Malá zvířata
Polyneuropatie greyhoundů I. HÁJEK,1 P. SCHÁNILEC,1 J. DUFEK,2 M. ŠAFROVÁ3
MVDr. Ivo Hájek asistent Oddělení vnitřních chorob
1
Fakulta veterinárního lékařství Veterinární a farmaceutické univerzity Brno
2
Privátní neurologická praxe/EP laboratoř, Brno
3
Genomia, genetická laboratoř, Plzeň
SOUHRN Hájek I., Schánilec P., Dufek J., Šafrová M. Polyneuropatie greyhoundů. Veterinářství 2013;63: Sdělení je věnováno případu štěněte plemene greyhound s klinickými projevy polyneuropatie. V návaznosti na klinické, neurologické, laboratorní a paraklinické vyšetření byla provedena genetická testace pacienta a elektroneurografie (ENG) periferních nervů, které potvrdily axonální a demyelinizační postižení dědičného charakteru. Vedle prezentace klinického případu je diskutována genetika a histologická charakteristika onemocnění.
SUMMARY Hájek I., Schánilec P., Dufek J., Šafrová M. Greyhound polyneuropathy. Veterinářství 2013;63: This communication deals with the case of a greyhound puppy with clinical symptoms of polyneuropathy. After clinical, neurological, laboratory and paraclinical examination, genetic testing of the patient and electroneurography (ENG) of peripheral nerves were performed. These procedures confirmed hereditary axonal and demyelinating disease. In addition to the presentation of this clinical case, genetics and histological character of the disease is discussed.
Úvod Greyhoundi byli vyšlechtěni pro lovecké účely, v průběhu šedesátých let dvacátého století se chov separoval na linii výstavní a linii pracovní (profesionální rychlostní soutěže). Dědičná polyneuropatie greyhoundů postihuje pouze výstavní linii a projevuje se identickými příznaky jako onemocnění CharcotMarie-Tooth u lidí (CMT). Toto onemocnění se podle elektrofyziologických a patomorfologických charakteristik dělí na demyelinizační (CMT1) a axonální (CMT2) fenotyp, popsán je i typ smíšený.1 Specifické formy onemocnění CMT byly vedle greyhoundů popsány i u dalších plemen psů (německá doga, rotvajler, dalmatin, aljašský malamut, leonberger, německý ovčák, border kolie, pyrenejský horský pes, malý knírač).2-10 Dědičná polyneuropatie greyhoundů je autosomálně recesivní onemocnění, které se projevuje u jedinců geneticky značených P/P (pozitivní/ pozitivní – mutovaná alela od obou rodičů), přenašeči jedné mutované alely (P/N – pozitivní/negativní) jsou bez klinických příznaků onemocnění. U postižených jedinců se choroba projevuje mezi třetím a devátým měsícem věku, nejčastěji se popisuje nejistota při chůzi, přešlapování, snížená citlivost končetin, slabost a bolestivost svalů či bunny hopping. V pokročilém stadiu se rozvíjí progresivní ataxie, výrazná tetraparéza, atrofie kosterních svalů a dysfonie. Stejně jako
650
Obr. 1 – Pacient – kyfóza, slabost končetin, méně dobrý výživný stav (osobní databáze majitelky) u lidí, kauzální terapie neexistuje a většina psů je kvůli výrazné progresi neurologických deficitů do jednoho roku věku utracena.
Popis případu Na Oddělení vnitřních chorob Kliniky chorob psů a koček byla přijata šestiměsíční fena greyhounda. Majitelka ji od jejího narození popisovala jako ukňouranou a nahrbenou s progresivním zhoršováním klinického stavu od tří měsíců stáří (obr. 1).
