Přírodovědecká fakulta Univerzity J.E. Purkyně
Katedra biologie 5. 2. 2015
Obecná zoologie Společné morfologické a funkční vlastnosti živočichů Buněčná, tkáňová a orgánová stavba těla Morfologie, chemoarchitektonika a funkce živočišných buněk a tkání Rozmnožování a časný vývoj organizmu. Principy cytologických metod Pro denní a kombinované bakalářské studium biologie Pracovní verze. Sledujte datum v záhlaví Obrazové doplňky viz Příloha skript a přednáškové prezentace Moodle (www.ujep.cz/výuka
……aneb v čem a proč jsou si všichni živočichové podobni
Doc. Dr. Vladislav Mareš, DrSc Přírodovědecká fakulta UJEP Univerzita J.E. Purkyně Za Válcovnou 8 41001 Ústí nad Labem
Fyziologický ústav AV ČR Odd. růstu a diferenciace buněk Laboratoř Biologie nádorové buňky FgU a 1.LF KU Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4
[email protected]
Ústí nad Labem 2015
Obsah Co, proč a jak přemět OZ studovat?
………………………….. ……. 2-4
1 SPOLEČNÉ VLASTNOSTI ŽIVOČICHŮ …………………..…………………………. 5- 28 1.1 Chemické složení (prvky, molekuly, molekulární komplexy) 1.2 Stavba těla (prostorová orientace, anatomie a hierarchie stavby těla) 1.3 Funkční vlastnosti (vnitřní prostředí organizmu, toky látek, energie a informací, pohyb, obrané, adaptační a reparační reakce, rozmnožování, chování, organizovanost v čase)
1.4 Třídění živočichů- Taxonomie
2 BUŇKA JAKO MORFOLOGICKÁ A FUNKČNÍ JEDNOTKA/MODUL ORGANIZMU ……….. 28-65 2.1 Nástin fylogeneze eukaryotní buňky 2.3 Organely endomembránového systému a mitochondrie 2.4 Cytoskelet 2.5 Jádro a jadérko 2.6 Cytosol a inkluse 3 KOMPLEXNÍ BUNĚČNÉ FUNKCE ……………………….. 66-99 3.1 Transport látek mezi buňkami a okolím. Klidový membránový potenciál 3.2 Přeměna látek a energie (metabolismus) 3.3 Transkripce DNA a syntéza bílkovin 3.4 Buněčné a molekulární mechanismy příjmu informací 3.5 Buněčný cyklus a jeho regulace 3.6 Diferenciace buněk, Význam a mechanizmy. . 4 ADAPTACE, REPARACE A REGENERACE 4.1 4.2 4.3 4.4
BUNĚK, TKÁNÍ A ORGÁNŮ …………………
99-106
Hlavní škodliviny a mechanizmy jejich působení Obranné a reparační reakce Regenerace buněk, tkání a orgánů. Kmenové buňky Buněčná smrt, její formy, mechanizmy a význam
5 ORGANIZACE BUNĚK DO TKÁNÍ. ZÁKLADNÍ TYPY ŽIVOČIŠNÝCH TKÁNÍ …………….107-124 5.1 Buňky a extracelulární matrix.. 5.2. Základní typy živočišných tkání, jejich charakteristiky a výskyt 6 ROZMNOŽOVÁNÍ ŽIVOČICHŮ …………………………………………… 6.1 Nepohlavní rozmnožování 6.2 Pohlavní rozmnožování 6.3 Blastogeneze 6.4 Genetické aspekty rozmnožování živočichů 7 PRINCIPY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ A
BIOTECHNOLOGICKÝCH METOD ……………
125-138
139-141
8 METODY, PŘÍSTROJE A ZAŘÍZENÍ POUŽÍVANÉ KE STUDIU BUNĚK A TKÁNÍ ………… 142-150 8.1 Světelná mikroskopie (SM) 8.2. Elektronová mikroskopie (EM) 8.3 Doplňková zařízení ke SM a EM 8.4 Další speciální zařízení 8.5 Příprava mikroskopických preparátů a jejich přehledná barvení 8.6 Principy speciálních histochemických a cytochemických metod 9 PROCVIČOVACÍ ÚLOHY …………… ………………………………. 151-163 10 Doporučená literatura a Příloha ……………………… ………………... 163-169 Obrazová příloha skript a přednáškové prezentace (viz Moodle KBI UJEP)
2
O čem to bude a jak na to? Obecná zoologie je věda zabývající se společnými vlastnostmi živočichů. Tyto Informace jsou dostupné v mnoha učebnicích a monografiích různého rozsahu a síťových databazích (viz Doporučená literatura). Předkládaná skripta podávají výběr informací v rozsahu úměrném jedno semestrálnímu kurzu v 1. ročníku studia biologie na PřF UJEP a potřebám znalostí pro pozdější bakalářské kurzy, fyziologie, zoologie, molekulární biologie, etologie apod.. Obrazové doplňky jsou na Moodle www.ujep.cz. Těžiště kurzu je v hierarchii stavby a funkce těla, především na buněčné a tkáňové úrovni.struktur. Samostatná kapitola je věnovaná základům rozmnožování živočichů, základům biotechnologických metod a zařízením a metodám používaným pro studium buněk a tkání.
Jak studovat? Rozpomenout se na středoškolské učivo a obsah kurzu Úvod do studia biologie (Dr. Ipser, CSc), Chemie a fyzika živých soustav (Dr. Benada, CSc) a Mikroskopické metody (Mgr. Drbalová). Do textových kapitol ve vytištěné podobě si vkládejte poznámky a vybrané snímky z přednáškových prezentací a jiných zdrojů tak, abyste v konečné fázi přípravy na zkoušku, vč. SZZ, pracovali již s jedním hlavním zdrojem. Upřednostňujte jednoduché „liniové“, černobílé kresby. Doporučuji jejich aktivní, tj. vlastní rukou prováděnou a ev. I modifikovanou reprodukci. Vše ukládejte „do hlavy“ a ne pouze „do PC, tašky,kapsy“ a pod .
Na konci skript jsou odkazy na podrobnější studijní materiály a procvičovací otázky a náměty k úvahám, konstruované podle požadavků při zkoušce. Tvořte i vlastní otázky a náměty k úvahám. Je to dobrý způsob sebekontroly studia. Úvahovými náměty procvičíte schopnost kombinace dílčích znalostí a hledání kauzálních vztahů. Přiložené otázky však nepředstavují jejich úplný seznam pro zkoušku. Mnoho informací lze nalézt na Internetu dle klíčových slov nebo hypertextových odkazů na konci skript. Pozor, na rozdíl od recenzovaných učebnic, internetové informace však nemusí být vždy úplné, či dokonce správné, neboť nepodléhají vždy odbornému dohledu. Doporučuji též sledovat ostatní studijní materiály na webových stránkách Katedry biologie PřF UJEP. Na konci některých kapitol jsou zmíněny poruchy buněčných funkcí a jejich dopad na zdraví člověka. Slouží pouze k upoutání zájmu o fyziologické funkce. Více ve výběrovém kurzu Patobiologie živočišných buněk a tkání. Všechny informace lze najít ad hoc v tištěné či elektronické literatuře. Určitá "pohotovostní databáze" v hlavě je pro studium dalších předmětů, i příp. pozdější tvůrčí práci, NEZBYTNÁ. To se neobejde bez jistého memorizačního úsilí, které lze usnadnit řazením poznatků do funkčních souvislostí.
Knowledge is of two kinds. We know the subject ourselves, or we know where we can find the information about Dr Samuel Johnson (1709-1784).Něco je však třeba mít pohotově v hlavě. Jinak ztratite zbytečně mnoho cenného času hledáním základních informací v knihovnách či na sítích místo tvůrčí práce (V. Mareš 2007) Pro dobře připravené posluchače ze SŠ a předchozích kurzů budou možná některé kapitoly skript triviální. Více naleznete v doporučených zdrojích. Budu rád, když takových studentů bude více než doposud. VM
3
CO JE VĚDA
A TZV. VĚDECKÝ POSTUP (SCIENTIFIC METHOD)?
Věda je trvale se vyvíjející soubor objektivních a utříděných poznatků o přírodě a vesmíru. Prvním krokem vědeckého poznávání je popis přírodních objektů a jevů pomocí definovaných kriterií. Následuje hledání vztahů mezi popisovanými objekty a jevy, především s hlediska jejich příčin a následků (kauzality). Předpokládaný možný vztah mezi nimi vede k vyslovení hypotézy (domněnky). Hypotéza deduktivní pracuje s hledáním podobnosti mezi dosud známým a nově zjištěným jevem, či objektem. Výsledkem je např. taxonomické zařazení nového organizmu na základě podobnosti morfologických znaků, genetické informace apod. , s ostatními jedinci v daném taxonu. Hypotéza induktivní navrhuje příčinný vztah mezi jevy. Deduktivní hypotéza se ověřuje opakovaným a upřesňovaným pozorováním a popisem objektu či jevu. Induktivní hypotéza se zpravidla ověřuje pokusem, ve kterém se sleduje vzájemná závislost studovaných jevů (např. hmotnosti těla živočichů na množství, či složení potravy, vztah mezi vybraným agens (např. virem, bakterií, toxinem, vyřazením genu a..) a funkční změnou či chorobou. Uvedená klasifikace hypotéz je výhodná i didakticky. Předpokládané vztahy mezi jevy, vyjádřené kvalifikovanou hypotézou se zpravidla ověřují pokusem, ve kterém se cíleně sleduje vzájemná závislost studovaných jevů, např. vliv množství či složení potravy, nebo exprese některého genu a pod na hmotnost těla, vybrané definované funkce apod.. Výsledky pokusů mají být vždy zhodnoceny statisticky, tj. stanovit jaká je pravděpodobnost jejich nálezu v opakovaném, nezávislém pokusu. Viz kurz statisticky . Na základě ověřené hypotézy je formulován závěr. Ze závěrů se vytváří sjednocující teorie, shrnující poznatky širšího významu (viz níže tzv. hlavní biologické teorie).
Pokus má zahrnout pouze jednu záměrně proměnnou hodnotu/faktor. Všechny ostatní podmínky mají zůstávat neměnné. Vztah/závislost mezi měněnou a závislou sledovanou kvantifikovatelnou hodnotou je vhodné vyjádřit graficky, funkcí, či jinou formu (sloupky, koláč, boxy atp.).Výsledky mají být opakovatelné (reprodukovatelné) v nezávislém, dalším a stejném pokusu a mají být zhodnoceny matematicky/statisticky. Zvláštním kriteriem vědeckosti hypotézy je její tzv. falzifikovatelnost (možnost vyvrácení, K. R. Popper) tj. vědecká hypotéza vyvratitelná novým pozorováním, nebo pokusem (pozor- neznamená to, že musí vyvrácená). Vylučuje se tím z vědecké sféry zkoumání „empiricky nepodchytitelných“ (tj. nadpřirozených) jevů.
Získané výsledky mají být zveřejněny přednáškou nebo plakátovou prezentací (poster) na odborné konferenci a co nejpodrobněji tiskem v odborném časopise, knize atp. Zveřejnění má předcházet posouzení odborné i formální stránky rukopisu nezávislým odborníkem, tzv. recenzí, peer review (nezaměňovat s „PR“ tj. Public Relations). Science is Measurement (Henry Stacy Marks,
1829-1898)
No investigation can be called true science without passing through mathematical tests. Leonardo da Vinci 1452-1519 Pro přírodní vědy to platí dodnes (VM, 2013)
Vědecké posnatky o živé přírodě byly koncem 19. a v polovině 20. století shrnuty do 5 tzv. základních biologických teorií, které jsou trvale ověřovány a rozvíjeny: Teorie (1) buněčné (2) biogenetické (3) genetické (4)homeostatické a (5) vývojové. Ad 1: J.E. Purkyně 1837/ 8, M. Schleiden 1838, T. Schwann 1838: „Všechny organizmy se skládají z buněk“. Ad2: L. Pasteur 1865: „Vše živé z živého“ a R. Virchow 1858 „ Omne cellula e cellula“, „každá buňka z buňky“. Ad 3: G.Mendel 1866, O. Avery a spol. 1944, J. Watson a F. Crick 1953: Organizmy mají genetickou paměť, která je obsažena v DNA. Ad 4: C. Bernard 1851: „Organizmy udržují stále složení svého vnitřního prostředí“. Ad 5: Ch. Darwin 1858 "Živé organizmy se vyvíjejí od jednodušších ke složitějším". Purkyňovo „ Omne vivo ex ovo“ (vše živé z vejce), uvedené na jeho náhrobku na Vyšehradském hřbitově v Praze, předznamenalo biogenetickou a genetickou teorii.
4
1 SPOLEČNÉ ZNAKY A VLASTNOSTI ŽIVOČICHŮ „Kilogram kamene a kilogram mozku obsahuje stejný počet kvarků a elektronů. Rozdíl je pouze v jejich uspořádání“. J. Kleczek, Pohled do vesmíru, 1998 „… do atomů, molekul, organel, buněk, tkání a orgánů, a to hierarchicky, účelně a vysoce diverzifikovaně“. VM Obecná zoologie je vědní oblast biologie zabývající se společnými strukturálními (anatomie a mikroskopická stavba těla) a funkčními vlastnostmi živočichů. Živočišné organizmy se vyznačují: : (1) Definovaným prostorovým uspořádáním těla (ohraničenost od okolí, tělní osy a roviny) (2) Více/mnoho buněčností s hierarchicky uspořádaností (molekuly—>buňky--> tkáně—>orgány--> orgánové soustavy) (3) Vnitřním prostředím organizmu a jeho homeostázou . (4) Heterotrofií (5) Látkovým a energetickým metabolizmem (toky látek a energie) (6) Příjmem a zpracováním informací (toky informací) (7) Adpatabilitou na změny vnitnřího a zevního prostředí (8) Pohybem těla a jeho částí (9) Schopností reparovat poškození a event. regenerovat poškozené částí těla (10) Organizovaností v čase (vznik-zánik jedince, fylo—a ontogenetický vývoj, adaptabilita, funkční periodicita) (11) Rozmnožováním a genetickou pamětí
1.1 Chemické složení živočišných organizmů (Opakování učiva SŠ a kurzu Chemie a fyzika živých soustav)
1. 1 1 Anorganické látky (biogenní prvky a anorganické sloučeniny) 1. 1. 2 Organické molekuly jednoduché a složené A. Sacharidy B. Lipidy C. Aminokyseliny D Peptidy a proteiny (bílkoviny) E. N-base, nukleozidy, nukleotidy a nukleové kyseliny
Vzpomínky na SŠ ?! viz níže
1.1.1 ANORGANICKÉ LÁTKY (biogenní prvky a jejich anorganické sloučeniny Nejvíce zastoupenými prvky jsou v živočišném organizmu uhlík, vodík, kyslík, dusík a fosfor a vápník (C,H,O,N,P,S, Ca), které tvoří až 60% suché hmoty organizmu. Jsou to tzv. hlavní, též primární nebo konstituční prvky. Méně časté (0.5-1%) jsou Cl, F, K, Na, Mg, Fe. Nejméně zastoupené, tzv. stopové prvky (0.05%) jsou Cu, I, Si., Mn, Zn, Br, As, Li, Pb, Sn, Co, Ni. Prvky se vyskytují v živočišných organizmech jako ionty (K+, Na+, Cl-, Ca++ atp.) nebo anorganické a organické molekuly (O2, N2, CO2, voda, H2CO3, H2PO4, HCl, NaHCO3-, 5
NaHPO4-, Ca2CO3, močovina, mastné kyseliny, alkoholy, aminokyseliny, sacharidy, dusíkaté base, bílkoviny atp.). Anorganické látky se podílejí na tvorbě elektrochemických gradientů (K+, Na+, Cl- aj.), jsou však často součástí enzymů (Fe++, Mg++, Mn++, Zn++, stopové prvky), transkripčních faktorů (Zn++), dýchacích pigmentů (Fe++, Cu++ aj.) a dalších biologicky aktivních molekul. Poskytují např. tvrdost kostní tkání (kalcium karbonát a kalcium fosfát), podílejí se udržování acidobasické rovnováhy (pH 7.2-7.4, pH= záporný dekadický logaritmus oxoniových iontů) a osmotického tlaku tělních a buněčných tekutin (300 miliosmolů, mOs). V udržování acidobasické rovnováhy se slabé kyseliny a jejich soli, jejichž roztoky představují tzv. pufry (syn. ústoje, nárazníkové roztoky). Pufry vyrovnávají pH reversibilními změnami disociace molekul. Cave: Na udržování pH se podílí i některé organické látky, vč. bílkovin (viz níže), cestou reverzibilní disociace funkčních skupin. Nejvíce zastoupenou anorganickou molekulou je v živočišném organizmu voda. Voda tvoří 60-90 % celkové hmotnosti těla. Její obsah kolísá dle druhu živočichů, věku, pohlaví, orgánu, funkčního stavu organizmu a pod). Její obsah klesá s věkem živočicha. Vyskytuje v buňce jako voda volná (cca 95%) nebo vázaná (cca 5 %), např. na polární skupiny hydrofilních proteinů. Voda má neutrální pH (7.0), uplatňuje se jako rozpouštědlo hydrofilních látek, podmiňuje osmotické jevy a svou tepelnou setrvačností se podílí na tepelné homeostáze buňky a organizmu.
1. 1. 2 ORGANICKÉ MOLEKULY Přehled hlavních skupin organických molekul A. Sacharidy Jednoduché: mono-, di-, tri-, tetra-, penta- hexasacharidy Polysacharidy : škrob, glykogen, chitin, glysosylaminoglykany aj. B. Lipidy Jednoduché: tuky, oleje, vosky, isoprenoidy Složené: fosfolipidy: glycerofosfolipidy: fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin, : fosfatidylserin, fosfatidylinositol) : sfingolipidy : glykolipidy : sulfolipidy : gangliosidy : lipidům podobné isoprenoidy (steroly, terpeny, karotenoidy aj.) : tzv. minoritní lipidy (fofatidylglycerol, lyzofosfoglycerol apod.) C. Aminokyseliny D. Peptidy (oligo-polypeptidy) a bílkoviny -bez nebílkovinné složky - s nebílkovinnou složkou: glykoproteiny : lipoproteiny : chromoproteiny : fosfoproteiny : nukleoproteiny E. Dusíkaté heterocyklické molekuly (N-base), nukleozidy, nukleotidy a nukleové kyseliny
Organické molekuly se vyskytují buď jako jednoduché nebo složené, tj. polymery stejných nebo různých molekul. A. Sacharidy (dříve cukry, uhlovodany, uhlohydráty, glycidy) obsahují uhlík, vodík a kyslík. Mají v molekule funkční skupinu karbonylovou (aldehydovou nebo ketonovou- aldózy a ketózy) a hydroxylové skupiny. Vyskytují se jako monomery (triosy, pentozy, hexózy, dle počtu atomů uhlíku) nebo jako disacharidy (např. sacharóza: glukóza-fruktóza, maltóza: 6
glukóza- glukóza, laktóza: glukóza-galaktóza), jako oligo- a polysacharidy (škrob, glykogen, celulóza, chitin, pektiny, glysosylaminoglykany aj.). Sacharidy s –OH skupinou na asymetrickém uhlíku vlevo se označují jako L- (lat. Leavus = levý), s –OH skupinou vpravo jako D-stereoizomery (Dexter=pravý). Sacharidy otáčející rovinu polarizovaného světla vlevo se označují jako (-) a jejich optické antipody jako (+). Redukcí karbonylové skupiny vznikají z monosacharidů alkoholy ( přípona –itol, např. manitol, glycitol, sorbitol atp.). Oxidací aldehydové s hydroxylových skupin vznikají kyseliny (aldonové, aldarové, uronové). Kyselina glukuronová je biologicky velmi významnou složkou mezibuněčné hmoty (viz kap.5.1). Náhradou –OH skupiny aminoskupinou (NH2) vznikají aminosacharidy, které jsou další důležitou složkou mezibuněčné hmoty, buněčného glykokalyxu atp.
Sacharidy se mohou vázat i s jinými molekulami a jsou často součástí názvu takových komplexů (glykoproteiny, peptidoglykany, glykolipidy apod.). Sacharidy jsou též součástí nukleozidů, nukleotidů a nukleových kyselin. Sacharidy slouží jako stavební molekuly buněk (např. celulóza), živiny, zdroj energie (glukóza, sacharóza, škrob, glykogen, inulin aj.), dále modifikují biologické vlastnosti bílkovin a lipidů (určují mj. krevní skupiny ABO), jsou významnou součástí mezibuněčného hmoty v tkáních. U některých bezobratlých (např. hmyzu) tvoří pevný povrch a oporu těla (chitin). B. Lipidy jsou látky nerozpustné vodě a rozpustné v tzv. organických rozpouštědlech. Největší skupiny představují lipidy jednoduché (i) a složené (ii). Menší, avšak biologicky významnou skupinou jsou lipidům podobné (iii) izoprenoidy. Biologickou významnou je i tzv. (iv) minoritní skupina lipidů. (Ad i) Jednoduché lipidy jsou estery vyšších karboxylových (syn. mastných) kyselin a alkoholu, nejčastěji glycerolu (triglyceridy, syn. triacylglyceroly). Do skupiny jednoduchých lipidů řadíme tuky, oleje, vosky a isoprenoidy. Jako mastné kyseliny se označují tzv. vyšší monokarboxylové kyseliny. Mají obvykle sudý počet atomů uhlíku (8 a více), uspořádaných lineárně, tj. nevětveně. Sudý počet C je dán tím, že jejich syntéza vychází adicí 2C acetátu. Kyseliny s C atomy spojenými pouze jednoduchými vazbami se označují jako nasycené (např. palmitová, stearová, arachidonová, lignocerová, myristová). Pokud se vyskytují i vazby dvojné, jde o kyseliny nenasycené (NEMKy). Čím je počet dvojných vazeb v mastné kyselině větší, tím nižší je bod tání (viz níže oleje a kap. 4- fluidita plazmatické membrány). Mononenasycené kyseliny se označují jako monoenové (MUFA, monosaturated fatty acids, např. olejová, palmitoolejová a další). Poly nenasycené se označují jako polyenové (PUFA: polyunsaturated fatty acids. (linolová –linen lat-len, linolenová, arachidonová a j.) Jsou nezbytnou složkou potravy mnoha živočichů i člověka, protože některé z nich nedokáží syntetizovat (esenciální mastné kyseliny) a jsou nezbytné pro funkci buněk , především oběhového, imunitního a nervového systému. „.....(biologicky) nejúčinnější omega 3 kyseliny jsou EPA (eikosapentaenová kyselina) a DHA (dokosahexaenová kyselina) – se vyskytují ..... nejčastěji v tuku ryb žijících v chladných vodách (lososi, makrely, pstruzi, tuňáci).....V rostlinné potravě se také nachází omega 3 kyselina – ALA (alfa-linolenová) – ve lněných semenech......, dalšími zdroji jsou .... ořechy, dýňová semena, řepka olejná a listová zelenina. ....... minimum omega 3 kyselin ... (v olivovém oleji, kráceno, vsuvky VM) “. http://www.fitlife.cz/clanky/zdroj-omega3-kyselin/ Vysvětlivka: Omega-3 vyjadřuje pořadí dvojné vazby od metylového konce mastné kyseliny
Tuky mají převahu nasycených mastných kyselin, oleje nenasycených mastných kyselin, které podléhají snadno oxidaci (viz níže). 7
Při oxidaci nenasycených mastných kyselin, např. tzv. volnými kyslíkovým radikály, kap. 5.8 a obr.44, vznikají lipidické hydroxyperoxidy a peroxyradikály, které poškozují molekulární stavbu a následně i funkci biomembrán, často s následkem smrti buňky (kap. 5.10). Látky zabraňující tomuto poškození jsou u např. vitamin C, E, flavonoidy z „barevné“ zeleniny a ovoce, apod., kap. 5). Oxidací podmíněná polymerace olejů vede ke vzniku tvrdého filmu (tzv. vysychavé oleje, používané při výrobě laků a barviv). Dvojné vazby nenasycených mastných kyselin mohou být též hydrogenovány, čímž dochází ke vzniku polotuhých a tzv. ztužených tuků. Tuky mohou být původu rostlinného i živočišného. Oleje získané z rostlin lisováním za studena jsou tzv. panenské oleje (virgin oils) nebo za tepla. Lisováním za studena se získává olej kvalitnější s vysokým obsahem dalších biologicky důležitých látek, např. lecitinu (tvořícím často zákal, což je známkou vysoké kvality). Tuky lze též extrahovat pomocí organických rozpouštědel s nízkou teplotou varu, např. trichlorethylenem, benzínem, apod.
Vosky jsou estery vyšších alifatických kyselin a primárních, případně sekundárních alifatických alkoholů (cetyl- cerylalkohol). Chemicky jsou vosky stálé, obtížně hydrolyzovatelné látky, které působením lipas nezmýdelňují. Při normální teplotě jsou pevné, při vyšších teplotách měknou a tají. V přírodě se vyskytující vosky mohou obsahovat kromě esterů i volné kyseliny, alkoholy, aldehydy, alkoholy, steroly, nasycené uhlovodíky a další látky. Vyskytují se jak u rostlin, tak u živočichů. V případě rostlin vytvářejí na povrchu listů a jiných orgánů tenkou ochrannou vrstvu, zvanou kutikula. Vosky jsou součástí mnoha mastí, kde plní ochrannou a emulgační funkci.
(Ad ii) Složené lipidy obsahují kromě alkoholu a mastných kyselin i další molekulu(y). Mezi biologicky významné složené lipidy patří: (a) Fosfolipidy jsou hlavními molekulami biomembrán. Mají jednu hydroxylovou skupinu alkoholu (glycerolu nebo sfingozinu) esterifikovou kyselinou fosforečnou a další molekulou obsahující dusík, která představuje hydrofilní, tj. ve vodě smáčivou, tzv. "hlavičku" fosfolipidu (cholín, etanolamin, serín, inozitol). Vzhledem k současné hydrofobicitě mastných kyselin na zbývajících 2 uhlících alkoholu, mají fosfolipidy tzv.obojetnou - amfifilní povahu, která je klíčovou pro stavbu a funkci biomembrán (obr. 5, viz též kap. 2.2). K nejčastěji se vyskytujícím fosfolipidům patří fosfatidylcholin (lecitin), fosfatidyletanolamin (kefalín), fosfatidylserin, fosfatidylinositol, difosfatidylglycerol (kardiolipin). Minoritní skupinu membránových fosfolipidů představují sfingofosfolipidy, které místo glycerolu obsahují 18ti uhlíkový dvojsytný alkohol sfingosin (př. sfingomyelin v myelinových obalech nervových vláken, viz kap. 5.2). V membránách archeí a některých anerobních bakterií (kap.3.3.) jsou tzv. etherové formy fosfolipidů (plasmalogeny, acetálové lipidy, glycerylétery), ve kterých jsou větvené alifatické řetězce typu izoprenoidů navázány na uhlík glycerolu nikoliv vazbou esterovou ale etherovou. Tyto lipidy se však vyskytují i v membránách některých eukaryotních buněk, např. makrofágů, trombocytů, neuronů, bílé hmotě nervové tkáně, nebo spermií. Poměrně hojné jsou v sarkoplazmatickém retiklu svalových buněk myokardu a kosterních svalů. Častou mastnou kyselinou je kyselina arachidonová, která je zdrojem řady bioloogicka aktivních látek (trmboxany, prostaglandiny, prostacykliny).Plasmalogeny ovlivňují fluiditu membrán, působí i jako zhášeče kyslíkových radikálů (viz kap. 4). Snižují povrchové napětí. U spermií mají fusogenní efekt (podporují splynutí plazmatické membrány spermie a vajíčka).
(b) Glykolipidy (syn. cerebrozidy) mají místo kyseliny fosforečné na jedné -OH skupině alkoholu (glycerolu nebo 18- ti uhlíkového dvojsytného sfingozinu) glykozidicky navázaný sacharid, často galaktózu. Cukerná složka představuje hydrofilní část molekuly. V erytrocytech glykosfingolipidy určují krevní skupiny ABO (v tělních tekutinách a sekrečních buňkách však ABO sacharidová složka je vázána na proteiny, viz níže glykoproteiny) . © Sulfolipidy obsahují i síru, zpravidla na molekule galaktózy. (d) Gangliozidy představují konjugát sfingozinu, mastné kyseliny a oligosacharidu, který je zakončený jednou či více molekulami N-acetyl-neuraminové kyseliny (syn. kyseliny sialové). 8
Jsou časté v nervové tkáni, ale vyskytují se i v jiných orgánech, zejména na buněčném povrchu. Mají význam při zachycování virů a jejich pronikání do buňky. (Ad iii) Isoprenoidy (steroidy, terpény, karotenoidy) jsou tetracyklické uhlíkaté sloučeniny, které nevyhovují zcela definici lipidů, neboť nejsou estery alkoholů. Rozpouští se však v organických rozpustidlech a nikoliv ve vodě. Mezi biologicky nejvýznamnější isoprenoidy patří steroidy (cholesterol, vitamin D, hormony kůry nadledvinek a pohlavní hormony, ekdyson-svlékací hormon řídící metamorfózu hmyzu, žlučové kyseliny) a karotenoidy (vitamin A) a další molekuly. (Ad iv) Minoritní skupinu tvoří fosfatidylgylceroly (např. kardiolipín), lyzofosfoglyceroly, fosfatidové kyseliny a glykolové lecitiny.
C. Aminokyseliny Aminokyseliny (AK) jsou organické kyseliny, ve kterých je jeden nebo více atomů vodíku nahrazeno zásaditou aminoskupinou (-NH2, zpravidla na α uhlíku, který sousedí s karboxylem, viz níže). V bílkovinách živočišného organismu se vyskytuje 20 AK, z nichž 19 je isomericky levotočivých AK (syn. L-konfigurace AK, L-alanin, L-cystein, atd.). Pravotočivé, D-formy, AK se vyskytují hlavně v bakteriích a některých antibiotikách. Každá AK má alespoň jednu kyselou karboxylovou skupinu (-COOH). AK mohu obsahovat též další funkční skupiny, např. SH, fenylové apod. Stupeň disociace funkčních skupin se může měnit, což napomáhá udržovat acidobasickou rovnováhu (pH) v buňce a vnitřním prostředí organizmu. Stav, ve kterém je molekula AK elektricky elektroneutrální (tj. zásadité a kyselé skupiny jsou v rovnováze) se nazývá isoelektrický bod. Biologická role AK a jejich derivátů je velmi pestrá. Slouží především jako stavební jednotky peptidů, bílkovin a jejich derivátů. Některé AK, např. kyselina glutamová, gammaaminomáselná nebo glycin, jsou neurotransmiterm v nervovém systému (více ve Fyziologii živočichů). AK slouží též jako prekurozory některých hormonů, biogenních aminů apod. Za určitých okolností jsou některé AK využívány k resyntéze glukózy (viz metabolický pool, kap. 3.2) Některé AK, tzv. nekódované, nestandartní, nebo non-proteinogenní AK vznikají až post-translačními modifikacemi bílkovin (prolin--> hydroxyprolin, serin--> fosfoserin), nebo se vyskytují v organizmu jen volné a plní jiné funkce. Např. ortitin a citrulin, jako součást cyklu tvorby močoviny. Z hlediska výživy se AK rozdělují na tzv. nahraditelné (organizmus je schopen je syntetizovat z jiných molekul) a tzv. esenciální, které musí být v potravě přítomny, podobně jako např. vitaminy.
D. Peptidy a bílkoviny Jsou to polymery AK vázaných peptidickou vazbou v lineární řetězce. Řetězce s méně než cca 20 AK (m.h. do 10 000) se označují jako oligopeptidy, s větší počtem AK jako polypeptidy. Bílkoviny jsou molekuly tvořené jedním nebo několika polypeptidy. Mohou obsahovat i nebílkovinnou složku (sacharid, lipid, fosfátovou skupinu, iont kovu, nukleové kyseliny). Bílkoviny mají několik úrovní strukturální organizace molekul. Tzv. primární strukturu bílkovin představuje pořadí aminokyselin v peptidickém řetězci. Sekundární strukturou bílkovin rozumíme periodické konformace peptidového řetězce (určované již primární strukturou). Nejčastější formou sekundární struktury je závitnice (helix) a tzv. skládaný beta list. Terciární struktura spočívá v další prostorové konformací 9
polypeptidového řetězce. Kvartérní strukturou se rozumí vzájemné uspořádání vícero polypeptidů (podjednotek) v jednu funkční bílkovinu. Molekuly fibrilárních bílkovin jsou tvořeny dlouhými úseky periodicky uspořádaných řetězců. Pro globulární bílkoviny jsou typické krátké periodické úseky, které bývají kombinovány do tzv. super sekundárních motivů.
Prostorové uspořádání polypeptidů je důležité pro jejich enzymatické, receptorové a další funkce, při kterých se uplatňují interakce s dalšími molekulami, uskutečňujícím se často na principu „zámku a klíče“. Narušení struktury bílkovin, tj. jejich denaturace, vede ke ztrátě jejich funkčních vlastností. Bílkoviny mohou obsahovat i složku nebílkovinnou, dle které se klasifikují jako glykoproteiny, lipoproteiny chromoproteiny, fosfoproteiny, nukleoproteiny aj.. Glykoproteiny obsahují sacharidovou složku, která může tvořit až 50% hmotnosti molekuly. Někdy to jsou jen krátké řetězce oligosacharidů. Glykoproteiny se vyskytují v plazmatické membráně buněk, v krevní plazmě, tvoří hormony a enzymy. Lipoproteiny jsou zpravidla lehčí než voda, lipidická složka tvoří obvykle 40 až 90% hmotnosti molekuly. Do této skupiny patří např. některé krevní plazmatické bílkoviny a membránové bílkoviny. Chromoproteiny obsahují atomem kovu zbarvenou prostetickou skupinu, např. železem nebo mědí. Mezi chromoproteiny patří např. hemoglobin, myoglobin, cytochromy. Fosfoproteiny obsahují fosfátové skupiny. Uplatňují se především v regulačních procesech v buňce. Fosforylace bílkoviny, např. enzymu, vede k její přechodné aktivaci. Fosforylaci bílkovin zprostředkovávají enzymy- proteinkinázy (obr. 34,37). Nukleoproteiny představují komplexy DNA nebo RNA a bílkovin. Některé proteiny obsahují sekvence AK, které mohou být „vystříženy“, jsou označované jako inteiny, nebo proteinové introny (viz též introny a exony DNA, kap.2.5 a 3.3).
E. Dusíkaté heterocyklické molekuly (syn. N-base), nukleozidy, nukleotidy a nukleové kyseliny. E1. N-baze jsou deriváty purinu (guanin, adenin) nebo pyrimidinu (thymin, cytosin, uracil). Tzv. minoritní base, jsou metylguanosin, pseudouridin, isopentenyladenin, inosin, metylcytosin. E2. Nukleozidy obsahují jednu z 5 základních N-basí a molekulu pentózy, tj. buď ribózu (ribonukleozidy) nebo 2-deoxyribozou (deoxyribonukleozidy). E3. Nukleotidy (ribonukleotidy, deoxyribonukleotidy) obsahují navíc ještě 1 až 3 zbytky molekuly kyseliny fosforečné, spojené esterovou vazbou. Nukleotidy jsou obvykle uváděny pouze zkratkami obsahujícími první písmeno N-base a počet fosfátových skupin (např. AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP atd., kde M=mono, D=di, T=tri). Nukleotidy tvoří nukleové kyseliny a jsou i zdrojem fosfátových skupin a energie, uložené v tzv. makroergních fosfátových vazbách. Ribonukleotidy jsou často koenzymem, např. oxidoreduktáz (nikotinadenindinukleotid- NAD+, flavinadenindinukleotid- FAD+ aj. viz kap. 3.2). Tzv. cyklické nukleotidy (cAMP, cGMP a pod.) se uplatňují při přenosu informace v buňce jako tzv. sekundární posli ( kap. 3.4). 10
E4. Nukleové kyseliny (NK) jsou polymery nukleotidů, tj. polynukleotidy. Molekula DNA obsahuje pyrimidinové base thymin a cytosin. V molekule RNA je thymin nahrazen uracilem. Purinovými bazemi jsou v DNA i RNA adenin a guanin. Osovou kostru polynukleotidového řetězce tvoří molekuly sacharidu pentózy (ribóza v RNA a deoxyribóza v DNA), propojené fosfátovými skupinami (PO4). Molekula DNA obsahuje dvě polynukleotidová vlákna, které vytváří dvoušroubovici (double helix). Obě vlákna jsou spojena vodíkovými vazbami mezi N-basemi, jejich tzv. komplementárním párováním (adenin -thymin, guanin -cytosin). Počet adeninových bazí se v molekule DNA rovná počtu thyminových bazí (A = T) a počet bazí guaninových se rovná počtu bazí cytozinových (G = C). Celkový počet purinových basí se rovná celkovému počtu basí pyrimidinových (A+G = C+T, tzv. Chargaffovo pravidlo)
Obě polynukleotidová vlákna jsou v molekule DNA uspořádána antiparalelně tj. na obou koncích dvoušroubovice má jedno vlákno volnou hydroxylovou (-OH) skupinu (tzv. 3´ konec) a druhé vlákno fosfátovou PO4-- skupinu na 5. uhlíku deoxyribozy (tzv. 5´ konec). Dvoušroubovice DNA je za fyziologických podmínek pravotočivá a má zpravidla tzv. Bkonformaci. Rozlišujeme na ní tzv. menší, vnitřní žlábek a větší, vnější žlábek. V mitochondriích a bakteriích má molekula DNA většinou kružnicové upořádání, tj. nevytváří shora zmíněné volné konce (viz kap.2.1.a 2.3). Méně častá je tzv. A-konformace pravotočivé dvoušroubovice DNA (např. ve sporách bacilů). Levotočivá dvoušroubovice vytváří méně obvyklou tzv. Z-konfirmaci (zig -zag konformace). Přechod z konformace B do Z se pravděpodobně uplatňuje při regulaci exprese genů (viz kap. 3.3 a 5.6). Jako pravotočivou označujeme šroubovici odpovídající tzv. pravidlu pravé ruky, které spočívá v tom, že při uchopení šroubovice do ruky tak, že palec směřuje ve směru podélné osy molekuly, ostatní prsty ukazují směr jejího „stoupání“. Levotočivé uspořádání odpovídá analogickému pravidlu levé ruky.
Molekula RNA je v živočišných buňkách zpravidla jednovláknová. Vyskytuje se jako tzv. informační (messengerová) RNA, transferová RNA a ribozomální RNA (viz kap. 3.3). V RNA se adenin páruje nikoliv s thyminem, ale s uracilem. Konkrétní úlohy jednotlivých prvků, anorganických sloučenin a organických molekul budou uvedeny v následujících kapitolách. Nukleotidové triplety DNA, spolu s jednosměrným tokem informaci z DNA přes genetický kód (mRNA) k proteinům, je společným znakem nejen živočichů, ale i všeho živého (Dogma molekulové biologie, viz kap….).
11
1. 2 STAVBA TĚLA
(obr. 3,4, 6-22. Podrobněji ve speciální zoologii)
1. 2. 1 Prostorová orientace, anatomie a hierarchie stavby těla (tělní plán) Těla živočichů jsou s vyjímkou nejjednodušíích (houbovci-, Porifera, vločkovci- Placozoa). oddělena od zevního prostředí zevní a vnitřní selektivně propustnou a ochranou barierou (viz 1.2.) Hlavní rysy anatomické stavby živočišných těl jsou symetričnost, polarita a stavební hierarchie). Nejjednodušší, Diblastika, jsou převážně radiálně symetričtí podél středové tělní osy. Triblastika jsou bilaterálně symetričtí (Bilateria, dříve Bilateralia). Typ tělní symetrie se zakládá již na úrovní rýhování vajíčka. Zatímco u Diblastik je rýhování spirální, u triblastik je tzv. pravo-levé (bilaterální). Viz kap. 6. 3. Tělo živočichů je morfologicky „polarizováno“ podle/ve směru jedné (Diblastika) nebo vícero tělesných os (Triblastica). U Diblastik lze tak rozlišit orální a ab-orální část těla. U Triblastik se v předozadní ose vytváří část hlavová, trupová a ocasní. V hlavové části se soustřeďují regulační centra, především nervová. Hlavová část se stává určující pro směr pohybu živočicha. V hlavové části těla je ústní otvor (viz Deuterostomia, viz kap. 6), na opačném konci otvor řitní (annus). Strukturálně a funkčně se postupně odlišuje část ventrální (břišní) a dorzální (hřbetní). Základní tělní plán metazoí se ustanovuje se začíná ustavovat již ve zralém vajíčku (selektivní distribuce mRNA a proteinů kódovaných maternálními geny a jejich redislokací při oplozovací reakci (viz níže a kap.6) a pokračuje po oplození a v procesu blastogeneze. Místo vniknutí spermie do vajíčka a vytvoření tzv. šedého srpku na opačné straně zygoty určuje předozadní osu a budoucí ventrální a dorzální části těla. Dalším společným morfologickým znakem živočichů je tzv. článkování (syn. segmentace, metamerizace) těla tj. vznik opakujících se tělních segmentů/modulů (Arthropoda, Annelida, Vertebrata) . Segmentation in animals typically falls into three types characteristic of the different phyla: Arthropoda, Vertebrata, and Annelida. Drosophila form segments from a field of equivalent cells based on transcription factor gradients. Zebrafish, and other vertebrates, use oscillating gene expression to define segments known as somites. Leech embryos, and other annelids, use smaller cells budded off from teloblast cells to define segments http://www.zeably.com/Segmentation_%28biology%29&type=small.
Článkování těla u obratlovců a savců je nejvíce patrné v časných stádiích ontogenetického vývoje. U ryb a hadů je v dospělosti patrné v uspořádání svalového a kosterního aparátu, u savců v uspořádání osového skeletu, svalstva a zčásti i centrální nervové soustavy. Základem článků skeletu a svalstva trupu jsou mesodermální somity-prvosegmenty (viz kap. 6). Jejich počet se v průběhu časné ontogeneze mění. Např. u l idského zárodku je přítomno koncem 2. měsíce 42-44 párů somitů. Později se však první a 57 posledních rozpadá v mesenchym. Zbývající vytvoří kolem chordy základy 32-34 obratlů. Aktuální počet somitů se využívá u řady species ke stanovení stáří embryí. Počet tělních článků má tendenci se v průběhu evoluce i ontogeneze zmenšovat a specializovat. 12
Tzv. homonomní (stejnocenné) článkovaní (někteří kroužkovci) spočívá v tom, že každému článku vyznačenému na povrchu těla odpovídá celý segment vnitřních orgánů. U heteronomně (nestejnocenně) článkových živočichů, počínaje pijavicemi a některými mnohoštětinatci, na jeden článek těla připadá více vnějších kožních zářezů. Heteronomní segmentace těla je dobře patrná u členovců.
Základní utváření tělního plánu je dnes podloženo znalostmi o funkci desítek genů a jejich transkriptů, které mají signalizační, nebo expresi genů regulující funkce, umožňující . asymetrické dělení buněk a jejich diferenciaci (viz též kap.3.4 v kap. 6.3 Více ve vývojové biologii a embryologii).
1.2.2 HIERARCHIE
VNITŘNÍ STAVBY TĚLA
Základní stavební a funkční jednotkou/modulem živočišných organizmů jsou buňky. Představují hierarchicky upořádané systémy molekul a organel. Buňky strukturálně a funkčně komunikují mezi sebou i s okolní extracelulární matrix, na jejíž tvorbě se podílejí. Společně vytvářejí komplexnější tkáňové struktury a orgány (viz kap. 1.1 a kap. 3 a 5). Tato stavební hierarchie se zvyšuje počas fylogeneze. S výjimkou u nejjednodušších skupin živočichů (houbovci-, Porifera, vločkovci- Placozoa). mají živočišné organizmy již tkáňovou úroveň organizace těla. 1.2.2 Tkáňová úroveň organizace těla je patrná již u Diblastik, u kterých je tkáňově organizovaný kryt povrchu těla a výstelka tělní/trávicí dutiny, derivující z ektodermálního a entodermálního zárodečného listu. U Triblastik se objevuje široké spektrum buněk a tkání derivujících z listu mesodermálního, s výjimkou nejnižších forem (ploštěnci, hlísti), u kterých je mesoderm jen málo vyvinutý. Zvyšuje se i spektrum buněk, tkání a orgánů ektoa endodermálního původu. Z ektodermu se v průběhu fylogeneze vyvinul nejen zevní tělní kryt a jeho přídatné struktury ale i nervový systém (centrální a periferní část, neurální lišta, sítnice). Z entodermu - prvostřeva a jeho vychlípenin, se tvoří epiteliální výstelka zažívacího traktu a jeho přídatné žlázy (slinné žlázy, játra, pankreas), dýchací orgány atp., viz kap. 6.3). Z mezodermu derivují pojivové tkáně, tvořící vazivové obaly orgánů, oporný, svalový, oběhový a vyměšovací aparát a výstelka druhotné tělní dutiny - coelomu, která umožnila rozvoj vnitřních orgánů, jejich nezávislý pohyb na tělní stěně, kompartmentalizaci a očistu tělních tekutin od metabolických zbytků (viz kap. 6.3). Buněčná a tkáňová rozmanitost vzniká procesem diferenciace. Její podstatou je časově a prostorově řízená exprese specifických genů, která vede k postupné proměně vajíčka na blastomery, buňky zárodečných listů, tkáně, orgánové základy a jejich další morfologické utváření a funkční specializaci. Diferenciální exprese genů je rovněž nezbytná v dospělosti pro obnovu, reparaci a regeneraci buněk a tkání apod. (viz kap. 3.6 ). Tkáňová úroveň organizace těla byla provázena vznikem tělních barier, které ohraničují organizmus od zevního prostředí, což umožnilo vytvoření samostatného tzv. vnitřního prostředí organizmu (viz níže) U nejjednodušších bezobratlých zevní tělní barieru tvoří 1-2 vrstvy epiteliálních buněk U vývojově pokročilejších organizmů se objevují složitější epiteliální pokryvy těla, odvozené ze zevního zárodečného listu, ektodermu, vč. jejich derivátů (kutikuly, šupiny, peří, kůže s přídatnými útvary jako např. žlázami, rohovité a kostěné struktury a pod), které vykonávají protektivní úlohu proti i chemickým, mechanickým, radiačním, biologickým a dalším vlivům. Tělní kryt nabývá tak kromě mechanických, rovněž další funkce: transportní, percepční, termoregulační, exo- a endokrinní, u bezobratlých i oporný, apod.(viz též níže) 13
Vnitřní tělní bariery, tj. ohraničení tělních dutin od vlastních tělních buněk zajišťují různé typy epiteliálních tkání, které se stávají postupně součástí komplexnějších sliznic. Mají selektivní propustnost a schopnost obousměrného, výběrového transportu chemických látek přijímaných potravou (viz kap. , brání průniků bakterií, virů a parazitů do nitra organizmu Součástí vnitřních barier se stávají v průběhu fylogeneze i další tkáně (pojiva, hladká svalovina, nervová a lymfatická tkáň (viz shora příklad stavby střevní stěny). Epiteliální buňky se funkčně diverzifikují.V některých dutinových orgánech, např. v mozku se ustavují vysoce selektivní bariery (např. ependymální výstelka komor mozku a míšního kanálu). 1. 2. 3 Orgánová úroveň organizace těla Orgány jsou tvořeny vždy několika typy tkání. Jeden typ tkáně v orgánech zpravidla převládá (tzv. hlavní), zatímco ostatní jsou minoritní a mají funkce pomocné. Např. v orgánech pohybu, kosterních svalech, je hlavní tkáň svalová, pomocnými jsou tkáně pojivové. V játrech je hlavní tkání epitel, pomocnými pak jsou pojiva. V každém orgánu je však zastoupena tkáň nervová v podobě nervových vláken a případně i celých nervových buněk. Všemi orgány prostupují rovněž buňky imunitního systému a většinou též mízní cévy (výjimka např.mozek). Příklad: Stavba trávicí trubice Vnitřní povrch je kryt sliznicí (tunica mucosa), která je tvořena epiteliální výstelkou, dále tzv. lamina propria mucosae tvořenou řídkým vazivem s kapilárami, imunitními a nervovými buňkami (Meissnerova pleteň), následovanou tenkou vrstvu tzv. slizniční svaloviny (muscularis mucosae) a podslizničním vazivem (submukóza). Následují 2-3 vrstvy cirkulárně a podélně uspořádané hladké svaloviny, mezi kterými je další nervová (Auerbachova) pleteň. Na povrchu je vazivový obal- seróza. Ve stěně střeva jsou četné žlázky tvořící hlen a trávicí střevní šťávu. Toto morfologické uspořádání zajišťuje trávení potravy, resorpci molekul a transport do krve, posun obsahu střeva. Více v přednáškové prezentaci a Fyziologii živočichů. Orgány různých živočišných taxonů vykazují vysokou morfologickou rozmanitost (pleiomorfii). Nicméně, orgány vyvíjející fylogeneticky ze společného embryonálního základu zachovávají některé společné stavební prvky/znaky a jsou proto klasifikovány jako orgány homologní (prsní ploutve ryb, křídla ptáků, ruce člověka nebo plakoidní šupiny plazů a zuby savců). Pro některé podobné funkce se však vyvinuly orgány morfologicky sice podobné, avšak z odlišných starších základů. Jde o tzv. orgány analogické (žábry korýšů vs. žábry ryb, křídla motýlů vs. křídla ptáků). Orgány, jejichž význam se v průběhu fylogeneze vytratil se označují jako rudimentární (např. kostrč člověka). Orgány běžné u fylogeneticky starších předků, avšak výjimečné u současných forem organizmů, jsou tzv. atavistické (u člověka např. srst nebo Darwinův hrbolek na ušním boltci). Kromě této nejstarší klasifikace morfologické či funkční „shody“ orgánů, vycházející z fylogeneze, existují i klasifikace vycházející z jiných hledisek, např. ontogenetického. Více ve srovnávací zoologii a evoluční biologii. Orgány se počas fylogeneze seskupovaly do morfologicky a funkčně spolupracujících orgánových systémů- soustav vyznačujících se rostoucí komplexitou.. K jejich zjednodušení došlo pouze u některých parazitických živočichů, využívajících funkcí hostitelského organizmu.
