PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL MENGGUNAKAN KONJUGAT FUMONISIN B1-OVALBUMIN SEBAGAI ANTIGEN UNTUK DETEKSI FUMONISIN SECARA IMUNOASAI
ROMSYAH MARYAM
,
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa disertasi yang berjudul:
PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL MENGGUNAKAN KONJUGAT FUMONISIN B1-OVALBUMIN SEBAGAI ANTIGEN UNTUK DETEKSI FUMONISIN SECARA IMUNOASAI adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan oleh penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka.
Bogor, Agustus 2007
Romsyah Maryam NRP F 226014011/IPN
SUMMARY ROMSYAH MARYAM. Production of Monoclonal Antibodies using Fumonisin B1-Ovalbumin Conjugate as the Antigen for the Detection of Fumonisin by Immunoassay. Under supervision of ANTON APRIYANTONO as the chairman, RIZAL SYARIEF, FRANSISKA R. ZAKARIA and LIES PAREDE as the advisory committee members. Fumonisins are mycotoxins produced by Fusarium spp. mainly F. verticillioides and F. proliferatum which are commonly found in grains such as corn, rice dan wheat. Fumonisin B1 (FB1) the most abundant and most toxic, is classified as a possible carcinogen for humans (Group 2B) and one of the five important mycotoxins in the world. The toxicity of FB1 for humans and animals, as well as its economic impact have been reported worldwide. In order to minimize the risks of FB1 contamination some countries have set the maximum levels of fumonisin in foods and feeds. Although there is no report on mycotoxicoses related to FB1 contamination in Indonesia, some findings indicated high concentration of fumonisin contamination in agricultural products could affect the national income. Analytical methods play crucial roles in the detection of fumonisin contamination in foods and feeds. Immunoassay is one of the most reliable, rapid, sensitive, specific, and economical method. This assay based on polyclonal or monoclonal antibodies. The objective of this study was to produce monoclonal antibodies (MAb) against FB1 and to generate direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-ELISA) for fumonisin analysis. This study includes several activities: (1) Synthesis of fumonisin B1-Ovalbumin antigen (FB1-Ova) and the enzyme conjugate fumonisin B1-horseraddish peroxidase (FB1-HRP), (2) Production and characterization of monoclonal antibodies against FB1, (3) Optimization and validation of the dc-ELISA, (4) Application of dc-ELISA for the detection of fumonisin in foods or feeds. FB1 used for the synthesis of FB1-Ova and FB1-HRP was isolated from F. verticillioides and F. nygamai culture in corn which produced FB1 1.54 g/kg and 0.87 g/kg, respectively. The average of protein concentration of the antigen produced from the conjugation of FB1 and Ova via glutaraldehyde reaction was 0.0933 ± 0.0178 mg/ml (n=5). The antigen was proven to be immunogenic to BALB/c mice and could be used for the antibody sreening using indirect competitive ELISA (ic-ELISA). The reaction of FB1 and HRP resulted in the formation of FB1-HRP enzyme conjugate which could be used as a label in the analysis of FB1 by dc-ELISA. Monoclonal antibodies were produced by fusion of the splenic lymphocytes from the FB1-Ova immunized BALB/c mice with Sp2/0-Ag 14 myeloma cells using polyethylene glycol (PEG 4000). Antibodies produced by the hybridoma cells were screened, and eight clones of the hybridomas with high antibody titers were selected for cell cloning. The highest antibody-producing hybridoma (2B2F6) was clonned by limited dilution. The secreted antibodies from subclone 2B1F6F7 belonged to the immunoglobulin G1 (IgG1) subclass. The concentration of the antibodies from the supernatant and the ascitic fluids after precipitation with ammonium sulphate and purification using HiTrap Protein A HP were 2.81 mg/ml and 1.62 mg/ml, respectively.
