PRODUKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE Burkholderia cepacia TERHADAP SUBSTRAT YANG BERBEDA
Skripsi
Oleh MELISHA
JURUSAN PERIKANAN DAN KELAUTAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
ABSTRAK PRODUKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE Burkholderia cepacia TERHADAP SUBSTRAT YANG BERBEDA
Oleh
Melisha
Pati atau amilum merupakan bahan utama yang dihasilkan oleh tumbuhan untuk menyimpan kelebihan glukosa sebagai produk fotosintesis. Burkholderia cepacia merupakan bakteri yang mampu menghidrolisis pati, karena bakteri tersebut memiliki enzim amilase. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap pertumbuhan, indeks amilolitik dan aktivitas enzim amilase bakteri B. cepacia. Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap dengan 3 perlakuan (substrat daun singkong, daun pepaya dan sente) dengan 3 ulangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bakteri B. cepacia mampu hidup dengan baik pada substrat daun pepaya. Pemberian substrat daun sente memberikan pengaruh terhadap indeks amilolitik yang ditunjukkan dengan adanya zona bening sebesar 9,8 mm. Aktivitas enzim amilase pada penelitan ini adalah 101,8 unit dan konsentrasi protein sebesar 0,094 mg/ml.
Kata kunci : Burkholderia cepacia, pati, enzim, amilase, protein
ABSTRACT
PRODUCTION AND ACTIVITY ASSAY OF Burkholderia cepacia TO DIFFERENT SUBSTRATES
By Melisha
Starch is the main ingredient that is produced by plants to save excess glucose as a product of photosynthesis. Burkholderia cepacia is a bacterium which is able to hydrolyze starch, because B. cepacia have the enzyme amylase. This study was aimed to determine the effect of different substrates on growth, the amylolytic index and amylase enzyme activity of the bacterium B. cepacia. This study used a completely randomized design with 3 treatments (substrate cassava leaf, papaya leaf and sente leaf) with 3 replications. The results showed that the bacterium B. cepacia was able to live well on papaya substrates. Sente leaf substrate gave effect to amylolytic index that was indicated by a clear zone was 9.8 mm. Amylase enzyme activity in this research was 101.8 units and the protein concentration was 0.094 mg / ml.
Keywords : Burkholderia cepacia, starch, enzyme, amylase, protein
PRODUKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE Burkholderia cepacia TERHADAP SUBSTRAT YANG BERBEDA
Oleh MELISHA
Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA PERIKANAN Pada Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2016
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Negararatu pada tanggal 14 Maret 1992 sebagai anak kedua dari pasangan Bapak Hi. Ardani dan Ibu Hj. Baiyana. Penulis memulai pendidikan formal dari taman kanakkanak Cindelaras Negararatu diselesaikan pada tahun 1998, Sekolah Dasar Negeri (SDN) 04 Sungkai Utara diselesaikan pada tahun 2004, Sekolah Madrasah Tsanawiyah Negeri (MTsN) Padang Ratu diselesaikan pada tahun 2007 dan Sekolah Usaha Perikanan Menengah Negeri (SUPMN) Kota Agung diselesaikan pada tahun 2010. Penulis kemudian melanjutkan pendidikan ke jenjang S1 di Jurusan Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung memalui jalur SNMPTN pada tahun 2011 dan menyelesaikan studinya pada tahun 2016. Selama menjadi mahasiswa, penulis aktif di organisasi Himpunan Mahasiswa Budidaya Perairan UNILA (HIDRILA) sebagai anggota bidang Minat dan Bakat pada tahun 2012/2013 dan sekretaris bidang Minat dan Bakat pada tahun 2013/2014. Penulis melaksanakan Praktik Umum di Balai Uji Standar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM) Cipayung, Jakarta Timur dengan judul “ Teknik Dasar Histopatologi pada Ikan Lele (Clarias Sp.) di Balai Uji Standar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM) Cipayung - Jakarta Timur” pada tahun 2015. Penulis melaksanakan kegiatan Kuliah Kerja Nyata (KKN) selama 40 hari di pekon Totokarto, Kecamatan Adiluwih, Kabupaten Pringsewu pada tahun 2014. Penulis melaksanakan penelitian akhir di Laboratorium Perikanan Universitas Lampung dengan judul “Produksi dan Pengujian Aktivitas Amilase Burkholderia cepacia Terhadap Substrat yang Berbeda” pada tahun 2016.
PERSEMBAHAN
Alhamdullillaahirabbil’alamin Dengan penuh rasa syukur kepada Allah SWT. Kupersembahkan skripsi ini untuk orang yang sangat kusayangi Papiku Hi. Ardani, Mamiku Hj. Baiyana, Enanku Muhammad Iqbal, S.E. dan Adikku Sella Triandani, Amd.F. Terimakasih untuk doa, semangat dan dukungan yang diberikan.
