Princip činnosti a pracovní režimy světelného mikroskopu A. ZADÁNÍ 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Seznamte se důkladně s jednotlivými prvky a s ovládáním světelného mikroskopu (Amplival pol. U). Prostudujte sestavu osvětlovací soustavy a proveďte její nastavení podle Köhlerova schématu. Vycentrujte tento mikroskop. Proveďte kalibraci příčného zvětšení mikroskopu pomocí měrného okuláru a objektivního měřítka. Pomocí okalibrovaného mikroskopu změřte rozměry buněk listu mechu, chloroplastů a celých lístků. Změřte průměrnou plochu buněk a zjistěte počet chloroplastů v buňce. Seznamte se s prvky mikroskopu pro fázový kontrast. Seřiďte mikroskop pro práci v režimu fázového kontrastu. Ověřte tento režim na umělém preparátu (mikroskop Meopta).
B. SEZNAM POMŮCEK 1. Přístrojové vybavení: mikroskopy Amplival pol. U, Carl Zeiss, Jena, Německo a Meopta, Československo. Měrný okulár, objektivní měřítko, sestava pro fázový kontrast. 2. Ostatní potřeby: zrcátko, podložní a krycí sklíčka, kádinka a tyčinka, mech, glycerin, imersní olej.
C. TEORIE 1. Osvětlovací soustava podle Köhlerova schématu Princip:
mléčné sklo
S
K
Cl(K)
filtr
Cl(C)
C
P
O
Obr. 1. Schéma Köhlerova uspořádání osvětlovací soustavy světelného mikroskopu
65
Osvětlovací soustava se skládá ze zdroje S, kolektoru K, clonky kolektoru Cl(K), kondenzoru C a clonky kondenzoru Cl(C). Clonka Cl(K) je v ohniskové rovině K (primární obraz S ), Cl(C) je v ohniskové rovině C. Správné nastavení: S je zobrazen kolektorem na Cl(C), Cl(K) je zobrazena kondenzorem na P. Pak Cl(K) omezuje osvětlené pole preparátu P a Cl(C) ovlivňuje osvětlení P a aperturní úhel osvětlovací soustavy (nazývá se proto také aperturní clonka). Je dosaženo optimálního využití světla zdroje a homogenní osvětlení preparátu. 2. Postup nastavení Köhlerova schématu pro Amplival pol. U 1) Vybereme vhodný preparát a při malém zvětšení zaostříme mikroskop na preparát (vertikální pohyb stolku ). 2) Zaostříme C tak, aby obrys uzavřené Cl(K) byl na preparátu ostře vidět (lze nyní vycentrovat daný objektiv ). 3) Sledujeme obraz vlákna S na Cl(C) zrcátkem a posuneme podél optické osy S tak, aby tento obraz byl ostrý. 4) Vycentrujeme S pomocí třech stavěcích šroubů tak, aby jeho obraz na Cl(C) byl ve středu. 5) Vycentrujeme daný objektiv pomocí dvou stavěcích šroubů tak, aby obraz přivřené Cl(K) byl ve středu zorného pole. 6) Zlepšíme homogennost pole zařazením mléčného skla. Intenzitu světla a jeho spektrální složení lze regulovat také pomocí filtru, vkládaného do optické osy. 3. Centrování mikroskopu (Amplival pol. U.) Cílem je seřídit mikroskop tak, aby všechny kruhové prvky měly střed na optické ose. Centrování lze provádět vůči opěrným (pevným) prvkům. U našeho mikroskopu jsou pevnými prvky kolektorová clonka, clonka zorného pole v okuláru a Amiciho-Bertrandova čočka. Centrovatelné prvky jsou: zdroj světla S, aperturní (kondenzorová) clonka Cl(K), stolek a objektiv (O). Postup centrování: 1) Zaostříme mikroskop na preparát, kolektorovou clonku na preparát a zmenšíme clonku zorného pole Cl (z.p.) tak , aby měla stejný průměr jako zobrazená kolektorová clonka. 2) Vycentrujeme dvěma nasouvacími klíči objektiv tak, aby obrazy Cl(K) a Cl (z.p.) byly vycentrované. 3) Zařadíme Amici-Bertrandovu čočku jako pomocný objektiv (sklopení páčky dolů) a zaostříme ho na obrazovou ohniskovou rovinu objektivu. V této rovině je obraz aperturní clonky a ten stavěcími šrouby této clonky vycentrujeme . 4) Obraz zdroje vycentrujeme stavěcími šrouby zdroje na zavřenou aperturní clonku . 5) Stavěcími šrouby vycentrujeme otočný stolek tak , aby při jeho otáčení zůstával střed otáčení ve středu nitkového kříže okuláru . 6) Při výměně objektivu je třeba zkontrolovat jeho vycentrování .