VETERINÁŘSTVÍ 9/2013
Malá zvířata
Obr. 2 – Výstup z analýzy detekované mutace řádek 1: vzorek postiženého jednice - nese dvě mutované alely (mutace c.1080_1089delTCGCCTGGAC v NDRG1 genu, mutovaný homozygot – jeden peak o velikosti 156 bp) řádek 2: vzorek zdravého jedince (jeden peak o velikosti 166 bp) řádek 3: vzorek heterozygota, nese jednu mutovanou alelu (mutace c.1080_1089delTCGCCTGGAC v NDRG1 genu) a jednu normální wild-type alelu Zdroj: Genomia, genetická laboratoř, Plzeň Hlavními symptomy byly tremor pánevních končetin, nekoordinovaný pohyb všech končetin a výrazná kyfóza. Fena byla řádně očkovaná, pocházela z deseti sourozenců (jeden s identickými neurologickými projevy) a přes normální příjem krmiva nepřibírala na váze. Dosavadní terapie pacienta sestávala z podávání kloubní podpory s obsahem chondroitin sulfátu, glukosamin sulfátu, kyseliny hyaluronové a tokoferolu, dále léčivých přípravků s obsahem draslíku, vitaminu C, zinku, inulinu, pupalkového oleje, vápníku, glukózy a vitaminu D. Vstupní klinické vyšetření odhalilo mírnou tachykardii (116 pulzů/min) a bilaterální hyperemii sliznice spojivky s výrazným nástřikem cév. Při neurologickém vyšetření byla v rámci posouzení postoje zaznamenána kyfóza thorakolumbální páteře a tremor pánevních končetin, při chůzi fena vykazovala mírnou až střední generalizovanou proprioceptivní ataxii, bylo viditelné „strouhání“ pánevních končetin, po zátěži jejich předsouvání a sunutí po podlaze. Při zvedání z lehu nebyla fena schopná se sama postavit. Vyšetření hlavových nervů bylo v normě, spinální reflexy byly generalizovaně oslabené (patelární bil. -2, flexory na pánevních končetinách -1, na hrudních 0/-1; 0: normoreflexie, -1/-2: hyporeflexie/areflexie, +1/+2: hyperreflexie/myoklonus). Postojové reakce byly rovněž deficitní, trakař taktilně na obou hrudních končetinách s výrazně opožděnou iniciací pohybu, stejně tak prováděný hopping/hemiwalking. V návaznosti na provedená základní vyšetření bylo vysloveno podezření na postižení periferního nervového systému (PNS) s progresivním průběhem (polyneuropatie). Vzhledem k lokalizaci léze (PNS) přicházely
VETERINÁŘSTVÍ 9/2013
v rámci diferenciální diagnostiky (VITAMIN D) v úvahu příčiny zánětlivé/infekční, metabolické, neoplastické/ paraneoplastické a degenerativní. Dalšími diagnostickými kroky proto byly screening metabolického profilu pacienta a vyloučení zánětlivých či neoplastických procesů. Hematologickým vyšetřením byla zjištěna pouze mírná polycytemie (spolu s hematokritem při horní hranici referenčního rozmezí), v biochemickém profilu byla hyperalbuminemie, mírná hyperglykemie, elevace jaterních a svalových enzymů, mírná hyperkalcemie s hyperfosfatemií a mírná elevace laktátu. Vedle základního biochemického panelu byly stanoveny i hladiny tyreotropního hormonu a tyroxinu, které byly v referenčním rozmezí (tabulka 1). Zobrazovací diagnostika thorakální a abdominální dutiny byla bez patologického nálezu. Vzhledem k plemeni a progresu symptomů byla provedena detekce mutace v genetické laboratoři (vyšetření je nabízeno několika subjekty po celé ČR). Výsledek tohoto vyšetření byl pozitivní, fena tedy byla nositelem dvou mutovaných alel (jedinec P/P, obr. 2). Z důvodu komplexní dokumentace případu a upřesnění formy a rozsahu postižení jsme dále přistoupili k elektrodiagnostickému vyšetření (ENG – elektroneurografie se supramaximální stimulací), které bylo provedeno pomocí dvoukanálového elektrodiagnostického přístroje Keypoint® Portable (Medtronic, Dánsko) za použití povrchové bipolární stimulační elektrody s tzv. soaked felt pads. Povrchové registrační elektrody (argentchloridový typ snímací plochy o průměru 10 mm potažené adhezivním hydrogelem) byly přiloženy na mm. interossei palmární, resp. plantární části vyšetřovaných končetin. Zemnící jehlová
