SEMINAR NASIONAL VI SDM TEKNOLOGI NUKLIR YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010 ISSN 1978-0176
PREPARASI, BIODISTRIBUSI DAN CLEARANCE SENYAWA PENGKONTRAS MRI Gd-DTPA-PAMAM G4-NIMOTUZUMAB MELALUI SIMULASI MENGGUNAKAN 153Gd-DTPA-PAMAM G4-NIMOTUZUMAB Adang H.G., Rista S.*, A. Mutalib, Yono S., Ratna Dini H., Karyadi, Sri Aguswarini, * RS Hasan Sadikin Bandung E-mail:
[email protected]
Abstrak PREPARASI, BIODISTRIBUSI DAN CLEARANCE SENYAWA PENGKONTRAS MRI GdDTPA-PAMAM G4-NIMOTUZUMAB MELALUI SIMULASI MENGGUNAKAN 153Gd-DTPAPAMAM G4-NIMOTUZUMAB. Salah satu tantangan besar dalam pengobatan adalah bagaimana cara mengirimkan bahan aktif obat ke sasaran secara efektif, tidak menyebar ke organ atau jaringan lain, karena penyebaran ke organ atau jaringan lain akan mengakibatkan efek samping pada organ atau jaringan tersebut. Dendrimer yang mampu berinteraksi dengan jaringan tumor kanker, merupakan pilihan yang sangat baik untuk membawa obat/senyawa ke organ/jaringan tumor atau kanker. Keunggulan dendrimer adalah pada bentuknya yang bercabang-cabang dengan permukaan yang sangat banyak, memungkinkan untuk dapat menyisipkan zat untuk diagnosa, terapi atau molekul biologi aktif lainnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik dan potensi Gd-DTPA-PAMAM G4-Anti EGFR Nimotuzumab sebagai senyawa pengkontras untuk mendeteksi tumor otak glioma. Penelitian dimulai dengan mengkonjugasikan CHX-A”-DTPA dengan PAMAM (poliamidoamin) G4 yang kemudian diikuti dengan mereaksikan DTPA-PAMAM G4 dengan anti EGFR Nimotuzumab. Senyawa komplek DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab kemudian direaksikan dengan logam paramagnetik Gadolinium (Gd) untuk menghasilkan senyawa pengkontras Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang lebih spesifik terhadap kanker glioma. Oleh karena Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab merupakan senyawa radioaktif, maka untuk memudahkan karakterisasinya pada penelitian ini, proses preparasinya menggunakan senyawa bertanda 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab. Efisiensi penandaan/pembentukan DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab yang yang ditentukan dengan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis) dan KCKT (Kromatografi Cair Tekanan Tinggi) setelah proses pemurnian menggunakan penyaring protein (Vivaspin) >90 %. Profil biodistribusi 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab memperlihatkan bahwa konsentrasi radioaktif pada hati dan limfa maíz cukup tinggi 48 jam setelah injeksi. Profil clearance komplek 153GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab menunjukkan bahwa 19,4 % dan 3,2 % komplek diekskresikan berturutturut melalui urin dan feces sampai dengan 120 jam setelah injeksi. Pencitraan menggunakan senyawa pengkontras 153GD-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang dilakukan pada tikus model (tikus putih yang pada otaknya telah diimplantkan sel-sel glioma) dengan alat MRI memberikan nilai densitas citra berturutturut 677, 730,740 dan 667 pada 1,2, 3 dan 4 jam setelah penyuntikan. Kata Kunci : dendrimer, glioma, PAMAM G4, Nimotuzumab,senyawa pengontras.