14
Růst velikosti a komplexity těla vedla ke zvýšeným nárokům na jejich funkční koordinaci. K původním látkovým/humorálním regulačním mechanizmům se přidávají regulace neuronální a imunitní, které tvoří tzv. integrační systémy organizmu (viz níže kap. 1.3.3.5 a Fyziologie živočichů). Orgány a orgánové systémy (podrobněji ve speciální zoologii a fyziologii. Viz též Hajer, J., http://biology.ujep.cz/vyuka/file.php/1/opory/Fylogeneze_a_system_strunatcu.pdf Tělní kryt (zevní a vnitřní tělní bariera) U nejjednodušších bezobratlých metazoí zevní tělní
barieru tvoří 1-2 vrstvy epiteliálních buněk U vývojově pokročilejších bezobratlých se objevují složitější epiteliální pokryvy těla, odvozené ze zevního zárodečného listu, ektodermu, vč. některých jejich derivátů (cilie, sekreční buňky, kutikuly). U obratlovců se vyvinula kůže tvořená epitelíální epidermis a pojivovou dermis a řadou přídatných struklur (šupiny, peří, žlázy, rohovité a kostěné struktury a pod). Zevní tělní bariery tak vykonávají protektivní úlohu proti i chemickým, mechanickým, radiačním, biologickým a dalším vlivům. Podílí se rovněž na transportu látek, percepci, termoregulaci, homeostáze vnitřního prostředí (viz níže), opoře těla (exoskelet bezobratlých) atp... Vnitřní tělní bariery, tj. ohraničení tělních dutin od vnitřních orgánů/ buněk tvoří epiteliální výstelky, které jsou součásti sliznic, především zažívací trubice. Mahí selektivní propustnost pro látky přijímané potravou (viz kap.3.1), brání průniků bakterií, virů a parazitů do nitra organizmu. Součástí orgánových barier se stávají v průběhu fylogeneze i další tkáně (pojiva, hladká svalovina, nervová a lymfatická tkáň,viz shora stavba střevní stěny). Epiteliální buňky se morfologicky a funkčně diverzifikují (sekrece, resorbce, endokrinní funkce apod. vit kap. 5.2) .V dutinách některých orgánů, např. v mozku se ustavují speciální bariery (ependymální výstelka komor a míšního kanálu). Diverzifikuje se rovněž látková propustnost kapilár cévního řečiště, které tvoří barieru různého stupně propustnosti i mezi vnitřním prostředím organizmu (krví, viz níže) a orgánovým parenchymem. Tělní bariery umožnují vznik tzv. vnitřní prostředí organizmu, tvořeného tělními tekutinami (viz níže kap. 1. 3) Opěrná a pohybová soustava. U fylogeneticky starších bezobratlých s měkkými těly (kroužkovci, larvy hmyzu) poskytuje tělní oporu hydroskelet, tvořený tělními dutinami naplněnými tekutinou, zpravidla endolymfou. U některých (ostnokožci), je relativně pevný endoskelet, tvořený sklerocyty a porézním amorfním materiálem, obsahujícím oxid hořečnatý, poskytující větší oporu i možnosti pohybu. U členovců a měkkýšů se vytvořil pevný exoskelet (chitinová kutikula, vápenaté lastury a ulity aj.), který poskytuje pevnou zevní oporu svalovému systému.
Nejvyšší komplexitu má opěrná a pohybová soustava obratlovců. Tělní oporu poskytuje endoskelet, tvořený kostmi spojenými klouby. Kostní tkáň má komplexní cytoarchitektoniku (viz kap. 5.2) U některých (žraloci), je kostra tvořená chrupavkou inkrustovanou často uhličitanem vápenatým. Kostry jednotlivých druhů obratlovců se liší podle stupně fylogenetického vývoje a životního prostředí (vzduch, voda, souš). Základem je mesenchymální struna hřbetní, která je postupně zatlačována/nahrazována tkání chrupavčitou (paryby, kruhoústí) nebo kostěnou (obratlovci). Kostru obratlovců tvoří postupně se v průběhu fylogeneze utvářející lebka, trup (páteř, hrudní koš, pánev) a kosti končetin. Lebka dle spojení s páteří je tzv. monokondylní (plazi, ptáci) nebo bikondylní (obojživelníci, savci). Končetinová kostra má u suchozemských část pletencovou (pánevní, lopatková) a volnou (více ve speciální zoologii).V průběhu fylogeneze se mění histologická stavba kostí, od jednoduché plsťovité k lamelární. ve která se u homoiothermů objevuje osteonové usporádání lamel 15
Zažívací (gastrointestinální) soustava. U nejjednodušších bezobratlých (prvoci, parazité) probíhá příjem živin celým povrchem těla tzv. parenterálně. U většiny vícebuněčných k tomu slouží speciální orgán(y), které mají různý stupeň specializace tj. slouží přijmu, rozkladu- trávení, vstřebávání potravy/živin a vyvrhování zbytků potravy.
Přijímací otvor, ústa, vznikají u tzv.prvoústých, Prostomií (členovci, hlístice, měkkýši, kroužkovci, vířnící, ploštěnci) v místě vchlípení blastuly/blastocysty (viz kap 6.3) v procesu gastrulace. U druhoústých – Deuterostomií (ostnokožci, polostrunatci, strunatci) se ústní otvor prolamuje druhotně a ustavuje se na opačném konci zárodku. Původní prvoústa se mění v otvor řitní (viz též níže rozdíly v tělním uložení nervové a oběhové soustavy).. Nejjednoduším typem trávicí soustavy je tzv. jednoduchá láčka (nezmar) nebo více členitá gastrovaskulární soustava ( medúzovci, korálnatci, ploštěnky, motolice), které mají společný přijímací a vyvrhovací otvor. U fylogeneticky výše postavených živočichů má trávící trubice otvor ústní, hltan, jícen, žaludek, střevo a konečník, vše různého stupně komplexity. Součástí jsou i přídatné orgány (čelisti, jazyk, zuby, slinné žlázy,žlučník játra, játra, pankreas endokrinní a imunitní buňky atd.) Anatomie trávicího traktu bezobratlých i obratlovců je přizpůsobena rovněž složení a fyzikálním vlastnostem potravy Více v Anatomii a fyziologii živočichů Dýchací soustava. Proces výměny plynů se u bezobratlých děje povrchem celého těla
(prvoci, houby, kroužkovci) nebo specializovanými orgány, které představují vychlípeniny pokožky:žábry –měkkýši, mnohoštětinatci, korýši, plicní vaky- pavouci, štíři, vzdušnicehmyz, ambulakrální soustava tzv. vodních cév, jimiž proudí mořská voda. U obratlovců slouží k výměně plynů žábry (vnější a vnitřní) složené z prokrvených žaberních lupínků na žaberních obloucích). Dýchání ve vzduch slouží plíce, které mají u různých taxonů různou stavbu a pohyblivost a dýchací cesty (plazi, ptáci, obojživelníci, savci) tvořené nozdrami, dutinou nosní, hrtanem, průdušnicí, průduškami a průdušinkami. Více v Anatomii a Fyziologii živočichů. Cévní-vaskulární soustava. U bezobratlých je cévní soustava tzv. otevřená nebo uzavřená . Otevřená cévní soustava je tvořena pulzující hřbetní cévou (měkkýši, členovci), která vypuzuje a zpětně nasává tělní tekutinu (hemolymfu) volně mezi tělní buňky. Uzavřená cévní soustava je tvořena uzavřeným cévním řečištěm. U kroužkovců a některých dalších bezobratlých je hlavní tělní tekutinou krev, jejíž cirkulace je udržovaná pulzací rozšířených části hřbetní cévy. U obratlovců je cévní systém uzavřený. Je tvořen tepnami, kapílárami a žílami. Cirkulace krve je udržována pulzací sadce různé anatomické komplexity (2 oddílové u ryb, 3 oddílové u obojživelníků, 4 oddílové u savců), uloženým na břišní straně těla. U suchozemských se vedle tzv. velkého somatického cévního systému vyvinul tzv. malý plicní oběh, zajišťující účinnou výměny plynů mezi organizmem a okolím. Filtrací tvořená míza (lymfa) je odváděná mízními cévami a mízovody do žilní části krevního řečiště. . Rozmnožovací soustava. Primárními pohlavními orgány (i znaky) jsou gonády, tvořící zárodečné buňky (gonocyty, samčí nebo samičí gamety ). Jsou patrné již u žahavců. Chybí však speciální vývodní a další přídatné orgány. Gonády samců jsou párová varlata (testes). Přídatné pohlavní orgány obratlovůjsou nadvarlata, vývodní cesty, prostata, semenné váčky, pářící orgán (penis) . 16
Gonády samic jsou: vaječníky (ovaria). U některých živočichů (ptáci) však bývá funkční jen jeden z obou těchto orgánů. Přídatné pohlavní orgány samičí jsou vejcovody, děloha, pochva (vagina), vulva, pochva a přídatné žlázky. Viz kap.6 a Fyziologie živočichů Integrační orgánové soustavy. Hormonální, nervový a imunitní systém (NS, ES, IS). V průběhu fylogeneze se u živočichů vyvinuly 3 regulační mechanizmy: (a) Hormonální (b) nervová (c) imunitní. Vzhledem k jejich celotělově koordinační úloze jsou označovány rovněž jako systémy integrační Hormonální systém je vývojově nejstarší. Je tvořen rozptýlenými buňkami v různých tkáních/orgánech, vč. mozku. U hmyzu a korýšů tvoří např. hormony řídící vývoj/svékání. U vyšších obratlovců jsou hormony tvořené rovněž v mozku (hypotalamus), ale převážně ve speciálních žlazách hypofýza, .epifýza, nadledviny, thyreoidea, parathyreoidea, thymus, Langerhansovy ostrůvky pankreatu, gonády aj. Nezanedbatelná je tvorba látkových působků buňkami rozptýlenými v různých orgánech, vč. orgánů a tkání imunitního systému. viz Anatomie a Fyziologie živočichů a člověka. Nervová soustava (NS) U nejjednodušších bezobratlých je NS tvořena rozptýlenou sítí
neuronů (láčkovci). U vyšších (ploštěnci, hlísti), se nervové buňky seskupují do provazců/svazků nebo ganglií (gangliová/řebříčková NS), propojenými svazky neuronálních výběžku (kroužkovci, členovci). Trubicová NS se vyskytuje u obratlovců a postupně se diferencuje v část míšní a mozkovou a periferní nervy. Řídící centra NS se potupně posouvají do hlavové části (tzv. kefalizace), která se současně stává hlavnínadřízenou integrační oblastí NS i organizmu. Funkční morfologii NS bude věnována podstatná část kurzu Fyziologie živočichů a člověka (viz též shora, kefalizace organizmu). Kromě neuronů se v NS objevují „obslužné“ buňky gliové, jejichž relativní četnost i fenotypy v průběhu fylogeneze rostou . Nervová soustva prvoústých j se nachází na břišní straně těla, zatímco u druhoústých na straně hřbetní. Imunitní soustava (systém IS). IS je přítomen již u bezobratlých (kroužkovci a výše). Je tvořen tělními barierami, fagocyty, antibakteriálními nespecifickými molekulami enzymového typu apod. U obratlovců přibyly speciální orgány, ( bursa Fabritii u ptáků, thymus, kostní dřeň, mízní uzliny, tonsily, slezina, slizniční lymfatická tkáň), umožňující tzv. specifickou buněčnou a humorální imunitní odpověď. Viz kap 5.2 a Fyziologie živočichů. Viz též Přílohu na konci skript The Basic Animal Groups, By Laura Klappenbach Organizmy vytváří společenství různé velikosti, komplexity a organizovanosti Vývoj stavby těla je řízen časově a prostorově koordinovanou posloupností exprese genů a aktivitou jimi kódovaných molekul (viz kap 3.3 a 3.6 a 6.3) .
1. 2 Funkční vlastnosti živočichů (podrobněji ve
speciální zoologii a fyziologii) (vnitřní prostředí, toky látek, energie a informací, pohyb,rozmnožování, chování, organizovanost v čase)
1. 2. 1 Vnitřní prostředí (VP) organizmu. Jeho součásti, význam a homeostáza Tělní bariery (zevní a vnitřní, vit shora kap.1.2) umožnily vznik na okolí nezávislého vnitřního prostředí organizmu, které poskytují tělním buňkám optimální chemické a fyzikální 17
podmínky (viz níže). Klíčovou úlohu má semipermeabilita buněčných membrán, mnohotné formy aktivního transportu volně neprostupujících molekul a těsné spoje mezi buňkami tělních bariér (viz kap.3.1 a 5.1). U živočichů s nejjednodušší, tj. neúplnou tkáňovou, stavbou těla (viz shora) VP představuje buněčný cytozol a mezibuněčná tekutina. U organizmů s tkáňovou a orgánovou stavbou tvoří VP gastrovaskulární tekutina, hydrolymfa, hemolymfa, tkáňový mok, celomová tekutina, krev, lymfa a některé minoritní tekutiny v dutých orgánech. Na existenci a význam VP upozornil r. 1865 Claude Bernard (La fixité du milieu intérieur est la condition d'une vie libre et indépendante). Pro stálost VP, jakožto podmínku volného a nezávislého života, zavedl. později (1932), Walter Cannon termín homeostasis.
Tělní tekutiny VP jsou pro tělní buňky bezprostředním zdrojem anorganických a organických látek, vč. plynů , a to v rovnoměrném a optimálním množství. Tekutiny VP přijímají rovněž zbytky metabolismu z buněk (voda, CO2, dusíkaté látky) a látky cizorodé, které přenášejí do vylučovacích orgánů. Vzhledem k tomu je nezbytné udržování stálých fyzikálních vlastností a chemického složení VP. Stálost VP, homeostáza (z řeckého homeo= stejný, stasis = stav) se týká celkového objemu tělních tekutin, jejich teploty, osmotického a onkotického tlaku, pH, tenze plynů, viskozity, koncentrace iontů, solí, organických molekul apod. U pokročilejších metazoí udržování homeostázy VP zajišťuje řada orgánů, jejichž komplexita se modifikuje a zvyšuje s progresí fylogenetického vývoje, růstu velikosti těla i tlakem životního prostředí (více ve Fyziologii živočichů a člověka). Homeostázu VP zajišťuje řada orgánů a orgánových systémů (trávicí, dýchací, cirkulační systém a vylučovací systém, vč.integumentu). Poskytují základní anorganické a organické látky, vč.vody, odstraňují metabolické zbytky a cizorodé látky, slouží k rozvodu tepla a plynů a pod) Jejich činnost je integrovaná systémem endokrinním, nervovým a imunitním. Více níže, též v kap. 1.3 a podrobněji ve Fyziologii živočichů a člověka. Fyzikální a chemické vlastnosti VP Objem tělních tekutin VP je udržován rovnováhou mezi jejich příjmem, především vody, potravou a vznikající rozkladem živin, a jejím výdejem-exkrecí. Dostatečný objem tělních tekutin je důležitý pro udržení zásob vody pro tělní buňky a zajištění cirkulace tělních tekutin v oběhovém systému. Pokles celkového objemu tělních tekutin vede ke zvýšení jejich osmotického tlaku (viz níže), což vyvolá pocit žízně, která je signálem k pití, vycházejícím z hypotalamu. Přebytečná voda je vylučována exkrečními orgány (integument, dýchací a speciální vylučovací orgány) nebo při jejím nedostatku v organizmu zadržována. Více ve Fyziologii živočichů Chemické složení a pH . VP u jednodušších mořských bezobratlých je blízké složením mořské vodě, s výjimkou nižšího obsahu síranů a přítomnosti proteinů. Tento rozdíl se ve fylogenetické řadě zvyšuje a objevuje se i pokles iontů hořečnatých. U kostnatých mořských ryb, klesá obsah i sodíkových a draslíkových iontů, výrazně se zvyšuje obsah bílkovin. Tekutiny VP se stávají vůči okolí hypoosmotické. Únik vody je proto omezován tělními barierami osmotickým tlakem iontů a molekul K opačnému procesu, tj. omezování nadměrného vstupu vody z okolí do VP došlo ve sladkovodním prostředí. Další nároky na regulaci obsahu vody, iontů a metabolických zbytků vyvolal přechod živočichů na souš. Viz Fyziologie živočichů. 18
VP musí obsahovat optimální množství iontů (Na+, L+, Ca++, Mn++, Mg++, a j) a organických molekul (glukóza, mastné kyseliny, aminokyseliny vitaminy, biologicky aktivní molekuly a pod). Více ve Fyziologii živočichů. Potřebnou tenzi O2 a CO2 zajišťují speciální pigmenty/barviva (hemoglobin, hemerytrin, hemocyanin). U bezobratlých jsou volně rozpuštěné volně rozpuštěné v tělních tekutinách U obratlovců je hemoglobin obsažen v červených krvinkách.Složení a funkce těchto barviv je více popsáno v kap 5.2. a ve Fyziologii živočichů. Další anorganické a organické molekuly jsou přenášeny volně ve vodní fázi tělních tekutin, nebo vázány na bílkovinné nosiče (více ve Fyziologii živočichů a člověka)
Pro funkci enzymů zajišťujících transport a přeměnu látek, pohyb a další funkce na úrovni buněčné i orgánové je nezbytné optimální pH, které v buňkách osciluje pH kolem 7.2 a v krevní plazmě v rozmezí 7.35 - 7.45..Snížení pH pod tyto hodnoty se označuje jako acidóza, zvýšení nad tyto hodnoty alkalóza. Opakování. Koncentrace vodíkových iontů v destilované vodě při 25 oC 1 je 10-7 molární. (1 molární roztok je 1 grammolekula sloučeniny nebo 1 gramatom v 1 l roztoku). Stejnou koncentraci mají v neutrálním roztoku i hydroxylové ionty. Tato koncentrace se vyjadřuje jako záporný dekadický logaritmus se symbolem pH (koncentrace protonů, power of Hydrogenii). Destilovaná voda má tedy pH 7.0. Je-li koncentrace obou iontů stejná, jde o roztok neutrální. Převažují-li ionty vodíkové, jde o roztok kyselý a při převaze hydroxylových iontů o roztok zásaditý. Vodíkový iont (proton, H+) je atom vodíku, z něhož byl odebrán 1 elektron. Kyselina je donor protonů, kdežto báze je akceptor protonů. Silou kyseliny rozumíme stupeň disociace molekul ve vodném roztoku.
Sloučeniny, které jsou schopny udržovat pH stupněm své disociace nazýváme pufry (syn. ústoje, nárazníky). Rozhodujícím pufrem v buňkách a tělních tekutinách je vodní roztok NaHCO3-/H2CO3, ze kterého se při alkalóze uvolňují H+ ionty a acidóze anionty bikarbonátové (HCO3-). Biologicky důležité pufry jsou i fosfátový pufr (HPO4 2- /H2PO4), hemoglobin, jehož kyselost stoupá se stoupající vazbou kyslíku a aminokyseliny, jejichž karboxylová skupina může uvolňovat H+ a bazická aminoskupina (NH2) je může přijímat.. Pohyb vody mezi buňkami a tělními tekutinami je určován osmotickým tlakem, daným počtem molekul, nebo jejich částí v objemové nebo váhové jednotce vody (osmolarita vs. osmolalita). Osmolalita buněk savců je 282 milismolů (mOsm) na kg hmoty . Přesun vody plazmatickou membránou probíhá přes molekulární kanály, akvaporiny Je-li v okolním prostředí vyšší osmotický tlak, buňky se svrašťují přesunem vody do okolí. V hyposomotickém prostředí buňky bobtnají v důsledku přestupu vody z okolí.. Osmoticky nejvýznamnější jsou ionty sodíku, draslíku a chloridy. Z organických molekul pak glukóza, močovina, aminokyseliny a bílkoviny, které vykonávají tzv. onkotický tlak tím, že í váží jisté množství vody. . Teplota VP a organizmu. Mezi procesy závislé na teplotě patří enzymatické reakce, fluidita biomembrán a prostorová struktura bílkovin (viz kap. 2.3 a kap. 3). Teplo vzniká v živočišném organizmu jako vedlejší produkt metabolických procesů, především v mitochondriích svalů a v játrech. Viz níže (kap.3.2)zákony themodynamiky Specializovaným orgánem pro přímou přeměnu chemické energie na tepelnou je hnědá tuková tkáň, která se vyskytuje na např. v podkoží mezi lopatkami a kolem gonád u novorozených savců a hibernujících druhů. Viz kap. 5.2 . a Fyziologie živočichů. Přeměna chemické energie na tepelnou v hnědém tuku je umožněna zkratovým tokem protonů z mezimembránového prostoru mitochondrií do matrix. Přeměnu fyzikální energie protonového gradientu (viz kap. 2. 3 a 3.2.) na tepelnou umožňují tzv. odpřahovací proteiny na vnitřní mitochondriální membráně, které odkloní tok protonů od ATP syntázy do matrix přes speciální protonový kanál. Výsledkem je uvolnění
19
relativně velkého množství tepla. Aktivace této odpřahovací cesty se dnes využívá i k redukci tělesné váhy. V rukou laiků však může způsobit nevratné poškození organizmu !!!. Významem a odlišnostmi ve výskytu a funkci hnědé tukové tkáně se zabývá srovnávací fyziologie. Viz též kap…5.2.
Schopnost živočichů produkovat dostatečné množství tepla vlastními mechanizmy , tzv. endothermie je u většiny ptáků a savců, ale některého hmyzu. Opakem, tj. závislost živočichů na příjmu tepla pouze z okolí, tzv. ektothermie je u většiny bezobratlých, obojživelníků a plazů. Teplotu na stálé výši udržují homeothermní (syn. homoithermní) živočichové (většina savců a ptáků). Homeothermii zajišťuje řada orgánů, které se podílejí na zahřívání a ochlazování organizmu (svalový, nervový a endokrinní systém, hnědá tuková tkáň, integument, dýchací a oběhový systém, tukový orgán aj.). Umožnila živočichům osídlit místa s dlouhodobě nepříznivými klimatickými podmínkami, jakož i udržovat aktivitu v teplotně nepříznivých obdobích roku či dne. Heterothermie (syn. poikilothermie) označuje značné kolísání tělesné teploty dané teplotou okolního prostředí. Poikilothermní jsou i někteří tzv. fakultativně endothermní živočichové (některý hmyz, malí ptáci i někteří savci). Zvláštní skupinu tvoří tzv. hibernující živočichové, u kterých dochází k dočasnému poklesu metabolizmu a teploty (křeček, sysel, ježek, netopýr). Stálou teplotu (homeothermii, syn.homoithermii) mohou udržovat i někteří ektothermní živočichové (ryby). 1. 2. 2 Příjem a přeměna živin a energie (látkový a energetický metabolizmus. kap.3.1. a 3. 2) Živočišné organizmy představují otevřený systém, ve kterém probíhá výměna látek, energie a informací s okolím. Tato komunikace je řízená a výběrová. Klíčovou úlohu v příjmu látek mají tělní bariery a plazmatické membrány tělních buněk. Organizmus přijímá z okolí anorganické a organické látky formou potravy (viz shora trávící soustava). Zdrojem organických látek jsou převážně látky vytvořené jinými organizmy (Heterotrofie, z řec. heterone - jiný a trophe - výživa), neboť živočichové, na rozdíl od autotrofů, nedokážou většinu z nich syntetizovat z anorganických molekul. Z látek přijímaných potravou jsou v buňkách organizmu syntetizované nové a tělu vlastní strukturální a funkční molekuly (kap. 3.2), především nukleové kyseliny a bílkoviny (viz kap. 3. 2 a 3. 3). Bílkoviny s enzymatickými vlastnostmi syntetizují řadu dalších molekul (viz kap. 3.2). Syntéza molekul de novo se označuje jako anabolizmus. Jako katabolizmus se označuje rozklad přijatých organických molekul, spojený zpravidla s přeměnou energie. Klíčovou roli v anabolických i katabolických procesech mají enzymy (viz kap. 1.1 a 3.2). Zdrojem stavebních i energii poskytujících molekul jsou pro živočichy látky syntetizované jinými živými organizmy (viz níže heterotrofie). Energie těchto látek je uložena v kovalentních chemických vazbách, především mezi uhlíkem a vodíkem. Štěpení těchto vazeb je oxidoredukční enzymatický proces probíhající anaerobně nebo aerobně, podle zákonů termodynamiky (viz kap. 3.2). Využití energie uvolněné z organických molekul vyžaduje její přeměnu-uložení do . makroergních fosfátových vazeb tělu vlastních molekul (ATP, GTP, CTP, UTP, fosfofokreatin, fosfoarginin), které pak enzymatickým štěpením poskytují energii v „dávkách“ potřebných pro většinu buněčných funkcí (transport látek, syntézu bílkovin, 20
příjem a transdukci signálů, pohyb, adaptaci na změny v okolí, dělení buněk, reparaci poškození atd. Na úrovni buněčné, v případě neopravitelných poškození, i pro tzv. programovanou smrt. Viz kap. 3 Nezužitkované energetické substráty přijaté potravou jsou ukládány do reservních molekul, např. polysacharidu glykogenu, především hepatocytů a svalových buněk, nebo triglyceridů tukových buněk a tukové tkáně, viz kap. 5.2. Katabolické procesy končí tzv. molekulárními zbytky .(hlavně CO2, voda, amoniak nebo kyselina močová, či močovina). K jejich vylučování slouží řada orgánů (integument, dýchací a zažívací trakt a speciální vylučovací orgány, které prošly řadou změn v průběhu fylogeneze, reagujících na okolní životní prostředí. Velké mezidruhové rozdíly se vyvinuly v hospodaření vodou, ionty a dusíkatými zbytky. Více ve Fyziologii živočichů. 1. 2. 3 Toky informací (viz kap. 3.4) Příjem a zpracování biologicky významných podnětů z okolí i nitra organizmu, je nezbytný pro obživu, rozmnožování, vývoj, adaptaci a obranu organizmu , regulaci homeostázy vnitřního prostředí a metabolizmu každého živočišného organizmu. Fylogeneticky starší je signalizace látková, která se později kombinuje s rychlejší regulací nervovou. Význam a komplexnost nervových regulací rostl s růstem velikosti těla, svalové soustavy a orgánové komplexity. Bylo tím umožněno rychlejší a cílenější celotělové koordinace funkcí a jejich změn- adaptace- na měnící se potřeby organizmu. Umožnilo to též vývoj nových funkčních vlastností živočichů (reflexní, instinktivní a sociální chování, učení a pod). V průběhu fylogeneze došlo k velkým proměnám integračních systémů a to jak na úrovni buněčné, tak orgánové (viz shora typy nervové soustavy). Odpovědi buněk na signál/ podněty (mechanické, chemické, látkové, elektrické, magnetické, látkové atd.) se liší u buněk dráždivých/vzrušivých a nevzrušivých Nevzrušivé buňky odpovídají na chemické signály (hormony, cytokiny, neuromediátory další, viz též kap. 1.2 orgánové soustavy) aktivací receptorových molekul, které následně aktivují kaskádu intracelulárních chemických dějů, vedoucích ke změně metabolizmu nebo některé komplexní buněčné funkce (transportu látek, buněčného dělení, diferenciace aj. viz kap. 3). Látkové signální molekuly působí buď v nejbližším okolí látku vylučujících buněk (sekrece parakrinní), nebo jsou tyto molekuly rozváděny do vzdálených oblastí těla tělními tekutinami (sekrece endokrinní). Pokud látka působí zpětně na sekretující buňku, tento proces se označuje jako sekrece autokrinní. Hormony a jim podobné látky působí vazbou a aktivací receptorů cílových buněk Hlavní skupiny látkových působků a způsob jejich receptorové signalizace jsou obecně uvedeny v kap. 3. 4). Signalizace i následné reakce organizmu jsou zajišťovány celotělovými, tzv. integračními systémy (nervovým, hormonálním a imunitním, viz shora kap. 1. 2 orgánové systémy a níže), vybavenými specifickými buňkami a orgány s celotělovým působením. Příjem podnětu dráždivými /vzrušivými buňkami (smyslové a nervové, svalové buňky) je provázen rychlou změnou klidového membránového potenciálu plazmatické membrány (depolarizaci) (KMP viz kap. 3.1). Tuto vlastnost buněk označujeme jako dráždivost. Schopnost podráždění šířit do vzdálenějších oblastí buňky nebo těla je označována jako vzrušivost. 21
Receptorovými molekulami, lokalizovanými převážně v plazmatické membráně, mohou být iontové kanály nebo molekuly aktivující kaskádu intracelulárních chemických dějů, které vedou „zpětně“ rovněž o regulaci propustnosti iontových kanálů a depolarizaci membrány.. Otevírání iontových kanálů dráždivých a vzrušivých buněk bývá velmi rychlé (milisekundy) a vede k přesunům iontů mezi buňkou a okolí,. Výsledek je depolarizace plazmatické membrány, která se může lavinovitě šířit po celé buňky vč. např. po dlouhých axonech nervových buněk. Podobně je tomu u svalových buněk přijímajících signály od nervového systému (více ve Fyziologii živočichů) Významnou úlohu ve vývoji schopnosti smyslových buněk přijímat specifické podněty z okolí měly a mají tzv. primární, nepohyblivé (non-motile) cílie (brvy) a mikroklky. Jsou to nitkovité výchlipky plazmatické membrány, které se účastní příjmu mechanických, chemických a radiačních podnětů. primární sensorické cilie se vyskytují např. tyčinkách sítnice komorového oka, sluchových, rovnovážných a čichových receptorových buňkách většiny živočichů. Receptorová funkce mikroklků se uplatňuje v některých fotoreceptorech (složené oko hmyzu, čípky komorového oka obratlovců aj.). Více viz kap 2.4. a Fyziologie živočichů.
1. 2. 4 Pohyb Pohyb, tj. aktivní přesun organizmu z místa na místo, nebo jen částí jeho těla, poskytuje živočichům výhody při získávání potravy, adaptaci, obraně a rozmnožování. V širším slova smyslu mezi pohybové funkce patří i pohyb vnitřních orgánů (zažívací trubice, srdce, chámovodů) a pohyb celých nebo častí buněk- cilíí a bičíků, panožek (dýchací trakt, vejcovody, spermie, migrace leukocytů a pod). Viz kap. 2.4 Pohyb protozoí, i některých izolovanýh buněk metazoí (spermie, migrující krevní buňky) zajišťují bičíky, cilie nebo panožky (viz kap 2.4). U vícebuněčných živočichů s tkáňovou a orgánovou organizací těla se nejdůležitějším výkonným aparátem pohybu stává svalová tkáň (kap. 5.2 ) a svalový systém, který spolupracuje s tělní oporou (viz shora opěrný a svalový systém). U vývojově pokročilejších bezobratlých s měkkými těly (kroužkovci, larvy hmyzu) se na pohybu účastní tělní opora v podobě hydroskeletu (viz shora), tj. tělních dutin naplněných tělní tekutinou. Pohyb je výsledkem stahování a uvolňování svalových vrstev, kterými se segmenty těla stahují a prodlužují, U některých taxonů (ostnokožci) je endoskelet pevný, tvořený sklerocyty a porézním amorfním materiálem, obsahujícím oxid hořečnatým, poskytujícím větší oporu i možnosti pohybu. U členovců a měkkýšů se svaly upínají na vnější kostru (exoskelet) Viz shora. Nejvyšší komplexity dosahuje pohyb u obratlovců, u kterých se svaly(viz kap. 5.2) upínají na pevný endoskelet, tvořený kostmi spojenými klouby. Kostní tkáň má komplexní cytoarchitektoniku (viz kap. 5.2) U některých (žraloci), je kostra tvořená chrupavkou často inkrustovanou uhličitanem vápenatým. Kostry jednotlivých druhů obratlovců se liší podle stupně fylogenetického vývoje a životního prostředí (vzduch, voda, souš). Základem je struna hřbetní, která je postupně zatlačována/nahrazována tkání chrupavčitou (paryby, kruhoústí) nebo kostěnou (obratlovci). Kostru obratlovců tvoří část osová/axiální (páteř, hrudní koš, pánev), Lebka a kosti končetin. Lebka dle spojení s páteří je tzv. monokondylní (plazi, ptáci) nebo bikondylní (obojživelníci, savci). Končetinová kostra má u suchozemských část pletencovou (pánevní, lopatková) a část volnou 22
Svalový pohyb se v nejjednodušší, a fylogeneticky nejstarší, podobě uskutečňuje pomocí myoepiteliálních buněk (Cnidaria). S kontraktilní funkcí myoepiteliálních buněk se však setkáváme i u savců, např. při vypuzování mléka z vývodů mléčné žlázy. Buněčná stavba svalových tkání je uvedena v kap 5.2 Výkonnou subcelulární složkou jsou cytoskeletální mikrofilamenta a jejich asociované proteiny, tzv. molekulové motory (viz kap. 2. 4). Pohybová aktivita organizmu a jeho částí je řízená nervovým aparátem (mozek, mícha, periferní nervy). V průběhu fylogeneze se toto řízení zdokonaluje a vrcholí sofistikovaným volním pohybem savců. Více ve Fyziologii živočichů. Zvláštní formou pohybu je vznášivý ("buyoantní") pohyb ve vodním prostředí, zajišťovaný např. změnou plynové náplně vzduchového měchýře ryb, nebo střídáním koncentrace sodíkových iontů ve vodní náplní tělních „komůrek“ u některých mořských bezobratlých (Nautilus) uskutečňovaný sodíko-draslíkovou pumpou 1. 2. 5 Adaptační a obranné mechanizmy (viz kap.4) Úprava dočasných změn vnitřního prostředí (VP) organizmu se uskutečňuje tzv. zpětněvazebnými (feed-back) mechanizmy. Při tzv. negativní zpětné vazbě (negative feedback regulation ) je zvýšení hodnot určitého parametru VP následováno „vypnutím“ tvorbu podporujících mechanizmů, nebo zapnutím inhibujících faktorů Opačně působí tzv. pozitivní zpětnovazební regulace (positive feedback regulation). Návrat k optimální fyziologické hodnotě může nastat náhle, jednorázově, nebo pozvolna formou tzv. tlumených kmitů, tj. klesajícími oscilacemi se zmenšující se amplitudou. U pokročilejších metozoí udržování homeostázy VP zajišťuje řada orgánů, jejichž komplexita se zvyšuje s progresí fylogenetického vývoje, růstu velikosti těla i tlakem životního prostředí (více ve Fyziologii živočichů a člověka). Dílčí orgánové systémy jsou pod integrační řízením systému endokrinního, nervového a imunitního. Umožňují komplexní adapatci orgaizmu na zátěžové vlivy otnačovanou jako Obecný adaptační syndron (General Stress Syndrom, Více ve Fyziologii živočichů a člověka. Při déle trvající funkční zátěži organizmus reaguje změnami obsahu strukturálních a funkčních molekul, především bílkovin, v buňkách zatěžovaných orgánů, tj. kvalitativními a kvantativními změnami jejich proteomu (soubor bílkovin buňky), .uskutečňovaných změnami exprese příslušných genů ( viz kap. 3.3, 4.2). To může vést ke změnam tvaru a velikosti buněk a orgánů, změnám dělení a počtu buněk, případně i jejich tkáňové reorganizaci (růst počtu synapsí v mozku při učení svalové hmoty při fyzické zátěži, změny počtu krvinek ve vyšších nadmořských výškách, zvýšená exprese některých enzymů při nutriční zátěži, přestavba trámčíté kosti při změnách mechanické zátěže a pod). Příklady negativní a pozitivní zpětné vazby Příklad 1. Při dosažení optimální hladiny pohlavních hormonů se jejich tvorba zastavuje tak, že dojde k vypnutí tvorby gonadotropinů v hypofýze. Současně se v krvi zvyšuje hormonů, typu inhibinů, které aktivně tlumí sekreci hypotalamických gonadoliberinů. Příklad 2. Pokles hladiny glukózy v krvi obratlovců vede ke zvýšenému vylučování (sekreci) hormonu glukagonu z pankreatu, který aktivuje rozklad glykogenu v játrech a 23
uvolňování glukózy do krve.Zvýšená hladina glukózy zpětno-vazebně sekreci glukagonu zastaví („vypne“). Současně se do krve začne vylučovat inzulín, který stimuluje transport glukózy z krve do buněk, což vede ke snižení glykémie. Více ve Fyziologii živočichů Při méně časté tzv. positivní zpětné vazbě (positive feedback) dochází k zesilování primární změny („plus vyvolává další plus“, minus další minus“), procesu podobným „nabalováním sněhové koule“. Příklad 3: Počáteční stahy dělohy při porody vyvolají vyplavování hormonu oxytocinu z hypofýzy, který dále tyto stahy zesiluje nebo proces zástavy krvácení. Více ve Fyziologii živočichů a člověka. Buňky i celé organizmy mohou být vystaveny i řadě škodlivin ze zevního prostředí. nebo tvořených v samotném organizmu, poškozujíících nejčastěji lipidy a bílkoviny cytozolu, biomembrán a cytoskeletu. V jádře a mitochondriích poškozujících rovněž nukleové kyseliny. Fyzikální škodliviny z okolí mohou být mechanické (teplo, chlad, elektromagnetické, ionizující a ÚV záření, tlak vzduchu, mikro- a nanočástice ve vzduchu a vodě, vč. cigaretového kouře aj.), chemické (některé kovy, kyseliny, louhy, těžké kovy, látky působící silně oxidačně redukčně, deaminačně, alkylačně, denaturačně, inhibičně na enzymy, polymeraci maktomolekul, změnami pH, a pod.) nebo biologické (bakterie, toxiny, viry, viroidy, priony, aj.) Fyzikální vlivy a jednoduché chemické látky (anorganické kyseliny a zásady, těžké kovy a pod), působí denaturaci bílkovin. Některé chemické jedy však vyřadí např. enzym, nebo strukturální protein tím, že blokují klíčové funkční skupiny molekuly (na př. aktivní centrum enzymu, vazné místo receptoru, membránového přenašeče, viz kap. 3.2, nebo místo nezbytné pro polymeraci strukturálních bílkovin, především cytoskeletu (viz kap.2.4) a tím i např. buněčné dělení (viz kap. 3.5).. Poškození může být zasáhnout primárně jednu nebo více skupinu organel. Často se však v buňce/tkáni/orgánu lavinovitě šíří (viz poškození reaktivními radikály kyslíku a dalších. látek, kap. 4). Poškozené bílkoviny mohou být v buňce re-naturovány (kap. 4.1 a 4.2) nebo rozloženy (viz lysozomy a proteazomy, kap.2.3 a 2.5). Škodliviny mohou být neutralizovány (oxidací, imunitními mechanizmy aj., více ve Fyziologii) nebo upraveny (např. zvýšením rozpustnosti ve vodě) tak, aby mohly být z těla vyloučeny V případě, že poškození je rozsáhlé a neopravitelné buňka hyne (formy úhynu jsou popsány v kap. 4.4) 1. 2. 6 Regenerace (viz kap.4) Regenerace je proces, který vede k náhradě opotřebených či poškozených buněk, tkání nebo orgánů. Regenerační schopnost je obecně vysoká u většiny bezobratlých. U suchozemských živočichů, např. plazů, ptáků, savců, probíhá většinou jen tzv. zhojení (zacelení) rány. Náhrada částí těla je možná však u ryb a ocasatých obojživelníků. Intensivní a celoživotně probíhá obnova buněk např. v populaci krevních elementů v kostní dřeni, v zárodečném epitelu samčích gonád, ve střevních kryptách, epidermis, apod. Obnova populací vychází zpravidla z tzv. zárodečné (germinální) oblasti tkáně či orgánu, která např. v plošných 24
epitelech je v blízkosti bazální laminy (BL), která řídí prostorovou orientaci (uspořádání) nově vznikajících dceřiných buněk. BL brání prorůstání epitelových buněk do hlubších vrstev orgánů. Porucha této pozičně-informační funkce BL je jednou z příčin/mechanizmů tvorby tzv. nádorových metastáz.
Proces regenerace vychází většinou z nediferencovaných buněk. Viz tzv. kmenové a progenitorové buňky (viz kap. 3.6 a 4.3) 1. 2. 7 Rozpoznávání a odstraňování látek tzv. tělu vlastních a cizích Živočišné organizmy nesmí rovněž tolerovat ve svém VP a tělních buňkách cizorodé biologické látky (cizorodé antigeny), především . mikroorganizmy, parazity a cizorodé anorganické a organické materiály/ tkáně. Tento dohled („IMMUNE SURVEILANCE“) zajišťuje řada nespecifických a specifických molekulárních, buněčných a orgánových mechanizmů. Mezi tzv. nespecifické mechanizmy patří tělní bariery, jejich mechanické a molekulární vlastnosti, makrofágy a další fagocytující buňky, především neutrofilní leukocyty, některé enzymy-lysozymy, antibakteriální nespecifické molekuly enzymového typu, nespecifické imunoglobuliny a pod.). Tyto obranné mechanizmy se vyskytují již u jednodušších bezobratlých (koužkovci aj.), a zůstávají zachovány u všech živočichů. Specifická imunitu uskutečňují specializované orgány (bursa Fabritii u ptáků, thymus, kostní dřeň, mízní uzliny, tonsily, slezina, slizniční lymfatická tkáň u savců. (Viz shora orgánové soustavy). V těchto orgánech se tvoří a specializují ( „školí“) buňky (kap. 5.2) uskutečňující tzv. specifickou imunitu- buněčnou a humorální Více ve Fyziologii živočichů. Specifické imunitní reakce vyžadují látkovou komunikaci mezi efektorovými imunitními a ostatními tělními buňkami. To se uskutečňuje pomocí širokého spektra bílkovinných molekul tzv. interleukinů (dříve lymfokiny), sekretovaných imunitními buňkami do tkáňových tekutin (imunoglobuliny), nebo kontaktem imunitních buněk s např. virem infikovaných ostatních buněk 1. 2. 8 Rozmnožování a ontogenetický vývoj (viz kap.6) Existenci živočichů, vč. jejich druhových vlastností, zajišťuje rozmnožování, spojené s předáváním genetické informace z rodičovských organizmů na potomstvo. Formy a mechanizmy rozmnožování živočichů, vč. oplozovací reakce a vzniku zygoty a následné blastogeneze jsou uvedeny v kap. 6. V těchto stádiích, jakož i v následném pre- a postnatálním vývoji, vč. dospívání dochází k růstu a anatomickému formování těla a nabývání funkčnosti jeho orgánů. Na buněčné úrovni probíhá v toto období života intensivní množení buněk a jejich diferenciace. Procesem diferenciace vznikají početné a výrazně odlišné buněčné fenotypy. Jejich základní skupiny jsou uvedeny v kap.5.2 Podstatou morfogeneze těla, jednotlivých orgánů a buněčných fenotypů je časově a prostorově řízená exprese genů, kódujících regulační bílkoviny (transkripční faktory, viz kap. 3.3) a fenotypově specifické strukturální a funkční molekuly (viz kap 3.6 a kap. 6). Průběh a mechanizmy stárnutí a smrti organizmu budou předmětem výběrových kurzů. Význam a mechanizmy buněčné smrti jsou uvedeny v kap. 4.4.
25
1. 2. 9 Chování (Instinkty, emoce, učení, spánek atd.) Instinktivní prvky chování (obživné, rozmnožovací, únikové) jsou patrné již u bezobratlých a jsou zprostředkovány ganglii jejich nervového systému. K největšímu rozvoji těchto funkcí došlo u obratlovců, kde jsou vázány na rozvoj hlavové části trubicového nervového systému, především mozku. Emoce, učení, paměť jsou zprostředkovány koncovým mozkem (telecephalon) v kooperaci s podkorovými oblastmi (spánek). Více ve Fyziologie živočichů 1. 2. 10 Organizovanost organizmu v čase Život živočichů je vymezen jeho početím a smrtí. Mezidobí, tvořené vývojovou fází, ontogenezí, následovanou dospělostí a stářím, se u různých živočichů významně liší a kolísá od desítek hodin až po mnoho roků. Časově spjatým procesem je rovněž periodicita buněčných, orgánových a celotělových funkcí. Periodicity/biorytmicita je jednou ze základních vlastností živočichů. Je řízena podněty z okolí (den/noc, světelnost a teplota okolí, sociální interakce a pod) nebo nitra organizmu (srdeční automacie, dýchání, peristaltika, spánek/bdění, denní kolísání teploty, menses, zásnubní tance a koitální pohyby a pod). Dle délky periody se cykly dělí na hodinové (circumhorální), denní (diurnální), týdenní, měsíční, roční. Věda studující funkční periodicitu (cyklů) je chronobiologie. K poznatkům o cyklických změnách funkční aktivity orgánů a organizmu, v současné době přibyly údaje o molekulární podstatě a mechanizmech těchto procesů. Geny, molekuly a buňky, které funkční cykly spouštějí se označují jako pacemakery vnitřních hodin Na genové úrovni, jsou to např. Per geny (period genes), Cloc (clock) a Bmal geny a další , které vykazují periodickou expresi. Vyskytují se u všech živočichů, vč. bezobratlých. V dospělosti u savců jsou exprimovány především v hypotalamu a šišince a vedou k tvorbě příslušných signálních molekul. S funkční periodicitou souvisí zřejmě i např. záliba člověka v pohybové a zvukové rytmicitě.Více ve Fyziologii živočichů. Klíčovou molekulou regulující základní celotělové a otgánové cirkadianní rytmy obratlovců v dospělosti je hormon melatonin, derivát hydroxyindolu, který se tvoří z aminokyseliny tryptofánu v epifýze (šišince) v tmavé (noční) fázi dne. Melatonin působí přes receptory, které jsou exprimovány v řadě orgánů. Kromě vlivu na diurnální rytmy melatonin má i řadu dalších účinků (antioxidační, antigonadotropní/ antireprodukční, pro-imunitní aj.). Primárním neurálním pacemakerem jsou suprachiazmatická jádra hypotalamu. Více ve Fyziologii živočichů a člověka. Je známa i řada genů (Nhe3, Dra, Ae1, Atp1, Wee1 aj.) jejichž periodická exprese reguluje např. cyklickou aktivitu přenašečů iontů na plazmatické membráně epiteliálních buněk. Periodické otevírání a závírání iontových kanálů membrán myokardu a hladké svaloviny. je podstatou srdeční automacie a střevní peristaltiky. Soubory buněk schopné této periodicity se označují jako orgánové pacemakery (hypotalamus, srdce, žaludek, střevo). Viz kap. 2. 3, 3. 1 a 3. 2) a Fyziologie živočichů. Periodický pohyb (oscilace) vykazují i lipidy buněčných membrán, podmiňující jejich tzv. fluiditu (viz kap. 2.3). 26
Zvláštní formou časové organizace buněk je regulace buněčného cyklu tzv. cyklinovými hodinami (viz kap.3.5)
1.3 Třídění (systematizace) živočichů Podobnosti a rozdíly mezi organizmy vedly k členění živočichů do skupin, taxonů (syn. syn. kategorii, jednotek). Systematickým a vědecky podloženým rozčleněním živé přírody se zabývá vědní obor biologická taxonomie (řecky taxis = uspořádání, nomo“ = zákon, pravidlo) . Zakladatelem vědecké taxonomie je švédský badatel Carl von Linné (1758). Jeho systém členění se opírá o morfologické znaky organizmů a je používán dodnes. Základní tyxonomickou jednotkou je druh (species). Vyššími taxony jsou rod-genus, čeleď-familia, řád-ordo, kmen-phylum, třída- classis, říše-regnum. Živočichové tvoří říší Animalia (obr. 1). Viz též níže. Každý živočich je označovaný tzv. binomickou nomenklaturou (podvojným názvoslovím), obsahujícím rodový název (genus, uvedený velkým písmenem) a název druhový (species, uvedený malým písmenem). Vše psáno proloženě. Někdy je připojen název třetí, poddruh. Za druhový název se připojuje zkratka příjmení toho, kdo organizmus popsal a zařadil (např. L = Linneus) a rok, kdy se tak stalo. Např. Šváb obecný, Blatta orientalis L.(1745). Jedinci stejného druhu tvoří uzavřené rozmnožovací společenství. Mechanizmy zabraňující mezidruhovému rozmnožování živočichů jsou uvedeny v kap. 6.2 Taxonomické zařazení člověka (morfologická binomická taxonomie) Nadříše (Doména) Eukaryota (Eucaryota). Říše Živočichové (Animalia). Podříše Mnohobuněční (Metazoa) Oddělení Triblastica Kmen Strunatci (Chordata) Podkmen Obratlovci (Vertebrata) Nadtřída Čelistnatci (Gnathostomata) Třída Savci (Mammalia) odtřída Živorodí (Theria) Nadřád Placentálové (Placenthalia) Řád Primáti (Primates) Podřád Vyšší primáti (Anthropoidea) Nadčeleď Lidoopi a Lidé (Hominoidea) Čeleď Lidé (Hominidea) Rod Člověk (Homo) Druh Člověk rozumný (Homo sapiens) Poddruh Člověk rozumný, vyspělý (Homo sapiens sapiens).Čeleď Hominidae obsahuje tři rody - Homo, Australopithecus a Ramapithecus. http://genetika.wz.cz/vyvoj.htm Taxonomická klasifikace živočichů, stejně jako všech živých organizmů, prošla velkými změnami. Kromě třídění založeného na shodách či rozdílech v morfologii (strukturální taxonomie), současná klasifikace živočichů bere do úvahy i jejich fylogenetické vztahy (evoluční taxonomie). Přísně genealogické vývojové vztahy mezi skupinami živočichů používá k třídění živočichů kladistická taxonomie (řecky klados = větev), která stanovuje „odvětvování“ se jednotlivých druhů od společných předků v již existujících liniích (syn.fylogenetická taxonomie). Připouští, že přirozené vztahy mezi druhy nemusí mít primárně strukturální základy. Organismy sdílející společného předka a s podobnými znaky tvoří taxonomické skupiny tzv. clades. Jejich grafickým zobrazením vzniká kladogram. Tzv. eklektická taxonomie respektuje kladogenezi i anagenezi, tj. vzájemné podobnosti organizmů. Tzv. numerická (fenetická) taxonomie třídí organizmy pomocí počítačové shlukové analýzy očíslovaných .znaků. Zachycuje podobnost, nikoliv příbuznost organizmů. Pomáhá v třídění dávno vzniklých druhů, u kterých nelze zrekonstruovat jejich kladogenezi. Organizmy, které se vyvinuly z jednoho, nebo několika společných předků, se označují jako mono- apolyfyletické, resp... Více v Evoluční a systematické biologii
27
K fylogenetické klasifikaci organizmů přispívají významně rozdíly v nukleotidových sekvencích 18S RNA malé podjednotky ribozomu i některých úseků DNA (tzv. DNA Finger Prints - VNTR a RFLP segmenty DNA a pod, viz kap. 7). Fylogenezu a třídění živočichů pomáhájí objasňovat též poznatky primární struktury ubiquiterních bílkovin (tzv. Protein Finger Prints). Z porovnání rozdílů v sekvencích nukleotidů a aminokyselin u současných a vyhynulých živočichů, získaných ze zkamenělin v časově definovaných geologických vrstvách, lze stanovit dobu, kdy se od sebe jednotlivé taxony oddělily ze společného základu (tzv. molekulární hodiny fylogenetického procesu, Viz níže). Tento přístup pomáhá posuzovat vztahy mezi živočišnými taxony s minimálním počtem srovnatelných morfologických znaků. …..“existence of a so-called molecular clock was first attributed to Emile Zuckerkandl and Linus Pauling who, in 1962, noticed that the number of amino acid differences in hemoglobin between different lineages changes roughly linearly with time, as estimated from fossil evidence.[1] They generalized this observation to assert that the rate of evolutionary change of any specified protein was approximately constant over time and over different lineages. The genetic equidistance phenomenon was first noted in 1963 by E. Margoliash, who wrote: "It appears that the number of residue differences between cytochrome C of any two species is mostly conditioned by the time elapsed since the lines of evolution leading to these two species originally diverged. If this is correct, the cytochrome c of all mammals should be equally different from the cytochrome c of all birds. Since fish diverges from the main stem of vertebrate evolution earlier than either birds or mammals, the cytochrome c of both mammals and birds should be equally different from the cytochrome c of fish. Similarly, all vertebrate cytochrome c should be equally different from the yeast protein."[2] For example, the difference between the cytochrome C of a carp and a frog, turtle, chicken, rabbit, and horse is a very constant 13% to 14%. Similarly, the difference between the cytochrome C of a bacterium and yeast, wheat, moth, tuna, pigeon, and horse ranges from 64% to 69%. Together with the work of Emile Zuckerkandl and Linus Pauling, the genetic equidistance result directly led to the formal postulation of the molecular clock hypothesis in the early 1960s.[3] Genetic equidistance has often been used to infer equal time of separation of different sister species from an outgroup.[4][5] Later Allan Wilson and Vincent Sarich built upon this work“. Více ve Vývojové biologii).