Dosen dan sahabat-sahabat yang selalu ada disaat suka dan duka serta almamaterku tercinta. Universitas Lampung
Pendidikan merupakan perlengkapan paling baik untuk hari tua (Aristoteles)
Banyak kegagalan dalam hidup ini dikarenakan orang-orang tidak menyadari betapa dekatnya mereka dengan keberhasilan saat mereka menyerah (Thomas Alva Edison)
Kebanggaan kita yang terbesar adalah bukan tidak pernah gagal, tetapi bangkit kembali setiap kali kita jatuh (Confusius)
Harapan adalah tiang yang menyangga dunia (Pliny the Elder)
“Maka sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan. Sesungguhnya bersama kesulitan ada kemudahan. Maka apabila engkau telah selesai (dari sesuatu urusan), tetaplah bekerja keras (untuk urusan yang lain). Dan hanya kepada Tuhanmulah engkau berharap.” (QS. Al-Insyirah,6-8)
Rahasia kehidupan adalah jatuh tujuh kali dan bangun delapan kali (The Alchemist, Paulo Cuelho)
Kalau aku susah, cukuplah kutangisi semalaman. Semalam suntuk. Esoknya aku tak mau lagi menangis. Aku bangun dan tegak kembali (Andrea Hirata)
SANWACANA
Segala puji bagi Allah SWT atas segala nikmat, rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Produksi dan Pengujian Aktifitas Amilase Burkholderia cepacia Terhadap Substrat yang Berbeda” yang merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan (S.Pi) pada Jurusan Perikanan dan Kelautan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1.
Papi, Mami, Nan Muhammad Iqbal dan adik Sela Triandani serta seluruh keluargaku yang selalu memberikan do’a, motivasi, cinta dan kasih sayang, kesabaran, perhatian dan dukungan yang tiada henti kepada penulis demi kelancaran, keselamatan dan kesuksesan penulis.
2.
Ibu Ir. Siti Hudaidah, M.Sc. selaku Ketua Jurusan Perikanan dan Kelautan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung.
3.
Ibu Esti Harpeni, S.T., M.AppSc. selaku dosen Pembimbing Akademik dan pembimbing utama, yang telah memberikan bimbingan serta saran dalam perbaikan dan penyelesaian skripsi ini.
4.
Bapak Dr. Supono, S.Pi., M.Si. selaku dosen pembimbing kedua yang telah memberikan bimbingan serta saran dalam perbaikan dan penyelesaian skripsi ini.
5.
Bapak Dr. Ir. Abdullah Aman Damai, M. Si. selaku dosen pembahas yang telah memberikan saran dan bimbingannya.
6.
Seluruh dosen dan staf Jurusan Perikanan dan Kelautan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung.
7.
Teman-teman Budidaya Perairan 2011, kakak tingkat 2009 dan 2010 maupun adik tingkat 2012 (Yola, bang Okta, mbak Riska, Restu Anisa, Neneng, Indah, Putri Endang, Utami, Tiwi, Sundari, Sulis, Weni, Syohib, Puji, Septi)
yang selalu membantu, menemani dan menyemangati sehingga penelitian dan skripsi ini akhirnya bisa diselesaikan. Terimakasih untuk bantuan tenaga, saran dan nasihat selama menyelesaikan skripsi ini serta untuk kebersamaan yang tak terlupakan. 8.
Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis juga menyadari akan segala kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, oleh karena itu penulis menerima kritik dan saran yang membangun dalam upaya perbaikan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat memberikan informasi yang berguna bagi kita semua.
Bandar Lampung, 23 Desember 2016 Penulis
Melisha
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR ISI................................................................................................. DAFTAR GAMBAR.................................................................................... DAFTAR TABEL ........................................................................................ DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................
i iii iv v
I.
PENDAHULUAN ............................................................................... 1.1 Latar Belakang ............................................................................. 1.2 Tujuan ........................................................................................... 1.3 Manfaat ......................................................................................... 1.4 Kerangka Pemikiran ...................................................................... 1.5 Hipotesis . ......................................................................................
1 1 2 2 2 5
II.
METODOLOGI PENELITIAN........................................................ 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................... 2.2 Alat dan Bahan Penelitian ............................................................ 2.3 Prosedur Penelitian ....................................................................... 2.3.1 Tahap Persiapan .................................................................. 2.3.1.1 Sumber Isolat .......................................................... 2.3.1.2 Pembuatan Substrat ............................................... 2.3.2 Tahap Pelaksanaan .............................................................. 2.3.2.1 Analisis Proksimat .................................................. 2.3.2.2 Peremajaan dan Ekstraksi Isolat Bakteri ................. 2.3.2.3 Produksi Bakteri B. cepacia .................................... 2.3.2.4 Indeks Amilolitik .................................................... 2.3.2.5 Pengujian Aktivitas Enzim Amilase Kasar ............ 2.3.2.6 Perhitungan Kadar Protein Enzim Amilase ........... 2.4 Analisis Data .................................................................................