The optimum condition for the dc-ELISA to detect 50 ng/ml FB1 required an antibody dilution of 1:10,000 and a FB1-HRP enzyme conjugate dilution of 1:400. The antibodies gave a specific reaction to FB1 with cross reactivity against fumonisin B2 (FB2) of 49%. The method sensitivity was 0,5 ng/ml with IC50 of 2,9 ng/ml. The dcELISA of spiked corn samples (40 ng FB1/g) showed good precision (SD=1.5%) and accuracy (SD=7.7%) with FB1 recovery ranging from 88.2 to 103.1%. FB1 standards in the concentration range of 1-50 ng/ml gave a linear response (R2= 0.9949) with regression equation Y= 7.1862 Ln(x) + 68.35. However, the linearity was reduced by the corn matrices (R2= 0.9841) at the same concentration range of FB1 standards. The ELISA method developed in this research had a good agreement with high performance liquid chromatographic method (HPLC) which indicated by the analytical results of FB1 in corn detected by the two methods (R2 = 0.9898). Analysis of commercial broiler dan layer feeds (n=10) using dc-ELISA revealed the presence of FB1 in the feeds ranging between 46.1 – 482.8 ng/g for the broiler feeds and 20.7 – 85.5 ng/g for the layer feeds. These levels were lower compared to the FB1 levels in poultry feeds in general. During storage at ambient temperature for six weeks, the concentration of FB1 in commercial chicken feeds gradually increased. This indicated that the production of FB1 by Fusarium spp. continued during the storage. However, the concentration of FB1 in both broiler and layer feeds were still low to cause mycotoxicoses in poultry. Direct competitive ELISA (dc-ELISA) is the most common immunoassay method used for the analysis of mycotoxins such as fumonisin. The dc-ELISA developed in this study using monoclonal antibodies showed a good performance when applied for the analysis of FB1 contaminated foods and feeds. The method is suitable for laboratories in the developing countries such as Indonesia in terms of support for food safety programs and global trade.
Keywords: monoclonal antibody, fumonisin B1-ovalbumin conjugate, fumonisin detection, immunoassay
RINGKASAN ROMSYAH MARYAM. Produksi Antibodi Monoklonal Menggunakan Konjugat Fumonisin B1-Ovalbumin Sebagai Antigen untuk Deteksi Fumonisin Secara Imunoasai. Di bawah bimbingan ANTON APRIYANTONO sebagai ketua komisi pembimbing, RIZAL SYARIEF, FRANSISKA R. ZAKARIA dan LIES PAREDE sebagai anggota. Fumonisin adalah mikotoksin yang dihasilkan oleh kapang Fusarium spp. terutama F. verticillioides dan F. proliferatum yang banyak dijumpai pada komoditas pertanian seperti jagung, beras dan gandum. Fumonisin B 1 (FB1) merupakan jenis fumonisin yang paling banyak ditemui di alam dan paling toksik, diklasifikasikan sebagai senyawa karsinogen (Grup 2B). FB1 termasuk dalam lima mikotoksin penting yang menjadi perhatian dunia. Toksisitas FB1 pada manusia dan hewan, serta dampak ekonomi yang disebabkan mikotoksin ini telah banyak dilaporkan. Oleh karenanya, untuk mengurangi risiko yang disebabkan karena kontaminasi FB1 beberapa negara telah menetapkan batas maksimum kandungan fumonisin ini dalam bahan pangan dan pakan. Meskipun di Indonesia belum ada laporan mengenai mikotoksikosis yang disebabkan oleh fumonisin dan belum ada laporan mengenai kerugian ekonomi, namun dari beberapa laporan yang mengindikasikan kontaminasi FB1 pada bahan pangan dan pakan yang cukup tinggi dapat mempengaruhi perekonomian nasional. Metode analisis memegang peranan penting dalam mendeteksi kontaminasi fumonisin pada bahan pangan dan pakan. Imunoasai adalah salah satu metode yang paling dapat diandalkan karena dengan metode ini proses analisis dapat dilakukan secara cepat dan mudah dengan sensitivitas dan spesifitas yang tinggi, serta ekonomis. Teknik ini menggunakan antibodi poliklonal atau monoklonal. Tujuan dari penelitian ini yaitu memproduksi antibodi monoklonal (AbMk) spesifik terhadap FB1 dan mengembangkan metode enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kompetitif