Abstract PREPARATION, BIODISTRIBUTION AND CLEARANCE OF MRI CONTRAST AGENT GdDTPA-PAMAM G4-NIMOTUZUMAB SIMULATED BY USING 153Gd-DTPA-PAMAM G4NIMOTUZUMAB. One of the major challenges in medicine is how to deliver the active ingredient of drug to target effectively where it do not spread to other organs or tissues, because it will cause adverse effects in the organ or tissue. A conjugated dendrimer is able to interact with the tumor tissue of cancer; therefore it is
Adang H G
711
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
SEMINAR NASIONAL VI SDM TEKNOLOGI NUKLIR YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010 ISSN 1978-0176 a very good choice for delivery of drugs / compounds to the organ / tissue tumors or cancer. The form of dendrimer branching with a vast surface, allowing the substance to be inserted for the diagnosis, therapy or other active biological molecules. This study was aimed to determine the characteristics and potential of GdDTPA-PAMAM G4-Anti EGFR Nimotuzumab as a contrast agent for detection of brain glioma tumor. The study was began by conjugating a CHX-A"-DTPA to PAMAM (polyamidoamine) G4 which was then followed by reacting the resulted PAMAM G4-DTPA with anti EGFR Nimotuzumab. Finally the DTPAPAMAM G4 formed was then reacted with paramagnetic metal, Gd, to form Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab. As Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab is not a radioactive compound, and in order for its formation and characterization processes were easily monitored, these processes were simulated using a 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab. The 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab with labeling efficiency of > 95% which was measured by TLC and HPLC methods, was obtained successfully. Biodistribution profile of 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab showed that radioactive concentrations were still relatively high in liver and spleen 48 hours post injection. Clearance profile showed that 19.4 % and 3.2 % of 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab were removed through urine and feces 96 hours post injection. The MRI imaging of Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab on white rat model (glioma implanted rat) gave the image density of 677, 730, 740 and 667; 1 hour, 2 ,3 and 4 hours post injection respectively. Keywords : dendrimer, glioma, PAMAM G4, Nimotuzumab, contrast agent
PENDAHULUAN Kanker adalah sel-sel yang kehilangan pengendalian dan mekanisme normalnya, sehingga mengalami pertumbuhan yang tidak teratur. Kanker dapat terjadi pada berbagai jaringan dalam organ. Menghindari faktor penyebab kanker adalah yang terbaik, tetapi hal ini sangat sulit karena penyebab kanker belum diketahui dengan pasti, oleh karena itu penanggulangan lebih ditekankan pada upaya deteksi dini yang diikuti dengan pengobatan [1]. Meskipun kemajuan yang pesat telah dicapai dalam pemahaman tentang biologi molekuler, penemuan biomarker kanker, radioterapi dan kemoterapi, tetapi semua itu sampai saat ini masih belum mampu memperbaiki survival rate penderita kanker secara keseluruhan. Saat ini klasifikasi diagnostik dan prognostik tidak dapat mencerminkan seluruh heterogenitas klinis dari penyakit kanker sehingga sulit untuk memprediksi keberhasilannya. Sebagian besar senyawa antikanker yang ada saat ini, tidak secara jelas dapat membedakan antara kanker dan sel normal, sehingga dapat menimbulkan toksisitas dan efek samping yang membahayakan pada sel disekitarnya [1, 2] . Pengembangan perangkat deteksi dini penyakit kanker yang diperlukan pada saat ini adalah yang spesifik ke target dan seminimal mungkin masuk ke organ/jaringan yang bukan target, sehingga tidak bias dalam diagnosanya yang pada akhirnya akan memudahkan dalam pengobatan. Dalam bidang kesehatan , konyugat dendrimer banyak digunakan sebagai sistem pengiriman obat (drug delivery system) yaitu dengan membawa bahan aktif secara selektif langsung ke sasaran sehingga tidak menyebar ke bagian tubuh yang STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
712
