Producta ab ADN recombinante

Producta ab ADN recombinante

Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.8-1

07/2007:0784 REKOMBINÁNS DNS TECHNOLÓGIÁVAL ELŐÁLLÍTOTT TERMÉKEK

Producta ab ADN recombinante E cikkely a rekombináns DNS technológiával előállított termékek gyártására és fejlesztésére vonatkozó általános követelményeket írja elő. E cikkely követelményei nem feltétlenül terjednek ki az egyes készítmények valamennyi jellemzőjére, ezért az egyedi cikkelyek vagy az illetékes hatóság további követelményeket is előírhat. A cikkely nem alkalmazható azokra a módosított élő mikroorganizmusokra, melyeket közvetlen humán és állati felhasználás céljára állítottak elő, pl. az élő vakcinákra. DEFINICIÓ Az rDNS termékeket génmódosítási eljárással állítják elő, melynek során a kívánt terméket kódoló DNS fragmenst – rendszerint plazmid, vagy vírus eredetű vektor felhasználásával – beillesztik a megfelelő mikroorganizmusba vagy sejtvonalba, így azokban a DNS szakasz kifejeződik és megtörténik a fehérjére való átírás (transzláció). A kívánt termék extrakcióval és tisztítással nyerhető ki. A sejtet vagy a mikroorganizmust a vektor bejutását megelőzően gazdasejtnek, a gazdasejt és a vektor gyártási folyamat során használt stabil együttesét pedig gazda-vektor rendszernek nevezzük. ELŐÁLLÍTÁS Az előállítás validált oltócsírarendszeren alapul, az illetékes hatóság által elfogadott, bizonyítottan alkalmas gazda-vektor kombinációt használva. Az oltócsírarendszerhez a gazda-vektor kombináció oltócsíra–törzstételéből származó törzs-, és szaporító sejtbankokat használják. A termelési, az extrakciós és tisztítási lépések részletes leírását, továbbá a gyártási tétel definícióját rögzíteni kell. Amennyiben az rDNS termékeket emberi vagy állati eredetű anyagok felhasználásával állították elő, az 5.1.7 Vírusbiztonság c.fejezet követelményeit alkalmazni kell. A gazda-vektor kombináció alkalmassági vizsgálatának oltócsírarendszer validálásának az alábbiakra kell kiterjednie:

továbbá

az

Producta ab ADN recombinante A GÉNMÓDOSÍTÁS (GÉNEXPRESSZIÓ)

(KLÓNOZÁS)

Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.5.8-2 ÉS

A

GÉNKIFEJEZŐDÉS

A gazda-vektor rendszer alkalmasságát, különös tekintettel a mikrobiológiai tisztaságra az alábbi módon kell bizonyítani: A gazda-sejt jellemzése, beleértve a forrást, a feno-, és genotípust és a sejttenyészet táptalaját. A gén-klónozás stratégiájának dokumentálása, és a rekombináns vektor jellemzése, beleértve az alábbiakat: 1.

a gén eredete és jellemzése

2.

a klónozott gén és a közvetítő vektorban a beépített gént szegélyező régiók nukleotid-szekvencia analízise. A klónozott szekvenciák számát minimálisra kell csökkenteni és az összes releváns kifejezett szekvenciát egyértelműen azonosítani kell és az azonosságot RNS szinten még egyszer meg kell erősíteni A klónozott gén DNS-szekvenciájának megerősítését általában az oltócsíra szintjén és az üzemi méretű termelés szokásos populációkétszerező szintje előtt és az után is el kell végezni. Bizonyos rendszerekben, pl., ahol a gén több másolata is bekerül a folyamatos sejtvonal genetikai állományába, előfordulhat, hogy a termelési szint nem alkalmas a klónozott gén szekvenciaanalízisére. Ilyen esetekben hasznos lehet a sejt teljes DNS állományának „Southern-blot” analízissel történő vizsgálata, vagy a hírvivő RNS (mRNS) szekvenciaanalízise, és különös figyelmet kell fordítani a szintetizált fehérje jellemzésére is

3.

a teljes közvetítő vektor felépítése, genetikája és szerkezete.

A gazda-vektor rendszer jellemzése az alábbiakat foglalja magába: 1.

a vektor gazdasejtbe történő bejutásának mechanizmusa

2.