Vše živé z živého BUNĚČNÁ TEORIE
KAŽDÁ BUŇKA Z BUŇKY
2 BUŇKA JAKO ZÁKLADNÍ STAVEBNÍ A FUNKČNÍ KEDNOTKA/ MODUL ŽIVOČIŠNÝCH ORGANIZMŮ Eukaryotní buňky je základní stavební a funkční jednotka všech živočišných organizmů. Jsou nositeli základních funkcí nezbytných pro život organizmu (příjem a přeměna látek, energie, informací, pohyb, regulace chemického složení a fyzikálních vlastností, schopnost autoreprodukce) i specifických vlastností, charakteristických pro jednotlivé orgány a částí těla. Živočišné buňky mají společnou základní stavbu. Od okolí jsou odděleny plazmatickou membránou (PM), která zajišťuje výběrovost a stálost jejího vnitřního prostředí, příjem látek, komunikaci s okolím a tvorbu tkáňových struktur. Nitro buněk je členěno do několika 28
základních oddílů, kompartmentů (pravé jádro, cytoplazma s membránovými organelami, cytoskelet a cytozol které strukturálně a metabolicky kooperují a vykonávají základní funkce (toky látek, energie a informací, pohyb a dělení buněk atp.). Viz kap.2 a 3, Eukaryotní buňky jsou výsledkem fylogenetického vývoje z jednodušších prokaryotních forem. Základní organizační schéma je však modifikováno v průběhu vývoje i dalšího života organizmu procesem buněčné diferenciace, tj. výběrovou (diferenciální ) expresí genů. Výsledkem ,je široké spektrum morfologicky a funkčně odlišných buněk, tzv. buněčných fenotypů, které se vyskytují izolovaně (buňky tělních tekutin, gamety a j) nebo tvoří tkáňové struktury, prostoupené do různé míry jimi tvořenou mimo-(syn.mezi-)buněčnou hmotou (extracelulární matrix). Viz kap. 4. . Pro lepší porozumění vzniku a významu shora uvedených procesů následuje stručný popis základní stavby prokaryotní buňky a možného fylogenetického vývoje buňky eukaryotní.
2.1 Nástin fylogeneze eukaryotní buňky Vývoj eukaryotních buněk začal pravděpodobně před zhruba 1.5 miliardou let, pravděpodobně vchlipováním povrchové plazmatické membrány anaerobního prokaryotního (archibakteriálního) prapředka do cytoplasmy a vytvořením jaderné blány, která oddělila DNA od ostatní cytoplazmy tj. vznikem tzv. pravého jádra ( řecky eukaryon). Vchlipováním plazmatické membrány se pravděpodobně vytvořily i membránové organely, tvořící tzv. endomembránový systém cytoplazmy (viz kap. 2. 3). Jaderná blána poskytla lepší ochranu genetické informace (DNA) před poškozením metabolickými škodlivinami vznikajícími nežadoucně v cytoplazmě při některých metabolických procesech (kap. 4.1). Umožnila rovněž sofistikovanější proces exprese a regulace genetické informace. Organely endomembránového systému umožnily specializaci a kompartmentalizaci metabolických a funkčních procesů v cytoplazmatickém oddíle buněk (viz níže). Endosymbiosou anaerobního předka, nesoucího již pravé jádro, s aerobními prokaryotními prabuňkami, vznikly pravděpodobně v jeho cytoplasmě mitochondrie (endosymbiotická teorie vzniku mitochondrií). V eukaryotních buňkách se vyvinula postupně rovněž síť vláken (cytoskelet, viz kap. 2. 4), která umožnila další integraci organel v buňce, buněk v tkáních, jakož i zdokonalení řady funkcí (pohyb buněk, transport látek v buňce apod.). I v tomto případě se zřejmě uplatnila endosymbióza s prokaryotním prapředkem (typu spirochet?), opatřeného vláknitými strukturami umožňující jejich prvotní pohyb. Stopy některých z těchto předpokládaných procesů lze dodnes spatřovat např. v rozpadu a rekonstituci jaderné blány do/z vesikul endoplazmatického retikula na začátku a konci mitózy, endocytóze, specifikách mitochondriální DNA, podobnosti molekulárních hmotností a dalších vlastností ribozomů. některých enzymů a proteinů se současnými eubakteriemi. Organely poskytly buňce mechanickou oporu, větší nitrobuněčnou „dělbu práce“ (příjem, přeměna a výdej látek-metabolizmus, příjem a výdej informací, lepší adaptace atp) a vznik mnohobuněčnosti (viz shora). Vše se uskutečňující v solubilním cytozolu (syn. základní cytoplazma), představujícím vnitřní prostředí buňky. Udržování jeho stálosti se stalo jedním ze základních vlastností buněk i mnohobuněčných organizmů. 29
V průběhu fylogeneze došlo k organizaci buněk do vyšších strukturálních a funkčních celků - tkání (viz kap. 6), které pak vytvořily orgány a orgánové systémy.(viz kap.1.2) Speciální funkce buněk a jednotlivých orgánů je výsledkem procesu buněčné diferenciace, (kap. 3.6), uskutečňovaná výběrovou expresí genů, buněčnými interakcemi v časných fázích tvorby tkání a orgánů (histogeneze a organogeneze ( kap. 3. 6, 5.2 a 6.3). Jak již uvedeno shora, uvedený nástin fylogenetického vývoje eukaryotní buňky je nejen velmi, velmi (!!) zjednodušený, ale není ani jedinou možnou cestou. Podle jiné hypotézy se mitochondrie, i anerobní hydrogenozomy a mitozomy (viz kap. 2. 3), vytvořily endosymbioticky dříve než pravé jádro, a to ze společného pra-prokaryota. Jaderná blána, i ostatní intracelulární membránový systém, se vytvořily později, a to nikoliv vchlipováním plazmatické membrány, ale splýváním amfipatických lipidů kolem chromozomu, tj. procesem podobným tvorbě základu prvotní plazmatické membrány. Tato cesta vzniku jaderné blány a endomembránového systému by nevyžadovala časnou existenci cytoskeletu, který je dnes pro vchlipování plazmatické membrány eukaryotní buňky nezbytný. Pozornost zasluhuje též hypotéza prvotní endosymbiózy s pre -prokaryotem typu cyanobakterií, ze kterých se vytvořily fotosyntetizující plastidy a později mitochondrie (viz též petit níže). „….Existuje (též) teorie, že genom mitochondrií nemá, mimo genů pro rRNA a tRNA, nic společného s původním genomem prokaryontního symbionta. Autor této teorie se domnívá, že více než bakteriálnímu chromozómu je mitochondriální DNA podobná bakteriálnímu plazmidu, který nese geny pro svou vlastní reprodukci spolu s několika geny pro dýchací enzymy. Tento plazmid původem z purpurových bakterií mohl podle autora v evoluci infikovat chloroplasty, vytěsnit jejich genom a proměnit je na mitochondrie…“. http://mujweb.cz/Veda/mitochondrie/7/7.htm
Spojováním isolovaných buněk, nebo neoddělováním buněk dceřiných, se asi před 0.5 mld let vytvořily pravděpodobně první vícebuněčné organizmy. Vazbu mezi buňkami umožnila tvorba mezibuněčné hmoty (extracelulární matrix, viz kap. 5. 1), adhezních bílkovin plazmatické membrány a specializovaných struk.mezibuněčnými spojů (viz . 2. 3 a 5.1).
2.2 Zvláštnosti prokaryotních buněk Prokaryotní buňky mají chromozomální DNA uloženou volně v cytoplasmě, tj. není oddělena membránovými obaly (nepravé jádro, nukleoid.syn. genofor). Chromozomální DNA má většinou cirkulární (kružnicové) uspořádání a pouze volně asociuje s bílkovinami Nukleoid má velmi dynamickou stukturu, která se mění s životním cyklem bakteriální buňky. Významnou roli při tom hrají tzv, histonům podobné proteiny, které se váží na DNA a podílejí se na vytváření vyšších prostorových struktur (terciární struktury). Chromozom může být připojen k výchlipce plazmatické membrány, mezozómu, který je však dnes považován za fixační artefakt. Geny eubakterií prakticky neobsahují introny. Častější jsou v genomu archeí především v genech kódujících ribozomální a transferovou RNA (viz kap.1.3.). V bakteriích se vykytují též malé cirkulární molekuly extrachromozomální DNA, tzv. plazmidy, tvořené nejčastěji 2 až 50 x 103 páry nukleotidů, které kódují bílkoviny, které nejsou pro život buňky nezbytné. Nicméně některé geny kódované plasmidy mohou přinášet bakteriím určité výhody – např. resistence na antibiotika, atp. Plazmidy si mohou bakterie volně vyměňovat, což zvyšuje jejich adaptabilitu na chemické škodliviny v okolí, vč. na antibiotika, vedoucí k vzniku nežádoucí resistence. Plazmidy jsou využívány v genovém inženýrství, jako nosiče (vektory) cizích genů do bakteriálních buněk (viz kap. 8).
Povrchová cytoplazmatická membrána většiny eubakterií obsahuje fosfolipidy, s výjimkou fosfatidylcholinu. Fosfolipidy umožňují tvorbu lipidického dvojlistu jako u buněk eukaryotních.
30
U prokaryot domény archea (i některých anaerobní eubakterií) však plazmatická membrána obsahuje fosfolipidy, ve kterých jsou řetězce alkylů připojeny k alkoholu vazbou nikoliv esterovou ale éterovou (viz níže). Tyto řetězce mají charakter izoprenoidů a spojují obě protilehlé lipidické molekuly „bez přerušení“. Nejde proto o lipidický dvojlist, ale de facto o list jeden. To zřejmě přispívá k přežívání těchto buněk v extrémních teplotních a chemických podmínkách. O výskytu a funkci těchto molekul viz kap. 3.1.7
Na rozdíl od eukaryot, eubakterie neobsahují v membránách sfingolipidy, velmi málo glykolipidů. Eu- i archebakterie obsahují málo, nebo žádné steroly (s výjimkou mykoplazmat). U prokaryot chybí schopnost osmotické regulace a pino- a fagocytózy. PM obsahuje bílkoviny, enzymy oxidační fosforylace, které slouží k přeměně energie organických látek okolí v ATP. U cyanobakterií tvoří PM malé invaginace, až tzv. thylakoidní váčky, které obsahují fotopigmenty schopné zachycovat část slunečního spektra a fotosynteticky tvořit ATP. Některé invaginace však mohou být artefaktem vznikajícím při zpracování bakterií pro elektronovou mikroskopii. Z povrchu některých bakterií odstupují vláknitá flagela, tvořená spirálně uspořádanou bílkovinou, flagelinem, sloužící k aktivnímu pohybu bakterií. Stavba a chemické složení bičíku je však zcela odlišné od bičíku eukaryotních buněk protozoí a živočichů (viz kap.1.2). Dalšími významnými vláknitými útvary na povrchu bakterií sou pili, tvořené specifickými proteiny. Ty se významně podílejí na mezibuněčné komunikaci a při kolonizaci povrchů, při vytváření tzv.. biofilmů. Delší flagela, vykonávají rotační pohyb, poháněný energií elektrochemického gradientu, tvořeného na PM v průběhu oxidačních reakcí. Na pohybu se může podílet i undulace zevní membrány. S výjimkou tzv. mykoplazmat je zevně od PM buněčná stěna a případně i další obal, kapsula. Buněčná stěna bakterií je tvořená různě silnou vrstvou peptidoglykanu (lineární polymer N-acetylglukózaminu- Nacetylmuramové kyseliny, je silná u tzv. grampositivních bakterií), který poskytuje bakteriím mechanickou pevnost. Důležitou součástí peptidoglykanu jsou krátké peptidové propojky, které obsahují L – i Daminokyseliny. U tzv. gram negativních bakterií (dle barvitelnosti Gramovou metodou) bakterií je peptidoglykanová vrstva tenká a zevně od ní je ještě permeabilní, tzv. zevní membrána; obsahuje kanálky, vystlané bílkovinami poriny, umožňujícími volný prostup větších molekul. Kapsula je tvořená vláknitými molekulami lipolysacharidu (kyseliny teikoové), které jsou vysoce imunogenní, tj. jsou velmi citlivě rozlišovány bílými krvinkami a makrofágy a vyvolávají tvorbu protilátek v organizmu. Zvyšují ale rovněž adhezní schopnosti bakterií a tím i jejich virulenci, tj. schopnost infikovat. (viz. Griffithův experiment s původcem pneumonie)
Syntéza bílkovin probíhá u bakterií na volných ribozomech, spojených molekulou mRNA v polyzomy. Ribozomy jsou menší (sedimentační konstanta 70S) než v eukaryotní buňce (sed.konst. 80S, viz kap.1.3). Menší jsou obě podjednotky ribozomů (30 a 50S vs. 40 a 60S u eukaryot, kde celý ribozom je 80S). Liší se i sedimentační konstanty a počet molekul RNA. Chybí 5.8S RNA ve velké podjednodce ribozomu . Translaci u prokaryot zahajuje tRNA nesoucí formyl methionin(fMet) na AUG iniciačním kodonu mRNA, zatímco u eukaryot je to methionin neformylovaný a vyžaduje se součinnost menšího počtu tzv. iniciačních faktorů.Další rozdíly v procesu translace i transkripce DNA viz kurz mikrobiologie. Messengerová RNA prokaryot má kratší poločas (sekundy až minuty), chybí její "sestřih" neboť ve většině případů neobsahuje introny (viz též shora). mRNA je polycystronická tj. nese informaci pro více než jeden peptid. 31
Rozdíly v proteosyntéze, umožňují selektivní inhibici růstu bakterií antibiotiky (tetracykliny, streptomycin, chloramfenikol, erythromycin, rifamycin a pod.), což se využívá např. v léčbě bakteriálních onemocnění.
Prokaryota mají podstatně více anaerobních a aerobních cest syntézy ATP než eukaryota. Prokaryota neobsahují cytoskelet. Množí se přímým binárním dělením, které následuje bezprostředně po replikaci chromozomu. Dělení není tedy provázeno periodickou kondenzací a dekondenzací chromozomu, ani tvorbou mitotického vřeténka. Oddělení dceřiných buněk zajišťuje vytvoření kontraktilního prstence ze speciálních tzv. Fts proteinů (FtsZ, FtsA, FtsK, FtsI), které se podílí na vchlipování povrchu, syntéze peptidoglykanů a dalších povrchových molekul i rozdělení chromozomů do dceřiných buněk (viz též níže a mitochondrie v kap.1.1.7). Kvůli absenci cytoskeletu bakteriím chybí schopnost pravé endocytózy (viz kap.1.1.5 a 3.1.3). Podle novějších poznatků mají archebakterie některými vlastnostmi (histonové bílkoviny, větší počet RNApolymeráz, iniciační amnokyselina při translaci metionin, citlivost k antibiotikům) blíže k eukaryotům, než eubakteriím. Více v Mikrobiologii a Vývojové biologii) Do živé přírody jsou někdy zahrnovány i viry, viroidy, virusoidy a event. i priony, jakožto nebuněčné formy živé hmoty. Mají rovněž relativně vysoký stupeň vnitřní organizovanosti, nemají však schopnost samostatného rozmnožování, ke kterému nezbytně potřebují hostitelskou prokaryotní nebo eukaryotní buňku. Jejich pozice ve fylogenezi je předmětem diskuse. Více v předmětech vývojové biologie, mikrobiologie a molekulární biologie. V tomto kurzu se s nimi nicméně setkáme při výkladu regulace buněčného dělení (viz tzv. vonkogeny, kap.3.5). Novinky vyžadující další potvrzení Bakterie s jádrem? Australští mikrobiologové objevili již druhou bakterii, která má svou DNA „uskladněnu“ ve zvláštní váčkovité organele obklopené cytoplazmatickou membránou. Bakterie se jmenuje rodovým jménem Pirellula a obývá různá prostředí ve slané i sladké vodě. J. Fuerst a M. Lindsayová, kteří pirellulu studovali, nazvali „schránku“ s DNA pirellulozom. Již před pěti lety byla objevena jiná bakterie (druhu Gemmata obscuriglobus) s podobným vnitřním uspořádáním. Ačkoliv jsou nově nalezené struktury u obou druhů odlišné, naznačují, že by ve světě bakterií mohlo jít o častější jev, než se dosud soudilo. Mikrobiologové hovoří žertem o tom, že bude třeba přepsat všechny učebnice. Nepřítomnost jádra byl totiž jeden z hlavních morfologických znaků odlišujících bakterie od eukaryotních buněk. Objevují se již také spekulace o možném vývojovém „mezičlánku“ mezi světem prokaryot a eukaryot. (New Scientist 154, 19, 1997) http://vesmir.msu.cas.cz/Pavel/bakterie.html http://www.zdrava-rodina.cz/med/med899/med899_3.html (sirné obrovské bakterie, s akceptorem elektronů dusičnany)
Ad fylogenetická příbuznost buněk “The common ancestry of eukaryotes, archaebacteria and eubacteria is well demonstrated by amino acid sequence comparisons of numerous proteins that are common to all three groups. On the other hand, there are a few proteins, like ubiquitin, that are common to eukaryotes and archaebacteria and which have yet to be observed in eubacteria. Some proteins appear to be wholly restricted to eukaryotes; this is especially true of cytoskeletal proteins. Recently, actin has been found by crystallography to be homologous with an ATP-binding domain found in a heat shock protein and several other proteins common to all three urkingdoms. This observation is puzzling on several counts. Most cytoskeletal proteins like actin and tubulin are very slow changing and must have been so for a very long time. How is it, then, that no sequence resemblance can be discerned with their alledged prokaryotic antecedents? The question is addressed by considering two bacterial fts proteins which appear to be related to actin, on the one hand, and tubulin, on the other. One answer may be that the rate of change of these proteins changed dramatically at a key point in their history. Another possibility is that eukaryotes are much older than some of their other proteins indicate” R.Doolittle, http://links.jstor.org/sici?sici=09628436(19950929)349%3A1329%3C235%3ATOAEOE%3E2.0.CO%3B2-M
Je DNA prokaryot vždy cirkulární? Linear plasmids and chromosomes were unknown in prokaryotes until recently but have now been found in spirochaetes, Gram-positive bacteria, and Gram-negative bacteria. Two structural types of bacterial linear DNA have been characterized. Linear plasmids of the spirochaete Borrelia have a covalently closed hairpin loop at each end and linear plasmids of the Gram-positive filamentous Streptomyces have a covalently attached protein at each end. Replicons with similar structures are more frequent in eukaryotic cells than in prokaryotes. Linear genomic structures are probably more common in bacteria than previously “…. práce týmu biologů z University of Iowa potvrzuje, že endosymbiont Paulinelly je vlastně nedávno pozřelá sinice z linie drobných oceánských sinic rodů Prochlorococcus a Synechococcus. Autoři studie osekvenovali cca 14 000 bází dlouhý fragment „plastidu“ Paulinelly a zjistili, že je jak sekvenčně, tak řazením jednotlivých genů velmi těsně blízký zmíněným sinicím. Paulinella chromatophora představuje luxusní evoluční model…, (který) představuje unikátní a zcela nedávnou evoluční událost, která již vstupuje do učebnic.
32
Ukazuje, že k endosymbióze plastidů může dojít a taky pěkně rázně dochází. Po ruce je i evoluční pohádka, jak k téhle endosymbióze mohlo dojít. Blízce příbuzný druh Paulinella ovalis je totiž heterotrofní měňavka bez jakéhokoliv náznaku plastidu. Živí se, nijak překvapivě, především sinicemi typu Synechococcus. „Plastidy“ Paulinelly jsou těmto dnešním hodně odvozeným sinicím bezprostředně příbuzné a tak jistě není těžké si domyslet zbytek“. Current Biology 16(17): R670-R672, Wikipedia.
http://www.osel.cz/index.php?clanek=2120 Dokonce, “……..some replicons may interconvert between circular and linear isomers. The molecular biology of these widely dispersed elements provides clues to explain the origin of linear DNA in bacteria, including evidence for genetic exchange between prokaryotes and eukaryotes”. Z: Linear plasmids and chromosomes in bacteria, J. Hinnebusch and K. Tilly Molecular Microbiology, 10:917-922, 1993 http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2958.1993.tb00963.x?cookieSet=1&journalCode=mmi Mají bakterie náznaky cytoskeletu? “…..In prokaryotes, numerous proteins are essential for cell division, such as FtsZ, which is encoded by filament-forming temperature-sensitive (fts) genes. FtsZ is the prokaryotic homolog of eukaryotic tubulin and is present in bacteria and archaea, and has also been identified in mitochondria and chloroplasts. FtsZ plays a key role in the initiation of cytokinesis. It self-assembles into the Z ring, which establishes the division plane during septation…”. M.C.M. Motta, http://www.bioone.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1368%2F10665234(2004)051%3C0394%3ATMAPFI%3E2.0.CO%3B2
Do živé přírody jsou někdy zahrnovány i viry, viroidy, virusoidy a event. i priony, jakožto nebuněčné formy živé hmoty. Mají rovněž relativně vysoký stupeň vnitřní organizovanosti, nemají však schopnost samostatného rozmnožování, ke kterému nezbytně potřebují hostitelskou prokaryotní nebo eukaryotní buňku. Jejich pozice ve fylogenezi je předmětem diskuse. Více v předmětech vývojové biologie, mikrobiologie a molekulární biologie. V tomto kurzu se s nimi nicméně setkáme při výkladu regulace buněčného dělení (viz tzv. vonkogeny, kap.1.6). Novinky vyžadující další potvrzení Bakterie s jádrem? Australští mikrobiologové objevili již druhou bakterii, která má svou DNA „uskladněnu“ ve zvláštní váčkovité organele obklopené cytoplazmatickou membránou. Bakterie se jmenuje rodovým jménem Pirellula a obývá různá prostředí ve slané i sladké vodě. J. Fuerst a M. Lindsayová, kteří pirellulu studovali, nazvali „schránku“ s DNA pirellulozom. Již před pěti lety byla objevena jiná bakterie (druhu Gemmata obscuriglobus) s podobným vnitřním uspořádáním. Ačkoliv jsou nově nalezené struktury u obou druhů odlišné, naznačují, že by ve světě bakterií mohlo jít o častější jev, než se dosud soudilo. Mikrobiologové hovoří žertem o tom, že bude třeba přepsat všechny učebnice. Nepřítomnost jádra byl totiž jeden z hlavních morfologických znaků odlišujících bakterie od eukaryotních buněk. Objevují se již také spekulace o možném vývojovém „mezičlánku“ mezi světem prokaryot a eukaryot. (New Scientist 154, 19, 1997) http://vesmir.msu.cas.cz/Pavel/bakterie.html http://www.zdrava-rodina.cz/med/med899/med899_3.html (sirné obrovské bakterie, s akceptorem elektronů dusičnany)
Ad fylogenetická příbuznost buněk “The common ancestry of eukaryotes, archaebacteria and eubacteria is well demonstrated by amino acid sequence comparisons of numerous proteins that are common to all three groups. On the other hand, there are a few proteins, like ubiquitin, that are common to eukaryotes and archaebacteria and which have yet to be observed in eubacteria. Some proteins appear to be wholly restricted to eukaryotes; this is especially true of cytoskeletal proteins. Recently, actin has been found by crystallography to be homologous with an ATP-binding domain found in a heat shock protein and several other proteins common to all three urkingdoms. This observation is puzzling on several counts. Most cytoskeletal proteins like actin and tubulin are very slow changing and must have been so for a very long time. How is it, then, that no sequence resemblance can be discerned with their alledged prokaryotic antecedents? The question is addressed by considering two bacterial fts proteins which appear to be related to actin, on the one hand, and tubulin, on the other. One answer may be that the rate of change of these proteins changed dramatically at a key point in their history. Another possibility is that eukaryotes are much older than some of their other proteins indicate” R.Doolittle, http://links.jstor.org/sici?sici=09628436(19950929)349%3A1329%3C235%3ATOAEOE%3E2.0.CO%3B2-M
Je DNA prokaryot vždy cirkulární? Linear plasmids and chromosomes were unknown in prokaryotes until recently but have now been found in spirochaetes, Gram-positive bacteria, and Gram-negative bacteria. Two structural types of bacterial linear DNA have been characterized. Linear plasmids of the spirochaete Borrelia have a covalently closed hairpin loop at each end and linear plasmids of the Gram-positive filamentous Streptomyces have a covalently attached protein at each end. Replicons with similar structures are more frequent in eukaryotic cells than in prokaryotes. Linear genomic structures are probably more common in bacteria than previously “…. práce týmu biologů z University of Iowa potvrzuje, že endosymbiont Paulinelly je vlastně nedávno pozřelá sinice z linie drobných oceánských sinic rodů Prochlorococcus a Synechococcus. Autoři studie osekvenovali cca 14 000 bází dlouhý fragment „plastidu“ Paulinelly a zjistili, že je jak sekvenčně, tak řazením jednotlivých genů velmi těsně blízký zmíněným sinicím. Paulinella chromatophora představuje luxusní evoluční model…, (který) představuje unikátní a zcela nedávnou evoluční událost, která již vstupuje do učebnic. Ukazuje, že k endosymbióze plastidů může dojít a taky pěkně rázně dochází. Po ruce je i evoluční pohádka, jak k téhle endosymbióze mohlo dojít. Blízce příbuzný druh Paulinella ovalis je totiž heterotrofní měňavka bez jakéhokoliv náznaku plastidu. Živí se, nijak překvapivě, především sinicemi typu Synechococcus. „Plastidy“ Paulinelly jsou těmto dnešním hodně odvozeným sinicím bezprostředně příbuzné a tak jistě není těžké si domyslet zbytek“. Current Biology 16(17): R670-R672, Wikipedia.
http://www.osel.cz/index.php?clanek=2120 Dokonce, “……..some replicons may interconvert between circular and linear isomers. The molecular biology of these widely dispersed elements provides clues to explain the origin of linear DNA in bacteria, including evidence for genetic exchange between prokaryotes and eukaryotes”. Z: Linear plasmids and chromosomes in bacteria, J. Hinnebusch and K. Tilly Molecular Microbiology, 10:917-922, 1993 http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2958.1993.tb00963.x?cookieSet=1&journalCode=mmi Mají bakterie náznaky cytoskeletu? “…..In prokaryotes, numerous proteins are essential for cell division, such as FtsZ, which is encoded by filament-forming temperature-sensitive (fts) genes. FtsZ is the prokaryotic homolog of eukaryotic tubulin and is present in bacteria and archaea, and has also been identified in mitochondria and chloroplasts. FtsZ plays a key role in the initiation of cytokinesis. It self-assembles into the Z ring, which establishes the division plane during septation…”. M.C.M. Motta, http://www.bioone.org/perlserv/?request=get-document&doi=10.1368%2F10665234(2004)051%3C0394%3ATMAPFI%3E2.0.CO%3B2
33
2. 3 ORGANELY ENDOMEMBRÁNOVÉHO SYSTÉMU (ES) A
MITOCHONDRIE (Obr. 3 C, 6-16)
2.3.1 Společné znaky membránových organel 2.3.2 Endomembránový systém 2.3.8 Mitochondrie a hydrogenozomy
2. 3. 1 Společné znaky membránových organel. Základní molekulární stavba VŠECH membránových organel, vč. mitochondrií je podobná. Společný strukturální základ je jednotková membrána (unit membráně). Mnoho poznatků o molekulární stavbě biomembrán bylo získáno studiem plazmatické membrány, především erytrocytů (viz níže). Základem všech biomembrán je lipidový dvojlist, skrze který procházejí, nebo jsou k němu jen připojeny, peptidické řetězce (obr.9 a níže). Průměrná šířka biomembrán je 7.5 nm a nejsou proto viditelné ve světelném mikroskopu. V běžném elektronovém mikroskopu (EM) se zobrazují pouze jako jednoduchá, tenká linie. Při použití mimořádně vysoce rozlišovacího EM pak tvoří typickou sendvičovitou „trojvrstvu“ viz níže v této kapitole). Molekuly biomembrán mají za tělesné teploty podobu „tekutého krystalu“, či fluidní mozaiky ( viz níže). Membrány jednotlivých organel však vykazují řadu kvantitativních i kvalitativních rozdílů v obsahu i složení lipidických a bílkovinných molekul, z nichž některé (PM) mají na svých koncích i sacharidová residua. Molekulové specifiky a jejich funkce budou uvedeny u jednotlivých komponent ES v této kapitole a v kap.3. # Membránové lipidy Lipidy tvoří "nosnou" vrstvu všech biomembrán. Odpovídají též za tzv. polopropustnost (semipermeabilitu, viz též níže) biomembrán, tj. větší propustnost pro malé a nepolární molekuly a látky rozpustné v tucích. Lipidické molekuly se mohou podílet i na i na přenosu informací do buňky, a to cestou syntézy biologicky aktivních molekul, např.některých tzv. druhých poslů (nebo jiných signalizačních molekul, např. prostaglandinů), které zajišťují přenos biologických signálů od receptorů na povrchu do buňky (kap.3.4). Hlavní skupinou lipidů biomembrán jsou fosfolipidy (viz kap. 1.1). Jsou uspořádány v charakteristický dvojlist, který se ve vodní fázi spontánně tvoří v důsledku jejich amfifilni povahy (viz shora kap. 1.1). Fosfolipidy se totiž ve vodní prostředí orientují svými hydrofobními, tj. nesmáčivými konci (řetězce mastných kyselin) k sobě, zatímco jejich opačné hydrofilní konce, tzv. hlavičky, směřují k vodnímu rozhraní. Tento proces, tzv. autoorganizace amfipatických molekul, byla pravděpodobně rozhodující pro vznik života vůbec (viz kap.2.1). Chemické spektrum fosfolipidů obsažených v zevním a vnitřním listu nebývá shodné. Největší rozdíly, tj. asymetrie tohoto spektra, jsou v plazmatické membráně, viz níže). V zevním listu převládá zpravidla fosfatidylcholín (lecitín) a minoritní sfingomyelin (obsahuje místo glycerolu 18- ti uhlíkový dvojsytný alkohol sfingosin, viz kap. 1.1. Je častý v myelinových obalech nervových vláken, viz nervová tkáň, kap. 10). Ve vnitřním listu 34
lipidické dvojvrstvy PM převládá fosfatidyletanolamin (kefalín), fosfatidylserin a fosfatidylinositol, difosfatidylglycerol- kardiolipin (vysoce zastoupený ve vnitřní membráně mitochondrií, viz kap. 2.3). Ke ztrátě asymetrie lipidické složení PM dochází při programované smrti, apoptóze (přesun fosfatidylserimu do zevního listu je signálem pro fagocytózu poškozené buňky makrofágy, viz kap. 3.1). Mezi fosfolipidy jsou vmezeřené molekuly cholesterolu, které snižují fluiditu biomembrán. Další minoritní lipidickou složkou některých biomembrán, především PM jsou glykolipidy (glykozylsfingolipidy, cerebrozidy, gangliozidy, viz kap.1.1). Fosfolipidy membrán archeí a některých anerobních bakterií (kap.3.3.) mají většinou na jednom uhlíku glycerolu navázaný izoprenoidový řetězec vazbou éterovou a nikoliv esterovou, jak tomu je u jiných fosfolipidů. Tento typ fosfolipidů se však vyskytuje i v eukaryotních buňkách, především neuronech a jejich myelinových obalech nebo v plazmatické membráně spermií. Ovlivňují fluiditu membrán, jsou zdrojem biologicky aktivních molekul, působí jako „zhášeči“ kyslíkových radikálů (viz kap. 4.1). Snižují povrchové napětí. U spermií podporují splynutí plazmatické membrány spermie a vajíčka (tzv. fuzogení efekt). Tuto funkci mají i v nervových synapsích, kde podporují splynutí (fuzi) synaptických váčků s presynaptickou membránou (viz kap. 5.2) při přenosu nervového vzruchu mezi neurony.
# Membránové bílkoviny Bílkoviny jsou další důležitou složkou biomembrán. Plní řadu specifických funkcí (receptory, enzymy, přenašeče, iontové kanály, adhezní molekuly a pod, viz níže kap. 2.3, 3.1, 3.4, 5.1). Peptidické řetězce některých bílkovin biomembrán prostupují („prošívají“) jejich lipidickou vrstvu jednou nebo vícekrát. Tyto bílkoviny se označují jako integrální. Jsou připojeny vodíkovými vazbami nebo elektrostatickými silami k polárním koncům vysoce dynamických fosfolipidů, v důsledku čehož molekuly bílkovin se v membráně přemisťují, v horizontální rovině „plavou“. Viz níže model fluidní mozaiky biomembrán. Viz níže. Jeden transmembránový helix mají např. bílkoviny PM s mechanickou funkcí (např. některé adhezní molekuly, 7 helixů má velká skupina bílkovin PM s receptorovými funkcemi. Změna jejich konformace vyvolaná navázáním specifické ligandy/agonisty (např. hormonu) z okolí buňky se přenese na cytoplazmatickou stranu PM, kde aktivuje další bílkoviny, ktwerými se přenáší signál do buňky (viz receptorový příjem informací, kap. 3.4). Bílkoviny periferní (syn. asociované) pouze „přiléhají“ k zevní, či vnitřní straně PM. Jsou připojeny vodíkovými nebo elektrostatickými silami k integrálním bílkovinám, nebo přichyceny k lipidové dvojvrstvě pomocí tzv. molekulární kotvy. „Kotvou“ na cytozolické straně membrány bývá delší saturovaná mastná kyselina (myristylová, 14C, palmitová, 16C s acylovou vazbou na N-koncovém glycinu proteinu), nebo nenasycená skupina farnesylová (15C) nebo geranylgeranylová (C20), navázaná na cysteinová residua proteinu. Souborně, jde o tzv. prenylaci proteinu. Na zevní-exoplasmické straně membrány slouží jako kotva glykosylfosfatidylinozitol (GPI kotva) Integrální bílkoviny biomembrán lze oddělit od lipidové dvojvrstvy pouze chemickými detergenty, periferní bílkoviny lze oddělit bez narušení vrstvy lipidů. Každý peptid má 2 hydrofilní konce, tzv. C- a N- konce (COOH- a NH2-), které mohou být na opačných nebo stejné straně membrány (více v Molekulární biologii).
Poměr obsahu bílkovin a tuků se liší dle typu buněk a typu membránových organel. Relativně nejvíce bílkovin je v plazmatické membráně. V elektron-mikroskopickém zobrazení (na velmi výkonných, nikoliv běžných přístrojích)po obarvení kyselinou osmičelou (OsO4), mají biomembrány buněk na příčném řezu typickou troj-vrstevnou strukturu. Ta je tvořena středním –širším a světlejším pruhem, odpovídajícím hydrofobní část lipidické dvojvrstvy na kterou se neváže hydrofilní OsO4. 35
Světlá vrstva je lemovaná 2 užšími a tmavšími vrstvami obsahujícími hydrofilní složky lipidů a bílkoviny, na které se OsO4 váže a pohlcuje procházející elektrony. Výsledkem tmavým efektem na obrazovce mikroskopu) Viz obr. 9 A,B Herakleitos: Panta rei (vše teče)
☺ Fluidně mozaikový model
biomembrán
Tanec lipidů
Řetězce mastných kyselin fosfolipidů biomembrán jsou v neustálém a velmi rychlém pohybu, a to kolem své osy (107krát za sec), v rovině membrány-laterální difúze, 1-2 um/sec. Relativně velmi pomalý je pohyb v rovině vertikální (flip-flop pohyb), tj. překlápění ze zevního do vnitřního listu dvojvrstvy (v intervalech několika hodin), což je nezbytné pro tvorbu biomembrán de novo v hl-ER (viz shora). Jak již uvedeno shora, bílkoviny jsou v lipidické vrstvě biomembrán "rozpuštěny" (volně připojeny) prostřednictvím elektrostatických a vodíkových vazeb. Mohou se k sobě přibližovat v rovině membrány a spolu reagovat (viz níže). Biomembrány mají proto za tělesné teploty podobu „tekutého krystalu“, či fluidní mozaiky (Singer a Nicholson 1971). Tento model biomembrán nahradil dřívější, tzv. sendvičový model (Danielli a Robertson 1952), kde bílkoviny byly lokalizovány v souvislé vrstvě na obou stranách dvojlistu lipidů.
Fluidně-mozaikový model biomembrán vedl k převratu v chápaní jejich funkce, především plazmatické membrány a její úlohy při příjmu látek a informací z okolí (viz kap.3.4). Vzájemné přiblížení se sousedních bílkovin, umožněné fluiditou membrány, vede totiž zpravidla k aktivaci jejich funkce, např. enzymatické aktivity, která pak spouští další procesy uvnitř buňky (viz např. kap. 3.4, transdukce signálů přes PM). Obecně platí, že vyšší stupeň fluidity mají membrány s větším zastoupením více pohyblivých fosfolipidů s nenasycenými mastnými kyselinami. Membránovou fluiditu (mikroviskozitu) snižuje vysoce hydrofobní cholesterol, který omezuje pohyb fosfolipidů. Při větším poklesu teploty cholesterol brání rychlé změně ze stavu sol v gel. Stupeň fluidity membrán značně ovlivňuje rovněž okolní teplota. Cholesterol chybí v membránách buněk rostlin bakterií, kde bývá však nahrazen jinými steroly, což je mj. významné dieteticky.
Fluidita biomembrán, a tím i pohyblivost bílkovin, se zvyšuje po navázání specifické signální molekuly, např. hormonu na receptorové bílkoviny plazmatické membrány. Fluidita membrán je zpravidla vysoká v dělících se a diferencujících se buňkách. Jistá omezení přemísťování v PM jsou v morfologicky a funkčně polarizovaných buňkách. V epiteliálních buňkách nedochází např. k přesunům bílkovin mezi apikálním a bazálním pólem, neboť by tím došlo k narušení funkčních odlišností PM na obou pólech. Překážku představují mezibuněčné spoje a vazba integrálních bílkovin PM na cytoskelet a extracelulární matrix.
2. 3. 2 Endomembránový systém (ES) ES tvoří plazmatická membrána, jaderná blána endoplasmatické retikulum, Golgiho aparát, lysozomy, endozomy a transportní váčky, vakuola a peroxisomy. Jednotlivé typy organel ES představují specializované metabolické a funkční oddíly, kompartmenty. Jejich membrány mohou mezi sebou splývat a přecházet tak z jedné organely do druhé, vč. plasmatické membrány (tzv. tok membrán). Organely ES úzce kooperují při výkonu řady základních metabolických procesů a funkcí. To je dobře patrno např. při syntéze a transportu bílkovin, na kterých se podílí většina organel ES (kap. 3.3). 36
Zdrojem biomembrán ES je hladké endoplazmatické retikulum (hl-ER), kde se tvoří insercí lipidů a proteinů do již existující membránové matrice tj. způsobem, který připomíná tkaní látky na tkalcovském stavu. Fosfolipidy jsou syntetizovány enzymy v zevním- cytozolickém listu hl-ER z glycerolu, koenzymuA a mastných kyselin přítomných v cytozolu. Syntézy fosfatidylcholinu zajišťuje např. acyltransferáza, fosfatáza, cholinfosfotransferáza, tvořícími postupně z uvedených prekurzorů glycerolfosfát, fosfatidovou kyselinou a diglycerid na který se v konečném stupni naváže cholin. Do protilehlého (luminálního) listu hl-ER jsou následně „překlopeny“ enzymy- flipázami. Tomuto překlopu nepodléhají glykolipidy, které zůstávají v zevním listu a v konečném umístění i na povrchu plazmatické membrány (viz níže)
Následuje inzerce bílkovin tvořených v hr-ER. Nově tvořená membrána se posléze odděluje od hl-ER formou váčku, který splývá s membránami cílových organel (viz též váčkový transport, kap.3.1). Tímto způsobem se může zvětšovat a obnovovat povrch buňky i ostatních organel ES. Proces se označuje jako „tok membrán“ v buňce. Obnova biomembrán ES je poměrně rychlá. Poločas obnovy např. PM kolísá v hodinách až dnech. 2. 3. 2. 1 PLAZMATICKÁ MEMBRÁNA (PM) (obr. 9) PM představuje rozhraní mezi buňkou a okolím, které zajišťuje výběrový příjem látek a signálů z okolí, ať již z extracelulárního prostoru nebo od okolních buněk, či extracelulární matrix . I když má PM stejnou základní molekulární stavbu jako ostatní biomembrány, vykazuje některé důležité rozdíly. Lipidová dvojvrstva PM má značně asymetrické spektrum fosfolipidů. Ve vnější polovině jsou více zastoupeny fosfolipidy obsahující cholin (fosfatidylcholin = lecitin a sfingomyelin). Ve vnitřním listu dvojvrstvy převažují fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin a fosfoinositidy. Obsah cholesterolu je v PM vyšší než v ostatních membránách buňky. V zevním listu PM jsou i molekuly glykolipidů, které chybí v ostatních membránových organelách. Lipidy PM představují nejen nosnou vrstvu pro ostatní molekuly PM, ale účastní se též aktivně na přenosu chemických signálů od receptoru do nitra buňky (viz tvorba tzv. sekundární poslů z membránového fosfatidylinositolu (kap. 3.4). Mezi molekulami fosfolipidů v obou lipidických listech PM jsou vmezeřeny (interkalovány) četné molekuly vysoce hydrofobního cholesterolu (viz shora vliv na fluiditu PM). V membránách některých buněk , např. mozkových buněk, jsou významnou složkou i sfingoglykolipidy (cerebrozidy). PM některých eukayotních buněk obsahuje též tzv. acetálové (esterové) lipidy, které tvoří jsou hojné v membránách archeí a některých anerobních bakterií (kap.2.1.). Týká se to např. neuronů, bílé hmoty, kardiomyocytů, spermií, krevních destiček. Ovlivňují fluiditu membrán, působí jako zhášeče kyslíkových radikálů (viz kap. 4.1). U spermií mají fusogení efekt tj. podporují splynutí plazmatické membrány spermie a vajíčka. Viz též plazmalogeny na Internetu a níže jejich syntézu v peroxizomech.
Lipidy i bílkoviny PM mohou nést, na rozdíl od membrán jiných organel, na zevní straně buňky cukerná zakončení (glykoproteiny a glykolipidy). Funkce bílkovin PM: Receptory, např. peptidických hormonů, růstových faktorů, cytokinů, biogenních aminů a dalších důležitých biologických signálů (viz kap. 3.4. a předmět fyziologie) Přenašeči (transportéry) iontů, malých organických molekul z okolí do buňky, z buňky do buňky nebo z buňky ven (kap.3.1) 37
Iontové kanály (viz kap. 3.1) Enzymy (např. Na+K+ ATPáza, viz kap. 3.2, G-proteiny viz kap.3.4 aj.) Adhezní bílkoviny, které zajišťují soudržnost, adhezi, buněk mezi sebou a mezi buňkami a mezibuněčnou hmotou (syn. extracelulární matrix) v tkáních (viz kap. 5.1). V některých místech PM se mohu tvořit shluky (mikrodomény) bílkovin a lipidů – tzv. ráfty (raft angl.vor), které představují "pohotovostní reservu vybraných molekul" (tzv.pool) pro transport některých molekul a receptorovou signalizaci do buňky. Ráfty jsou mikrodomény PM obohacené sfingoglykolipidy (sfingomyelin), cholesterolem a některými bílkovinami, např. kaveoliny, trimerními a momerními G-proteiny aj., viz níže). Řetězce mastných kyselin sfingoglykolipidů jsou v ráftech delší (jsou více "nataženy" neboť mají méně dvojných vazeb) a molekuly jsou blíže u sebe. To, spolu s vyšším obsahem cholesterolu, vytváří nano-ostrůvky s větší tloušťkou a nižší fluiditou. Tyto ostrůvky proto „plavou jako vory" v okolní, tekutější lipidické fázi PM. Rafty tak představují preformovanou hotovost („ pool“) signálních a transportních molekul, především receptorového typu (viz kap. 3.4) Segmenty PM obohacené bílkovinou kaveolinem se uplatňují ve váčkovém transportu cholesterolu do buňky (viz kap. 3.1).
Bílkoviny asociované (periferní) se často účastní na přenosu informací od receptoru do buňky (např. GTP vážící proteiny, enzymy syntetizující tzv. sekundární posly apod.(viz kap. 3.4) Glykoproteiny a glykolipidy, spolu s dalšími okolními glykany, tvoří tzv. buněčný glykokalyx, který obsahuje četné anionické skupiny, především kyseliny N-acetyl-neuraminové (sialové). Výsledkem je elektricky negativně nabité pole v této "vzdálenější" oblasti PM, které se uplatňuje v buněčných interakcích, např. při migraci buněk v časných stádiích vývoje zárodku. Pozor: Na bezprostředním povrchu má PM náboj positivní, viz KMP níže kap. 3.1
Sacharidy tvoří zhruba 8% hmoty PM; nejčastěji se vyskytuje D- glukóza, D-manóza, Lfukóza, kyselina N-acetyl-neuraminová (sialová), N-acetyl-D-glukozamin a N-acetyl-Dgalaktozamin. Cukerná zakončení bílkovin a lipidů plazmatické membrány výrazně zvyšují jejich strukturální polymorfii a tím i jejich receptorovou variabilitu a specifitu pro vazbu signálních molekul přicházejících z okolí buňky. Úloha PM v adhezi a mezibuněčných komunikacích (obr.12-14) Specifické skupiny integrálních bílkovin PM zajišťují vazbu buněk mezi sebou a buněk s extracelulární matrix (viz 5.1) v tkáních a při některých funkčních procesech (viz níže). Hlavní skupiny těchto tzv. adhezních molekul jsou: (i) cadheriny, (ii) Ig -superfamily CAMstj. Adhezní molekuly tzv. imunoglobulinové super-rodiny a (iii) integriny (iv) selektiny a (v) CD44 skupina molekul. Funkce adhezních bílkovin je nezastupitelná při tvorbě a udržování tkáňových struktur (skupiny i-iv). Některé adhezní bílkoviny jsou četnější v místech tzv. mezibuněčných spojení (viz níže). Adhezní bílkoviny umožňují specializovanou mechanickou a signalizační komunikaci mezi buňkami a buňkami a extracelulárním prostředím, mezibuněčnou hmotou v tkáních (syn. extracelulární matrix, viz kap. 5.1). Většina z nich svým intracelulární koncem reaguje rovněž s molekulami intracelulárních signalizačních kaskád (viz kap. 3.4) řídících základní buněčné funkce, např. buněčné dělení, migrace buněk za vývoje (viz níže), vycestovávání leukocytů z krevního řečiště, adheze spermie k vajíčku v procesu oplozování (viz kap. 6.2), polarizaci epiteliálních buněk (kap. 5.2) apod. 38
Přesuny (migrace) buněk jsou masivní při tvorbě zárodečných listů, tkání a orgánových základů (blastogeneze, histogeneze a organogeneze, viz kap. 6.3). Adhezní molekuly slouží jako rozpoznávací znaky buněk určující jejich konečnou tkáňovou a orgánovou lokalizaci.