tidak diinginkan. Keunggulan dendrimer sebagai sistem pengiriman obat adalah pada struktur molekulnya yang bercabang-cabang dengan permukaan yang sangat banyak, sehingga memungkinkan untuk dapat menyisipkan zat untuk diagnosa, terapi atau molekul biologi aktif lainnya pada molekul dendrimer tersebut. Satu molekul dendrimer dapat membawa molekul yang mengandung sel kanker , zat terapi pembunuh sel kanker, molekul pemberi sinyal untuk sel kanker. Pengkonyugasian dendrimer dapat dilakukan dengan molekul pembawa yang spesifik ke target (targeted specific) seperti asam folat, peptida, monoklonal antibody. Jika konyugat dendrimer ini kemudian digabungkan dengan logam paramagnetik dengan menggunakan suatu ligand yang sesuai (seperti DTPA atau DOTA) maka akan terbentuk senyawa pengkontras untuk MRI yang dipakai untuk keperluan diagnosa suatu penyakit tertentu sesuai dengan kespesifikan molekul yang diikatkan pada dendrimer tersebut [3, 4, 5, 6, 7, 8]. Nimotuzumab merupakan antibodi monoklonal yang digunakan sebagai obat anti kanker. Nimotuzumab ini termasuk dalam kelompok inhibitor epidermal growth factor receptor (EGFR). Senyawa ini menghambat protein reseptor epidermal growth factor(EGF) yang banyak terdapat pada pemukaan sel kanker. EGF secara normal menstimulasi sel untuk tumbuh dan berdiferensiasi. Dengan menghambat reseptor ini, nimotuzumab mencegah sel kanker menerima pesan yang diperlukan sel untuk tumbuh, berkembang dan menyebar. Nimotuzumab menghambat aktivasi protein tirosin kinase dan berikatan dengan afinitas yang optimal serta spesifisitas tinggi pada daerah ekstraseluler dari EGFR, sehingga dapat Adang H G
SEMINAR NASIONAL VI SDM TEKNOLOGI NUKLIR YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010 ISSN 1978-0176 menghambat ikatan ligan dan aktivasi reseptor. Nimotuzumab terbuat dari rangkaian asam amino yang 95% rangkaiannya sama dengan rangkaian asam amino antibodi manusia. EGFR merupakan target kunci dalam pengembangan terapi kanker. Obat-obatan dengan target EGFR terbukti dapat meningkatkan efek terapi bila digunakan bersamaan dengan pengobatan tradisional seperti terapi radiasi dan kemoterapi [9, 10, 11, 12, 13]. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen tersebut diantara 2 fasa yaitu fasa diam dan fasagerak. Teknik pemisahan ini memanfaatkan interaksi komponen dengan fasa diam dan fasa gerak serta sifat fisik dan sifat kimia komponen. Salah satu jenis teknik kromatografi yang umum adalah kromatografi lapis tipis yaitu merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Teknik ini biasanya menggunakan fasa diam dalam bentuk pelat silika/alumina dan fasa geraknya dengan jenis sampel yang akan dipisahkan. Teknik kromatografi lainnya yang banyak digunakan saat ini adalah KCKT (kromatografi cair kinerja tinggi) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, KCKT memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu retensi serta tinggi puncak suatu senyawa. Dalam penelitian ini metode KLT dan KCKT digunakan untuk menentukan kemurnian radiokimia senyawa 153 Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab sebagai model dari senyawa pengkontras Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab. Dalam penelitian ini telah dilakukan pembuatan senyawa pengkontras MRI spesifik target berbasis dendrimer (PAMAM G4), Gd-DTPA-PAMAM G4Anti EGFR antibodi monoklonal (Gd-DTPAPAMAM G4-anti EGFR Nimotuzumab). Penyiapan dilakukan dengan mengkonyugasikan PAMAM G4 pada Nimotuzumab. PAMAM G4-Nimotuzumab yang terbentuk kemudian direaksikan dengan logam paramagnetik Gd dengan menggunakan bifuctional chelating agent DTPA. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik dan potensi GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab sebagai senyawa pengkontras untuk mendeteksi tumor otak Adang H G
713
glioma. Oleh karena senyawa Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab bukanlah senyawa radioaktif, maka untuk memudahkan karakterisasinya pada penelitian ini, proses preparasi sediaan Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab disimulasikan dengan Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab bertanda 153 Gd (153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab) yang lebih mudah dideteksi dengan menggunakan alat pencacah radioaktif [14]. Pada penelitian ini penentuan kemurnian radiokimia komplek 153GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis dan KCKT. Karakterisasi senyawa 153Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab dilakukan dengan melihat profil biodistribusi, profil clearance dan pencitraan dengan alat MRI menggunakan hewan uji yang telah ditumbuhi dengan sel kanker glioma pada otaknya. METODE 1.