A vektor gazda sejten belüli másolatainak száma, fizikai állapota és stabilitása

3.

a kifejeződés elősegítésére és ellenőrzésére tett intézkedések.



SEJTBANK-RENDSZER A törzs-sejtbank a kívánt gént tartalmazó közvetítő vektor által már átalakított eredeti sejtek homogén szuszpenziója, melyet tárolás céljából (pl. folyékony nitrogénben) különálló tároló edényekben egyenlő részletekben osztottak el. Bizonyos esetekben szükséges lehet, hogy külön törzs-sejtbankot hozzanak létre a közvetítő vektornak és a gazdasejtnek is. A szaporító sejtbank a törzs-sejtbank(ok)ból korlátozott számú átoltással nyert homogén sejtszuszpenzió, melyet tárolás céljából (pl. folyékony nitrogénben) különálló edényekben egyenlő részletekben osztottak el. Mindkét sejtbank esetén valamennyi tárolóedényt azonos módon kell kezelni, és a tárolóhelyről kivett tárolóedényt oda visszatenni nem szabad. A sejtbank alkalmazható korlátozott számú átoltással végzett előállításra és folyamatos tenyésztéssel végzett előállításra is. Korlátozott számú átoltással végzett előállítás Erre a termelési eljárásra jellemző, hogy a gyártási folyamat során a populációkétszereződés ill. az átoltások száma limitált. Meg kell adni az elvégezhető átoltások vagy sejtkétszerezések azon maximális számát, melyek esetén a gyártási folyamat rutinszerűen teljesíti az alábbiakban leírt követelményeket. Előállítás folyamatos tenyésztéssel Ennél a tenyésztési eljárásnál nem korlátozott az előállítás kezdetétől számított populációkétszerezések ill. átoltások száma. Az aratás, csakúgy mint az előállítás befejezésének követelményeit a gyártó határozza meg. Monitorozásra a tenyészet teljes élettartama alatt szükség van; a monitorozás kívánt gyakoriságát, típusát az előállítási rendszer és a termék természete szabja meg. Információval kell rendelkeznünk a kifejeződő gén molekuláris integritásáról ill. a gazdasejt feno-, ill. genotípusának jellemzőiről a hosszú ideig tartó tenyésztés után. Az aratások további feldolgozásra történő elfogadását egyértelműen össze kell kapcsolni a monitorozási programmal, emellett a további feldolgozásra szánt termék gyártási tételének pontos definiálására is szükség van. A SEJTBANK VALIDÁLÁSA

A sejtbank validálása magába foglalja:



1.

az életképesség és a vektor megtartó képesség vizsgálatát

2.

a sejtek fenotípusos jellemzők alapján történő azonosítását

3.

ahol szükséges, annak bizonyítását, hogy a sejtbank mentes a potenciálisan onkogén vagy fertőző ágensektől (vírus, baktérium, gomba vagy mikoplazma). Kitüntetett figyelmet kell szentelni azoknak a vírusoknak, amelyek gyakran előfordulnak olyan fajokban, melyekből a sejtvonal származik. Bizonyos sejtvonalak endogén vírusokat (pl retrovírusokat) tartalmaznak, melyeket nem könnyű eltávolítani. Ezek kifejeződését több, olyan körülményrendszert alkalmazva is vizsgálni kell, melyekről ismert, hogy elősegítik az adott organizmus indukcióját

4.

emlőssejtek esetén a sejtbank tumorképző aktivitásának részletes vizsgálatát.

A SEJTEK ELLENŐRZÉSE

Minden sejtbank eredetét, formáját, tárolását, felhasználását és a tervezett felhasználási sebesség mellett vizsgált stabilitását – a tárolás és a visszanyerés körülményei között – teljes körűen dokumentálni kell. Az új sejtbankokat teljes mértékben validálni kell. AZ ELŐÁLLÍTÁSI ELJÁRÁS VALIDÁLÁSA

Kivonás és tisztítás Valamennyi, a gazdasejtből vagy táptalajból származó szennyező anyag különösen vírusrészecskék, fehérjék, nukleinsavak és hozzáadott anyagok eltávolítására és/vagy inaktiválására irányuló tisztítási és extrakciós lépést validálni kell. A validálási vizsgálatokkal azt kell bizonyítani, hogy a rutinszerűen elvégzett előállítási műveletek eleget tesznek az alábbi követelményeknek: -

idegen ágensek eltávolítása a termékből. Vizsgálatokat kell végezni, pl. megfelelő fizikai-kémiai tulajdonságokkal rendelkező vírusok hozzáadásával, és meg kell állapítani, hogy milyen mértékben képesek a tisztítási lépések a szennyező anyagok mennyiségét csökkenteni.