6 6 6 8 8 8 8 9 9 9 9 10 10 11 11
III.
HASIL DAN PEMBAHASAN.......................................................... 3.1 Pertumbuhan Bakteri .................................................................... 3.2 Uji Amilolitik Isolat Bakteri ......................................................... 3.3 Pengujian Aktivitas Enzim Amilase Kasar ..................................
12 12 14 17
i
3.4 Penentuan Kadar Protein Enzim Amilase .................................... 19 3.5 Uji Proksimat ................................................................................ 19 IV.
KESIMPULAN DAN SARAN 4.1 Kesimpulan ................................................................................... 22 4.2 Saran ............................................................................................. 22
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 23 LAMPIRAN
ii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. 2.
Halaman
Kerangka Pikir Penelitian ........................................................................ 4 Kurva Pertumbuhan Bakteri B. cepacia .................................................. 12
iii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. 2. 3. 4.
Halaman
Alat yang digunakan dalam penelitian ..................................................... Bahan yang digunakan dalam penelitian ................................................. Pengukuran Indeks Amilolitik B. cepacia ............................................... Uji Proksimat ...........................................................................................
6 7 14 20
iv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.
Halaman
Skema pembuatan Media Pertumbuhan.................................................... Skema Produksi dan Ekstraksi Enzim Amilase ........................................ Skema Uji Indeks Amilolitik B. cepacia .................................................. Skema Pengujian Aktivitas Enzim Amilase Kasar .................................. Skema Pengukuran Kadar Protein ........................................................... Pertumbuhan Bakteri pada Tiap Substrat.................................................. Kurva Standar Glukosa dan Perhitungan Aktivitas Amilase .................... Kurva Standar BSA dan Perhitungan Total Protein Enzim ...................... Hasil Uji Analisa Ragam Anova Indeks Amilolitik ................................. Gambar Bahan-Bahan Penelitian .............................................................. Gambar Alat-Alat Penelitian..................................................................... Gambar Pengukuran Pertumbuhan Optimal Bakteri ................................ Gambar Pengujian Indeks Amilolitik ....................................................... Gambar Ekstraksi Enzim .......................................................................... Gambar Pengujian Kadar Glukosa............................................................ Gambar Pengujian Kadar Protein .............................................................
27 28 30 31 33 35 36 37 39 42 43 44 45 46 47 48
v
I. PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang Karbohidrat adalah senyawa organik yang terdiri dari serat kasar dan
bahan bebas tanpa nitrogen (BETN). Unsur-unsur karbohidrat terdiri dari karbon, hidrogen dan oksigen dalam perbandingan yang berbeda-beda (Gufran dan Kordi, 2010). Karbohidrat merupakan salah satu komponen sumber energi dalam pakan. Selain itu berperan dalam menghemat penggunaan protein sebagai sumber energi (Afrianto dan Liviawaty, 2005). Ikan gurame mempunyai sifat omnivora yang berkecenderungan herbivora sehingga dapat mencukupi kebutuhan makannya dengan mengkonsumsi pakan yang mengandung karbohidrat 20-30% yang berasal sari pakan berbentuk pellet dan dedaunan hijau (Alfin et al., 2014). Kemampuan ikan untuk memanfaatkan karbohidrat bergantung pada kemampuannya untuk menghasilkan enzim amilase (Mujiman, 1991). Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis yang bekerja secara efisien dan spesifik (Singleton dan Sainsbury, 2006). Enzim dihasilkan oleh semua makhluk hidup untuk mengkatalisis reaksi biokimia dalam tubuh makhluk hidup tersebut sehingga reaksi-reaksi itu dapat berlangsung lebih cepat (Sianturi, 2008). Enzim amilase merupakan enzim yang menghidrolisis molekul pati untuk memberikan produk yang bervariasi termasuk dekstrin dan polimerpolimer kecil yang tersusun dari unit-unit glukosa (Windish dan Mhatre, 1965). Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber seperti tanaman, hewan dan mikroorganisme (Purwandani et al., 2012). Salah satu mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim amilase adalah bakteri amilolitik. Bakteri amilolitik merupakan bakteri yang memproduksi enzim amilase dan memecah pati (Frazier dan Westhoff, 1988). Arief et al. (2010) melaporkan bahwa spesies Pseudomonas sp., Pseudomonas pseudomallei merupakan bakteri yang dapat menghasilkan enzim amilase karena mampu mendegenerasi karbohidrat yang dibuktikan dengan terbentuknya halo pada media Bushnell Hass (BH) yang ditambahkan amilum sebagai indikator kerja.