651
Malá zvířata
elektroda byla inzerována subkutánně v oblasti ramenního, respektive kyčelního kloubu. Na hrudních končetinách bylo provedeno neurografické vyšetření nn. ulnares, na pánevních končetinách nn. tibiales. Vyšetřením loketních nervů byla bilaterálně potvrzena snížená rychlost vedení vzruchu (NCV, nerve conduction velocity, obr. 3, 4), na holenních nervech byla zaznamenaná rychlost ještě nižší (obr. 5, 6). Vedle snížené rychlosti vedení vzruchu potvrzující demyelinizační postižení testovaných nervů byla zaznamenána nízká amplituda snímaných potenciálů (CMAP, compound muscle action potential) vypovídající o axonálním postižení (obrázky 3-6). Provedená elektroneurografie vypovídala o projevech pokročilé polyneuropatie s demyelinizačním a axonálním postižením periferních nervů s výraznější manifestací na pánevních končetinách (klinicky i neurograficky). Na základě nálezů byla vyslovena nepříznivá prognóza, s majitelkou byla probrána nutnost fyzioterapie bez možnosti medikamentózního ovlivnění klinického stavu a zvažována eutanázie s případným pato-
morfologickým posouzením periferních nervů. Dva měsíce po návštěvě na naší klinice majitelka informovala o stavu pacienta, tremor pánevních končetin progredoval a začaly se objevovat příznaky dyspnoe. Soukromý veterinární lékař diagnostikoval dilatační kardiomyopatii (DCM). Dušnost pacienta však mohla souviset i s postupnou obrnou dýchacích svalů, která je v rámci polyneuropatie greyhoundů v pokročilém stadiu poměrně běžná. Bratr pacientky byl, týden před kontaktováním naší kliniky, uspán z důvodu asfyxie, naše pacientka podstoupila eutanázii v jedenáctém měsíci stáří.
Diskuse Polyneuropatie juvenilních greyhoundů je dědičným onemocněním, které je způsobeno mutací NDRG1 genu (N-myc downstream regulated gene) na třináctém chromozomu (CFA13). Jedná se o deleční mutaci exonu 15, která byla detekována v roce 2010. Mutace deseti párů
Tab. 1 – Hematologické a biochemické vyšetření Parametr
Jednotky
Výsledky
Referenční rozmezí
Leukocyty
109/l
8,0
6,0-17,0
segmenty
109/l
4,96
3,3-10,5
9
lymfocyty
10 /l
2,48
1,0-3,6
eozinofily
109/l
0,4
0-0,5
monocyty
109/l
0,08
0-0,5
12
10 /l
9,63
5,5-8,5
Hemoglobin
g/l
165
120-180
Hematokrit
l/l
0,52
0,37-0,55
9
10 /l
251
200-500
Celkový protein
g/l
69,5
55-75
Albumin
g/l
39,0
23-34
Urea
mmol/l
5,6
3,3-8,3
Kreatinin
μmol/l
80,8
35-110
Glukóza
Erytrocyty
Trombocyty
mmol/l
8,1
3,1-6,7
ALT
μkat/l
5,5
0,1-1,0
AST
μkat/l
1,78
0,1-1,0
ALP
μkat/l
2,13
0,1-2,5
Kreatinkináza
μkat/l
6,61
0,1-4,0
mmol/l
3,21
2,3-3,0
Vápník Fosfor
mmol/l
2,35
1,0-2,1
Sodík
mmol/l
144,7
140-155
Draslík
mmol/l
4,0
4,0-5,5
TSH
ng/ml
0,17
0,01-0,60
cT4
nmol/l
27,3
12,9-45,1
Laktát
mmol/l
3,97
< 3,0
652
Obr. 3 – Elektroneurografie nervus ulnaris sin. – rychlost vedení vzruchu 39,8 m/s, velikost amplitud ze dvou stimulačních míst 2,8 mV a 2,3 mV (velikost stimulačního proudu 31,59 mA a 44,91 mA) mV – milivolt, mA – miliampér, sin. – sinister/levý
