama 1 17

(Syed et al., 2015)

(Wichitnit had et al., 2009)

Guddadar angavvan ahally, et al (2002)

menit. - Volume injeksi sampel 20 L - Flow rate 1,0 mL/min - UV-DAD deteksi pada 425 nm; suhu kamar - Total running time = 20 menit Mobile phase metanol : 10 mM phosphoric acid akan dicoba digunakan sebagai mobile phase (Tracy et al., 2013) dalam penelitian ini, mengingat baik metanol dan asetonitril dapat memisahkan dengan baik curcuminoids pada HPLC menggunakan kolom C18 (Tracy et al., 2013; Zhang et al., 2013). Akan tetapi, pemilihan penggunaan metanol dibandingkan asetonitril lebih diutamakan dengan pertimbangan ekonomis. II.5.2 Thin Layer Chromatography (TLC) Metode Thin Layer Chromatography (TLC) atau Kromatografi Lapis Tipis (KLT) umumnya digunakan sebagai metode kualitatif untuk memantau jalannya suatu reaksi, proses pemisahan atau yang lainnya. Mengingat metode ini cukup sederhana, mudah dan murah. Silika gel adalah fase stasioner paling umum digunakan dalam TLC dengan sistem pelarut yang berbeda termasuk benzen, etil asetat, etanol, kloroform, asam asetat, heksan, dan metanol untuk pemisahan kromatografi. Beberapa metode analisa kualitatif curcuminoid secara TLC ditampilkan pada Tabel II.5.

18

Tabel II.5 Beberapa Metode Analisa Curcuminoid secara TLC menggunakan silica plate sebagai fase diam. Fase gerak Keterangan Referensi - 20 mL mobile phase (Diklorometan : metanol = 95:5 (v/v)) dibuatkan dan dituangkan dalam KLTchamber. Tunggu hingga chamber benar-benar jenuh dengan fase gerak. Diklorometan : (Fagundes - Totol yang terbentuk metanol = 95:5 et al., diamati dibawah cahaya (v/v) 2015) putih dan mengekspos plate ke sinar UV (365 nm dan 254 nm). - Penampakan bercak dapat dilakukan dengan penyemprotan 20%-v H2SO4 dalam etanol. - 200 mg crude extract dilarutkan dalam 1 mL dichloromethan:metanol = 99:1 (v/v). Kemudian larutan tersebut ditotolkan Diklorometan : (Anderson pada lempeng TLC-silika metanol = 97:3 et al., dan dielusikan pada fase (v/v) 2000) gerak tertentu. - Curcumin (C), demethoxycurcumin (DMC) dan bisdemethoxycurcumin (BDMC) terdeteksi berturutturut dengan Rf 0.49; 0.22;

19

II.6

Studi Hasil Penelitian Sebelumnya Baru-baru ini, telah dikembangkan jenis pelarut baru berdasarkan DES yang merupakan campuran eutektik bertitik leleh lebih rendah dari masing-masing komponen penyusunnya. Campuran terbentuk dari senyawa-senyawa metabolit primer yang umum di alam, yaitu gula, basa dan asam organik, asam amino, protein, alkohol, polyalkohol, dll. Mengingat komponenkomponen penyusunnya telah tersedia secara alamiah, maka diberi NADES – Natural Deep Eutectic Solvent (Choi et al., 2011; Dai et al., 2013). Air terkadang merupakan salah satu konstituen penyusun. Kemudahan pembuatan NADES yang terdiri dari senyawa-senyawa baku berharga murah, dan ketersediaannya secara alami dan melimpah, sifatnya yang aman; menjadikan NADES memiliki sejumlah keunggulan dibandingkan green solvent lainnya (Dai et al., 2013). Walaupun telah dilakukan penelitian pada NADES, masih terdapat kekurangan informasi tentang isu-isu praktis yang berkaitan dengan aplikasi mereka sebagai pelarut terutama untuk produkproduk alami senyawa bioaktif berskala komersial. Aplikasi dari NADES untuk ekstraksi metabolit sekunder (Dai et al., 2013; Guo et al., 2013; Park et al., 2014; Zhang et al., 2014) telah dilaporkan serta penerapannya dalam pengolahan biodiesel (Huang et al., 2013; Shahbaz et al., 2011; Shahbaz et al., 2013; Tang et al., 2014). Mikro atau makro-molekul bisa dilarutkan dengan NADES (Dai et al., 2013). Misalnya, diketahui NADES memberikan kelarutan yang baik dari pada serangkaian senyawa bioaktif seperti rutin, quercetin, asam sinamat, taxol, carthamin, ginkgolide B serta beberapa makromolekul seperti gluten, DNA, dan pati di NADES dilaporkan (Dai et al. 2013). Kelarutan senyawa-senyawa tsb dalam NADES secara substansial lebih tinggi dibandingkan kelarutan mereka di air. NADES seperti proline-malic acid-water (PMH), sucrose-choline chloride-water (SCH), glucose-choline chloride-water (GCH), sorbitol-choline chloride-water (SoCH), 1,2-propanediol-choline chloride-water (PCH), fructose-glucose-sucrose-water (FGSH), dan lactic acid20

glucose-water (LGH) untuk ekstraksi fenolat seperti cartomin dan carthamin dari safflower (Flos Carthami), corolla dari Carthamus tinctorius L. telah ditunjukkan oleh (Dai et al., 2013 ). Zat warna alami safflower ini terbukti memiliki kelarutan tinggi dalam PMH, dan LGH. Namun, berbagai jenis metabolit sekunder, seperti fenolat lainnya termasuk flavonoid, terpenoid, glikosida, dan alkaloid, memiliki sifat dan karakteristik kelarutan yang berbeda. Hal ini juga ditunjukkan dalam studi kelarutan dengan rutin murni, quercetin, asam sinamat, carthamin, taxol, dan ginkgolide B (Dai et al., 2013). Ekstraksi metabolit fenolik dari safflower (Carthamus tinctorius) dengan pelarut NADES (Dai et al. 2013) termasuk stabilitasnya juga telah dilaporkan. NADES berbasis gula stabil untuk pigmen fenolik alami ketika terkena cahaya, suhu yang lebih tinggi, dan waktu penyimpanan yang lama. Oleh karena itu, NADES menawarkan keuntungan jelas atas DES sintetis terutama untuk bahan makanan, kosmetik, dan aplikasi farmasi. Hasil ini menunjukkan perlunya penelitian lebih lanjut tentang aplikasi dari NADES sebagai pelarut ekstraksi ramah lingkungan.

21

Halaman ini sengaja dikosongkan

22

BAB III METODE PENELITIAN III.1

Bahan-bahan Kimia yang digunakan Serbuk Curcuma mangga diperoleh dari donasi Sari Herbal (Sukun, Malang, Indonesia). Pelarut pada metode ekstraksi soxhlet adalah etanol 96%. Etanol 96% diperoleh dari UD. Sumber Ilmiah Persada. Kurkumin standard HPLC grade (kemurnian 99%) dari TCI (Tokyo, Japan), sedangkan bahanbahan kimia lain pendukung analisa juga diperoleh dari SigmaAldrich (St. Louis, MO, USA). III.2

Alat-alat yang digunakan Aparatus extractor soxhlet, mantel pemanas, rotary evaporator, hot plate, UV lamp (254 nm dan 365 nm), dan HPLC. III.3 Variabel Penelitian III.3.1 Variabel Tetap pada Ekstraksi menggunakan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) 1. Waktu ekstraksi : 1 x 24 jam, NADES yang memberikan hasil terbaik (yield curcuminoid tertinggi) dilakukan ekstraksi kembali dengan waktu ekstraksi 48, 72, dan 96 jam 2. Suhu ekstraksi : 40oC 3. Serbuk Curcuma mangga yang digunakan dan ratio pelarut:bahan yang digunakan (w/w) (2 mg/2 g NADES)

III.3.2 Variabel Bebas pada Ekstraksi menggunakan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES)  Tipe NADES a. Netral : • Fruktosa-glukosa-air (FG-H2O = 1:1:9) • Fruktosa-sukrosa-air (FS-H2O = 2:1:22) 23

b.

Basa: • Betaine chloride-sukrosa-air (BS-H2O = 1:1:6) • Betaine chloride-glukosa-air (BG-H2O = 5:2:5) c. Asam: • Asam maleat-glukosa-air (MAG-H2O = 1:1:4) • Asam maleat-sukrosa-air (MAS-H2O = 1:1:8) • Asam sitrat-sukrosa-air (CAS-H2O = 1:2:10)  Kandungan Air a) Netral: • Fruktosa-glukosa-air (FG-H2O = 1:1:10) • Fruktosa-sukrosa-air (FS-H2O = 2:1:32) b) Basa: • Betaine chloride-sukrosa-air (BS-H2O = 1:1:7) • Betaine chloride-glukosa-air (BG-H2O = 5:2:6) c) Asam: • Asam maleat-glukosa-air (MAG-H2O = 1:1:7) • Asam maleat-sukrosa-air (MAS-H2O = 1:1:11) • Asam sitrat-sukrosa-air (CAS-H2O = 1:2:16) III.3.3 Variabel Respon 1. Yield curcuminoid hasil ekstraksi menggunakan NADES yield dihitung dari persamaan berikut: 2. Properties fisik NADES : densitas III.4 Metode Penelitian III.4.1 Pembuatan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) Semua Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) yang digunakan dalam penelitian ini dipersiapkan berdasarkan metode yang dilakukan Dai et al. (2013). Metode pemanasan kombinasi freeze-dry dipilih untuk pembuatan NADES. Komponenkomponen penyusun (misal: fruktosa, glukosa, dan air untuk FGH2O) dicampurkan sesuai dengan mol ratio yang telah ditentukan pada botol tertutup. Campuran tersebut diaduk pada suhu 70 oC 24

menggunakan magnetic stirrer dalam water bath hingga diperoleh campuran berbentuk liquida yang bening. Selanjutnya campuran liquid yang diperoleh dimasukkan ke dalam freeze-dry hingga beratnya konstan (3 hari). Campuran liquida keluar freeze-dry diamati, jika tetap berbentuk cairan liquida yang bening (tidak mengendap, tidak berubah warna ataupun mengkristal), maka selanjutnya campuran liquida tersebut disebut sebagai NADES. Campurkan komponen-komponen penyusun NADES sesuai mol ratio yang ditentukan Komponen-2

Komponen-3

Komponen-1 Set suhu pemanasan hot plate (70 ᵒC) Freezedry (3 hari)

NADES

Magnetic stirrer Aduk dengan magnetic stirrer hingga terbentuk campuran liquid bening

Gambar III.1 Skema pembuatan NADES dengan menggunakan metode pemanasan kombinasi freeze-dry

25

III.4.2 Ekstraksi Senyawa Bioaktif menggunakan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) Ekstraksi senyawa bioaktif menggunakan NADES dilakukan dengan menambahkan serbuk Curcuma mangga 2±0,1 mg ke dalam 2,00±0,1 g NADES yang telah ditimbang secara akurat dan diletakkan dalam 5 mL botol sampel amberlite tertutup. Botol sampel diaduk pada suhu 40 oC menggunakan hot plate dan berpengaduk magnetik. Pengadukan dilakukan selama 1x24 jam dan setelah 24 jam sampel diambil untuk diketahui kandungan curcuminoid yang telah terekstrak. Untuk sampel NADES yang memberikan nilai yield tertinggi, dilakukan ekstraksi lanjutan; ekstraksi dilanjutkan hingga 48, 72, dan 96 jam dan dianalisa yield curcuminoid yang didapat. Jika terjadi perubahan fisik, misal terjadi kritalisasi ataupun karamelisasi, ekstraksi dihentikan. Selanjutnya sampel disimpan pada suhu ruang dan gelap untuk keperluan analisa pada tahap selanjutnya. Termometer NADES Serbuk Curcuma (2 g) mangga (2 mg)  Setelah ekstraksi (24 jam), ekstraksi dihentikan  Simpan sampel (suhu ruang & tempat gelap) Sampel NADES+serbuk Curcuma mangga