1
Pseudomonas cepacia (kini dinamakan Burkholderia cepacia) merupakan mikroorganisme berupa bakteri yang dapat menghidrolisis substrat karbohidrat yang dibuktikan dengan adanya zona bening di sekitar isolat. Hal ini dapat diasumsikan bahwa B. cepacia mengandung enzim amilase yang mempunyai kemampuan menghidrolisis karbohidrat menjadi senyawa yang lebih sederhana (Alfin et al., 2014). Berdasarkan kemampuannya dalam menghidrolisis karbohidrat maka enzim amilase tersebut harus diketahui aktivitasnya sehingga diperoleh hasil akhir berupa unit/mg protein enzim yang dapat membantu ikan gurame dalam memanfaatkan sumber karbohidrat untuk mempercepat proses pertumbuhannya.
1.2
Tujuan
Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah: 1.
Mempelajari
pengaruh
pemberian substrat
yang berbeda terhadap
pertumbuhan bakteri B. cepacia dan waktu produksi enzim amilase B. cepacia 2.
Mempelajari pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap indeks amilolitik B. cepacia
3.
Mempelajari aktivitas enzim amilase kasar B. cepacia dan kadar protein enzim amilase B. cepacia.
1.3
Manfaat Manfaat yang diperoleh dari penelitian ini adalah memberikan informasi
baru tentang pemanfaatan bakteri B. cepacia sebagai sumber penghasil enzim amilase sehingga dapat menjadi salah satu alternatif untuk membantu mempercepat pertumbuhan ikan gurame.
1.4
Kerangka Pikir Ikan gurame memiliki potensi untuk dibudidayakan secara komersial
karena mempunyai nilai ekonomis tinggi. Akan tetapi, masih banyak ditemukan kendala dalam usaha budidayanya, antara lain pertumbuhannya yang relatif
2
lambat dibandingkan dengan ikan air tawar lainnya (Rasmawan, 2009). Laju pertumbuhan yang rendah dapat disebabkan oleh kurangnya efisiensi pemanfaatan energi dan materi di dalam pakan sehingga energi yang tersedia tidak cukup untuk pertumbuhan (Kurnia, 1997). Buwono (2000) menyatakan bahwa pakan memiliki fungsi utama sebagai penyedia energi bagi aktivitas sel-sel tubuh. Kandungan gizi dalam pakan dapat berupa karbohidrat, lemak dan protein yang berfungsi sebagai sumber energi. Pengunaan karbohidrat untuk menggantikan protein dan lemak sebagai sumber energi dapat dimaksimalkan untuk mengurangi biaya pakan karena karbohidrat merupakan sumber energi yang murah dan dapat menggantikan sumber energi protein yang lebih mahal. Ikan gurame membutuhkan pakan dengan komposisi protein 30-32% dan karbohidrat 20-30% yang berasal dari pakan berbentuk pellet dan dedaunan hijau. Dedaunan hijau ini banyak mengandung karbohidrat terutama karbohidrat berupa BETN dan serat kasar. Daun keladi dan kangkung yang sering dikonsumsi ikan gurame banyak mengandung karbohidrat kompleks seperti pati (Cahyoko, 2011). Nutrien (protein, karbohidrat, dan lemak) akan dicerna jika sesuai dengan ketersedian enzim pencernaan sehingga jumlah energi yang dapat digunakan untuk pertumbuhan berkaitan dengan kemampuan ikan dalam mencerna pakan. Rendahnya kemampuan ikan gurame dalam memanfaatkan karbohidrat pakan pada tingkat pencernaan disebabkan oleh rendahnya aktivitas enzim amilase dalam saluran pencernaan (Handayani, 2006). Salah satu upaya untuk mengingkatkan enzim amilase adalah dengan memanfaatkan bakteri pencernaan yang dapat menghasilkan enzim amilase. Penyeleksian bakteri yang dapat menghasilkan enzim amilase dilakukan dengan cara pengujian aktivitas enzim dengan substrat karbohidrat (Aslamsyah, 2009). Penelitian sebelumnya telah dilakukan untuk mengetahui jenis bakteri yang berada dalam saluran pencernaan ikan gurame. Berdasarkan penelitian Alfi et al. (2014) bakteri dalam saluran pencernaan ikan gurame yang dapat menghasilkan enzim amilase adalah Burkholderia cepacia.