Obr. 4 – Elektroneurografie nervus ulnaris dx. – rychlost vedení vzruchu 42,2 m/s, velikost amplitud ze dvou stimulačních míst shodná 2,4 mV (velikost stimulačního proudu 33,6 mA a 39,87 mA) mV – milivolt, mA – miliampér, dx. – dexter/pravý
VETERINÁŘSTVÍ 9/2013
inzerce 1
Malá zvířata
Obr. 5 – Elektroneurografie nervus tibialis sin. – rychlost vedení vzruchu 34,1 m/s, velikost amplitud ze dvou stimulačních míst 0,7 mV a 0,4 mV (velikost stimulačního proudu 32,97 mA a 33,6 mA) mV – milivolt, mA – miliampér, sin. – sinister/levý
Obr. 6 – Elektroneurografie nervus tibialis dx. – rychlost vedení vzruchu 39,0 m/s, velikost amplitud ze dvou stimulačních míst 0,7 mV a 0,6 mV (velikost stimulačního proudu 40,92 mA a 40,2 mA) mV – milivolt, mA – miliampér, dx. – dexter/pravý bází (10 bp) s označením c.1080_1089delTCGCCTGGAC je odpovědná za klinické projevy onemocnění a mutace v NDRG1 genu jsou odpovědné i za senzorickou a motorickou neuropatii u lidí (CMT4D), aktuálně byla v tomto genu (exon 4) detekována i mutace způsobující progresivní polyneuropatii aljašských malamutů, zmíněná v úvodu tohoto příspěvku.11,12 Při postupu detekce mutace je genomová DNA vyizolována ze vzorku krve odebraného nesrážlivě do EDTA pomocí komerčně dodávané izolační soupravy. Ze vzorku DNA je následně provedena polymerázová řetězová reakce (PCR), při které dojde k amplifikaci exonu 15 a přilehlých oblastí NDRG1 genu. Pro detekci deleční mutace
654
c.1080_1089delTCGCCTGGAC se používá fragmentační analýza. Jedná se o metodu PCR s fluorescenčně značeným primerem s následnou separací PCR produktů (velikostních fragmentů) podle velikosti pomocí kapilární elektroforézy. Fluorescenčně značený PCR produkt při průchodu kapilárou po ozáření laserem emituje záření o specifické vlnové délce a intenzitě, přístroj jej detekuje jako tzv. peaky.13 Pro stanovení velikosti PCR produktu je ke vzorku zařazen velikostní standard – dle pozic peaků velikostního standardu a vzorku je určena velikost analyzovaného PCR produktu. Vzorky o neznámém genotypu jsou analyzovány společně s pozitivní kontrolou, která prokazuje přítomnost hledané mutace (např. přenašeč 10 bp delece v exonu 15 NDRG1) a kontrolou kontaminace (non-template control). Genotypy vzorků jsou určeny na základě přítomnosti peaků, které odpovídají specifickým velikostním fragmentům. Vzorek jedince bez mutace c.1080_1089delTCGCCTGGAC má jeden peak odpovídající velikosti 166 bp (dvě „zdravé“ alely v zákrytu). Vzorek přenašeče mutace c.1080_1089delTCGCCTGGAC má dva peaky odpovídající velikostem 166 bp (alela bez mutace) a 156 bp (alela s delecí 10 bp). Vzorek mutovaného homozygota má jeden peak odpovídající velikosti 156 bp (dvě mutované alely v zákrytu, obrázek 2). Histologickým vyšetřením periferních nervů se u postižených jedinců zjišťuje až 50% úbytek myelinových vláken spojený s endoneurální fibrózou a subperineurálním edémem. Část zachovaných vláken má rozdílný charakter myelinové pochvy a odlišný axonální průměr. Elektronmikroskopicky jsou přítomná denzní a lamelární tělíska v axoplazmě a deformované mitochondrie, dalším častým nálezem je dilatace Schmidt-Lantermanových náruček, které jsou obecně viditelné pouze v periferním nervovém systému. Závažná axonální atrofie se rozvíjí společně s instabilitou paranodálního myelinu a abnormálním ztenčením myelinové pochvy, označovaném jako tomacula. Tyto nálezy fakticky odpovídají histologickým nálezům dědičných neuropatií u lidí.11,14,15 Svaly jsou postiženy