Příušnice – strategie laboratorní diagnostiky u vysoce proočkované populace Radomíra Limberková F.Sedláček, J.Poustková, O.Hégrová, M.G.Schreinerová, J.Trmal
VIII. Hradecké vakcinologické dny 4. - 6.10.2012
Laboratorní průkaz onemocnění příušnicemi vyhl.473/2008 o systému epidemiologické bdělosti pro vybrané infekce ve znění vyhlášky č.233/2011; příl. č.14 Systém epidemiologické bdělosti příušnic; čl.2 - Laboratorní diagnostika
1. Přímý průkaz nevakcinálního kmene viru příušnic izolací z klinického vzorku odebraného v akutní fázi onemocnění 2. Detekce nukleové kyseliny nevakcinálního kmene viru příušnic izolací z klinického vzorku odebraného v akutní fázi onemocnění 3. Detekce IgM protilátek proti viru příušnic u osob, které nebyly v posledních 6 týdnech očkovány 4. Průkaz sérokonverze nebo výrazného, několikanásobného vzestupu hladiny specifických parotitických IgG protilátek vyšetřením dvojice vzorků sér nebo slin osob, které nebyly v posledních 6 týdnech očkovány 5. Průkaz vzrůstu hladin již existujících parotitických IgG protilátek u reinfekcí 6. Detekce antigenu nevakcinálního kmene viru příušnic (DFA) pomocí specifických parotitických monoklonálních protilátek v klinickém vzorku, odebraném v akutní fázi onemocnění Ke správné interpretaci laboratorních výsledků je třeba brát v úvahu též klinické a epidemiologické údaje včetně statusu očkování.
Doporučení WHO WHO doporučuje provádění molekulárně epidemiologických studií zahrnujících genotypizaci recentních příušnicových kmenů jako součást programu surveillance. Detailní monitoring by mohl pomoci objasnit vzorce cirkulace viru, jeho evoluci a rovněž by mohl napomoci k vytvoření strategie kontroly nad vznikajícími epidemiemi. Pro detailní monitoring ovšem v ČR chybí legislativní opora, neboť na rozdíl od spalniček a zarděnek, pro příušnice není vyhláškou stanovena povinnost zasílání izolátů z klinických vzorků do NRL k dalšímu určování.
Současná praxe v laboratorní diagnostice příušnic 1. sérologie - běžně zasílanými klinickými vzorky jsou diagnosticky méně vhodná akutní séra, jejichž vyšetřením obvykle získáme problematicky interpretovatelná data a pro definitivní diagnostický závěr je nutné provést vyšetření párového vzorku séra, čímž je laboratorní závěr oddálen 2. vhodnější možnost přímého průkazu infekčního agens není zatím využívána, ačkoli se jedná o neinvazivní způsob odběru s výhodou rychlého diagnostického závěru (RT-PCR)
Vhodné vzorky pro přímý průkaz - Stěr z bukální sliznice, sliny nejpozději do 9.dne od začátku klinických příznaků (ideálně do 3.-4.dne)
- Moč nejpozději do 9.dne od začátku klinických příznaků (ideálně do 4.dne) méně vhodná (náročnější ke zpracování, cytotoxická na tkáňové kultury) http://www.szu.cz/tema/prevence/priusnice Příušnice: příručka pro odběr, skladování a transport klinického materiálu
- Likvor parotitická meningitida
Skladování a transport vzorků Bukálně – orální stěry, sliny, moč do 24 hodin od odběru při teplotě +4°C dlouhodobě při teplotě -70°C, při přepravě nesmí rozmrznout (suchý led) Sérum do týdne od odběru při teplotě +4°C dlouhodobě při teplotě -20°C
Nejvhodnější klinické vzorky • Ideální sestava zaslaného klinického materiálu: - vzorek pro přímý průkaz + párové sérum • Reálná sestava klinického materiálu - vhodná pro zjištění primárního či sekundárního selhání vakcinace u vzorků s prokázanou přítomností viru příušnic (PCR, TK) - vzorek pro přímý průkaz + akutní sérum
Sérologický průkaz primárního či sekundárního selhání vakcinace vyšetřením akutního vzorku séra u pacientů s pozitivním záchytem viru příušnic RRL RKI, Berlín
