Potensi Desikator untuk Inkubator Anaerob Siti Humaidah (1506 100 030) Dosen Pembimbing : 1) Dr.rer.nat. Ir.Maya Shovitri,M.Si. dan Nengah Dwianita K, S.Si., M.Si. Program Studi Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember Surabaya 2011 Abstract This study aimed to determine the potential of vacuum desiccator as an anaerobic incubator. Desiccator vacuum is being pumped so that the atmosphere inside is empty. Tested Isolate used are Pseudomonas aeruginosa as aerobic bacteria, Escherichia coli as facultative anaerobic bacteria and Desulvofibrio as obligate anaerobic bacteria. Tested isolates were incubated in a vacuum desiccator. As a comparison is Hungate technique that is replacing the oxygen gas inside the tube head space with nitrogen gas and positive control. Positive control is a culture grown in test tubes containing thioglikolat media without gas replacement (replacing gas) and incubated with putting it on the laboratory bench. The results showed that all isolates tested could grow in a vacuum desiccator, Hungate technique and control. It is anticipated by the factors used thioglikolat media has influence on the degradation conditions of aerobic - anaerobic. Also because of time pumping gas out of the desiccator is not maximized so that there is still oxygen in the head space test tube. Keyword: Vacuum desiccator PENDAHULUAN Latar Belakang Mikroorganisme anaerob adalah mikroorganisme yang tidak menggunakan oksigen sebagai elektron akseptor dalam proses respirasinya, tetapi menggunakan bahan anorganik lain (Madigan et al, 1997). kebanyakan mikroorganisme anaerob sangat sensitif terhadap oksigen. Keberadaan sedikit oksigen saja dalam lingkungannya dapat menghambat dan membunuh mikroorganisme tersebut. Mikroorganisme anaerob mulai diteliti pada tahun 1877 dengan ditemukannya bakteri Vibrion septique oleh Louis Pasteur. Berbagai macam metode telah dikembangkan untuk membiakan mikroorganisme anaerob, salah satunya oleh Brewer pada tahun 1940 yang menambahkan sodium tioglikolat (C2H3NaO2S) pada media biakan sebagai reagen pereduksi oksigen (Margaret, 2009). Perkembangan teknik anaerob juga didukung oleh Hungate pada tahun 1950 yang mengembangkan metode pergantian gas yang berada di ruang kosong (head space) suatu wadah biakan. Gas yang berada di ruang tersebut dikeluarkan dan diganti dengan gas nitrogen, hidrogen dan karbondioksida.
Metode ini dituliskan pada buku The Rumen and Its Microbes (Chung et al., 1997). Pada saat ini, laboratorium mikrobiologi banyak menggunakan anaerob jar bebas oksigen dan teknik Hungate untuk isolasi mikroorganisme anaerob (Burt et al., 1977). Menurut Gillespie (1994) anaerob jar adalah suatu wadah yang kedap udara dan rendah oksigen dan digunakan sebagai inkubator mikroorganisme anaerob. Reduksi oksigen pada anaerob jar dilakukan dengan sitem GasPak yaitu menambahkan paladium sehingga oksigen (O2) dapat bereaksi dengan hidrogen (H2) dari GasPak menjadi air (H2O) (Harley and Prescott, 2002). Paladium sangat efektif untuk mereduksi oksigen, tetapi disisi lain paladium mahal harganya (Shahin et al, 2002). Desikator adalah wadah untuk mengeringkan suatu spesimen dan menjaganya dari kelembaban udara (Daintith 1994). Desikator sederhana laboratorium adalah wadah yang pada bagian dasarnya berisi silika gel atau bahan kimia pengering lainnya. Desikator dilengkapi dengan penutup kaca yang dilapisi oleh vaselin. Vaselin atau petroleum jelly merupakan hidrokarbon golongan alkana dengan 20 hingga 30 atom karbon yang berasal dari minyak bumi
(Oxtoby, 2002). Vaselin berfungsi sebagai penutup celah antara penutup dan wadah desikator sehingga tidak ada aliran udara masuk atau keluar dari desikator. Vaselin juga berfungsi sebagai zat anti mikroorganisme (Fitriana, 2009). Berdasarkan kondisinya, desikator berpotensi untuk dikembangkan menjadi anaerob jar dengan menghilangkan gas yang berada di head space desikator. Rumusan Permasalahan Apakah desikator yang sudah vakum dapat digunakan sebagai inkubator kultur bakteri anaerob? Batasan Permasalahan Batasan masalah dalam penelitian ini adalah: 1. Gas yang berada di head space desikator divakum dengan menggunakan pompa vakum. 2. Kondisi anaerob ditentukan oleh indikator biologi yaitu Desulvofibrio sebagai bakteri obligat anaerob, Escherichia coli sebagai bakteri fakultatif anaerob, Pseudomonas aeruginosa sebagai bakteri obligat aerob. Tujuan Penelitian Untuk mengetahui potensi desikator sebagai inkubator kultur bakteri anaerob. Manfaat Penelitian Apabila terbukti desikator berpotensi positif sebagai anaerob jar, maka Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Biologi ITS mempunyai anaerob jar yang murah dan aplikatif. Sehingga penelitian tentang bakteri anaerob dapat dikembangkan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Biologi ITS.