Mutace adhezních molekul vedou k vážným onemocněním, např. kůže. Jsou i jednou z příčin metastazování nádorových buněk (schopnosti přemístit se z místa primárního ložiska nádoru do jiného orgánu). Hlavní skupiny (rodiny) adhezních molekul podrobněji: Kadheriny. Jsou široce zastoupené v PM v různých typech tkání a orgánů. Vyžadují pro svou funkci přítomnost Ca2+ iontů. Spojují buňky mezi sebou v tkáňových strukturách. Jsou četné v bodových desmozomech. Liší se svým složením v různých typech tkání. E-cadheriny se vyskytují v epiteliálních tkáních; N-cadheriny v nervové tkáni, myokardu a čočce; P-cadheriny, v placentě a epidermis. Svým intracelulárním koncem kontaktují bílkoviny membránového cytoskeletu, především molekuly typu kateninů (3.4). Molekuly imunoglobulinové skupiny (Ig -superfamily CAMs). Jsou na Ca2+ nezávislé glykoproteiny PM. Obsahují segment aminokyselinových sekvencí, který je společný všem imunoglobulinům. Uplatňují se především v komunikaci mezi endotheliálními buňkami cév a buňkami imunitního systému. Vyskytují se v několika buněčně specifických izoformách označovaných zkratkami ICAM 1-3 a VCAM. Integriny. Jsou tvořeny 2 odlišnými podjednotkami (α, β heterodimer), které mají značně variabilní strukturu. Fungují jako nízko afinitní receptory pro fibronektin mezibuněčné hmoty (extracelulární matrix, viz obr.14 C), od které přebírají signály regulující adhezi, proliferaci a další funkce buněk. Na cytoplazmatické straně se přes další bílkoviny (vinkulin, talin, alfa aktinin, kap.3.4) integriny spojují s aktinovými mikrofilamenty v cytoplasmě. Existuje poměrně velký počet izoforem obou podjednotek a jejich kombinací. Selektiny jsou Ca++ dependentní molekuly plazmatické membrány, které se váží na sacharidovou složkou mudínům podobných adhezních molekul sousedních buněk. Uplatňují se především v interakcích cévní výstelky a krevních buněk. Vyskytují se v několika buněčně specifických izoformách (L-leukocytární, P (Platelet-destičkový, E-Endotheliální) Vzhledem k tomu, že selectiny rozpoznávají a váží chemicky definované sacharidové molekuly, řadí se rovněž mezi tzv. lektiny. CD44 skupina molekul se rovněž váží na extracelulární sacharidové molekuly, především kyselinu hyaluronovou, ale i některé další molekuly. Slouží k mechanické a signalizační komunikaci mezi buňkami a extracelulární matrix Podobně jako integriny, svým intracelulární koncem interagují v buňce s molekulami signalizačních kaskád a uplatňují se tak v regulaci buněčného dělení, migrace, tvaru buněk, genové exprese i přežívání buněk. Jejich mutace jsou jednou z příčin metastazování nádorových buněk (schopnosti přemístit se z místa primárního ložiska nádoru do jiného orgánu).
Mezibuněčné spoje (Intercellular junctions). V některých místech PM se adhezní molekuly vyskytují ve větším množství a PM vytváří speciální struktury, tzv. mezibuněčná spojení (intercellular junctions). Dle funkce je lze rozdělit do 3 hlavních skupin: (i) spoje těsnící (ii) zpevňující a (iii) vodivé (komunikační), z nichž některé mají další podskupiny (a-d). Toto členění se v poslední době opouští, neboť se ukázalo, že některé spoje plní více funkcí, např. zpevňující i komunikační (spoje mezi buňkami a extracelulární matrix), nebo zpevňující i morfogenetickou (viz pásové desmozomy). Nicméně, tato starší klasifikace usnadňuje zapamatování a proto použito v následujícím výkladu. Ad (i) Těsnící spoje, vznikají adhezí bílkovin zevních listů PM přilehlých buněk. Occludin a claudin-1 jsou peptidy procházející 4x PM. Peptid JAM 1x. Tyto spoje jsou časté mezi apikálními póly epiteliálních buněk slizničních výstelek, nebo mezi endothelovýcmi buňkami kapilár mozku a varlat. Výsledkem je oboustranná neprostupnost molekul, vč. malých organických (glukóza, aminokyseliny a pod), např. střevním obsahem a krví nebo krví a mozkovým či testikulárním parenchymem 39
Ad (ii) Zpevňující spoje, jsou pásová nebo bodová ztluštění membrán přiléhajících buněk, s úponem mikrofilament nebo středních filament cytoskeletu. Vyskytují se v tkáních, které jsou mechanicky namáhány (epidermis, myokard a pod). Jejich hlavní podskupiny jsou: a) Pásové desmozomy (syn. zonula adherens, adherent belts), jsou ztluštění PM tvořené kadheriny, ke kterým se uvnitř buňky připojují přes menší bílkovinné mezičlánky (cateniny, vinculin) svazky aktinových mikrofilament. Vytváří se tak kontraktilní prstenec mezi apikálními částmi epiteliálních buněk, který realizuje některé morfogenetické procesy v embryonálním vývoji (např. tvorba neurální rýhy a posléze trubice). b) Bodové desmozomy (syn. macula adherens, nebo jen desmozomy), představují symetrická knoflíkovitá ztluštění PM sousedních buněk, obsahující četné speciálními bílkoviny (desmoglein a desmocollin ze skupiny kadherinů). Na vnitřní straně se přes menší bílkovinné mezičlánky (kateninům podobný plakoglobin a desmoplakiny) upínají bočně na střední filamenta cytoskeletu. Významně přispívají k soudržnosti buněk v tkáních. c) Hemidesmozomy, s úpony středních filament, zpevňují vazbu mezi epiteliálními buňkami a extracelulární matrix. Vazbu zprostředkovávají adhezní molekuly PM integrinového typu laminin extracelulární matrix. d) Fokální spoje se často vyskytují při bázi epiteliálních buněk. Spojují integriny PM s fibronektinem extracelulární matrix, např. basální laminy epiteliálních tkání. V buňce na tyto spoje navazují paprsčitě uspořádaná mikrofilamenta (stress fibers). Ad (iii) Vodivé (komunikační) spoje (a) nexus (syn. gap junction, elektrická synapse, též spoje dírkaté či mezerové), umožňuje volný a rychlý přesun iontů a malých molekul z buňky do buňky; průchod se uskutečňuje přes příčně orientované mikrokanálky, konexony, které jsou tvořeny molekulami speciálních bílkovin. Vyskytují se často v embryonálních tkáních. V dospělosti jsou v myokardu, mozku, mezi osteocyty kostní tkáně apod. (b) chemické synapse. Jsou speciální spoje vyskytující se pouze v nervovém systému a ve svalech (nervosvalová zakončení, neuromuskulární ploténky). Jsou tvořeny presynaptickým "knoflíkem", synaptickou štěrbinou a postsynaptickou částí. V presynaptickém oddílu jsou drobné vesikuly (synaptické váčky), které obsahují signální molekuly, neurotransmitery, které se vlivem depolarizace okolní PM vylévají cestou exocytózy do synaptické štěrbiny. Navazují se na receptory v postsynaptické membráně, kterými jsou často iontové kanály, jejichž otevření vede k depolarizaci postsynaptické membrány a tím i přenosu nervového impulsu na další neuron, nebo z nervového zakončení na sval. 2. 3. 2. 2 ENDOPLAZMATICKÉ RETIKULUM (ER) (obr. 6-13)
membránový labyrint ??
ER představuje nepravidelnou síť vzájemně propojených plochých cisteren a tubulů. ER je v dynamickém strukturálním i funkčním vztahu k ostatním organelám endomembránového systému, především k PM, endozomálně -lysozomálnímu systému, Golgiho aparátu, peroxizomům, vakuole, bláně jaderné. K membránám ER mohou být připojeny ribozomy, čímž vzniká tzv. drsné či hrubé ER (hr-ER). Ostatní ER je tzv. hladké ER
40
2. 3. 2. 3 Hladké ER ( Hl-ER) Hl-ER je místem syntézy lipidů, především fosfolipidů pro novotvorbu buněčných membrán. Tvorba buněčných membrán probíhá tak, že se do již existující membránové „předlohy“ vkládají nové lipidické molekuly (jako do tkanina vycházející z tkalcovského stavu, viz shora). Více v Molekulové biologii. Nově vytvořené membrány opouští hl-ER ve formě váčků, které posléze splývají s ostatními organelami ES (viz shora „tok“ membrán v buňce, kap. 2.2). V hl-ER se syntetizuje též cholesterol a steroidy a glykogen. Probíhá zde detoxifikace škodlivých a cizorodých látek, nejčastěji jejich oxidací, redukcí nebo konjugací s kyselinou glukuronovou, což činí tyto látky rozpustnými ve vodě a snáze vylučitelnými z organizmu ledvinami. Hl-ER obsahuje rovněž pohotovostní zásobu kalciových iontů, které se mohou přechodně uvolňovat do cytozolu a aktivovat řadu buněčných funkcí (svalová kontrakce, příjem signálů přes některé receptory, sekrece, apod., viz kap. 3.4). Tyto funkce zajišťují membránově vázané i volné bílkoviny hl-ER (přenašeče, enzymy, iontové kanály, viz níže) Např. ionty kalcia přecházejí z hl-ER do cytozolu speciálními iontovými kanály a z cytozolu zpět jsou čerpány proti koncentračnímu spádu specifickými Ca++ATPázami. Detoxifikační oxidázy spolupracují s NADPH a NADH, dvojmocnými kationty a molekulovým kyslíkem. Klíčovou úlohu mají cytochromy P 450. Více ve výběrovém kurzu Obecná patobiologie buněk a tkání. Detofixikace je vícestupňový proces, který původně sloužil k metabolismu krevního barviva, steroidních hormonů, přirozených toxinů z potravy apod. Dnes i látek uměle syntetizovaných člověkem, vč. mnoha léků. Bohužel, některé meziprodukty vznikající např. při detoxifickaci polycyklických uhlovodíků (vyskytují se i cigaretovém kouři), jsou však silně kancerogenní. V hl_ER probíhá též minoritní tzv. ω-oxidace mastných kyselin s delším uhlíkovým řetězcem. Viz β- oxidaci v mitochondriích.
2. 3. 2. 4 Hrubé ER a ribozomy (Hr-ER, syn. drsné ER) Hr-ER je místem syntézy bílkovin a jejich prvních, tzv. post-translačních úprav. V lumen hrER jsou bílkoviny opatřovány cukernými konci, tj. glykozylovány, většinou na asparaginovém N zbytku peptidu (zajišťuje membránově vázaný nenasycený lipid, dolichol, s 75-95 uhlíky). Hotové bílkoviny se odštěpují od ER formou membránou obalených váčků, které vstupují do Golgiho aparátu, kde jsou upravovány („processing“) a dále exportovány v buňce nebo z buňky (viz níže, Golgiho aparát, lysozomy, váčkový transport, sekrece apod.) Lumen hr-ER souvisí s perinukleárním prostorem, který je uzavřen listy jaderné blány. Výskyt hr-ER se v různých buňkách liší. Je relativně rozsáhlejší v buňkách s vysokou syntézou bílkovin, např. v jaterních buňkách, žlázovém epitelu, nervových buňkách a pod). (Více viz kap. 5.2). Ribozomy. Mají vzhled jemných granulí, tvořených tzv. větší a menší podjednotkou. V eukaryotních buňkách má velká podjednotka sedimentační konstantu 60S, (S= Svedberg) a malá podjednotka 40S. Ve funkční ribozom (Cave: 80S) se obě podjenotky spojují po navázaní na molekulu mRNA. Ribozomy jsou tvořeny několika typy RNA (tzv. ribozomální RNA, rRNA) a velkým počtem bílkovin. Velká podjednotka obsahuje 28S, 5.8S a 5S rRNA, malá podjednotka pouze 18S rRNA (obr. 32 A). 41
Ribozomy mitochondrií a chloroplastů jsou celkově menší a jsou podobné velikostí, strukturou i citlivostí vůči účinku antibiotik, která inhibují translaci u prokaryot (např. chloramfenikol), zatímco cytoplazmatické ribozomy jsou citlivé na cykloheximid. Chybí 5.8S RNA ve velké podjednotce
Většina rRNA (mimo 5S RNA) je syntetizována v jadérku, kde "zraje" (štěpení, metylace aj.) a spojuje se s ribozomálními proteiny, tvořenými primárně v cytoplasmě. Tzv. zralé podjednotky ribozomu jsou odděleně transportovány z jádra do cytoplasmy, kde se účastní proteosyntézy (translační fáze, viz kap. 5.3). V eukaryontní buňce se ribozomy mohou vyskytovat volně nebo připojené na molekulu informační ribonukleové kyseliny (mRNA), jako tzv. polyzomy nebo na endoplazmatické retikulum (hr-ER). Volné ribozomy se podílí na syntéze cytozolových proteinů, proteinů určených pro membrány ostatních organel endomembránového systému, jádra a mitochondrií. Bílkoviny syntetizované na hr-ER jsou většinou určeny pro sekreci do mezibuněčné hmoty (syn. extracelulární matrix), žlázových vývodů nebo tělních tekutin, především krve (viz též níže sekreční dráha). 2. 3. 2. 5 GOLGIHO APARÁT (GA)
SYN G.KOMPLEX
(obr.6, 11)
Camilo Golgi (1843-1926), nació en Corteno (Italia) y estudió medicina enla Universidad de Pavía, donde obtuvo su
GA představuje svazek plochých-diskoidálních a na sebe naskládaných, lehce prohnutých membránových cisteren, připomínajících "sloupek mincí". V těsném okolí cisteren jsou četné váčky. Počet cisteren ve svazku u různých buněk kolísá v živočišných buňkách mezi 4 až 6. U flagelát jich může být až 60. V rostlinných buňkách se tento svazek označuje někdy jako diktyzom (syn. Golgiho granulum). Počet takovýchto svazků v buňkách je různý a tvoří tubuly či cisternami propojenou síť- aparát (komplex), která obklopuje jádro a je i v blízkosti centrozomu. GA je funkčně polarizovaný. Část přebírající váčky od z hr- a hladkého ER se označuje jako cis-část. Následuje sřední část, kde probíhají terminální posttranslační úpravy váčky přijatých molekul (glykozylace, acetylace, metylace, fosforylace, sulfatace, myristilace, proteolytické štěpení peptidů na menší fragmenty). Tím se mění jejich chemické a biologické vlastnosti (viz níže). Takto „upravené-opracované “ molekuly pak ve váčcích odchází z tran-části GA k dalším cílovým oblastem buňky (viz níže transport látek, sekrece, tvorba lysozomů a další). Zmíněné úpravy bílkovin mění jejich mol.hmotnost, stabilizují a modifikují prostorovou strukturu a tím i jejich enzymatickou či hormonální aktivitu, činí je resistentnějšími k proteolýze, zvyšují rozpustnost ve vodě, snižují sklon k jejich samoagreagaci a pod. Cukerná zakončení molekul v PM ovlivňuje též vzájemné "rozpoznávání " buněk (cell recognition) v procesu tvorby tkání za vývoje (histogeneze), zprostředkovává kontaktní inhibici růstu, imunitní reakce a pod. Cukerné zbytky na sfingolipidech PM erytrocytů určují např. aglutinogeny krevních skupin AB0. (Pozor: na ostatních buňkách jsou cukerné skupiny určující krevní skupiny A,B,O součástí glykoproteinů PM).
Váčky zformované v trans-části GA dostávají „obal“ (coat, viz níže COP I, II) a "adresy" ve formě specifických molekul (v-SNARES), podle kterých jsou transportovány k cílovým strukturám buňky. Místa jejich příjmu nesou zrcadlově formované receptory, tzv. t-SNARES (v= vesicular t= target SNARES, viz též níže transportní váčky kap. 3.1). Proces glykozylace bílkovin začíná již v hr-ER (viz shora tzv. N- (asparagin)- linked glykozylace) a je dokončen v GA, především na zbytcích serinu a threoninu (tzv. O-linked glykozylace). Výsledkem je vznik glykoproteinů, které jsou určeny pro sekreci z buňky, a glykolipidů pro PM. Sacharidy v nich představují minoritní složku. V GA se dokončuje i tvorba proteoglykanů, ve kterých tvoří sacharidy většinovou složku, a které jsou sekretované do okolí buňky jako součást extracelulární matrix (viz kap. 5.1).
42
2. 3. 2. 6 BLÁNA JADERNÁ (BLJ) syn. karyotéka, jaderný obal, jaderná membrána (obr. 6,11,12) BLJ odděluje jádro od cytoplazmy. Je tvořena dvěma plan-paralelními membránami, které jsou deriváty cisteren ER. Štěrbina mezi listy membrán (20-40nm, perinukleární prostor nebo perinukleární cisterna) komunikuje s cisternami hrER. Listy BLJ se v některých místech spojují a vytvářejí polyedrické póry (70 nm v průměru), osazené proteinovými komplexy, které zajišťují řízený transport makromolekul z cytoplazmy do jádra (např. histonů) a z jádra do cytoplazmy, především mRNA a ribozomů. Počet pórů kolísá dle typu, stupně zralosti a funkčního stavu buňky, a to od několika desítek do několika tisíc. Jaderné póry jsou "osazeny" četnými molekulami bílkovin, které jsou specializované pro export a import molekul a partikulí mezi jádrem a cytoplazmou (nukleoforiny, NES a LES proteiny -Nuclear Export and Localisation Signal Molecules, penduliny aj.). K nim se upínají filamenta z cytoplazmatické i jaderné strany. Na jaderné straně vytvářejí charakteristickou košíčkovitou strukturu připomínající drátěný košík na zátce lahve šampaňského.
Na vnitřní straně vnitřního listu BLJ je jemná síť fibrilárních bílkovin, laminů, označovaná jako jaderná lámina („skořápka“). Laminy (typ A, B a C), obsahují sekvence aminokyselin homologní se středními filamenty cytoplazmatického cytoskeletu. Laminy B jsou spojeny s integrálními proteiny BLJ. Laminy A a C (varianty proteinu kódovaného stejným genem) jsou ve spojení s rozvolněnými interfázovými chromozomy. Na zevním povrchu zevního listu BLJ jsou zpravidla navázány ribozomy. Laminy typu B jsou ubiquiterní. Laminy typu A se vyskytují především v časných stádiích vývoje- blastogeneze. Tkáňově specificky jsou přítomny rovněž laminy typu C. Jak bude uvedeno v kap. 3.5, v profázi mitózy nastává depolymerizace laminů, a to v důsledku jejich fosforylace tzv. Faktorem podporujícím zrání (Maturation Promoting Factor, MPF, tj. komplex G2 cyklinu a tzv. CDK kinázy,), následované rozpadem BLJ do malých vezikul, ke kterým zůstávají připojeny molekuly laminu B. Váčky se stávají dočasnou součásti hrER. Po ukončení mitózy se váčky nesoucí lamin B dostávají do vzájemného kontaktu a vzniká nová BLJ.
2. 3. 2. 7 LYSOZOMY, (obr. 6,10,13,16)
ENDOZOMÁLNÍ SYSTÉM, TRANSPORTNÍ VÁČKY, KAVEOZOMY Malé, ale důležité a rozmanité
(i) Lysozomy (Ly) jsou malé, membránou ohraničené váčky (0.5-1 um), které obsahují hydrolytické enzymy (kyselé hydrolázy s pH optimem kolem pH 5.5). Probíhá v nich rozklad makromolekul pohlcených z okolí buňky procesem endocytozy (viz též níže endozomy) nebo biologického materiálu, např. bakterií či fragmentů poškozených uhynulých buněk pohlcených procesem fagocytozy (viz též níže heterofagozomy). Účastní se též rozkladu vlastních poškozených nebo opotřebených organel buňky v tzv. autofagozomech (autofagie). Ly obsahují zhruba 40 různých hydroláz, označovaných podle makromolekulárních substrátů, které štěpí (nukleázy, proteázy, lipázy, fosfolipázy, glykozidázy, fosfatázy, sulfatázy a pod.). Definice a klasifikace Ly prošla několika změnami (viz níže). Lysozomální enzymy jsou primárně syntetizované v hr-ER, kde začíná jejich glykolyzace (N-glykozylace), poté procházejí v GA dalšími relativně složitými úpravami (O-glykosylace) a tříděním do klatrinem „opláštěných“ váčků (viz též níže), ve kterých se manózová cukerná zakončení enzymů distribuují do váčků obsahujících specifický manózo-6-fosfát receptor (MP6R). Plášť váčků se poté rozpadá a váček se mění na časný endozom (prelysozom) v jehož membráně je protonová pumpa, která čerpáním protonů snižuje ve váčku pH (5.0). To vede k odpojení (disociaci) manozylovaných molekul enzymů od M6Preceptoru a recyklaci MP6R v nové vytvořeném váčku do Golgiho aparátu. Zbývající obsah (tj. fosforylované a dosud neaktivní enzymy - proenzymy), zůstávají v malých membránou 43
obalených váčcích, označovaných dříve jako primární lysozomy, dnes „vesikuly transportující kyselé hydrolázy“. Tyto vezikuly zůstávají v buňce připravené splynout s pozdními endozomy, obsahující např. molekuly pohlcené z okolí buňky tzv. receptorově zprostředkovanou endocytou (RZE, viz kap. 3.1) nebo fagocytozou. Splynutím endocytárních váčků se shora zmíněnými vesikulami obsahujícími kyselé hydrolázy se vytvoří tzv. vlastní lysozom (dříve sekundární lysozom), ve kterém se rozloží pohlcený obsah. Tímto mechanizmem je např. transportován do buněk cholesterol v komplexu s lipoproteinovým nosičem, který se primárně váže na receptory v PM (kap. 3.1). Aktivace kyselých lysozomálních hydroláz v lysozomu vyžaduje další okyselení obsahu (pH cca 4.8), což zajišťuje přenašeč protonů (tzv. v-ATPáza) v membráně lysozomu. Kromě protonů, do váčků procházejí iontovým kanály i chloridové anionty. Nízké pH rovněž denaturuje bílkoviny a další makromolekuly, což usnadňuje hydrolázám přístup k jejich enzymatickým substrátům. Proces konverze neaktivních lysozomálních proenzymů na jejich aktivní formu je stále předmětem zkoumaní. Jeho součástí je zřejmě i cílené odštěpení části molekuly proenzymu jinými lysozomálními proteázami. . Nežádoucímu samonatrávení buňky po ev. uvolnění lysozomálních enzymů do cytoplazmy zabraňuje neutrální až mírně alkalické prostředí ( pH 7.0 až 7.3) cytosolu, které tyto enzymy rychle inaktivuje. Lysozomální enzymy mohou být sekretovány formou exocytózy i do okolí buňky. Pokud takto se vyprazdňující lysozom obsahoval i nerozložitelný materiál, proces se někdy označuje jako „buněčná defekace“.
Lysozomální aktivita je vysoká v rostoucích a degenerujících buňkách a tkáních. Lysozomy jsou četné jsou i v granulocytech, ve kterých slouží k usmrcení a rozkladu fagocytovaných mikroorganizmů (tzv. druhá obranná linie organizmu proti infekci). Lysozomální enzymy uvolněné okolí buňky štěpí okolní materiál (např. při rozrušují obaly vajíčka při oplození), podílí se na resorpci žloutku v časných fázích embryogeneze, keratinizaci kůže, trombolýze a pod. Exocytované lysozomální enzymy mohou Být zpět buňkami pohlceny (formou receptorově zprostředkované endocytozy,. Kap. .3.4) a opět zapojeny do endozomálního systému buňky (viz shora). Není váček
jako váček
Endozom (y), někdy endozom -lysozomální systém, lze tedy definovat jako prelysozomální kompartment buňky, tvořený membránou ohraničenými váčky a tubuly, obsahujícími látky syntetizované v buňce (viz shora kyselé prelysozomální hydrolázy) nebo látky pohlcené z okolí (viz receptorově zprostředkovaná endocytoza shora a v kap. 3.1), ve kterém dojde nejprve k okyselení jeho obsahu a oddělení receptorů od transportovaných molekul (časný E.), oddělení a recyklaci receptorů (pozdní E.) do PM a nakonec k enzymatickému rozkladu transportovaných látek resp. jejich nosičů (viz např. shora zmíněné komplexy lipoproteinů a cholesterolu) kyselými hydrolázami v lysozomu. Kromě zmíněného cholesterolu jsou procesem RZE ve formě komplexů s bílkovinnými nosiči pohlcovány i některé další molekuly potřebné pro stavbu a metabolismus buňky. Fagozomy mohou obsahovat např. bakterie, buněčnou drť apod. pohlcené z okolí (heterofagozomy) nebo vlastní korpuskulární materiál, např. poškozené nebo opotřebované organely (autofagozomy, viz kap. 3.1).
Znalosti o endosom -lysozomálním systému nejsou dosud ustálené a informace v učebnicích mohou být nejednotné nebo nejasné. (ii) Transportní váčky, jak již naznačeno shora, představují pestrý soubor drobných membránou obalených váčků nebo nepravidelných cisteren, sloužících k transportu molekul mezi buňkou a okolím a mezi jednotlivými organelami v buňce samotné. Obsah váčku je označován jako náklad, cargo.Molekuly carga jsou k membráně váčku připojeny specifickými receptory, které jsou integrálními bílkovinami membrány váčku (viz též receptorově zprostředkovaná endocytoza a kap. 3.1).
44
Na povrchu mají váčky často bílkovinný plášť (coat) a jsou proto označovány jako opláštěné váčky (coated vesicles). Přítomnost pláště je dočasná. Jeho tvorba i rozpad je regulován řadou dalších molekul (tzv. adaptorové proteiny, membránové fosfoinozitoly, GTPázy a další, více v Molekulové biologii). Plášťové molekuly se účastní formování váčku, který začíná jako prohlubeň membrány (potažená jamka v PM, coated pit, endocytoza, kap. 3.1), která se postupně mění ve váček. Odškrcení váčku od mateřské membrány zajišťuje pak v místě jeho „krčku“ „kontraktilní“ bílkovina dynamin. Podobně začínající tvorba váčku z GA, ER nebo endozomu se označuje jako pučení váčku. První zjištěnou plášťovou bílkovinou byl klathrin. Molekula klathrinu má podobu triskelionu (viz obr….). Při vhodných podmínkách vytváří penta- a hexagonální komplexy, které košíčkovitě obklopí váček. Plášť je připojený k membráně váčku další bílkovinou. Adaptinem 1 v případě lysozomů a váčků endozomálního systému transportujících molekuly z Golgiho aparátu a adaptinem 2 pro váčky směřující endocytózou od plazmatické membrány k endo -lysozomálnímu systému.. Rozpad klatrinového váčku vyžaduje energii z ATP.
Dalšími "plášťovými" molekulami jsou Coatomer Protein I a Coatomer Protein II (COP I, COP II), které obalují váčky přenášející molekuly v buňce mezi ER a GA. Nedávno byl zjištěn další typ pláště tzv. retromer, který se uplatňuje ve váčkovém transportu v endozom-lysozomálním systému (viz shora). Plášť tvořený COP I, II a retromerem nemá podobu klathrinového košíčku (basket coat), nýbrž spíže hrudkovitého obalu (patchy coat). Další bílkoviny zakotvené do membrány váčku slouží k cílené dopravě carga k dalšími intracelulárním organelám nebo k plazmatické membráně. Významnou skupinou jsou tzv. vesikulární SNARES (v-SNARES). Po jejich navázaní se na komplementární molekuly, tzv. t-SNARES (t= target, cíl), na cílové organele (tzv. "docking váčku") dojde ke splynutí membrány váčku s membránou cílové organely a předání obsahu transportního váčku do této organely nebo jeho vyloučení z buňky (viz též exocytóza, kap. 3.1). Dle posledních poznatků, fúzi membrány váčku a cílové organely napomáhá vytvořený komplex t- a vSNARES nejen tím, že váček „identifikuje“, ale současně jej změnou své konformace i „přitahuje“ k cílové organely ( tzv. tethering, angl. tether= vazné lano lodi). Zkratka SNARES je odvozena z Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion Attachment protein Receptor. Plný název není třeba znát. Transport váčků označených molekulami SNARES vyžaduje energii, která je získávána z GTP štěpeného tzv. malými či monomerickými G proteiny, především ze skupiny tzv. rab proteinů, majících enzymatickou aktivitu. Srovnej s trimerními G-proteiny v kap. 5.4 (iii) Kaveozomy (měchýřky "slujové", J. Černý, Vesmír sv. 82, str. 8, 2003) jsou nedávno objevené, velmi malé endo-pinocytární váčky, které se vyskytují nejčastěji v blízkosti PM a které nemají klatrinový plášť. Jejich menbrána je však obohacena o některé lipidy (cholesterol a glykosfingofosfolipidy, viz též shora kap1.1 a 3.1 ráfty PM) bílkoviny, především kaveolin, který představuje samostanou „plášťovou“ skupinu. Obsah kaveozomů je pH neutrální. Představují pravděpodobně samostatnou cestu receptorově zprostředkované endocytozy např. pro cholesterol, viz shora, a transcytózy (viz. kap. 3.1), i vstupu některých virů do buňky. Obsah kavezomů končí zpravidla v endoplazmatickém retikulu. Někteří je považují za samostanou skupinu membránových organel. (iii) Vakuola (V), rozdíl od buněk rostlinných a nižších hub, kde V je součástí ELS, je v živočišných buňkách, s výjimkou prvoků (viz trávicí a vodu transportující tzv. pulzující vakuoly), málo vyvinutá a slouží převážně ke střádání některých látek (např. lipidů v tukových buňkách, pigmentů apod.). Funkčně specializovanou skupinu představují synaptické váčky nervových buněk (viz kap. 5.2).
45
2. 3. 2. 8 PEROXIZOMY (Px). Px jsou to membránou obalené váčky o průměru 0.05 –2 mm. Obsahují enzymy schopné odnímat vodík (oxidovat) delším mastným kyselinám za vzniku acetyl-koA (ß-oxidace), peroxidu vodíku a tepla. Peroxid je rozkládán na vodu a O2 katalázou bez vzniku nebezpečných tzv. volných kyslíkových radikálů. Molekulární kyslík uvolněný z H2O2 může být využit k oxidaci a ev. inaktivaci dalších organických molekul (viz níže). Kratší štěpy mastných kyselin mohou být využívány dalšími organelami, např. v mitochondriích . Mezi anabolické funkce peroxizomů patří syntéza prostaglandinů, cholesterolu, žlučových kyselin, plasmalogenů (etherové fosfolipidy, viz kap. 1.1 a shora lipidy PM) a kyseliny oxalové. V Px se rovněž může tvořit glukóza z necukerných molekul (glukoneogeneze) a probíhat proces transaminace. Viz též předměty Fyziologie a Biochemie. Mezi oxidační substráty Px patří též D-aminokyseliny, alkoholy, aldehydy, fenoly, dikarboxylové kyseliny, puriny, polyaminy. U hlodavců též močová kyselina, která je rozkládána enzymem urátoxidázou. Ta způsobuje výskyt pravidelné mřížkové struktury, krystaloidů, patrných v elektronovém mikroskopickém obraze těchto organel.
Enzymy peroxizomů jsou tvořeny v hr-ER, z kterého se odškrcují formou váčků, nebo se syntetizují na volných ribozomech (kataláza) a dodatečně jsou obaleny membránou. Při těchto procesech se netvoří ATP, ale uvolněná energie se přeměňuje přímo v teplo. Analogem peroxizomů v rostlinných buňkách jsou glyoxyzomy, které se účastní přeměny mastných kyselin na cukry v glyoxylátovém cyklu v semenech při klíčení a v procesu tzv. fotorespirace (viz předmět Botanika).
Peroxizomy měly pravděpodobně fylogeneticky primární úlohu v zužitkování a zneškodňování atmosférického kyslíku, který se objevil v atmosféře v důsledku fotosyntézy. Rudimentární funkce si Px zachovaly i po vzniku mitochondrií využívajících kyslík cestou oxidativní fosforylace (viz 3.2). Z hlediska fylogenetického je rovněž pozoruhodné, že do membrán Px mohu být nové molekuly vládány i mimo endoplazmatické retikulum, což jim poskytuje jistý stupeň autonomie (semiauotomie) a někteří autoři je proto neřadí mezi organely ES. Peroxizomy jsou četné např. v hepatocytech a renálním epitelu, kde dochází k inaktivaci mnoha škodlivin, glukoneogezi, transaminaci apod. Poruchy Px způsobují řadu závažných onemocnění.
2. 3. 3 MITOCHONDRIE A HYDROGENOZOMY (obr.6,10, 11,16)
„kW"
2. 3. 3. 1 Mitochondrie (M) jsou membránové organely kulovitého nebo tyčinkového tvaru (cca 1 x 0.5 um). Jsou tzv. semiautonomní (polosamostatné), neboť mají relativně vysoký stupeň reprodukční autonomie. Na rozdíl od ostatních membránových organel se totiž tvoří dělením (odškrcováním z mateřské organely) a nikoliv odštěpováním z endoplazmatického retikula. Mají též schopnost syntetizovat některé vlastní bílkoviny. Počet M v buňce je úměrný jejím energetickým potřebám. Je vysoký např. v myokardu, ledvinách, létacích svalech ptáků a od. V jaterních buňkách savců je jich zhruba 2-3 tisíce. V ooocytech obojživelníků až 300. 000. Podobně i u některých prvoků, např. améb. Opačně je tomu např. v povrchových keratinocytech epidermis nebo anerobních prvoků, např. Trypanozom. M. jsou tvořené zevní a vnitřní membránou. Vnitřní membrána je zřasena do lamel (krist, lístků) nebo trubiček, tubulů (např. v buňkách syntetizujících steroidní hormony) jsou v ní zakotveny molekuly dýchacího řetězce. 46
U hmyzu se vyskytují i smíšené lamelární -tubulární mitochondrie. Minoritním podtypem popisovaným některými autory v nervových buňkách jsou mitochondrie s tzv. prizmatickými (trojúhelníkovými) kristami. U některých anerobních prvoků kristy prakticky chybí.
Mezi zevní a vnitřní membránou je tzv. mezimembránový prostor, ve kterém se tvoří protonový gradient, který je využíván pro tzv. syntézu ATP cestou chemiosmotické fosforylace (viz níže). Na některých místech zevní a vnitřní membrána mitochondrie je propojena tzv. megapóry (Mitochondrial Permeability Transition Pores, MPTP), které jsou za fyziologických podmínek uzavřeny. Otevírají se však při poškození buňky (viz kap. 4) a umožňují únik cytochromů do cytozolu, kde spouští proces tzv. programované smrti buňky, apoptózu (viz kap.4.4). V prostoru ohraničeným vnitřní membránou je koloidní matrix. Obsahuje řadu enzymů, které zajišťují významné metabolické procesy. Mezi nejdůležitější patří: (i) (ii) (iii) (iv) (v) (vi) (vii)
Dekarboxylace pyruvátu (tvořený glykolýzou v cytozolu), Rozklad acetyl-KoA tvořeného z pyruvátu cestou tzv. Krebsova (citrátového) cyklu, Rozklad mastných kyselin na 2C fragmenty tzv. beta-oxidací (kap. 3.2), Syntéza steroidních molekul, močoviny a Syntéza glukózy z necukerných molekul (viz glukoneogeneze v kap. 3.2). Syntéza bílkovin (viz níže a kap.3.3) Zásobárna iontů kalcia (podobně jako v hl-ER)
Zevní membrána je relativně propustná i pro větší molekuly (až do m.h. 10 000). Obsahuje některé enzymy, mj. pro prodlužování řetězců mastných kyselin až do 18 C a metabolizmu fosfolipidů. Mitochondrie samy však získávají většinu fosfolipidů z hladkého ER. Je pozoruhodné, že lipidická složka mitochondriálních membrán obsahuje i etherové lipidy (plasmalogeny, viz kap. 1.1, 2.3, 3.1), vyskytující se v plazmatické membráně arche-, některých anerobních eu-bakterií (viz kap. 2.1). Vnitřní membrána je málo propustná i pro látky nízkomolekulární. Je proto obohacena speciálním fosfatidylglycerolem- kardiolipinem, který slouží mj. k transportu fosfátů do matrix mitochondrií. Důležitou složkou vnitřní membrány jsou bílkoviny, které zajišťují (i) transport elektronů a protonů z NADH+ (NADH+ se tvoří Krebsově cyklu, ve kterém probíhá konečný metabolismus nejen glukózy ale i 2C štěpů uvolňovaných beta- oxidací z mastných kyselin) a (ii) syntézu ATP, enzymem ATP syntázou, která využívá energii protonového gradientu v mezimembránovém prostoru (kap.3.2).
V mitochondriální matrix se nachází 1 chromozom (avšak ve vícero kopiích), který je zpravidla cirkulární (kružnicový) (viz ale též níže) . Je-li genetická informace všech kopií identická, stav se označuje jako mitochondriální homoplázie. Postihne-li mutace DNA část chromosomů, stav se označuje jako heteroplázie. Stupeň heteroplázie se může náhodně měnit, mj. nerovnoměrnou distribucí mitochondrií do dcerinných buněk při redukčním dělení ooocytů , což může mít závažné funkční důsledky. U člověka obsahuje mitochondriální chromozom pouze 37 genů (13 genů strukturálních kódujících enzymy a přenašeče elektronů v dýchacím řetězci, 22 genů pro tRNA, 2 geny pro rRNA. Velmi nízký je obsah nekódující DNA (junk DNA, introny, viz kap.3.3). Počet genů však není u všech živočichů stejný (viz níže). Chybí jaderná chromatinová struktura. Význam některých kodónu je blíže k purpurovým nesirným bakteriím než eukaryotním buňkám. Některé nukleotidové triplety mohou být sdíleny dvěma sousedními geny, kdy v jednom genu představuje koncový, a v genu následujícím triplet počáteční. Genomickou podobnost sdílí mitochondriální DNA s alfa proteobakteriemi. Mitochondriální DNA živočichů pochází prakticky jen z mateřské vaječné buňky (viz níže a matroklinita v kap.6.2). Kódující geny ve většině případů nejsou v živočišných buňkách přerušovány introny (výjimkou mezi eukaryoty jsou pravděpodobně mitochondrie kvasinek). Redukce mitochondriálního genomu spojená s přesunem genů do jádra není u všech eukaryotních organizmů stejná. U protistů Reclinomas americana jej tvoří 67 genů. U parasitických prvoků, např. Plasmodium falciparum (původce malárie) pouze 3 geny. I když k prvotnímu přenosu genů z mitochondrie do jádra došlo před miliardami let, tento proces se podařilo nedávno experimentálně simulovat (viz níže).
47
V matrix mitochondrií jsou volně uložené ribozomy, které syntetizují bílkoviny kódované mitochondriálním genomem. Velikostí jsou více podobné bakteriálním (70S) než cytoplaszmatickým (80S). Většina bílkovin mitochondrií je (90%) je však syntetizovaná v cytoplazmě mimo mitochondrie, dle genetické informace uložené v jádře buňky (viz shora) odkud jsou "dopravovány" do mitochondrií speciálními transportními molekulami (viz níže chaperony a kap. 4.2). Transportu bílkovin z cytoplasmy do mitochondrie se účastní speciální molekuly, tzv. chaperony, (viz též kap. 4.2), které dočasně bílkovinu linearizují (denaturují), čímž se usnadní její průchod membránami mitochondrie. Po přesunu takto modifikovaného proteinu přes membrány, jeho renaturaci (tj. obnovení původní prostorové struktury) provedou v matrix opět molekuly typu chaperonů.
Mitochondrie mají vlastní reprodukční cyklus, který zahrnuje replikaci DNA, longitudinální zvětšení organely, zaškrcení její vnitřní membrány a vytvoření 2 samostatných, septem oddělených vnitřních oddílů. Následným zaškrcením zevní membrány se mitochindrie rozdělí ve 2 samostatné organely. Každá dceřiná mitochondrie obdrží jednu nebo více kopií chromozomu. Vlastní rozdělení organely zaškrcením („mitochondriokineza“) zajišťují, podobně jako u prokaryot (kap. 2.1), speciální konstrikční proteiny U prvoků je to tubulinu evolučně blízký prokaryotní FtsZ protein, u hub a živočichů pak pravděpodobně bílkovina dynamin mající GTPázou aktivitu. Replikace DNA neprobíhá ve všech současně. Vrozené poruchy v mitochondriálním genomu, jakož i syntéze a transportu mitochondriálních bílkovin jsou příčinou vážných onemocnění svalů, nervového systému a dalších orgánů. Mitochondrie jsou po celou dobu života i zdrojem malého množství tzv. volných kyslíkových radikálů, které mohou působit oxidační poškození biomembrán a tím urychlovat opotřebení a dobu života buněk… a být tak jednou z příčin i stárnutí organizmu. Více viz shora – únik cytochromů z mitochodnrií do cytozolu a aktivace apoptózy, která je popsána v kap. 4.4. Minimaxi čtení: “….Binary fission in procaryotes depends on filaments made of the FtsZ protein. FtsZ is a cytoskeletal GTPase that is structurally related to tubulin and assembles into a ring at the equator of the cell. FtsZ filaments are essential for the recruitment of all the other cell division proteins to the division site. Together, these proteins guide the inward growth of the cell wall and membrane, leading to the formation of a septum that divides the cell into two. Bacteria in which the ftsZ gene is inactivated by mutation cannot divide. A FtsZ-based mechanism is also used in the division of chloroplasts in plant cells mitochondria in protists. In fungi and animal cells, another self-assembling GTPase called dynamin) has apparently taken over the function of FtsZ in mitochondrial division”. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mboc4.section.3381 “…Previously, the bacterial cell division protein, FtsZ, was shown to localize at the mitochondrial division site in the alga. We showed that FtsZ and dynamin coexist as mitochondrial division-associated proteins that act during different phases of division. CmDnm1 was recruited from 10-20 cytoplasmic patches (dynamin patches) to the midpoint of the constricted mitochondrion-dividing ring (MD ring), which was observed as an electrondense structure on the cytoplasmic side. CmDnm1 is probably not required for early constriction; it forms a ring or spiral when the outer mitochondrial membrane is finally severed, whereas the FtsZ and MD rings are formed before constriction. It is thought that the FtsZ, MD, and dynamin rings are involved in scaffolding, constriction, and final separation, respectively. In eukaryotes, mitochondrial severance is probably the most conserved role for the dynamin family”. http://merolae.biol.s.u-tokyo.ac.jp/publication/organelle.html Matsuzaki M, Nature 2004 Přesto, důvěřuj ale ověřuj:
“ ……..V preparátech mtDNA vyšších živočichů se vyskytuje 90% genetické informace ve tvaru obdobných “kruhů”, jaký je na obrázku 7-3. Zbytek tvoří při separaci porušené molekuly. V preparátech mtDNA hub a rostlin je kružnicových molekul méně a jejich velikost neodpovídá hodnotě předpovězené z kruhové mapy. U tabáku se nikdy nepodařilo izolovat v kruhové formě více než několik procent DNA. Původně se předpokládalo, že tato mtDNA je velmi fragilní a při separaci se snadno poškodí. Nové izolační techniky dokázaly, že mtDNA mnohých rostlin a hub tvoří vlákna o délce mnohem větší než očekávané kružnice a že kružnicové modely jsou výjimečné….”. P. Říha, http://mujweb.cz/Veda/mitochondrie/7/7.htm “At variance with the earlier belief that mitochondrial genomes are represented by circular DNA molecules, a large number of organisms have been found to carry linear mitochondrial DNA…. The first linear mitochondrial genome was discovered in the ciliate Tetrahymena by Suyama and Miura in 1968. Since then other species harboring linear mitochondrial genome were discovered. These organisms belong to a large variety of taxonomical groups (ciliates, apicomplexan protozoa, algae, slime molds, oomycetous fungi, yeasts and several species of the metazoan phyllum Cnidaria). Even mtDNA of yeast Saccharomyces cerevisiae, portrayed by geneticists as a circular molecule of 25 µm circumference, is in vivo mainly linear”. Více viz Kováč L., http://oldwww.fns.uniba.sk/~kbi/kovlab/questions.htm#1 „…..Linear mitochondrial genomes were found in organisms belonging to diverse phylogenetic taxa such as ciliates, apicomplexan protozoa, green algae, yeasts, oomycetes, slime molds as well as in metazoan species from the phylum Cnidaria. Several lines of evidence indicate that the linear form of a mitochondrial genome has neither an independent evolutionary origin nor a radically different lifestyle from its circular counterpart. Rather, the conversion from one form to another has occurred accidentally through a relatively simple mechanism during evolution. This means that a cell with a linearized mitochondrial genome may use a tinkering strategy to mobilize a preexisting set of proteins to deal with the end-replication problem within its organelle. Our studies revealed that the fortuitous evolutionary emergence of linear DNA genomes in mitochondria was accompanied by the generation of various types of terminal structures, adaptation
48
of components of DNA replication machinery, and hence the application of differing strategies of telomere replication. ……..Moreover, the ends of linear mitochondrial DNA were shown to adopt a higher-order structure termed the telomeric loop (t-loop), which is analogous to the t-loops present at the tips of mammalian chromosomes“. J.Nosek, http://www.hhmi.org/research/scholars/nosek.html Tak přece jen kružnicová, aspoň u člověka ?………. O mitochondriích, mapách a přitažlivosti kruhu,F. Cvrčková, Vesmír 73, 428, 1994/8 “ ………dříve, než si zvykneme na představu, že mitochondriální DNA je uzavřena do kružnice, měli bychom se zamyslet nad tím, odkud ta představa pochází. Konstrukce genetické mapy se podobá mapování neznámého území před nástupem letecké či družicové fotografie. Mapa chromozomu se sestavuje po kouskách; základem mapování je určování sousedů kteréhokoli zvoleného bodu na molekule DNA. Narazíme-li podruhé na bod, ze kterého jsme vyšli (a jsme-li si jisti, že se tento bod na chromozomu neopakuje), mapa se uzavírá do kruhu. Znamená to však, že se do kružnice uzavírá i studovaná molekula DNA? Bylo by tomu tak, kdybychom mapu odvozovali z jediné kopie mitochondriálního genomu; ale skutečné mapy se sestavují na základě analýzy populací molekul. A tu se nám náhle naskýtají dvě možnosti, jak obdržet kruhovou mapu lineárního chromozomu. Mapa sama o sobě k závěru, že mitochondriální DNA je kružnicová, nestačí. Odkud se tedy bere všeobecně přijatá představa, že mitochondriální DNA je kružnicová? Argument, že mitochondrie jsou někdejší bakterie a že bakterie mají kruhové chromozomy, nestačí. Nejpřesvědčivějším důkazem samozřejmě je úhledný, elektronovým mikroskopem pořízený snímek molekul DNA uzavřených do kružnice, jejíž obvod pokud možno odpovídá délce mapy sestavené „po kouskách“. V preparátech mitochondriální DNA vyšších živočichů je takových kroužků až 90 %. Nad zbytkem si není třeba lámat hlavu, uvědomíme-li si, že analýza jakékoli DNA v elektronovém mikroskopu se podobá stanovování průměrné délky vařené špagety na základě fotografie. Rozbité molekuly (a přetržené špagety) nejsou žádnou vzácností. Kruhová mapa mitochondriální DNA si našla cestu do učebnic a tím i do obecného povědomí. Zdálo by se, že oprávněně; ale toto zdání je, jak ukazuje nedávno zveřejněný článek Arnolda Bendicha z Univerzity v Seattlu, klamné. Situace totiž není zdaleka tak jednoduchá, pokud se zabýváme i jinými organizmy, než jsou mnohobuněční živočichové. V preparátech mitochondriální DNA hub a rostlin je kružnicových molekul méně, než bychom čekali, a jejich velikost mnohdy neodpovídá hodnotě předpovězené z kruhové mapy. U tabáku např. nikdo nikdy neviděl víc než několik procent pozorovaných molekul mitochondriální DNA v kruhové formě. Vžitou představou to však neotřáslo: je přece možné, že se tabáková DNA snadno trhá při izolaci a že zdokonalení metod nakonec přece jenom přinese potvrzení učebnicového modelu…… K tomu však nedošlo. … byly vyvinuty nové a mnohem šetrnější izolační techniky – ale ukázalo se, že mitochondriální DNA mnohých rostlin a hub tvoří vlákna o délce mnohem větší než očekávané kružnice a že kružnicové molekuly jsou spíše výjimkou než pravidlem! Ne že by se zase stalo tak moc. Replikace kružnicové DNA může dát vzniknout dlouhým, zřetězeným lineárním molekulám, které pořád poskytují stejnou kruhovou mapu a ví se, že například některé viry takovou replikační strategii s úspěchem používají…… Proč vlastně vstoupila kruhová mapa do našeho povědomí tak hluboko, že pozorování ojedinělých kružnicových molekul ve změti lineární DNA stačilo jako „důkaz“ obecně kruhové povahy mitochondriálního genomu? Odpověď je jednoduchá: učebnice praví, že mitochondriální DNA je kruhová. Naše (tedy savčí) mitochondriální DNA kruhová je, a savčí buňky byly studovány jako první. Kdyby první pozorované molekuly mitochondriální DNA pocházely z tabáku, byli bychom se divili, k čemu je ta vzácná a neobvyklá kružnicová forma……” Promiskuitní DNA, Stěhování genů z organel do jádra.E. Kejnovský, Vesmír 86, 179, 2007/3, Proč se geny přesouvají do jádra? Kráceno VM. Vsuvky (…) VM. “……Prokaryotičtí předchůdci organel (vč. mitochondrií) byli původně sexuální, a poté, ….co uzavřeli endosymbiotické partnerství, ….začali být asexuální. …..nepřítomnost sexuality vede k hromadění škodlivých mutací. Nefungují totiž opravné mechanismy na bázi rekombinace DNA, které spočívají v opravě poškozených kopií genů podle kopií nepoškozených. Selekční tlak kromě toho zvýhodňuje malé genomy. V evoluci byly zvýhodněny úseky DNA, které byly přeneseny do jádra, kde mohou rekombinovat, a tím opravovat své poškození. Ukázalo se, že během evoluce organel rostlinných buněk a řas (plastidů) bylo do jádra přeneseno až 5000 genů. Mnohé kopie těchto genů jsou funkční i po přenosu do jádra. Organely totiž využívají produkty svých bývalých genů, i když jsou tyto geny v jádře. Které geny jsou promiskuitnější? Proč některé geny v organelách zůstávají? Byly totiž nalezeny i organely prokazatelně endosymbiotického původu, které ztratily DNA. ….. zdá se, že některé geny zůstaly v organelách zachovány v důsledku určitých vlastností proteinů (hydrofobicitou), a také v souvislosti s řízením oxidativních procesů. Některé proteiny by těžko procházely membránami z cytoplazmy do organel, a proto je výhodnější je syntetizovat přímo uvnitř organel. Stejně tak v případě proteinů řídících oxidativní procesy je výhodnější jejich syntéza přímo v organelách, kde mohou být odpovídající geny zapínány a vypínány podle potřeby organel. Ukázalo se, že v evoluci se některé geny z organel přenášejí do jádra přednostně. Co je příčinou různé náchylnosti genů k promiskuitě? Jako první přecházejí do jádra geny, jejichž produkty mají regulační funkci. Geny související … s překladem genetické informace a s dýcháním opouštějí organely jako poslední. ….příkladem je enzym rubisco, jehož katalytická podjednotka je kódována chloroplastem, zatímco regulační podjednotka pochází z jádra. Jak se organelové geny dostanou do jádra? Původně se uvažovalo o prostřednictví transpozon(ů), nebo o fágovém přenosu. Dnes existenci organelové DNA v jádře vysvětlují dvě hypotézy: přenos prostřednictvím RNA a včlenění velkých kusů organelové DNA rekombinací. Tyto hypotézy se navzájem nevylučují a pro obě existují experimentální důkazy. …. první hypotéza? Organelový gen se přepíše do RNA, a pak se zpětně přepíše (reverzní transkriptázou) do komplementární DNA (cDNA), která se včlení do jaderného genomu. Skutečně byly nalezeny úseky organelových genů v jádře, jimž chyběly introny, tj. úseky genů, které zmizí pouze při úpravách RNA. Představu včleňování velkých kusů DNA podpořily objevy …..chloroplastové DNA v jádře rýže nebo …mitochondriální DNA v jádře huseníčku (Arabidopsis thaliana). Úseky obsahovaly nejen geny s introny, ale i mezigenové oblasti. Tyto obří kusy DNA byly zřejmě procesem rekombinace včleněny do jaderného genomu poté, co se membrána organel rozpustila a jejich DNA se dostala do cytoplazmy a do jádra. Jak častý je přenos genů do jádra? Vědci ….vložili proto do chloroplastového genomu tabáku gen kódující rezistenci k antibiotiku a zajistili, aby byl tento gen zapnut jen tehdy, když je v jádře. Poté prokázali, že u rostlin tabáku, jež vyrostly v přítomnosti daného antibiotika, se do jádra přenesl kousek chloroplastového genomu nesoucího rezistenci k antibiotiku. S překvapením zjistili, že je takový přenos poměrně častý, u jedné ze 16 000 rostlin…. ale (možná i) mnohem častější …… Lze říci, že z několika tisíc rostlin…. například na palouku… nese alespoň jedna v jádře „čerstvý“ kousek chloroplastové DNA, který se do jádra včlenil v minulé generaci. Promiskuitní DNA v lidském genomu Úseky promiskuitní DNA jsou i v jaderném genomu člověka. Kromě mitochondriálních genů, které se přesunuly do jádra před několika stovkami milionů let a konají svoji práci pod novou vládou, bylo v našem genomu identifikováno přes 200 nefunkčních fragmentů mitochondriální DNA. Z nich vědci dále zkoumali 42 úseků, které se do našeho jaderného genomu včlenily nejpozději. Zjistili, že pouze 14 z nich se nachází také v jaderném genomu šimpanze, což naznačuje, že většina těchto úseků byla do našeho genomu včleněna až po oddělení větví vedoucích k člověku a k šimpanzům, tedy někdy před 4–8 miliony let. Některé úseky se dokonce liší i mezi lidskými populacemi, to znamená, že byly včleněny „nedávno“. Fragmenty mitochondriální DNA nejsou v lidském genomu rozptýleny rovnoměrně. Pohlavní chromozom Y, přítomný pouze u mužů, je mitochondriální DNA kolonizován mnohem více než ostatní chromozomy. Zajímavé je i to, že se promiskuitní DNA včleňuje s mnohem vyšší frekvencí do vysoce aktivních genů než do oblastí nekódujících (např. repetitivních)
49
sekvencí. …. objevy naznačují, že úseky … promiskuitní DNA v lidském genomu nejsou zcela neškodné. Jejich včlenění do genů může způsobit i závažná onemocnění, což dokazuje nedávný objev mitochondriální DNA v genu důležitém pro srážlivost krve u pacientů trpících hemofilií. Promiskuitní DNA všude Organelová DNA se pohybuje z efektivně využitého genomu prokaryot do zcela odlišného genetického prostředí eukaryotického jádra, obsahujícího složené geny a velké množství opakujících se úseků DNA, repeticí. Organely se vyznačují nejen odlišnou genovou i genomovou organizací ve srovnání s jádrem, ale i odlišnými mechanismy regulace genové exprese. Podíl promiskuitní DNA v genomech byl dosud podhodnocován, což bylo způsobeno tím, že algoritmy používané v sekvenačních projektech považovaly organelové sekvence za nežádoucí kontaminace a systematicky je vyřazovaly. To se nyní přehodnocuje. Ukázalo se, že například v genomu huseníčku (Arabidopsis thaliana) pochází 18 % genů ze starobylého plastidového genomu. Organismy se brání, aby jejich jaderné genomy nebyly přesyceny organelovými sekvencemi. Aktivně se jich zbavují různými mechanismy, především rekombinací. V laboratoři vývojové genetiky rostlin v Biofyzikálním ústavu AV ČR, kde se zabýváme strukturou a evolucí pohlavních chromozomů u rostlin, jsme zjistili, že se na pohlavním chromozomu Y modelové dvoudomé rostliny silenky širolisté (Silene latifolia) hromadí chloroplastová DNA. Zřejmě je to tím, že u chromozomu Y, který nemá partnera (na rozdíl od autozomů a pohlavního chromozomu X), a tudíž nerekombinuje, tento obranný mechanismus nefunguje. Ukazuje se, že všudypřítomný přenos genů z organel do jádra a vzájemné ovlivňování mezi buněčnými genomy hrají v evoluci genomů důležitou úlohu. Spolu s přenosnými elementy – především s retroelementy (viz Vesmír 79, 273, 2000/5) – je jedním z hlavních činitelů ovlivňujících dynamiku eukaryontních genomů od jejich vzniku”.
