PAT – kvalitativní a kvantitativní stanovení na ID-gelových kartách
Eliška Rýznarová LAB-MED Systems s.r.o.
Princip testu Přímým antiglobulinovým (Coombsovým) testem (PAT) prokazujeme in vivo navázané imunoglobuliny a nebo složky komplementu na erytrocyty. Prokazujeme senzibilizaci ery.
1
2
Kdy se PAT provádí (1)
Kdy se PAT provádí (2)
V případě podezření na: 1. hemolytické onemocnění novorozenců (HON) 2. autoimunní hemolytickou anémii (AIHA) 3. hemolytickou transfuzní reakci (HTR) 4. medikaméntozně indukovanou hemolýzu
6. V případě podezřelých laboratorních nálezů: • pozitivní ctl / Rh kontrola • pozitivní autokontrola (vlastní ery + vlastní sérum/plazma) • pozitivní zkouška kompatibility vždy s určitými ery dárce (v 1 případu na 70 až 80 000 obyvatel je u dárce PAT + )
Dále jako: 5. Negativní kontrola při průkazu ery antigenů nepřímým Coombsovým testem (NAT) 3
4
1
Klinický význam PAT
Lýza ery
• Pozitivní PAT při HON, AIHA nebo HTR diagnostikuje urychlenou destrukci ery na imunologickém podkladě s intra nebo extravaskulární hemolýzou ve slezině nebo játrech.
Intravaskulární hemolýza: • vždy při inkompatibilitě v AB0 a jiných systémech, kdy protilátka aktivuje komplement Extravaskulární hemolýza: • v případě, kdy protilátky komplement neváží a senzibilizované ery jsou odstraňovány v RES
• Stupeň hemolýzy ery závisí na množství navázaných Ig nebo komplementu. 5
Imunoglobuliny IgG (1)
6
Imunoglobuliny IgG (2)
• • • •
Rozděleny do 4 podtříd: IgG1, 2, 3, 4 IgG1 a IgG3 mohou aktivovat komplement IgG2 a IgG4 aktivují komplement zřídka Podtřídy IgG1 a IgG3 jsou považovány za klinicky významné • Aby mohlo dojít k indukci fagocytózy, musí být erytrocyt pokryt: - 1 000 až 4 000 molekulami IgG1 - nebo 135 až 500 molekulami IgG3 7
Ery senzibilizované IgG mohou být předmětem: - rychlého odbourávání fagocytózou - a nebo na protilátkách závislou a buňkami zprostředkovanou cytotoxicitou, vyúsťující v extravaskulární hemolýzu ery ve slezině či játrech (ADCC- antibody dependent cell cytotoxicity)
8
2
Technika a citlivost PAT (1)
Technika a citlivost PAT (2) PAT je pozitivní, pokud je na erytrocyt vázáno: • 100 až 500 molekul IgG • 400 až 1100 molekul C3d složky komplementu
PAT by měl být prováděn s polyspecifickým AGH, obsahujícím alespoň anti-IgG + C3d
Poznámka: • Při vazbě komplementu in vivo zůstává na povrchu obvykle jen fragment C3d, což je způsobeno enzymatickou aktivitou v krevním oběhu pacienta. • Komplement vázaný in vitro je obvykle C3b (C3c + C3d). 9
10
Pozitivní PAT (1)
Pozitivní PAT (2)
• Nutné další testování – zjištění příčiny. • Ne každý pozitivní PAT je však spojen se zkrácenou dobou přežívání ery. • Negativní PAT nevylučuje možnost procesu hemolýzy: - daná protilátka může mít nízkou afinitu - vazbu Ig na ery nemůžeme prokázat, protože je pod prahem citlivosti laboratorního testování
• Je nutno posuzovat společně s klinickým obrazem a dalšími laboratorními parametry: - hemoglobin (Hb)
11
-
hematokrit (Hk) laktátdehydrogenáza (LDH) haptoglobin retikulocyty hladina imunoglobulinů 12
3
Příklad: HON, novorozenec B Rh+, CcD.ee, Kmatka anti-D
PAT a CTL Reakce nemusí spolu vzájemně souhlasit: • U pozitivní CTL je často také PAT pozitivní • U pozitivního PAT je obvykle CTL negativní • U negativní CTL může být PAT pozitivní CTL není náhradou za PAT.
13
pokračování:
Novorozenec: při vyšetření KS, fenotypu Rh a K na ID-Kartě zjištěny rozdíly: • s polyklonálními reagenty falešně pozitivní reakce na 4+, ctl 4+ • s monoklonálními reagenty ctl negativní a reakce s anti-D negativní, nutno ověřit Rh po eluci (zablokované ery anti-D protilátkou od matky a nemožnost reakce s dg. anti-D?) • ID-Karta „DC-Screening I“ – prokázána senzibilizace ery novorozence IgG na 4+ • Provedena eluce protilátek z ery novorozence. Zjištěno: v eluátu anti-D a ery novorozence Rh+14 !