Bioteknologi Biologi ITS. Isolat Desulvofibrio diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Universitas Airlangga. Pembuatan Media Media yang digunakan adalah media thioglikolat (Lampiran 2). Media thioglikolat (Oxoid, CMO173®, Inggris) sebanyak 30 gr dilarutkan dalam 1000 ml akuades hingga homogen. Media dituang ke tabung reaksi sebanyak 7,5 ml, kemudian diautoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C dengan tekanan 1,5 atm. Untuk isolat uji bakteri obligat anaerob Desulvofibrio perliter media ditambahkan 2 gr MgSO4. 7H2O sebagai elektron akseptor dan 300 ml sodium laktat sebagai elektron donor (Widdle and Bak, 1991). Selanjutnya media tersebut digunakan untuk kultur bakteri obligat anaerob. Desikator Sebagai Anaerob Jar Sembilan buah tabung reaksi berisi media thioglikolat diinokulasi dengan isolat uji. Inokulasi pada media dilakukan dengan menginokulasi 1 µl isolat ke media. Biakan kemudian diletakan ke dalam desikator yang kemudian ditutup rapat. Gas yang ada didesikator dikeluarkan dengan pompa (Haiou®, Cina) selama 1 menit (Lampiran 3). Inkubasi dilakukan pada suhu ruang selama 72 jam dan diamati pertumbuhannya. Parameter yang digunakan sebagai indikator keberadaan oksigen seperti (Tabel 3.1). Tabel 3.1 Parameter keberadaan oksigen
METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Mei sampai Oktober 2010 di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Biologi ITS. Alat, Bahan, dan Cara kerja Isolat Uji Tiga jenis bakteri digunakan sebagai isolat uji yaitu Pseudomonas aeruginosa sebagai bakteri aerob obligat, Escherichia coli sebagai bakteri anaerob fakultatif, dan Desulvofibrio sebagai anaerob obligat. Isolat E. coli dan P. aeruginosa adalah koleksi Laboratorium Mikrobiologi dan
*) head space = ruang kosong di tabung reaksi antara permukaan media dan tutup karet atau sumbat.
Teknik Hungate pada tabung reaksi Teknik Hungate dalam penelitian ini adalah dengan mengalirkan gas nitrogen ke wadah biakan. Inokulasi pada media dilakukan dengan menginokulasi 1 µl isolat ke media. Tabung reaksi yang sudah berisi isolat uji ditutup dengan penutup sumbat karet dan kemudian dialiri gas nitrogen selama 2 menit (Lampiran 4). Selanjutnya biakan diinkubasi pada suhu ruang selama 72 jam. Parameter pengamatan seperti pada (Tabel 3.1). Konfirmasi Isolat Uji Setelah Inkubasi Isolat uji yang hidup setelah inkubasi dilakukan karakterisasi untuk mengkonfirmasi apakah isolat yang hidup tersebut adalah isolat uji yang telah diinokulasikan. A. Karakterisasi Bakteri Desulfovibrio Isolat yang diduga sebagai Desulfovibrio dikarakterisasi berdasarkan buku panduan standar Bergeys Manual of Determinative Bacteriology meliputi: Pengamatan makroskopik Pengamatan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati pertumbuhan isolat pada tabung reaksi pada media thioglikolat (Oxoid, CMO173®, Inggris). Hasil positif pengamatan bakteri Desulfovibrio adalah apabila bakteri tersebut tumbuh pada dasar tabung reaksi (Cappuccino and Sherman, 2001; Harley and Prescott, 2002). Pengamatan mikroskopik Preparat ulas ditetesi larutan kristal violet sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama 20 detik, selanjutnya dicuci preparat di bawah air mengalir dan dikeringanginkan. Selanjutnya larutan iodin (Merck, Jerman) diteteskan sebanyak 2-3 tetes di atas permukaan preparat dan didiamkan selama 1 menit, kemudian dicuci di bawah air mengalir dan dikeringanginkan. Larutan etil alkohol (Merck, Jerman) 95% diteteskan setetes demi setetes di atas permukaan lapisan preparat sampai kristal violet tercuci dan kemudian dicuci di bawah air mengalir dan dikeringanginkan. Larutan safranin diteteskan di atas permukaan kaca obyek dan didiamkan selama 20 detik, dicuci di bawah air mengalir dan dikeringanginkan. Setelah kering, preparat ditutup dengan gelap penutup untuk diamati dibawah mikroskop pada perbesaran 1000X dengan bantuan minyak imersi (Lay, 1994).