Analisa HPLC Yield Curcuminoid

Water bath Hot plate

Lakukan ekstraksi pada 40 ᵒC selama 24 jam

Gambar III.2 Skema ekstraksi senyawa bioaktif dari Curcuma mangga menggunakan NADES 26

III.4.3 Ekstraksi Senyawa Bioaktif dengan Soxhlet dan Maserasi Soxhlet ekstraksi menggunakan etanol dipilih sebagai metode konvensional (Fagundes et al., 2015). Masukkan 40 g bubuk kunyit (Curcuma mangga) ke dalam thimble extractor soxhlet. Tambahkan 250 mL etanol ke labu sebagai pelarut, rangkai alat extraksi soxhlet dan letakkan didalam mantel pemanas, nyalakan mantel pemanas dan lakukan ekstraksi hingga reflux etanol berwarna jernih/tidak berwarna, menandakan bahwa hampir semua curcuminoid telah berhasil diektrak. Catat waktu ekstraksi soxhlet yang diperlukan dan banyaknya sirkulasi solvent yang terjadi. Selama proses soxhletasi jaga suhu ekstraksi konstan dan tidak overheat untuk mencegah terjadinya bubled. Setelah ekstraksi selesai, dinginkan dan simpan larutan ekstrak untuk tahap kedua. Tahap kedua dilakukan penyaringan larutan etanol menggunakan kertas saring untuk memastikan tidak ada serbuk Curcuma mangga terikut dalam larutan ekstrak. Selanjutnya lakukan penguapan pelarut, etanol, menggunakan rotary evaporator untuk menguapkan solvent mendapatkan ekstrak terkonsentrasi. Timbang berat ekstrak yang diperoleh. Simpan ekstrak tersebut pada tempat gelap untuk analisa selanjutnya.

27

Buncher funnel

Serbuk Curcuma mangga (40 g)

Kertas saring Ke vacuum pump

Etanol 96% (250 mL)

Buncher flask Penyaringan

Pemanas (Hot plate) Lakukan ekstraksi soxhet hingga Etanol reflux jernih Rotary evaporator ekstrak Analisa HPLC Yield curcumin

Gambar III.3 Skema Ekstraksi Soxhlet Metode maserasi juga turut dilakukan menggunakan wadah inert yang tertutup rapat (erlenmayer) pada suhu kamar dengan perbandingan solvent dan bubuk kunyit yang sama sebagaimana ektraksi soxhlet (40 g serbuk Curcuma mangga dan 250 mL etanol 96%). Proses ekstraksi ini dilakukan disertai pengadukan menggunakan magnetic stirrer selama 1x24 jam. Setelah 24 jam ekstraksi dilakukan, solvent dan ekstrak terlarut disaring; selanjutnya residu serbuk Curcuma mangga ditambahkan kembali 250 mL fresh etanol dan ekstraksi ke-2 28

dimulai. Proses ekstraksi maserasi tersebut terus dilakukan hingga ketika ekstrak yang diperoleh tidak lagi berwarna kuning, menandakan bahwa hampir semua curcuminoid telah berhasil diektrak. Catat waktu total yang diperlukan untuk maserasi dan volume total solvent yang diperlukan. Kumpulkan menjadi satu semua ekstrak yang diperoleh. Selanjutnya, proses ekstraksi selesai, pelarut dipisahkan dari sampel dengan penyaringan, penguapan pelarut etanol, menggunakan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak terkonsentrasi. Timbang berat ekstrak yang diperoleh. Simpan ekstrak tersebut pada tempat gelap untuk analisa selanjutnya. Ekstraksi soxhlet dan maserasi ini dilakukan secara duplo (dua kali ulangan). Residu Serbuk Curcuma Fresh Etanol (250 mL) mangga (40 g)

Serbuk Curcuma Etanol (250 mL) mangga (40 g)

Buncher funnel

Kertas saring

Penyaringan

Ke vacuum pump

Analisa HPLC

Setelah ekstraksi Buncher (24 jam, suhu flask kamar), ekstraksi dihentikan

Yield Curcuminoid

Ekstraksi diulang hingga filtrate ekstrak berwarna jernih (ekstraksi 24 jam, suhu kamar)

Gambar III.4 Skema Ekstraksi Maserasi

29

III.4.4 Analisa Kuantitatif secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC) A. Preparasi sampel sebelum diinjeksikan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Ekstrak sampel 100 µL ditimbang secara akurat dan diencerkan hingga 1 mL dalam labu takar yang bersesuaian dengan metanol p.a HPLC grade. Sedangkan untuk ekstrak hasil maserasi dan soxhlet semua ekstrak yg diperoleh ditambahkan metanol hingga 100 mL dalam labu takar yang bersesuaian dengan metanol p.a HPLC grade. Sampel diultrasonik selama 5 menit. Saring sampel tersebut dengan 0.2 µm nylon membrane syringe filter. Sampel siap diinjeksikan ke HPLC dan dianalisa pada 421,4 nm. Analisa Senyawa Bioaktif menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Analisa HPLC dilakukan untuk mengkuantifikasi senyawa bioaktif (curcumin (C), demethoxycurcumin (DMC) dan bisdemethoxycurcumin (BDMC)) yang berhasil terekstrak oleh NADES. Kolom HPLC Zorbax Eclipse XDB RP-18, (5µm, 150 x 4,6 mm ID) digunakan. Isokratik sistem mobile phase dengan komposisi asetonitril:asam asetat 1% = 50:50 (v/v) digunakan pada flow rate 1,0 mL/min, volume injeksi = 20 L, 30oC suhu kolom, dan total running time = 10 menit. Absorbansi diukur pada 421,4 nm. B.

III.4.5 Analisa Kualitatif secara Thin Layer Chromatography (TLC) A. Preparasi sampel untuk analisa secara Thin Layer Chromatography (TLC) Potong lempeng KLT-silica ukuran (5 cm x 6 cm), tandai dengan pensil pada 1 cm dari batas bawah dan 0,5 cm dari bagian atas lempeng. Totolkan larutan sampel secukupnya (200 mg crude extract yang telah dilarutkan dalam 1 mL diklorometan:metanol = 99:1 (v/v)) pada lempeng silika yang 30

telah disiapkan dan sertakan pula larutan standar curcuminoids sebagai pembanding bercak (1 mg/mL). Lempeng yang telah ditotolkan sampel ekstrak dan larutan standar dibiarkan selama 1 menit untuk pengeringan. Analisa Senyawa Bioaktif menggunakan Thin Layer Chromatography (TLC) Siapkan sekitar 20 mL 5% metanol dalam diklorometan (mobile phase). Letakkan filter paper ke dalam KLT-chamber. Tuangkan mobile phase secukupnya, pastikan KLT-chamber jenuh dengan mobile phase dan ruang tertutup rapat. Lempeng yang telah ditotolkan diletakkan dalam ruang kromatografi/ KLTchamber secara vertikal. Letakkan secara perlahan dan hati-hati. Pastikan lempeng diletakkan secara bersamaan dalam posisi vertikal dan ruang chamber tertutup rapat. Tunggu beberapa saat hingga mobile phase mencapai batas atas lempeng. Ketika solvent mencapai tanda garis, keluarkan plat dan biarkan kering. Terakhir, amati kromatogram (plat) dibawah cahaya putih kemudian pigmen dipisahkan dengan mengekspos plate ke radiasi cahaya radiasi UV (365 nm dan 254 nm) atau setelah penyemprotan plat dengan 20% larutan H2SO4 dalam etanol. Tandai bercak yang timbul dan hitunglah nilai Rf dari tiap-tiap bercak. B.

31

III.5 Diagram Alir Metode Penelitian III.5.1 Diagram Alir Penelitian secara Keseluruhan Ekstraksi metode konvensional

Pembuatan NADES

Ekstraksi senyawa bioaktif menggunakan NADES (2 mg serbuk/ 2 g NADES)

Ekstraksi secara soxhlet (40 g serbuk/ 250 mL etanol)

Ekstrak senyawa bioaktif dalam NADES

dihentikan jika etanol reflux berwarna jernih

Ekstraksi secara maserasi (40 g serbuk/ 250 mL etanol) Ekstraksi diulang hingga filtrate ekstrak berwarna jernih (ganti solvent setiap 1x24 jam)

Analisa secara HPLC

Analisa secara HPLC

Yield Curcuminoid

Yield Curcuminoid

32

III.5.2 Diagram Alir Pembuatan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) Mencampurkan komponen-komponen penyusun NADES (sesuai mol ratio yang telah ditentukan)

Mengaduk campuran tersebut pada suhu 70 oC menggunakan magnetic stirrer dalam water bath hingga diperoleh campuran berbentuk liquida yang bening

Memasukkan ke dalam freeze-dry hingga berat konstan (3 hari )

Jika campuran liquida tetap bening (tidak mengendap, mengkristal ataupun berubah warna), maka NADES telah diperoleh

33

III.5.3 Diagram Alir Ekstraksi Senyawa menggunakan Natural Deep Eutectic (NADES)

Bioaktif Solvents

Menambahkan serbuk Curcuma mangga 2±0,1 mg ke dalam 2±0,1 g NADES dan diletakkan kedalam 5 mL botol sampel amberlite tertutup

Mengaduk botol sampel pada suhu 40oC mengunakan hot plate dan magnetic selama 1x24 jam

Setelah 24 jam sampel diambil untuk diketahui kandungan curcuminoid yang telah terekstrak

Untuk sampel NADES yang memberikan yield tertinggi, ekstraksi dilanjutkan hingga 48, 72, dan 96 jam

Sampel disimpan pada suhu ruang dan gelap untuk keperluan analisa pada tahap selanjutnya

34

III.5.4 Diagram Alir Ekstraksi Senyawa Bioaktif secara Konvensional A. Soxhlet Memasukkan 40 g bubuk kunyit ke dalam thimble extractor soxhlet Tambahkan 250 mL etanol ke labu

Melakukan ekstraksi hingga etanol reflux berwarna jernih

Setelah ekstraksi selesai, dinginkan dan simpan larutan

Menyaring larutan menggunakan kertas saring

Menguapkan etanol menggunakan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak terkonsentrasi Menimbang berat ekstrak yang diperoleh

Menyimpan ekstrak pada tempat gelap untuk analisa selanjutnya

35

B. Maserasi Memasukkan 40 g bubuk kunyit ke dalam erlenmeyer

Tambahkan 250 mL etanol ke erlenmeyer

Melakukan ekstraksi hingga diperoleh filtrate ekstrak berwarna jernih Menyaring larutan menggunakan kertas saring

Menguapkan etanol menggunakan rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak terkonsentrasi

Menimbang berat ekstrak yang diperoleh

Menyimpan ekstrak pada tempat gelap untuk analisa selanjutnya

36

III.5.5 Metode Analisa III.5.5.1 Analisa Kuantitatif secara High Performance Liquid Chromatography (HPLC) A. Preparasi sampel sebelum diinjeksikan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Menimbang ekstrak sampel 100 µL dan mengencerkan hingga 1 mL dalam labu takar yang bersesuaian dengan metanol p.a HPLC grade. Menambahkan 100 mL dalam labu takar yang bersesuaian dengan metanol p.a HPLC grade untuk hasil ekstrak maserasi dan soxhlet yang diperoleh

Sampel diultrasonik selama 5 menit

Menyaring sampel tersebut dengan 0.2 µm nylon membrane syringe filter

Menginjeksikan sampel ke HPLC dan menganalisa pada 421,4 nm

37

III.5.5.2 Analisa Kualitatif secara Thin Layer Chromatography (TLC) A. Preparasi sampel untuk analisa secara Thin Layer Chromatography (TLC) Memotong lempeng TLC silica ukuran (5 cm x 6 cm)

Menandai dengan pensil pada 1cm dari batas bawah dan 0,5 cm dari bagian atas lempeng

Menotolkan larutan sampel secukupnya (200 mg crude extract yang telah dilarutkan dalam 1 mL diklorometan:metanol = 99:1 (v/v)) pada lempeng silika yang telah disiapkan dan melakukan sertakan pula larutan standard curcuminoids sebagai pembanding bercak (1 mg/mL)

Menunggu selama 1 menit untuk pengeringan

38

B.