langsung untuk analisis fumonisin. Penelitian ini terdiri dari beberapa kegiatan: (1) Sintesis antigen fumonisin B1-ovalbumin (FB1-Ova) dan konjugat enzim fumonisin B1horse raddish peroxidase (FB1-HRP), (2) Produksi dan karakterisasi antibodi monoklonal spesifik terhadap FB1, (3) Optimisasi dan validasi ELISA kompetitif langsung, (4) Aplikasi ELISA kompetitif langsung untuk mendeteksi fumonisin pada bahan pangan atau pakan. FB1 yang digunakan untuk sintesis antigen FB1-Ova dan FB1-HRP diisolasi dari biakan kapang F. moniliforme dan F. nygamai pada media jagung yang masingmasing menghasilkan FB1 1,54 g/kg dan 0,87 g/kg. Rataan konsentrasi protein dari antigen yang dihasilkan dari konjugasi FB1 dengan Ova melalui reaksi dengan glutaraldehida yaitu 0,0933 ± 0,00178 mg/ml (n=5). FB1-Ova yang terbentuk dari reaksi tersebut bersifat imunogenik, terlihat dengan adanya respon antibodi pada mencit BALB/c yang diimunisasi dengan antigen tersebut, dan dapat digunakan sebagai pereaksi untuk pengujian antibodi secara ELISA kompetitif tidak langsung. Reaksi antara FB1 dan enzim horseraddish peroxidase (HRP) menghasilkan FB1-HRP enzim konjugat yang dapat digunakan sebagai label pada analisis FB1 secara ELISA kompetitif langsung. Antibodi monoklonal dihasilkan melalui fusi sel limfosit mencit yang diimunisasi FB1-Ova dengan sel mieloma Sp2/0-Ag14 menggunakan polietilen glikol (PEG 4000). Antibodi yang dihasilkan oleh hibridoma diskrining, dan delapan klon
dari sel hibrid dengan titer antibodi yang tinggi diseleksi untuk kloning sel. Hibridoma yang menghasilkan antibodi tertinggi (2B2F6) diklon melalui pengenceran terbatas. Antibodi yang disekresikan oleh subklon 2B2F6F7 termasuk dalam subkelas imunoglobulin G1 (IgG1). Konsentrasi antibodi dari supernatan dan cairan asites setelah pengendapan dengan ammonium sulfat dan pemurnian melalui kolom HiTrap Protein A HP masing-masing 2,81 mg/ml dan 1,62 mg/ml. Kondisi optimum ELISA tak langsung untuk mendeteksi 50 ng/ml FB1 memerlukan pengenceran antibodi 1:10.000 dan konjugat enzim FB1-HRP 1:400. Antibodi tersebut memberikan reaksi yang spesifik terhadap FB1 dengan reaksi silang terhadap fumonisin B2 (FB2) sebesar 49%. Sensitivitas metode ini yaitu 0,5 ng/ml dengan IC50 2,9 ng/ml. Analisis sampel jagung yang diberi standar FB1 (40 ng/g) secara ELISA kompetitif langsung menunjukkan presisi (SD=1,5%) dan akurasi (SD=7,7%) yang baik dengan rekoveri berkisar antara 88,2-103,1%. FB1 standar pada kisaran konsentrasi 1-50 ng/ml menunjukkan garis linear (R2=0,9949) dengan persamaan regresi Y=7,1862 Ln(x) + 68,35. Namun, linearitas menurun dengan adanya matriks jagung (R2= 0,9841) pada kisaran konsentrasi standar FB1 yang sama. Perbandingan analisis FB1 dalam jagung (n=10) secara ELISA kompetitif langsung dengan metode KCKT menunjukkan korelasi yang baik di antara kedua metode tersedbut (R2=0,9898). Analisis pakan ayam komersial (n=10) secara ELISA kompetitif langsung menunjukkan adanya kontaminasi FB1 pada kisaran 46,1–482,8 ng/g untuk pakan ayam pedaging dan 20,7–85,5 ng/g untuk pakan ayam petelur. Konsentrasi tersebut lebih rendih dibandingkan dengan konsentrasi FB1 pada pakan ayam pada umumnya. Perlakuan penyimpanan kedua jenis pakan pakan tersebut pada temperatur kamar selama enam minggu menunjukkan adanya peningkatan konsentrasi FB1. Hal ini menunjukkan bahwa produksi FB1 oleh Fusarium spp. terus berlangsung selama penyimpanan. ELISA kompetitif langsung adalah metode imunoasai yang paling banyak digunakan untuk analisis mikotoksin termasuk fumonisin. Metode ELISA kompetitif langsung yang dikembangkan pada penelitian ini dengan menggunakan antibodi monoklonal menunjukkan performan yang baik ketika diaplikasikan untuk menganalisis bahan pangan dan pakan yang terkontaminasi FB1. Metode ini sesuai untuk digunakan pada laboratorium-laboratorium di negara berkembang seperti Indonesia guna mendukung program keamanan pangan dan perdagangan global.