-

a vektorból, a gazdasejtből, a táptalajból, illetve a reagensből származó szennyezők célzott eltávolítása. A DNS–re vonatkozó redukciós kapacitást mesterséges elszennyezési (spiking) módszerrel kell megállapítani. Az állati eredetű fehérjék mennyiségének csökkenését immunkémiai módszerekkel kell követni.

-

termékre előírt kitermelési érték fenntartása

-

A tárolni kívánt gyártási intermedierek megfelelő stabilitásának igazolása.

Az anyag jellemzése Mindenekelőtt az ömlesztett végtermék azonosság-, tisztaság-, hatóanyagtartalom és stabilitásvizsgálatát kell elvégezni számos kémiai, fizikai, immunkémiai és biológiai vizsgálatot alkalmazva. A gyártási tétel felszabadítása előtt a gyártónak minden esetben el kell végezni a termék azonossági és tisztasági vizsgálatát továbbá hatóanyagtartalmának meghatározását. Az előállítás állandósága Az előállítás és a tisztítás állandóságának bizonyítására vizsgálatokat kell végezni. Ide tartoznak, pl. az alábbi, az anyag jellemzésére szolgáló vizsgálatok, gyártásközi valamint végtermékkel végzett vizsgálatok. AMINOSAV ÖSSZETÉTEL

Részleges aminosav-szekvencia analízis. A szekvencia adatok lehetővé teszik, hogy kimutassuk, hogy a fehérje N-terminálisán végbementek-e az érési/módosítási folyamatok, valamint a C-terminálison nem történt-e esetleg aminósav-vesztés. Peptid-térkép. A fehérje-termék kémiai és/vagy enzimatikus bontását követően, alkalmas eljárással, pl. kétdimenziós gélelektroforézissel, kapilláris elektroforézissel vagy folyadékkromatográfiával vizsgálva, a vizsgált fehérjéről és a standard készítményről készített peptid-térkép nem különbözhet szignifikánsan egymástól. A peptid-térkép emellett alkalmas a meglévő diszulfid kötések meglétének igazolására is. MOLEKULATÖMEG MEGHATÁROZÁSA

A klónozott gén megtartása. A tenyésztés után a vektort, vagy a klónozott gént tartalmazó sejtek megengedett legkisebb mennyiségét (%-ban kifejezve) az illetékes hatóság hagyja jóvá.



Összes-fehérje. A fehérje kitermelést meg kell határozni. Kémiai tisztaság. A fehérje-termék tisztaságát referencia készítménnyel összehasonlítva, alkalmas módszerrel – mint pl. folyadékkromatográfia, kapilláris elektroforézis vagy nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDSPAGE) – kell meghatározni. Gazdasejt eredetű fehérjék. A gazdasejt eredetű fehérjék immunkémiai módszerekkel határozhatók meg, pl. – hacsak nincs más előírás – a termék előállításához alkalmazott gazda-vektor rendszer fehérje komponenseivel szemben termelődött poliklonális antitestek felhasználásával. A következő típusú eljárások alkalmazhatók: folyékony-fázisú kiszorításos meghatározások (pl. radioimmunmódszerek), folyékony fázisú direkt kötődésen alapuló meghatározások és olyan közvetlen kötődésen alapuló meghatározás, ahol nitrocellulóz (vagy ahhoz hasonló) membránra immobilizált antigéneket alkalmaznak (pl. „dot-immunoblot” módszer, Western-blot módszer). Az immunkémiai eljárások validálásának általános követelményei a 2.7.1. Immunkémiai Módszerek c. fejezetben találhatók meg. A gazdasejt szennyezők meghatározására végzett immunkémiai módszereknek az alábbi követelményeknek is meg kell felelniük: - Antigén készítmények. Az antiszérumot olyan antigén készítménnyel kell termeltetni, melyet olyan gazdasejtből nyernek, melybe a gyártás során alkalmazott, de a terméket kódoló specifikus gént nem tartalmazó vektort (un. üres vektort) juttattak be. A gazdasejt tenyésztése és a fehérje extrakciója a termék gyártása során a tenyésztéshez és a kivonáshoz alkalmazott körülményekkel megegyezően történik. Antiszérum készítéséhez olyan részlegesen megtisztított készítmény is felhasználható, amely a gyártási folyamatnak csak bizonyos tisztítási lépésein esett át. - Kalibrálás, standardizálás. Mennyiségi értékekre vonatkozó adatokat a gazdasejtből származó fehérje-antigén standarddal felvett dózis-válasz görbékkel való összevetéssel nyerhetünk. Tekintettel arra, hogy ezek a készítmények nem tökéletesen meghatározott fehérjék keverékei, a standard készítményt megfelelő fehérjemeghatározási módszer alkalmazásával kell készíteni és kalibrálni. A készítmény - megfelelő stabil állapotban tárolva - hosszabb ideig alkalmas a felhasználásra. - Antiszérumok. Az antiszérumok nagy reakcióképességű antitesteket tartalmaznak, olyanokat, melyek a lehető legtöbb fehérjét ismerik fel az antigén elegyben és nem lépnek keresztreakcióba a termékkel.