Bahan dan Peralatan
Penelitian ini dilakukan di Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka BATAN. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah senyawa CHX-A”-DTPA [(R)-2-Amino-3-(4-isothiocyanatophenyl)prophyltrans-(S,S)-cyclohexane-1,2-diaminepentaacetic acid] yang diperoleh dari Macrocyclic. Dendrimer yang digunakan adalah polyamidoamin (PAMAM) G4 dengan gugus amin dalam bentuk larutan 10 % dalam metanol dari pemasok Aldrich. Nimotuzumab diperoleh dalam bentuk larutan injeksi TheraCim dari Innogen. Tikus yang telah diinfeksi tumor otak diperoleh dari bagian Farmakologi RSHS Bandung. Larutan 153Gd sitrat 1 mM dibuat dengan melarutkan 10 µmol GdCl3 (Stream) yang telah diirradiasi dalam 9 ml akuades dan 100 µmol Na sitrat, kemudian pH dinetralkan dan volume ditambah sampai 10 ml. Larutan salin, air suling diperoleh dari IPHA dan gas N2 dari IGI. Kolom PD-10 (Sephadex G25) diperoleh dari Pharmacia Hewan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit dan tikus putih. Single channel analyzer (BIOSCAN) dan Gammatec II digunakan sebagai pencacah radioaktivitas pada penentuan kemurnian radiokimia. Pelat silika gel F254 (Merck) digunakan sebagai fasa diam pada kromatografi lapis tipis (KLT). Alat kromtografi cair kinerja tinggi KCKT (Shimadzu) dengan detektor UV dan radioaktif (NaI-Tl) digunakan untuk menentukan kemurnian radiokimia. Kolom yang digunakan untuk penentuan kemurnian radiokimia dengan KCKT adalah Size Exclusion Column 250 (SEC, 300 x 7,8 mm dia) didapat dari pemasok Biorad. 2.
Konyugasi
CHX-A”-DTPA
dengan
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
SEMINAR NASIONAL VI SDM TEKNOLOGI NUKLIR YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010 ISSN 1978-0176 PAMAM G4
6.
Dendrimer PAMAM G4 dalam metanol 10% b/v , dimasukkan dalam vial 10 ml, kemudian dialiri gas nitrogen sampai kering. Isi vial (PAMAM G4) dilarutkan kembali dalam 200 µL dapar fosfat pH 7. Kedalam larutan PAMAM G4, ditambahkan CHXA”-DTPA dalam dapar bikarbonat pH 8,5. Larutan kemudian distirer selama 48 jam pada suhu kamar. Pemurnian konjugat DTPA-PAMAM G4 dilakukan dengan ultrafiltrasi menggunakan filter protein (Vivaspin MWCO 10 KD). Volume akhir larutan dibuat 500 µL dalam air .
Kemurnian radiokimia komplek 153Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab ditentukan dengan menggunakan metode KCKT. Kolom yang digunakan dalam penentuan kemurnian radiokimia ini adalah SEC 250 (BioRad) dengan eluen PBS 0,1 M pH 7,2 yang lajualirnya 1 ml/menit. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan dua detektor yaitu detektor UV (280 nm) dan detektor radioaktif NaITl. 7.
3.