Hasil positif bakteri Desulfovibrio berwarna merah muda (merupakan gram negatif) dan berbentuk koma. Hal ini dikarenakan lapisan peptidoglikan yang lebih tipis pada bakteri tersebut dan tidak dapat mengikat pewarna pertama dan hanya dapat mempertahankan pewarna kedua, berupa safranin yang berwarna merah (Lay, 1994). Uji Pembentukan Hidrogen Sulfida (H2S) Jarum inokulasi dengan ujung tajam yang sudah mengandung isolat bakteri ditusukkan ke dalam media semi padat Triple Sugar Iron Agar (TSIA) (Difco, USA) (Lampiran 1) yang ditambahkan 2 gr MgSo4. 7H2O sebagai elektron akseptor dan 300 ml sodium laktat sebagai elektron donor (Widdle and Bak, 1991). secara aseptis kemudian diikubasikan selama 24 jam pada temperatur 37°C (Cappuccino & Sherman, 2001). Hasil positif Desulfovibrio ditandai dengan terbentuknya endapan hitam di dalam media sebagai indikator terbentuknya H2S. B. Karakterisasi Bakteri Escherichia coli Isolat yang diduga sebagai E. coli dikarakterisasi berdasarkan buku panduan standar Bergeys Manual of Determinative Bacteriology meliputi: Pengamatan makroskopik Pengamatan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati pertumbuhan isolat pada tabung reaksi di media thioglikolat (Oxoid, CMO173®, Inggris). Hasil positif pengamatan bakteri E. coli adalah apabila isolat bakteri tumbuh sepanjang kolom tabung reaksi (Cappuccino and Sherman, 2001, Harley and Prescott, 2002). Pewarnaan Gram Cara kerja pewarnaan Gram E. coli sama pada pewarnaan Gram Desulfovibrio. Hasil positif bakteri E. coli berwarna merah muda (merupakan gram negatif) dan berbentuk batang. Hal ini dikarenakan lapisan peptidoglikan yang lebih tipis pada bakteri tersebut dan tidak dapat mengikat pewarna pertama dan hanya dapat mempertahankan pewarna kedua, berupa safranin yang berwarna merah (Lay, 1994). Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA) Satu ose biakan bakteri diinokulasikan secara aseptis pada media agar miring TSIA
pada tabung reaksi dan diinkubasi 24 jam pada temperatur 37°C. Hasil positif E. coli merupakan bakteri yang melakukan fermentasi laktosa dan glukosa sehingga terjadi penurunan pH menjadi asam yang ditandai dengan terjadi perubahan warna menjadi kuning pada seluruh bagian media dan menghasilkan gas yang ditandai dengan sedikit terangkatnya bagian bawah media biakan (Harley and Prescott, 2002). C. Karakterisasi Bakteri Pseudomonas aeruginosa Isolat yang diduga sebagai P. aeruginosa dikarakterisasi berdasarkan buku panduan standar Bergeys Manual of Determinative Bacteriology meliputi: Pengamatan makroskopik Pengamatan makroskopik dilakukan dengan cara mengamati pertumbuhan isolat pada tabung reaksi di media thioglikolat (Oxoid, CMO173®, Inggris). Hasil positif pengamatan bakteri P. aeruginosa adalah apabila isolat bakteri hanya tumbuh di permukaan media (Cappuccino and Sherman, 2001; Harley and Prescott, 2002). Pewarnaan Gram Cara kerja pewarnaan Gram P. aeruginosa sama pada pewarnaan Gram Desulfovibrio dan E. coli. Hasil positif bakteri P. aeruginosa berwarna merah muda (merupakan gram negatif) dan berbentuk batang. Hal ini dikarenakan lapisan peptidoglikan yang lebih tipis pada bakteri tersebut dan tidak dapat mengikat pewarna pertama dan hanya dapat mempertahankan pewarna kedua, berupa safranin yang berwarna merah (Lay, 1994). Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA) Cara kerja uji TSIA pada P. aeruginosa sama pada uji TSIA E. coli. Hasil positif P. aeruginosa merupakan bakteri yang hanya memfermentasi glukosa ditandai dengan adanya perubahan warna menjadi kuning pada bagian bawah agar (Harley and Prescott, 2002). Rancangan Penelitian Penelitian dilakukan dengan sembilan kali pengulangan. Data penelitian dianalisa dengan menggunakan metode deskriptif. Deskripsi keberhasilan teknik vakum dan
Hungate meliputi kemampuan hidup isolat uji dengan parameter pada (Tabel 3.1). HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi desikator vakum sebagai inkubator anaerob dengan menggunakan media thioglikolat. Yang dimaksud dengan desikator vakum adalah desikator yang semua gas yang ada di atmosfernya dipompa keluar. Desikator tersebut kemudian digunakan sebagai tempat inkubasi dari isolat uji dalam tabung reaksi yang head space-nya tidak dialiri gas nitrogen (Gambar 4.1a). Sebagai pembanding dilakukan teknik Hungate, yaitu kultur isolat uji tabung tabung reaksi, dimana gas di head space-nya diganti dengan gas nitrogen (dari gas oksigen menjadi gas nitrogen) dan diinkubasi tidak di dalam desikator vakum tetapi hanya diletakkan di meja laboratorium saja (Gambar 4.1b). Hasil dan pembahasan diurut mulai dari kontrol positif, teknik Hungate dan desikator vakum.
(a)
(b)
Gambar 4.1 (a) Inkubasi di desikator vakum dan (b) Inkubasi di suhu ruang pada teknik Hungate Pada penelitian ini digunakan kontrol positif untuk mengetahui pertumbuhan isolat uji tanpa adanya perlakuan inkubasi di desikator vakum dan teknik Hungate. Kultur pada kontrol positif ditanam di tabung reaksi yang berisi media thioglikolat tanpa pergantian gas (replacing gas) dan diinkubasi dengan meletakannya di meja laboratorium. Berdasarkan Gambar 4.2 dan Lampiran 2 diketahui bahwa pada kontrol positif ini semua isolat uji P. aeruginosa (bakteri aerob obligat), E. coli (bakteri anaerob fakultatif) dan Desulvofibrio (bakteri anaerob obligat) dapat tumbuh.