neurogenní atrofií vycházející z chronické denervace s histologicky viditelnou nekrózou, myofagocytózou, akumulací lipidů v perimysiu a ztrátou intramuskulárních myelinových nervových vláken a jejich větvení.11 Dědičná polyneuropatie greyhoundů je jednou z mnoha forem polyneuropatií, k jejichž diagnostice musí lékař přistupovat systematicky v rámci nacionále, anamnézy, klinického a neurologického vyšetření a dalších diagnostických postupů (laboratorní nálezy, zobrazovací metody, elektrodiagnostika, v případě podezření na dědičné onemocnění potvrzení genetickým testem).16 V případě postižení periferního nervového systému (nález generalizované hyporeflexie v rámci neurologického vyšetření s možným postižením hlavových nervů, případně flacidní paraparéza/paraplegie např. při nástupu akutní polyradikuloneuritidy nebo soubor monoparéz/monoplegií) je ke zhodnocení postižení a určení přesné lokalizace možné provést elektroneurografické vyšetření, využité v případě našeho pacienta. Spodní hranice referenčního rozmezí je stanovena na 50
VETERINÁŘSTVÍ 9/2013
Malá zvířata
m/s, v jednotlivých studiích prováděných v minulosti se však průměrná rychlost vedení vzruchu periferními nervy (nerve conduction velocity) pohybovala nejčastěji mezi 50 a 80 m/s.17-20 Námi provedenou metodikou byla průměrná rychlost vedení vzruchu loketním nervem u zdravých psů stanovena na 63±9 m/s.21 Elektromyografie (EMG) může odhalit neurogenní postižení jednotlivých svalových skupin v podobě spontánní aktivity (pozitivní ostré vlny, fibrilační potenciály atd.) a úbytku zapojených motorických jednotek (MU, motor units).
13.
14. 15. 16.
17.
Závěr 18.
Polyneuropatie juvenilních greyhoundů má infaustní prognózu, odhalení mutace však výrazně přispělo k pochopení mechanismů jejího vzniku a studium těchto onemocnění psů může v budoucnosti přispět i k řešení fatálních neurologických diagnóz v humánní medicíně. Elektroneurografie je v případě této diagnózy (potvrzené genetickým testem) doplňkovou paraklinickou metodou, která přispívá k typologii a určení rozsahu postižení (pro správný diagnostický a terapeutický postup v rámci postižení PNS je však stále rozhodující anamnéza, progres symptomů a kvalitní klinické a neurologické vyšetření) a která může pomoci v monitoringu pacientů s postižením periferních nervů. V chovech greyhoundů by zároveň mělo probíhat genetické testování chovných jedinců a postupná selekce přenašečů defektních alel. Literatura: 1. Zhang, R. X., Tang, B. S. Classification and molecular diagnostic procedure for Charcot-Marie-Tooth disease. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 2012;29(5):553-557. 2. Henricks, P. M., Steiss, J., Petterson, J. D. Distal peripheral polyneuropathy in a great dane. Can Vet J 1987;28(4):165-7. 3. Braund, K. G., Toivio-Kinnucan, M., Vallat, J. M., Mehta, J. R., Levesque, D. C. Distal sensorimotor polyneuropathy in mature Rottweiler dogs. Vet Pathol 1994;31(3):316-26. 4. Braund, K. G., Shorek, A., Cochrane, S., Forrester, D., Kwiecien, J. M., Steiss, J. E. Laryngeal paralysis-polyneuropathy complex in young Dalmatians. Am J Vet Res 1994;55(4):534-42. 5. Braund, K. G., Shores, A., Lowrie, C. T., Steinberg, H. S., Moore, M. P., Bagley, R. S., Steiss, J. E. Idiopathic polyneuropathy in Alaskan malamutes. J Vet Intern Med 1997;11(4):243-9. 