2. 3. 3. 2 Hydrogenozomy (H). Podobně jako mitochondrie, hydrogenozomy jsou malé organely obalené dvojitou membránou. Vnitřní membrána však netvoří kristy ani tubuly. H. neobsahují pravděpodobně DNA. Kolem jejich tvorby jsou stále jisté nejasnosti i když se předpokládá rovněž jejich endoymbiotický původ (viz níže). H. se vyskytují se u jednobuněčných anaerobních prvoků, žijících většinou parasiticky (Trichomonas vaginalis, bičíkovci žijící v bachoru přežvýkavců, některé nižší houby). H. mohou oxidovat některé organické molekuly, především pyruvát, který přeměňuji na acetát a plynný molekulární vodík (H2). Oxidací uvolněnou energii přeměňují na ATP, nikoliv však cestou chemiosmotické- (chybí ATPsyntáza), ale tzv. substrátové fosforylace (konverzí sukcinyl-CoA na sukcinát pomocí enzymu sukcinát thiokinázy). Tato málo častá organela je zajímavá tím, že kolem jejího původu je mnoho spekulací, které souvisí s fylogenetickým vývojem eukaryotní buňky a mitochondrií. Dle některých autorů hydrogenozomy představují anaerobního prokaryontního prapředka, asimilovaného v aerobní prabuňce. Dle jiných, hydrogenozomy představují zjednodušenou formu mitochondrií, adaptovaných na anaerobní podmínky a parasitický způsob života nositelů těchto organel. Nevylučuje se ani jejich vývojová vztah k peroxizomům. Pozoruhodné je rovněž to, že hydrogenozomy byly objeveny v r. 1973 současně v zahraničí a u nás Jiřím Čerkasovem. Hydrogenozomům podobné organely jsou i tzv. mitozomy. Neprodukují však plynný vodíl. Mitochondriální pramatka(y) Eva(y) ?? Kolik, kde, kdy? John B. Ferguson http://encarta.msn.com/text_761582165__1/Mitochondria.html “ ….. comparison of …. human mitochondrial DNA suggests that humans have descended from a woman who lived in Africa 140,000 to 290,000 years ago. Genetic samples taken from African, Asian, Australian, European, and New Guinean ethnic groups revealed a specific number of mitochondrial DNA types. Comparison of these mitochondrial DNA types enabled scientists to construct a family tree that shows when each group probably began evolving away from one another. On this tree, the African mitochondrial DNA occupies the longest and oldest of the branches, giving rise to the other ethnic groups. There were likely many other women alive at the time of the so-called mitochondrial Eve, but their lines of maternal inheritance have died out. This commonly occurs when one generation in a family fails to have a daughter. Pavel Říha http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/19/19.htm Kráceno a upraveno (V.M.) …..mutace DNA, které, nepoškodí-li organismus do takové míry, že by neobstál v konkurenci a tlaku prostředí, přetrvávají a hromadí se. Frekvence vzniku mutací je v čase přibližně konstantní a u příbuzných druhů velmi podobná. Analýza mtDNA 150 žen různých ras a národností.... ukázala, že .Největší rozdíly v mtDNA jsou mezi osobami afrického původu. ….. tato mtDNA je tudíž nejstarší, protože při konstantní rychlosti mutací dokázala nahromadit nejvíce odchylek. V této nejstarší vývojové větvi stromu sahající do Afriky můžeme hledat ženu, po které jsme zdědili svoji mtDNA. Na základě …. výzkumu a odhadu frekvence mutací mtDNA vědci vyslovili hypotézu posledního společného předka celého lidstva, mitochondriální Evy. ….. O mitochondriální Evě s jistotou víme pouze, že byla žena, která měla nejméně dvě dcery, jejichž potomci přežili do dnešních dní. Rychlost mutací mtDNA je pro člověka asi 2 – 4% změn za 1 milion let. Protože největší odchylky v lidské mtDNA byly necelých 0,6%, musela mitochondriální Eva žít před 140 000 – 280 000 lety. Ve své době nebyla jediná žijící žena, ale přesto pouze její genetická linie .. přežila. Tehdy pravděpodobně ve východní Africe vznikla vývojově úspěšná populace Homo sapiens, která začala postupně vytlačovat dřívější příslušníky rodu Homo nejprve v Africe a pak i ostatních částech světa. Odhadem v této zárodečné populaci žilo před 200 000 lety cca. 10 000 lidí moderního typu. Svojí expanzí nahradila potomky první migrační vlny Homo erectus, kteří se rozšířili z Afriky již před několika sty tisíci let. Homo sapiens byl ve svém tažení velmi úspěšný, neboť “vyhubil” všechny starší formy člověka a ovládnul Zemi. Základní chyba autorů mitochondriální Evy… byl předpoklad, že všechny mitochondrie jednoho jedince jsou stejné. Jejich článek vyšel rok před objevením prvního onemocnění způsobeného mutací mtDNA a formulování pojmů homoplazmie a heteroplazmie (viz shora, VM). Další námitka odpůrců teorie mitochondriální Evy se týká spolehlivosti “molekulárních hodin”. Kdyby autoři teorie pramatky vycházeli z asi 4 – 5 krát nižší mutační frekvence, posunul by se čas existence Evy na období před 1 milionem let. To by vyřešilo problém druhé migrace z Afriky: pramatka by byla příslušnicí Homo erectus, který tehdy opouštěl Afriku a začal kolonizovat svět. Autoři teorie mitochondriální Evy použili pro srovnání mutační rychlosti mtDNA lidoopů, opic a jiných savců, které jistě více odpovídají rychlostí mutace lidské mtDNA, než nízké mutační rychlosti některých druhů ryb, o které se opírali oponenti. Jiná skupina odpůrců poukázala na fakt, že změny mitochondriálního genomu mohou být podstatně rychlejší. Správnost časových odhadů
50
A. C. Wilsona a jeho teamu zpochybňuje heteroplazmií. Heteroplazmie by změnila pohled na minulost. Podle nové kalkulace by mitochondriální Eva žila před neuvěřitelnými 6000 lety. Toto číslo odporuje všem historickým poznatkům (kromě Bible). Také by se zkrátila doba osídlení Evropy i dalších kontinentů.Protože tyto propočty zjevně nejsou reálné, je možné, že “mitochondriální hodiny” by v průběhu času změnily (zrychlily) svůj rytmus.Někteří paleoantropologové zpochybňují teorii mitochondriální Evy a rozšíření jejích potomků, protože nebyly objeveny žádné nálezy dokazující migraci člověka moderního typu z Afriky a vyhubení starých populací v době asi před 200 000 lety. Tuto hypotézu vyvracejí sérií kosterních nálezů z určitých oblastí (jmenovitě např. Čína), dokazujících postupný vývoj místních populací směrem k modernímu člověku.Představa, že by nově příchozí vyhubili své předchůdce bezezbytku, není snadno pochopitelná, natož proveditelná. Takový jev se objevuje velmi zřídka. Spíše se populace alespoň částečně smísí nebo dokonce splynou. Zastánci teorie mitochondriální Evy tvrdí, že by v případě smísení populací zvláště v okrajových oblastech, kam by noví emigranti z Afriky přišli zřejmě nejpozději (například východní Asie), musely přetrvat některé linie mtDNA podstatně starší než 200 000 let. Speciální výzkum mtDNA obyvatel východní Asie nic takového nepotvrdil. Odpůrci teorie mitochondriální Evy také zpochybnili funkci programu, pomocí kterého byla zpracovávána získaná data. Pro velký rozsah vstupních údajů nebylo možno sestavit všechny potenciální vývojové stromy a vybrat ten s nejmenším počtem větví. Počítačový program si zapamatoval pouze omezený počet dosud nejúspornějších stromů a ty použil v následujícím kroku. Tento postup však nevede k nejúspornějšímu řešení, tj. ke stromu s nejméně větvemi. Někteří oponenti … nalezli strom úspornější, ba dokonce takový, ze kterého vyplýval neafrický původ pramatky. Dosud tedy neznáme optimální vývojový strom mtDNA. Přesto o starobylosti afrických mtDNA svědčí především největší procento odchylek mezi nimi. Je o polovinu větší než u asijských mtDNA a dvakrát větší než mezi australskými nebo evropskými mtDNA. Je možné, že potomci jedné ženy žijící ve zmíněném období se rozptýlili a smísili se svými sousedy. Shodou nejrůznějších okolností její dcery a dcery jejich dcer pronikaly do dalších populací a vytlačovaly potomstvo dalších žen – současnic své pramatky. Během 200 000 let se mohlo vystřídat kolem 12 000 generací, což je dostatečně dlouhá doba pro převládnutí na celém světě. Toto šíření mtDNA by nevyžadovalo kompletní vyhubení starých populací nově příchozími. Také by nebylo v rozporu s multiregionální teorií. Umožnilo by zachování morfologických kosterních znaků místních populací, jak je popsáno v této teorii. Morfologické znaky jsou určovány jadernou DNA a jejich dědičnost nijak nesouvisí s heretabilitou mtDNA. Tento přístup ani nevyžaduje předpoklad, že matka pocházela z nejprogresivnější populace. Skutečný přesun populací doprovázelo šíření jejich technologií. Zatímco v Africe se již vyskytovaly kamenné sekery, ve východní Asii nebyly nalezeny ani po době předpokládaného příchodu moderních populací z Afriky. Takováto shoda náhod vedla k převládnutí jedné mateřské linie. To lze jednoduše demonstrovat počítačovým programem, jak uvádí [II-2, str. 666]: “Představme si např. 1. generaci dvaceti matek, z nichž každá má 4 dcery (synové jsou mimo hru). Těmto osmdesáti dcerám počítač přiřadí po náhodném čísle, jehož velikost může např. reprezentovat schopnost přežití či přízeň osudu. Dcery seřadíme podle velikosti náhodných čísel a 20 “nejsilnějších” dá život druhé generaci. Každá z nich má opět 4 dcery a postup se opakuje. U každého jedince počítač samozřejmé sleduje, z které pramatky v 1. generaci vlastně pochází. Je zřejmé, že je zde vše naprosto náhodné. Po určitém počtu cyklů (generací) vždy převládnou dcery pocházející z jediné z 20 žen 1. generace. Není tato “souhra náhod” modelem, jak k převládnutí jediného typu mtDNA došlo? Existence mitochondriální Evy není tedy pouze teorie, ale matematický fakt. Y-chromosomový Adam Protože pouze muži mohou přenést chromozom Y, je možno definovat také Adama (obr. 19-4). Existuje mnohem méně variací chromozomu Y než mutací mitochondrií (samozřejmě vezmou-li se v úvahu jejich různé mutační frekvence). To znamená, že poslední společný předchůdce mužů, Ychromosomový Adam (značí se “YcA”), žil mnohem později než mitochondriální Eva. Je datován do období před 27 000 lety (další zdroje uvádějí 37 000 – 49 000 let a dokonce až před 188 000 lety [V-25]). Rozmnožení pouze jedné linie bylo způsobeno pohlavní selekcí ovlivněnou ekonomickým postavením jedinců.
John B. Ferguson http://encarta.msn.com/text_761582165__1/Mitochondria.htmlAnother use of mitochondrial DNA analysis is in forensic science. The identities of the skeletons alleged to be those of Tsar Nicholas II, the last Russian tsar, and his family were recently established using mitochondrial DNA. The mitochondrial DNA of a living maternal relative of the tsar's family was found to be an exact match to the suspected remains of the tsar's wife, Alexandra, and three children. Because mitochondrial DNA is inherited through the mother, the mitochondrial DNA of Tsar Nicholas II's skeleton did not match that of his wife and children”.
2. 4 CYTOSKELET
(obr.13,17,18,19, 33) Nejen skelet
2.4.1 Hlavní komponenty cytoskeletu a jejich funkce 2.4..1.1 Mikrotubuly 2.4.1.2 Mikrofilamenta 2.4.1.3 Střední filamenta 2-4.2 Členění cytoskeletu dle lokalizace v buňce 2.4.2.1 Cytoplasmatický cytoskelet a jeho funkce 2.4.2.2 Membránový cytoskelet a jeho funkce 2.4.2.3 Jaderný cytoskelet a jeho funkce
Cytoskelet je komplexní síť vláken různé morfologie a různého chemického složení, která prostupuje celou buňkou. Má mnohočetné funkce. Poskytuje vnitřní oporu buňce i buňkám mezi sebou v tkáních, zajišťuje intracelulární transport váčků, pohyb částí buněk i některých celých buněk pomocí specializovaných organel (bičíky, brvy, panožky). Prostřednictvím specializovaných (svalových) buněk zajišťuje i pohyb mnohobuněčných organizmů. Cytoskelet se významně podílí rovněž na příjmu informací z okolí, hlavně z extracelulární matrix. Spolu s mezibuněčnými spoji zajišťuje cytoskelet soudržnost tkání, morfogenetické pohyby orgánových základů. 51
V některých učebnicích se proto hovoří o cytoskeletálním principu organizace buňky, jakožto doplňku k membránovému organizačnímu principu (viz shora ES). Současné poznatky ukazují, že tento organizační princip lze rozšířit i na celé tkáně (viz níže adheze buněk mezi sebou a jejich úpony k mezibuněčné hmotě, kap. 5.1). 2.4.1.1 Mikrotubuly (MT). MT jsou dutá vlákénka různé délky o průměru 20 – 28 nm. Jsou tvořena převážně dimery alfa a beta tubulinu, které jsou v dynamické rovnováze mezi jejich nepolymerovanou a polymerovanou formou. Tubulin je vysoce fylogeneticky konzervativní bílkovina tj. liší se mezi jednotlivými druhy živočichů jen pořadí malého počtu aminokyselin. Geny kódující tubulin jsou na jednom nebo více chromozomech, odlišně dle druhové příslušnosti.
Polymerací alfa a beta dimerů se tvoří lineární protofilamenta, která jsou následně organizovaná do MT tak, že 13 protofilament vytvoří zpravidla 1 MT. MT jsou chemicky a funkčně polarizovaná vlákna. Tzv. minus konec je zakotven alfa-tubulinem v MTOC (viz níže) a opačný, tzv. plus konec je „osazen“ Tzv. GTP čepičkou. Polymerace tubulinu a tvorba MT začíná v tzv. mikrotubuly organizujících centrech (MTOC), ke kterým patří centriola (centrozom, viz níže), basální tělísko bičíku a cilií a chromozomální kinetochor. Nezbytné je i malé množství gama tubulinu. K polymerizaci tubulinu dochází spontánně v přítomnosti GTP, který se navazuje na beta-tubulin dimerů (tzv. GTP čepička, GTP cap), která stabilizuje MT, tj. brání jeho depolymeraci. Přidáváním nových dimerů na minus konci ( u MTOC) se tubulinové dimery posunují k periferii MT,i což spolu s pomalejší depolymerací na plus konci vede k prodlužování MT. Posun tubulinových dimerů od minus konce (MTOC) k periferii se označuje jako treadmiling MT, tj. fenomén šlapacího kola. Po hydrolýze GTP se MT začne zkracovat od plus konce k minus konci. Růst a zánik MT tak připomíná nahazování a stahování rybářského vlasce.
K MT se připojují tzv. asociované bílkoviny (MAP), které většinou MT stabilizují. MAP2 stabilizuje např. MT v dendritech nervových buněk a tzv. tau protein (tubulin-associated protein) v axonech. MAP 4 je přítomen v glii i jiných typech buněk. Mikrotubuly se účastní transportu organel a granulárních částic v buňce (transport váčků mezi organelami endomembránového systému, pohyb chromozomů při mitóze, pohyb bičíku a řasinek apod.). Transport podél MT zajišťují speciální bílkoviny, tzv. molekulové motory (syn. motor proteins). Směrem k plus konci MT váčky jsou posunovány molekulami kinezinu, k minus konci, molekulami dyneinu. Energii pro tento transport poskytuje ATP, které molekulové motory štěpí, neboť mají současně i ATPázovou aktivitu. Příkladem může být rychlý transport neurotransmiterů a některých enzymů z perikarya do synaptických zakončení v nervových buňkách dyneinem (50-400 mm/den). Transport opačným, tj. retrográdním směrem, realizovaný kinesinem slouží např. k posunu fragmentů organel ze synapsí do těla neuronu, kde dochází k jejich lysozomální dekompozici. Bezprostředně podél mikrotubulů a mikrofilament, tj. bez účasti asociovaných bílkovin, probíhá v axonech tzv. pomalý transport; slouží např. přesunu rozpustných cytosolových enzymů z perikarya do synapsí; rychlost je pouze 0.2 až 8 mm/den.
Dynein a kinezin jsou označovány též jako tzv. lineárně operující ("kráčející") molekulové motory. Dalším typem jsou tzv. rotační molekulové motory, např. mitochondriální ATPsyntáza, kde jsou uváděny do rotačního pohybu její podjednotky proudem protonů. Rotačními motory, zakotvenými v plazmatické membráně a poháněnými protony z vnějšku, jsou bičíky bakterií. Pozor: Morfologie a chemické složení bakteriálního bičíku je však velmi odlišné od bičíku eukayrot. Další bílkoviny s motorickými funkcemi viz níže mikrofilamenta a myoziny.Další bílkoviny s motorickými funkcemi viz níže mikrofilamenta a kurz molekulární biologie.
52
Centrozom (C) je drobná organela, tvořená tvořena dvěma kolmo na sebe orientovanými krátkými tyčinkam-centriolami (cca 0.2 um), z nichž každá je složena z 9 tripletů mikrotubulů po obvodě (vzorec „ 9x3 +0" ). C. je uložen ve světlejším dvorci amorfní cytoplazmy (centrosféra), který obsahuje molekuly iniciující tvorbu mikrotubulů (gamma tubulin, pericentrin, ninein aj) . Komplex tak představuje MTOC (viz polymerace tubulinu shora) živočišné buňky. V místě centrioly je tzv. minus konec MT, ze kterého MT paprskovitě vybíhají do periferie cytoplasmy. Centrozom se zdvojuje (diplozom) před mitózou, při přechodu buňky z G1 do S fáze buněčného cyklu a vytváří póly mitotického vřeténka. Jedna centriola je při duplikaci centrozomu tzv.mateřská a řídí tvorbu mikrotubulů centrioly dceřinné. Do dceřiné buňky přechází vždy jedna centriola mateřská a jedna dceřiná. Centriola.může chybět v trvale postmitotických buňkách. Chybí též u vyšších rostlin a hub. Odlišnou strukturu má např. u octomilek (9x2+0), u hlístice coenorhabditis elegans 9x1+0)
Bičík, cilie (řasinky) jsou tvořeny 9 dvojicemi (dublety) MT uspořádanými kolem jednoho centrální dvojice MT (vzorec “ 9 x 2+2 "). Obvodové (periferní) dvojice mají společnou přilehající část (neúplné dublety, typu „CO! a nikoliv „OO“). Centrální MT jsou ukotveny v bazálním tělísku, které má charakter MTOC. V místě tohoto ukotvení (kořínek bičíku) je již zpravidla pouze jeden MT. K periferním dubletům MT je přidružena bílkovina dynein, která má ATPásovou aktivitu. Energie uvolněná po hydrolýze ATP vede ke vzájemnému přichycení mikrotubulových, což se projeví jejich posunem a kmitavým či vlnivým pohybem bičíku. Periferní dvojice MT jsou připojeny k centrálním pomocí speciálních radiálně uspořádaných bílkovin („loukotě“ dřevěného kola). Některé rostlinné alkaloidy brání polymerizaci tubulinu nebo rozpadu mikrotubulů a tím i vzniku nebo rozpadu mitotického vřeténka (např. kolcicin z ocúnu, taxol z tisu, vinblastin z brčálu). Těchto účinků se využívá léčebně k zástavě dělení nádorových buněk.
Tzv. primární nepohyblivé cilie se uplatňují v percepci fyzikálních a chemických signálů z okolí. Vyskytují se u sensozorických orgánů metazoí (čich, zrak, chuť, pohyb a poloha organizmu v prostorou. Mají klíčovou funkci v tvorbě a udržování tkáňových struktur a vzniku řady vývojových poruch a dalších patologických stavů. 2.4.1.2 Mikrofilamenta syn. aktinová vláhkna (MF). MF mají průměr 5-7 nm. Vyskytují se často ve svazcích. Jsou tvořena 2 šroubovicově stočenými vlákny tzv. F- aktinu (F= fibrilární- polymerovaný aktin, který vzniká polymerací G- tj. globulárního aktinu). Aktinová vlákna mají tzv. „roztřepený“ (barbed) a „bodový“ konec (barbed a pointed end), znázorňovaný schematicky v sarkomerách v podobě opeřeného šípu. Roztřepený konec se označuje též jako plus (+) konec MF (místo novotvorby vlákna polymerizací), konec „bodový“ jako minus (-) konec. MF a jejich svazky jsou provázeny řadou asociovaných (syn. aktin-vážících) bílkovin. S molekulami myozinu zajišťují MF pohyb buněk a transportních váčků v buňce. Pohybové funkce zahrnují améboidní pohyb, proudění cytosolu do tvořících se panožek nitkovitého nebo „plachetkovitého“ vzhledu (filopodia a lameliodia), dynamické změny tvaru buněk, tvorbu a udržování mikroklků a svalový pohyb, a to jak kosterních tak hladkých svalů i myokardu. MF zajišťují též tzv. morfogenetické procesy za vývoje a cytokinezu (kap. 3.6), která následuje mitotické dělení. Energii poskytuje ATP, štepený molekulami myozinu . Transport váčků a jejich obsahu - karga („nákladů“)- v buňce k plus či minus konci je určován typem myozinu. Podle nejnovějších studií, aktinová vlákna a tzv. Actin-Related-Proteins (Arps) se účastní na přemísťování molekulárních komplexů i v jádře eukaryot. 53
Aktin je fylogeneticky vysoce konzervativní molekula (80% shody v primární struktuře molekuly v lidských a kvasinkových buňkách). V kvasinkách je aktin kódovaný 1 genem, u savců 6 geny. U savců se dle izolelektrického bodu aktin člení do 3 podskupin: aktin-α ve skeletálních a hladkých svalových buňkách, aktin ß-, γ- v buňkách nesvalových. Aktin ß u člověka má 8 izoforem Geny kódující aktin kosterních svalů, myokardu či cytoplazmatický aktin nesvalových buněk však nejsou identické. Aktin σ a ε je přítomen u některých protozoí. Homology aktinu (MreB a ParM geny) se vyskytují i u nesferických prokaryot.
Cyklus polymerace a depolymerace aktinu vyžaduje energii z ATP. Rychleji rostoucí konec MF je označován jako plus (+) konec, pomaleji rostoucí, jako minus (-) konec. G a F forma aktinu jsou ve stavu dynamického přechodu. Cyklus polymerace a depolymerace se projevuje změnami konsistence cytoplazmy (sol--gel). Probíhá např. při tvorbě améboidních panožek nebo lamellipodií ostatních buněk (např. pohyb měňavky, migrace leukocytů), tvorbě buněčných výběžků, mikroklků apod. Uvedené funkce zajišťují MF kooperací s řadou skupin asociovaných (syn. aktin-vážících) bílkovin. Kromě rozdílů v jejich složení, liší se i vazbou na (+) nebo (-) konec MF, případně k jejich středové části (Filament side binding proteins). . 1. Na tvorbě síťových struktur pod plazmatickou membránou se podílí řada molekul, které jsou uvedeny níže u tzv. membránového cytoskeletu. Přes bílkoviny vinkulin, talin, alfaaktinin se MF připojují k integrálním bílkovinám plazmatické membrány v místech tzv. fokálních adhezí, četných na bazálních polech epiteliálních buněk (viz kap. 2.3,2.4 a 5.2). Svazky takto připojených ("napnutých") MF se označují se jako "stress fibers".Viz též níže myoziny. 2. Svazky aktinových filament v mikroklcích (kartáčovém lemu) epiteliálních buněk střeva jsou příčně propojeny molekulami filaminu, vilinu, fimbrinu, alfa-aktinin 3. Filamin spojuje MF do gelové sítě v cytoplazmě a pseudopodiích. Bílkoviny gelsolin a fragmin napomáhají rozpadu (depolymeraci) těchto sítí a aktinových vláken. Myozin I se účastní pohybových aktivit plazmatické membrány (viz níže myoziny I-XVI) 4. Ve svalech jsou hlavní asociované bílkoviny myosin, troponin a tropomyosin, nebulin. Tropomyosin podélně „obtáčí“ aktinové vlákno a váže globule troponinu. V tzv. klidovém stavu jsou jimi blokovány místa, na které se může na aktinové vlákno připojit hlavička myosinu, která byla před tím „napružená“ energií z ATP, zvětšením úhlu mezí ní a tzv. ocáskem myosinu (myosin tail). Bočně asocijující nebulin udržuje pravidelné rozložení MF v sarkomeře svalové tkáně Viz též níže kap. 5.2 . V kosterních svalech jsou MF zakotvena do sarkolemy specifickým proteinem dystrofinem. Vrozená mutace této bílkoviny vede k těžkých poruchám stavby a funkce svalů, tzv. dystrofickým změnám (odtud jeho jméno, neboť studium této choroby vedlo k objevu této molekuly i její funkce). Více ve Fyziologii živočichů.
Myosiny se vyskytují v několika isoformách (I-XV). Nejdůležitější isoformy jsou I a II. Myosin I je monomerní, ostatní tvoří dimery. Každá isoforma je tvořena těžkým a lehkým řetězccem. Na těžkém řetězci lze rozlišit několik částí: tzv. hlavičku, mající ATPázovou aktivitu, flexibilní „krček“ a stočený molekulární „ocasek“ (angl. head, neck a tail). Délka ocásku jednotlivých izoforem se liší. Je nejkratší u myosinu I . Ocásek myosinu II má helikální strukturu, která umožňuje tvorbu myosinových dimerů (jejich vzájemným „obtočením“). Rozdíl je i v jejich afinitě k ostatním buněčným molekulám a organelám. „Ocásek“ myosinu I a V se přednostně váže na membránové struktury, zatímco ocásek myosinu II se váže na aktinová vlákna.
54
To, spolu s afinitou hlavičky k aktinu u obou typů myosinů, předurčuje myosin I a V k intracelulárnímu transportu váčků, zatímco myosin II ke svalovému pohybu. Myosin II v membránovém cytoskeletu (viz kap. 2.4) se účastní rovněž undulačních pohybů plazmatické membrány a migrace buněk. Mechanismus pohybových funkcí myosinu spočívá v kývavém pohybu hlavičky. V klidovém stavu hlavička svírá s krčkem a ocáskem ostrý úhel, který se může zvětšit (více otevřít- „napružit“) energií z ATP, uvolněné enzymatickou (ATPázovou) aktivitou hlavičky. Návrat „hlavičky“ do původního stavu vede, při současném jejím připojení na aktinové vlákno, k jeho posunu ve směru kmitu hlavičky. Tím se např. v kosterním svalu myosinová a aktinová vlákna po sobě posunouzasunou se, a celý komplex (sarkomera, viz kap.5.2) se zkrátí, což se projeví kontrakcí- stažením svalu. V případě transportu váčků v cytoplazmě myozinem I nebo myozinem V se komplex myozinváček (napojený na krátký těžký řetězec myozinu) posouvá po aktinovém vláknu k jeho plus, tzv. roztřepenému konci. Opačným směrem posouvá váčky myozin VI. Svalový stah je iniciován depolarizací membrány svalové buňky acetylcholinem vyplaveným z nervového zakončení (nervosvalová ploténka). Tím dojde k uvolnění Ca2+ ze sarkoplazmatického retikula a aktivaci ATPázové aktivity myosinu. Zvýšení Ca++ vede rovněž ke změně konfigurace tropomyosinu a troponinu tj. jejich odklonění, čímž se na aktinovém vlákn uvolní místo pro připojení „napružených“ hlaviček myosinu. Jak již zmíněno shora, uvolnění tohoto napružení vede k "zasunutí" se obou těchto komponent MF ke středu tj. zkrácení komplexu. Sumace těchto drobných mikroskopických zkrácení se projeví zkrácením celého svalu. Tento model tzv. klouzavé kontrakce svalu bude probírán podrobněji ve Fyziologii živočichů a člověka (viz též kap. 5.2). Krček těžkého řetězce je obtočen kratším tzv. lehkým bílkovinným řetězcem, který má schopnost vázat Ca++ ionty, které aktivují ATPázovou aktivitu myosinu. Ca++ vázající protein v oblasti krčku se u jednotlivých typů myosinů liší. Více v Molekulární biologii. Kromě shora uvededných aktin-vážících proteinů, v literatuře je jich popsáno několik dalších desítek
2.4.1. 3 Intermediární (střední) filamenta (IF). IF jsou vlákna tvořená několika typy bílkovin, specifických pro jednotlivé základní živočišné tkáně ( kap.5, obr.6 E). Jsou však vždy tvořena z tetramerických, neperiodicky uspořádaných protofilament (8 v jednom IF), dávajících IF velkou pevnost. IF poskytují buňce mechanickou oporu a spolu s některými typy mezibuněčných spojení (desmozomy, viz shora), podílí se na stavbě a funkci mezibuněčných spojení typu bodových desmozomů, které zajišťují soudržnost buněk v tkáních, např. v epitelech. V hladkých svalových buňkách zabraňují jejich nadměrnému pasivnímu protažení (kap. 5.2) apod. IF tvořená bílkovinou vimentinem se vyskytují v buňkách pojivových tkání. IF obsahující cytokeratiny (20 různých typů) se vyskytují v epitelových buňkách. IF tvořená bílkovinou desminem jsou např. v buňkách svalových. Tzv. gliový kyselý fibrilární protein (GFAP) je astrocytech nervové tkáně. Neurofilamentové proteiny jsou v buňkách nervových. Nestin v nezralých prekurzorech nervových a svalových buněk. K IF jsou řazeny též laminy jaderné blány (viz shora 2.4.a příloha obr. 17 C) 2. 4. 2 ČLENĚNÍ
CYTOSKELETU DLE LOKALIZACE V BUŇCE
(obr.17 A,B,C)
I když cytoskelet tvoří v buňce souvislou síť, která v jistém smyslu přechází i z buňky do buňky (viz extracelulární matrix kap. 6.1), dle lokalizace v buňce se z obvykle člení do 3 oddílů: (i) cytoplasmatického (ii) membránového a (iii) jaderného.
55
2.4.1 Cytoplasmatický skelet je tvořen nepravidelnou sítí vláken mezi jádrem a plazmatickou membránou tvořená MT, IF a MF. MT vycházejí z centrioly a zajišťují nitrobuněčný transport organel, především transportních váčků. IF se bočně se upínají k bodovým desmosomům a zajišťují tvar a mezibuněčnou oporu buněk. MF se upínají k pásovým desmozomů, hemidesmozomům a fokálním adhesím plazmatické membrány, zpravidla přes kratší bílkovinné mezičlánky (viz shora aktinové "stress fibers"). Mají motorické funkce a účastní se změn v utváření povrchu buňky (pseudopodia, mikroklky), podílí se na adhezi buněk k extracelulární matrix, růstové podložce v buněčných kulturách apod.). 2..4.2 Membránový skelet (buněčný "kortex"), je síť bílkovin pod plazmatickou membránou, tvořená krátkými proteinovými vlákny a globulemi, vázanými z vnitřní strany membrány na její integrální proteiny. Tyto se zevně napojují na bílkoviny extracelulární matrix (exoskelet, viz též kap.5.1). Membránový skelet ovlivňuje vlastnosti a funkci plazmatické membrány (fluiditu, poddajnost, tvorbu pseudopodií, filo- a lamelipodií, přenos chemických signálů do cytoplazmy, váčkový transport, poddajnost plazmatické membrány, apod.). Studie na erytrocytech ukázaly, že síť membránového skeletu je tvořena tetramery bílkoviny, spektrinu propojených krátkými řetízky aktinu a globulemi několika dalších bílkovin (protein 4.1, ankyrin, adducin a další), kterými je síť připojena k integrálním bílkovinám PM. Analogickou, i když složitější spektrin-aktinovou mřížku s jinými izoformami spektrinu a speciálními spojujícími molekulami (např. tzv. dystrofin ve svalechviz shora, filamin v trombocytech, ezrin v epiteliálních buňkách, apod.), lze nalézt ve většině buněk (Obr.18 c). 2.4.3 Jaderný skelet. Jak již uvedeno shora, na vnitřní straně jaderné blány je jemná síť, jaderná lamina tvořena středními filamenty (bílkoviny Lamin A, B,C, viz shora IF), ke které jsou zakotveny chromozomy buněk v interfázi. Na jadernou laminu se připojuje další velmi jemná síť, jaderná matrix, která prostupuje celým jádrem a je tvořena několika typy bílkovin (aktin, aktin-related proteins-arps, myosin I a další). Zajišťuje vnitřní prostorovou organizaci jádra, tj. konformační změny chromozomů a chromatinu, transport molekul vznikajících v procesu transkripce genomu (m-RNA, rRNA a některé další molekuly), některé receptorové funkce, apod. Jaderná lamina se podílí na rozpadu jaderné blány na začátku mitózy a jaderná matrix je zřejmě i cílovou strukturou některých onkoproteinů, regulujících buněčný cyklus (viz kap. 3.5).
2. 5 JÁDRO (NUCLEUS, KARYON) (obr. 6-12, 17 C, 20-22) 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.3 2.5.4
Chromatin Chromozomy Geny, transpozony, nekódující DNA Jadérko (nucleolus) Karyoplasma (nukleoplasma)
Databanka & velín
Trochu historie 1886 1871 1888 1944
Nepřímý důkaz korpuskulárních "párů faktorů", jakožto nositelů dědičnosti G. Mendelem Objev nukleové kyseliny Popis "jaderných tělísek", chromozomů neznámé funkce, v dělících se buňkách Identifikace geneticky transformujícího materiálu s nukleovou kyselinou
56
1953 Poznání struktury DNA 1961 Rozluštění genetického kódu 1977 Začátek mapování lidského genomu 1954 Přečtení prvního genomu (bakterie Haemophilus influenze) 1995 Zveřejnění první verze lidského genomu 2003 Zmapování lidského genomu (nikoliv však jeho smysluplného čtení tj. stále rozumíme jen zlomku textu)
Jádro je paměťové a řídicí centrum buňky. Je nositelem tzv. jaderné genetické informace (viz též kap. 3.3). Tvar a velikost jader v buňce značně kolísá, od malého kulovitého (lymfocyty) po veliké (neurony) až silně laločnaté (granulocyty). Buňky mohou obsahovat 2 i více jader. Jádro je oddělené od cytoplasmy dvojitou jadernou blanou a označujeme jej proto jako pravé jádro. 2. 5. 1 Chromatin
Chromos= barevný
Chromatin je materiál viditelný v jádře již světelným mikroskopem po obarvení běžnými histologickými barvivy (hematoxylin, toluidinová modř a pod) nebo v běžném elektronmikroskopickém obraze. Chromatin tvořen DNA, RNA a bílkovinami. Jádro lidské buňky obsahuje např. zhruba 6 pg DNA, 1-3 pg RNA a 35 pg bílkovin. Někdy se uvádí, že při celkové délce molekuly DNA v buňce 1-2 m a velikosti jádra 5-10 um, by v tenisovém míčku muselo být organizovaně svinuto cca 20 km nitě. Způsob této organizace viz níže. Základní stavební supramolekulární jednotkou chromatinu jsou nukleosomy. Nukleozom je tvořen molekulou DNA o délce zhruba 200 nukleotidových párů (200 bp, base pairs). Z toho 146 párů je navinuto na glubuli-oktetu histonů, tvořeného 2x [H2A, H2B, H3 a H4] molekulami 2A, 2B, 3 a 4. Zbývající páry nukleotidů,tzv. punker DNA, jsou obalených histonem H1 a tvoří spoj mezi jednotlivými nukleozomy. V EM tak vzniká obraz podobný korálkům navlečeným na niti. DNA tvoří vždy 2 superhelixy (otočky) kolem každého nukleozomu, vč. spojovacího H1 histonu. Histon H4 je fylogeneticky vysoce konzervativní. Rozdíl v primární struktuře této bílkoviny v telecím thymu a hrachu je pouze ve 2 aminokyselinách (z celkového počtu 102). Vysokou druhovou specifitu vykazuje histon H1, který se uplatňuje v regulaci transkripce DNA (viz níže). V samčích spermiích jsou histony nahrazeny polyaminy
Řady nukleozomů se stáčejí do spirály (solenoidu), vždy s šesti nukleozomy v jedné otočce spirály. Jejich dalším stáčením se vytvářejí chromatinová vlákna o průměru 30 nm, která se dále spirálovitě stáčejí a vzniká chromatin různého stupně kompaktnosti. Vysoce kompaktní je tzv. heterochromatin, který představuje silně se barvící hrudky v jádře. Málo kompaktní a málo se barvící je tzv. euchromatin. Stupeň kompaktnosti chromatinu je zpravidla nepřímo úměrný rozsahu a intensitě transkripce genů. Podíl hetero- a euchromatinu se v buňce může měnit. Trvale kondensovaný heterochromatin se označuje jako konstitutivní (např. jeden X chromozom v jádrech buněk samic vyskytující se zpravidla v blízkosti jaderné blány, jako tzv. Barrovo tělísko, nebo jako paličkovity přívěsek laločnatého jádra v leukocytech). Dočasně kondensovaný heterochomatin se označuje jako fakultativní. Upořádání chromatinu je velmi komplexní a vysoce organizované, neboť musí dostupnost DNA pro výběrovou transkripci genů (viz kap. 3.3)
umožnit 57
Významnou úlohu v regulaci kondenzace chromatinu a exprese genů mají jaderné bílkoviny. Např. fosforylace H1 histonu kondezaci chromatinu zvyšuje. Acetylace histonů působí rozvolnění chromatinu. Uskutečňuje se neutralizací jejich kladného náboj, což snižuje jejich vazbu s DNA, která se tak stavá přístupnější pro molekuly zajišťující transkripci genu. Hypoacetylace histonů je naopak jevem charakteristickým pro neaktivní chromatin. Stupeň acetylace je regulován aktivitou histon acetyltransferázy a histon deacetylázy. Modifikace histonů, spolu s metylací DNA (viz kap. ….) ovlivňují genovou expresi beze změn v primární struktuře DNA . Změny v expresi genů zůstavají zachovány v dceřinných buňkách a proto se tyto změny/regulace genové exprese nazývají epigenetické. Uplatňují se jak fyziologicky v časném vývoji organizmu při tvorbě/diferenciaci základních buněčných fenotypů a mohou být též příčinou některých poruch.
V jádře eukaryontních buněk se vyskytují rovněž tzv. nehistonové bílkoviny (anionické„kyselé“) bohaté na dikarboxylové aminokyseliny (glutamová, asparagová). Učastní se regulace replikace a transkripce DNA. Jedna jejich skupina, mající vysokou elektroforetickou pohyblivost se označuje jako HMG (High Mobility Group). Účastní se na regulaci distribuce chromatinu a v kooperaci s transkripčními faktory i regulace transkripce DNA. 2. 5. 2 Chromozomy Chromozomy jsou dobře patrné v kondensované („sbalené“) formě v buňce ve stádiu mitózy buněčného cyklu. Mitotický chromozom tvoří 2 chromatidy spojené v zúženém místě zv. centromera. Na některých chromozomech jsou další, tzv. sekundární konstrikce. Centromera může být zhruba uprostřed chromozomu (chromozomy metacentrické), nebo posunuta méně nebo více k jednomu pólu (chromozomy submetacentrické ). Centromeru na koncích chromatid mají chromozomy akrocentrické. Cenromerou oddělené části chromozomu se označují jako raménka chromozomu (raménko p a q). Chromatin centromery se liší od ostatních částí chromozomu (opakující se sekvence nukleotidů, protein CENP-A místo histonu H3) V nedělící se buňce, nebo v mezidobí mezi dvěma následujícími mitózami, jsou chromozomy silně rozvolněné (dekondenzované) a tvořené pouze jednou chromatidou. Jejich uspořádání v jádře však není náhodné. Mají vymezené své domény, podporované jejich úpony k lamině jaderné blány. K centromeře přiléhá mističkový proteinový komplex, kinetochor, na který se upíná část vláken mitotického vřeténka. Zvláštní typ chromozomů jsou tzv. chromozomy polytenní (syn. obří, giant chromosomes) a chromozomy štětkovité. Chromozomy polytenní (syn. obří, giant chromosomes) se vyskytují ve slinných žlázách dvoukřídlého hmyzu. Jsou tvořené velkým počtem chromatid, které se vytvořily opakovanou replikací chromatid nenásledovanou jejich mitotickým (tzv. endomitóza). Na některých místech těchto chromozomů se vyskytují bublinovitá rozšíření, tzv. Balbianiho prstence (syn. puffs). V těchto místech došlo k rozvolnění chromatid v důsledku aktuálně probíhající transkripce DNA. Chromozomy štětkovité chromozomy (syn. lampbrush chromosomes), mají podobu kartáčů používaných dříve na čištění petrolejových lamp (dnes např. zkumavek v laboratořích). Vyskytují se ve vajíčkách v diplotenní stádiu profáze heterotypického dělení (meioza I, viz kap. 6.2) u některých živočichů (korýši, obojživelníci, ptáci). Štětkovitý vzhled vytvářejí do stran vybíhající kličky rozvolněných chromatinových vláken, na kterých probíhá aktuálně syntéza mRNA (viz kap. 3.3)
Koncové části chromozomů se označují jako telomery. Tvoží tzv. nelepivé konce chromozomu, které zabraňují mj. lineárnímu spojování chromozomů mezi sebou.