Kata kunci: antibodi monoklonal, konjugat fumonisin B1-ovalbumin, deteksi, fumonisin, imunoasai
©Hak Cipta Milik Institut Pertanian Bogor, Tahun 2007 Hak Cipta Dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari IPB, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetakan, fotokopi, mikrofilm dan sebagainya
PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL MENGGUNAKAN KONJUGAT FUMONISIN B1-OVALBUMIN SEBAGAI ANTIGEN UNTUK DETEKSI FUMONISIN SECARA IMUNOASAI
ROMSYAH MARYAM
Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup: Dr. drh. Retno D. Soejoedono, MS Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka: 1. Dr. drh. Agustin Indrawati, M.Biomed 2. Dr. Tri Budhi Murdiati, MSc.
Judul Disertasi
: Produksi antibodi monoklonal menggunakan konjugat fumonisin B1-ovalbumin sebagai antigen untuk deteksi fumonisin secara imunoasai
Nama Mahasiswa : Romsyah Maryam Nomor Pokok
: F226014011
Progam Studi
: Ilmu Pangan
Disetujui: Komisi Pembimbing
Dr.Ir. Anton Apriyantono, MS Ketua
Prof.Dr.Ir. Rizal Syarief, DESS Anggota
Prof.Dr. Ir.Fransiska R. Zakaria, MSc Anggota
Drh. Lies Parede, MSc, PhD Anggota
Ketua Program Studi Ilmu Pangan
Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS NIP. 130 516 873 Tanggal ujian: 2 Juli 2007
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Chairil Anwar Notodiputro, MS NIP. 130 891 386 Tanggal lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang berkat rahmat, serta taufik dan hidayahNya penulisan disertasi ini dapat diselesaikan. Disertasi berjudul “Produksi Antibodi Monoklonal Menggunakan Konjugat Fumonisin B1Ovalbumin Sebagai Antigen untuk Deteksi Fumonisin Secara Imunoasai” ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar doktor pada Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini penulis sampaikan ucapan terima kasih yang tulus serta penghargaan yang setinggi-tingginya kepada Bapak Dr. Ir. Anton Apriyantono, MS selaku Ketua Komisi Pembimbing atas segala bimbingan dan arahannya selama pendidikan dan penyelesaian studi. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Rizal Syarief, DESS., Ibu Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, MSc., serta Ibu Drh. Lies Parede, MSc.PhD selaku Anggota Komisi Pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan masukan kepada penulis selama penelitian hingga selesainya penulisan disertasi ini. Terima kasih kepada Dr. drh. Retno D. Soejoedono, MS selaku penguji luar komisi yang bersedia menguji pada ujian tertutup, serta Dr. drh. Agustin Indrawati, M.Biomed dan Dr. Tri Budhi Murdiati, MSc. selaku penguji luar komisi pada ujian terbuka Program Studi Doktor di Institut Pertanian Bogor. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Rektor dan Pembantu Rektor IPB, Dekan Sekolah Pasca Sarjana, Dekan dan Wakil Dekan Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB, Ketua Program Studi Ilmu Pangan IPB untuk kesempatan yang telah diberikan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan S3 di IPB. Kepada Kepala Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET), Ketua Kelti Toksikologi dan Virologi, yang telah memberikan kesempatan dan fasilitas, serta dukungan moril bagi penulis untuk melaksanakan penelitian hingga selesainya masa studi. Terima kasih kepada Badan Litbang Pertanian Departemen Pertanian atas bantuan beasiswa melalui Proyek PAATP. Terima kasih disertai rasa hormat penulis sampaikan kepada Ibunda tercinta dan Ayahanda (almarhum) atas segala do’a restu, serta dukungannya sehingga penulis dapat menyelesaikan studi ini. Kepada Kakak dan adik tercinta, terima kasih atas segala cinta kasih dan dorongan semangat yang diberikan selama ini. Terima kasih kepada Prof. DR. drh. Sjamsul Bahri, MS., drh. Indraningsih, DR. R. Widiastuti, Sri Rachmawati, MSc, drh. Adin Priadi, Dra. Helmy Hamid, MSc. Dra. Masniari,MS., drh. Andriani, MSi. atas segala saran dan dorongan semangatnya, dan Zakiah Muhajan, SS,M.Hum dan seluruh staf perpustakaan BBALITVET dan IPB yang telah membantu penelusuran literatur untuk penulisan disertasi ini. Terima kasih kepada Siti Djuariah dan rekan-rekan di lab. Toksikologi,Virologi dan Bioteknologi BBALITVET atas segala bantuannya selama masa penelitian. Kepada Tati Ariyanti terima kasih atas kesediaannya menjadi proof reader pada penulisan disertasi ini. Kepada rekan-rekan program studi IPN Mbak Mar, Rahma, Ria, Rifda,Yuyun, Bu Asriani dan Mbak Susi, terima kasih untuk persahabatan yang tulus dan kerjasama yang baik selama ini. Terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu kelancaran penelitian hingga selesainya penulisan ini. Menyadari akan segala kekurangan yang terdapat pada penulisan disertasi ini, dimohon saran dan masukannya untuk perbaikan. Semoga disertasi ini bermanfaat khususnya bagi perkembangan IPTEK dan masyarakat pada umumnya.