Zona aerob
(a)
(b)
(c)
Gambar 4.2 Isolat uji yang tumbuh pada kontrol positif setelah inkubasi selama 72 jam. (a) P. aeruginosa, (b) E. coli dan (c) Desulvofibrio. Adanya pertumbuhan isolat uji pada kontrol positif ini mungkin disebabkan oleh faktor pendukung berupa media thioglikolat. Media thioglikolat adalah media yang mengandung sodium thioglikolat, 0,075% agar, resazurin dan nutrisi lainnya (Lampiran 1). Sodium thioglikolat berfungsi sebagai donor elektron yang akan mereduksi oksigen di dalam media. Kandungan agar 0,075% pada media thiogliolat menghambat difusi oksigen dari permukaan media ke dasar media, sehingga ada stratifikasi konsentrasi oksigen dalam media. Konsentrasi oksigen pada permukaan media relatif lebih tinggi dari pada bagian tengah dan bawah, sehingga bagian permukaan media relatif bersifat aerob dan bagian dasar media bersifat anaerob (Marschall et al; 1992). Adanya stratifikasi konsentrasi oksigen pada media mengakibatkan perbedaan lokasi pertumbuhan isolat uji (Gambar 4. 2). P. aeruginosa yang bersifat aerob obligat tumbuh hanya di permukaan media, E. coli yang bersifat anaerob fakultatif tumbuh pada seluruh bagian media dan Desulfovibrio yang bersifat anaerob obligat tumbuh di bagian bawah media. Pada permukaan media kontrol positif terlihat perubahan warna resazurin menjadi merah muda. Resazurin pada media thioglikolat merupakan indikator redoks yang akan berubah warna menjadi merah muda jika terdapat oksigen (Turoski, 2001). Warna merah muda setinggi ± 1cm terlihat jelas pada permukaan media dari isolat uji Desulfovibrio yang menunjukkan adanya oksigen pada permukaan tersebut (Gambar 4.2). Sedangkan pada kultur E. coli tidak nampak adanya warna merah muda, karena oksigen diduga
telah habis digunakan untuk respirasi E. coli. Warna merah muda pada kultur P. aeruginosa terlihat samar karena tertutup oleh biomasa sel yang tumbuh pada permukaan media (Gambar 4.2). Demikian pula dengan teknik Hungate, isolat uji P. aeruginosa (bakteri aerob obligat), E. coli (bakteri anaerob fakultatif) dan Desulvofibrio (bakteri anaerob obligat) juga dapat tumbuh seperti terlihat pada Gambar 4.3 dan Lampiran 2. Harapan awalnya adalah dengan aplikasi teknik Hungate maka yang dapat tumbuh hanyalah isolat Desulfovbrio saja sebagai indikator ketidakberadaan oksigen di head space tabung reaksi. Tetapi hasil penelitian ini menunjukkan hal yang sebaliknya, semua isolat uji dapat tumbuh. Dugaan penyebab tumbuhnya isolat uji pada teknik Hungate adalah sama dengan kontrol positif, yaitu diduga karena kandungan media thioglikolat. Namun antara kontrol positif dan teknik Hungate terdapat perbedaan penampakan warna merah muda pada permukaan media thioglikolat. Pada teknik Hungate tidak ada warna merah muda yang menandakan oksigen telah habis tergantikan oleh nitrogen.