Analisa Senyawa Bioaktif menggunakan Thin Layer Chromatography (TLC) Menyiapkan sekitar 20 mL 5% metanol dalam diklorometan (mobile phase)

Meletakkan filter paper ke dalam TLC-chamber

Meletakkan lempeng yang telah ditotolkan sampel ekstrak dan larutan standard dalam ruang kromatografi/ TLCchamber secara vertikal

Menunggu beberapa saat hingga mobile phase mencapai batas atas lempeng. Saat mencapai tanda garis, keluarkan plat dan biarkan kering

Mengamati kromatogram (plat) dibawah cahaya putih kemudian pigmen dipisahkan dengan mengekspos plate ke radiasi cahaya UV (365 nm dan 254 nm) atau setelah penyemprotan plat dengan 20% larutan H2SO4 dalam etanol

Menandai bercak yang timbul dan hitunglah nilai Rf dari tiaptiap bercak

39

Halaman ini sengaja dikosongkan

40

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN Pembuatan dan Stabilitas Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) Pembuatan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) pada penelitian ini berdasarkan metode pemanasan yang dilakukan oleh Dai et al. (2013). Metode ini selain sederhana juga murah, hanya memerlukan pengaduk pada suhu moderat (70 oC) sehingga aman dan jauh dari suhu degradasi komponenkomponen pembentuk NADES.

IV.1

FS-H2O (2:1:19) FS-H2O (2:1:11)

Gambar IV.1 FS-H2O (2:1:19 dan 2:1:11) Tidak Stabil Komponen-komponen pembentuk NADES ditimbang sesuai dengan molar ratio yang telah ditentukan, dicampurkan dengan air (jumlah tertentu) hingga larut pada suhu 70 oC. Setelah diperoleh campuran liquida, selanjutnya campuran tersebut di masukkan ke dalam freeze dry hingga beratnya konstan (3 hari) dan diperoleh liquida bening-transparan yang kental. Selanjutnya dihitung kembali mol ratio air di dalam NADES yang terbentuk. Nilai mol ratio yang tercantum adalah nilai mol ratio masingmasing komponen penyusunnya secara berurutan; Sebagai contoh NADES fruktosa-glukosa-air (FG-H2O = 1:1:9) menunjukkan mol fruktosa = 1 mol, glukosa = 1 mol dan air = 9 mol. Oleh sebab itu, kandungan air dalam NADES tidak dapat ditentukan 41

diawal, karena air yang terikat dalam NADES adalah molekul air yang tertahan di dalam NADES setelah freeze dry (Gambar IV.1); selain itu tidak semua perbandingan mol ratio air menghasilkan NADES yang stabil (Gambar IV.1). Dalam hal ini, sebagai contoh pada pembuatan NADES, FG-H2O (1:1:9), NADES yang dihasilkan stabil, tetapi dengan ratio 1:1:4 terdapat pengendapan solid (Gambar IV.2). Terlihat NADES ((FG-H2O = 1:1:4) buram setelah 3-4 hari masa penyimpanan (Gambar IV.2).

FG-H2O (1:1:9) FG-H2O (1:1:4)

Gambar IV.2 FG-H2O (1:1:4) Campuran larutan liquida yang dihasilkan, dikatakan terbentuk menjadi NADES apabila setelah freeze dry (3 hari) tetap berupa liquida yang bening/transparan, tidak terbentuk endapan, ataupun terbentuk kristal dan stabil dalam waktu tertentu (3-7 hari). NADES stabil yang dihasilkan ini akan tetap stabil dan dapat disimpan pada suhu ruang hingga 3-12 bulan tanpa terjadi perubahan baik bentuk dan warna (Gambar IV.3).

Gambar IV.3 NADES yang dihasilkan (kiri ke kanan): FS-H2O (2:1:32) dan FG-H2O (1:1:10) 42

NADES dikatakan gagal (X) apabila dalam waktu tertentu campuran liquida tidak larut sempurna/tidak dapat larut, terdapat endapan ataupun terbentuk kristal (Gambar IV.1 dan Gambar IV.4). Sebagai contoh pada pembuatan NADES tipe basa Betaine-sukrosa-air (BS-H2O = 1:1:6) dan Betaine-glukosa-air (BG-H2O = 5:2:5). Pada BS-H2O (1:1:6), betaine tidak dapat larut dalam campuran betaine-sukrosa-H2O dalam berbagai perbandingan molar ratio air. Sedangkan pada BG-H2O (5:2:5), kristal terbentuk sesaat setelah campuran liquida dingin (suhu ruang). NADES tipe basa yang dipilih, gagal terbentuk (Gambar IV.4), oleh karena itu variabel NADES tipe basa beserta kandungan airnya tidak dapat dilakukan. NADES yang digunakan dalam penelitian ini ditampilkan pada Tabel IV.1. NADES dengan kandungan air yang lebih besar dipilih sebagai NADES dengan variabel kandungan air.

Gambar IV.4 Kombinasi BG-H2O (5:2:5) dan BS-H2O (1:1:6) tidak terbentuk NADES (terbentuk kristal maupun terbentuk endapan) Perbedaan mol ratio dari komponen-komponen pembentuk NADES, dapat mempengaruhi stabilitas NADES. Untuk memperoleh kestabilan dari NADES maka dilakukan percobaan dengan mengubah rasio molar dari air, peningkatan rasio molar air dilakukan dengan cara penambahan/pengenceran NADES dan jika ingin mengurangi rasio molar air dilakukan 43

freeze dry kembali hingga diperoleh NADES yang stabil. NADES dapat diencerkan (dengan penambahan air dalam molar tertentu) 25% hingga maksimum 50% tanpa kehilangan sifatnya sebagai NADES. Pengenceran lebih lanjut (>50%) akan menyebabkan hilangnya sifat NADES, akibat hilangnya ikatan hidrogen pada larutan (Choi et al., 2011; Dai et al., 2013) NADES dapat terbentuk karena adanya ikatan hidrogen antar molekul dari komponen-komponen pembentuknya. Penambahan jumlah air ataupun pengenceran terhadap NADES akan menimbulkan perubahan drastis dari stuktur NADES, kemungkinan besar karena putusnya ikatan hidrogen yang terbentuk (Choi et al., 2011; Dai et al., 2013, Dai et al., 2013a). NADES adalah suatu liquid kristal yang mana semua molekulnya tersusun melalui ikatan hidrogen dan gaya antar molekul lainnya (Dai et al., 2013). Sebagaimana yang ditunjukkan oleh Choi et al. (2011) dalam penelitiannya, adanya struktur yang lebih besar yang terbentuk pada malic acid-sucrose (MAS-H2O); demikian pada pada NADES: 1,2-propanediolcholine chloride (Dai et al., 2013) dan proline-malic acid (Dai et al., 2015). Pada 1,2-propanediol-choline chloride, ikatan hidrogen mungkin terbentuk antara gugus hidroksil dari 1,2propanediol dengan choline chloride (Dai et al., 2013); sedangkan ikatan hidrogen terbentuk antara gugus hidroksil malic acid dengan atom hidrogen pada gugus amina dari proline (Dai et al., 2015).

44

Table IV.1 NADES yang digunakan dalam penelitian ini Golongan

Netral

Asam

Basa

Komponen Fruktosa-glukosa-air (FG-H2O)* Fruktosa-glukosa-air (FG-H2O) Fruktosa-sukrosa-air (FS-H2O) Fruktosa-sukrosa-air (FS-H2O)

Mol rasio 1:1:09** 1:1:10 2:1:22 2:1:32

Ket √ √ √ √

Malic acid-glukosa-air (MAG-H2O) Malic acid-glukosa-air (MAG-H2O) Malic acid-sukrosa-air (MAS-H2O) Malic acid-sukrosa-air (MAS-H2O) Citric acid-sukrosa-air (CAS-H2O) Citric acid-sukrosa-air (CAS-H2O)

1:1:04 1:1:07 1:1:08 1:1:11 1:2:10 1:2:16

√ √ √ √ √ √

Betaine-sukrosa-air (BS-H2O) Betaine-glukosa-air (BG-H2O)

1:1:06 5:2:05

X*** X

*Singkatan yang dipakai pada NADES sbb: F = fruktosa, G = glukosa, S = sukrosa, MA = malic acid, CA = citric acid, dan B = betaine. **Nilai molar ratio secara berurutan sesuai dengan urutan komponen NADES. Contoh FG-H2O = 1:1:09, berturut-turut 1 adalah molar ratio untuk fruktosa (F), 1 untuk glukosa (G), dan 09 untuk air (H2O). ***X = NADES gagal terbentuk, dalam hal ini terjadi pengendapan ataupun pengkristalan.

CAS-H2O

MAS-H2O

Gambar IV.5 Perubahan warna CAS-H2O dan MAS-H2O Selain terjadinya pengendapan ataupun terbentuknya kristal, (Gambar IV.4), NADES yang mengandung sukrosa 45

mengalami perubahan warna beberapa saat setelah dilakukan pemanasan; perubahan warna dari kuning muda hingga kuningkecoklatan, Gambar IV.5. NADES yang mengandung sukrosa: CAS-H2O (1:2:10), CAS-H2O (1:2:16), MAS-H2O (1:1:8) dan MAS-H2O (1:1:11), namun uji FTIR yang dilakukan menunjukkan tidak adanya perubahan struktur pada NADES tersebut (Gambar IV.6 dan Gambar IV.7 ). Spektra FTIR baik untuk MAS-H2O (Gambar IV.6) maupun CAS-H2O (Gambar IV.7) hanya menunjukkan terjadinya sedikit pergeseran spektra. Terjadinya perubahan warna pada NADES yang mengandung sukrosa ini diduga karena terhidrolisanya sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Akan tetapi uji FTIR yang telah dilakukan tidak dapat mendeteksi ada/tidaknya gugus 1,4--glikosidik pada fruktosa. Sehingga diperlukan analisa metode lain (missal: FTIRRaman) untuk membuktikan dugaan terjadi/tidaknya hidrolisa sukrosa (Brizuela et al., 2012).

Malic acid

Sukrosa

46

Gambar IV.6 FTIR Spektra MAS-H2O jernih/tidak berubah warna (a); MAS-H2O yang berubah warna (b); sukrosa padat (c); dan malic acid padat (d).