6. Shelton, G. D., Podell, M., Poncelet, L., Schatzberg, S., Patterson, E., Powell, H. C., Mizisin, A. P. Inherited polyneuropathy in Leonberger dogs: a mixed or intermediate form of Charcot-Marie-Tooth disease?. Muscle Nerve 2003;27(4):471-7. 7. Coates, J. R., O'Brien, D. P. Inherited peripheral neuropathies in dogs and cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract 2004;34(6):1361-401. 8. Vermeersch, K., Van Ham, L, Braund, K. G., Bhatti, S., Tshamala, M., Chiers, K., Schrauwen, E. Sensory neuropathy in two Border collie puppies. J Small Anim Pract 2005;46(6):295-9. 9. Gabriel, A., Poncelet, L., Van Ham, L., Clercx, C., Braund, K. G., Bhatti, S., Detilleux, J., Peeters, D. Laryngeal paralysis-polyneuropathy complex in young related Pyrenean mountain dogs. J Small Anim Pract 2006;47(3):144-9. 10. Vanhaesebrouck, A. E., Couturier, J., Cauzinille, L., Mizisin, A. P., Shelton, G. D., Granger, N. Demyelinating polyneuropathy with focally folded myelin sheaths in a family of Miniature Schnauzer dogs. J Neurol Sci 2008;275(12):100-5. 11. Drögemüller, C., Becker, D., Kessler, B., Kemter, E., Tetens, J., Jurina, K., Jäderlund, K. H., Flagstad, A., Perloski, M., Lindblad-Toh, K., Matiasek, K. A deletion in the N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1) gene in Greyhounds with polyneuropathy. PLoS One 2010;5(6):e11258. 12. Bruun, C. S., Jäderlund, K. H., Berendt, M., Jensen, K. B., Spodsberg, E. H., Gredal, H., Shelton, G. D., Mickelson, J. R., Minor, K. M., Lohi, H., Bjerkås, I.,
VETERINÁŘSTVÍ 9/2013
19.
20.
21.
Stigen, O., Espenes, A., Rohdin, C., Edmund, R., Ohlsson, J., Cizinauskas, S., Leifsson, P. S., Drögemüller, C., Moe, L., Cirera, S., Fredholm, M. A Gly98Val mutation in the N-Myc downstream regulated gene 1 (NDRG1) in Alaskan Malamutes with polyneuropathy. PLoS One 2013;8(2):e54547. Rozen, S., Skaletsky, H. J. Primer3 on the www for general users and for biologist programmers. In: Krawetz, S., Misener, S. Bioinformatics methods and protocols: methods in molecular biology. Totowa NJ, Humana Press, 2000:365-386. Takashima, H. Molecular genetics of inherited neuropathies. Rinsho Shinkeigaku 2006;46(11):760-7. Junqueira, L. C. Tkáň nervová. In: Junqueira, L. C., Carneiro, L., Kelley, R. O. Základy histologie. Jinočany; H&H, 1997:153-183. Faissler, D., Adamo, F., Cauzinille, L., Jaggy, A., Jurina, K. Periférny nervový systém a muskulatúra. In: Jaggy A. Učebnica a atlas neurológie malých zvierat. Bratislava; Pro-Trade, 2009:271-331. Šrenk, P., Flühmann, G., Bergamasco, L., Jaggy, A., Muhle, A. Elektrodiagnostika. In: Jaggy, A. Učebnica a atlas neurológie malých zvierat. Bratislava; Pro-Trade, 2009:154-169. Lee, A. F., Bowen, J. M. Evaluation of motor nerve conduction velocity in the dog. Am J Vet Res 1970;31(8):1361-6. Van Nes, J. J., van den Brom, W. E. Electroneurographic examination of the ulnar and radial nerves in the dog: reference values, biological variation and reproducibility. Res Vet Sci 1986;40(2):189-96. Takakura, Y, Inada, S. Motor nerve conduction velocity of the ulnar and tibial nerves and characteristics of M wave of the interosseous muscles in the adult dog. Nihon Juigaku Zasshi 1983;45(3):413-6. Hájek, I., Dufek, J., Uhlíková, I., Schánilec, P. Electroneurographic examination of the ulnar nerve in the dog: measurements by surface electrodes. In: 88. Fyziologické dny, Hradec Králové; Poster 2012:91.
Adresa autora: MVDr. Ivo Hájek Klinika chorob psů a koček FVL VFU Brno Palackého 1-3 612 42 Brno
inzerce 1/4
655