(a)
(b)
(c)
Gambar 4.3 Isolat uji yang tumbuh pada teknik Hungate setelah inkubasi selama 72 jam. (a) P. aeruginosa, (b) E. coli dan (c) Desulvofibrio. Meskipun isolat P. aeruginosa masih dapat tumbuh setelah aplikasi teknik Hungate, tetapi biomassa selnya lebih sedikit jika dibandingkan dengan kontrol positif. P. aeruginosa adalah bakteri obligat aerob yang mutlak membutuhkan gas oksigen untuk respirasinya. Walaupun tidak dilakukan perhitungan gas oksigen di headspace tabung reaksi, namun diduga penukaran gas oksigen dengan gas nitrogen belum dapat menghilangkan semua gas oksigen dalam
headspace tabung reaksi setelah aplikasi teknik Hungate. Menurut Ortega (2007) dengan konsentrasi 0,4% saja P. aeruginosa masih bisa tumbuh dengan waktu pembelahan biner sel (doubling time) 138 ± 20 menit. Lamanya waktu paruh ini bisa dilihat dari tipisnya biomassa sel pada teknik Hungate jika dibandingkan dengan kontrol positif (Gambar 4.2). Selain itu ternyata menurut Ramsdell (1935), kadar oksigen kurang dari 0,3 ml dalam media tidak mengakibatkan perubahan warna pada resazurin. Rendahnya kadar oksigen dalam teknik Hungate ini mungkin sebagai penyebab tidak terdeteksinya keberadaan oksigen oleh resazurin. Proses vakum yang dilakukan pada desikator diharapkan dapat mengeluarkan semua gas yang berada di dalam head space desikator dan head space tabung reaksi. Gas yang ada di head space tabung reaksi diasumsikan dapat ikut tertarik keluar ketika proses vakum dilakukan, karena tabung reaksi hanya ditutup dengan kapas dan kasa. Sehingga, berdasarkan parameter keberadaaan oksigen (Tabel 3.1) bakteri fakultatif anaerob dan obligat aerob diharapkan akan mati. Namun hasil yang diperoleh adalah isolat uji P. aeruginosa (bakteri aerob obligat), E. coli (bakteri anaerob fakultatif) dan Desulvofibrio (bakteri anaerob obligat) dapat tumbuh seperti yang ditunjukkan oleh Gambar 4.4 dan Lampiran 2. Hal ini diduga selain karena faktor media thioglikolat, juga karena faktor oksigen yang masih ada di head space tabung reaksi. Terlihat dari Gambar 4.4 ada warna merah muda pada permukaan media yang diinokulasi dengan Desulfovibrio sebagai indikasi keberadaan oksigen. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa pemompaan gas keluar dari desikator yang dilakukan selama 1 menit (60 detik) belum dapat mengeluarkan gas yang berada di head space tabung reaksi. Adanya oksigen di head space tabung reaksi dapat mendukung pertmbuhan bakteri P. aeruginosa (bakteri aerob obligat) dan E. coli (bakteri anaerob fakultatif) walaupun inkubasi dilakukan di dalam desikator yang divakum.