66
4. Měření příčných rozměrů v mikroskopu (např. buněk, chloroplastů a celých lístků mechu) K měření příčných rozměrů objektů, které jsou celé vidět v mikroskopu využijeme měřící okulár a okalibrovaný mikroskop. Jeden z okulárů nahradíme měřícím okulárem firmy Carl Zeiss, Jena (zvětšení 15 x). Zorné pole zaostřené oční čočkou okuláru je znázorněné na obr. 2. V horní polovině je pevná stupnice osmi stejně vzdálených očíslovaných dílků. Je to hrubé okulárové měřítko (tzv. mikrometr). Pevný střed pole je vyznačen jako vrchol pravého úhlu svíraného dvěma přerušovanými polopřímkami v pravé části zorného pole. Vodorovná přerušovaná přímka, zrcadlový obraz dvou pevných polopřímek, krátká vertikální linie na střední přímce a dvojice pevných linií částečně se překrývající s pevnou stupnicí se současně pohybují při otáčení mikrometrického šroubu. Vzdálenost dvojice linií odpovídá deseti a vzdálenost sousedních pevných linií měřítka stu dílků na bubínku mikrometrického šroubu měrného okuláru. Splývá-li střed pohyblivé dvojice linií s pevnou linií, je na stupnici mikrometrického šroubu nula. Pevné měřítko slouží k přibližnému odhadu rozměrů a k zápisu počáteční a koncové hodnoty měřeného rozměru. Pokud zvolíme jako jednotku jeden dílek stupnice mikrometrického šroubu, udává stupnice mikrometrického šroubu jednotky a desítky a čísla u linií pevného měřítka stovky těchto jednotek (např. 365 až 728 apod.). Měřící okulár lze pomocí stavěcích šroubů vycentrovat vůči ose mikroskopu.
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Obr . 2. Zorné pole měřícího okuláru Carl Zeiss, Jena Pro kalibraci máme k dispozici kromě měřícího okuláru ještě objektivní měřítko (tzv. objektivový mikrometr), ve kterém je jeden centimetr rozdělen přesně liniemi na sto dílků (označení 10 : 100). Vložíme objektivní měřítko jako preparát do mikroskopu a zaostříme mikroskop na tuto stupnici. Otočíme stolek tak, aby linie měřítka byly přesně rovnoběžné s liniemi stupnice v okuláru. Linie objektivního měřítka jsou při větším zvětšení poměrně široké, a proto při kalibračním postupu nastavujeme střed pohyblivé části okuláru nebo jednu z dvojice pohyblivých linií na stejný okraj či střed obrazu linie objektivního měřítka.
67
Otáčením mikrometrického šroubu okuláru zjistíme, kolik dílků šroubu připadá na vzdálenost sousedních linií obrazu objektivního měřítka. Měření provádíme statisticky. Připadá-li v průměru na vzdálenost sousedních linií objektivního měřítka D dílků, je charakteristická konstanta uspořádání objektiv-okulár: k = 0,1/D
(mm).
Chceme-li nyní měřit příčné rozměry objektů v preparátu, posuneme pomocí křížového posuvu objekt do středu zorného pole a natočíme preparát pomocí otočného stolku do takové polohy, aby měřený rozměr splýval s vodorovnou linií zorného pole, nebo byl s ní alespoň rovnoběžný. Druhou možností dosažení této rovnoběžnosti je otočení měrného okuláru. Tento postup je méně praktický a u polarizačního mikroskopu využíváme s výhodou vycentrovaného otočného stolku. Nyní nastavíme pomocí mikrometrického šroubu pohyblivý střed nitkového kříže na levý krajní bod měřené úsečky a odečteme hodnotu polohy mA a totéž provedeme pro pravý krajní bod ( hodnota mB ). Délka měřené úsečky je d = k . (mB - mA). Tímto způsobem změříme příčné rozměry buněk a chloroplastů např. listů mechu. K měření příčných rozměrů objektů, jejichž obraz je větší než zorné pole mikroskopu lze použít křížových posuvů preparátu (x, y), které jsou nastavitelné s přesností na 0,1 mm za použití nonia obdobně jako u posuvného měřítka. Měřící okulár nastavíme nejlépe tak, aby vznikl nitkový kříž (střední poloha). Křížovým posunem preparátu nastavíme jeden krajní bod měřené úsečky (A) tak, aby splýval se středem nitkového kříže a odečteme polohy na křížových posuvech (xA, yA). Totéž provedeme pro druhý krajní bod B (xB, yB). Vzdálenost bodů je dána vztahem ( odvoďte) d=
(x
B
- x ) 2 + (y - y ) 2 A B A
Změřte délku a šířku zvoleného listu mechu tímto způsobem. Některé další možnosti měření na mikroskopu Plošná hustota objektů Zjistíme celkovou plochu zorného pole (P) např. tím, že změříme jeho průměr. Pokud se jedná o objekty, které zcela pokrývají zorné pole a navzájem se nepřekrývají (např. buňky listu mechu nebo buňky pokožky cibule), lze průměrnou plochu jednoho objektu vypočítat ze vztahu p = P / j, kde j je počet objektů v zorném poli. Počet objektů připadajících na jednotkovou plochu je pak dán vztahem i = j / P.