3
Bakteri B. cepacia dapat ditemukan di dalam tanah, air dan akar tanaman. B. cepacia diketahui dapat bertahan hidup di dalam air selama 1 tahun (Supriadi, 2006) sehingga berpotensi masuk dalam tubuh ikan gurame melalui media air dan tanah pada kolam budidya. Bakteri B. cepacia memiliki sifat hidrokarbonoklastik yaitu mampu mendegradasi beberapa jenis karbon (Nursyirwani dan Kathy, 2007). Namun sampai saat ini belum diketahui bagaimana aktivitas B. cepacia terhadap jenis karbohidrat yang berasal dari pakan ikan. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas amilase B. cepacia terhadap substrat yang berbeda (Gambar 1). Ikan gurame
Pertumbuhan lambat Sebagian besar pakan mengandung karbohidrat Isolasi bakteri penghasil enzim amilase pada usus ikan gurame
Produksi dan ekstraksi enzim
Uji indeks amilolitik
Uji patogenitas (Postulat Koch)
Uji aktivitas enzim amilase
Uji daya hambat
Penentuan substrat yang optimal
Uji penambahan enzim pada pakan ikan
Pertumbuhan ikan meningkat
Gambar 1. Kerangka Pikir Penelitian
4
1.5
Hipotesis
Hipotesis perlakuan yang digunakan yaitu : 1.
H0 = Tidak ada pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap pertumbuhan bakteri B. cepacia H1 = Ada pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap pertumbuhan bakteri B. cepacia
2.
H0 = Tidak ada pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap waktu produksi enzim amilase H1 = Ada pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap waktu produksi enzim amilase
3.
H0 = Tidak ada pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap indeks amilolitik H1 = Minimal ada satu pengaruh pemberian substrat yang berbeda terhadap indeks amilolitik
5
II.
2.1
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai April 2016, bertempat
di Laboratorium Perikanan, Jurusan Perikanan dan Kelautan, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung. Uji proksimat substrat dilakukan di Laboratorium Analisis Hasil Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Lampung. Sedangkan untuk menghasilkan supernatan enzim, sentrifugasi dilakukan di Laboratorium Biomass, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
2.2
Alat dan Bahan Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian mulai dari produksi sampai
pengujian aktivitas enzim amilase disajikan dalam Tabel 1. Tabel 1. Alat-alat yang digunakan dalam Penelitian No
Nama Alat
1
Tabung erlenmeyer
2
Tabung reaksi
3
Cawan petri
4
Bunsen
5
Jarum ose
6
Autoklaf
7
Spreader
8
Timbangan digital
Spesifikasi/Merk
Kegunaan
AGC IWAKI 250 ml Sebagai wadah media pertumbuhan bakteri IWAKI pyrex Sebagai wadah mereaksikan bahan kimia dan pengembangbiakan bakteri Sebagai wadah media pertumbuhan bakteri Untuk membantu proses sterilsasi lingkungan Untuk mengambil dan menanam bakteri pada media Wids 23 Untuk mensterlisasikan alat dan bahan penelitian Untuk meratakan larutan pada media cawan petri Boeco Germany Untuk menimbang bahan yang akan digunakan dalam penelitan
6
No
Nama Alat
Spesifikasi/Merk
Kegunaan
9
Inkubator
Froilabo
10
Mikropipet
-
11
Hot plate stirer
Stuart
12
Pipet tetes
-
13
Laminar air flow
Nuaire, Model No. NU-1264DDE
14
Spektrofotometer
Thermo Scientific Genesys 20
15
Shaker
16
Sentrifugasi
Boeco Germany PSU-15i Hybrid Refrigerated Centrifuge CAX-370
Tempat menyimpan hasil penanaman bakteri Untuk memindahkan larutan yang bervolume kecil Untuk menghomogenkan larutan Untuk membantu memindahkan larutan Untuk preparasi alat dan bahan agar tidak terkontaminasi Untuk mengukur absorbansi larutan dan pertumbuhan bakteri Untuk menghomogenkan media dan bakteri Untuk memisahkan padatan dan larutan (supernatan)
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu isolat bakteri B. cepacia dan beberapa bahan kimia yang disajikan dalam Tabel 2. Tabel 2. Bahan-bahan yang digunakan dalam Penelitian No
Nama Bahan
1
Daun singkong
2
Daun pepaya
3
Daun sente
4
Glukosa
5
BSA
6
Amilum
7
Media NA (Nutrient Agar)
Kegunaan Sebagai sumber karbohidrat dalam media Sebagai sumber karbohidrat dalam media Sebagai sumber karbohidrat dalam media Sebagai bahan pembuatan kurva standar glukosa Sebagai bahan pembuatan kurva standar BSA Sebagai bahan dalam uji kemampuan enzim amilase Sebagai media pertumbuhan bakteri pada peremajaan bakteri
7
No 8
Nama Bahan Media NB (Nutrient Broth)
Kegunaan Sebagai media untuk pengenceran bakteri
9
Akuades
Sebagai pelarut dalam pembuatan media dan larutan kimia lainnya
10
Media MSM (minimal synthetic Sebagai medium)
11
12
Reagen
media
minimal
untuk
pertumbuhan bakteri DNS
(Dinitrosalcylic Sebagai
pereaksi
acid)
menghasilkan gula pereduksi
Lugol’s iodine
Sebagai
larutan
untuk
untuk
menguji
aktivitas amilolitik 13
Pereaksi lowry A
Sebagai pereaksi dalam penentuan kadar protein enzim amilase
14
Pereaksi lowry B
Sebagai pereaksi dalam penentuan kadar protein enzim amilase
2.3
Prosedur Penelitian
2.3.1 Tahap Persiapan a. Sumber Isolat Isolat bakteri B. cepacia diperoleh dari usus ikan gurame yang dipreparasi oleh Alfin et al. (2014).