primární selhání vakcinace (= primoinfekce)
sekundární selhání vakcinace (= reinfekce)
IgM pozitivní IgG negativní,hraniční, pozitivní
IgM negativní IgG pozitivní, rychle se zvyšující
Specifika diagnostiky vakcinovaných FALEŠNĚ NEGATIVNÍ NÁLEZY U VAKCINOVANÝCH OSOB: • v akutním séru často nejsou detekovatelné IgM protilátky (až u 30%) • u párových sér často nedochází k očekávanému signifikantnímu vzestupu titru protilátek ani sérokonverzi v párových sérech • vakcinovaní vylučují méně viru a po kratší dobu, protože IgG protilátky stoupají v akutní fázi často velmi rychle (nutnost časného odběru – nejlépe do 3.dne)
80% nemocných v ČR patří mezi vakcinované osoby Nespolehlivá sérologie - jednoznačným průkazem probíhající infekce je
izolace viru či průkaz virové RNA
Diagnostické metody NRL PŘÍMÝ PRŮKAZ VIRU: 1. Izolace na tkáňových kulturách
Vero
2. RT-PCR
Mumps Virus RT-PCR kit, Shanghai ZJ, BioTech
SÉROLOGIE:
1. ELISA Enzygnost Anti-ParotitisVirus/IgM, Siemens Enzygnost Anti-ParotitisVirus/IgG, Siemens 2. Hemaglutinačně inhibiční test (HIT) 3. Virus neutralizační test (VNT)
Vzorky k přímému průkazu viru příušnic únor-květen 2012 - 27 stěrů z bukální sliznice zejména od ambulantních pacientů infekčních klinik z regionů se zvýšeným výskytem onemocnění (5 z nich nebylo validních – nestandardní odběr a nevhodné dlouhodobé skladování - 40 dní při +8°C) - odebrané převážně v počátku klinické manifestace onemocnění (do 4.dne od začátku onemocnění) - časnost odběru (nejlépe do 3.dne) je pro záchyt viru nezbytná zejména u vakcinovaných
Růstové vlastnosti příušnicových kmenů izolovaných v roce 2012 Virus má velmi dobré růstové vlastnosti: - cytopatický efekt obvykle již od 3.dne 1.pasáže - i z PCR negativního vzorku se podařilo izolovat virus - izolace viru i ze vzorku, který byl 40 dní uchovaný v lednici a nestandardně odebrán matka této pacientky (1968) hospitalizace - mening., pankreatitis dvě vakcinované sestry - 1993 neonemocněla, 2003 onemocněla
pozitivní záchyty kmenů příušnic (izolace, PCR) 16/27 59,25% resp. 15/22 68,18% (pouze validní vzorky)
Přímý průkaz viru-vyšetřovací schéma pozitivita 13x
identifikace (RT-PCR, IHAd, HIT)
Izolační pokus 27 stěrů
negativita, bakt.kontam, atyp.CPE 5x
6x
3 x HSV-1
RT-PCR pozitivita negativita 3x (2x BK, 1x CPE HSV-1)
Výsledky izolace na buňkách Vero Místo
Počet vzorků
TK +
TK -
BK
HSV
Genotypizace
Karlovy Vary
6
2
1
0
3
2
Pardubice
12
8
0
4
0
7
Teplice
2
1
0
1
0
1
Praha 5
1
1
0
0
0
1
Praha 10
5
1
4
0
0
1
Liberec
1
0
0
1
0
celkem
27
13
5
6 2x PCR +
3 1xPCR +
12
Genom viru příušnic - jednovláknitá nesegmentovaná RNA negativní polarity - 15 384 nukleotidů - 7 genů pro následujících 7 proteinů genomové mapy: core proteiny: 1. nukleokapsidový (NP) 2. phosphoprotein (P) – V a I 3. membránový – matrix (M) 4. large (L) povrchové glykoproteiny: 5. fúzní (F) 6. hemaglutinin-neuraminidáza (HN) nejvariabilnější s neobjasněnou funkcí: 7. small hydrophobic (SH)
SH protein • na základě sekvenční analýzy genu SH proteinu (nejvariabilnější části genomu viru příušnic) se kmeny viru příušnic dělí na jednotlivé genotypy • v současnosti je známo třináct genotypů: A-M • v rámci daného genotypu existují varianty
• genotypy C, D, E, G, H - západní polokoule B, F, I - Asie • genotypy C, D, G, H, I, J jsou považovány za neuropatogenní – genetický základ neurovirulence není zatím objasněn • v určitém geografickém regionu může současně cirkulovat více genotypů, např. 2000 Španělsko: genotyp H – hromadný výskyt genotyp D – sporadické případy