Bogor, Agustus 2007 Romsyah Maryam
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 18 Juni 1964 di Bogor sebagai putri ke enam dari pasangan Bapak Madhari dan Ibu Rosmah. Penulis menempuh pendidikan sarjana pada Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pakuan di Bogor dan lulus pada tahun 1990. Pada tahun 1997 penulis mendapat beasiswa AusAID untuk mengikuti pendidikan program master di School of Medicine Queensland University, Australia dan lulus pada tahun 1999. Selanjutnya, penulis berkesempatan untuk melanjutkan studi Progam Doktor pada Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor pada tahun 2002 dengan beasiswa PAATP Badan Litbang Pertanian, Departemen Pertanian. Sejak tahun 1983 penulis bekerja sebagai teknisi di Kelti Toksikologi dan tahun 1991 mendapat promosi menjadi staf peneliti di Kelti yang sama pada Balai Besar Penelitian Veteriner hingga saat ini. Penelitian yang dilakukan oleh penulis yaitu bidang toksikologi, khususnya penelitian penanggulangan masalah mikotoksin dan pengembangan metode deteksi. Sealin melaksanakan penelitian, penulis juga menjadi anggota Perhimpunan Mikologi Kedokteran Indonesia dan Ikatan Sarjana Wanita Indonesia. Selama masa pendidikan program S3 telah dipublikasi 2 karya ilmiah yang berjudul “ Metode deteksi mikotoksin” dan Produksi fumonisin oleh kapang Fusarium moniliforme dan Fusarium nygamai pada medium jagung” pada jurnal Mikologi Kedokteran Indonesia tahun 2006. Karya-karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari disertasi yang disusun oleh penulis.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ............................................................................................ vi DAFTAR GAMBAR .......................................................................................
vii
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................
x
PENDAHULUAN ............................................................................................
1
Latar Belakang .......................................................................................
1
Perumusan Masalah ...............................................................................
3
Tujuan Penelitian ...................................................................................
4
Manfaat Penelitian .................................................................................
5
Hipotesis ................................................................................................
5
TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................
6
Fumonisin ...........................................................................................
6
Kapang Penghasil Fumonisin ........................................................
6
Sifat Kimia Fisika .........................................................................
8
Biosintesis Fumonisin....................................................................
9
Jenis-jenis Fumonisin ....................................................................
10
Kontaminasi pada pangan/ dan pakan ...........................................
13
Metode analisis fumonisin.............................................................
16
Imunoasai ...........................................................................................
19
Peran sistem imun dan antibodi ....................................................
20
Prinsip Imunoasai .........................................................................
22
Antigen .........................................................................................
23
Antibodi .......................................................................................
24
Produksi Antibodi oleh Sel Limfosit B ........................................
25
Produksi Antibodi Monoklonal ....................................................