Pembuatan CHO-Nimotuzumab
Pada larutan Nimotuzumab ditambahkan dapar asetat pH 5 dan kemudian didinginkan pada suhu 28 oC sebelum penambahan larutan NaIO4 dalam dapar asetat pH 5.5 ( 0.3 ml). Campuran disimpan selama 2 jam pada suhu 2-8 oC sebelum ditambahkan 6 µL etilen glikol. Campuran reaksi kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 2-8 o C yang diikuti dengan proses pemurnian dengan ultrafiltrasi menggunkan protein filter (Vivaspin MWCO 10 KD). Hasil ultrafiltrasi kemudian diencerkan dengan PBS 0,1 M pH 7 sampai diperoleh volume 0,6 ml. Konsentrasi CHONimotuzumab yang diperoleh kemudian ditentukan dengan spektrofotometer Uv/Vis. 4.
Konyugasi DTPA-dendrimer dengan CHONimotuzumab
Kedalam larutan DTPA-dendrimer yang telah diatur pHnya menjadi 8,5 dengan dapar bikarbonat 50 mM ditambahkan CHO-nimotuzumab. Campuran reaksi kemudian di stirer selama 20-24 jam pada suhu 2-8 o C dan terlindung cahaya. DTPA-dendrimerNimotuzumab yang terbentuk kemudian dimurnikan dengan ultrafiltrasi menggunakan protein filter (Vivaspin MWCO 10 KD). 5.
Pembuatan Gd-DTPA-DendrimerNimotuzumab atau 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Kedalam larutan DTPA-dendrimer-Nimotuzumab ditambahkan larutan Gd sitrat 0.3 M, kemudian atau 153 Gd-sitrat 0,3 M yang kemudian di stirer selama 24 jam pada suhu 2 – 8 oC dan terlidung dari cahaya. 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang terbentuk kemudian dimurnikan dengan ultrafiltrasi menggunakan protein filter (Vivaspin MWCO 10 KD). Konsentrasi Nimotuzumab pada sediaan 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab ditentukan dengan spektrofotometer Uv/Vis.
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
714
Penentuan Kemurnian Radiokimia 153GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Uji biodistribusi sediaan 153Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab
Sebanyak 0,1 mL sediaan 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab dengan aktivitas 100 Ci disuntikkan melalui vena ekor mencit (berat 25-35 g). Mencit kemudian dibunuh dibedah setelah 1, 3, 4, 24 dan 48 jam paska injeksi. Organ-organ seperti darah, ginjal , limpa, jantung, paru, lambung, kandung kemih, hati dan otak kemudian dicuplik yang kemudian dicacah dengan alat pencacah sinar gamma. Peresentase cacahan pada tiap gram organ atau tiap organ kemudian dihitung. 8.
Urin dan feces clearance sediaan 153GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Besarnya perubahan aktivitas komplek dalam urin dan feces per satuan waktu merupakan laju urin dan feces clearance. Penentuan uji pencucian 153 radiofarmaka Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab dari ginjal dilakukan dengan menyuntikkan 0,2 mL dengan aktivitas sekitar 200 Ci sediaan kepada tikus secara intra vena melalui vena ekor. Tifus tersebut kemudian dimasukkan kedalam metabolic cage. Urin tifus ditampung dan pada selang waktu tertentu paska injeksi (1, 3, 4, 24 dan 48 jam) diambil dan diukur aktifitasnya dengan alat pencacah gamma (Gammatec II). Persentase aktifitas yang dikeluarkan melalui urin dan feces setelah selang waktu tertentu dihitung dengan cara membandingkan cacah urin dan feces dengan standar yang telah diketahui cacahannya. 9.
Pencitraan Glioma dengan MRI menggunakan senyawa pengontras GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab.
Pencitraan kanker otak (glioma) menggunakan senyawa pengontras Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab yang dilakukan menggunakan tikus model (tikus yang pada otaknya telah diimplantkan sel-sel glioma). Tikus model disuntik dengan GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang kemudian dicitra dengan menggunakan alat MRI 1, 2, 3 dan 4 Adang H G
SEMINAR NASIONAL VI SDM TEKNOLOGI NUKLIR YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010 ISSN 1978-0176 [mV] Gd-153 DTPA DENDRIMER NIMOTUZUMAB 1
Gd-153 DTPA DENDRIMER NIMO- 364 ( 2009) - Detector uv Gd-153 DTPA DENDRIMER NIMO- 364 ( 2009) - Detector NaITl
6.70 0
jam setelah penyuntikan. Dari hasil pencitraan akan diperoleh densitas citra pada masing-masing waktu.