Gambar IV.7 FTIR Spektra CAS-H2O berubah warna (a); sukrosa padat (b); dan citric acid padat (c). 47

Ekstraksi Curcuma mangga dengan Soxhlet dan Maserasi Pemilihan metode ekstraksi tergantung pada sifat bahan dan senyawa yang akan diisolasi. Ada beberapa teknik ekstraksi padat-cair yang tersedia. Teknik konvensional yang umum digunakan adalah ektraksi perendaman (maserasi), ekstraksi soxhlet dan perkolasi. Pada penelelitian ini dilakukan ekstraksi soxhlet dan ekstraksi perendaman (maserasi). Ekstraksi soxhlet adalah metode ekstraksi yang paling umum digunakan yang menghasilkan yield lebih tinggi daripada metode ekstraksi konvensional lainnya (Rastagno dan Prado., 2003). Metode ini dilakukan dengan menempatkan serbuk Curcuma mangga ke dalam thimbel, penggunaan thimble dimaksudkan supaya tidak terjadinya carry over (terikutnya serbuk Curcuma mangga ke dalam ruang sirkulasi siphon). Ekstraksi soxhlet dilakukan pada suhu 78 oC, pelarut yang menguap dikondensasikan (diembunkan) dalam kondensor. Penguapan dan kondensasi pelarut tersebut terjadi berulang-ulang hingga ruang sirkulasi penuh dan overflow. Proses ini dinamakan 1 sirkulasi, semakin banyak jumlah sirkulasi diharapkan semakin banyak senyawa target yang terekstrak sehingga proses ekstraksi dapat berjalan dengan maksimal. Selanjutnya, pelarut akan bercampur dengan sampel, serbuk Curcuma manga (40 g); mengekstrak (memisahkan/mengambil) senyawa yang diinginkan (curcuminoid). Terjadi 15x sirkulasi pada ekstraksi soxhlet yang dilakukan. Ekstraksi dihentikan saat warna pelarut pada extraction chamber telah jernih. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotary evaporator. Proses ekstraksi perendaman (maserasi) menempatkan bubuk Curcuma mangga (40 g) dan pelarut (etanol 96%) 250 mL dalam wadah tertutup (terlindung dari cahaya). Maserasi dilakukan pada suhu kamar disertai dengan pengadukan. Proses ekstraksi dihentikan ketika tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dengan konsentrasi dalam serbuk yang ditandai dengan jernihnya warna ekstrak yang IV.2

48

didapatkan. Kontak antara bubuk Curcuma mangga dan pelarut (etanol 96%) hingga terjadi kesetimbangan yaitu selama 15 hari. Setiap hari (1x24 jam) digunakan pelarut fresh sebanyak 250 mL. Lama waktu maserasi (15 hari) berdasarkan banyaknya sirkulasi yang terjadi pada ekstraksi soxhlet. Setelah proses maserasi, semua ekstrak yang diperoleh disatukan, disaring untuk selanjutnya filtrat yang didapat dipekatkan dengan rotary evaporator. Tabel IV.2 Yield Curcuminoid (mg/g) yang diekstrak Menggunakan Metode Konvensional Yield (mg/g*) Metode BDMC** DMC C Soxhlet 0,020 0,028 0,071 Maserasi 0,026 0,034 0,092 *yield dinyatakan sebagai mg senyawa bioaktif/g berat kering Curcuma mangga **bisdemethoxycurcumin (BDMC), demethoxycurcumin (DMC) dan curcumin (C)

Hasil analisa menunjukkan bahwa metode perendaman (maserasi) yield yang diperoleh lebih besar dibandingkan ekstraksi soxhlet baik yield untuk BDMC, DMC, dan C (Tabel IV.2). Kekurangan dari metode maserasi ini adalah memakan banyak waktu dan memerlukan lebih banyak jumlah pelarut dibandingkan metode soxhlet. Selain itu pada metode ekstraksi soxhlet, ekstraksi dilakukan pada titik didih pelarut terpilih (etanol, 78 oC), memungkinkan terjadinya degrdasi curcuminoid khususnya curcumin. Salem et al. (2014) menginformasikan bahwa curcumin stabil pada 10-55 oC dan akan terdegradasi pada 70 oC selama 24 jam. Kemungkinan terdegradasinya curcumin juga didukung dengan rendahnya yield curcuminoids yang diperoleh; Sandur et al. (2007) mendapatkan yield crude curcuminoids sebesar 50 mg/g pada ekstraksi rimpang Curcuma longa Thailand 49

menggunakan etanol (95%) selama 24 jam. Sedangkan Popuri dan Pagala (2013) hanya mendapatkan yield curcuminoids sebesar 26 mg/g dari ekstraksi rimpang Curcuma longa menggunakan etanol (95%) selama 1 jam. Ekstraksi Curcuma mangga dengan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) IV.3.1 Kalibrasi Curcuminoids menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Berikut HPLC (High Performance Liquid Chromatography) kromatogram standard curcuminoid (Gambar IV.8), bisdemethoxycurcumin (BDMC), demethoxycurcumin (DMC) dan curcumin (C) berturut-turut terlihat pada retention time (RT) 4,615; 5,096; dan 5,644 min. Spektrum bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin dan curcumin pada panjang gelombang 421,4 nm sebagaimana berikut (Gambar IV.9). IV.3

curcumin

demethoxycurcumin

bisdemethoxycurcumi n

Gambar IV.8 Kromatogram Curcuminoid standard pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography) pada konsentrasi curcuminoid 25,7 ppm (BDMC = 0,785 ppm; DMC = 4,750 ppm dan C = 20,166 ppm)

50

Gambar IV.9 Spektrum dari atas ke bawah: Bisdemethoxycurcumin (BDMC), Demethoxycurcumin (DMC) dan Curcumin (C) 51

Adapun kurva kalibrasi dari standar curcuminoid: bisdemethoxycurcumin (BDMC), demethoxycurcumin (DMC) dan curcumin (C) ditampilkan pada Gambar IV.10-Gambar IV.12. Hubungan antara kadar (ppm = mg/L) dan luas area untuk bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin dan curcumin berturut-turut: y = 137,2x + 1,598 (R2 = 0,997); y =146,0x + 7,993 (R2 = 0,999); y = 153,3x – 19,76 (R2 = 0,999) (Gambar IV.10-Gambar IV.12).

Gambar IV.10 Kurva Kalibrasi Bisdemethoxycurcumin (BDMC)

52

Gambar IV.11 Kurva Kalibrasi Demethoxycurcumin (DMC)

Gambar IV.12 Kurva Kalibrasi Curcumin (C) 53

curcumin

demethoxycurcumin

Gambar IV.13 Kromatogram Curcuminoid standar pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography) pada konsentrasi curcuminoid 0,028 ppm (BDMC = 0,001 ppm; DMC = 0,005 ppm dan C = 0,022 ppm)

Gambar IV.14 Kromatogram Curcuminoid standar pada HPLC (High Performance Liquid Chromatography) pada konsentrasi curcuminoid 0,0102 ppm (BDMC = 0,0003 ppm; DMC = 0,002 ppm dan C = 0,008 ppm) 54

IV.3.2 Ekstraksi Curcuma mangga menggunakan Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) Ekstraksi curcuminoid menggunakan NADES dari serbuk Curcuma mangga dilakukan pada berbagai macam NADES dan dibandingkan dengan etanol 96% dan air sebagai pelarut pembanding (Tabel IV.3). Etanol (96%) dan air dipilih sebagai pelarut pembanding mengingat etanol (96%) digunakan pada ekstrasi soxhlet dan maserasi selain juga banyak digunakan sebagai pelarut pada ekstraksi curcuminoids; sedangkan air dipilih mengingat NADES larut dengan baik dalam air. Hasil ekstraksi yang dilakukan ditampilkan pada Tabel IV.3. Hasil analisa menunjukkan bahwa ekstraksi dengan NADES, FS-H2O (2:1:32), dapat mengambil ekstrak curcuminoid lebih baik dibandingkan dengan etanol (96%) dan air. Sedangkan tidak terdeteksinya curcuminoid pada ekstrak NADES yang lainnya termasuk etanol (96%) dan air dimungkinkan oleh alasan berikut: (1) kadar curcuminoid yang terdeteksi diluar nilai kadar batas terkuantifikasi (Limit of Quantification, LOQ) dari kalibrasi kurva standard yang dilakukan; (2) curcuminoid memang benar tidak terekstrak oleh NADES. Oleh sebab itu, perlu dilakukan ekstraksi dengan nilai solid rasio yang lebih besar, >2 mg serbuk Curcuma manga/2 g NADES. Gambar IV.13 konsentrasi standard curcuminoid 0,028 ppm yang diinjeksikan, komposisi BDMC, DMC, dan C masingmasing sebesar 0,001 ppm; 0,005 ppm; dan 0,022 ppm, berurutan. Peak BDMC tidak terlihat, hanya terdapat peak DMC dan C. Hal ini menunjukkan bahwa Limit of Detection (LOD) dari BDMC adalah 0,001 ppm. Sedangkan pada konsentrasi curcuminoid 0,0102 ppm (Gambar IV.14) tidak didapatkan peak baik untuk BDMC, DMC, dan C; yang menunjukkan bahwa nilai LOD dari DMC dan C masing-masing yaitu 0,002 ppm dan 0,008 ppm. Sedangkan nilai Limit of Quantification (LOQ) dari masingmasing curcuminoids berdasarkan nilai konsentrasi terendah pada kurva kalibrasi curcuminoids yang telah dilakukan (Gambar IV.10-Gambar IV.12). 55

Tabel IV.3 Hasil Ekstraksi Curcuma mangga dengan NADES* NADES Konsentrasi (μg/μL) Mol rasio BDMC** DMC C Tipe NADES FG- H2O 1:1:9 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 FS-H2O 2:1:22 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 MAG-H2O 1:1:4 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 MAS-H2O 1:1:8 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 CAS-H2O 1:2:10 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 Kandungan Air FG- H2O 1:1:10 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 FS-H2O 2:1:32 < 1,56x10-5 1,75x10-5 3,98x10-4 MAG-H2O 1:1:7 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 MAS-H2O 1:1:11 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 CAS-H2O 1:2:16 < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 Pembanding Etanol < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 Air < 1,56x10-5 < 0,52x10-5 < 2,20x10-5 *Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan 2 mg serbuk Curcuma manga dan 2 mL NADES. **bisdemethoxycurcumin (BDMC), demethoxycurcumin (DMC) dan curcumin (C). Tidak terdeteksinya ataupun tidak terkuantifikasinya curcuminoids pada variable NADES selain FS-H2O (2:1:32) pada Tabel IV.3, dapat dihindari dengan menggunakan solid rasio sebagaimana telah diusulkan pada paragraph sebelumnya ataupun dengan menginjeksikan jumlah sampel yang lebih besar pada analisa HPLC, >20 μL/sampel/injeksi. Akan tetapi, injeksi sampel dalam jumlah lebih besar perlu dilakukan secara hati-hati untuk menghindari overloaded maupun terdepositnya sampel pada 56

coloumn HPLC. Oleh sebab itu, konsentrasi sampel yang akan diinjeksikan sebaiknya dikondisikan berada dalam range LOD dan LOQ (Tabel IV.4). Sehingga pada kurva kalibrasi sebaiknya diperbanyak pengambilan data pada konsentrasi rendah. Tabel IV.4 LOD dan LOQ pada kondisi analisa HPLC Konsentrasi (μg/μL) Curcuminoids LOD LOQ -6 BDMC 0,85x10 1,56x10-5 DMC 1,89x10-6 0,52x10-5 C 8,00x10-6 2,20x10-5 Terdapat perbedaan kemampuan mengekstraksi curcuminoid pada NADES, FS-H2O (2:1:32) dengan FS-H2O (2:1:22). Yang mana, FS-H2O (2:1:32) berhasil mengekstrak curcuminoid dalam range konsentrasi terkalibrasi (Tabel IV.3). Hal tersebut dimungkinkan adanya pengaruh air terhadap kemampuan NADES mengekstraksi curcuminoid; walaupun curcuminoid khususnya curcumin tidak larut dalam air (Salem et al., 2014). Peningkatan kandungan air dalam NADES FS-H2O akan meningkatkan kelarutan curcuminoid dalam NADES, mengingat semakin besar kandungan air dalam NADES maka viskositas/kekentalan NADES akan berkurang sehingga kontak/penetrasi pelarut kedalam matrik tanaman (serbuk Curcuma mangga) semakin baik. Tingginya viskositas dari NADES menimbulkan kesulitan dalam praktek ektraksi, yaitu akibat rendahnya mass-transfer pelarutan/ekstraksi senyawa target kedalam badan liquid pelarut/solvent (Dai et al., 2015). Yang mana kekurangan ini telah diminimalkan dengan melakukan pengenceran/penambahan air pada NADES yang dimaksud serta ditambahkan gaya eksternal berupa pengadukan menggunakan stirrer dan ekstraksi pada suhu 40 oC. Tabel IV.5 menunjukkan perolehan yield curcuminoid pada ekstraksi soxhlet, maserasi dan NADES (FS-H2O = 2:1:32). 57