29
Imunisasi ................................................................................
29
Produksi dan kultur hibridoma ...............................................
30
Skrining antibodi ....................................................................
33
Karakterisasi dan purifikasi antibodi ......................................
33
Visualisasi Imunoasai .................................................................... 34 Aplikasi Antibodi Monoklonal ...................................................... 36
iii
Halaman
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ............................. 36 Disain dan Konfigurasi ELISA ...................................................... 37 ELISA kompetitif langsung ..................................................... 37 ELISA kompetitif tak langsung ............................................... 38 ELISA penangkap antibodi ...................................................... 40 ELISA sandwich antibodi ganda .............................................. 40 Aplikasi ELISA untuk deteki fumonisin ........................................ 40 Daftar Pustaka ..................................................................................... 42 PRODUKSI DAN ISOLASI FUMONISIN B1 DARI BIAKAN KAPANG FUSARIUM VERTICILLIOIDES DAN FUSARIUM NYGAMAI PADA MEDIUM JAGUNG Abstrak ..................................................................................................
51
Abstract .................................................................................................. 51 Pendahuluan ........................................................................................... 52 Materi dan Metode ................................................................................
53
Hasil dan Pembahasan ........................................................................... 56 Kesimpulan ............................................................................................ 62 Daftar Pustaka ........................................................................................ 62
SINTESIS ANTIGEN FUMONISIN B1-OVALBUMIN DAN FUMONISIN B1-HORSERADDISH PEROXIDASE ENZIM KONJUGAT Abstrak .................................................................................................. 65 Abstract .................................................................................................. 66 Pendahuluan ........................................................................................... 66 Materi dan Metode ................................................................................
68
Hasil dan Pembahasan ........................................................................... 73 Kesimpulan ............................................................................................ 82 Daftar Pustaka ........................................................................................ 83
iv
Halaman PRODUKSI DAN KARAKTERISASI ANTIBODI MONOKLONAL TERHADAP FUMONSIN Abstrak ..................................................................................................
86
Abstract .................................................................................................. 86 Pendahuluan ........................................................................................... 87 Materi dan Metode ................................................................................
88
Hasil dan Pembahasan ........................................................................... 96 Kesimpulan ........................................................................................... 107 Daftar Pustaka ....................................................................................... 108 STANDARDISASI DAN APLIKASI METODE ELISA BERBASIS ANTIBODIMONOKLONAL UNTUK DETEKSI FUMONISIN PADA PANGAN DAN PAKAN Abstrak .................................................................................................. 110 Abstract ................................................................................................. 111 Pendahuluan .......................................................................................... 111 Materi dan Metode ............................................................................... 112 Hasil dan Pembahasan .......................................................................... 115 Kesimpulan .......................................................................................... 123 Daftar Pustaka ...................................................................................... 123
PEMBAHASAN UMUM Produksi dan Isolasi Fumonisin ............................................................ 127 Sintesis antigen FB1-Ova dan FB1-HRP enzim konjugat ..................... 128 Produksi hibridoma melalui fusi menggunakan polietilen glikol ......... 129 Produksi dan karakterisasi antibodi monoklonal .................................. 130 Standardisasi dan aplikasi ELISA berbasis antibodi monoklonal untuk untuk deteksi fumonisin pada bahan pangan dan pakan .............. 130 Daftar Pustaka ........................................................................................ 131
v
Halaman
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan .......................................................................................... 134 Saran ..................................................................................................... 135 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 137 LAMPIRAN ..................................................................................................... 150
vi
DAFTAR TABEL Halaman 1
Spesies Fusarium spp. penghasil fumonisin dan pengelompokannya…….
7
2
Jenis-jenis fumonsin dan gugus fungsinya ……………………………..... 10
3
Kontaminasi fumonisin pada berbagai jenis komoditas pertanian yang digunakan sebagai bahan pangan maupun pakan di Indonesia .......... 15
4
Perbedaan sifat antara sistem imun no spesifik dan spesifik ...................... 21
5
Perbedaaan sifat antara antibodi poliklonal dan monoklonal ..................... 29
6
Galur-galur mieloma dan limfoblastoid yang dapat digunakan untuk produksi hibridoma .................................................................................... 31
7
Perlakuan pada produksi fumonisin dengan menggunakan media jagung . 55
8
Jadual imunisasi mencit BALB/c untuk pembuatan antiserum ................