58
Telomery jsou předmětem intensivního studia. Ukázalo se, jejich replikace v S-fázi buněčného cyklu není úplná) a při opakovaném dělení buňky se proto i zkracují. Při jisté kritické hodnotě jejich délky buňka ztrácí schopnosti dalšího děliteni. To je jedna z příčin tzv. generačního stárnutí buněk. Opačný typ změn vede ke vzniku transformovaného (syn. nádorového) buněčného fenotypu, vyznačujícího se trvalou proliferací (generační nesmrtelnost buňky, viz též kap. 3.5 a 4.4). Genom člověka obsahuje 92 telomer (46x2). U některých protozoí je jejich počet mnohonásobně vyšší.
Počet chromozomů v jedné tzv. chromozomální sadě zdravé buňky jednoho živočiš-ného druhu je konstantní. Liší se však značně mezi jednotlivými druhy živočichů. Např. pes má 39, žížala 18 párů chromozomů. Člověk má 23 párů chromozomů (celkem 46), z toho je 22 párů je tzv. autozomálních (autozomy) a 1 pár pohlavních (gonozomy). Chromozomy tvořící ekvivalentní páry se označují též jako homologní (autozomy), páry s nestejnými chromozomy (XY), jako chromozomy heterologní (gonozomy). Geny lokalizované na stejném chromozomu jsou tzv. ve vazbě Buňky obsahující základní sadu chromozomálních párů (tzv. 2N počet, kde N= number) se nazývají diploidní. V některých buňkách (např. játra a myokard mohou být 2 a více sad chromozomálních párů (buňky tetra-, okto- polyploidní). Souborně se označují jako buňky euploidní. V procesu gametogezene dochází k redukci chromozomů na jeden z každého chromozomálního páru (haploidní počet, viz kap. 6.2). V nádorových buňkách bývá základní počet chromozomů „nenásobkový“ (aneuploidní buňky). Obsah DNA v jedné sadě chromozomů se označuje „DNA Complement“. Celkový obsah DNA v jádře proto se označuje jako 2C DNA. Srovnej s 2 N počtem chromozomů (shora)
Soubor všech chromozomů představuje karyotyp buňky. Chromozomy uměle seřazené dle velikost a tvaru je tzv. karyogram (syn. idiogram) . Soubor všech genů buňky představuje (genotyp). Soubor všech znaků buňky, či organizmu, určovaný exprimovanými, tj. transkribovanými či "přepisovanými" geny, se nazývá fenotyp. Další vymezení těchto pojmů v předmětu Genetika. Vědní obor zabývající se strukturou (pořadím basí) DNA v u a jednotlivých genech pomocí biotechnologických metod, příp. i jejich funkčním významem, se nazývá genomika (ev. funkční genomika). Významnou novou substrukturou jádra jsou tzv. perichromatinová granula a fibrily; nacházejí se na okrajích kondenzovaného chromatinu a jsou místem intenzivní transkripce DNA. V normálních, častěji však patologicky změněných buňkách, se vyskytují rovněž tzv. nukleární tělíska. Jejich původ a význam není zcela jasný (pravděpodobně se uplatňují při zrání ribozomální RNA).
Sestavování karyotypu. Pro ověření chromozomálních poruch, např. u plodů s podezřením na vrozené vady, je třeba chromozomy sestavit do homologních párů do skupin, lišících se velikostí chromozomů a jejich typem (polohou centromery), v pořadí od větších k menším, s umístěním pohlavních chromozomu jako posledních. Pro tento účel se chromozomy isolují z mitotických buněk vystavených hypotonickému šoku, který vede k prasknutí plazmatické membrány a „vysypání“ se chromozomu do nejbližšího okolí, čímž se vzájemně separují. Skládaní homologních párů usnadňují tzv. proužkování chromozomů. Tzv. G-proužkování je výsledkem barvení Giemsovým roztokem po předchozí mírné digesci chromozomů trypsinem. Tmavší proužky jsou místa méně intensivní transkripce a četnějších A-T bazí. Světlejší proužky pak místa s vyšší transkripcí a vyšší četností G-C basí. Q-pruhování spočívá v obarvení chromozomů flurochromem Quinacrinem. R-pruhování (Reverse banding) je barvení Giemsovým roztokem po krátkodobé zahřátí vzorku. Tmavší pruhy odpovídají světlejším při použití G-proužkovacího barvení. Dříve byly takto vizualizované chromozomy ofotografovány a do homologních dvojic a skupin sestaveny ručně po rozstříhání fotografie. Dnes k tomu slouží počítačové programy pro analýzu programu
59
2. 5. 3 Geny, transpozony, nekódující DNA
Potřebné i zbytečné (?)
Gen (termín poprvé použitý dánským badatelem W. Johansenem v r. 1909), též cistron či vloha, označuje úsek DNA který obsahuje informaci pro primární strukturu jednoho polypeptidu (strukturní geny), nebo molekulu rRNA či tRNA. U prokaryot vytváří často několik strukturních genů společně regulovanou jednotku, tzv. polycistronní gen. Tzv. regulační geny jsou úseky DNA, které ovlivňují expresi sousedních strukturních genu, po navázání specifické bílkoviny, transkripčního faktoru (viz kap. 3.3 a 3.6. a bakteriální operon) Geny kodující bílkoviny nezbytné pro zajištění základní stavby a funkce každé buňky (dělení, transport látek, přeměna látek-metabolizmus, syntéza bílkovin, bílkoviny membránových organel,cytoskeletu, risozomů, nukleozomů a pod.) se označují jako geny „provozní“ nebo „house-keeping“ („dům-udržující“). Ostatní geny zajišťují speciál-ní funkce, např. syntézu neurotransmiterů v neuronech, syntézu protilátek lymfocyty, hormonů, jedů u nižších obtratlovců apod. Počet strukturních genů u různých živočišných druhů se velmi liší. Drosophila melanogaster má např. cca 13 500 genů, mikroskopická hlístice Caenorhabtidis elegans 19.000 genů. U amphioxa (phylum chordata) 22.000. V lidském genomu se odhaduje počet genů na 25 000 - 30 000 (dřívější odhad 100 tisíc genů byl tedy značně redukován). Počet genů se sice v průběhu fylogeneze se zvyšuje, avšak nikoliv uměrně stupni vývoje živočichů a někdy je patný i opačný trend (myš má např. větší počet genů než člověk). U člověka se však významně zvyšuje obsah tzv. nekódující DNA (viz níže a kap 3.3 a 3.6). Celkový počet proteinů v buňce, tzv. proteom (= protein complement of the genome) však může být, zvláště u fylogeneticky nejvýše postavených živočichů o mnoho vyšší než počet genů, a to v důsledku modifikací bílkovin daných variabilitou sestřihu pre-mRNA, editace mRNA a post-translačních úprav bílkovin (viz kap. 3.3). Projekt HUGO (Human Genome Mapping Organization) http://www.hugo-international.org/ se zabývá objasňováním složení lidského genomu, který obsahuje zhruba 3 mld párů nukleotidových bází, což by mohlo tvořit asi 100 000 genů. Současný odhad počtu genů je jen 25 000-30 000. Projek HUGO byl zahájený na počátku 90. let 20. století, s předpokládaným ukončením v roce 2005. Přesto byl draft lidského genomu publikován již v únoru roku 2001. Mezinárodní tým vědců oznámil dokončení plné identifikace lidského genomu 14. dubna 2003 (k 50. výročí objevu dvoušoubovice DNA). Pozn. VM. Smysluplné čtení celého lidského genomu (tj. znalost všech konkrétních bílkovin, které jsou jednotlivými jednotlivými geny kódovány) však ještě stále chybí. Jaké jiné –omy ješte existují? Aby byla stuace pokud možno ještě komplikovanější, ….na nedávném sympoziu „Proteomic Forum 2001” v Mnichově intenzivně diskutovalo … též o DNA methylacích (methylom), proteinových glykosylacích (glykom) a fosforylacích (fosfoproteom) při buněčné signalizaci (signalom), …..(slovníček rychle proliferujích –omů a –omik lze nalézt mj. na -Omes and -omics glossary), Projekty řešené současnou proteomikou jsou orientované převážně …na řešení … problémů biomedicinského výzkumu. Velké americké státní instituce, jako je National Cancer Institute (NCI) nebo U.S.Food and Drug Administration (FDA) horují pro … výchovu odborníků v proteomice ….tak, aby se příslušná vyšetření co nejrychleji dostala k lůžku pacienta. Dva příklady takových projektů jsou uvedeny na obr. 1. Stejně jako se dostávájí do rutinního použití DNA diagnostické metody, počítá se s použitím speciálních technik laserového odběru asi jednoho tisíce buněk normální a nádorové tkáně, jejichž proteiny budou separovány na dvojrozměrných gelech, a abnormální proteiny identifikovány, produkovány rekombinantně, a řešena jejich trojrozměrná struktura jako podklad pro racionální farmakologickou intervenci (obr.1, horní panel). Podobně… v krevním séru…. budou vzorky séra podrobovány rutinní analýze po podání bežných léčiv, aby bylo možné hodnotit, které proteiny byly po podání léčiva indukovány, popřípadě které….. viz http://www.czproteo.cz/proteomics.cs.php Kráceno V.M.
Pozoruhodným však je, množství DNA kódující proteiny, či molekuly RNA nezbytné pro syntézu bílkovin představují často jen zlomek jejího celkového množství jaderné DNA. U člověka, je to např. pouze asi 1.5 - 3 %. Zbývajících zhruba 97% DNA představuje tzv. nekódující DNA (Junk DNA), jejíž význam, pokud nějaký, je nejasný (viz níže). Geny se liší svou velikostí., tj. počtem nukelotidových tripletů kódujících aminokyseliny bílkovin. Většina bílkovin člověka je tvořena řádově stovkami aminokyselin. Některé, jako např. svalové bílkoviny dystrofin a titin až několika tisící. 60
Geny jsou na chromozomech eukaroyntních buněk uspořádány lineárně ("za sebou"). Geny na jednom chromozomu tvoří vazebnou skupinu (geny jsou tzv. ve vazbě). Lokalizace většiny genů na chromozomech je stabilní, každý gen má svůj tzv. lokus. Některé segmenty DNA jsou však schopny se přemisťovat v rámci genomu. Tyto segmenty, tzv. transpozony (T, „skákající geny“). Za jejich objev (v kukuřici !!! v r. 1944) byla v r. 1983 udělena Nobelova cena Barbaře McClintockové). Mohou ovliv- ňovat transkripci strukturních genů (kap. 5.7). T. obsahují tzv. jádro tvořené opakovanými sekvencemi nukleotidů, na jejichž konci je kódován enzym transpozáza, který umožňuje vyštěpování a přemísťování transpozomu. Tvoří několik skupina představují až desítky % celkové DNA. Tzv. retrotranspozony se nejprve přepisují do mRNA a teprve posléze procesem reverzní transkripce, tj. zpětným přepisem do DNA , se začlení do nového místa v genomu. Jejich počet se v průběhu fylogenetického vývoje zvyšuje. V lidském geonomu tvoří až desítky procentcelkové DNA . Jedna skupina, tzv. Alu sekvence, je v lidském genomu přítomna v celém rozsahu genomu asi v počtu půl milionu kopií. Dělí se několika skupin, které se liší stupněm přemísťovací autonomie. Některé z nich (LTR retrotranspozony) jsou blízké svou genetickou informací retrovirům. Většina DNA transpozonů u člověka neobsahuje použitelné genetické informace. Nicméně, nelze vyloučit, že se nějakým způsobem uplatňovaly ve fylogenezi živočichů, vč. člověka. Jsou proto dnes řazeny do tzv. DNA „haraburdí“, viz níže. Pomocí molekulárně biologických metod je však je možno některé z nich oživit (jeden z nich je známý jako tzv. „sleeping beauty“, šípková Růženka) s cílem učinit z nich terapeutické nosiče „zdravých“ genů do poškozených částí genomu. Významně fyziologicky se však uplatňují některé retrotranspozice. Např. U obratlovců, fyziologická transpozice genů pro konstantní a variabilní část molekuly imunuglobulinů zvyšuje obrovsky variabilitu protilátek tvořených lymfocyty. K transposicím genů dochází i v rýhujících vajíčkách a ve stárnoucích buňkách. Transpozice genů u bakterií a některých protozoálních intracelulárních parasitů (např. trypanozom) vede ke změnám jejich povrchových glykoproteinů (antigenů), což zvyšuje jejich odolnost vůči obranným imunitním reakcím i antibiotikům. Více ve Fyziologii a Mikrobiologii a Virologii. http://biol.lf1.cuni.cz/ucebnice/repetitivni_dna.htm
Počet genů na jednotlivých chromozomech se značně liší. Na chromozomu 19 je např. u člověka 23 genů na 1 milion nukleotidových párů (BP). Na chromozomu 13 je to pouze 5 genů na 1 mil BP.. Některé geny vykazují vysokou konservativnost tj. liší se poměrně málo u fylogeneticky vzdálených druhů. Některé geny se objevují až na jistém stupni fylogeneze. U bezobratlých chybí např. geny kódující bílkoviny imunitních reakcí, srážlivosti krve, geny tzv. tkáňové slučivosti apod. Mechanizmy změn struktury a počtu genů viz Evoluční biologie. Zamyšlení nad důsledky přečtení kompletní lidské genetické informace, http://denicek.net/zamysleni-nad-dusledky-precteni-kompletni-lidskegeneticke-informace.html “…..Přečtení kompletní lidské genetické informace (přesněji 97%, repetitivní sekvence v té době přečteny nebyly) bylo oznámeno 26. června 2000. …..Lidský genom je sice přečtený, to však ale zdaleka neznamená, že je to hotové . Sice byly sekvenovány všechny nukleotidy, ale jen po malých částech, které je nyní nutné poskládat ve správném pořadí.Ani zde však práce ještě nekončí, vlastně její nejdůležitější část teprve začíná a čeká zde jistě spousta překvapení. Je sice hezké, že knihu lidského genomu máme sestavenou, ale nevíme zatím, co se vní přesně píše neznáme funkci všech genů, jaké jsou jejich bílkovinné produkty a což je možná ještě záludnější problém vzájemné vztahy. Právě výzkum bílkovinných produktů jednotlivými geny je navíc komplikován faktem, že v důsledku alternativního sestřihu z jednoho genu může vzniknout více než jeden typ bílkoviny (v extrémním případě 30 000) (1). Proces sekvenování byl sice ukončen o celé tři roky dříve, než odhadovali ti nejsmělejší, ale jak dlouho potrvá, než vše, nebo aspoň část na které bude možné založit další konkrétní činnost, pochopíme? Navíc mi nezbývá než souhlasit s F. Cvrčkovou, která píše (2): Troufám si ale pochybovat, že právě znalost našeho vlastního genomu významně přispěje k obecnému pochopení zásadní biologické otázky, jak se z neživých molekul dělá živé tělo. Projekt čtení lidského genomu je nejdražším svého druhu vůbec, přitom genetická informace jiných (nižších) živočichů byla známa už před tím (první bakterie Haemophilus influenzae). Bylo skutečně nutné již nyní přistupovat k tak nákladnému procesu? V budoucnosti lze předpokládat zdokonalení jak metodiky tak techniky a tím pádem i zrychlení a hlavně zlevnění celého procesu. Nebyly by již
61
vynaložené peníze užity efektivněji a hlavně užitečněji, kdyby z nich byly zaplacené podrobné analýzy již přečtených genomů? Nechci význam celé záležitosti nijak shazovat, ale z celého počínání mám zatím dojem, že knihy pouze hromadíme, místo abychom se v nich učili číst. F. Cvrčková (2) píše: budeme si muset počkat, až Craig Venter (pozn. ředitel Celera Genomics) osekvencuje ještě genom myši, na které se aspoň dá experimentovat. Na současném stupni poznání by asi opravdu bylo užitečnější znát genom myši, jehož čtení je stejně náročné jako u každého jiného savce a tedy i člověka. A ještě mnoho hlodavců bude muset, bohužel, zemřít, než se lidé dočkají prvních výsledků. Většina genomu je navíc pro myš i člověka společná, takže přenést znalosti ze zkoumání myšího genomu na člověka by bylo jednodušší, než se pyšnit tím, jakého ohromného výsledku jsme dosáhli a zároveň si lámat hlavu, co vlastně s ním, když máme tak svázané ruce. Nepochybuji, že poznávání funkce všech genů se bude postupně dařit. Jedním z prvních překvapivých zjištění bylo, že genů není dříve odhadovaných 50 000 100 000, ale pouze kolem 38 000. Nejjednodušší jistě bude nalézat (a odhalovat funkci) geny velkého účinku, které však způsobují jen 2% onemocnění (např. cystická fibróza) a ovlivňují kvalitativní znaky jako je třeba barva očí. Zbylých 98% onemocnění může být ovlivněno geny malého účinku, přičemž jejich konkrétní konstelace může být v jedné situaci nevýhodná a v druhé naopak výhodná (3). Konkrétní problémy, před kterými po přečtení lidského genomu stojíme se úzce dotýkají problematiky ochrany osobních informací, diskriminace na základě jejich znalosti a jejich zneužití, dále prenatální i postnatální diagnostiky, vlivu diagnózy jedince na jeho okolí a mnoha dalších. Zároveň se však nabízí možnost efektivní prevence a léčby nyní smrtelných a neléčitelných onemocnění, která s sebou ale opět přináší otazníky v podobě omezené dostupnosti těchto metod a nové eugeniky . Každá odpověď vyvolává celou řadu dalších otázek, které bude nutné řešit jak na poli legislativním, tak především filosoficko-etickém. Diskriminace na základě genetické informace Pakliže dojde ke genetickému testování pacientů na některé dědičné nemoci, poruchy či disposice, je bezpodmínečně nutné, aby se tyto testy uskutečňovaly jen za výslovného souhlasu pacienta a jejich výsledky byly kvalitně chráněny. Jak ve svém článku dokládá M. Lipoldová (3), není možné o těchto problémech mluvit jako o vzdálené budoucnosti, nýbrž jako o současnosti: Poté, co lékaři otestovali populaci beduínů (arabských kočovníků) na přítomnost recesivní mutace v genu působící metabolickou chorobu leucinózu, začal kmen pozitivní jedince diskriminovat. Ženy s touto mutací se nemohou vdát a muži se musejí ženit mimo kmen. Chtějí-li kyperští Řekové získat povolení k sňatku, musejí předložit potvrzení, že byli geneticky testováni na mutace vyvolávající talasémii (dědičnou chudokrevnost způsobenou tvorbou abnormálního hemoglobinu. Zatím se jedná jen o lokální záležitosti (a i ty by bylo žádoucí zastavit), ale co kdyby se takovéto praktiky rozšířily masově? Pacient by se stal vůči rozhodnutím pojišťoven pokud by nějaké (v dobrovolném pojišťovacím systému) existovaly a zaměstnavatelů zcela bezmocný. Naplnily by se tak orwellovské vize s tím rozdílem, že Velký Genetický Bratr by sice neovládl naši mysl, ale jádra našich buněk a lidé geneticky nezpůsobilí by sice nebyli vaporizováni (pozn. zmizeni, vymazáni z existence i dějin, viz. George Orwell: 1984), ale zato zcela ignorováni, nejen na trhu práce. Jaký rozdíl? Naštěstí naše společnost k takto katastrofickým vizím nesměřuje, chtělo by se říci, ale vždyť sehnat vzorek DNA libovolného člověka je tak snadné! Stačí přece použitá sklenice, zbytek cigarety; obezřetnost je na místě. Legislativně pravděpodobně půjde vycházet ze stávajících zákonů, pokud dojdeme konsensu na poli etickém, ale jak se účinně zneužití bránit, když to, že zaměstnanec byl vyhozen na základě (např. pokoutně provedených) testů své DNA a ne za nedostačující pracovní výkony se přeci tak obtížně dokazuje! Dopad diagnóz na okolí, prenatální diagnostika, právo nevědět. Umíme-li perfektně diagnostikovat, ještě nemusí být vyhráno. Ostatně i dnes známe mnoho nemocí, které umíme určit, nikoliv léčit (Alzheimerova choroba). Vzroste mezera mezi diagnostickými a terapeutickými možnostmi medicíny. Vysoká účinnost nové diagnostiky nebude totiž bezprostředně následována působivými terapeutickými zásahy. Počet neléčených chorobných stavů se zvýší, což nepotěší ani lékaře, ani pacienta. Píše Vladimír Vonka (4). Mohli bychom tak dojít k zajímavé situaci, kdy je skoro každý nějak nemocný, ale jen málokdo se může i léčit. Ale vážně. Co způsobí pacientovi diagnóza nemoci, která se má rozvinout třeba až za dvacet let? Co kdyby taková diagnóza byla určena třeba už při prenatálním vyšetření? Rodiče již nyní mají právo rozhodnout, zda se jim narodí dítě např. s cystickou fibrózou. Mohou tedy rozhodovat, zda se jim narodí potomek, který na 50% zhruba ve věku 40 let onemocní rakovinou? Něco mi říká, že ne, ale jsou to přeci dva celkem podobné případy! Při takové diagnostice dopředu se ale nemoci jednoho pacienta nemusejí týkat jen jeho samotného. Dědičnou chorobu může mít i spousta lidí z jeho příbuzenstva, ani o ní zatím nemusejí vědět.Další rozevírání příslovečných nůžek mezi bohatým západem a chudým východem je jen dalším z mnoha důsledků. Stačí, aby se naplnila jen část toho, co si od nové revoluce v medicíně slibujeme, aby se propast mezi námi, kteří se přejídáme a potraviny vyhazujeme a nimi, kteří hladovějí a hlady umírají zase o pořádný kus rozšířila a mi byli těmi, kdo žijí aspoň 120 let a oni těmi, kdo umírají před čtyřicítkou . LITERATURA:(1) Storchová, Zuzana: Homo sapiens sapiens: přečteno! Online
Vesmír 8/2000, http://vesmir.cts.cuni.cz/08_2000/427.htm,
citováno dle 22.11.2001.(2) Cvrčková, Fatima: Konec genetiky? Online
Vesmír 8/2000, http://vesmir.cts.cuni.cz/08_2000/430.htm, citováno dle 22.11.2001.(3) Lipoldová, Marie: Genetické testy, etické problémy a právo nevědět. Online Vesmír 11/2000, http://vesmir.cts.cuni.cz/11_2000/608.htm, citováno dle 22.11.2001.4) Vonka, Vladimír: Naděje a rizika molekulové medicíny. Online Vesmír 3/99, http://vesmir.cts.cuni.cz/03_99/132.htm, citováno dle 22.11.2001.Wolpert, Lewis: Je Věda nebezpečná? Online Vesmír 6/1999, http://vesmir.cts.cuni.cz/06_99/325.htm, citováno dle 22.11.2001.Kahn, Axel: Genetika, medicína a společnost. Online Vesmír 12/2000, http://vesmir.cts.cuni.cz/12_2000/686.htm, citováno dle 22.11.2001.
2. 5. . 4 Jadérko syn. nucleolus. Je pravidelně se vyskytující struktura v jádře, která může mít různý tvar a velikost, lišící se v různých typech buněk a měnící se i v závislosti na funkčním stavu buňky. Jadérko místem syntézy ribozomální RNA (rRNA) a zrání ribozomů. Je tvořeno 3 složkami – komponentami rozlišitelnými v EM dle své struktury. Jsou tzv. fibrilární centra (FC), denzní fibrilární komponenta (DFC, , syn. pars fibrosa) a granulární komponenta (GC, syn pars granulosa). Viz níže i-iii (i) Fibrilární centra ( syn. "amorfní" složka, nukleolemata), obsahují rDNA, tj. genetickou informací pro syntézu rRNA. Oblast obsahující rDNA je označována též jako organizátor jadérka (NOR, nucleolus organizing region). Vyskytuje se na jednom nebo několika chromozomálních párech. V jádře nedělící se buňky, nebo ve stádiu interfáze dělící se buňky, může být proto přítomno jedno nebo více jadérek. Na rozhraní fibrilární a DFC komponenty jadérka. probíhá řepis genetické informace z rDNA do rRNA
62
U člověka je např. NOR lokalizován na 5 párech chromozomů a v lidské buňce může být tudíž maximálně 10 jadérek. Více NOR se však může spojit a vytvořit jedno větší jadérko, které bývá zpravidla výkonnější v syntéze rRNA. NOR obsahuje tandem opakujících se rRNA genů. U člověka např. až 200. rDNA geny je tvořen promotrem, dále tzv. interním a externím spacerem (mezerníkem, ITS/ETS), vlastními kódovacími sekvencem RNA zevním nepřepisovaných spacerem.
(ii) V DFC komponentě jadérka, probíhají post-transkripční úpravy pre-rRNA Viz níže a též kap. 3.3). (iii) V granulární komponentě jadérka se molekuly RNA spojují s proteiny, tj. tvoří se nukleoproteinové komplexy a organizují se do ribozomálních podjednotek. Pozor: Ribozomální proteiny se syntetizují v cytoplasmě dle informací mRNA transkribované v jádře RNA polymerázou II. Poté jsou importovány do jádérka K jadérku přiléhá tzv. perinukleolární chromatin, (heterochomatin), který dotváří celkový vzhled jadérka. Buňky s vysokou proteosyntézou mají zpravidla velká kompaktní jadérka (s mozaikovou distribucí fibrilární a granulární komponenty), nebo tzv. jadérka s nukleolenematy. Pro přechodné snížení proteosyntézy jsou charakteristická jadérka prstenčitá, zpravidla s jedním velkým centrálně uloženým fibrilárním centrem. 2. 5. 5 Nekódující DNA (Junk DNA)
Jaderné haraburdí. Opravdu???
Jak již uvedeno shora, DNA kódující bílkoviny organizmu představuje pouze malou část jaderné DNA. U kvasinek je to např. asi 47-68 % celkové DNA. U hmyzu 37-53%. U člověka se odhaduje podíl této DNA na 3-8%. S fylogenetickým vývojem se tedy zvyšuje obsah DNA nekódující proteiny nebo RNA proteosyntetického aparátu. K nekódující DNA je možno řadit nukleotidové sekvence intronů (1.5% u člověka, viz též níže syntéza bílkovin, kap. 3.3). Introny se vyskytují ve všech eukaryotních genomech. Chybí u eubakterií, častější jsou u archeí, především v genech pro rRNA a tRNA, ojediněle v genech kódujících proteiny. Pro vznik a význam intronů je několik teorií. Původně to mohli být např. genomoví parazité typu virů a transpozomů, pomnožené a přemisťované v genomu hostitele tzv. vlastním „sestřihem“ (autosplicing), tj. katalytickou aktivitou RNA bez účasti bílkovinných enzymů. Do této skupiny patří introny v genech kódujících rRNA a tRNA. Introny v pre-mRNA genů kódujících bílkoviny však jsou „vystřihovány“ složitějším mechanizmem (vi kap. 3.3). Lokalizace intronů u eukaryot v některých genech kódujících proteiny je fylogeneticky vysoce konzervativní tj. identická ve vývojově velmi vzdálených geonomech. Někteří badatelé proto předpokládají, že tato skupiny intronů byla přítomna již ve společném buněčném prapředku a u poději se objevivších prokaryot byly eliminovány jako „nevhodné“, protože sestřih pre-mRNA kódující proteiny musí probíhat odděleně od proteosyntetického translačního aparátu cytoplazmy, tj. v jádře odděleném od jadernou blanou, neboť jejich zavzetí to orimární struktury bílkovin by vedlo k jejich nefunkčnosti. Opakem této tzv. „Introns-early hypothesis“ je „Introns-late hypothesis“, podle které intronů v genech kódujících proteiny vznikly až dodatečně v eukaryontních buňkách. Ve vývoji intronů v některých genech a částech genomu eukaryot se významně uplatňovaly i jejich replikace a případné redislokace.
Další a četnější skupinou molekul nekódující DNA jsou tzv. dlouhé (Long) a krátké (Short) vmezeřené (Interspaced) repetivní nukleotidové (Nucleotide) sekvence-elementy 63
(Elements) (zkratky LINE, SINE). Mohu vyskytovat v blocích (tzv. tandemové repetice) nebo být volně rozptýlené v různých oblastech jádra. Repetivní sekvence jsou časté v konstitutivním heterochomatinu, v centromerických a telomerických oblastech chromozomů. V lidském genomu sem patří i DNA transpozonů (viz shora). Další skupinu nekódující DNA představuje tzv. satelitní DNA, tvořena mnohotně se opakujícími stejným sekvencemi nukleotidů. Při centrifugaci sedimentuje v podobě vedlejšího (satelitního) a menšího prstence (více v molekulární biologii). Některé nekódující sekvence DNA vykazují velký interindividuální polymorfismus, který je využíván k identifikaci osob v kriminalistice (viz např. VNTR a RFLP sekvence a DNA finger prints, kap. 7. Nekódující DNA je někdy označovaná též jako "hlušinová" nebo "odpadová" (junk) DNA. Donedávna byla považována za "skladiště", např. porouchaných, a v průběhu fylogeneze vyřazených genů, transpozonů ( viz shora a kap. 2.5 a 3.3), tzv. parazitárních či sobeckých genů, atp. Přibývá však poznatků o jejich významu. Pokusy na zvířatech skutečně ukazují, že např. myši, u kterých byla vyřazena velká část nekódující DNA se vyvíjejí a žijí bez zřejmých poruch. Nicméně, část této "zbytečné" DNA a její transkripty mají pravděpodobně funkční úlohu. Přemisťující se sekvence (především retrotranspozony) mohou např. ovlivňovat expresi sousedních strukturálních genů. Rovněž některé rozdíly v alelách VNTR se ukazují být pravděpodobně funkčně významné (např. mohou zvyšovat náchylnost k cukrovce).
Samostatnou skupinu transribovaných intergenových úseků DNA jsou tzv. malé RNA molekuly, které neobsahují informaci pro žádné proteiny, ani pro RNA proteosyntetického aparátu, které ale mohou ovlivňovat syntézu bílkovin. Jsou tvořeny obvykle 80-300 páry nukleotidů. Hlavní skupiny malých RNA jsou (A) malé jaderné RNA (snRNA, small nuclear RNA) (B) malé jadérkové RNA (snoRNA, small nucleolar RNA) (C) malé cytoplazmatické RNA (scRNA, small cytoplasmic RNA), tvořené hlavně tzv. microRNA (miRNA). SnRNA jsou se uplatňují v samotném jádře v procesu sestřihu pre-mRNA. MicroRNA jsou transportovány do cytoplazmy, kde po jistých úpravách zabraňují translaci hybridizací s komplementárními sekvencemi mRNA nebo vedou k degradaci mRNA. Tato inhibice translace se označuje jako přirozená RNA interference (RNAi). Jde o fylogeneticky starý mechanismus buněčné obrany proti některým virům. Využívá se též k cílené inhibici tvorby některých bílkoviných transkriptů pomocí malých, synteticky připravených tzv.siRNA (short interfering RNA). Více v Molekulové biologii Ukazuje se , že malé molekuly RNA jsou četnější u fylogeneticky výše postavených druhů i funkčně komplexnějších orgánů, dosahujíce maxima v mozku člověka.Některé jejich podskupiny zasahující zřejmě do mnoha funkcí, např. do vývoje gamet, těhotenství, odolnosti vůči virům, nádorové transformace a pod. Viz též zpráva níže. ….miRNAs and siRNAs are ∼21-26-nucleotide (nt) RNA molecules…..které jsou functionally equivalent ..ale… distinguished by their mode of biogenesis… miRNAs are produced from transcripts that form stem-loop structures….processed in the nucleus by a complex of at least two components: the RNase III enzyme Drosha, a protein called Pasha in Drosophila or DGCR8 in mammals….. transport(ed) to the cytoplasm of a 65-75-nt pre-miRNA, which is .. processed (in) the cytoplasm (RNase III endonuclease Dicer complex…., RNA silencing complex (RISC). .. In contrast, siRNAs are produced from long double-stranded RNA (dsRNA) precursors, which can be either endogenously produced or exogenously provided. Processing of siRNAs is also Dicer-dependent and their assembly into the RISC complex is facilitated by the Dicer enzyme complex, at least in some cases (Valencia-Sanches M.A., Genes and Development, 2006, kráceno a upraveno VM)
64
Čerstvá zpráva: „The first highly specific knockouts of a microRNA, miR155, in mice result in multiple defects in adaptive immunity…”, Moffett et al. Genome Biology 2007, 8:221
2. 5. 6 Karyoplasma (syn. nukleoplasma). Jde o amorfní obsah jádra, tvořený ve vodě rozpuštěnými bílkovinami, ionty a různými metabolity. Někdy je sem řazena i stále dosud málo prozkoumaná tzv. jaderná matrix, tvořená molekulami volnými aktinu a myosinu I, nebo jejich krátkými oligomery, které se účastní přemísťování molekul v procesu transkripce DNA. Bílkoviny nukleoplasmy se mohou uplatňovat též jako receptory pro některé hormony (viz kap. 3.4).
2. 6 CYTOSOL A INKLUSE
Buněčná šťáva. Zn. lékaři (ne)doporučují
Cytosol je koloidní roztok makromolekul a nízkomolekulárních látek (ionty, ve vodě rozpustné malé organické molekuly vč. některých enzymů), který zbývá jako supernatant po intenzivním odstředění suspense jemně rozrušených buněk (105.000 x g). V cytosolu se mohou vyskytovat různá granula, tzv. inkluse (paraplazma), která obsahují zásobní, odpadní či sekreční produkty buněk (tukové kapky, glykogen, žloutková zrnka, pigmenty aj.). Shora použitému skupinovému členění organel se vymykají proteazomy. Jsou to velmi malé, membránou neohraničené mikrobarely, tvořené bílkovinami s proteázovou aktivitou. Sestávají z centrální „duté válcovité “ katalytické podjednotky (sedimentační konstanta 20S) s vlastní proteázovou aktivitou a 2 menších čepičkovitých, tzv. regulačních podjednotek (19S) na obou koncích podjednotky centrální. Ty mění strukturu ubiquitinem (viz níže) označeného poškozeného nebo cizorodého proteinu tak, aby jej bylo možno „ zasunout“ do proteázového centrálního mikrobarelu (viz níže) Proteazomy slouží k organizovanému (řízenému) rozkladu poškozených nebo cizorodých bílkovin. Tyto však musí být předem „označeny“ navázáním peptidu ubiquitinu Proces vyžaduje ATP, který je štěpen jednou z malých podjendotek, tzv. víčkem, které rozpoznává ubiquitinovou značku . V případě cizorodých bílkovin je tento rozklad často neúplný. V buňkách imunitního systému takto vytvořené fragmenty slouží např. k tzv. prezentaci antigenu při imunitních reakcích (více v předmětu Fyziologie). Ubiquitin-proteázomový systém byl dosud popisován pouze v cytoplazmě. Ukazuje se však, že se vyskytuje i v jádře. Za objev ubiquitinu a jeho funkce byla udělena Nobelova cena v r. 2004
65
3 KOMPLEXNÍ BUNĚČNÉ FUNKCE
Obr. 21-40
Organizmus představuje otevřený systém tj. mezi nim a okolním prostředím probíhá trvalá výměna (tzv. tok) látek, energie a informací. Tyto toky jsou výběrové a obousměrné. Jsou nezbytné pro udržení vnitřní struktury a homeostázy vnitřního prostředí organizmu, funkční aktivity, adaptaci na změny okolních podmínek, reparaci poškození, a v případě jejich neopravitelnosti, i tzv. programovanou smrt. Jedná se o procesy řízené širokým spektrem molekul (enzymy, přenašečI, signální molekuly) na úrovní buněčné, orgánové i delého organizmu Viz kap. 1.1.a níže
3. 1 Transport látek (obr.23-26)
P P … Pooouuuzzzeeeppprrrooo"""vvvyyyvvvooollleeennnééé"""… …... (((iiiooonnntttyyy,,,m … m …))) Jízdné v ATP mooollleeekkkuuulllyyy,,,pppaaarrrtttiiikkkuuullleee…
Z okolí organizmus musí přijímat vodu, ionty, plyny, organické molekuly aj. U jednobuněčných a nejjednoduších bezobratlých přijem látek se uskutečňuje celým povrchem těla, tzv. parenterálně. . U většiny vícebuněčných k tomu slouží speciální orgán(y), které jsou v různém stupni specializované pro přijem, rozklad- trávení, vstčřebávání a a vyvrhování nestravitelných a metabiolických zbytků Viz Srovnávací Fyziologie. Klíčovou úlohu vevstřebávání a dalších přeměnách látek mají u všech živočichů transportní mechanizmy přes plazmatickou membránu buněk a jejich organel . Základní typy transportu přes plazmatickou membránu buněk. 3.1.1 Pasivní transport (prostá difuse) 3.1.2 Aktivní transport pomocí přenašečů : 3.1.2.1 usnadněná (facilitovaná) difuse 3.1.2.2 primární transport (Na+K+ pumpa) a klidový membránový potenciál 3.1.2.3 sekundární transport (Na+ kotransport) 3.1.2.4 skupinová translokace 3.1.2.5 iontové kanály 3.1.3 Cytoza (váčkový transport makromolekul a částic) 3.1.3.1 endocytoza prostá (pinocytoza) 3.1.3.2 receptorově zprostředkovaná endocytoza 3.1.3.3 exocytoza 3.1.3.4 transcytoza 3.1.3.5 fagocytóza
PM je polopropustná, semipermeabilní , tj. brání volnému průniku většiny potravou přijímaných molekul přes vnitřní tělní bariery a buněk těla. Volně, prostou difuzí, mohou přes PM procházet jen malé nepolární molekuly (O2, CO2, N2) a látky rozpustné v tucích (lipofilní, hydrofobní). Jejich transport nevyžaduje chemickou energii (ATP) a probíhá pouze po koncentračním spádu. Ostatní látky (vč. např. většiny iontů i jednoduchých organických molekul (např. glukóza, aminokyseliny, nukleotidy apod.) musí být přes PM do buněk selektivně přenášeny (transportovány), či aktivně propouštěny. Funkci přenašečů vykonávají specializované integrální bílkoviny plazmatické membrány (viz níže pumpy, iontové kanály, aj.)
66
Makromolekuly ve vodní fázi, a příp. i větší partikule, mohou vstupovat do buněk i ve váčcích, které se odškrcují od plazmalemy. Transportní mechanismy operující na PM slouží k udržování stálého iontové složení buněčného nitra, přívodu živin, vylučování metabolických zplodin, přívodu biologicky aktivních (regulačních) molekul do buněk i vvnitřního prostředí organizmu. 3. 1.1 Pasivní transport. Prostá difúze
Pouze pro malé a nenabité Zn. zdarma
Jak již bylo uvedeno, volně mohou do buňky přes plazmatickou membránu procházet molekuly malé, bez elektrického náboje (nepolární) a rozpustné v tucích, lipofilní (CO2,O2,N2, glycerol, urea, ethanol, krátké mastné kyseliny, étery, steroly, nedisociované organické kyseliny a rovněž většina léčiv a ekologicky škodlivých látek). Zvláštní formou difúze (osmóza) procházejí do buňky molekuly vody (viz níže akvaporiny). Difúze je závislá na koncentračním spádu látky, nevyžaduje chemickou energii a probíhá do ustavení termodynamické rovnováhy. Difuse není buňkou regulovatelná, neumožňuje výběr molekul u okolí. 3. 1. 2 Transport pomocí přenašečů Jak již uvedeno shora, ionty, polární a ve vodě rozpustné (tj. hydrofilní, čili lipofobní) molekuly (např. glukóza, sacharóza, aminokyseliny, ATP, glukózo-6-fosfát, ionty např. K+, Mg++, Ca++, Cl-, HCO3-, HPO4- aj.) nemohou volně prostupovat PM. Transport těchto látek zajišťují molekuly PM, které mají povahu specifických pump, přenašečů nebo kanálů. Jsou poháněny energií získávanou z ATP nebo koncentračního gradientu přenášených, nebo spolu-přenášených (ko-transportovaných) látek, např. iontů sodíku nebo protonů. 3.1.2.1 Usnadněná (syn. zprostředkovaná nebo facilitovaná) difúze. Přenašečem je specifická bílkovina PM (permeáza, translokáza), která po navázání příslušné molekuly změní svou konfiguraci tak, že umožní průchod látky do buňky. Jde o přenos typu uniportu, který nevyžaduje chemickou energii, je závislý na koncentračním gradientu, který je však pro každou molekulu specifický. Uplatňuje se např. při přenosu monosacharidů a aminokyselin z buněk střevní sliznice do krve, z krve do buněk ostatních orgánů, iontů chlóru z krve do parietálních buněk žaludku a pod. 3.1.2.2 Primární aktivní transport (syn. sodíko-draslíková pumpa, Na+K+ ATPáza). Zajišťuje přenos iontů sodíku a draslíku do buňky a z buňky. Vytváří nerovnoměrné rozložení iontů mezi buňkou a okolím, které se projevuje vznikem elektrického napětí, klidového membránového potenciálu. Molekulární pumpa má Na+K+- ATPázovou aktivitu, která pro transport poskytuje chemickou energii štěpením ATP. Každou "funkční otočkou" pumpy se z buňky vyčerpají 3 ionty sodíku a do buňky přenesou 2 ionty draslíku. Tento způsob přenosu látek se označuje též jako antiport. Na+K+ ATPáza je protein, který se skládá z 1 páru menších (glykozylovaných) a 1 páru větších podjednotek, nesoucích na zevní straně vazebná místa pro 2 ionty draslíku a na vnitřní (tj.cytoplazmatické) straně pro 3 ionty sodíku, jakož i katalytické místo pro ATP (v komplexu s Mg++).
67
Iontově specifické transportní ATPázy čerpají rovněž Ca++ z buňky, nebo z cytosolu do endoplazmatického retikula a protony z cytosolu do lyso-endozomálních váčků (proto název v-ATPázy). Antiport Na+, H+ na plazmatické membráně se uplatňuje při regulaci pH cytozolu. V PM i v endoplazmatické retikulu je i další velká skupina tzv. ABC ATPáz (ATP Binding Casette ATPase), které přenášejí i některé menší organické molekuly, např. menší fragmenty peptidů z proteazomů na povrch buňky. U některých parazitů a nádorových buněk vyčerpávají z buněk léčiva a tím podmiňují i jejich odolnost vůči těmto látkám. Jejich inhibitory jsou proto zkoumány jako nová terapeutika. Další příklady v Molekulové biologii a Fyziologii živočichů. Klidový membránový potenciál (KMP) (obr.21b)
Pozor, napětí!!
KMP je elektrický náboj na plazmatické membráně (PM) všech živých buněk. Na zevním povrchu PM je náboj positivní, na vnitřní straně negativní. Hodnota KMP se liší u různých typů buněk a kolísá v rozmezí -40 až - 90 mV. KMP vzniká v důsledku nerovnoměrného rozložení iontů a ionizovaných skupin větších molekul v buňce a jejím okolí, což je primárně podmíněno semipermeabilitou PM, tj. její odlišnou propustností pro některé ionty a větší molekuly. Uvnitř buňky je především mnoho větších molekul s negativně nabitými funkčními skupinami, které nemohou z buňky unikat difuzí (aminokyseliny, bílkoviny aj.) a které svým elektrickým nábojem „přitahují" z okolí dovnitř buňky kationty. Ustavení početní rovnováhy kladných a záporných nábojů na obou stranách semipermeabilní membrány se nazývá Gibbs-Donnanova rovnováha. V okolí buňky je sice vysoká koncentrace Na+ a Ca++ pro které není plazmatická membrána permeabilní. Relativně snáze však pronikají do buňky ionty draslíku. Při vyrovnání kladných a záporných nábojů v buňce touto cestou však nitrobuněčná koncentrace (115 mmol/l) draslíku značně přesáhne jeho koncentraci v okolí buňky (3.8 – 5.4 mmol/l). Část K+ z buňky proto uniká po koncentračním spádu.Tzv. elektrochemická rovnováha draslíku se ustálí při cca –70 mV. Tuto rovnováhu vyjadřuje Nernstova rovnice: KMP=log (K+ zevně/K+ uvnitř buňky) x RT/ZF (R je plynová konstanta, T absolutní teplota, Z valence=+1, F Faradayova konstanta)
Za některých okolností, např. při podráždění nervových buněk, dochází k rychlému otevření iontových kanálů pro Na+ (viz níže), což vede poklesu KMP, k tzv. depolarizaci PM. Okamžitý „přebytek“ kladných nábojů je ihned „kompenzován“ únikem ekvivalentního množství K+ z buňky (repolarizace PM). PM je však pro sodíkové ionty volně neprostupná z obou jejích stran a buňka musí pro obnovení iontové rovnováhy "přebytek" Na+ vyčerpat (spolu s dočerpáním iontů K+, které unikly v procesu repolarizace PM). Obnovení této iontové rovnováhy zajišťuje tzv. sodíko-draslíková pumpa PM (viz shora). Obsah Na+ u většiny buněk se zvyšuje i jinými mechanizmy, na např. ko-transportem větších molekul (viz níže). Vyčerpávání Na+ zajišťuje rovněž sodíko-draslíková pumpa. Více ve Fyziologii živočichů. 68
Na vzniku KMP se však podílejí i další ionty (Mg++, Ca++ , Cl-). Iontovou rovnováhu všech skupin iontů vyjadřuje tzv. Goldmannova rovnice (viz Molekulová biologie) Depolarizace PM nervové nebo svalové buňky, zprostředkovaná rychlým přesunem sodíkových iontů do buňky otevřením příslušných iontových kanálů se lavinovitě šíří jako tzv. akční nebo postsynaptický potenciál po buňce a jejich výběžcích a představuje tzv. nervový vzruch, impulz. Více ve Fyziologii živočichů a člověka. U bakterií, hub, rosltinných buněk, ale i některých organel živočišných buněk, např. mitochodrií, je elektrický náboj tvořen protony a podmíněn primárně tzv. elektrogenní iontovou pumpou. Je méně závislý na iontovém složení okolního prostředí a na rozdíl od KMP popsaného shora, klesá velmi rychle po zástavě funkce iontové pumpy.
3.1.2.3 Sekundární aktivní transport (syn. Na+ nebo H+ kontransport), využívá nejčastěji elektrochemického potenciálu protonů ( H+ v bakteriích, plísních a rostlinách) nebo Na+, vytvořených transportem primárním. Jedná se o transport typu symportu, kdy organická molekula je přenášena do buňky proti koncentračnímu spádu, zatímco ionty Na+ nebo H+ proudí do buňky po koncentračním spádu a jejich iontový gradient poskytuje kotransportu potřebnou energii. Tento typ přenosu látek se uplatňuje např. při resorpci aminokyselin v ledvinách, cukrů ve střevě a pod. 3.1.2.4 Transport skupinovou translokací je spojen se změnou chemické struktury přenášené molekuly. Přenášečem je enzym, který je zároveň katalyzátorem příslušné chemické změny. Jde např. o současnou fosforylaci monosacharidů v bakteriích, štěpení disacharidů ve střevě, připojení glutamylového zbytku k aminokyselinám při jejich zpětné resorpci v tubulech ledvin aj.). 3.1.2. 5 Transport selektivními kanály. Zajišťuje specifický transport iontů a vody. Tyto transportéry jsou bílkoviny plazmatické membrány schopné konformačních změn, které je činí tzv. otevřené nebo zavřené. Část molekuly, která je odpovědná za uzávěr se nazývá hradlem kanálu. K otevření hradla dochází receptorovým navázáním agonistní molekuly (acetylcholin, kys. gama aminomáselná a pod.). Podle způsobu jakým se kanál otevírá rozlišujeme iontové kanály bezhradlové, s hradlem regulovaným chemicky, napěťově nebo mechanicky. Transport vody zdarma (bez ATP)
Zvláštní skupinu tvoří kanálky umožňující prostup vody do buňky a z buňky ven, tzv. akvaporiny. Za jejich objev byla v r. udělena Nobelova cena. Jsou tvořeny tetramery bílkovin, které umožňují selektivní průchod molekul vody. Jejich počet v PM buňky je regulován podle potřeb vodního hospodářství organizmu signálními molekulami (hormony). Akvaporinovým kanálkem může projít 2-4x109 molekul vody za sec. Akvaporiny jsou četné v PM erytrocytů, ledvinných nefronech, žlázách se zevní sekrecí, plicích, centrálním nervové systému. Akvaporiny v různých typech buněk se liší složením bílkovin. Existuje až 12 různých typů akvaporinů. Více ve fyziologi živočichů.
Typy iontových kanálů
Není kanál jako kanál
Bezhradlové kanály slouží např. pro transport aniontů, některých cukrů a další energetických substrátů v bakteriích, vnější membráně mitochondrií a chloroplastů Kanály s chemickým či ligandovým hradlem, např. pro Na+ a K+ v kanále nikotinového acetylcholinového receptoru na postsynaptické membráně nervosvalové ploténky kosterního svalu ¨ Kanály s napěťovým hradlem, na př. pro Na+ v axonu Kanály s mechanickou regulací, pro některé kationty, na př. K+ v stereocilích vláskových buněk vnitřního ucha, ale též v PM prvoků.
69
Pro většinu iontových kanálů existují dobře definované molekuly blokátorů, z nichž některé významné klinické použití (blokátory Ca++ + kanálů v buňkách myokardu, kanálů excitačních aminokyselin v mozku, Na kanálů v epitelu ledvin a pod.).