Terlihat bahwa NADES (FS-H2O = 2:1:32) sebagai pelarut dapat mengekstraksi curcuminoid lebih banyak dibandingkan etanol (96%) baik secara ekxtraksi-soxhlet ataupun maserasi. Selain itu, FS-H2O (2:1:32) memberikan selektifitas curcumin yang lebih tinggi (96%-berat) dibandingkan etanol (96%); yang mana etanol hanya mampu mengektrak 60-61% curcumin, 22-23% DMC, dan sisanya BDMC. Sedangkan BDMC dan DMC kurang selektif terekstrak pada penggunaan FS-H2O (2:1:32) sebagai pelarut. Rohman, Abdul (2012) menjelaskan bahwa kandungan C, DMC, dan BDMC berturut-turut 60-80%, 15-30%, dan 2-6%-berat terhadap total curcuminoid di dalam rimpang Curcuma longa. Merujuk Dai et al. (2013), polaritas FS-H2O (2:1:32) didekati dengan menggunakan polaritas FGS-H2O (1:1:1:11); mengingat keduanya mengandung gula-gula. Polaritas FGS-H2O (1:1:1:11) dilaporkan sebesar 48,21 kcal/mol (nilai polaritas dilaporkan sebagai ENR), yang mana nilai kepolaran tersebut bernilai sama dengan polaritas air; sedangkan metanol yang bersifat sedikit kurang polar dibandingkan air memiliki nilai ENR = 51,89 kcal/mol. Walapun demikian, FS-H2O (2:1:32) berhasil mengekstrak curcumin (C) dan demethoxycurcumin (DMC), sedangkan air tidak. Selain itu, diperlukan pengukuran polaritas dari FS-H2O (2:1:32) itu sendiri, untuk mengetahui nilai polaritas yang sebenarnya.

58

Table IV.5 Yield Curcuminoid (mg/g) pada Berbagai Metode Ekstraksi Yield Curcuminoid (mg/g*) Total (%**) Metode Curcuminoid (mg/g) BDMC*** DMC C Soxhlet 0,020 (17) 0,028 (23)0,071 (60) 0,120 Maserasi 0,026 (17) 0,034 (22)0,092 (61) 0,152 NADES N.D**** 0,013 (4) 0,287 (96) 0,300 (FS-H2O = 2:1:32) *yield dinyatakan sebagai mg senyawa bioaktif/g berat kering Curcuma mangga **Prosentase berat terhadap total berat curcuminoid yang berhasil terekstrak. Curcuminoid = BDMC + DMC + C ***bisdemethoxycurcumin (BDMC), demethoxycurcumin (DMC) dan curcumin (C) ****N.D = not detected Selain polaritas pelarut, terdapat berbagai macam faktor yang mempengaruhi keberhasilan suatu ekstraksi dari matrix tanaman, diantaranya: sifat-sifat fisika-kimia senyawa target (seperti: polaritas, pKa, kelarutan), sifat-sifat fisika-kimia pelarut (seperti; densitas, viskositas, polaritas, pKa), letak/lokasi senyawa target didalam matrix tanaman, hidrofobisitas dan hidrofilisitas dari senyawa target (Rachmaniah et al., 2014). Mengingat curcumin (C) bersifat ionik, yang mana bentuknya didalam suatu pelarut tergantung pada pH lingkungannya (Salem et al., 2014) maka tingkat keasaman/kebasaan (pH) NADES juga diukur. Gambar IV.15 menunjukkan bentuk curcumin pada berbagai pH dan sebagai konsekuensi dari senyawa yang terprotonisasi, maka kelarutan curcumin akan meningkat dengan meningkatnya pH larutan, sehingga pada pH asam dan netral curcumin tidak larut dalam air. Tingkat keasaman/kebasaan (pH) NADES didekati dengan pengukuran pH pada NADES yang telah diencerkan 10x dengan aquadest. Pengenceran harus dilakukan mengingat sifat 59

NADES sangat kental/viskos, sehingga pengukuran pH secara langsung pada NADES tidak dimungkinkan. Tabel IV.6 menampilkan pH NADES pada 10x pengenceran. Kelarutan curcumin di dalam air akan meningkat dalam kondisi alkali sementara itu praktis tidak larut dalam air pada pH asam dan netral (Salem et al., 2014) Namun Tabel IV.6 menunjukkan bahwa curcumin dapat larut dan terektrak pada FS-H2O (2:1:32) yang memiliki pH = 6 (netral) dan benar curcumin tidak didapatkan pada ekstrak NADES MAG-H2O, MAS-H2O, dan CAS-H2O yang memiliki pH asam (pH = 2). Hal ini menunjukkan bahwa NADES memiliki karakteristik lain yang tidak sama dengan komponen-komponen pembentuknya.

Gambar IV.15 Bentuk curcumin (C) pada berbagai pH: berbentuk terprotonisasi pada lingkungan asam (pH <1); berbentuk netral pada pH 1-7; dan berbentuk deprotonisasi pada pH>7,5 (Salem et al., 2014; Fagundes et al., 2015).

60

Table IV.6 Pengukuran pH* NADES Variabel Rasio pH Tipe NADES FG-H2O 1:1:9 6 Netral FS-H2O 2:1:22 6 MAG-H2O 1:1:4 2 MAS-H2O 1:1:8 2 Asam CAS-H2O 1:2:10 2 Kandungan Air FG-H2O 1:1:10 6 Netral FS-H2O 2:1:32 6 MAG-H2O 1:1:7 2 MAS-H2O 1:1:11 2 Asam CAS-H2O 1:2:16 2 *merupakan nilai pendekatan pH; diukur pada NADES yang telah diencerkan 10x dengan aquadest. Melihat kandungan curcuminoids terekstrak yang sangat kecil (Tabel IV.3), maka dilakukan kembali ekstraksi curcuminoids dengan NADES menggunakan 5 mg serbuk Curcuma manga/ 2 gr NADES, selama 1x24 jam, pada 40 oC. Penggunaan ratio solid yang lebih besar, diharapkan akan diperoleh ekstrak yang lebih pekat sehingga lebih mudah untuk dianalisa baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan MAS-H2O (1:1:11) dan CASH2O (1:2:16) sebagai pelarut serta etanol (96%) dan air sebagai pelarut pembanding. Deteksi Rf pada bisdemethoxycurcumin (BDMC), demethoxycurcumin (DMC) dan curcumin (C) mengikuti literatur (Fagundes et al., 2015). Hasil analisa lempeng Thin Layer Chromatography (TLC) menunjukkan bahwa tidak ada curcuminoids yang terekstrak baik pada etanol (96%) maupun air (Gambar IV.16); sedangkan pada MAS-H2O (1:1:11), CAS-H2O (1:2:16) terlihat 61

adanya spot curcumin (C) dan bisdemethoxycurcumin (BDMC), menunjukkan bahwa C dan BDMC terektrak oleh MAS-H2O (1:1:11) dan CAS-H2O (1:2:16) (Gambar IV.17). MAS-H2O (1:1:11) dan CAS-H2O (1:2:16) menunjukkan selektifitas yang berbeda dibandingkan dengan FS-H2O (2:1:32). MAS-H2O (1:1:11) dan CAS-H2O (1:2:16) lebih selektif terhadap BDMC dibandingkan C; sedangkan FS-H2O (2:1:32) lebih selektif terhadap C dibandingkan DMC (Tabel IV.5). BDMC lebih larut pada MAS-H2O (1:1:11) dan CAS-H2O (1:2:16) yang bersifat asam (pH = 2, Tabel IV.6) dibandingkan curcumin.

Curcumin (C) Demethoxycurcumin Bisdemethoxycurcumin (DMC)

Gambar IV.16 Penampakan lempeng Thin Layer Chromatography (TLC): (1) disemprot menggunakan 20% H2SO4 dalam etanol (v/v); (2) penampakan bercak pada 365 nm. Legenda: S = standar curcuminoids, E = ekstrak etanol, dan A = ekstrak air. Ekstraksi dilakukan menggunakan 5 mg serbuk Curcuma mangga/ 2 gr pelarut, 1x24 jam, 40 oC, sampel yang ditotolkan 50 L.

62

Curcumin (C) Demethoxycurcumin (DMC) Bisdemethoxycurcumin (BDMC)

Gambar IV.17 Penampakan lempeng Thin Layer Chromatography (TLC): (1) disemprot menggunakan 20% H2SO4 dalam etanol (v/v); (2) penampakan bercak pada 365 nm; (3) penampakan bercak pada 254 nm. Legenda: S = standar curcuminoids, M = ekstrak MAS-H2O (1:1:11), dan C = ekstrak CAS-H2O (1:2:16). Ekstraksi dilakukan menggunakan 5 mg serbuk Curcuma manga/ 2 gr NADES, 1x24 jam, 40 oC, sampel yang ditotolkan 50 L.

Curcumin (C) Demethoxycurcumin (DMC) Bisdemethoxycurcumin (BDMC)

Gambar IV.18 Penampakan lempeng Thin Layer Chromatography (TLC) setelah dilakukan penyemprotan bercak dengan 20% H2SO4 dalam etanol (v/v). Legenda: S = standar curcuminoids, F1 = ekstrak FS-H2O 1x24 jam, F2 = ekstrak FS-H2O 2x24 jam, F3 = ekstrak FS-H2O 3x24 jam, dan F4 = ekstrak FS-H2O 4x24 jam. Ekstraksi dilakukan menggunakan 2 mg serbuk Curcuma manga/ 2gr NADES, 40 o C, sampel yang ditotolkan 50 L. 63