(a)
(b)
(c)
Gambar 4.4 Isolat uji yang tumbuh pada desikator vakum setelah inkubasi selama 72 jam. (a) P. aeruginosa, (b) E. coli dan (c) Desulvofibrio Melihat indikasi ini, mungkin potensi desikator vakum sebagai inkubator kultur bakteri anaerob dapat dikaji ulang dengan meningkatkan waktu vakum sampai dengan batas maksimalnya. Batas waktu maksimal tersebut dapat dilihat berdasarkan volume desikator dan kecepatan proses vakum pompa (air displacement) seperti persamaan (1) berikut. Volume desikator Air Displacement
(1)
Bila kecepatan pompa vakum (Haiou®, Cina) adalah 0,9 m2/h atau 0,25 L/dt dan volume desikator adalah 18,5 L, maka waktu maksimal proses vakum adalah 74 detik seperti perhitungan (2) dibawah ini Volume desikator
18,5 L =
0,25 L/dt
(2)
Air Displacement
Secara kualitatif, biomassa isolat uji yang tumbuh dari dua metode anaerob tersebut (desikator vakum dan teknik Hungate) tidak berbeda nyata, tetapi secara kuantitatif diduga memiliki perbedaan biomassa sel. Sebagai contoh pada isolat uji Desulfovibrio. Pertumbuhan isolat uji pada kontrol positif (Gambar 4.2), teknik Hungate (Gambar 4.3) dan desikator vakum (Gambar 4.4) menunjukan kesamaan ketinggian biomassa sel bila dilihat dari dasar media. Tetapi apabila diuji secara kuantitatif, mungkin jumlahnya tidak sama. Uji kuantitatif yang bisa dilakukan adalah secara turbidimetrik yaitu perhitungan
massa sel berdasarkan kekeruhan (Waluyo, 2008). Untuk konfirmasi bahwa isolat yang tumbuh bukan kontaminan, maka dilakukan uji konfirmasi dengan pengamatan mikroskopik dan uji fermentasi dengan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA). Uji TSIA dilakukan karena dapat membedakan fermentasi dari E. coli dan P. aeruginosa serta dapat membuktikan adanya gas H2S pada bakteri yang mereduksi sulfur. Menurut Holt et al., (1994) E. coli bersifat anaerob fakultatif dan dapat menfermentasi laktosa dan glukosa, sedangkan P. aeruginosa bersifat obligat aerob dan hanya dapat menfermentasi glukosa saja. Hasil uji TSIA menunjukan karakter isolat uji E. coli seperti yang diharapkan, yaitu melakukan fermentasi laktosa dan glukosa sehingga terjadi penurunan pH menjadi asam dan menghasilkan gas. Indikasi penurunan pH ditunjukkan dengan perubahan warna merah menjadi kuning pada seluruh bagian media dan indikasi ada gas ditunjukkan oleh terangkatnya bagian bawah media biakan (Gambar 4.5).
