PNA ISH Detection Kit Kód K5201 9. vydání
Pro hybridizaci in situ za pomocí PNA sond konjugovaných s fluoresceinem. Kit obsahuje dostatek činidel pro provedení nejméně 40 testů*. * Množství testů je počítáno z použití 25 µL sond a 150 µL ostatních činidel na sklíčko.
(128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 1/10
Obsah Strana Princip metody ......................................................................................................................... 3 Činidla...................................................................................................................................... 3 A.
Poskytnuté materiály................................................................................................... 3
B.
Potřebný materiál, který není součástí dodávky.......................................................... 4
C.
Příprava činidel ........................................................................................................... 4
Upozornění .............................................................................................................................. 5 Uchovávání .............................................................................................................................. 7 Jednodenní postup in situ hybridizace pro deteci RNA pomocí PNA sond.............................. 7 Poznámky k postupu ............................................................................................................... 9
(128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 2/10
Použití In vitro diagnostikum. Sada PNA ISH Detection Kit je určena pro detekci sond peptidové nukleové kyseliny (PNA) konjugovaných s fluoresceinem a hybridizovaných se svou cílovou RNA v buněčných nebo tkáňových preparátech.
Princip metody Tato sada poskytuje uživateli všechna činidla nutná pro provedení hybridizace in situ k detekci buněčné RNA, s výjimkou specifické, PNA sondy konjugované s fluoresceinem. V tkáňových řezech nebo buněčných nátěrech (dodaných uživatelem) je hybridizována sonda peptidové nukleové kyseliny (PNA) konjugovaná s fluoresceinem se svou cílovou RNA podle níže uvedeného postupu. Hybridizace je následována posthybridizačním promytím pomocí roztoku pro důkladné promytí Stringent Wash při teplotě 55 °C po dobu 25 minut. Poté je přidána králičí protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatázou Alkaline PhosphataseConjugated Rabbit F(ab’) Anti-FITC, se kterou je vzorek inkubován po dobu 30 minut, po kterých následuje promytí. Použití F(ab’) fragmentu protilátky zajistí, že je nespecifická vazba na vzorek udržována na minimální úrovni. Dále je přidán substrát (enzymový substrát, BCIP/NBT), se kterým je vzorek inkubován za pokojové teploty po dobu 30-60 minut, po kterých následuje promytí. Volitelné je lehké kontrastní barvení haematoxylinem. V konečné fázi je vzorek montován. Pozitivní barvení je rozeznáno pomocí mikroskopu jako tmavě modré/černé zbarvení na místech hybridizace.
Činidla A. Poskytnuté materiály Lahvička 1 (2 mL) Proteináza K (x 10) 10 x koncentrovaná proteináza K v 50 mmol/L Tris/HCl, 15 mmol/L azidu sodného, pH 7,5. Je velmi důležité uchovávat lahvičku 1 při teplotě 2-8 °C, protože proteináza K se sama rozkládá. Lahvička 2 (0,5 mL) PNA sonda negativní kontroly Negative Control PNA Probe/FITC (k přímému užití) Nahodilé PNA sondy konjugované s fluoresceinem; v hybridizačním roztoku. Obsahuje 30% formamid. Lahvička 3 (0,5 mL) Sonda pozitivní kontroly Positive Control PNA Probe/FITC (k přímému užití) PNA sonda konjugovaná s fluoresceinem, cílená proti glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenáze v hybridizačním roztoku. Obsahuje 30% formamid. Lahvička 4 (25 mL) Roztok pro důkladné promytí Stringent Wash (x 60) 60 x koncentrovaný roztok pro důkladné promytí Stringent Wash. (128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 3/10
Lahvička 5 (6 mL) Protilátka Anti-FITC/AP (k přímému užití) S alkalickou fosfatázou konjugovaná protilátka proti fluoresceinu (afinitně izolované králičí fragmenty F(ab’)). V 50 mmol/L Tris pufru, 5 mmol/L MgCl2, 0,25 mmol/L ZnCl2, 3% BSA, dále obsahuje stabilizátor a konzervační látku, pH 7,5. Lahvička 6 (6 mL) Substrát (k přímému užití) 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát (BCIP) a nitromodř tetrazolia (NBT). V 100 mmol/L Tris, 100 mmol/L NaCl, 50 mmol/L MgCl2, s obsahem konzervační látky, pH 9,0. Obsahuje 1,7% N,N-dimetylformamidu. TBS (Tris pufrovaný fyziologický roztok, pH 7,5) 3 balení ve fólii, každé na 1 L pufru o pH 7,5. Každé balení obsahuje Tris-zásadu 1,4 g ± 4%, Tris/HCl 6,0 g ± 4%. 8,75 g NaCl ± 4%. Rozpusťte obsah každého balení ve fólii v 1 L čisté vody.