Pengaruh waktu ektraksi terhadap perolehan yield curcuminoids terekstrak juga diteliti lebih lanjut menggunakan lempeng TLC (Gambar IV.18). Hasil lempeng TLC menunjukkan adanya DMC terekstrak pada NADES, FS-H2O (2:1:32); akan tetapi waktu ekstraksi tidak banyak mempengaruhi besaran nilai DMC terekstrak, mengingat seragamnya intensitas titik DMC baik pada 1x24 jam waktu ekstraksi hingga 4x24 jam waktu ekstraksi. Gambar IV. 18, hasil TLC, juga menunjukkan bahwa FS-H2O (2:1:32) lebih selektif pada DMC. Hal ini tidak sesuai dengan hasil dari analisa HPLC bahwa FS-H2O (2:1:32) lebih selektif terhadap curcumin dibandingkan terhdap DMC maupun BDMC (Tabel IV.4). Adanya perbedaan tersebut, tidak dapat kami jelaskan lebih lanjut. IV.4 Sifat-sifat Fisik Natural Deep Eutectic Solvents (NADES) Sifat-sifat fisika NADES yang dapat terukur yaitu densitas, viskositas, suhu dekomposisi, suhu glass, pH dan polaritas. Mengingat terdapatnya keterbatasan dalam hal analisa, maka hanya sifat fisika berupa densitas dan suhu dekomposisi yang dilaporkan (Tabel IV.7). Secara umum, semua NADES memiliki densitas yang lebih besar dibandingkan dengan densitas air (1 g/mL). Terlihat bahwa semakin besar kandungan air di dalam NADES, maka densitas NADES akan semakin menurun. Selain itu, NADES memiliki sifat yang sangat kental (viskositas tinggi), walaupun tetap berupa liquid pada suhu ruang (30 oC) dan bahkan pada suhu rendah (18 oC). Hal tersebut menunjukkan bahwa NADES berbentuk liquid kristal dan akan tetap berada pada bentuk liquid pada rentang suhu yang lebar, hingga -100 oC NADES dilaporkan tetap berbentuk liquid dan terdekomposisi pada >200 oC (Dai et al., 2013). Viskositas NADES menurun dengan peningkatan suhu, dan menurun secara signifikan dengan penambahan air. Sebaliknya, viskositas NADES akan meningkat dengan turunnya suhu penyimpanan. 64

Tabel IV.7 Densitas NADES Kandungan Mol Densitas Tdekomposisi Golongan Komponen Air rasio (g/mL) (oC) (%-berat) FG- H2O 1:1:09 28 1,3223 >122,47 FG- H2O 1:1:10 30 1,3469 >129,08 Netral FS-H2O 2:1:22 32 1,3825 >131,47 FS-H2O 2:1:32 41 1,3529 >118,58 MAG-H2O 1:1:04 19 1,3757 >222,68 MAG-H2O 1:1:07 28 1,3552 >128,90 Asam MAS-H2O 1:1:08 23 1,3949 >134,16 MAS-H2O 1:1:11 33 1,3424 >127,12 CAS-H2O 1:2:10 19 1,4267 >128,87 CAS-H2O 1:2:16 26 1,3696 >127,07 Tabel IV.7 juga menunjukkan suhu dekomposisi NADES. Dekomposisi NADES terjadi karena berkurangnya kandungan air didalam NADES tersebut, sehingga ikatan hidrogen yang terbentuk menjadi rusak dan bentuk liquid kristal tidak tercapai (Dai et al., 2013). NADES dengan mol rasio air lebih tinggi lebih cepat terdekomposisi. NADES dengan mol rasio air terendah, MAG-H2O (1:1:4) memiliki suhu dekomposisi tertinggi. Hal ini menunjukkan bahwa NADES dapat digunakan sebagai solvent pada suhu 0 oC hingga 120 oC.

65

Halaman ini sengaja dikosongkan

66

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN V.1

Kesimpulan Dari penelitian ekstraksi senyawa bioaktif dari rimpang Curcuma mangga menggunakan pelarut ramah lingkungan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa : 1. Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) (FS-H2O = 2:1:32) dapat digunakan sebagai pelarut dalam ekstraksi senyawa bioaktif berupa curcuminoid terutama curcumin dari Curcuma mangga. 2. Yield senyawa bioaktif Curcuma mangga (curcuminoid) secara ekstraksi menggunakan Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) diperoleh 0,344 mg senyawa bioaktif/g berat kering Curcuma mangga; secara ekstraksi Soxhlet diperoleh 0,120 mg senyawa bioaktif/g berat kering Curcuma mangga dan secara maserasi 0,152 mg senyawa bioaktif/g berat kering Curcuma mangga. 3. Ekstraksi senyawa bioaktif (curcuminoid) dengan NADES FS-H2O = 2:1:32 memberikan yield lebih besar dibandingkan dengan ekstraksi menggunakan etanol ataupun air (waktu dan suhu ekstraksi yang sama, 1x24 jam; 40oC) V.2

Saran 1. Pada penelitian selanjutkan dilakukan pembuatan NADES tipe basa dengan komponen yang berbeda. 2. Menambahkan kuantitas (banyaknya) bahan baku serbuk Curcuma mangga yang digunakan untuk ekstraksi.

67

Halaman ini sengaja dikosongkan

68

DAFTAR PUSTAKA Abas, Faridah. 2005. ‘Phytocemical and Biologycal Activity Studies of Cosmos Caudatus and Curcuma Mangga and the Online Characterization of Bioactive Fraction from Melicope Ptelefolia’. Universiti Putra Malaysia. Anand P, Kunnumakkara AB, Newman RA, and Aggarwal BB. 2007. ‘Bioavailability of Curcumin: Problems and Promises’. Molecular Pharmaceutics 4: 807–18. Anderson, Andrew M, Matthew S Mitchell, and Ram S Mohan. 2000. ‘Isolation of Curcumin from Turmeric’. Journal of Chemical Education 77 (3): 359–60. Atun, Sri, Retno Arianingrum, Eddy Sulistyowati, and Nurfina Aznam. 2013. ‘Isolation and Antimutagenic Activity of Some Flavanone Compounds from Kaempferia Rotunda’. International Journal of Chemical and Analytical Science 4 (1): 3–8. doi:10.1016/j.ijcas.2013.03.004. Bagchi, Anamika. 2012. ‘Extraction of Curcumin’. IOSR Journal of Environmental Science, Toxicology and Food Technology (IOSR-JESTFT) 1 (3). www.iosrjournals.org. Bar-Sela G, Epelbaum R, and Schaffer M. 2010. ‘Curcumin as an AntiCancer Agent: Review of the Gap Between Basic and Clinical Applications’. Current Medicinal Chemistry 17: 190–97. Brizuela, Alicia Beatriz, Laura Cecilia Bichara, Elida Romano, Alisia Yurquina, Silvano Locatelli, and Silvia Antonia Brandán. 2012. ‘A Complete Characterization of the Vibrational Spectra of Sucrose’. Carbohydrate Research 361 (November): 212–18. doi:10.1016/j.carres.2012.07.009. Castro, M.D.Luque de, and L.E.Garcia Ayuso. 2000. ‘Enviromental Applications/Soxhlet Extraction’. Academic Press University of Cordoba, 2701–9. Choi, Young Hae, Jaap van Spronsen, Yuntao Dai, Marianne Verberne, Frank Hollmann, and Isabel W.C.E. Arends. 2011. ‘Are Natural Deep Eutectic Solvents the Missing Link in Understanding Cellular Metabolism and Physiology?’ American Society of Plant Biologists 156: 1701–1705. Dai, Yuntao, Jaap van Spronsen, Geert-Jan Witkamp, Robert Verpoorte, and Young Hae Choi. 2013. ‘Natural Deep Eutectic Solvents as

xiv

New Potential Media for Green Technology’. Analytica Chimica Acta, 61–68. Dai, Yuntao, Geert-Jan Witkamp, Robert Verpoorte, and Young Hae Choi. 2013a. 'Natural Deep Eutectic Solvents as A New Extraction Media for Phenolic Metabolites in Carthamus tinctorius L'. Analytical Chemistry, 6272-6278. Dai, Yuntao, Geert-Jan Witkamp, Robert Verpoorte, and Young Hae Choi. 2015. 'Tailoring Properties of Natural Deep Eutectic Solvents with Water to Facilitate their Applications'. Food Chemistry, 14-19. Deetlefs, Maggel, and Kenneth R Seddon. 2010. ‘Assessing the Greenness of Some Typical Laboratory Ionic Liquid Preparations’. Green Chemistry 12: 17–30. doi:10.1039/b915049h. Domínguez de María, Pablo, and Zaira Maugeri. 2011. ‘Ionic Liquids in Biotransformations: From Proof-of-Concept to Emerging DeepEutectic-Solvents’. Current Opinion in Chemical Biology, Biocatalysis and Biotransformation/Bioinorganic Chemistry, 15 (2): 220–25. doi:10.1016/j.cbpa.2010.11.008. Fagundes, Thayssa da S. F, Karen Danielle B Dutra, Carlos Magno R Ribeiro, Rosângela de A. Epifanio, and Alessandra L. Valverde. 2015. ‘Using a Sequence of Experiments with Turmeric Pigments from Food To Teach Extraction, Distillation, and Thin-Layer Chromatography to Introductory Organic Chemistry Students’. Journal of Chemical Education. doi:10.1021/acs.jchemed.5b00138. Gorke, Johnathan, Friedrich Srienc, and Romas Kazlauskas. 2010. ‘Toward Advanced Ionic Liquids. Polar, Enzyme-Friendly Solvents for Biocatalysis’. Biotechnology and Bioprocess Engineering 15: 40–53. Guddadarangavvanahally, Jayaprakasha, Mohan Rao Lingamullu Jagan, and Sakariah Kunnumpurath K. 2002. ‘Improved HPLC Method for the Determination of Curcumin, Demethoxycurcumin, and Bisdemethoxycurcumin’. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50: 3668–82. Guo, Wujie, Yucui Hou, Weize Wu, Shuhang Ren, Shidong Tian, and Kenneth N. Marsh. 2013. ‘Separation of Phenol from Model Oils with Quaternary Ammonium Salts via Forming Deep

xv

Eutectic Solvents’. Green Chemistry 15: 226–29. doi:10.1039/c2gc36602a. Horkey, Adam. 2013. ‘Rapid Analysis of Curcuminoids in Turmeric Extract Using the Agilent 1290 Infinity LC and STM Columns’. Agilent Technologies, 1–4. Huang, Wei, Shaokun Tang, Hua Zhao, and Songjiang Tian. 2013. ‘Activation of Commercial CaO for Biodiesel Production from Rapeseed Oil Using a Novel Deep Eutectic Solven’. Industrial & Engineering Chemistry Research 52: 11943−11947. Hutapea, Johnny Ria. 1993. Inventaris Tanaman Obat Indonesia (II). Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Jayandran, Muhamed Haneefa, and Balasubramanian. 2015. ‘Synthesis Characterization and Comparative Studies Of Turmeric Oleoresin Derived From Selected Turmeric Plants’. Asian Journal of Pharmaceutical Science & Technology 5 (1): 18–21. Lestari, Maria L.A.D., and Gunawan Indrayanto. 2014. ‘Chapter Three Curcumin’. In Profiles of Drug Substances, Excipients and Related Methodology, edited by Harry G. Brittain, Volume 39:113–204. Academic Press. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128001 738000039. Malek, Sri Nurestri A., Guan Serm Lee, Sok Lai Hong, Hashim Yaacob, Norhanom Abdul Wahab, Jean-Frederic Faizal Weber, and Syed Adnan Ali Shah. 2011. ‘Phytochemical and Cytotoxic Investigations of Curcuma Mangga Rhizomes’. Molecules, no. 16: 4539–48. doi:10.3390/molecules16064539. Mangan, Yellia. 2003. Cara Bijak Menaklukkan Kanker. AgroMedia. Mukhriani. 2014. ‘Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, Dan Identifikasi Senyawa Aktif’. Jurnal Kesehatan 7 (2): 361–67. Mushtaq, Mian Yahya, Young Hae Choi, Robert Verpoorte, and Erica G. Wilson. 2014. ‘Extraction for Metabolomics: Access to The Metabolome’. Phytochemical Analyis 25: 291–306. Nabati, Mehdi, Mehrdad Mahkam, and Hassan Heidari. 2014. ‘Isolation and Characterization of Curcumin from Powdered Rhizomes of Turmeric Plant Marketed in Maragheh City of Iran with Soxhlet Technique’. Iranian Chemical Communication 2: 236– 43. Park, Ha Eun, Baokun Tang, and Kyung Ho Row. 2014. ‘Application of Deep Eutectic Solvents as Additives in Ultrasonic Extraction of