80
kolom sec 2000
HASIL DAN PEMBAHASAN
Eluen bufer phosphat pH7 Gd-153 DTPA Dendrimer
Gambar 1. Struktur Senyawa Pengontras MRI Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Hasil penentuan efisiensi penandaan komplek 153GdDTPA-PAMAM G4-nimotuzumab yang dilakukan dengan KCKT menggunakan kolom SEC 250dengan eluen PBS 0,1 M pH 7 yang kecepatan alirnya 1 ml/menit dapat dilihat pada Gambar 2. Dari Gambar 2 dapat dilihat puncak Gd-DTPAPAMAM-G4-nimotuzumab pada 6,297 menit (kromatogram warna hijau) yang dideteksi dengan detektor UV (280 nM) Sementara itu puncak 153GdDTPA-PAMAM G4-nimotuzumab dapat dilihat pada 6,7 menit (radiokromatogram warna kuning) yang dideteksi dengan detektor radioaktif (NaI-Tl). Dari dua kromatogram ini dapat dilihat dengan jelas 153 terbentuknya Gd-DTPA-PAMAM G4nimotuzumab. Efisiensi pembentukan/penandaan 153 Gd-DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab yang dihitung berdasarkan kromatogram adalah > 90 %. Dari kromatogram ini juga dapat dilihat maíz adanya pengotor lain yaitu komplek 153Gd-DTPAPAMAM G4 pada 9,393 menit.
Adang H G
715
1
9 .5 3 3
panja ng gelombang 280 nm
6 .2 9 7
V o l ta g e
40
Flow 1
A
9 .3 9 8
2
20
B
0
0
10
20
30
40 [min.]
Time
Gambar 2. Kromatogram HPLC Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab ( A = detektor radioaktif dan B= detektor UV). 153
Profil biodistribusi kompleks 153Gd-DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab (% dosis per gram organ) dapat dilihat pada Gambar 3. Pengujian biodistribusi kompleks 153Gd-DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab dilakukan dengan menggunakan mencit putih dengan berat antara 25-35 g. Organ dan jaringan yang diambil adalah darah, kandung kemih, ginjal, paru, limpa, lambung, hati, jantung, otot dan otak. Dari profil biodistribusi ini dapat dilihat radioaktifitas pada ginjal sampai dengan 48 jam setelah injeksi masih lebih tinggi dibandingkan dengan organ lainnya. Dari data dapat diartikan bahwa komplek cenderung bersifat hidrofil dengan rute ekskresinya melalui ginjal. Keradioaktifan yang cukup signifikan juga terdapat pada organorgan hati dan limfa, hal ini disebabkan karena ukuran dari komplek Gd-DTPA-PAMAM G4nimotuzumab yang relatif besar (~ 170 kD) yang akan tertahan di hati dan limfa (Gambar 3) [5, 8, 9]. 12
8 % radioaktivitas
Pembuatan senyawa pengontras MRI Gd-DTPAPAMAM G4-nimotuzumab dilakukan dalam 4 tahap reaksi yaitu pembuatan CHO-nimotuzumab, konyugasi DTPA dengan dendrimer PAMAM G4, reaksi CHO-nimotuzumab dengan DTPA-PAMAM G4 dan reaksi DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab dengan gadolinium (Gd). Karena senyawa GdDTPA-PAMAM G4-nimotuzumab (Gambar 1) bukan senyawa yang radioaktif, maka untuk memudahkan karakterisasinya, proses preparasi cedían pada penelitian ini disimulasikan dengan GdDTPA-PAMAM G4-nimotuzumab bertanda 153Gd (153Gd-DTPA-PAMAM G4-nimotuzumab)
2
60
1 Jam 3 Jam 4 jam 24 jam 48 jam 4
0 Darah
K.ke mih
Ginjal
Lambung
Hati
Jantung
Paru
Limpa
Otak
Otot
Nama Organ
Gambar 3. Biodistribusi 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Hasil penentuan urin dan feces clearance yang diamati selama 96 jam setelah injeksi secara berturut-turut dapat dilihat pada Gambar 4 dan Gambar 5. Hasil ekskresi melalui urin menunjukkan bahwa sekitar 19,4 % radioaktifitas sedíaan 153Gd-
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
SEMINAR NASIONAL VI SDM TEKNOLOGI NUKLIR YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010 ISSN 1978-0176 DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab diekskresikan setelah 96 jam pengamatan. Sedangkaqn presentase tertinggi dalam urin clearance terjadi pada 24 jam setelah injeksi (~ 18,3 %).