b. Pembuatan Substrat Substrat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari karbohidrat yang terdapat pada daun singkong, daun pepaya dan daun sente. Preparasi substrat menjadi tepung yaitu dengan cara daun singkong, daun pepaya dan daun sente diambil dan disortasi untuk memisahkan kotoran dengan cara membuang bagian-bagian pelepah daun dan tangkai daun. Kemudian pencucian dilakukan untuk menghilangkan kotoran yang masih melekat dengan menggunakan air mengalir, selanjutnya pengeringan dilakukan
8
dengan cara dikering anginkan atau tidak kena cahaya matahari langsung atau pada suhu kamar ±25⁰C sampai kadar air ≤ 10 %. Proses selanjutnya yaitu penggilingan/penepungan yang dilakukan dengan menggunakan mesin penepung.
2.3.2 Tahap Pelaksanaan a. Analisis Proksimat Analisis proksimat untuk substrat daun singkong, daun pepaya dan daun sente meliputi kadar air dengan metode thermogravimetri, kadar abu dengan metode pengabuan tanur, kadar protein dengan metode kjedahl, kadar lemak dengan metode soxhlet, kadar karbohidrat dan pati dengan cara by difference (Lestari et al., 2013).
b. Peremajaan dan Ekstraksi Isolat Bakteri B. cepacia Peremajaan isolat bakteri dilakukan pada media nutrien agar (NA). Media NA ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan aquades. Bahan-bahan tersebut kemudian dipanaskan di atas hot plate stirer sampai mendidih. Setelah itu disterilisasi dalam autoklaf selama 2 jam pada suhu 121oC pada tekanan 1 atm. Kemudian didinginkan dan dituang ke dalam tabung reaksi. Inokulasi bakteri dilakukan dengan cara menempatkan 1 ose biakan ke dalam tabung reaksi miring secara aseptik, kemudian inkubasi pada suhu 27-28oC selama 24-48 jam. Isolat bakteri siap untuk produksi enzim. Ekstraksi isolat bakteri dilakukan dengan cara kultur cair bakteri disentrifuge selama 15 menit dengan kecepatan 8.000 rpm. Supernatan yang mengandung ekstrak dari enzim amilase kasar diambil untuk diuji aktivitasnya (Sumrin et al., 2011).
c. Produksi Bakteri B. cepacia B. cepacia dikultur pada media MSM cair (minimal synthetic medium) yang ditambahkan 0,5% sumber karbon (daun singkong, daun pepaya dan daun sente). Media terdiri dari 0,1 % K2HPO4, 0,01%
9
MgSO4.7H2O, 0,1% NaCl, 0,7% (NH4)2SO, 0,05% ekstrak ragi (Chasanah et al., 2011). Isolat bakteri diambil dan diinokulasi pada media awal berupa 20 ml MSM cair, kemudian dishaker dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 27-28oC selama 24 jam. Selanjutnya diambil 10% hasil kultur dipindahkan pada media produksi berupa 80 ml MSM cair, kemudian dishaker dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 27-28oC. Kepadatan bakteri dihitung dengan mengukur absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm.
d. Indeks Amilolitik (IA) Bakteri hasil isolasi diuji kemampuannya dalam menghidrolisis karbohidrat dengan cara membuat media MSM padat yang ditambahkan 1% substrat karbohidrat (daun singkong, daun pepaya dan daun sente). Potongan kertas cakram steril direndam pada biakan kultur bakteri selama 1 jam. Potongan kertas cakram diletakkan pada media MSM kemudian diinkubasi pada suhu 27-28oC selama 66 jam. Setelah inkubasi, larutan lugol’s iodine dituang di atas kultur. Adanya aktivitas enzim amilase ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni.
e. Pengujian Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat bakteri dikultur pada MSM cair yang telah ditambahkan 0,5% substrat daun pepaya selama 66 jam. Kemudian kultur cair bakteri disentrifuse dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang dihasilkan kemudian diambil 3 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan dengan 1 ml larutan amilum 1% dan diinkubasi selama 60 menit pada suhu 27-28oC. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 2 ml reagen DNS. Kemudian tabung dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit, didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit dan ditambahkan akuades sebanyak 20 ml. Pada larutan blanko ditambahkan larutan amilum 1% dan diinkubasi selama 60 menit pada
10
suhu 27-28oC, tanpa penambahan supernatan. Tiap larutan dideterminasi intensitas warnanya
menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 540 nm.
f. Perhitungan Kadar Protein Enzim Amilase Penentuan kadar protein dilakukan dengan cara ditambahkan 2 ml larutan ekstrak enzim pada tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2,75 ml pereaksi Lowry B dan dihomogenkan, dibiarkan selama 15 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,25 ml pereaksi Lowry A dan dihomogenkan, lalu dibiarkan selama 30 menit agar reaksi berjalan sempurna. Absorbansi sampel diukur pada panjang gelombang 750 nm.