(a)
(b)
(c)
Gambar 4.5 Uji TSIA pada E. coli pada (a) kontol positif, (b) teknik Hungate dan (c) teknik desikator. Uji TSIA juga menunjukkan bahwa isolat uji P. aeruginosa adalah isolat yang diharapkan. Media TSIA mengandung 1% laktosa, 1% sukrosa dan 0.1% glukosa. P. aeruginosa hanya mampu memfermentasikan sebagian saja dari gula tersebut yaitu glukosa. Fermentasi parsial yang dilakukan P. aeruginosa dapat dilihat dari perubahan warna media TSIA yang juga parsial, ada bagian yang berubah warna menjadi kuning dan ada yang masih berwarna merah. Warna merah menunjukkan bahwa gula tidak difermentasikan dan tidak terjadi perubahan pH (tetap basa) (Gambar 4.6) (Harley and Prescott, 2002).
(a)
(b)
(c)
Gambar 4.6 Uji TSIA pada P. aeruginosa. (a) teknik desikator, (b) teknik Hungate dan (c) kontol positif. Sedangkan uji TSIA Desulfovibrio tidak menghasilkan karakter yang diharapkan, yaitu terbentuk endapan hitam (FeS) yang merupakan reaksi dari H2S dengan ferous sulfat pada media TSIA, meskipun media telah ditambahkan MgSO4. 7H2O sebagai elektron akseptor dan sodium laktat sebagai elektron donor. Desulfovibrio adalah bakteri pereduksi sulfat yang menggunakan SO4 sebagai elektron akseptor sehingga terbentuk H2S (Madigan et al, 1997; Matias et al, 2005). Widdle and Bak (1991) menyatakan bahwa substrat yang toksik bagi Desulfovibrio adalah yang mengandung indol atau phenol yang dapat menghambat pertumbuhan Desulfovibrio dan mengakibatkan tidak terbentuknya H2S pada media. Sedangkan media TSIA mengandung phenol red sebanyak 0,024 gr per liter (Harley and Prescott, 2002). Selain itu Desulfovibrio adalah bakteri yang bersifat obligat anaerob; media TSIA yang digunakan walaupun telah ditambahkan MgSO4. 7H2O sebagai elektron akseptor dan sodium laktat sebagai elektron donor tetapi tidak dikondisikan secara anaerob. KESIMPULAN Dari hasil penelitian diketahui bahwa desikator berpotensi sebagai inkubator kultur anaerob ditandai dengan tumbuhnya isolat Desulfovibrio (anaerob obligat). Namun terdapat kelemahan dalam pemanfaatan desikator vakum ditandai dengan hidupnya isolat P. aeruginosa (aerob obligat) dan E. coli (fakultatif anaerob) yang diduga masih terdapat oksigen di head space tabung reaksi. SARAN Untuk mengetahui potensi desikator vakum sebagai alternatir anaerob jar perlu
diperhatikan kemungkinan kebaradaan oksigen dalam head space tabung reaksi. DAFTAR PUSTAKA Chung, King-Thom dan M. P. Bryant. 1997. Robert E. Hungate: Pioneer of Anaerobic Microbial Ecology. Department of Microbiology and Molecular Cell Sciences, The University of Memphis, Memphis, TN 38152 Department of Animal Science, University of Illinois, Urbana, IL 61801, U.S.A. Anaerobe (3): 213– 217. Dwidjoseputro. D. 1978. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan: Surabaya. Fitriana, M. 2009. Skripsi: Formulasi dan Uji Aktivitas Antijamur Secara In Vitro Salep Minyak Atsiri Rimpang Temu Giring (Curcuma heyneana val.) dengan Basis Vaselin. Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah: Surakarta. Gilespie, S. H. 1994. Medical Microbiology Ilustrated. Butterwort Heinemann: London. Hansen, S. P. 1999. High Vacuum with Mechanical Pumps. Bell Jar. Vol. 8, No. 2. Harley and Prescott. 2002. Laboratory Exercise In Microbiology. 5th Edition. Mc Graw Hill. Holt, J.G. (1994). Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology . Ninth Edition. Williams and Wilkins: USA. Horn, K. V., Katherine. W., dan E. J. Baccaglini. 1997. Evaluation of the AnaeroPack System for Growth of Anaerobic Bacteria. Department of Clinical Pathology, Westchester County Medical Center,1 and Department of Pathology, New York Medical College,2 Valhalla, New York 10595. Journal Of Clinical Microbiology. Vol. 35, No. 8: 2170– 2173, Imhof, A. dan I. Heinzer. 1996. Continuous Monitoring of Oxygen Concentrations in Several Systems for Cultivation of Anaerobic Bacteria. Institute of Microbiology, Kantonsspital, CH5001 Aarau, Switzerland. Journal of clinical microbiology. Vol. 34, No. 7: 1646–1648.