9
Komposisi gel elektroforesis yang digunakan untuk konfirmasi
70
pembentukan antigen FB1-Ova dan FB1-HRP enzim konjugat..................
72
10
Pengukuran protein dari antigen FB1-Ova dengan spektrofotometer .......
78
11
Pengukuran protein dari FB1-HRP enzim konjugat dengan spektrofotometer................................................................................ .......
81
12
Program imunisasi mencit BALB/c dangan FB1-Ova secara intra vena ..
90
13
Respon antibodi yang terdeteksi pada serum mencit yang diimunisasi Dengan FB1-Ova pada pengenceran 1:5.000 ............................................
14
97
Pengukuran protein dari antibodi dalam supernatan setelah pemurnian melalui kolom HiTrap Protein A HP dengan spektrofotometer .............. 102
15
Pengukuran protein dari antibodi dalam cairan asites mencit setelah pemurnian melalui kolom HiTrap Protein A HP pada spektrofotometer ...................................................................................... 103
16
Rekoveri FB1 pada sampel jagung yang dideteksi menggunakan metode ELISA kompetitif langsung berbasis antibodi monoklonal ......... 116
17
Analisis FB1 pada jagung dengan ELISA kompetitif langsung dan KCKT ....................................................................................................... 126
18 Konsentrasi FB1 dalam pakan ayam pedaging selama penyimpanan …… 121 19
Konsentrasi FB1 dalam pakan ayam petelur selama penyimpanan .......... 121
vii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Kontaminasi kapang Fusarium spp. pada jagung hibrida lokal, morfologi F. verticillioides dan F. nygamai koleksi Bbalitvet Culture Collection (BCC) ...........................................................................
8
2. Struktur dasar fumonisin (Rheeder et al. 2002) .........................................
8
3 Bosintesis fumonisin (Abbas et a.l 1996) ...................................................
9
4 Struktur kimia fumonisin B1 (EHC 2000) ..................................................
10
5 Perbandingan struktur fumonisin dan sfingosin .........................................
12
6 Struktur dasar imunoglobulin (Ig) ..............................................................
25
7 Kinetika respons antibodi: Pembentukan IgM sebagai respon primer dan pembentukan IgG pada respon sekunder ..................................................
26
8 Antigen dengan berbagai epitop ...............................................................
26
9 Produksi antibodi poliklonal oleh sel B ....................................................
27
10 Produksi antibodi monoklonal oleh sel B ................................................
28
11 Struktur kimia polietilen glikol (PEG) ......................................................
32
12 Sistem seleksi dengan medium HAT ........................................................
33
13 Tahapan pada ELISA kompetitif langsung (Rittenberg 1990) ..................
38
14 Tahapan pada ELISA kompetitif tidak langsung (Rittenberg 1990)..........
39
15 Kontaminasi alami kapang Fusarium spp. pada jagung lokal ...................
54
16 Pertumbuhan kapang F. moniliforme dan F. nygamai pada media PDA setelah inkubasi 7 hari pada suhu 25oC dan 37oC .....................................
57
17 Pertumbuhan kapang F. moniliforme dan F. nygamai pada media jagung setelah inkubasi 7 hari ...............................................................................
57
18 Pola produksi FB1 oleh F. Moniliforme dan F. nygamai pada media jagung dengan suhu penyimpanan 25oC dan 37oC ...................................
59
19 Konsentrasi FB1 pada tiap fraksi ekstrak biakan F. verticillioides ............
60
20 Fumonisin B1 pada ekstrak biakan F. moniliforme setelah pemurnian melalui XAD-2 dan deteksi dengan HPLC ...............................................
61
21 Reaksi pada sintesis antigen FB1-Ova melalui jalur glutaraldehida .........
75
viii
Halaman
22
Konfigurasi antigen FB1-Ova, antiserum, goat anti-mouse IgG-HRP enzim konjugat pada dot blot immunoassay dan ELISA tidak langsung ............. 76
23
Konfirmasi hasil sintesis antigen FB1-Ova ............................................... 77
24
Konfirmasi pembentukan FB1-HRP dan ELISA kompetitif langsung ...... 79
25
Konfigurasi antibodi/antiserum, antigen, FB1-HRP enzim konjugat pada ELISA kompetitif langsung ..............................................................