2.4
Analisis Data Data hasil penelitian diolah dengan menggunakan analisis sidik ragam
dengan uji F untuk mengetahui ada atau tidak pengaruh pemberian tepung daun singkong, daun pepaya dan daun sente terhadap indeks amilolitik bakteri B. cepacia. Apabila terdapat perbedaan antar perlakuan maka dilanjutkan dengan uji BNT pada selang kepercayaan 95%. Sedangkan pertumbuhan bakteri, aktivitas enzim amilase kasar dan kadar protein enzim amilase dianalisa secara deskriptif.
11
IV. KESIMPULAN
4.1. Kesimpulan Kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah: a.
B. cepacia mampu hidup pada ketiga substrat dengan pertumbuhan sel tertinggi terdapat pada substrat daun pepaya dengan waktu produksi enzim selama 66 jam.
b.
Ketiga substrat secara keseluruhan menunjukkan bahwa bakteri mampu menghidrolisis
masing-masing
sumber
karbohidrat,
namun
indeks
amilolitiknya berpotensi rendah. c.
Ekstrak kasar enzim memiliki nilai aktivitas enzim yang tinggi yaitu sebesar 101,8 unit dan konsentrasi protein sebesar 0,094 mg/ml.
4.2. Saran Diharapkan dilakukan penelitian lanjutan terhadap kondisi optimum untuk produksi enzim seperti suhu, pH, konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, aktivitor dan inhibitor sehingga dapat mikroorganisme penghasilnya.
diketahui
aktivitas enzim
tertinggi
dari
DAFTAR PUSTAKA
Afrianto, E. & Liviawaty, E. 2005. Pakan Ikan. Yogyakarta: Kanisius. Agustien, A. 2010. Protease bakteri termofilik. Bandung: Universitas Padjajaran Press. Alfin, G., Harpeni, E., Ali, M., & Putri, B. 2014. Penapisan bakteri penghasil enzim amilase dari usus ikan gurame (Osphronemus gouramy). Seminar Indonesia Aquaculture Jakarta 26-29 Agustus 2014. 218225. Alexander, M. 1994. Biodegradation and Bioremediation. United States of America: Academic Press Inc. Almatsier, S. 2009. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Arief, M., Sulmartiwi, L., Pragoyo., & Saputri, M.H. 2010. Isolasi bakteri indigen sebagai pendegradasi bahan organik pada media pembenihan ikan lele dumbo (Clarias sp.) sistem resirkulasi tertutup. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 2 (2):112-117. Aslamsyah, S. 10 Oktober 2009. Kontribusi mikroflora dalam saluran pencernaan ikan gurame (Osphronemus gouramy) pada fase karnivora. Makassar. Seminar Nasional Perikanan dan Kelautan Kawasan Timur Indonesia. Makassar. Buwono, I. D. 2000. Kebutuhan Asam Amino Esensial dalam Ransum Ikan. Yogyakarta: Kanisius. Cahyoko, Y. 2011. Pengaruh beberapa jenis karbohidrat dalam pakan terhadap pertumbuhan benih gurami (Osphronemus goramy Lac.) yang berumur diatas 80 hari. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan. 3 (2): 133-138. Chasanah, E., Patantis, G., Zilda, D.S., Ali, M., & Risjani, Y. 2011. Purification and characterization of aeromonas media klu 11.16 chitosanase isolated from shrimp waste. Journal of Coastal Development. 15 (1): 104-113. Dali, S., Arfah, R., Karim, A., & Patong, A.R. 2013. Eksplorasi enzim amilase dari mikroba yang diisolasi dari sumber air panas di Sulawesi selatan dan aplikasinya dalam produksi maltodekstrin. Makassar: Universitas Hasanuddin Press.