Lay, W.B. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo. Madigan, M.T dan J.M. Martinko. 1997. Brock; Biology of Microorganisms. 8th edition. Pearson Prentice Hall, USA. Mans, J. 2006. Vacuum Physics and Technology. 6th edition. Spring. Ebook. Marschall, Christoph., P. Frenzel., dan H. Cypionka. Influence of oxygen on sulfate reduction and growth of sulfate-reducing bacteria. 1992. Arch Microbiol Vol: 159:168-173. Margaret. 2009. Artikel: The Recognition of Anaerobic Growth and the Development of the Anaerobic Jar. www.cmpt.ca/pdf_archived.../anaerob es_jar_mswift_03_7_4.pdf. Didownload pada 29 November 2009 pukul 08.00 WIB. Nelson, D. L. dan Michael M. C. 2004. Lehninger: Principles Of Biochemistry. 4th edition. Worth Publishers. Inc, New York. Ortega. C. A dan C. S. Harwood. 2007. Responses of Pseudomonas aeruginosa to low oxygen indicate that growth in the cystic fibrosis lung is by aerobic respiration. Molecular Microbiology Vol 65(1): 153–165. Oxtoby, D.W. 2002. Prinsip- Prinsip Kimia Modern. Edisi keempat. Erlangga: Jakarta. Pak, K Ran, H Lee, H lee1, Y kim,Y oh, and S Choi. 2003. Involvement of Organic Acid During Corrosion of Iron Coupon by Desulfovibrio desulfuricans. Journal Microbiol. Biotechnol. Vol 13(6): 937–941 Ramsdell.G. A., W. M. T Johnson., JR., and f. R. Evans. 1935. Investigation of Resazurin as an Indicator of The Sanitary Condition of Milk. Journal Dairy Science. Vol 18: 705-717. Reed G. B. dan J. H. ORR. 1945. Cultivation of Anaerobes and OxidationReduction Potentials. Queen University, Kington, Kanada. J. Bact: 309-320. Shahin, May., W. Jamal, T. Verghese, dan V.O. Rotimi. 2002. Comparative Evaluation of Anoxomat and Conventional Anaerobic GasPak Jar Systems for the Isolation of Anaerobic
Bacteria. Departments of Microbiology, Faculty of Medicine, Kuwait University and Mubarak AlKabeer Teaching Hospital, Kuwait. Med Princ Pract. Vol 12: 81–86. Smith. 1952. Desiccator Data. Noyes Chemical Laboratories. University of Illinois. Analytica Chimica Acta. Vol 6. Turoski V., S. D. Richardson., J. Plude. 2001. Paper: A New Method For Monitoring Toxicity Using Stock Culture Or Indigenouss Biomss. Division of Enviromental Chemistry. American Chemistry Society. Vol 41 No 1. Waluyo, L. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. UMM press: Malang. Watt, B, j. G. Collee. dan R. Brown. 1976. Tests of Performance of Anaerobic Jars. Microbiological Laboratories, Western General Hospital, Crewe Road, Edinburgh EH4 2XU and Department of Bacteriology, University Medical School, Teviot
Place, Edinburgh. J. clin. Path. Vol 29: 534-536. Widdle and Bak edited by Burt, R. dan K. D. Phillips. 1991. Gram Negative Mesophilic Sulfat Reducing Bacteria in Technical methods: A new anaerobic jar. Public Health Laboratory, Luton and Dunstabk Hospital, Lewsey Road, Luton LU4 ODZ, UK. J. Clin. Pathol. Vol 30:1082-1084. www.textbookofbacteriology.net/themicrobial world/Structure.html. Diakses pada tanggal 7 April 2010 pada Pukul 21.58 WIB. www.eid.ac.cn/MirrorResources/7279/ecoli.ht m.1.1.html. Diakses pada tanggal 7 April 2010 pada Pukul 21.30 WIB. http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfnewt hiopage.html. Diakses pada tanggal 23 januari 2011 pada Pukul 18.00 WIB. http://en.academic.ru/dic.nsf/enwiki/76356. Diakses pada tanggal 7 April 2010 pada Pukul 22.00 WIB.