B. Potřebný materiál, který není součástí dodávky 1. Všeobecné laboratorní vybavení pro histologické postupy. 2. Vybavení a specifické PNA sondy konjugované s fluoresceinem, nutné pro hybridizační krok. 3. Vodní lázeň nastavená na 55 °C. Pro důkladné promytí je nutná možnost protřepávání. 4. Silanizovaná sklíčka Dako Silanized Slides, kód S3003. 5. Pero Dako Pen, kód S2002 (volitelně). 6. Čistá voda (například Milli-Q voda nebo destilovaná voda). 7. Montovací médium Dako Faramount, kód S3025 nebo Dako Glycergel, kód C0563. C. Příprava činidel
TBS pufr Rozpusťte obsah jednoho balení TBS ve fólii v 1 L čisté vody.
Roztok pro důkladné promytí Stringent Wash Solution (pracovní roztok) Rozřeďte požadované množství roztoku Stringent Wash Solution, lahvička 4, 60krát v čisté vodě a předehřejte jej ve vodní lázni na 55 °C.
Proteináza K (pracovní roztok) Těsně před použitím rozřeďte požadované množství proteinázy K, lahvička 1, v poměru 1:10 pomocí TBS. Ihned po použití uložte lahvičku 1 do teploty 2-8 °C. (viz Poznámky k postupu, 3).
(128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 4/10
Upozornění 1. Pro profesionální uživatele. 2. Lahvičky 2 a 3, kontrolní sondy Positive a Negative Control PNA Probes, obsahují ≥25<50% formamid a ≥1-<3% chlorid sodný. Lahvičky 2 a 3 jsou označeny:
Nebezpečí H319 H360 P201 P202 P281 P280 P264 P308 + P313 P305 + P351 + P338
P337 + P313 P405 P501
Způsobuje vážné podráždění očí. Může poškodit reprodukční schopnost nebo plod v těle matky. Před použitím si obstarejte speciální instrukce. Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny bezpečnostní pokyny a neporozuměli jim. Používejte požadované osobní ochranné prostředky. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc. Skladujte uzamčené. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy.
3. Lahvička 6, Substrát, obsahuje ≥1-<3% N,N-dimetylformamid a ≥1-<3% trometamol a nese označení:
Nebezpečí H360 H373 P201 P202 P280 P260 P314 P308 + P313 P405 P501
Může poškodit reprodukční schopnost nebo plod v těle matky. Požár NEHASTE, dostane-li se k výbušninám. Před použitím si obstarejte speciální instrukce. Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny bezpečnostní pokyny a neporozuměli jim. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. Nevdechujte páry. Necítíte-li se dobře, vyhledejte lékařskou pomoc. PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. Skladujte uzamčené. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy.
4. Balení TBS (Tris pufrovaný fyziologický roztok, pH 7,5) ve fólii obsahuje ≥25-<50% trometamol a ≥25-<50% 2-amino-2-(hydroxy-metyl)propan-1,3-diol hydrochlorid. Balení TBS je označen:
Varování (128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 5/10
H319 H315 H335 P280 P271 P261 P264 P304 + P340 + P312
P302 + P352 + P362-2 + P363 P337 + P313 P405 P501
Způsobuje vážné podráždění očí. Dráždí kůži. Může způsobit podráždění dýchacích cest. Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranné brýle nebo obličejový štít. Používejte ochranný oděv. Používejte pouze venku nebo v dobře větraných prostorách. Zabraňte vdechování par. Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. PŘI VDECHNUTÍ: Přeneste postiženého na čerstvý vzduch a ponechte jej v klidu v poloze usnadňující dýchání. Necítíte-li se dobře, volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. PŘI STYKU S KŮŽÍ: Omyjte velkým množstvím vody a mýdla. Kontaminovaný oděv svlékněte. Kontaminovaný oděv před opětovným použitím vyperte. Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc. Skladujte uzamčené. Obsah a obal zlikvidujte v souladu se všemi místními, regionálními, národními a mezinárodními předpisy.