Transportní mechanismy jsou v buňce často nerovnoměrně rozloženy. Např. v epiteliálních buňkách zažívacího traktu na tzv. apikálním a basálním operují odlišné transportní mechanismy. Uvedeme na příkladu transportu glukózy enterocyty a tvorbě HCl v žaludku. Do enterocytu se glukóza dostává ze střevní dutiny sekundárním transportem v apikální části buňky. Energii poskytuje gradient Na+ iontů, vytvářený primárním transportem (Na+K+- ATPázou), operujícím v bazolaterální části buňky. Do krve je z enterocytu glukóza přenášena usnadněnou difúzí. Jejímu zpětnému toku z extracelulárního prostoru do střevního lumen brání těsná spojení mezi apikálními částmi buněk. Do parietálních buněk žaludeční sliznice prostupuje z krve CO2 volnou difúzí. Z CO2 se v basální části buňky enzymaticky tvoří bikarbonátový aniont; antiportem HCO3- a Cl- se do buňky čerpají chloridové anionty, které jsou v apikální části buňky exportovány do lumen žaludku enzymatickým přenášečem, permeázou, tj. mechanismem usnadněné difúze. Proton vznikající při tvorbě bikarbonátového aniontu je exportován do lumen žaludku antiportem s ionty kália. Samostatně trasnportované ionty H a Cl- vytvoří HCL teprve v lumen žaludku. Více ve Fyziologii živočichů a člověka +
3.1.3 Cytoza, váčkový transport
(obr.25, 26,33)
Balíková pošta
??
Přenos větších, ve vodě rozpustných molekul (proteiny, lipoproteiny, chromoproteiny, některé neurotransmitery) i partikulí (buněčná drť, bakterie, drobné anorganické a organické částice) do buněk se uskutečňuje pomocí váčků, které se tvoří vchlipováním plazmalemy a transportované komplexy postupně zcela obklopí. Formou membránou obalených váčků jsou přenášeny rovněž bílkovinné komplexy v buňce mezi jednotlivými organelami. Speciálním případem je transport neurotransmiterů v nervových buňkách. 5.1.3.1 Endocytoza prostá, syn. pinocytoza (buněčné pití, též fluidní či konstitutivní endocytoza), se dle starší představy uskutečňuje trvalým vchlipováním PM a tvorbou váčků, které obsahují vodu a ve vodě rozpuštěné látky v okolí buňky. Jde o nespecifický transport, který zřejmě nevyžaduje tvorbu speciálních opláštěných váčků. Proces fluidní endocytozy probíhá trvale ve všech buňkách, velmi výrazně např. v trámčitém epitelu jater, epitelu kanálku ledvin, folikulech štítné žlázy, a dalších. 3.1.3.2 Receptorově zprostředkovaná endocytoza (RZE) Jako RZE je označován váčkový transport, kterého se účastní specifické receptory PM. Účast receptorů činí tento proces nejen výběrový ale i mnohonásobně, až 10.000 krát účinnější. Příklady. RZE slouží k transportu např. Fe++ v komplexu s bílkovinou feritinem, nebo cholesterolu navázaného na nízkohustotní lipoprotein, inzulínu, vitelogeninu, imunoglobulinů v embryonálním období vývoje, některých hormonů a růstových faktorů, lysozomálních enzymů apod.. Průběh RZE. Na receptor v PM se nejprve naváže transportovaná látka, zpravidla v komplexu s bílkovinou. Navázáním komplexu (ligandy) na receptor, např. lipoproteinu nesoucího cholesterol, se komplexy receptor-liganda shlukují (koncentrují) a v místě jejich shluku se začíná vchlipovat PM. Na cytoplazmatické straně tvořícího se jamky se hromadí bílkovina klatrin, která se připojuje na membránu jamky, a později váčku, pomocí dalších bílkovin, adaptinů. Vytváří se tak tzv. potažená jamka (coated pit, coated cap, viz obr. 13,25,26), která se prohlubuje, až posléze vytvoří klatrinovým pláštěm potažený váček (coated vesicle), který se za účasti energie uvolněné hydrolýzou GTP a další bílkoviny (dynamin) odškrtí od PM. 70
Současně s ligandou je nespecificky (tj. bez účasti receptoru a bez možnosti koncentrace pohlcovaných látek) internalizována i extracelulární tekutina (pinocytoza, syn. endocytoza vodní fáze, syn. fluid phase endocytosis. Otázka klatrin-nezávislé pinocytózy není dosud definitivně zodpovězena (viz též shora).
Opláštěné váčky ztrácejí v buňce klatrinový plášť a přeměňují se v tzv. časný endozom (systém komunikujících váčků a tubulů), ve kterém se oddělí transportované molekuly (ligandy) od receptorů, a to v důsledku poklesu pH uvnitř endozomu. Molekuly receptorů jsou pak transportovány zpět k PM, formou váčku, který vypučí z endozomu. Časný endozom se dříve označoval zkratkou CURL (Compartment of Uncoupling of Receptors and Ligands). Rozpad klatrinového váčku vyžaduje energii, kterou z ATP uvolňují okolní cytosolické ATPázy.
Zbytek časného endozomu se mění v tzv. pozdní endozom , který má na vnitřní straně membrány vysokou koncentraci receptorů pro manoso-6-fosfát (M6P-R). K těmto receptorům jsou směrovány vesikuly obsahující lysozomální enzymy z trans-Golgiho aparátu (viz kap. 2. 3). Lysozomální enzymy se aktivují a rozloží nosič ligandy (např. lipoproteinový nosič cholesterolu, viz níže) na aminokyseliny a mastné kyseliny, které se uvolní do cytosolu spolu s molekulami ligandy, tj. cíleně transportovaných molekul (viz níže příklad RZE cholesterolu). Celý proces RZE trvá zhruba 15 min. Příklad RZE cholesterolu z krve do buněk. Cholesterol se do krve dostává z jater a střeva ve formě lipoproteinových (L) komplexů. Pro bílkovinou čast jednoho z nich, tzv. nízkodensitní (LDL, low density lipoprotein) komplex, mají cévní endothelie na svém povrchu receptor, přes který jsou liporoteinové komplexy endocytovány cestou RZE tj. váčků potažených klatrinem. Po odpadnutí klatrinového pláště se váček mění v tzv. časný endozom, ve kterém se sníží pH a tím oddělí receptory od přenášené molekuly (ligandy). Receptory se vrací (jsou recyklovány) formou nově vytvořeného váčku zpět do PM endothelií. Vzniká pozdní endozom, do kterého byly nasměrovány lysozomální enzymy, které rozloží proteinovou složku LDL komplexu na jednotlivé aminokyseliny, a ty se spolu s cholesterolem, se uvolní do cytosolu. Aminokyseliny jsou využity pro běžnou proteosyntézu, cholesterol je zabudován do biomembrán, nebo je využit k syntéze dalších molekul, např. steroidních hormonů. Podobně jsou např. do buněk transportovány i jiné látky uvedené na začátku kapitoly. Nedostatek příslušných receptorů z vrozených nebo získaných příčin (na př. v důsledku autoimunitních procesů), vede k vážným metabolickým poruchám, např. tzv. familiární hypercholesterolemii (postižení receptorů pro tzv. nízkohustotní lipoprotein, který přenáší do buněk cholesterol). V důsledku zvýšené koncentrace molekuly cholesterolu vypadávají z roztoku a tvoří v poškozených částech cévních stěn depozita (atheromy), které omezují přítok krve do orgánu a vedou tak např. vzniku srdečních infarktů, mozkových mrtvic apod.
Po obalení membránou může být pohlcena i větší částice procesem fagocytózy (viz níže) . Formou uměle připravených lipidických váčků (lipozomů) lze do buňky rychle a účinně dopravovat hydrofilní farmaka.
2.1.3.4 Transcytoza. Je váčkový transport látek přes celou buňku, tj. z přenos molekul z extracelulárního prostoru na jedné straně epiteliálních buněk do prostoru na straně protilehlé. Tento proces probíhá např. v epiteliálních buňkách střeva při transportu mléčných proteinů do krve novorozenců. 2.1.3.5 Exocytoza je proces váčkového transportu oligo až polymerních látek, nebo některých menších molekul, např. neurotransmiterů, z buněk do okolí. Membrána sekrečního váčku musí nejprve splynout s PM a obsahu váčku se pak vyprázdní do extracelulárního prostoru. Na spojení transportních váčků s membránou cílové organely se podílejí tzv. GTP vazebné proteiny. Membrána váčku je integrována do PM. Formou exocytozy se uskutečňuje zevní i vnitřní sekrece, jakož i trvalý (konstitutivní) transport molekul do extracelulárního prostoru (např. kolagenu z fibroblastů v pojivových tkáních). Proces zevní a vnitřní sekrece je řízen nervovými a hormonálními faktory 71
(sekrece regulovaná, pulzní). Obsah váčků bývá více zahuštěn než u sekrece konstitutivní a zpravidla i více post-translačně modifikován). Jak vyplývá z vnitřní organizace buňky, bílkovinný obsah sekrečních váčků se tvoří v hrubém endoplasmatickém retikulu. Je opracován v Golgiho aparátu, odkud se transportuje ve váčcích opatřených specifickými bílkovinami (koatomery, klatrin, t-Snares viz shora). Tento řetěz procesů, vázaných na shora uvedené organely se označuje též jako sekreční dráha. Vlastní transport váčků zajišťují molekulové motory asociované k mikrotubulům. Trvale probíhající sekrece (např. tvorba slin) se označuje jako konstitutivní.Sekrece stimulovaná nervově nebo hormonálně je tzv. regulovaná. Zvláštní formou sekrece je tzv. sekrece apokrinní a holokrinní (mazové žlázky a mléčná žláza), kdy se do sekretu odškrcuje celý apikální segment epiteliální buňky, nebo se celá buňka přeměňuje na sekret (viz též kap.5.2)
2.1.3.6 Fagocytoza. Je forma váčkového transportu makromolekul (lipoproteinové komplexy, transferin apod. viz níže) a mikročástic (partikulí, např. bakterií, virů, poškozených organel a částí buněk z extracelulárního prostoru, ale i vlastních zbytků organel v buňce) do buňky a v buňce. Tento proces neprobíhá za účasti klatrinem potažených (coated) jamek a váčků, ale protředníctvím aktinových mikrofilament, které umožňují tvorbu jemných výběžků PM kolem pohlcovaného objektu, kterými jej zcela obalí. Výsledný váček, fagozom, se označuje jako heterofagozom v případě, že jeho obsah pochází z extracelulárního prostoru, nebo jako autofagozom v případě, že byla pohlcena poškozená část z nitra fagocytující buňky. Fagozom v buňce splyne s vesikulou nesoucí lysozomální enzymy za vzniku fagolysozomu, ve kterém dojde k enzymatickému rozkladu pohlcené částice. Nerozložitelné zbytky tvoří tzv. residuální tělíska, která mohou být vyloučena z buňkou cestou exocytozy. Příklad experimentálně vyvolané fagocytozy latexových mikrokuliček gliovými buňkami je uveden na Obr. 11 Některé buňky jsou na proces fagocytozy vysoce specializovány. Patří sem především neutrofilní granulocyty (mikrofagocyty) a makrofágy (profesionální fagocyty), které se uplatňují při imunitních reakcích organizmu. V těchto buňkách je rozklad pohlceného obsahu komplexnější. Více ve Fyziologii a VK Patobiologie buněk a tkání. Více podrobností a další tranportní systémy v předmětu Molekulární biologie.
3 2 PŘEMĚNA LÁTEK A ENERGIE (LÁTKOVÝ A ENERGETICKÝ METABOLIZMUS BUNĚK) (obr. 27,28,29) 3.2.1 Celková charakteristika metabolických procesů
Metabolic pathways
Látkový metabolismus, syn. látková přeměna, představuje soubor chemických reakcí a s nimi spojených energetických přeměn, probíhajících po předem definovaných, tzv. metabolických drahách (metabolic pathways). Výsledkem je buď syntéza nových látek, především stavebních a zásobních molekul např. lipidů a bílkovin biomembrán, cytoskeletu, mezibuněčné hmoty, glykogenu, zásobních lipidů a pod., nebo tzv. biologicky aktivních molekul (enzymy, receptory, adhezní molekuly, hormony, cytokiny, růstové faktory a pod). Tyto procesy označujeme souborně jako anabolické. Jiné metabolické dráhy vedou k rozkladu organických molekul, především živin, provázeným uvolněním energie. (reakce endergonické). Tyto procesy nazýváme souborně katabolickými, syn. degradačními. 72
Rozklad pouze přechodně se uplatňujících regulačních molekul, např. cyklinů v buněčném cyklu, nebo molekul poškozených viz kap. 3.4 a 4.2.
U jednobuněčných jsou metabolické procesy vázány na organely buňky. U vícebuněčných živočichů jsou pro metabolické procesy specializované orgány (syntéza glykogenu v játrech a svalech, tvorba močoviny a žlučových kyselin v játrech, syntéza hormonů v endokrinních žlázách, trávicích enzymů ve žlázách zažívacího traktu apod.). Anabolické procesy zvyšují komplexitu molekul a vyžadují proto energii, získávanou z makroergních fosfátových vazeb, nejčastěji z ATP, GTP, fosfokreatinu nebo u bezobratlých i z fosfoargininu (reakce endergonické). Nedílným vedlejším produktem metabolických přeměn je teplo. ¨ Klíčovou úlohu v přeměně látek (metabolizmu) mají enzymy 3. 2. 2 Enzymy, jejich stavba, klasifikace a funkce (Viz kurzy Chemie živých soustav a Úvod…) Enzymy jsou molekuly (bílkoviny, event RNA- tzv. ribozymy), které působí jako katalyzátory biochemických reakcí (biokatalyzátory) tím, že snižují aktivační práh reakce, tj. hodnotu energie potřebnou ke spuštění reakce. Skládají se z bílkovinné a nebílkovinné časti zv. koenzym. Koenzym muže tvořit nekovalentně vázaný atom některých kovů (Fe2+, Mg2+ Cu2+ apod., syn. kofaktor) nebo složitější organická molekula, např. eletrony přenášející NAD+, FAD+ v dýchacím řetězci mitochondrií, NADP+, karboxyl přenášející koenzym A, kap.5.2, některé vitaminy apod. Bílkovinná část se označuje též jako apoenzym. Komplex bílkovinné a nebílkovinné části tvoří holoenzym (holos = celý). Viz též ribonukleoproteinový enzymový komplex katalyzující syntézu koncových částí chromozomů, telomer, enzym telomeráza kap.5.6.
Enzymy jsou zpravidla globulární bílkoviny. Za katalytickou reakci je odpovědno tzv. aktivní centrum (místo) molekuly, na které se váže substrát(y), které vstupují do reakce. Aktivní centrum enzymu je specifikováno sekvencí několika aminokyselin na peptidovém řetězci a terciární konfigurací molekuly. U některých enzymů je za katalytickou reakci odpovědná pevně vázaná nebílkovinná prostetická skupina. Katalytickou aktivitu mohou mít též některé molekuly RNA, tzv. ribozymy. Uplatňují se např. při úpravách RNA molekul (viz kap. 1.1 a 3.3). Předpokládá se, že autokatalytické vlastnosti RNA měly primární význam pro vznik a vývoj živé hmoty. Více v evoluční biologii. Jako isoenzymy jsou označovány enzymy se stejnou substrátovou afinitou, lišící se však v primární struktuře, tj. sekvenci aminokyselin. Mohou se lišit v optimálních podmínkách, za kterých reakce jimi katalyzovaná probíhá. Existence isoenzymů je projevem tzv. genového polymorfismu (více viz předmět Genetika a Molekulární biologie)
Syntéza enzymů je primárně řízena na úrovni transkripce příslušných genů. Některé enzymy se v buňkách tvoří neustále (tzv. konstitutivní enzymy). Jiné v závislosti na přítomnosti či absenci jejich substrátu (induktivní enzymy). Tzv. induktory nebo represory působí v regulační oblasti genu. Viz kap. 3.3 a 3. 6. Enzymy se syntetizují často v neaktivní formě (proenzymy, zymogeny), které jsou aktivovány, např. odštěpením části peptidického řetězce (limitovaná či parciální proteolýza), fosforylací apod. Takto je např. neaktivní trypsinogen nebo pepsinogen, tvořený v pankreatu, přeměněn na aktivní trypsin v žaludku. 73
Enzymatické reakce probíhají optimálně při jistém pH. U savců a člověka v rozmezí 7.357.40. Nízké pH vyžadují ale např. lysozomální hydrolázy (viz kap. 2.3), Důežité je rovněž jisté množství (koncentrace) substrátu a teplota (25-45oC). Optimální podmínky pro jednotlivé enzymy nejsou stejné (Viz kurz Fyzika a chemie pro biology). Jednotkou aktivity enzymu je katal, tj. množství enzymu, které přemění 1 mol substrátu za 1 sekundu. Tzv. specifická aktivita vyjadřuje počet katalů na kg bílkoviny. Aktivitu enzymu ovlivňují též některé látky, tzv. aktivátory či inhibitory enzymu. Zatímco aktivátory enzymatické reakce zrychlují (např. ionty kovů K+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, a Mo3+), inhibitory tuto reakci zpomalují nebo 2+ blokují (těžké kovy, Hg ). Inhibice může být tzv. vratná nebo nevratná. Podle místa zásahu inhibitoru do molekuly enzymu pak můžeme rozlišit inhibitory kompetitivní, nekompetitivní a allosterické. Kompetitivní inhibitor se váže na stejné místo jako substrát enzymu, se kterým soutěží o vazné místo. Této inhibici lze zabránit nadbytkem substrátu (blokace sukcinát dehydrogenasy kyselinou malonovou). Nekompetitivní inhibitor se váže na reaktivní skupiny v molekule enzymu a tím ovlivňuje jeho afinitu. Nekompetitivní inhibici nemůžeme odstranit nadbytkem substrátu (např. blokace Krebsova cyklu kyselinou fluoroctovou). Ke kompetitivní inhibici dochází tehdy, jestliže se inhibitor váže na komplex enzym-substrát. Při alosterické inhibici se inhibitor váže na enzym tak, že mění jeho prostorové uspořádání a enzym pak není schopen reakci katalyzovat. Patří se např. organofosfáty (tabun) blokující acetylcholinesterasu rozkládající acetylcholin, neurotrasmiter vylévající se na nervových synapsích. Jeho nekontrolovatelné vylévání kolem synapse působí na další neurony a způsobuje křeče.
Pro enzymy jsou užívány dva typy názvosloví. Staré, tzv. triviální ( trypsin, pepsin, kathepsiny, atp.) a nové, systematické, které vychází z povahy katalyzované reakce a názvu enzymatického substrátu (např. NADH dehydrogenáza, glutamin transamináza, cytochromoxidáza, gama glutamyltranspeptidáza a pod). Mezinárodní klasifikace rozděluje enzymy do 6 skupin (EC1-6): 1.Oxidoreduktutázy (přenos elektronů), 2.Transferázy (přenos skupin atomů) 3.Hydrolázy (hydrolytické štěpení různých vazeb) 4.Lyázy (štěpení chemických vazeb jinou než hydrolytickou cestou) 5.Isomerázy (intramolekulové přeměny substrátu) 6.Ligázy (syntetázy) (slučování dvou molekul za současného štěpení ATP nebo jiného energetického substrátu) „V lidském těle existuje více jak 2000 typů enzymů. Chybění některého vede často k vážným zdravotním poruchám, např. tzv. fenylketonurii, kdy v důsledku genetické mutace chybí enzym fenylalanin hydroxylasa, která přeměňuje aminokyselinu fenylalanin na tyrosin. Někdy chybí jen kofaktor tohoto enzymu, tetrahydrobiopterin. V důsledku toho se fenylalanin v organizmu hromadí, což vede k mentální retardaci a potlačení syntézy melaninu (blonďaté vlasy a modré oči). Touto poruchou trpí jedno dítě z 4500-100 000 narozených. Tito jedinci se musí vyvarovat potravin obsahujících fenylanin vč. masa, mléka, sýrů a mnoha dalšího s vyznačím „nevhodné pro fenylketonuriky“ na obalech. Fenylketonurii popsal Finský A. Fönsen r. 1934. Zjistil, že v moči postižených se objevuje fenylpyruvát. Přítomnost této molekuly je dnes ověřována u všech novorozených dětí. Řízenou výživou lze pak předejít vzniku mentální retardace. Ovlivnění aktivity některých enzymů se využívá léčebně. Např. acylpyrin blokuje hormon ovlivňující syntézu prostaglandinů, látek s krátkou životností vznikajících v těle v místě postižených zánětem. Prostaglandiny jsou zodpovědné jak za projevy zánětu (otok, zarudnutí, bolestivost, zvýšená teplota). Potlačení jejich tvorby odstraňuje tyto příznaky. Inhibicí enzymu tromboxan A2 vede ke snížení srážlivosti krve. Některé enzymy vyráběné biotechnologicky se používají k likvidaci na antibiotika rezistentních bakterií způsobujících střevní infekce. Enzym je navázán na iontoměničovou pryskyřici aby odolal nízkému pH v žaludku a přechází do střeva, kde rozkládá buněčnou stěnu kvasinek a baktérií“.
http://chemistry.webzdarma.cz/enzymy.htm Viz též
výběrový kurz Patobiologie živočišných buněk a tkání.
3. 2. 3 PŘEMĚNA ENERGIE V BUŇCE (obr. 27-30)
Jouly, kalorie
Jak uvedo již shora, buňky i organizmy potřebují pro výkon svých funkcí energii, kterou získávají metabolickou přeměnou potravou přijatých živin, tj. organických molekul 74
synatizovaných rostlinami nebo živočichy, nebo rozkladem vlastních zísobních látek (glykogen, fosfokreatin, triglyceridy). Energie uložená v chemických vazbách živin je uvolňována oxidorekčními procesy a přeměňovaná v energii chemických vazeb nově syntetizovaných strukturálních a funkčních molekul, nebo do tzv. makroergních vazeb některých molekul (ATP. GTP, fosfokreatin, fosforarginin u bezaobralých aj). Energie makroergních vazeb slouží pro transport látek (příjem a výdej látek z buňky a do buňky), syntézu bílkovin a dalších molekul, nitrobuněčný transport molekul a organel pomocí molekulových motorů, buněčný pohyb, příjem informací přes receptory aj. Přeměna energie v buňce i organizmu je řízená 2 obecně platnými termodynamickými zákony, dle kterých: 1.Energie nemůže vznikat ani zanikat, může se pouze se přeměňovat z jedné formy na jinou 2. Při přeměně energie v jinou se vždy uvolňuje určité množství tepla. Oxidorekučním procesy jsou z živin uvolňovány vysokoenergetické elektrony (oxidace je provázená ztrátou elektronu) a přenášejí se na molekuly s vyšším tzv. redox potenciálem, kterým je nakonec tzv. aktivovaný kyslík. Spolu s elektrony jsou transportovány i protony (H+). Proto je oxidace organických molekul spojena s jejich dehydrogenací. Oxidoredukční procesy probíhají v živé hmotě postupně, tj. energie odebraných elektronů je uvolňovaná postupně po malých kvantech a přeměňována v makroergní vazby jiných molekul (viz výše). Oxidační procesy mohou probíhat bez účasti kyslíku v cytozolu (viz níže glykolýza a fermentace) nebo za účasti kyslíku v mitochondriích (oxidativní fosforylace) a peroxizomech Hlavním zdrojem energie je pro buňky glukóza a mastné kyseliny. Oxidace glukózy probíhá v první fází v cytozolu glykolýzou, která v nepřítomnosti kyslíku končí fermentací. V přítomnosti kyslíku pokračuje oxidativní fosforylací v mitochondriích. Glykolýza začíná fosforylací glukózy na glukózo-6-fosfát, za účasti enzymu hexokinázy a dodání energie z 2 molů ATP na 1 mol glukózy. Tato, tzv. aktivovaná glukóza se rozkládá činností dalších enzymů na 2 triózy a nakonec na 2 molekuly kyseliny pyrohroznové. V průběhu tohoto procesu se uvolní energie, která se přemění na 4 mol ATP. Čistý energetický zisk z 1 mol glykolyticky rozložené glukózy je tedy 2 mol ATP (4 minus 2 moly spotřebované na iniciální aktivaci glukózy). To je však pouze zhruba 3% energie obsažené v glukóze. Vodík uvolněný z glukózy přejímá NADH+. V nepřítomnosti kyslíku se kyselina pyrohroznová se redukuje příjmem atomu vodíku z NADH+ (viz níže) a mění se na ethanol nebo kyselinu mléčnou (alkoholové nebo mléčné kvašení, fermentace). NADH+H+ se tímto redukuje na NAD+ a regeneruje pro opětovné přijetí vodíkových atomů z dalších molekul glykolyticky štěpené glukózy. Fermentací v jiných biologických systémech může se tvořit též řada dalších látek (kys.octová, máselná, propionová, butanol aj., viz např. Biologie prokaryot)
V přítomnosti kyslíku vstupuje kyselina pyrohroznová do mitotochondrií. 75
V mitochondriální matrix je pak pyruvát dekarboxylován a přeměněn na acetyl-CoA. Ten je dále přeměňován kaskádou reakcí tvořících tzv. Krebsův (citrátový) cyklus, ve kterém dojde k jeho dekarboxylaci za vzniku CO2 a NADH+. V Krebsově cyklu se tvoří 3 molekuly NADH+ , 2 FADH2 a 1 molekula GTP. Více v kurzu Chemie pro biology. Molekuly NADH+ (příp. FADH2) přenášejí vysokoenergetické elektrony k vnitřní membráně mitochondrií, kde jsou oxidovány (dehydrogenovány) a odebrané elektrony dále přenášeny tzv. dýchacím řetězcem. Energie elektronů je postupně přeměňována na protonový gradient v mezimembránovém prostoru mitochondrií, který přeměńuje ATP syntíza na ATP (viz níže). Dýchací řetězec je tvořený několika molekulárními komplexy (komplex I-IV), které jsou integrálními bílkovinami vnitřní mitochondriální membrány. Syn. Oxidativně-fosfoforylační systém, OXFOS. Pohyblivými články jsou Ubiquinon syn. Koenzym Q a cytochrom c. Zjednodušeně řečeno, první článek dýchacího řetězce, tzv. komplex I, nebo II (viz níže) přebírá vysoko-energetické elektrony spolu s protony od NADH+H+ (komplex I) event. FADH2 (komplex II). cchemicky jsou to flavinové dehydrogenázy-oxidoreduktázy Po disociaci protonů a elektronů, elektrony přecházejí na ubichinon (koenzym Q), který elektrony předává cytochromům b-c1 ve spolupráci s enzymem cytochrom c reduktázou (komplex III). Cytochrom c je poté oxidován cytochrom c oxidázou a elektrony přebírají cytochromy a1-a3 (komplex IV). Nízko-energetické („energeticky vyčerpané“) elektrony přebírá vysokoafinitně kyslík, který se v matrix slučuje s protony (H+) na vodu. Elektrony jsou, s výjimkou CoQ, transportovány ve dvojicích, v párech. CoQ přebírá a dále předává elektrony jednotlivě. To vede k jejich častějšímu „úletu“ a solitárnímu záchytu na jiných molekulách. Nespárovaný elektron dává těmto molekulám vysokou oxidační aktivitu tj. schopnost „vytrhnout“ elektron chybějící do páru z molekul a organel v okolí a tím poškodit jejich strukturu a funkci (viz kap.4.1). Tok elektronů představuje tedy řetěz oxidoredukčních dějů, které probíhají po spádu tzv. redox potenciálu jednotlivých článků dýchacího řetězce (z -0.320 mV komplexu I na +0.815 mV komplexu IV). Afinita jednotlivých článků dýchacího řetězce k negativnímu náboji elektronů se tedy postupně zvyšuje a je nejvyšší na jeho konci, kde je akceptorem elektronu aktivovaný kyslík. Rozdíly v redox potenciálu, spolu s enzymatickou aktivitou a pevným zakotvením některých článků dýchacího řetězce ve vnitřní membráně mitochondrie (Komplex I, III a IV), určují posloupnost transportu elektronů. Více v v kurzu Chemia pro biologyi. Důležitou složkou komplexů I-III jsou tzv. FeS (železo-sirná) centra, které představují vlastní vazná místa elektronů v jednotlivých komplexech. Komplex III a IV obsahuje kromě atomů železa i kationty mědi, ze kterých přebírá elektrony v konečné fázi aktivovaný kyslík. Energie přenášených elektronů je dýchacím řetězcem postupně (cca 200 kJ z jednoho páru elektronů) využívaná uvedenými komplexy dýchacího řetězce pro transport protonů do prostoru mezi zevní a vnitřní membránou mitochondrie. Energie elektronů odňatých ze substrátů Krebsova cyklu je takto transformována v energii elektrochemického protonového gradientu v intermembránovém prostoru mitochondrie.
76
Energie tohoto gradientu (proud protonů do matrix mitochondrie) je přeměňovaná ATPsyntázou (lokalizovanou rovněž ve vnitřní mitochondriální membráně) na chemickou energii ukládanou do ATP. Vzhledem k uplatňování se jak fyzikálních tak chemických procesů, tvorba ATP v mitochondriích se označuje jako chemiosmotická fosforylace (!!!) Jiný způsob fosforylace je tzv. substrátová fosforylace, kdy příslušný enzym přímo dehydrogenuje energeticky bohatý substrát a makroergní fosfátová vazba se přímo přenáší na ADP za vniku ATP. Touto cestou se tvoří ATP při glykolýze.
Energie jednoho pár elektronů z NADH+H+ stačí pro přenos 6 protonů do mezimembránového prostoru. K syntéze 1 molekuly ATP je potřeba 2 protonů. Z 1 molekuly glukózy vznikají tedy 4 molekuly ATP při glykolýze (čistý zisk 2 molekuly) a cca 36 molekul při oxidativní fosforylaci. Zástavu oxidativní fosforylace působí oxid uhelnatý (CO) blokádou přenosu elektronů cytochromoxidázou. Kyanidy působí takto vazbou na ionty železa v cytochromech a organická látka dinitrofenol, zvýšením propustnosti vnitřní mitochondriální membrány, což vede k ztrátě protonového gradientu v mezimembránovém prostoru.
Oxidace glukózy může probíhat též v tzv. pentózovém cyklu, který se uskutečňuje v cytosolu. Jeho úlohou však není pouze tvorba ATP, ale i molekul pentoz, potřebných pro syntézu nukleotidů a nukleových kyselin. Více viz předmět biochemie.
Glukóza je jako hlavní energetický zdroj využívána především mozkovými a svalovými buňkami. V jiných orgánech jsou hlavním zdrojem energie mastné kyseliny (srdce, ledviny aj.) a glukóza slouží jen jako zdroj minoritní. Energetické využití mastných kyselin probíhá rovněž z velké části v mitochondriích. Mastné kyseliny jsou v matrix rozkládány tzv. beta dekarboxylací, při které vznikají dvojuhlíkaté zbytky, které vstupují jako acetyl-CoA do shora popsaného Krebsova cyklu. Beta-oxidace delších mastných kyselin probíhá též v peroxizomech. Uvolňování energie z takto vytvořených molekul acetyl-CoA však probíhá v mitochondriích oxidativní fosforylací.
Cestou beta-oxidace mohou být využívány jako zdroj energie též aminokyseliny pro předchozí deaminaci (rovněž v mitochondriích). Z odštěpené aminoskupiny se tvoří v mitochondriích močovina (tzv. ornitinový cyklus) V buňkách některých orgánů může být glukóza syntetizovaná ze zbytků některých aminokyselin a glycerolu triglyceridů. Tento proces se označuje jako glukoneogeneza (více viz předmět fyziologie živočichů).
Shora popsané metabolické cesty umožňující vzájemnou přeměnu základních jednoduchých organických molekul se označují souborně jako intermediární metabolizmus (syn. metabolický pool). Více v předmětu Fyziologie živočichů.
3. 3 TRANSKRIPCE DNA A SYNTÉZA BÍLKOVIN (obr. 31,32) Funkce bílkovin: strukturální, enzymatické, receptorové…. ….. kapitola je v přípravě
Není dogma jako dogma
3. 3. 1 Centrální dogma molekulární biologie 77
Informace pro složení a strukturu všech bílkovin je uložena v jaderné DNA. Tato tzv. genetická informace musí být nejprve v jádře přepsána (transkripce) do molekuly mRNA, nesoucí pak tzv. genetický kód. V cytoplazmě pak dojde k „překladu“ (translaci) této informace z nukleotidového kódu mRNA do kódu aminokyselinového. Tok informací z nukleových kyselin do bílkovin je označován jako Centrální dogma molekulové biologie. Obrácený tok informací je možný jen mezi RNA a DNA, a to pomocí tzv. reverzní transkripce za účasti enzymu reverzní transkriptázy (uplatňuje se významně např. při přesunech transpozonů v jádře, množení RNA virů v buňce nebo v některých biotechnologických postupech, viz kap. 8), nikoliv však od bílkovin zpět k nukleovým kyselinám. 3. 3. 2 Transkripce genetické informace Transkripcí rozumíme proces, kterým se genetická informace obsažená v nukleotidovém kódu DNA přepisuje do nukleotidového kódu messengerové RNA (mRNA, syn.informační nebo mediátorová RNA). Proces transkripce probíhá v jádře (a v matrix mitochondrií). Konečným produktem trankripce mohou být a. Bílkoviny s převážně strukturální-stavební funkcí (např. bílkoviny cytoskeletu, extracelulární matrix aj.) b. Bílkoviny, majících funkce metabolické, informační, transportní, pohybové a pod. (enzymy, receptory, růstové faktory, transduční bílkoviny, molekulové motory, cytokiny, transkripční faktory a pod) c.Transferové RNA (tRNA) a ribozomální RNA (rRNA). d. Tzv. microRNA molekul, s dosud málo objasněnou funkcí (Viz též kap. 2.5, 3.3,3.6) Procesu transkripce předchází rozvolnění chromatinové struktury a oddálení obou vláken DNA v příslušném segmentu genomu. Transkripce začíná od tzv. startovacího kodonu příslušného genu a končí nukleotidovou sekvencí zvanou terminátor (syn. stop místo). Zde dojde k uvolnění RNA řetězce od DNA templátu. V těsné blízkosti před startovacím místem je u většiny genů sekvence nukleotidů označovaná jako promotor, která je schopna vázat RNA-polymerázu a další proteiny, které jsou nezbytné pro zahájení procesu transkripce strukturního genu. Část transkripční jednotky kódující primární strukturu dané bílkoviny se označuje jako strukturní gén. Přepisovaný úsek DNA a kooperující molekuly se označují jako transkripční jednotka. Viz též operon prokaryot. Přepisováno je zpravidla pouze jedno vlákno DNA, které se označuje jako templát (raznice, syn. matriční nebo negativní vlákno). Nepřepisované vlákno se označuje jako positivní. Templátové vlákno DNA je přepisováno směrem od svého konce 3´ ke konci 5´. Syntetizovaný řetězec RNA se prodlužuje ve směru od 5´--3´ a od DNA se odvíjí tudíž svým 5´ koncem. Nukleotidy se připojují na DNA templát komplementárním párováním bazí (A-U, T-A, C-G, G-C). Polymeraci jednotlivých nukleotidů ve vlákno zajišťují enzymy RNA polymerázy. Eukaryotické buňky mají 3 třídy RNA polymeráz (I, II, III), které spojují jednotlivé nukleotidy v řetězec ve směru 5´-->3´. Vazba RNA-polymerázy na promotor a zahájení transkripce genu u v eukaryontní buňce vyžaduje přítomnost tzv. transkripčních faktorů, TATA Box Binding protein-TBF, TF-B, -F, -E, -H, které se v uvedeném pořadí važí na TATA box promotoru jako první
78
RNA polymeráza I se uplatňuje při přepisu většiny rRNA genů. RNA polymeráza II při přepisu všech genů kódujících veškeré proteiny a některé geny pro tzv. malé RNA. RNA polymeráza III, pro tRNA gen , 5S rRNA gen a některé malé RNA. U prokaryot operuje pouze jedna třída RNA polymerázy. Pro regulaci transkripce u prokaryot a eukaryot viz kap. 3.6.
Výsledkem transkripce strukturního genu je tzv. primární transkript, označovaný jako premessengerová RNA (pre-mRNA). Syn.: heterogenous nuclear RNA (hnRNA) Pre-mRNA musí být před exportem z jádra do cytoplasmy „upravena“. Tento tzv. postranskripční processing zahrnuje následující kroky a. přidání GTP "čepičky" na 5´ začátek molekuly b. přidání polyadenylového konce (ocásku, Poly(A)tail) na jejím 3´ konci, tvořeným až několika sty adenin nukleotidových bazí . c. tzv. sestřih (splicing) pre-mRNA, který spočívá v odstranění nekódujících úseků tzv. intronů (chybí u bakterií). Kódující úseky primárního transkriptu, tzv. exony se spojí v souvislý řetěz kodónů. d. V molekule však jsou ponechány nekódující sekvence (UTRs, untranslated regions) před tzv. startovním kodonem (5´UTR) a za stop kodonem (3´UTR, viz též shora), které podporují stabilitu mRNA (chrání před štěpením ribonukleázami). Dále, podílí se na „umístění“ mRNA v cytoplazmě (3´UTR) a pravděpodobně i modulaci efektivity translace e. Takto upravený transkript představuje zralou mRNA, který je transportován jadernými póry do cytoplasmy. Sestřih, který odstaní všechny introny je označován jako konstitutivní. Pokud některé inntrony zůstávají, jde o tzv. alternativní sestřih. Jejich přepisem se částečně mění vlastnosti bílkovin. Tímto mechanizmem vznikají např. isoenzymy, tj. bílkoviny se stejnou enzymatickou aktivitou, ale s poněkud odlišnou strukturou.
V procesu sestřihu pre-mRNA (RNA) se uplatňuje autokatalytická aktivita RNA, tj. autokatalytická reakce probíhá bez účasti bílkovinných enzymů (ribozymy).
Stabilita mRNA je časově omezená. Na rozdíl od prokaryot, kde mRNA se rozpadá po několika minutách, mRNA eukaryotních buněk má delší poločas (desítky minut až hodin, ojediněle delší (např. ve zralých bezjaderných erytrocytech). Eukaryotická mRNA je tzv. monocistronická (cistron = gen), tj. kóduje pouze jeden peptid (který však může být v rámci postranslačních úprav štěpen na menší aktivní segmenty). Bakteriální mRNA je na rozdíl od toho často polycistronická, tj. jedna molekula mRNA kóduje více polypeptidů. Dále, u bakterií může proces transkripce i translace probíhat pro daný peptid současně. Nikoliv však v buňce eukaryontní. RNA transkripty bakteriálních genů nepodléhají shora uvedeným postranskripčním úpravám.
Triplety nukleotidů mRNA (tzv. kodóny), které nesou genetickou informaci získanou transkripcí z DNA, představují genetický kód (sensu strictum). Vlastnosti genetického kódu (GK): ♪ Univerzálnost. V celé živé přírodě, tj. vč. virů, je GK tvořen triplety nukleotidů. Ve většině buněčných organizmů je většina aminokyselin kódována stejnými triplety (tzv. canonical code) . O některých výjimkách (non-canonical code) viz níže a Molekulová biologie. ♫ Degenerovanost. GK Je tvořen 64 kodóny, vždy třemi ze čtyř možných N-basí (celkem 43 kombinací). 61 kodónů slouží ke kódovaní 20 základních aminokyselin. Některé aminokyseliny jsou tedy kódovány vícero kodóny, tzv. synonymními kodóny (např. leucin, 79
serin, arginin 6 kodóny). Možnost kódovaní jedné aminokyseliny vícero kodóny (vždy však jen jedním z možných kodónů) se označuje jako degenerovanost GK. Tato vlastnost (redundace) je výhodná v případě bodových mutačních změn DNA, neboť mutace nemusí pak znamenat vždy změnu zápisu pro určitou aminokyselinu. Pouze 2 aminokyseliny mají k dispozici pouze 1 kodon: methionin (AUG) a tryptofán (UGG). AUG kodón (start codon), patří methioninu a označuje i místo začátku přepisu mRNA. Je pro všechna eukaryota i většinu prokaryot. UAA, UGA a UAG nekódují žádnou aminokyselinu ale označují místo, kde přepis (translace) mRNA končí (stop nebo též nebo terminační kodóny).
♫♪ Nepřekryvnost. Kódony musí být „čteny“ v řádě jeden za druhým a každý nukleotid musí být čten pouze jako součást svého kodonu a ve směru 5´--3´. Tato posloupnost čtení se nazývá čtecí rámec (reading frame). Jeho posun o např. 1 nukleodid (frame-shifting), vede ke vzniku nefunkčního, nebo jinak funkčně pozměného proteinu. Vzácné fyziologické vyjímky, viz Molekulová biologie. Za některých okolností může být informace přepisována z mRNA do DNA tzv. reverzní transkripcí. Proces je katalyzován enzymem RNA-dependentní DNA polymerázou (syn. reverzní trankriptáza). Proces je využíván v biotechnologicky pro přenosy genů (transfekce buněk). Reverzní transkripce se přirozeně uplatňuje v přesunech retrotranspozonů v buňkách a v rozmnožovacím cyklu některých RNA virů (syn. retroviry), jejichž genom musí být nejprve integrován do molekuly DNA hostitelské buňky. Inhibitory reverzní transkriptázy slouží jako antivirotika. Některé RNA transkripty (tzv. small nuclear RNA) nevstupují do cytoplasmy a nejsou nositeli kódu pro syntézu bílkovin. Jiné, tz. micro RNA, v cytoplasmě interferují s translací mRNA (viz níže)
Dovětek: Proces transkripce u eukaryontů byl zdokumentováni i morfologicky, elektronmikroskopicky , např. v žabích vajíčkách. Vícero molekul RNA se tvoří současně a molekuly RNA polymeráz postupují po rDNA postupně „za sebou“. Molekuly syntetizované jako první jsou proto nejdelší, molekuly jejichž syntéza začala později jsou dočasně kratší. Různá momentální délka bočně od DNA odstupujících molekul vytváří obraz podobný vánočnímu stromečku (Christmas trees, viz též http://www.cytochemistry.net/Cellbiology/nucleus3.htm Na této adrese můžete najít pěkný EM obraz jadérka i zmíněných vánočních stromečků
3. 3. 3 Syntéza bíkovin. Translace nukleotidového kódu do aminokyselinového Proces translace probíhá v cytoplasmě. Účastní se jej ribozomy, tRNA, mRNA, řada enzymů, bílkovinných „faktorů“ a GTP. Jeho výsledkem je překlad nukleotidového genetického kodu do aminokyselinové „abecedy“ (kodu). Translace se pracovně dělí do 3 stádií: (i) iniciaci (ii) elongaci a (iii) terminaci. (i) Iniciace začíná v živočišné buňce spojením malé podjednotky ribozomu s methionintRNA (na vazné místo P, zatímco místo A zůstavává volné), dále s tzv. eukaryotickým iniciačním faktorem (eIF1-5) a GTP. Poté se za účasti další bílkoviny se připojí mRNA. Methionin-tRNA se posune na tzv. iniciační kodon (AUG) mRNA. Po hydrolýze GTP a uvolnění uvedených faktorů se připojí velká podjednotka ribozomu a může být zahájeno stádium elongace. Viz níže odstavec ii. Pozn. U prokaryont translaci zahajuje formyl-methionin-tRNA
Molekuly tRNA (transferové RNA) jsou kódovány v jádře, zpravidla tandemově ve vícero kopiích (podobně jako rRNA). Molekula tRNA musí projít post-transkripčními úpravami na 80
obou koncích i uvnitř molekuly. Části molekuly s komplementárními nukleotidy vytváří dvouvláknové úseky a molekula získává podobu jetelového listu (plošný model) nebo písmena L (prostorový model). Na jednom pólu (konec 3´ s tripletem CCA) takto utvářené molekuly tRNA je vazné místo pro specifickou aminokyselinu. Na opačném pólu molekuly je nukleotidový triplet antikodón, který je komplementární ke struktuře tripletu kodujícího příslušnou aminokyselinu v molekule mRNA. Tyto informace jsou „čteny“ ribozomy. To zajišťuje správné zasazení příslušné aminokyseliny do syntetizovaného peptidického řetězce Připojení správné aminokyseliny k tRNA vyžaduje ATP a enzym aminoacyl-tRNA syntetázu (tzv. aktivace aminokyseliny). V buňce je 1 enzym pro každou z 20-ti přirozených aminokyselin. Počet druhů tRNA je v eukaryontní buňce je větší než počet aminokyselin (důsledek degenerovanosti genetického kódu) avšak je menší než celkový počet tripletů genetického kódu. Antikodony molekul tRNA jsou u pro většinu kodonů pro aminokyseliny na mRNA jedinečné. Přetrvávájící nepoměr mezi počtem kodonů mRNA a počtem tRNA je řešen tím, že párování posledního nukleotidu tripletu antikodonu tRNA s kodonem mRNA není v některých případech zcela striktní, tj. Na některé odlišné kodony se může vázat stejná tRNA. Nekomplementárnost vazby se však vždy týká jen nukleotidové baze ve třetím pořadí daného kodónu. Např. na oba kodony mRNA pro fenylalanin (UUU nebo UUC) se může vázat tRNA s antikodonem AAG. Řeší se tím nepoměr mezi počtem kodonů mRNA a tRNA . Tatio vlastnost tRNA se označuje jako wobbling (kolísavost) tRNA. Více v molekulární biologii. Poznament je třeba též, že v cytozolu a matrix mitochondrií není vždy specifita tRNA pro jednotlivé aminokyseliny stejná.
(ii) Elongace představuje postupné připojování dalších aminoacyl-tRNA komplexů dle informace čtené z mRNA ve směru 5´--3´. Nová aminokyselina se nejprve připojuje na tzv. A místo (aminoacylové, akceptorové, aminokyselinové) ribozomu za účasti tzv. eukaryotických elongačních faktorů (eEF1alfa2, eEF1A, eEF1B) a GTP. Mezi karboxylovou skupinou první aminokyseliny (methionin, viz startovací kodon shora) a aminoskupinou skupinou další aminokyseliny se v místě A ribozomu vytvoří peptidická vazba. Vytvořený dipeptid se poté přesune na P místo ribozomu, ze kterého se současně uvolní aminoacyl-tRNA první (předchozí) aminokyseliny tím, že se přesune na E místo ribozomu, kde jej opustí. Opakováním tohoto procesu („přesuny tam a zpátky “ mezi místy A-P-A, spojenými s posunem ribozomu po molekule mRNA, tj. posunem místa A ribozomu na další kodon mRNA) se peptidický řetězec prodlužuje (elonguje). Proces elongace je ukončen terminací (viz níže odstavec iii. Vznik peptidické vazby vyžaduje energii z GTP a enzym peptidyltransferázu, která je integrální součástí velké podjednotky (23S RNA, která má vlastní katalytickou aktivitu a jde tedy o velký nebílkovinný enzym typu ribozymu. Energii z GTP vyžaduje rovněž přesun rostoucího peptidu z místa A na místo P ribozomu. (ii) Terminace. Po dosažení tzv. terminačního stop kodonu na mRNA (UAA, UAG nebo UGA) se naváže tzv. terminační uvolňovací faktor (Releasing Factor, RF) a GTP a na poslední aminokyselině se místo peptidické vazby, připojením H2O, vytvoří volná karboxylová skupina (-COOH). V posledním kroku je tRNA z P-místa přesunuta do místa E (Exit). Peptidový řetězec se pak oddělí od ribozomu za účasti tzv. uvolňovacích faktorů (releasing factors). Obě podjednotky ribozomů se pak opět oddělí. Celý proces trvá desítky sekund až několik minut. Průběh translace u Prokaryot viz příslušný kurz
Celková energetická bilance translace: Syntéza 1 peptidické vazby vyžaduje 4 makroergni vazby pocházející z ATP (pro vazbu aminokyseliny na příslušnou tRNA za vzniku komplexu 81
aminoacyl-tRNA) a 2 molekul GTP (pro vznik peptidické vazby, přesuny z místa A na P při elongaci peptidu a jeho konečné uvolnění od ribozomu, viz shora). Na 1 molekule jedné mRNA může pracovat (překládat informaci z nukletidového do aminokyselinového kódu) postupně za sebou více ribozomů, z nichž každý syntetizuje stejný peptid. Peptid syntetizovaný prvním ribozomem se tak stává dočasně nejdelším a nejprve ukončeným. Po ukončení translace jsou peptidy syntetizované na hr-ER dále upravovány. Již v cisternách hr-ER, kam je peptid translokován pomocí speciálních molekul, probíhají tzv. tzv. ko-translační úpravy (N-glykozylace tj. glykozylace na N-asparaginových residuích bílkoviny). Po odškrcení z hr-ER se je peptid váčkovým transportem přenesen do Golgiho aparátu, kde proběhnou posttranslační úpravy. Ty zahrnují odštěpení koncových částí peptidu, úpravy postranních řetězců hydroxylací, fosforylací, tvorbu disulfidických můstků, o-glykozylaci, štěpení peptidu na menší fragmenty a případné následné přidávaní prostetických skupin a sestavování polypeptidů do kvartérních struktur a pod. Zvláštní formou postranslačních úprav je tzv. sestřih (splicing) peptidu (viz níže). Tvorba molekul rRNA a ribozomů probíhá v jadérku (viz kap. 2.5, 3.3). Genetická informace nesená rDNA v NOR segmentu chromozomu je nejprve přepisovaná do 45S pre-rRNA. Její post-transkripční úpravy a tzv. „zrání ribozomů“ zahrnují: (i)
(ii)
(iii)
štěpení 45S pre-rRNA na 28S RNA a 5.8S rRNA velké podjednotky a 18S rRNA malé podjednotky připojení 5S rRNA k velké podjednotce, kódované a přepisované mimo jadérko připojení velkého počtu ribozomy tvořících bílkovin syntetizovaných v cytoplazmě.