68
U větších objektů, z nichž některé zasahují do zorného pole jen částečně, je třeba zvolit pravidlo jejich počítání. Jedna možnost je jako příklad pro buňky uvedena na obr. 3.
nepočítáme
počítáme
Obr .3. Pravidlo počítání buněk Rozdělíme zorné pole na pravou a levou část a do počtu zahrneme jen buňky zcela uvnitř zorného pole a ty buňky, které částečně zasahují do levé části zorného pole. Ty, které zasahují do pravé části zorného pole do celkového počtu nezahrnujeme. Tato metoda není příliš přesná. Je třeba volit takové zvětšení, při němž je v zorném poli alespoň několik desítek objektů. Určete tímto způsobem průměrnou plochu buněk vybrané části listu mechu a průměrný počet buněk na jeden čtvereční mm . Tloušťka objektů v preparátu Zde se využívá mikrometricky dělený šroub vertikálního posuvu stolku. Objekt při větším zvětšení zaostříme na jeho svrchní část a odečteme hodnotu mA, pak na spodní část a odečteme mB. Při určování tloušťky objektu musíme brát v úvahu indexy lomu médií u objektivu (no) a média obklopujícího vzorek v preparátu (np). Tloušťka objektu se pak vypočte ze vzorce T = np /no .(mA - mB). U suchých objektivů je n = 1, u imersních n = ni (index lomu imersní kapaliny). V naší úloze se pokuste změřit tloušťku krycího sklíčka. 5. Fázový kontrast 5.1. Metoda fázového kontrastu Při studiu bezbarvých buněk a tkání se i v nejnovějších pracích v biologii a v biofyzice používá metoda fázového kontrastu. Princip této metody lze vysvětlit několika způsoby, např. vektorově 5 nebo vlnově 3. Zde využijeme odvození pomocí zápisu harmonických vlnění, které umožní matematické zdůvodnění jevu. Kontrastem budeme v tomto textu rozumět veličinu K = (I1 - I2)/(I1 + I2)
69
kde I1, I2 jsou jasy prostředí (pozadí) a objektu na obrazu v mikroskopu. Je-li pozadí jasnější než objekt, hovoříme o pozitivním kontrastu (K 0), je-li pozadí tmavší než objekt, jedná se o negativní kontrast (K 0). Jsou-li jasy stejné, obraz je bez kontrastu (K = 0). Při metodě fázového kontrastu se studují velmi malé objekty, které nevykazují amplitudový kontrast, tj. nemají jinou absorpci než pozadí. Mohou mít ale jiný index lomu. Nechť je index lomu prostředí n1, objektu n2 a geometrická tloušťka objektu ve směru průchodu světla h (viz obr. 4).
n1
1
1 n 2
2
2
h (b)
(a)
Obr. 4. K definice kontrastu (a) a fázového rozdílu (b) Rozdíl fází paprsků procházejících objektem a prostředím je = 2 - 1 = 2/0 (n2 - n1)h, kde 0 je vlnová délka světla ve vakuu (zdůvodněte). Uvažujme dvě harmonické vlny procházejícího světla: vlna prošlá pozadím a vlna prošlá objektem
v1 = a1 sin t
v2 = a2 sin (t + ) = a2 cos sin t + a2 sin cos t = aI sin t + aII sin (t + /2) kde aI = a2 cos ; aII = a2 sin Protože předpokládáme malý objekt, je 1 a platí přibližně aI a2 ; aII 0 (diskutujte, kdy je objekt "malý"). Rozklad vlny procházející objektem na dvě dílčí vlny má i fyzikální opodstatnění. Vlna I prochází objektem přímo, zatímco vlna II se rozptyluje, tj. odchyluje se od přímého směru. Vypočítáme-li intenzity těchto vln (zářivé toky energie) jako veličiny úměrné časovým středním hodnotám kvadrátů amplitud, platí
70
T
I1 = A/T
a 12 sin2 (t )dt =
0
A 2 a1 2
T
I2 = A/T
A 2 a2 2
a 22 sin2 (t + )dt =
0
Protože náš objekt je fázový, nedochází ke změně amplitudy a tudíž a1 = a2 I1 = I2 a kontrast
K = 0.