xvi

Two Phenolic Acids from Herba Artemisiae Scopariae’. Analytical Letters, 1476–84. doi:10.1080/00032719.2013.874016. Paulucci, Viviane P., Renê O. Couto, Cristiane C. C. Teixeira, and Luis Alexandre P. Freitas. 2013. ‘Optimization of the Extraction of Curcumin from Curcuma Longa Rhizomes’. Revista Brasileira de Farmacognosia 23 (1): 94–100. doi:10.1590/S0102695X2012005000117. Popuri, Asok Kumar, and Bangaraiah Pagala. 2013. ‘Extraction of Curcumin From Tumeric Roots’. International Journal of Innovative Research & Studies 2 (5). Pushpakumari, K.N, Varghese Naijo, and Kottol Kavitha. 2014. ‘Purification And Seperation Of Individual Curcuminoids From Spent Turmeric Oleoresin, A By- Product From Curcumin Production Industry’. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research 5 (8): 3246–54. doi:10.13040/IJPSR.0975-8232.5(8).3246-54. Putra, Effendy De Lux. 2004. ‘Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi’. USU Digital Library. Rachmaniah Orchidea, Young Hae Choi, Erica G. Wilson, Robert Verpoorte, and Geert-Jan Witkamp. 2014. ‘Solubility Study of Galanthamine-HBr in Natural Deep Eutectic Solvent (NADES) Solubility Study of Galanthamine-HBr in Natural Deep Eutectic Solvent (NADES)’, 115–128. Rastagno, Mauricio, and Juliana Prado. 2003. Natural Product Extraction. RSC Publishing. Revathy, S, S Elumalai, Merina Benny, and Benny Antony. 2011. ‘Isolation, Purification and Identification of Curcuminoids from Turmeric (Curcuma Longa L.) by Column Chromatography’. Journal of Experimental Sciences 2 (7): 21–25. Rohman, Abdul. 2012. 'Mini Review Analysis of Curcuminoidds in Food and Pharmaceutical Products'. International Food Research Journal 19 (1): 19-27. Saefudin, Fauzia Syarif, and Chairul. 2014. ‘Potensi Antioksidan Dan Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Kunyit Putih (Curcuma Zedoaria Rosc.) Pada Sel Hela’. Pusat Penelitian Biologi-LIPI 17 (3): 381–90. Salem, M, S Rohani, and E.R Gillies. 2014. ‘Curcumin, a Promising Anti-Cancer Therapeutic: A Review of Its Chemical Properties,

xvii

Bioactivity and Approaches to Cancer Cell Delivery’. Royal Society of Chemistry Advance 4, 10815–10829. Shahbaz, K., F. S. Mjalli, M. A. Hashim, and I. M. AlNashef. 2011. ‘Eutectic Solvents for the Removal of Residual Palm Oil-Based Biodiesel Catalyst’. Separation and Purification Technology 81 (2): 216–22. doi:10.1016/j.seppur.2011.07.032. Shahbaz, K., F. S. Mjalli, M. A. Hashim, and I. M. AlNashef. 2013. ‘Elimination of All Free Glycerol and Reduction of Total Glycerol from Palm Oil-Based Biodiesel Using Non- Glycerol Based Deep Eutectic Solvents’. Separation and Purification Technology 48: 1184–1193. doi:10.1080/01496395.2012.731124. Syed, Haroon Khalid, Kai Bin Liew, Gabriel Onn Kit Loh, and Kok Khiang Peh. 2015. ‘Stability Indicating HPLC–UV Method for Detection of Curcumin in Curcuma Longa Extract and Emulsion Formulation’. Food Chemistry 170 (March): 321–26. doi:10.1016/j.foodchem.2014.08.066. Tang, Baokun, Yu Jin Lee, Ha Eun Park, and Kyung Ho Row. 2014. ‘Pretreatment of Biodiesel by Esterification of Palmitic Acid in Brønsted–Lowry Acid Based Deep Eutectic Solvents’. Analytical Letters. Thuy Pham, Thi Phuong, Chul-Woong Cho, and Yeoung-Sang Yun. 2010. ‘Environmental Fate and Toxicity of Ionic Liquids: A Review’. Water Research, Emerging Contaminants in water: Occurrence, fate, removal and assessment in the water cycle (from wastewater to drinking water), 44 (2): 352–72. doi:10.1016/j.watres.2009.09.030. Tracy, Mark. 2013. ‘Separation of Curcuminoids from Turmeric – Comparison of Polar Embedded and C18 Solid HPLC Core Columns’. Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA. Wahyuni, A Hardjono, and Paskalina Hariyantiwasi Yamrewav. 2004. ‘Ekstraksi Kurkumin Dari Kunyit’. Prosiding Seminar Nasional Rekayasa Kimia Dan Proses. Wichitnithad, Wisut, Nutthapon Jongaroonngamsang, Sunibhond Pummangura, and Pornchai Rojsitthisak. 2009. ‘A Simple Isocratic HPLC Method for the Simultaneous Determination of Curcuminoids in Commercial Turmeric Extracts’. Wiley Interscience 20: 314–319. doi:10.1002/pca.1129.

xviii

Windono, Tri, and Nani Parfati. 2002. ‘Curcuma Zedoaria (Berg Ius) Roscoem Kajian Pustaka Kandungan Kimia Dan Aktivitas Farmakologik’. Fakultas Farmasi Universitas Surabaya. Wood, Nicola, and Gill Stephens. 2010. ‘Accelerating the Discovery of Biocompatible Ionic Liquids’. Physical Chemistry Chemical Physics 12: 1670–74. Zhang, Heng, Baokun Tang, and Kyung Ho Row. 2014. ‘Extraction of Catechin Compounds from Green Tea with a New Green Solvent’. Chem. Res. Chin. Univ 30 (1): 37–41. doi:10.1007/s40242=014-3339-0. Zhang, Qi, David Thomas, and Ian Acworth. 2013. ‘The Quantitative Analysis of Curcuminoids in Food and Food Additives Using Rapid HPLC With Electrochemical, UV, or Fluorescence Detection’. Thermo Fisher Scientific, Chelmsford, MA, USA.

xix

APPENDIKS A PERHITUNGAN PEMBUATAN NADES A.1 Mol Rasio untuk Variabel Tipe NADES Contoh perhitungan menggunakan NADES (MAG-H2O) Berat gelas kimia kosong = 97,4296 gram Berat Malic Acid = 25,4682 gram Berat Glukosa = 37,6390 gram Berat air (H2O) = 39,0663 gram Total NADES

= Berat Malic Acid + Berat Glukosa + Berat air (H2O) = 25,4682 gram + 37,6390 gram + 39,0663 gram = 102,1735 gram

Menghitung fraksi massa Fraksi massa Malic Acid

Fraksi massa Glukosa

Fraksi massa air (H2O)

Menghitung mol Mol Malic Acid

A-1

Mol Glukosa

Mol air (H2O)

Total mol = Mol Malic Acid + Mol Glukosa + Mol air (H2O) = 0,1899 mol + 0,1899 mol + 2,1704 mol = 2,5502 mol Menghitung fraksi mol Fraksi mol Malic Acid

Fraksi mol Glukosa

Fraksi mol air (H2O)

Menghitung mol rasio Mol rasio Malic Acid Mol rasio Glukosa Mol rasio air (H2O)

A-2

Massa NADES sebelum freeze dry Berat gelas kimia + NADES = 191,8597 gram Berat NADES

= (Berat gelas kimia + NADES) - Berat gelas kimia kosong = 191,8597 gram - 97,4296 gram = 94,4301 gram Massa Malic Acid = fraksi massa Malic Acid x berat NADES = 0,2493 x 94,4301 gram = 23,5380 gram Massa Glukosa = fraksi massa Glukosa x berat NADES = 0,3684 x 94,4301 gram = 34,7865 gram Massa air (H2O) = fraksi massa air (H2O) x berat NADES = 0,3824 x 94,4301 gram = 36,1056 gram Massa NADES setelah freeze dry selama 3 hari Berat gelas kimia + NADES = 169,4096 gram Berat NADES

= (Berat gelas kimia + NADES) - Berat gelas kimia kosong = 169,4096 gram - 97,4296 gram = 71,9800 gram

Massa Malic Acid = Massa Malic Acid sebelum freeze dry = 23,5380 gram Massa Glukosa = Massa Glukosa sebelum freeze dry = 34,7865 gram Massa air (H2O) = Berat NADES - Massa Malic Acid Massa Glukosa

A-3

= (71,9800 - 23,5380 - 34,7865) gram = 13,6555 gram Menghitung fraksi massa Fraksi massa Malic Acid

Fraksi massa Glukosa

Fraksi massa air (H2O)

Menghitung mol Mol Malic Acid

Mol Glukosa

Mol air (H2O)

Total mol = Mol Malic Acid + Mol Glukosa + Mol air (H2O) = 0,1755 mol + 0,1755 mol + 0,7586 mol = 1,1097 mol

A-4

Menghitung fraksi mol Fraksi mol Malic Acid

Fraksi mol Glukosa

Fraksi mol air (H2O)

Menghitung mol rasio Mol rasio Malic Acid

Mol rasio Glukosa

Mol rasio air (H2O)

A-5

Tabel A.1 Mol Rasio untuk Variabel Tipe NADES MAG-H2O(1:1:5) Gelas kimia 97.4296 kosong Asam Maleat 25.4682 Glukosa 37.6390 Air 39.0663 TOTAL NADES 102.1735

BM

mass mol mol Mol fraction fraction ratio

gr gr 134.09 0.2493 0.1899 0.0745 1 gr 198.17 0.3684 0.1899 0.0745 1 gr 18 0.3824 2.1704 0.8510 11 gr

1.0000 2.5502 1.0000

Sebelum Freeze Dry Beaker+Nades 191.8597 gr Nades Only 94.4301 gr Asam Maleat Glukosa Air

23.5380 gr 34.7865 gr 36.1056 gr

Setelah Freeze Dry (3 Hari) Beaker+Nades 169.4096 gr Nades Only

71.9800 gr

Asam Maleat Glukosa

23.5380 gr 134.09 0.3270 0.1755 0.1582 34.7865 gr 198.17 0.4833 0.1755 0.1582

BM

A-6

mass mol mol mol fraction fraction ratio 1 1

Air

13.6555 gr

18

0.1897 0.7586 0.6836 1.0000 1.1097 1.0000

4

A.2 Mol Rasio untuk Variabel Kandungan Air Contoh perhitungan menggunakan NADES (MA-G-H2O) Berat gelas kimia kosong = 91,1405 gram Berat NADES = 17, 8153 gram (Dari hasil Variabel Tipe NADES) Berat Malic Acid = Berat NADES x fraksi massa Malic Acid setelah freeze dry = 17, 8153 gram x 0,3270 = 5,8257 gram Berat Glukosa = Berat NADES x fraksi massa Glukosa setelah freeze dry = 17, 8153 gram x 0,4833 = 8,6098 gram Berat air (H2O) = Berat NADES x fraksi massa air (H2O) setelah freeze dry = 17, 8153 gram x 0,1897 = 3,3798 gram Penambahan air (H2O) sebanyak 2,0633 gram Sehingga, total NADES menjadi = (17, 8153 + 2,0633) gram = 19,8786 gram Menghitung fraksi massa Fraksi massa Malic Acid

A-7

Fraksi massa Glukosa

Fraksi massa air (H2O)

Menghitung mol Mol Malic Acid

Mol Glukosa

Mol air (H2O)

Total mol = Mol Malic Acid + Mol Glukosa + Mol air (H2O) = 0,0434 mol + 0,0434 mol + 0,3042 mol = 0,3893 mol Menghitung fraksi mol Fraksi mol Malic Acid

A-8

Fraksi mol Glukosa

Fraksi mol air (H2O)

Menghitung mol rasio Mol rasio Malic Acid

Mol rasio Glukosa

Mol rasio air (H2O)

Tabel A.2 Mol Rasio untuk Variabel Kandungan Air Botol kimia 91.1405 gr Nades Only 17.8153 gr Stirrer 5.0887 gr mass mol mol BM mol fraction fractionratio Asam Maleat Glukosa Air

5.8257 gr 134.09 0.2931 8.6098 gr 198.17 0.4331 3.3798 gr 18 0.2738 1.0000

A-9

0.0434 0.0434 0.3024 0.3893

0.1116 1 0.1116 1 0.7768 7 1.0000

Penambahan Air 2.0633 gr Total NADES 19.8786 gr

APPENDIKS B PERHITUNGAN DENSITAS NADES B.1 Densitas NADES Menghitung densitas NADES (FS-H2O) Dimana : Berat pikno kosong = 15,8333 gram Berat pikno + NADES = 29,3626 gram Volume pikno = 10 mL

Perhitungan dengan cara yang sama dilakukan untuk NADES lainnya.