5. Lahvička 4,roztok Stringent Wash, obsahuje 3,6% Trometamol. V koncentracích obsažených ve výrobku není u Trometamolu nutné označení jako nebezpečný materiál. Bezpečnostní list (SDS) je profesionálním uživatelům k dispozici na požádání. 6. Lahvičky 1, 5, Proteináza K a protilátka Anti-FITC/AP obsahují azid sodný jako konzervační látku. Azid sodný (NaN3) je chemikálie, která je v čistém stavu vysoce toxická. V koncentracích, v nichž se azid sodný nachází v produktu, není klasifikován jako nebezpečný, může však reagovat s olověnými a měděnými armaturami a vytvářet vysoce výbušné koncentrace kovových azidů. Při likvidaci spláchněte velkým množstvím vody, abyste zabránili nahromadění kovových azidů v armaturách. 7. Lahvička 5, protilátka Anti-FITC/AP, obsahuje materiál živočišného původu. Stejně jako u jiných výrobků z biologických zdrojů i zde dodržujte správné postupy zacházení.
(128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 6/10
Uchovávání Činidla tohoto kitu by měla být uchovávána při teplotě 2-8 °C. Lahvičky 2 a 3 by měly být uchovávány v temnu. Nepoužívejte po uplynutí doby expirace uvedené na lahvičce. Jsou-li činidla uchovávána v jiných než uvedených podmínkách, musí je uživatel prověřit. Nestabilita výrobku není signalizována žádnými zřetelnými známkami. Testujte proto současně se vzorky pacientů i pozitivní a negativní kontroly. Pokud dojde k nečekanému zbarvení, které nelze vysvětlit odchylkami v laboratorních postupech, a máte-li podezření na problém s výrobkem, kontaktujte naši Technickou službu. Protože proteináza K se sama degraduje, je velmi důležité lahvičku 1 uchovávat při 2-8 °C a omezit její vystavení pokojové teplotě.
Jednodenní postup in situ hybridizace pro deteci RNA pomocí PNA sond Postup byl vyvinut pro tkáňové řezy fixované ve formalínu a zalité do parafínu. Činidla obsažená v tomto kitu, stejně jako podmínky hybridizace a promývání, byly upraveny pro dosažení optimálních výsledků za použití s fluoresceinem konjugovaných PNA sond Dako. Současně se vzorky by měly být vyšetřovány i pozitivní tkáňové kontroly. POZNÁMKA: Všechny inkubace probíhají za pokojové teploty, pokud není uvedeno jinak.
(128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 7/10
Rehydratace
Ponořte sklíčka s tkáňovými řezy do xylenu
2 x 5 min
Ponořte je do 99% etanolu
2 x 3 min
Ponořte je do 96% etanolu
2 x 3 min
Ponořte je do čisté vody. Nádoba nesmí obsahovat RNázu (viz Poznámky k postupu, 1)
3 min
Obkružte vzorek perem Dako Pen, kód S2002 Ponořte jej do čisté vody Předběžná úprava
2 x 3 min
Umístěte sklíčka do vlhké komůrky (použijte čisté rukavice) Těsně před použitím rozřeďte potřebné množství proteinázy K, lahvička 1, 1:10 v TBS, například přidáním 11 kapek z lahvičky 1 (nebo 500 µL) k 4,5 mL TBS (viz Poznámky k postupu, 2) Ke každému řezu přidejte 150 µL ředěné proteinázy K (viz Poznámky k postupu, 3). Ihned po použití uložte lahvičku 1 do teploty 2-8 °C.