Kmeny viru příušnic zaslané ke genotypizaci do RRL RKI Označení NRL
Místo odběru
Označení RRL
Rok narození
Vakcinační status
MuVi-CZE12-56
Karlovy Vary
12-0085
1991
2 dávky
MuVi-CZE12-59
Karlovy Vary
12-0086
1996
2 dávky
MuVi-CZE12-72
Pardubice
12-0087
1991
MuVi-CZE12-73
Pardubice
12-0088
1993
neznámo neznámo 2 dávky
MuVi-CZE12-77
Pardubice
12-0089
1993
2 dávky
MuVi-CZE12-80
Pardubice
12-0090
1988
2 dávky
MuVi-CZE12-81
Pardubice
12-0091
1992
2 dávky
MuVi-CZE12-86
Pardubice
12-0092
1981 1981
nevakcinován
MuVi-CZE12-89
Pardubice
12-0093
1994
2 dávky
MuVi-CZE12-116
Teplice
12-0238
2004
2 dávky
MuVi-CZE12-131
Praha 10
12-0239
1993
2 dávky
MuVi-CZE12-152
Praha 5
12-0240
1993
2 dávky
Výsledky genotypizace z RRL RKI • ze všech 12 zaslaných kmenů (2 KV, 7 PA, 2 Pha,1 TE) byla úspěšně extrahována MuV RNA a následně byla provedena sekvenace 316 nukleotidů genu SH proteinu • všechny izolované kmeny viru příušnic v ČR - genotyp G • genotypizované kmeny z daných regionů se liší: jedním nukleotidem: varianta Karlovy Vary ( shodné s Prahou 10) varianta Pardubice (shodné s Prahou 5) jedním nukleotidem od varianty Pardubice a dvěma nukleotidy od varianty Karlovy Vary: varianta Teplice
Sekvence nukleotidů reprezentující jednotlivé varianty genotypu G >MuVi-CZE-12-56-00085-Karlovy Vary •
AAGAATGAATCTCATGGGGTCGTAACGTCTCGTGACCCTGCCGTTGCACTATGC CGGCGATCCAACCCCCATTATACCTCACATTTCTATTGCTAATTCTTCTTTATCTG ATCATAACTTTGTATGTCTGGATTATATTAACTGTTACTTATAAGACTGCGGTGCG ACATGCAGCACTGTACCAGAGATCCTTCTCTCACTGGAGTTTCGATCACTCACTC TAAGAAGATCCCCAGTTAGGACAAGTCCCGATCCATCATGCAAGAACAATCTGC ATTTGAATAATGCCGTTCAATCATGAGACATAAAGAAAAAA
>MuVi-CZE-12-72-00087-Pardubice •
AAGAATGAATCTCATGGGGTCGTAACGTCTCGTGACCCTGCCGTTGCACTATGC CGGCGATCCAACCCCCATTATACCTCACATTTCTATTGCTAATTCTTCTTTATCTG ATCATAACTTTGTATGTCTGGATTATATTAACTGTTACTTATAAGACTGCGGTGCG ACATGCAGCACTGTACCAGAGATCCTTCTTTCACTGGAGTTTCGATCACTCACTC TAAGAAGATCCCCAGTTAGGACAAGTCCCGATCCATCATGCAAGAACAATCTGC ATTTGAATAATGCCGTTCAATCATGAGACATAAAGAAAAAA
>MuVi-CZE-12-116-00238-Teplice •
AAGAATGAATCTCATGGGGTCGTAACGTCTCGTGACCCTGCCGTTGCACTATGC CGGCGATCCAACCCCCATTATACCTCACATTTCTATTGCTAATTCTTCTTTATCTG ATCATAACTTTGTATGTCTGGATTATATTAACTGTTACTTATAAGACTGCGGTGCG ACATGCAGCACTGTACCAGGGATCCTTCTTTCACTGGAGTTTCGATCACTCACTC TAAGAAGATCCCCAGTTAGGACAAGTCCCGATCCATCATGCAAGAACAATCTGC ATTTGAATAATGCCGTTCAATCATGAGACATAAAGAAAAAA
Distribuce hlášených genotypů, 2005 – 2011 (údaje k dubnu 2012) G
C H
J
B C D
J
F
D
G
G
H I
G D,C,H
J
H
K
Výskyt genotypu G • • • •
2004/05 2005/06 2006 2007/08
UK ČR USA Kanada (současně i genotyp D)
• 2008/09
Makedonie (6% komplikací: 39% orchitid, 4,7% meningitid)
• 2009
Nizozemí (16% komplikací: 20% orchitid, 4% meningitid)
• 2010
Bavorsko (většina komplikací-orchitidy)
• 2010/11
Skotsko
• 2012
ČR (10,9 % komplikací-očkovaní v 8%, neočkovaní 27%; orchitida 6% očkovaných a 21% neočkovaných; meningitis 1,2% očkovaných a 4% neočkovaných)
Genotypy a účinnost vakcinace - ve vakcíně je obsažen příušnicový kmen Jeryl Lynn (genotyp A), který je fylogeneticky odlišný od cirkulujících genotypů - největší antigenní rozdílnost je mezi genotypy AxB-D AxG-I - výsledkem je nekompletní zkřížená neutralizace
Přesto zatím nejsou jednoznačné důkazy o tom, že by genotypová neshoda současných kmenů vedla k selhávání vakcinace či že by byla epidemiologicky významná. Účinnost vakcinace ve vztahu ke genotypu, ale i možnost přispění vyvanutí imunity ke zvýšenému výskytu onemocnění, jsou široce řešenou stále otevřenou otázkou.