Gazdasejt és vektor eredetű DNS. DNS-maradványok hibridizációs analízissel mutathatók ki, amelynek során megfelelően érzékeny szekvencia-független analitikai eljárásokat vagy más, megfelelő érzékenységű analitikai módszereket kell használni. Hibridizációs analízis A mintában lévő DNS-t egyszálú DNS-sé kell denaturálni, nitrocellulóz vagy más alkalmas filter felületére immobilizálni, majd a gazda-vektor előállító rendszerből készített, jelölt DNS-el (DNS próba) hibridizálni kell. Bár számos kísérleti megközelítés létezik, a gazda-vektor DNS vizsgálatára irányuló hibridizációs eljárásnak eleget kell tennie a következő követelményeknek: - DNS próbák. A tisztított DNS-t a gyártási eljárással megegyező körülmények között növesztett gazda-vektor rendszerből nyerjük. A gazdasejt kromoszomális DNS-e és a vektor DNS külön is előállíthatók és külön is alkalmazhatók próbaként. - Kalibrálás és standardizálás. Mennyiségi értékekre vonatkozó adatokat standard készítményekre kapott válasszal összevetve nyerhetünk. A kromoszomális DNS próbák kromoszomális DNS standarddal, a vektor DNS próbák vektor DNS standarddal használhatók. A standard készítmények spektroszkópiás eljárással kalibrálhatók és alkalmas helyen tárolva hosszabb időn át felhasználhatók. - A hibridizáció körülményei. A hibridizációt olyan szigorú körülmények között kell végrehajtani, hogy biztosak lehessünk a próba és a standard DNS készítmény hibridizációjában, és a gyógyszeranyag ne befolyásolhassa a hibridizációt az alkalmazott koncentráció-körülmények között. Szekvencia-független eljárások Az alkalmas eljárások között találhatók: szulfonált citozin maradványok kimutatása az egyszálú DNS-ből (melynek során, a filter felületén immobilizált DNS citozinját in situ szulfonálják, majd a kimutatást és mennyiségi meghatározást a szulfonált csoporthoz kötődő antitesttel végzik; egyszálú DNS kimutatása fehérjéhez kötött egyszálú DNS fragmentum és a fehérje antitestjének felhasználásával. Egyik eljárás sem igényel specifikus gazda vagy vektor DNS-standardot. Az alkalmazott módszert validálni kell, azért, hogy bizonyított legyen a válaszgörbék linearitása és a DNS-standardra kapott válaszgörbékkel való párhuzamossága, valamint az, hogy sem a hatóanyag, sem a segédanyagok nem zavarják a mérést az alkalmazott koncentrációk esetén.


AZONOSSÁGI VIZSGÁLAT, MEGHATÁROZÁS


VIZSGÁLATOK

ÉS

TARTALAMI

A végtermékre (letöltés vagy kiszerelt tétel) vonatkozó követelményeket, továbbá a vonatkozó vizsgálati eljárásokat az egyedi cikkelyek írják elő. TÁROLÁS Lásd az egyedi cikkelyt Felirat Lásd az egyedi cikkelyt

Producta ab ADN recombinante

Recommend Documents