Hybridizace
Inkubujte
20-30 min
Ponořte sklíčka do čisté vody
2 x 3 min
Ponořte sklíčka do 96% etanolu
~ 10 s
Osušte sklíčka na vzduchu
~ 5 min
Přidejte k tkáňovému řezu 1-2 kapky PNA sondy konjugované s fluoresceinem. Na zvláštní řezy přidejte kontrolní sondy, lahvičky 2 a 3. Překryjte řezy krycími sklíčky Umístěte sklíčka do vlhké komůrky (abyste zabránili vyschnutí řezů) Umístěte vlhkou komůrku do inkubátoru (viz Poznámky k postupu, 4)
Důkladné promytí
11 h při 55 °C
Předehřejte roztok pro důkladné promytí Stringent Wash o pracovní koncentraci (lahvička 4 ředěná 1:60) na 55 °C ve vodní lázni Odstraňte krycí sklíčka
Detekce
Ponořte sklíčka do předehřátého pracovního roztoku pro důkladné promytí Stringent Wash
25 min při 55 °C za protřepávání
Uveďte sklíčka do pokojové teploty krátkým ponořením do TBS
10 s
Umístěte sklíčka do vlhké komůrky Přidejte 2-3 kapky protilátky Anti-FITC/AP, lahvička 5, ke každému řezu Inkubujte
30 min
Odklepejte protilátku Ponořte sklíčka do TBS
2 x 3 min
Ponořte sklíčka do čisté vody
2 x 1 min
Umístěte sklíčka do vlhké komůrky Přidejte 2-5 kapek substrátu, lahvička 6, ke každému řezu (viz Poznámky k postupu, 5) Inkubujte
30-60 min
Odklepejte substrát Ponořte sklíčka do vody z vodovodu
(128677-001)
5 min
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 8/10
Kontrastní barvení a montování
Pokud je to žádoucí, proveďte kontrastní barvení hematoxylinem
5-10 s
Montujte pomocí činidla Dako Faramount, kód S3025, nebo Glycergel, kód C0563
Poznámky k postupu 1. Od tohoto kroku až do dokončení hybridizace je důležité zabránit kontaminaci řezů RNázami a se sklíčky manipulovat pouze v čistých rukavicích na jedno použití. Laboratorní sklo může být zbaveno RNáz celonoční inkubací při teplotě 200 °C. Další metody inaktivace RNáz v roztocích jsou popsány v publikaci autorů Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (viz také oddíl Upozornění). 2. Rozpusťte obsah jednoho balení TBS ve fólii v 1 L čisté vody (bez RNáz). 3. Protože proteináza K se sama degraduje, je velmi důležité lahvičku 1 uchovávat při 2-8 °C a omezit vystavování pokojové teplot ě. Optimální proteolytické štěpení se může u jednotlivých tkáňových bločků lišit. Pro zmrazené řezy a cytospiny by proteináza K měla být naředěna více než 1:10; jako vodítko pro ředění použijte 1:100-1:1000 v závislosti na fixaci. 4. Zjistili jsme, že inkubační doba 11 hodin poskytuje optimální citlivost, avšak uspokojivých výsledků může být dosaženo snížením inkubační doby na 15-30 minut v závislosti na množství cílové RNA přítomné ve vzorku. 5. Zjistili jsme, že substrát Substrate (BCIP/NBT), který je součástí kitu PNA ISH Detection Kit, poskytuje citlivost nejvyšší, ale také činidlo Dako New Fuchsin (kód K0625) dává velmi uspokojivé výsledky. 6. Lahvičku 6 před použitím neprotřepávejte. Substrát občas tvoří precipitát, který, pokud je roztok protřepán, může ovlivnit výsledky barvení.
(128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 9/10
Vysv ětlení sy mbolů
Katal og ové čísl o
Te plota sklado ván í
Čísl o šarže
Výrobce
In vitro di agn ostický zdr avotni cký p rostřede k
Chra ňte pře d slune čním záře ním (viz čá st Skla dová ní)
Přidejte vo du
Piktogra m GHS (viz část o be zp ečno stn ích opa tře ních)
Vi z n ávod k po užití
Lze p oužít pr o te stů
Pou žitel né do
Piktogra m GHS (viz část o be zp ečno stn ích opa tře ních)
Výrobce: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dánsko Tel. +45 44 85 95 00 Fax +45 44 85 95 95
(128677-001)
P04101CZ_01_K520111-2/2015.08 str. 10/10