26
80
Konfirmasi pembentukan FB1-Ova dan FB1-HRP dengan SDS-PAGE ...............................................................................................
27
82
Pertumbuhan sel mieloma Sp2/0-Ag14 pada fasa logaritmik dalam medium RPMI mengandung 10% FBS ....................................................
98
28
Proses fusi antara sel mieloma dengan sel limfosit .................................
99
29
Klon-klon dari sel hibridoma yang tumbuh 6 minggu setelah fusi ..........
99
30
Proses kloning dari sel hibridoma dan kultur sel dari klon 2B1F6 dalam medium RPMI mengandung 10% FBS ......................................... 100
31
Grafik pertumbuhan sel hibridoma klon 2B1F6 yang dikultur kembali dalam medium RPMI setelah penyimpanan dalam nitrogen cair selama satu bulan ................................................................................................. 101
32
Pola grafik fraksinasi imunoglobulin G (IgG) dari supernatan pada kolom HiTrap Protein A HP ...................................................................
33
Pola grafik fraksinasi imunoglobulin G1 (IgGi) dari cairan asites pada kolom HiTrap Protein A HP ..........................................................
34
102
104
Uji sub kelas imunoglobulin (Ig) yang disekresikan sel hibridoma subklon 2B1F6F7 pada supernatan dengan ELISA penangkap menggunakan kit identifikasi subkelas imunoglobulin (Sigma) .............
35
105
Konfigurasi ELISA pada pengujian subkelas imunoglubulin dari Antibodi monoklonal (AbMk) yang dihasilkan oleh sel hibridoma subklon 2B1F6F7 ...................................................................................................
36
105
Analisis imunoglobulin dalam supernatan dan asites mencit setelah purifikasi melalui kolom HiTrap Protein A HP .....................................
106
ix
Halaman
37
Performan standar FB1 dan FB2 yang dideteksi secara ELISA kompetitif lansung menggunakan antibodi monoklonal (supernatan) dari subklon 2B1F6F7 .............................................................................. 118
38
Pola grafik ELISA kompetitif langsung dan linearitas FB1 menggunakan antibodi monoklonal (supernatan) dari klon 2B1F6 ...
39
118
Kurva kalibrasi standar FB1 dalam matriks jagung pada pengujian FB1 secara ELISA kompetitif langsung ................................................. 119
40
Korelasi metode ELISA kompetitif langsung dengan menggunakan AbMk dari klon 2B1F6 dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) .................................................................................................
41
120
Pengaruh penyimapanan terhadap konsentrasi FB1 pada pakan yang disimpan selama 42 hari (6 minggu) ............................................
122
x
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
1 Pembuatan pereaksi ................................................................................... 150 2 Medium dan pereaksi yang digunakan untuk pembiakan sel .................... 153 3 Prosedur ELISA tidak langsung untuk uji antibodi pada serum, supernatan atau cairan asites ........................................................................................ 154 4 Prosedur ELISA kompetitif langsung untuk mendeteksi fumonisin.......... 155 5 Titer antibodi serum (antiserum) dari mencit yang diimunisasi dengan antigen FB1-Ova ........................................................................................ 156 6 Pengujian antibodi yang disekresikan oleh sel hibridoma ........................
157
7 Pengujian antibodi yang dihailkan oleh subklon 2B1F6F7 dalam supernatan dan cairan asites .....................................................................
158
8 Penentuan kondisi optimum antigen, antibodi dan enzim konjugat untuk pengujian antibodi secara ELISA tidak langsung ....................................
159
9 Skrining antibodi dari kultur sel hibridoma .............................................
160
10 Uji linieritas, sensitivitas dan IC50 secara ELISA kompetiti langsung ....
162
11 Analisis FB1 dalam pakan ayam pedaging secara ELISA kompetitif langsung ....................................................................................................
163
12 Analisis FB1 dalam pakan ayam petelur secara\ ELISA kompetitif langsung .. ................................................................................................... 164 13 Analisis varian (ANOVA) perlakuan penyimpanan pakan ayam pedaging dan petelur .................................................................................................. 165