Novorozenec – prokázána senzibilizace ery IgG na 4+
pokračování:
Jaké Rh má novorozenec ?
Nespecifické reakce s dg.polyklonálními, opakováno s dg.monoklonálními. Třeba vyšetřit PAT !
15
ID-Karta „DC-Screening I“
16
4
Novorozenec – prokázána senzibilizace ery IgG – jaké je Rh ?
V eluátu z ery novorozence prokázána anti-D protilátka
Pokračování:
Pokračování:
Je novorozenec Rh negativní nebo Rh pozitivní? Třeba ověřit po eluci.
Vyšetření eluátu proti panelu typových ery: zjištěna anti-D autokontrola: vlastní ery + vlastní sérum pozitivní = volná anti-D v séru 17
18
Novorozenec je po eluci protilátky anti-D chloroquinem Rh pozitivní!
Závěr:
ID gelové karty 1. „LISS / Coombs“
Epitopy D antigenu na ery novorozence byly zablokovány anti-D protilátkou od matky.
2. 3. 4. 5.
Po eluci reagují ery pozitivně s anti-D na ID-Kartě s monoklonálními dg.
(anti-IgG, - C3d)
„Coombs Anti-IgG“ „DC - Screening II“ (IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl) „DC - Screening I“ (IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl) „DAT IgG- Dilution“ (anti-IgG 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, ctl)
6. „DAT IgG1 / IgG 3“ (anti-IgG1 1:1, 1:100 / anti-IgG3 1:1, 1:100 / anti-IgG 1:10) 19
20
5
„LISS / Coombs“ pozitivní výsledek
1. „LISS / Coombs“ • ID-Karta LISS/Coombs se používá pro rutinní testování PAT (NAT: protilátek, zk.kompatibility) • ID-Karta se 6 mikrozkumavkami, obsahuje polyspecifické AGH (králičí anti-IgG, monoklonální anti-C3d, klon C 139-9) • Anti-IgG není specifický pro těžké (H) řetězce γ, může reagovat i s lehkými (L) řetězci Kappa a Lambda – tedy s i s IgA a IgM. Poznámka: Vzájemný poměr lehkých řetězců Kappa a Lambda ve všech molekulách Ig v organismu je specifický pro každý živočišný druh. U člověka je 65:35.
• Vyšetřované ery se ředí ID-Diluentem 2 (50µl) • Do ID-Karty 50µl ery, 10 min v ID-Centrifuze 21
22
2. „Coombs Anti-IgG“
3. „DC- Screening II“
• ID-Karta se 6 mikrozkumavkami, obsahuje králičí anti-IgG. • Detekce anti-IgG je nejdůležitější funkcí AGH. • Použití anti-IgG AGH neinterferuje se složkami komplementu, které se mohou vázat na ery nespecificky. • Protilátky, detekovatelné pouze díky jejich schopnosti vázat komplement jsou ojedinělé. 23
ID-Karta je pro vyšetření 2 pacientů a obsahuje: IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl • •
ID-Karta umožní v jednom kroku rozlišit mezi IgG nebo C3d vázanými na ery Ery nepropírat (aby se vazba komplementu neuvolnila), ředit v ID-Diluentu 2 24
6
„DC- Screening I“ „DC-Screening II“
4. „DC- Screening I“ • •
•
•
ID-Karta obsahuje: IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl ID-Karta umožní v jednom kroku rozlišit mezi IgG, IgA, IgM a složkami komplementu C3c nebo C3d vázanými na ery Ery nepropírat (aby se vazba komplementu a IgM neuvolnila), ředit v ID-Diluentu 2
•
25
Umožní v jednom kroku rozlišit mezi třídami Ig nebo komplementem, vázaným na ery: IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl (DC-Scr.I) IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl (DC-Scr.II) Detekce IgG navázaných na ery je nejdůležitější funkcí AGH, nicméně detekce složek komplementu je důležitá při vyšetřování pacientů s AIHA. 26
„DC-Screening I a II“ – hodnocení výsledků (1)
„DC-Screening I a II“ – hodnocení výsledků (2)
Výsledky testování s monospecifickými reagenty pomáhají definovat klinický stav pacienta: • Smíšený typ AIHA – průkaz IgG i C3 • AIHA s tepelnými protilátkami (WAIHA – warm auto-immune haemolytic anaemia) - nejčastěji je prokazována IgG senzibilizace ery - ve 24 % IgG i C3 - v 7% pouze samotný komplement - mohou být přítomny i IgM, IgA