Gambar 5. Citra MRI Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab
Hasil uji T1 pencitraan otak tikus putih yang telah diinplant dengan sel kanker otak menggunakan cedían pengkontras Gd-DTPA dan Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab dengan alat MRI menunjukkan bahwa T1 Gd-DTPA > Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab (1/T1 Gd-DTPA < 1/T1 Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab). Hasil ini memperlihatkan bahwa penyangatan citra GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab lebih tinggi dibanding dengan Gd-DTPA.
Gambar 4. Urin Clearance 153Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab
Sementara itu hasil uji feces clearance (Gambar 5) menunjukkan bahwa radioaktifitas sedíaan 153GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang diekskresikan melalui feces hanya ~ 3,32 % selama 96 jam pengamatan setelah injeksi. 1.8
1.5
% radioaktivitas
1.2
0.9
0.6
0.3
0 4J
24 J
72 J
96 J
120 J
Waktu, jam
Gambar 4. Feces Clearance 153Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab
Hasil pencitraan kanker otak (glioma) menggunakan senyawa pengkontras Gd-DTPA-PAMAM G4nimotuzumab yang dilakukan pada tikus model (tikus yang pada otaknya telah diimplantkan sel-sel glioma) dengan alat MRI dapat dilihat pada Gambar 5. Hasil densitas citra yang diamati 1,2, 3 dan 4 jam setelah injeksi berturut-turut adalah 677, 730,740 dan 667 [14]. Dari hasil ini dapat dilihat bahwa densitas citra maksimum diperoleh 3 jam setelah injeksi sedangkan 4 jam setelah injeksi citra densitas sudah mulai menurun.
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
716
KESIMPULAN Dari hasil preparasi dan karakterisasi (biodistribusi dan uji clearance) senyawa 153Gd-DTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab sebagai simulasi untuk pembuatan senyawa pengontras MRI Gd-DTPAPAMAM G4-Nimotuzumab yang secara umum digunakan untuk sistem pengiriman obat ke target (Drug Delivery System) dapat disimpulkan bahwa : a. Penggunaan perunut radioaktif 153Gd memudahkan pengamatan dalam proses preparasi dan karakterisasi sedíaan 153 pengkontras Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab. b. Hasil uji biodistribusi menunjukkan bahwa konsentrasi komplek Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab pada hati dan limpa maíz cukup tinggi 48 jam setelah injeksi yang diperkirakan disebabkan oleh ukuran molekul komplek GdDTPA-PAMAM G4-Nimotuzumab yang relatif cukup besar (~ 170 kD). c. Pencitraan otak menggunakan cedían pengkontras Gd-DTPA-PAMAM G4Nimotuzumab dengan alat MRI, sebaiknya dilakukan antara 2 sampai 3 jam setelah injeksi karena kondisi tersebut memberikan densitas citra yang maksimum. Untuk melengkapi data biodistribusi dan clearance yang sudah ada, perlu dilakukan beberapa pengujian lainnya seperti lipofilisitas, stabilitas, pembersihan dari darah (blood clearance) dan juga uji immunologi.