obrazová ohnisková rovina 1
2
C
P
v II
v II
v I
F o
rovina obrazu
2
vI Q fázová destička
O
Obr. 5. Princip metody fázového kontrastu Protože vlny vI a vII opouštějí objekt v různých směrech, procházejí po zobrazení objektivem různými body obrazové ohniskové roviny objektivu. Vlna vI prochází ohniskem. Obě vlny se setkají v rovině obrazu a vytvářejí obraz objektu 2´. Vložíme-li do ohniska F´o čtvrtvlnovou destičku (jaká je její tloušťka ?), způsobující posuv vlny ve fázi o (+/2), bude intenzita nové složené vlny I 2 dána výrazem I 2 = A/T
T
a2 cos sin (t + /2) + a2 sin sin (t + /2)2 dt =
0
=
A 2 a 2 1 + 2cos sin . 2
a obraz získá kontrast K = (I1 - I´2) / (I1 + I´2) = (- cos . sin )/(1 + cos . sin ). Z tohoto odvození vyplývá, že pro případ n2 n1 kdy 0 vznikne při použití čtvrtvlnové destičky negativní kontrast, objekt je světlejší než pozadí. Ověřte experimentálně. Při použití třičtvrtěvlnné destičky, tj. při posunu o 3/2 vznikne pozitivní kontrast
71
K = (I1 - I´2) / (I1 + I´2) = (+ cos . sin )/(1 - cos .sin ). (Dokažte). V praktickém provedení fázového kontrastu je nejčastěji používána /4 destička. 5.2. Praktické provedení fázového kontrastu Protože principiální uspořádání uvedené na obr. 5 je málo světelné, používá se v praxi zařízení s prstencovými elementy (fázová clonka a fázová destička). V ohniskové rovině kondenzoru je umístěna prstencová fázová clonka a v obrazové ohniskové rovině objektivu je fázová destička. Při správném seřízení mikroskopu na fázový kontrast splývá obraz fázové clonky s fázovou destičkou. U různých typů mikroskopů se může postup seřizování lišit. Některé typy mikroskopů mají revolverově výměnné fázové clonky tak, že každému fázovému objektivu přísluší fázová clonka. U našeho mikroskopu je jediná fázová clonka a lze měnit parametry kondenzoru (ohniskovou vzdálenost) tak, aby se osvětlovací systém přizpůsobil danému fázovému objektivu.
fázová clonka
C
P
O
ohnisková rovina
Q
obrazová rovina
fázová destička
Obr. 6. Praktické provedení fázového kontrastu Postup při seřizování mikroskopu pro fázový kontrast 1) Zašroubujeme příslušný objektiv pro fázový kontrast (červená značka Ph). Zaostříme mikroskop na preparát, nejlépe na oblast bez struktur. Místo jednoho okuláru umístíme pomocný mikroskop a zaostříme jej na fázovou destičku (tmavý prstenec na světlém poli). 2) Do osvětlovací soustavy umístíme fázovou clonku, aperturní clonku otevřeme na maximum. V pomocném mikroskopu vidíme obraz clonky jako světlý prstenec na tmavém pozadí. 3) Měníme postupně polohu kondenzoru (vertikální posuv), ohniskovou vzdálenost kondenzoru (otáčením prstence na kondenzoru) a polohu clonky (otáčení a příčný posuv) tak, aby obraz clonky zcela splynul s fázovou destičkou. V tomto okamžiku je seřízen fázový kontrast.
72
obraz fázové clonky
různé poloměry
fázová destička (a) neseřízeno
(b) vycentrováno
(c) seřízeno (shodné poloměry)
Obr. 7. Postup při seřizování fázového kontrastu
D. LITERATURA [ 1 ] J. Pazourek: Pracujeme s mikroskopem, SNTL, Praha 1975. [ 2 ] J. Brož a kol.: Základy fyzikálních měření I, SPN, Praha 1983. [ 3 ] J. Brož a kol.: Základy fyzikálních měření IIA, SPN, Praha 1974. [ 4 ] J. Nauš: Experimentální metody biofyziky I (skripta) UP Olomouc 1985. [ 5 ] J. Fuka, B. Havelka: Optika a atomová fyzika, I. Optika , SPN, Praha 1961.
73
74