• Onemocnění chladových aglutininů (CAD – Cold Agglutinin Disease): - častá senzibilizace ery pouze složkami komplementu - mohou být přítomny i IgM, IgA • Paroxysmální chladová hemoglobinurie (PCH – Paroxysmal Cold Haemoglobinuria): - senzibilizace ery pouze složkami komplementu - pokud ale ery předem propereme 4°C fyziologickým roztokem, pak lze detekovat také IgG autoprotilátky • K rozlišení CAD od PCH napomáhá test průkazu bifázických hemolyzinů: Donath-Landsteinerův test (diagnostikuje chladovou hemoglobinurii)
27
28
7
5. „DAT IgG - Dilution“ (1)
„DAT IgG - Dilution“ (2)
ID-Karta: • Umožňuje indikaci klinické závažnosti pozitivního výsledku PAT v souvislosti s AIHA, HTR a HON a odhad rizika hemolýzy nebo HON. • Je určena k posouzení relativního množství IgG vázaného na ery • V případech, kdy je pozitivní NAT lze také stanovit hladinu IgG i séru /plazmě pomocí korespondujících ID-DiaCell
ID-Karta: • Obsahuje anti-IgG v ředění: 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, ctl • Testované ery musí být předem 3 x proprány a naředěny na 0,8% suspenzi ID-Diluentem 2 • Po pipetování ery do karet, ihned centrifugovat 10 min v ID-Centrifuze
29
30
„DAT Anti-IgG Dilution“ titr 1:1000 závažné riziko hemolýzy
„DAT IgG - Dilution“ hodnocení reakcí Titr anti-IgG: ředění anti-IgG
1 : 10
1 : 30
1 : 100
1:300
1:1000
ctl
reakce
2+
±
-
-
-
-
Titr 1:30 je nezávažný, stanovení podtříd není nutné ředění anti-IgG
1 : 10
1 : 30
1 : 100
1:300
1:1000
ctl
reakce
3+
3+
2+
1+
-
-
Titr 1:300 je klinicky závažný s rizikem hemolýzy, stanovení podtříd je nezbytné 31
32
8
„DAT Anti-IgG Dilution“ titr 1:1000 závažné riziko hemolýzy do titru 1:30 je riziko nezávažné
6. „DAT IgG1 / IgG3“ (1) • ID-Karta je určena k diferenciaci mezi nízkou a vysokou mírou rizika hemolýzy způsobené AIHA nebo HON • ID-Karta umožní definovat rizikové množství klinicky závažných podtříd IgG, IgG1 a IgG3 vázaných na ery • ID-Karta obsahuje dvě různá ředění anti-IgG1 a anti-IgG3 : anti-IgG1 1:1, 1:100 anti-IgG3 1:1, 1:100 ctl anti-IgG 1:10 •
Testované ery musí být předem 3 x proprány a naředěny ID-Diluentem 2
33
„DAT IgG1 / IgG3“ (2)
34
„DAT IgG1 / IgG3“- hodnocení výsledků
• Aby mohlo dojít k indukci fagocytózy, musí být erytrocyt pokryt: 1000 - 4000 molekulami IgG1 nebo 135 - 500 molekulami IgG3 • Na ID-Kartě představuje ředění 1:1 mez citlivosti: - pro anti-IgG1 cca 1000 IgG1 molekul / ery - pro anti-IgG3 cca 125 molekul IgG3 / ery • Pozitivní reakce u druhého ředění 1:100 pak indukuje vysokou koncentraci IgG1 a IgG3 na ery a vysoké riziko hemolýzy 35
Nízká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = nízké riziko hemolýzy Vysoká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = vysoké riziko hemolýzy
reakce
anti-IgG1 1:1 1:100
anti-IgG3 1:1 1:100
ctl
anti-IgG 1:10
2+ 3+ 2+ 3+
3+ 2+ 2+ 3+
-
3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+
2+ 2+
2+ 2+
riziko nízké vysoké vysoké nízké nízké vysoké 36
9
„DAT IgG1 / IgG3“- vysoké riziko hemolýzy Nízká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = nízké riziko hemolýzy Vysoká koncentrace molekul IgG1, IgG3 na ery = vysoké riziko hemolýzy
Závěr Pouze DiaMed nabízí kompletní řadu ID-Karet, která umožní komplexní řešení a dořešení problému při pozitivitě PAT: 1. 2. 3. 4. 5.
37
Děkuji za pozornost
„LISS / Coombs“ (anti-IgG, - C3d) „Coombs Anti-IgG“ „DC - Screening II“ (IgG, C3d, ctl / IgG, C3d, ctl) „DC - Screening I“ (IgG, IgA, IgM, C3c, C3d, ctl) „DAT IgG- Dilution“ (anti-IgG 1:10, 1:30, 1:100, 1:300, 1:1000, ctl) 6. „DAT IgG1 / IgG 3“ (anti-IgG1 1:1, 1:100 / anti-IgG3 1:1, 1:100 / anti-IgG 1:10) 38
39
10