Adang H G
SEMINAR NASIONAL VI SDM TEKNOLOGI NUKLIR YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010 ISSN 1978-0176 UCAPAN TERIMAKASIH Terimakasih yang sebesar-besarnya disampaikan kepada dr. Rose dan juga Bagian Farmakologi UNPAD yang telah membantu sampai selesainya penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA 1.
Rong Tong, Jianjun Cheng, Anticancer Polymeric Nanomedicine, Polymer Review (2007) 47 :345-351 2. Benjamin P. Sopczynski, A New Anti-Tumor Drug Delivery System : Dendrimers, MMG 445 Basic Biotechnology eJournal 2008, 2, 8792. Diunduh tg l09-04-2008 dari : http://ejournal.vudat.msu.edu 3. Sonke Svenson, Donald A. Tomalia, Dendrimers in biomedical applications – reflections on the field, Advanced Drug Delvery Reviews 57 (2005), 2215-1137. Diunduh tgl 18-03-2007 dari : http://www.sciencedirect.com. 4. Dhruba J.B., Marianne K., Mujgan G., Tessa M.S., Shaker A.M., Nanoparticles and cancer therapy : A consice review with emphasis on dendrimers, International Journal of Nanomedicine 2009 : 4, 1-7. 5. Thommey P. Thomas, Anil K. Patri, Andrzej Myc, Mon Thiri Myaing,Jing Yong Ye, Theodore B. Norris, James R. Baker Jr., In Vitro Targeting of Synthesized Antibody Conjugated Dendrimer Nanoparticle, Biomacromolecules 2004,5, 2269-2274. 6. Luzzi D.E., Smith B.W., Nanoradiopharmaceuticals and Methods of Use, US Patent No. 20070031327. 7. Donald A. Tomalia, L.A Reyna, S. Svenson, Dendrimers as multi-purpose devices for oncology drug delivery and diagnostic imaging, Biochemical Society Transactions (2007) Vol.35, part 1. pp.61-67. 8. Kobayashi, Hisataka , Choyke, Peter L., Methods for tumor treatment using dendrimer conjugates, United States Patent 20060204443 (2006). 9. Martin W. Brechbiel, Robert A. Star, Hisataka Kobayashi, Methods for Functional kidney imaging using small dendrimer contrast agents, United States Patent. 229316 (2002). 10. Ruth Duncan, Lorella Izzo, Dendrimer Biocampatibility and Toxicity, Advanced Drug Delvery Reviews 57 (2005), 2116-2129. Diunduh tgl 16-05-2008 dari : http://www.sciencedirect.com.
Adang H G
717
11. Kalevi Kairemo, Paola Erba, Kim Bergstrom, Ernest K.J. Pauwels, Nanoparticle in Cancer, Current Radiopharmaceuticals, 2008, 1, 30-36. 12. Spencer H.L., Sum YU Kwok, Pratap Singh, Steven E.Diamond., Immobization of specific binding assay reagents. Diunduh tgl. 24-032008 dari : http://www.freepatentsonline.com/EP0637385 B1.html. 13. Thomas T.P., Patri A.K., Andrzej Myc, Mon Thiri Myaing, Jing Yong Ye, Norris T.B., James R.B. Jr., In vitro targeting of synhesizes antibody-conjugated dendrimer nanoparticles, Biomacromolecules 2004, 22692274. 14. Ristaniah D.S., Penyangatan citra resonansi magnetik tumor otak glioma tikus dengan menggunakan senyawa pengontras Gd-DTPAdendrimer- antibodi anti- EGFR, Ringkasan Desertasi Promosi Doktor, Program Pasca Sarjana Universitas Padjadjaran Bandung, 2009
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
SEMINAR NASIONAL VI SDM TEKNOLOGI NUKLIR YOGYAKARTA, 18 NOVEMBER 2010 ISSN 1978-0176
STTN-BATAN & Fak. Saintek UIN SUKA
718
Adang H G