Dirnawan, H., Suwanto, A., & Purwanaria, T. 2000. Eksplorasi bakteri termofil penghasil enzim amilase hidrolitik ekstraseluler dari sumber air panas gunung pancar. Hayati. 7: 52-55. Divakaran, D. A. 2011. Comparative Study on Production of α-Amylase from Bacillus licheniformis Strains. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (4) 1397-1404. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Frazier, W. C. & Westhoff. 1988. Food Microbiology. New York: McGraw-Hill. Ginting,Y. 2009. Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Enzim Amilase Kasar Termofilik dari Sumber Air Panas. Skripsi: Universitas Sumatera Utara. Gufran, M. & Kordi. 2010. Panduan Lengkap Memelihara Ikan Air Tawar Di Kolam Terpal. Yogyakarta: Lily Publisher. Handayani, S. 2006. Studi efisiensi pemanfaatan karbohidrat pakan bagi pertumbuhan ikan gurame (Osphronemus goramy Lac.) sejalan dengan perubahan enzim pencernaan dan insulin. Desertasi: Institut Pertanian Bogor. Kurnia, B. 1997. Tingkat karbohidrat optimum dalam pakan untuk pertumbuhan ikan gurame (Osphronemus gouramy Lac.) berukuran rata-rata 25,0 gram. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga. Lestari, L.A., Fatma, Z.N. & Sudarmanto. 2013. Analisis Zat Gizi. Yogyakarta: Unveriversitas Gadjah Mada Press. Mutia, M. 2013. Isolasi dan karakterisasi enzim amilase dari akar rimpang alangalang (Imperata cylindrica). Skripsi. Universitas Hasanuddin. Mujiman, A. 1991. Makanan Ikan. Jakarta: Penebar Swadaya. Murdiyanto, B. 2005. Rancangan Percobaan. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada. Nursyirwani & Kathy, C.A. 2007. Isolasi dan karakteristik bakteri hidrokarbonoklastik dari perairan dumai dengan sekuen 16S rDNA. Jurnal Ilmu Kelautan. Vol 12 (1): 12-17. Ochoa-Solano, J. & Olmos-Soto, J. 2006. The functional property of Bacillus for shrimp feeds. Food Microbiology. 23: 519–525. Pelczar, M.J.Jr. & Chan, E.C.S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 1. Jakarta: Universitas Indonesia Press.
24
Pelczar, M.J.Jr. & Chan, E.C.S. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Polaina, J. & McCabe, A.P. 2007. Industrial Enzymes. Netherland: Springer. Pratiwi, D.A., Maryani, S., Skrikin, Suharno, Bambang, S. 2006. Biologi. Jakarta: Erlangga. Purwandani, L. P., Drajat, P. & Anna, R. 2012. Isolasi dan uji aktivitas enzim amilase dari isolat bakteri termofilik amilolitik pasca erupsi merapi pada berbagai variasi suhu dan pH. Skripsi: Universitas Negeri Yogyakarta. Rasmawan. 2009. Kinerja ikan gurame Osphronemus gouramy Lac. yang dipelihara pada media bersalinitas 0, 3, 6 dan 9 ppt dengan paparan medan listrik. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Sebayang, F. 2005. Isolasi dan Pengujian Aktivitas Enzim α Amilase dari Aspergillus niger dengan menggunakan media campuran onggok dan dedak. Jurnal Komunikasi Penelitian. 17 (5): 1,3 dan 4. Singleton & Sainsbury. 2006. Dictionary of Microbiology And Molecular Biology 3rd Edition. England:John Wileyand Sons. Sianturi, D.C. 2008. Isolasi bakteri dan uji aktivitas amilase termofil kasar dari sumber air panas penen sibirubiru sumatra utara. Tesis. Medan: Universitas Sumatra Utara. Soewoto, H. 2000. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta: Widya Medika. Souza, P.M. & Magalhaes, P.O. 2010. Application of Microbial α-Amylase in Industry – A Review. Brazilian Journal of Microbiology. 850-861. Suarni & Patong, R. 2007. Potensi kecambah kacang hijau sebagai sumber enzim α-Amilase. Indo. J. Chem. 7 (3); 332-336. Sudarmadji, S. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Liberty Sumrin, A., Ahmad, W., Ijaz, B., Sarwar, M.T., Gull, S., Kausar, H., Shahid, I., Jahan, S., Hussain, M & Riazuddin, S. 2011. Purification and Medium Optimization of α-amylase from Bacillus subtilis 168. African Journal of Biotechnology. 2119-2129. Sugiri, N. 1992. Biologi Sel. Depdikbud Direktorat Jendral Pendidikan Pusat Antar Universitas Ilmu Hayati: Institut Pertanian Bogor. Supriadi. 2006. Analisis risiko agens hayati untuk pengendalian patogen pada tanaman. Balai penelitian tanaman obat dan aromatik. Jurnal Litbang Pertanian. l 25 (3): 23-30. 25
Ward, O.P. 1983. Microbial and Enzyme Technology. New York: Applied Science Publishing. 251- 305. Widman, K. F. 1989. Tinjauan Klinis Atas Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta: EGC. Winarno, F.G. 1983. Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia. Windish, W.W. & Mhatre, N.S. 1965. Microbial Amylases. New York: Academic Press. Yazid, E. & Nursanti, L. 2006, Penuntun Praktikum Biokimia. Kanisius.
Yogyakarta:
26