Genotypy a účinnost vakcinace Mumps virus neutralizing antibodies do not protect against reinfection with a heterologous mumps virus genotype; Johan Nojd a kol.; Vaccine 19 (2001) 1727-1731
- vakcinací JL (1996) nedošlo k vytvoření průkazných VN Ab proti genotypu A - v séru jen VN Ab proti genotypu D (onemocnění v dětství– souběh cirkulace A a D genotypu ve Švédsku 1970-1985) - VN Ab proti genotypu D neochránily před chronickým onemocněním genotypem A (V-X /1999) - až v II /2000 prokazatelné VN Ab proti A X Antibody Induced by Immunization with the Jeryl Lynn Mumps Vaccine Strain Effectively Neutralizes a Heterologous Wild-Type Mumps Virus Associated with a Large Outbreak; S.A. Rubin a kol.; J Infect Dis. (2008); 198 (4): 508-515
- geometrický průměr titrů VN Ab proti genotypu G byl asi o polovinu nižší než proti genotypu A; - titry VN Ab proti oběma genotypům s časovým odstupem od vakcinace klesaly (10 let po 2.dávce na úroveň titrů před její aplikací); - protilátky indukované vakcinací efektivně neutralizovaly virus genotypu G u všech 88 osob X Long-Term Persistence of Mumps Antibody after Receipt of 2 Measles-Mumps-Rubella (MMR) Vaccinations and Antibody Response after a Third MMR Vaccination among a University Population A. A. Date a kol.; J Infect Dis.(2008); 197:1662-8
- EIA IgG+ 94% (ze 440 osob); 28 osob IgG- ; 19 IgG- dostalo 3. dávku vakcíny - 1 osoba nadále EIA IgG- (průkaz reakce paměťových B buněk – nešlo o primární selhání vakcinace) - VN Ab proti genotypu A u 91 EIA pozitivních osob, titr 1:4 vakcinovaní < 1 - 5 lety 95% vakcinovaní > 15 lety 58%
Současné cíle NRL - zkvalitnění laboratorní diagnostiky onemocnění opřené především o přímý průkaz agens (izolace viru, PCR) jako jednoznačného průkazu probíhající infekce - vyšetřování dalšími sérologickými metodami (HIT, VNT), neboť doposud rutinně uplatňované sérologické vyšetření metodou ELISA (IgG/IgM) neposkytne vždy jednoznačný diagnostický závěr - získání komplexních informací o cirkulujících kmenech na území ČR a sérologické odpovědi nemocných, neboť vzhledem k rozdílnosti neutralizačních epitopů u různých genotypů nelze vyloučit, že imunita zajišťovaná virem určitého genotypu nebude stejně účinná proti kmenům jiných genotypů
Závěr Nemocnými jsou převážně vakcinovaní mladí dospělí jedinci s delším časovým odstupem od aplikace vakcíny (kolem 15 let), poměrně častý je i výskyt komplikací, zejména pak orchitidy a meningitidy. Specifika laboratorní diagnostiky vakcinovaných osob vede k nutnosti změny vyšetřovací strategie zaměřené více na přímý průkaz infekčního agens. Monitorování genotypové distribuce příušnicových kmenů a genotypově specifické imunity populace je ve vakcinální éře, vzhledem ke kontinuální evoluci viru a tlaku na výběr vakcíny, nezbytné.
Poděkování všem spolupracujícím infekčním klinikám a příslušným hygienickým stanicím