A-10

Tabel B.1 Densitas NADES Berat Pikno Berat Pikno + Berat NADES kosong NADES NADES (gram) (gram) (gram) CAS-H2O* 15,8328 30,0998 14,2670 CAS-H2O** 15,8325 29,5289 13,6964 FG-H2O* 15,8345 29,0573 13,2228 FG-H2O** 15,8333 29,3027 13,4694 MAS-H2O* 15,1827 29,1316 13,9489 MAS-H2O** 15,8313 29,2551 13,4238 MAG-H2O* 15,8325 29,5892 13,7567 MAG-H2O** 15,8577 29,4101 13,5524 FS-H2O* 15,1883 29,0136 13,8253 FS-H2O** 15,8333 29,3626 13,5293 Ket : * Variabel Tipe NADES ** Variabel Kandungan Air

A-11

Denstias (g/ml) 1,4267 1,3696 1,3223 1,3469 1,3949 1,3424 1,3757 1,3552 1,3825 1,3529

APPENDIKS C PERHITUNGAN JUMLAH CURCUMINOID DARI EKSTRAKSI RIMPANG CURCUMA MANGGA C.1 Kurva Kalibrasi

A-12

Gambar C.1 Kurva Kalibrasi Bisdemethoxycurcumin (BDMC)

Gambar C.2 Kurva Kalibrasi Demethoxycurcumin (DMC)

A-13

Gambar C.3 Kurva Kalibrasi Curcumin (C) C.2 Jumlah Curcuminoid Menghitung yield ekstrak curcuminoid menggunakan NADES (FS-H2O) Berat Curcuma mangga = 2,07 mg = 0,00207 gram Berat NADES (FS-H2O) = 2,0191 gram Volume NADES (FS-H2O)

Areacurcuminoid (dari hasil HPLC) masing-masing  Area bisdemethoxycurcumin = 0 mAU.s  Area demethoxycurcumin = 10,91663 mAU.s  Area curcumin = 40,23962mAU.s

A-14

Untuk menghitung kadar sampel ektrak, digunakan persamaan kurva kalibrasi yang diperoleh dimana sumbu y merupakan respon area (mAU.s) dan sumbu x merupakan kadar (ppm).  Bisdemethoxycurcumin (BDMC) Persamaan kurva kalibrasi y = 137,2x + 1,598

 Demethoxycurcumin (DMC) Persamaan kurva kalibrasi y =146,0x +7,993

 Curcumin (C) Persamaan kurva kalibrasi y = 153,3x – 19,76

A-15

Perhitungan yield curcuminoid :  Bisdemethoxycurcumin (BDMC)

= - 0,008 mg/g

 Demethoxycurcumin (DMC)

= 0,014 mg/g  Curcumin (C)

= 0,282 mg/g

A-16

Tabel C.1 Yield ekstrak demethoxycurcumin (DMC) menggunakan NADES Berat Ekstrak Area Kadar Berat Curcuma DMC DMC (ppm) (mg) mangga (g) (mg/g) 10,91663 0,020 0,000030 0,014 FS- H2O 9,32026 0,009 0,000014 0.00207 0,007 11,40388 0,023 0,000035 0,017 Tabel C.2 Yield ekstrak curcumin (C) menggunakan NADES Berat Ekstrak Kadar Berat Area C Curcuma C (ppm) (mg) mangga (g) (mg/g) 40.23962 0,391 0,000584 0,282 FS- H2O 40.83877 0,395 0,000590 0.00207 0,285 42.67340 0,407 0,000608 0,294

APPENDIKS D PERHITUNGAN YIELD EKSTRAK CURCUMINOID DARI EKSTRAKSI RIMPANG CURCUMA MANGGA D.1 Ekstraksi Maserasi dengan Solvent Etanol 96% Menghitung yield ekstrak curcuminoid pada Run 1 Maserasi Berat Curcuma mangga = 40,0060 gram Sampel hasil ekstrak maserasi dan soxhlet yang volumenya sekitar 100 cc di adkan dengan metanol p.a hingga 100 mL = 0,1 L Area curcuminoid (dari hasil HPLC) masing-masing  Area bisdemethoxycurcumin = 1404,98584 mAU.s

A-17

 Area demethoxycurcumin = 2103,05518 mAU.s  Area curcumin = 5747,40674mAU.s Untuk menghitung kadar sampel ektrak, digunakan persamaan kurva kalibrasi yang diperoleh dimana sumbu y merupakan respon area (mAU.s) dan sumbu x merupakan kadar (ppm).  Bisdemethoxycurcumin (BDMC) Persamaan kurva kalibrasi y = 137,2x + 1,598

 Demethoxycurcumin (DMC) Persamaan kurva kalibrasi y =146,0x +7,993

 Curcumin (C) Persamaan kurva kalibrasi y = 153,3x – 19,76

A-18

Perhitungan yield curcuminoid :  Bisdemethoxycurcumin (BDMC)

= 0,026 mg/g

 Demethoxycurcumin (DMC)

= 0,036 mg/g  Curcumin (C)

A-19

= 0,094mg/g Perhitungan dengan cara yang sama dilakukan untuk metode soxhlet (Run 1) dan maserasi (Run 1 & 2) Tabel D.1 Yield ekstrak bisdemethoxycurcumin (BDMC) metode soxhlet & maserasi Berat Ekstrak Kadar Berat BDMC Curcuma BDMC (ppm) (mg) mangga (g) (mg/g) 1132,84595 8,245 0,825 0,021 Soxhlet 40.0031 0,817 0,020 Run 1 1122,75342 8,172 1123,30493 8,176 0,818 0,020 1404,98584 10,229 1,023 0,026 Maserasi 40.0060 0,026 Run 1 1402,44983 10,210 1,021 1399,73437 10,190 1,019 0,025 1431,17224 10,420 1,042 0,026 Maserasi 40.0046 0,026 Run 2 1430,54065 10,415 1,042 1577,57532 11,487 1,149 0,029 Tabel D.2 Yield ekstrak demethoxycurcumin (DMC) metode soxhlet &maserasi Berat Ekstrak Kadar Berat DMC Curcuma DMC (ppm) (mg) mangga (g) (mg/g) 1649,54333 11,237 1,124 0,028 Soxhlet 40.0031 0,028 Run 1 1637,63208 11,155 1,115 1644,45093 11,202 1,120 0,028 2103,05518 14,343 1,434 0,036 Maserasi 40.0060 0,036 Run 1 2099,52588 14,319 1,432 2091,22437 14,262 1,426 0,036 Maserasi 2018,04712 13,761 1,376 40.0046 0,034

A-20

Run 2

1990,55554 1642,46460

13,572 11,188

1,357 1,119

0,034 0,028

Tabel D.3 Yield ekstrak curcumin (C) metode soxhlet &maserasi Berat Kadar Berat Ekstrak C Curcuma (ppm) (mg) C (mg/g) mangga (g) 4330,29297 28,408 2,841 0,071 Soxhlet 40.0031 0,072 Run 1 4375,76123 28,704 2,870 4363,46289 28,624 2,862 0,072 5747,40674 37,640 3,764 0,094 Maserasi 40.0060 0,094 Run 1 5725,95312 37,500 3,750 5717,70947 37,446 3,745 0,094 5448,77734 35,694 3,569 0,089 Maserasi 40.0046 0,090 Run 2 5470,77295 35,838 3,584 5694,32813 37,294 3,729 0,093

A-21

BIODATA PENULIS Penulis 1 Nurhasanah, perempuan kelahiran Bontang, Kalimantan Timur, 14 September 1992, merupakan anak ketujuh dari sembilan bersaudara. Penulis pernah menempuh pendidikan di SD Negeri 002 Bontang Selatan, SMPN3 Bontang, SMK Negeri 1 Bontang Jurusan Analis Kimia. Penulis juga telah menyelesaikan pendidikan Diploma III di Jurusan Teknik Kimia Politeknik Negeri Samarinda pada tahun 2014. Untuk memenuhi syarat meraih gelar Ahli Madya, penulis menyelesaikan Laporan Akhir dengan judul “Pembuatan Katalis Heterogen Dari Kulit Telur Ayam Dengan Metode Impregnasi Menggunakan Kalium Iodida Berpenyangga Al2O3”. Pada tahun 2015, penulis melanjutkan pendidikan S1 di Departemen Teknik Kimia FTI-ITS lewat program Lintas Jalur. Pada tahun 2016, penulis mengambil bidang studi Biomassa dan Konversi Energi. Penulis memiliki pengalaman kerja praktek di PT. Kaltim Parna Industri bagian Process Engineer pada tahun 2013 dan PT. Indonesia Power di bagian Effisiensi dan Laboratorium pada tahun 2016. Agustus 2016, penulis menyelesaikan Tugas Desain Pabrik Kimia sebagai syarat meraih gelar Sarjana dengan judul “Pra Desain Pabrik Syngas dari Gasifikasi Batu Bara Kualitas Rendah Sebagai Pasokan Gas Pabrik Pupuk”. Email : [email protected]

BIODATA PENULIS Penulis 2 Umra Misli Saktia, perempuan kelahiran Muara Badak, Kalimantan Timur, 08 Januari 1993, merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Penulis pernah menempuh pendidikan di SD Negeri 006 Muara Badak, SMP Terbuka Muara Badak, SMA Negeri 1 Muara Badak. Penulis juga telah menyelesaikan pendidikan Diploma III di Jurusan Teknik Kimia Politeknik Negeri Samarinda pada tahun 2014. Untuk memenuhi syarat meraih gelar Ahli Madya, penulis menyelesaikan Laporan Akhir dengan judul “Pirolisis Sampah Plastik Polyethylene Terephthalate (PET) dengan Penambahan Steam”. Pada tahun 2015, penulis melanjutkan pendidikan S1 di Departemen Teknik Kimia FTI-ITS lewat program Lintas Jalur. Pada tahun 2016, penulis mengambil bidang studi Biomassa dan Konversi Energi. Penulis memiliki pengalaman kerja praktek di Vico Indonesia bagian Operation Integrity Department pada tahun 2013 dan di bagian Northern Area Department pada tahun 2016. Agustus 2016, penulis menyelesaikan Tugas Desain Pabrik Kimia sebagai syarat meraih gelar Sarjana dengan judul “Pra Desain Pabrik Syngas dari Gasifikasi Batu Bara Kualitas Rendah Sebagai Pasokan Gas Pabrik Pupuk”. Email : [email protected]