Morfologie a molekulární stavba ribozomů je popsaná v kap. 4.1.3.2 Syntéza bílkovin v prokaryontní a eukaryontní buňce probíhá principiálně stejně. Existují však jisté rozdíly (ribozomy bakterií jsou menší, mRNA je tzv. polycystronická tj. kóduje více proteinů, neobsahuje introny, translace začíná formyl-methion-tRNA komplexem a pod), které jsou využívány v léčbě infekčních bakteriálních onemocnění antibiotiky. Antibiotika jsou produkty hub, plísní apod., mající inhibiční účinek na syntézu bílkovin bakterií, nikoliv však buněk eukaryontních. Některé bakterie mají odolnost vůči antibiotikům zakódovanou v DNA. V tom případě se hovoří o jejich "přirozené odolnosti". Častější je však odolnost získaná stykem s antibiotiky. Děje se tak dvěma způsoby. V kultuře bakterií buď objeví jedna zmutovaná, která potom své vlastnosti předá dalším odnožím ("vertikální" šíření), nebo se odolnost šíří "horizontálně", kdy imunitu si předávají bakterie mezi sebou, výměnou tzv. R plasmidů. Tomu napomáhá nadužívání antibiotik v medicíně, zemědělství, prmyslu atp. Bakterie se takto "otužují"
http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_splicing Protein splicing is an intramolecular reaction of a particular protein in which an internal protein segment (called an intein) is removed from a precursor protein with a ligation of C-terminal and N-terminal external proteins (called exteins) on both sides. ….Normally, splicing is associated only with pre-mRNA splicing. …… splicing proteins is categorized into 4 classes: maxi-intein, mini-intein, trans-splicing intein, and alanine intein. Více v Molekulové biologii
3. 4 BUNĚČNÉ A MOLEKULÁRNÍ MECHANIZMY PŘÍJMU INFORMACÍ (obr. 34,37) 3.4.1 Chemické a fyzikální biologické signály 3.4.2 Receptory, jejich funkce, vlastnosti a distribuce v buňce 3.4.3 Receptory lokalizované v PM 5.4.3.1 Celková charakteristika 5.4.3.2 Přenos signálu přes PM a jeho šíření v buňce 3.4.4 Receptory v cytoplazmě a jádře 3.4.5 Rychlost receptorové odpovědi 3.4.6 Ukončení receptorové odpovědi
Molekulová seznamka Hledám receptor
Zn. menší hydrofobní agonista
Příjem informací z okolí i vnitřního prostředí slouží k interakci buněk, orgánů a organizmu s s okolím. K příimu informací u jednobuněčných živočichů slouží speciální bílkovinyreceptory v plazmatické membráně a jejich výběžcích (viz níže cilie), nebo uvnitř buněk. U 82
vícebuněčných se vyvinuly speciální sensorické buńky, které jsou buď rozloženy celotělově (fotoreceptory bezobratlých, mechano- a chemo- a thermoreceptory v kůži obratlovců a pod) nebo jsou soustředěeny do tzv. smyslových orgánů (oči, uši, sluch, chuťové pohárky a další, viz fyziologie živočichů). Klíčové molekuly pro příjem všech typů podnětů (viz níže) jsou receptorové molekuly buněk. 3. 4. 1 Chemické a fyzikální biologické signály Informační komunikace mezi buňkami jakož i vnitřním prostředím organizmu a okolím se děje pomocí chemických a fyzikálních signálů, které jsou přijímány specifickými molekulami, receptory. Signální molekuly mohou být volné nebo vázané a to buď na okolní buňky nebo mezibuněčnou hmotu, extracelulární matrix. Informační komunikaci umožňují též některá mezibuněčná spojení (chemické synapse a nexy syn. gap junctions, elektrické synapse, viz kap. 4.1.2.3) Hlavní skupiny signálních molekul jsou: ● hormony endokrinních žláz, ● neurotransmitery, feromony ● tkáňové hormony (růstové faktory, cytokiny). ● molekuly mezibuněčné hmoty (extracelulární matrix, viz kap. 5.1) a okolních buněk. ● oxid dusnatý (NO), molekulární kyslík a pravděpodobně i jeho tzv. reaktivní formy (viz kap.4.1) Z fyzikálních vlivů se u živočichů signalizačně uplatňují: ● teplota, ● mechanické podněty, tlak, vibrace apod., ● osmolarita, ● elektrické napětí, zvuk, fotonové záření, magnetické pole aj. 3. 4. 2 Receptory (R-y), jejich společné vlastnosti a výskyt v buňce Definice R-ů a jejich společné vlastnosti. R-y jsou molekuly, zpravidla bílkovinného typu, specializované pro vazbu specifických molekul (syn. agonistů, ligand, primárních poslů). Po navázání ligandy (např. hormonu) nebo dopadu fyzikálního podnětu dojde k tzv. stimulaci či aktivaci receptoru, která vyvolá kaskádu dalších, předem naprogramovaných změn, jejichž výsledkem je funkční nebo metabolická odpověď buňky. Bílkovinné R-y představují asi 1% celkových bílkovin v těle. Výskyt R-ů v buňce. R-y jsou lokalizovány buď na povrchu buněk nebo v cytosolu, případně až j jádře. Hydrofilní a velké lipofilní signální molekuly, které nemohou volně vstupovat do buněk mají receptory na povrchu buňky,v plazmatické membráně (PM). Jsou to integrální bílkoviny PM. Hydrofobní signální molekuly, které mohou snaze difundovat přes PM mají R-y lokalizované intracelulárně (viz níže kap. 3.1). 3. 4. 3 Membránově lokalizované R-y R-y PM jsou zpravidla tvořeny jednou nebo několika peptidickými podjednotkami, z nichž každá jednou nebo vícekrát membránu prostupuje ("prošívá PM"). Receptor pro 83
katecholaminy prochází na př. PM 7x ( obr. 37 B). Savčí buňka obsahuje na svém povrchu více než 100 různých typů R-ů pro různé signální molekuly z okolí. Typický receptor PM obsahuje (a) vnější oblast pro zakotvení hormonu nebo jiného "posla", ( b) část, která procházející plazmatickou membránou a (c) volné zakončení uvnitř buňky. Navázání ligandy (agonisty) na zevní část se aktivuje cytoplazmatické zakončení, což vede k jeho interakci s jednou nebo více molekulami specializovanými pro přenos informací uvnitř buňky (tzv. transdukce signalizace přes PM, viz níže Gproteiny). Výsledkem je metabolická a funkční odpověď buňky (viz níže).
Šíření signálu od R-ů v PM do buňky (tzv. transdukce signálu) probíhá několika způsoby, dle kterých je lze rozdělit do 3 skupin: a. b. c. d.
R-y spřažené s G-proteiny R-y s vlastní enzymatickou aktivitou R-y typu iontových kanálů R-y cytokinové super-rodiny
Receptory spřažené s G-proteiny předávají informace do nitra buňky nepřímo, prostřednictvím dalších molekul, G-proteinů (viz níže). Přímou cestou signalizují podnět do buňky R-y typu iontových kanálů nebo receptory s vlastní enzymatickou aktivitou (viz níže). Ad (i) R-y spřažené s G-proteiny. Podnět přinášený k tomuto typu R-ů signální molekulou (tzv. primárním poslem) je předáván do cytoplazmy pomocí tzv. sekundární poslů (secondary messengers). Tomu předchází interakce receptoru s G-proteiny, asociované k vnitřní straně PM. G-proteiny aktivují sousední membránové proteiny - enzymy, které syntetizují molekuly sekundárních poslů. Jako sekundární posli slouží nejčastěji cyklický AMP (cAMP). Dále, to jsou deriváty membránového fosfoinositolu (viz fosfolipidy kap.1.1, 2.3), - inositol 1,4,5- trifosfát (IP3), diacylglycerol (DAG), Ca++, cGMP. Přenos podnětu od receptoru do nitra buňky se nazývá transdukce signálu přes PM Funkci sekundárních poslů mohou plnit i jiné molekuly. Jde na př. o oxoniové ionty, vznikající aktivací NADH2 oxidázy, nebo oxid dusnatý (více v předmětu Fyziologie živočichů). Z membránových fosoflipidů mohou být receptorově aktivovanou fosfolipázou A2 vznikat z membránových fosfolipidů, především jejich polynenasycených mastných kyselin (viz PUFA, kap. 1.1) přes kys. arachidonovou též prostaglandiny, tromboxany a leukotrieny. Tyto molekuly slouží i jako signální molekuly vylučované do blízkého okolí (viz parakrinní sekrece, kap.6).
G-proteiny jsou bíkovinné trimery, tvořené 3 podjednotkami (α,ß,γ). Jsou lokalizovány na vnitřní straně PM. Patří do početnější skupiny tzv. GTP-vázajících proteinů (proto i název G-proteiny). Podjednotka α váže za klidových podmínek GDP. Po stimulaci receptoru se trimerní komplex G-proteinu spojí dočasně s receptorem, podjednotka α uvolní GDP, naváže GTP a oddělí se od podjednotek ß, γ. Takto aktivovaná podjednotka α, i dimer ß,γ, mohou reagovat s dalšími, tzv. cílovými proteiny plazmatické membrány (viz níže). Podjednotka α pak svou enzymatickou aktivitou hydrolyzuje navázané GTP, spojí opět s podjednotkami ß,γ a tím se celý G-protein stává opět inaktivní. Cílovými proteiny aktivovaných G-proteinů, jsou sousední bílkoviny PM, mající enzymatickou aktivitu, kterou katalyzují v cytozolu tvorbu dalších molekul účastnících se přenosu a šíření informace, tzv. sekundárních poslů. 84
Častým, a prvně objeveným sekundárním poslem je cAMP, které syntetizuje G-proteinem aktivovaná adenylátcykláza. Aktivace fosfolipázy C- ß vede k syntéze sekundárních poslů IP3 a DAG z fosfolipidu fosfoinositolu v PM (viz shora). IP3 difunduje do cytoplazmy a uvolňuje Ca2+ z hl-ER. DAG zůstává vázán v PM. Sekundární posli aktivují v cytoplazmě další enzymy, proteinkinázy, které fosforylují efektorové (výkonné) bílkoviny, které realizují změnu metabolismu a funkce buněk. Např. aktivaci nebo zástavu buněčného dělení, změny permeability PM, vylučování hormonů ze sekrečních buněk, glykogenolýzu v játrech a svalech, lipolýzu v tukové tkáni-viz kap. 6, exprese genomu, apod. Proteinkinázy tvoří mnohočlenou tzv. rodinu bílkovin. Proteinkináza A je aktivovaná, tj. je dependentní na cAMP. Proteinkinázu C aktivuje DAG a IP3. Ca ionty uvolněné z ER vedou k aktivaci tzv. Calmodulin (CaM) dependentní kinázy. Viz též níže též tzv. Mitogeny aktivované kínázy (MAPK). Zvýšení hladiny Ca2+ v cytozolu vyvolané IP3, nebo i otevření Ca iontových kanálů v PM jinými ligandami, vede ke změnám funkce buňky přes aktivaci tzv. Ca2+ vážící proteiny, které po navázání kalciových iontů reagují s dalšími efektorovými proteiny (kalmodulin, troponin C a další), které zajistí požadovanou funkční odpověď buňky. Ionty kalcia mohou vstupovat též do mitochondrií, kde podporují energetickou přeměnu aktivací pyruvát- , izocitrát- , a glutarát-dehydrogenázy. G proteiny se vykytují v několika isoformách. Shora popsané zvýšení hladiny cAMP zajišťuje tzv. Gs protein (s = stimulační). Receptorová aktivace tzv. Gi-proteinů (i = inhibiční) vede naopak k inhibici adenylylcyklázy, což se projeví, spíše než poklesem hladiny cAMP, změnou propustnosti některých iontových kanálů. Fosfolipázu C- ß (vznik IP3 a DAG, viz shora) aktivují receptory přes tzv. Gq proteiny. Tzv. Gt-protein, (t=transducin), zajišťuje přenos světelného signálu v tyčinkách sítnice. Golf (ofl-olfactory) vznik podráždění v čichovém epitelu. Funkci podobnou shora uvaděným tzv. trimerním G proteinů, mají i tzv. malé, monomerní G proteiny označované zkratkami (Ras, RhoA, Rac1, RaIA apod). Jejich mutace jsou častou příčínou poruch dělení buněk, vč. nádorového bujení. Viz též níže onkogeny. Více v předmětu Molekulární biologie.
Signalizační cestu (kaskádu) se sekundárními posly používají často peptidické hormony tvořené žlázami s vnitřní sekrecí, dále některé neuromediátory (adrenalin, noradrenalin, acetylcholin, histamin) a další biologicky aktivní molekuly, ale i např. světlo fotony dopadající na světločivé buňky sítnice. Více v předmětu Fyziologie a Molekulární biologie. Aktivace jednoho R tohoto typu stačí k aktivaci většího počtu G-proteinů. Každá molekula sekundárního posla aktivuje větší počet kináz, atd., což vede í k mohutnému zesílení (amplifikaci) primárního signálu. Buňky používají i signalizační kaskády tvořené řadou tzv. „malých G-proteinů“ . Často se jedná o monomery fungující podobně jako shora popsaná G-alfa podjednotka shora popsaných trimerních („velkých“ ) Gproteinů. Patří sem např. tzv. ras proteiny uplatňujících se řízení dělení buněk (viz níže a kap. 3.5) nebo váčkové transportu látek (kap. 4.1, iii). Mutace těchto molekul proto vede často nádorové transformaci buněk. Více v kap. 4 a výběrovém kurzu Patobiologie buněk a tkání. cAMP využívají jako signalizační molekulu i prokaryontní buňky (např. v regulaci metabolizmu při nedostatku energetických substrátů). Působí však pouze přes změny transkripce genů (kap. 3.3)
Ad (ii) R-y s vlastní enzymatickou aktivitou. Cytoplazmatická část těchto R-ů má enzymatické vlastnosti, které se aktivují po podráždění receptoru specifickým podnětem. Enzymatická aktivita se projevuje nejčastěji fosforylací (tzv. proteinkinázová aktivita) dalších bílkovin cytoplazmy. Tím se mění metabolizmus a funkční aktivita buňky. 85
Fosforylace cílových cytoplazmatických bílkovin probíhá zpravidla na jejich tyrozinových residuích (zbytcích) a proto jsou tyto receptory označovány jako R-y s vlastní (!) tyrozinkinázovou aktivitou (RTK). Tento typ R-ů se uplatňuje při regulaci buněčného dělení růstovými faktory (viz kap. 3.5). Některé receptory této skupiny mají i fosfatázovou enzymatickou aktivitu, tj. schopnost defosforylace a inaktivace R.. Některé receptory, např. pro atriový natriuretický faktor, předávají signál cestou aktivace své guanylátcyklázové aktivity. Více ve Fyziologii živočichů
Ad (iii) R-y typu iontových kanálů. Tyto R-y se po podráždění na několik milisekund otevřou tj. stanou se propustnými pro určitý typ iontů (např. sodíku, draslíku, vápníku, chloridů a pod). Zvýšení jejich hladiny vede ke změně funkční aktivity buňky. Tento typ R-ů bývá aktivován chemicky, např. acetylcholinem, změnou elektrického napětí na PM, nebo mechanicky. V klidovém stavu je iontový kanál uzavřen tzv. hradlem nebo vrátky, které vzniká těsným přiblížením se jeho peptidických podjednotek či „smyček“ k sobě. Podle povahy signálu, který iontový kanál aktivuje (otevírá) iontové kanály se dělí na chemicky, napěťově a mechanicky regulované. Součástí názvu kanálu jsou rovněž ionty, které specificky propouští a případně i název příslušné jeho ligandy. Iontové kanály jsou tvořeny zpravidla 5 peptidickými podjednotkami, seskupenými do kruhu. Střed takovéhoto pentamerického kanálu je v klidovém stavu zpravidla uzavřen. Po otevření (viz výše) propouští kationty nebo anionty, dle náboje postranních skupin aminokyselin mířících do nitra kanálu. Nagativní náboj uvnitř otevřeného kanálu umožňuje průchod kationtů, pozitivní náboj pak průchod aniontů. Příklad: Sarkolemma kosterních svalových vláken obsahuje chemicky regulované iontové kanály pro Na+ aktivovatelné acetylcholinem. Některé iontové kanály se cyklicky samy spontánně otevírají a zavírají. Takto je zajišťovaná např. srdeční automacie nebo střevní peristaltika. Více ve fyziologii živočichů- Existuje i zvláštní skupina iontových kanálů, které jsou dlouhodobě až trvale otevřeny. Cave: Iontové kanály je třeba odlišovat od konexonů a akvaporinů umožňujících transport větších molekul do živočišné buňky.
Ad (iv) R-y cytokinové super-rodiny. Syn. R-y vážící se s tyrozinkinázovou aktivitou. Tyto R-y nemají vlastní enzymatickou aktivitu jako skupina (ii). Po aktivaci však spojují s cytoplazmatickými proteiny, u kterých aktivují tyrozinkinázovou aktivitu, která pak fosforyluje cílové bílkoviny buňky, odpovědné za její metabolické a funkční změny. R-y této skupiny se váží s biologicky aktivními molekulami tvořenými buňkami imunitního systému (lymfokiny i některými dalšími tzv. tkáňovými hormony- cytokiny a růstovým hormonem člověka.
Signalizační síť aktivovaná různými R-y je však ještě mnohem komplexnější, než popsáno shora. Některé další mezičlánky a molekulární informační sítě jsou stručně uvedeny níže. Více v Molekulové biologii. Šíření signálů v buňce od R-ů se zpravidla účastní malé molekuly bílkovin, kódované tzv. c (ras proteiny , viz shora i kap. 3.5, c-onc), patřící do skupiny tzv. monomerních G-proteinů (GTPáz), které aktivují další články signalizačních kaskád, které se označují zkratkami, např. podle výsledné funkční odpovědi- Mitogeny Aktivované Protein Kinázy (MAPK) a kinázy těchto kináz (MAPKK).
86
Aktivace MAP kináz je konečným článkem kinázových kaskád, které se účastní několik dalších kinázových rodin. Jsou to např. tzv. Stress Activated Protein Kinases-SAPKs, Janus kinases-JAKs, a další označkované opět pouze zkratkami, jako např. ERKs- Extracellular Signal Regulation Kinases, STATs apod). Cílovou molekulou kinázových kaskád, vedoucích podnět od receptorů PM, je často až jádro, kde mění expresi genomu. Změny exprese mohou postihnout až 100 dosud známých genů, které regulují buněčné dělení. Patří do skupiny tzv. early response genes, z nichž některé geny (např. c-Fos, c-Jun) kódují transkripční faktory (viz kap. 3.3, 3.6), které ovlivňují transkripci dalších genů. Kinázy lze je uspořádat dle fylogenetické příbuznosti do bílkovinných rodin a super (nad)-rodin (angl. protein families and superfamilies). Více v předmětu Molekulární biologie. Poznámka. V PM mají receptory též lipofillní deriváty mastných kyselin, prostaglandiny, které vznikají oxidací kyseliny arachidonové PM. Působí lokálně jako tkáňové hormony zejména na hladké svaly, nervové buňky, cévní systém a reprodukční aparát. Jsou synthetisovány ve většině buněk. Tvoří se ve zvýšené míře při zánětlivých reakcích a jsou i příčinou bolesti v místě zánětu. Inhibice jejich tvorby kyselinou acetylosalicylovou (acylpyrin, ibalgin, brufen a podobné farmaceutické preparáty) proto tlumí zánět i bolest. Mají ochrannou funkci pro žaludeční sliznici. Potlačení jejich tvorby nadměrným používáním shora uvedených a volně dostupných léků, může vést k tvorbě tzv. žaludečních a dvanácterníkových vředů.
3. 4. 4 Receptory v cytoplazmě a jádře buněk V cytoplazmě a jádře se nacházejí R-y pro biologicky aktivní molekuly, které mohou volně procházet PM (nepolární, lipofilní molekuly). Patří sem steroidní pohlavní hormony, hormony kůry nadledvin, štítné žlázy a retinol (provitamin A), vitamin D. Některé z nich (glukokortikoidy) se receptorově spojují již v cytoplazmě s tzv. transportními proteiny. Vytvořený komplex se pak přenáší do jádra, kde se váže na specifické regulační úseky DNA, tzv. steroid responsive elements v oblasti promotoru strukturálních genů, které mění jejich transkripci, ev. ovlivňují stabilitu m-RNA, vznikající jejich přepisem. Jiné hormony této skupiny (retinoidy, thyroxin štítné žlázy) mají bílkovinný receptor až na DNA v jádře. Návázaním příslušné hormonální ligandy se aktivuje transkripce příslušných genů. Slouží k regulaci růstu a diferenciace buněk. Více v Molekulové biologii a Fyziologii živočichů. 3. 4. 5 Rychlost receptorové odpovědi Po podráždění receptorů typu membránových iontových kanálů dojde k odpovědi buňky v řádu milisekund. Tyto R-y se uplatňují především při synaptickém přenosu (např. tzv. nikotinové R-y pro acetylcholin, glutamátové, glycinové a GABAA receptory, viz později předmět Fyziologie živočichů). Několik desítek milisekund vyžaduje odpověď zprostředkovaná R-y působícími přes G protein. Odpověď s latencí hodin až dnů nastává po stimulaci R-ů pro steroidy, tyroxin a retinol, které mají receptory v cytoplazmě nebo až v jádře (viz níže). Pozn. Pro některé R-y nejsou dosud známé jejich ligandy. Označují se proto jako sirotčí (orphan) R-y
3. 4. 6 Ukončení receptorové odpovědi Stimulace R-ů PM a následná odpověď může být ukončena několika způsoby: (i) Enzymatickým rozložením molekuly sekundárního posla (viz níže rozpad cAMP), nebo (ii) defosforylací cílové efektorové bílkoviny enzymy, fosfatázami. Enzymaticky může být (iii) selektivně rozložena i molekula stimulující receptor (např. acetylcholin nebo jiný neuromediátor v synaptické štěrbině chemických synapsí). Další možností ukončení Rsignalizace je ten, že segment membrány nesoucí komplex receptor-agonista je (iv) pohlcen endocytozou formou membránovou obaleného váčku, ve kterém je agonistní molekula enzymaticky rozštěpena a R vrácen do plazmatické membrány transportním váčkem (recyklace receptoru). 87
Aktivací těchto, i některých dalších mechanismů, lze též dosáhnout fyziologického snížení odpovědi R-ů, tzv. desenzitizace R-ů. Přenos podnětu receptorovým systémem využívajícím G proteiny lze narušit farmakologicky. Oslabení odpovědi lze docílit obsazením vazebných míst na receptorech molekulami tzv. antagonistů, z nichž některé mají široké klinické použití (blokátory a a ß- adrenergních receptorů, kalciových kanálů, excitačních aminokyselin a pod.). Zvýšení jejich účinnosti lze docílit inhibicí enzymatického rozkladu molekul sekundárních poslů. Rozpad cAMP zpomalují např. xanthinové deriváty, ke kterým patří kofein a thein, theobromin v kávě, čaji a čokoládě. Podjednotku α Gs-proteinu udržuje ve stavu trvalé aktivity toxin bakterií působících choleru, což vede k poruchám resorbce látek ve střevě a je příčinou těžkého průjmu. Opačně působí toxin bakterií vyvolávajících černý kašel (pertusis). Geneticky podmíněné defekty α podjednotky Gsproteinu vede ke změnám citlivosti na různého hormony a tím i k poruchám vývoje a některých další hormonálně řízených funkcí.
3. 5 BUNĚČNÝ CYKLUS A JEHO REGULAČNÍ MECHAMIZMY (obr. 35,36, 38-42) 3. 5. 1 Význam buněčného dělení Dělení buněk zajišťuje řadu základních funkcí živočichů. Mezi nejdůležitější patří: ☺ ☺ ☺ ☺
rozmnožování jednobuněčných organizmů, nepohlavní rozmnožování organizmů vícebuněčných, ontogenetický vývoj obnova tkání za vývoje a v dospělosti (epitelové výstelky, žlázy se zevní sekrecí, kostní dřeň a pod). ☺ reparace a regenerace poškozených tkání a orgánů V průběhu dělení dochází k tzv. lineárnímu přenosu genetické informace z mateřské buňky na buňky dceřiné. U jednobuněčných živočichů se genetická informace dělením přenáší na celý nový organizmus (vertikální přenos genetické informace). Přenos se týká informace obsažené v genech buněčného jádra (tzv. jaderná dědičnost) i v mitochondriích (mimojaderná dědičnost, matroklinita).
Živočišné buňky se dělí nepřímo, mitoticky. Mitóza (nepřímé dělení jádra) je však jen konečné stádium dělení buňky, kterému předchází řetěz morfologických a chemických dějů, označovaných souborně jako buněčný cyklus (BC). ☻ Poruchy dělení buněk mají závažné důsledky pro vývoj a život organizmu. K nejzávažnějším poruchám, spočívajícím v nekontrolovaném dělení buněk, patří nádorová transformace buněk. 3. 5. 2 Buněčný cyklus (BC), jeho fáze a regulace (a) Definice BC : BC je řetěz strukturálních a chemických změn jehož výsledkem je rozdělení mateřské buňky ve 2 buňky dceřiné. Období předcházející vlastnímu dělení (mitóze), se označuje jako interfáze. (b) Fáze BC: BC se člení se do 3 úseků, fází: postmitotická G1-fáze, fáze syntézy DNA, též S-fáze a premitotická G2-fáze. Následuje fáze mitotická, M-fáze a cytokineze.
88
Co se děje v jednotlivých fázích BC? V G1-fázi se v buňce syntetizují strukturální a funkční makromolekuly (specifické m- RNA, bílkoviny, na př. G1 cyklinu a jeho kinázy, enzymy potřebné pro nadcházející replikaci DNA). (i) V S-fázi, dochází k replikaci DNA (duplikace genetické informace), pokračuje syntéza RNA a některých bílkovin (histonů). (ii) V G2 fázi probíhá syntéza RNA a regulačních bílkovin, např. G2 cyklinu, (viz níže cyklinové hodiny a MPF faktor), nehistonových proteinů, fosfolipidů a některých enzymů, dokončuje se replikace centrozomů, které migrují k opačným pólům buňky. (iii) Ve fázi mitózy dojde k rozpadu jaderné blány (viz níže), vytvoření mitotického vřeténka, jeho úponu na kinetochory chromozomů, rozdělení chromatid a jejich redistribuce k pólům mateřské buňky. (iv) V průběhu cytokineze se zaškrcuje cytoplasma a dokončí se oddělení obou dceřiných buněk. Zaškrcení realizuje tzv. kontraktilní prstenec tvoření svazky mikrofilament orientovaných kolmo na podélnou osu buňky. Replikace DNA (obr.38) Replikace (syn. reduplikace) DNA probíhá u živočichů na každém chromozomu odděleně. Začíná v několika (až 20-ti) tzv. iniciačních replikačních bodech chromozomu (u bakterií je tomu tak pouze jednom místě, tzv. ori lokus). Segmenty DNA, které jsou replikovány z jednoho iniciačního replikačního bodu se nazývají replikony. Zpravidla se proces člení do 3 fází: iniciačná, elongační a termínační V iniciační fázi se v iniciačních replikačních bodech obě vlákna dvojšroubovice DNA rozpojí aktivací enzymu helikázy a spolupracujích proteinů a vznikne replikační bublina či vidlice, do jejíž vrcholu nasedne na obě vlákna speciální tzv. DNA vážící protein a DNA-primáza (DNA řízená RNA-polymeráza), syntetizující tzv. RNA-primer, tj. krátký segment 50-2001000 nukleotidů zv. též startér. Následuje vlastní replikace DNA připojováním basí na principu komplementárního párování na obou mateřských vláknech DNA. Viz též níže V elongační fázi rozplétání obou vláken zajišťuje helikáza a další proteiny (single strandDNA binding protein). Deoxynukleotidy dceřinných vláken jsou spojovány DNA polymerázami za účasti tzv. proteinové svorky (PCNA, Proliferation Cell Nuclear Antigen). Enzymy zv. topoisomerázy uvolňují napětí v molekule dvojšroubovice, které vzniká jejím rozplétáním na vrcholu replikační vidlice. V eukaryontní buňce je to DNA-polymeráza α v komplexu DNA primázy na zpožďujícím se vlákně a DNA polymeráza δ na vedoucím vlákně.
Nová dvojšroubovice obsahuje pak vždy jedno vlákno mateřské a jedno vlákno nově syntetizované DNA. Tento proces replikace DNA označujeme proto jako semikonservativní. Proces replikace DNA probíhá pouze ve směru 5´--3´. Vzhledem k tomu, že obě vlákna mateřské DNA jsou uspořádána antiparalelně (na obou koncích dvojšroubovice jsou koncové části 3´ i 5´, jedno vlákno se replikuje kontinuálně směrem k 5´konci mateřského vlákna (tzv. vedoucí nebo předbíhající, též anterográdní vlákno), zatímco druhé vlákno se synthetisuje semidiskontinuálně, tj. vždy až po odvinutí krátkého úseku mateřského vlákna (proto se označuje též jako zpožďující se, nebo též retrográdní vlákno). Postupně syntetizované polynukleotidové segmenty tvořené na zpožďujícím se vlákně se nazývají Okazakiho fragmenty ( proces vzdáleně připomíná tzv. zadní steh při ručním šití). Následně se primer (nezbytný pro začátek syntézy každého segmentu) odbourá a činností DNA89
polymerázy je nahrazen polydeoxyribonukleotidovým řetězcem a spojen DNA-ligázou v souvislý řetězec. Ve fázi terminace na konci zpožďujícího se řetězce však nastává replikační problém, který spočívá v tom, že 3´konci matricového (vedoucího) řetězce „již není místo“ na navázaní RNA primeru a DNA-polymerázy. Tento problém řeší enzym telomeráza. Telomeráza je tvořená RNA a katalyticky aktivním proteinem. Rozpoznává matricovou telomerickou DNA, která je bohatá na G baze. U člověka se jedná o mnohonásobné sekvence GGGTTA. Ribonukleotidové sekvence telomerázy přechodně prodlouží 3´konec templátového DNA řetezece, což poskytne úchyt pro RNA primer a DNA polymerázu, která poté dosyntetizuje chybějící nukleotidové baze na konci opožďujícího se dceřinného vlákna (komplementárním párováním dle telomerázou prodlouženého konce matricového řetězce. Podobný problém, řešený rovněž telomerázou, je i na začátku vedoucího DNA řetězce po uvolněni iniciálního RNA primeru.. Telomery se za fyziologických podmínek v dělících se somatických buňkách přesto po každé mitóze zkracují. Po zhruba 50-60 cyklech se proto dělení zastaví, jako prevence vzniku mutace případným „slepováním“ chromozomů. Vyčerpání mitotické aktivity se označuje jako generační stárnutí buňky. Tento problém odpadá při replikaci kružnicové DNA prokaryot a mitochondrií. Před oddělením mateřských a dceřiných vláken projdou dceřiná vlákna tzv. kontrolním čtením (proof-reading) a případné chybně spárované nukleotidy jsou vyměněny činností DNA-polymerázy β DNA-polymeráza γ zajišťuje replikaci DNA v mitochondriích (probíhá nezávisle na replikaci jaderné DNA). U prokaryont se replikace DNA účastní DNA-polymeráza I,II a III.Více v Molekulové biologii.
3. 5. .3 Řízení BC
Cyklinové hodiny, bim,,bam,bum…?
BC cyklus je řízen řadou nízkomolekulárních látek (kalciové ionty, cyklické nukleotidy, prostaglandiny aj.) a bílkovin, které fungují jako nitrobuněčné hodiny, jako signální molekuly působící na buňku z jejího okolí nebo jako jejich receptory na povrchu buňky. Kromě chemické identifikace a stanovení specifických funkčních vlastností těchto bílkovin se v posledních letech podařilo nalézt i geny, které je kódují. Tím se otevřela cesta k poznání poruch buněčného dělení vznikajících velmi často poškozením jaderné DNA. Regulace buněčného cyklu spočívá v řízení: (1) postupného přechodu buňky z G1 do M-fáze a fáze cytokineze (2) opakovaného vstupu dceřiných buněk do G1 fáze BC, event. vstupu nedělící se buňky (Go fáze) do G1, tj. startu BC (3) zástavy BC před mitózou v buňkách, u kterých došlo k neúplné replikaci DNA nebo jejímu poškození Ad 1. Přechod buňky jednotlivými fázemi BC zajišťují bílkoviny označované jako cykliny a cyklin-dependentní kinázy
90
Cykliny jsou specifické bílkoviny, které působí v komplexu s tzv. cyklin dependentními proteinkinázami (zkratka Cdk), které aktivují. Aktivované proteinkinázy pak fosforylují další bílkoviny, čímž indukují další krok BC, tj. posun buňky do jeho další fáze. Oba typy molekul jsou syntetizovány přímo v dělící se buňce. Molekuly cyklinu jsou po vstupu do cílové fáze BC enzymaticky rozloženy v organelách zv. proteazomy (viz kap. 2. 6 a kap. 4). Molekuly Cdk dependentních kináz zůstávají zachovány pro další cyklus. K aktivaci proteinkináz dochází až při dosažení jistého, tzv. kritického počtu cyklinových molekul. Obsah cyklinů proto v dělící se buňce periodicky stoupá a klesá a celý systém se proto někdy označuje jako "cyklinové hodiny". Cykliny, i jimi aktivované proteinkinázy se v živočišných buňkách vyskytují v několika typech (Cyklin A,B,E,D a další), z nichž každý je specifický pro přechod buňky do následující fáze BC. Cyklin A a E řídí např. přechod z G1 do S-fáze. Proto se též označují jako G1- a S-cykliny. Cyklin B, přechod z G2 fáze do mitózy. K poznání regulační úlohy těchto molekul přispěl o studium živočišných buněk v kulturách, dělení kvasinek a jejich tzv. CDC (Cell Division Cycle) mutantů a překvapivě i některých virů (viz níže). Při hledání příčin poruch dělení CDC kvasinkových mutantů byly totiž zjištěny defekty v genech, které kódují bílkoviny, které svým složením se podobaly jak cyklinům, tak Cdk proteinkinázám isolovaným z živočišných buněk, vč. níže zmíněného MPF faktoru žabích vajíček. Tím byl získán důkaz o univerzalitě cyklinového systému a položeny základy k dalšímu rozvoji poznatků o regulaci BC genovými produkty za normálních podmínek, i pro objasňování poruch dělení, vč. nádorové transformace buněk (viz níže, růstové faktory).
První objevený cyklin, cyklin B (též premitotický), aktivuje cdk-dependentní kinázu v G2 fázi BC. Proteinkináza fosforyluje laminy v jádře. Výsledkem je depolymerace laminů rozpad jaderné blány, následované kondenzací chromozomů a tvorbou mitotického vřeténka, tj. vstup a průchod buňky do M-fáze (mitózy) BC. Tento cyklin byl objeven původně jako součást tzv.MPF faktoru (M-phase Promoting Factor) v žabích vajíčkách, kde je nezbytný pro vstup do M-fáze prvního meiotické dělení. Na tomto modelu bylo rovněž zjištěno, že obsah MPF v cytoplasmě vajíček osciluje. Dosahoval maxima před M-fází a poté jeho obsah rychle klesal. Na tomto modelu bylo rovněž zjištěno, že MPF obsahuje i další bílkovinu s proteinkinázovou aktivitou, později identifikovanou s cyklin-dependentní kinázou.
Ad 2. Opakovaný vstup dceřiných buněk do BC, případně vstup nedělící se buňky z Go do G1 fáze zajišťují některé tzv. růstové faktory (RF) Vstup buňky do G1 fáze vyžaduje překonání tzv. startovního místa cyklu (syn. restrikčního bodu). Pokusy s pěstováním buněk mimo organizmus v podmínkách kultur ukázalo, že vstup buňky do G1 fáze závisí na přítomnosti některých polypeptidů vyskytujících se v krevním séru, zvláště mláďat, Jsou označovány jako růstové faktory (RF nebo GF z angl. Groth Factors). Působí přes receptory lokalizované v plazmatické membráně buněk (viz kap. 3.4). Názvy RF pocházejí často z názvů buněk, ze kterých byly RF poprvé isolovány, nebo buněk na kterých byly poprvé růstové účinky zjištěny, i když je dnes známo, že se uplatňují v regulaci mnoha jiných typů buněk. Používají se většinou jen zkratky (akronymy) jejich anglických názvů. Příklady: Epidermal Growth Factor-EGF, Fibroblastic Growth Factor-FGF, Platelet Derived Growth FactorPDGF (Růstový faktor isolovaný z krevních destiček), Insulin like growth factor-IGF apod. Řada z nich e vyskytuje v několika isoformách.
Růstové faktory a některé další molekuly (cytokiny, viz molekulární biologie a fyziologie) a jejich receptory, spolu s molekulami účastnící se přenosu podnětu přes plazmatickou membránu a uvnitř buňky (transdukce signálu, viz kap. 3.4) jsou kódovány geny, které se souborně označují jako protoonkogeny, nebo tzv. celulární onkogeny, c-onc. Viz níže 91
Ad 3. Zástavu BC v poškozených buňkách umožňují proteiny kódované několika geny, z nichž klíčovou úlohu má gen TP 53 a gen Rb1 I brzd třeba........
Exprese (transkripce) genu TP 53 se aktivuje v případě, že došlo k poškození buňky, zvláště molekuly DNA. Protein kódovaný tímto genem buněčný cyklus, p53, zastaví dělení do doby než buňka poškození opraví. V případě, že oprava není možná, p53 aktivuje apoptotický proces ( viz kap 4.4). Gen TP 53 je proto nazýván "strážcem integrity genomu". Produkt „zdravého“ (angl. wild) genu Rb1 (odvozeno z názvu nádoru- retinoblastom, ve kterém byla isolována jeho mutovaná forma) rovněž brzdí buněčný cyklus. Působí v součinnosti s genem kódujícím protein E2F (viz níže). p53 má charakter transkripčního faktoru, tj. působí navázáním na regulační sekvence genů regulujících průchod buněk BC. Aktivuje především gen p21, který kóduje tzv. Cdk-inhibiční protein. V případě jeho mutace, poškozené (mutované) buňky se mohou dále dělit a stát se zdrojem buněk nádorových. Brzdné účinky bílkoviny kódované genem RB se ztrácejí její nadměrnou fosforylací (oddělí se podjednotka E2F, která aktivuje expresi genů kódujících enzymy pro vstup do S-fáze). The E2F family of transcription factors is a key regulator of cell-cycle checkpoints in mammalian cells. The E2F protein is a major target of Rb and the activity of E2F/pRb is intimately connected with the G1-S transition of the cell cycle.
Protoonkogeny, onkogeny, antionkogeny Jak již zmíněno shora, onkogeny zahrnují skupinu genů, jejichž bílkovinné produkty se podílejí na regulaci buněčného cyklu. Patří mezi ně růstové faktory (RF) a cytokiny (viz shora) a jejich receptory, bílkoviny transdukčních signalizačních drah, transkripční faktory apod. Bílkoviny kódované onkogeny mohou být lokalizovány v plazmatické membráně, v cytoplazmě nebo v jádře. Jejich skupinový a poněkud alarmující název onkogeny, vznikl pod vlivem poznatků o virech, které u zvířat, vyjímečně i člověka (viz níže), jsou schopny vyvolat nádorovou transformaci buněk. Ukázalo se totiž, že některé ze shora uvedených bílkovin regulujících buněčný cyklus, především RF a jejich receptory, jsou svým chemickým složením často velmi podobném (nikoliv však zcela identické) bílkovinám kódovaným v genomu těchto, tzv. onkogeních virů (RNA retroviry, viz níže). Geny kódující shora uvedené bílkoviny regulující buněčné dělení v nepoškozených eukaryontních buňkách se proto souborně označují jako protoonkogeny. Onkogeny odpovědné za nádorovou transformaci buněk, jejímž charakteristickým znakem je ztrát kontroly buněčného cyklu (nekontrolované nadměrné dělení), vznikají mutací DNA. Protoonkogeny označovány též jako c-onkogeny (cellular oncogenes), zatímco geny onkogenních virů jako v-onkogeny. Zpravidla se používají zkratky c- onc a v-onc. Geny p53 a RB se někdy označují jako anti-onkogeny. Název onkogenu je zpravidla uváděn zkratkou ze 3 písmen, viz níže. Mezi nejznámnější onkogenní viry zvířat patří virus Rousova sarkomu (v-src). Mezi lidské onkoviry patří některé papilomariry (dnes existuje proti nim vakcinace, předcházející karcinomu děložního hrdla a penisu), herpetické viry, virus hepatitidy B a C, virus Epstein-Barrové (EBC virus) a některé další málo četné agens. http://genetika.wz.cz/clanky/onkogenni_viry.php
Látky působící změnu c-onc na v-onc se označují skupinově jako mutageny. Vymknutí se z genetické kontroly buněčného děleni (i adhezivity a migrace) je podstatou nádorové transformace buněk. Takto působící mutageny se označují jako kancerogeny 92
Mutageny lze dělit na fyzikální (např. různé typy radiace), chemické (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy, nitrosaminy, alkylační látky, benzpyren, benzidin, pesticidy, polycyklické uhlovodíky, uhelný dehet, plísňový aflatoxin B1, arsen, azbest a pod) a biologické (RNA retroviry). V buňce může dojít i k tzv. spontánním mutacím, např. při selhání oprav DNA způsobených samotným replikačním aparátem buňky, nebo ovlivněním genů regulujících intenzitu dělení přesunem tzv. transpozonů Mutace se mohou týkat celého genomu (polyploidie), jednotlivých chromozomů (zmnožení počtu, translokace části jednoho chromozomu na jiný) nebo jednotlivých genů, resp. molekuly DNA (tzv. bodové mutace: inzerce, delece nebo translokace bazí, posun čtecího rámce, tvorba dimerů). Důsledkem mutací genů je změna transkripční aktivity příslušných genů nebo změna primární struktury, a tím i funkce proteinu kódovaného příslušným genem. Bodové mutace se však v důsledku degenerovanosti genetického kódu (viz kap. 2. 5 a kap. 3.3) nemusí projevit změnou v sekvencích aminokyselin a tím i změně funkce takto kódované bílkoviny (tzv. tiché mutace). K nádorové ztrátě kontroly buněčného dělení může vést přemístěním některých transpozonů do oblasti genů kódujících buněčný cyklus, adhezi a migraci buněk.
Cyklující buňky představují tzv. růstovou frakci populace. Nedělící se buňky, setrvávající dočasně nebo trvale v tzv. Go fázi, představují tzv. nerůstovou frakci Růstová frakce je vysoká v rostoucích populacích v mládí; v dospělosti pak v tkáních s rychlou fyziologickou obnovou (krevní buňky, epitely, kostní dřeň a pod.). Mezi málo se dělící patří např. mozkové, jaterní a svalové buňky
3. 5. .4 Generační stárnutí buněk
"50 krát, a dost" !
Většina tělových (somatických) buněk savců se může rozdělit pouze zhruba 50 krát. Významnou příčinou tohoto, tzv. generačního stárnutí buněk, je vyhasínání exprese genu, který kóduje enzym, telomerázu, která zajišťuje replikaci koncových částí chromozomů. V důsledku "vyhasínání" funkce tohoto genu, resp. enzymu, se konce chromozomů v průběhu opakovaných cyklů zkracují, až posléze se dělení buňky nevratně zastaví. Aktivitu tohoto genu si uchovávají tzv. kmenové buňky. (viz kap. 3.6). Vysokou aktivitu telomerázy mají často nádorové buňky.
3.6 DIFERENCIACE BUNĚK V PRŮBĚHU VÝVOJE A V DOSPĚLOSTI (obr. 43) 3. 6. 1 Diferenciální („výběrová“) exprese genů, její regulační mechanismy a biologický význam V těle živočichů je široké spektrum buněčných typů (fenotypů). Tato rozmanitost se odvozuje z oplozené vaječné buňky procesem diferenciace. Podstatou tohoto procesu je řízená exprese genů, která vede k dělení a postupné proměně vajíčka na blastomery, buňky zárodečných listů, orgánových základů a parechyncmové buňky jednotlivých tělních orgánů. Diferenciální exprese genů je rovněž nezbytná pro v dospělosti v procesech adaptace, reparace a regenerace v tkání, orgánů a organizmu. I když každá buňka obsahuje všechny geny (u člověka zhruba 30.000) přepisována (transkribována, exprimována) je pouze jejich malá část (cca 1-5%). Ve všech buňkách jsou přepisovány geny kódující proteiny membránových organel, cytoskeletu, ribozomů, chromozomů, cytosolu, různých forem RNA nebo enzymů, zajišťujících základní metabolické dráhy a funkce buňky, pod.. Proto se tyto geny označují též jako „provozní“ nebo housekeeping genes ("domácnost udržující geny"). Kromě toho jsou v buňkách přepisovány geny jejichž produkty zajišťují specifické funkce buňky, např. specifické signální molekuly (hormony, cytokiny, růstové faktory), jejich 93
receptory, enzymy syntetizující neuromediátory v nervové tkáni a atp. Tyto geny se někdy označují skupinově jako buněčně či tkáňově specifické, nebo „luxusní“ geny, které jsou základem odlišností v morfologii a funkci buněčných fenotypů. Spektrum přepisovaných (syn. exprimovaných) genů kódujících bílkoviny, které vykonávají specifické funkce, se liší v buňkách různých fenotypů (nap. buňkách nervových, svalových, krevních apod.). V průběhu ontogenetického vývoje se buňky změnami exprese genů od sebe odlišují morfologickými, chemickými i funkčními vlastnostmi. Tento proces se označuje jako buněčná diferenciace. Z oplozeného vajíčka takto vznikají buňky různých fenotypů. Z blastomer se diferenciací tvoří takto postupně, zárodečné listy, orgánové základy a dospělé orgány (viz kap. 6.3). Proces diferenciace probíhá i v dospělosti v tzv. fyziologicky se obnovujících tkáních (např. epitely, krev) a při některých reparačních a regeneračních procesech (viz kap. 4.2, 4.3). Na regulaci expresi genů se v průběhu diferenciace podílí humorální vlivy (volné chemické působky jako např. hormony, růstové faktory, cytokiny a pod), jakož i přímé kontakty mezi buňkami (viz kap. 2.3 ) a buňkami a extracelulární matrix (EXCM viz kap. 5.1). Spektrum těchto regulačních mechanizmů se stále rozšiřuje. Viz např. malé RNA molekuly kap. 1.1., 2.5. a 3.3) . Více v předmětu Molekulární biologie Dobře zevně patrným a známým příkladem diferenciace buněk je vývoj sekundárních pohlavních znaků v pubertě, kdy pod vlivem cirkulujících pohlavních hormonů se např. u samců zvyšuje transkripce genů kódujících syntézu svalových bílkovin, v epidermis se na některých částech začínají exprimovat geny pro tvorbu ochlupení, u samic pak geny podmiňující tvorbu mléčných žláz apod. V trvale obnovujících se tkáních, např. v epidermis, je migrace dceřiných buněk k povrchu provázena změnou exprese genů, např. pro bílkoviny středních filament cytoskeletu. Regenerace poškozených tkání, nebo celých částí těla (viz níže) vyžaduje rovněž aktivaci transkripce řady genů.
Změnou spektra exprimovaných genů, nebo změnou intensity transkripce již exprimovaných genů (pomocí tzv. zesilovačů-enhancers a zeslabovačů- silencers) se buňky a orgány mohou též adaptovat na změny funkčních požadavků i v dospělosti. (viz též kap. 3.3 a 3 6 a předmět Molekulární biologie). Zvýšenou expresi genů kódujících enzymy a membránové pumpy potřebují např. jaterní nebo ledvinné buňky k rozkladu či vyloučení škodlivých látek (alkohol, alkaloidy, chlorované uhlovodíky, volné kyslíkové a jiné radikály apod., ale i léky, viz níže kap. 4), svalové buňky ke zvětšení celkového objemu svalu při trvalejším zvýšení fyzické námahy apod. Exprese speciálních genů je nezbytná i pro programovanou smrt buňky, apoptózu (viz. níže kap. 4.4)
Schopnost tvořit nové a různorodé diferencované buněčné fenotypy z nezralých prekurzorů v průběhu života klesá. Velkou diferenciační kapacitu, tj. schopnost tvořit dceřinné buňky různých fenotypů, si zachovávají tzv. zárodečné, kmenové a progenitorové buňky (viz kap. 3.6). l Regenerace jater J. Brůha a kol., Vesmír 86, 518, 2007/8 (Kráceno a dopněno textem v závorkách VM) “….Jestliže je objem (chirugicky) odstraněné jaterní tkáně – parenchymu – s patologickým ložiskem příliš velký, hrozí akutní selhání jater. ….. zbytkový parenchym (obsahuje) buňky progenitorové, schopné diferencovat v hepatocyty a cholangiocyty. ….. progenitorové buňky … zdrojem hepatocytů jen průběžně se obměňujících. Jsou zde však ještě kmenové buňky, a to jednak krvetvorné, jednak mezenchymální. ….(které) mohou doplnit počet progenitorových buněk i diferencovat (se) ve vlastní jaterní buňky (hepatocyty), nebo v buňky žlučovodů (cholangiocyty). Navíc, ….jsou schopny fúzovat jak se zdravou, tak s poškozenou buňkou jater, a tím jí jednak vrátí její funkci…..Co nutí buňky, aby zvyšovaly svůj počet (proliferovaly), a tím zahájily regeneraci? Již několik hodin po vyřazení části jaterního parenchymu vzroste sérová hladina interlukinu 6 a jednoho z faktorů nekrotizujících tumor (TNFalfa). …… Začátek proliferace je provázen vzestupem růstového faktoru hepatocytů (HGF), epidermálního růstového faktoru (EGF) a transformujícího růstového faktoru alfa (TGF-alfa). Růstový faktor hepatocytů je produkován neparenchymovými jaterními buňkami a podněcuje tvorbu parenchymových buněk, zatímco transformující růstový faktor alfa produkují parenchymové buňky k své vlastní stimulaci. Konec proliferace je naopak provázen vzestupem sérové hladiny transformujícího růstového faktoru beta (TGF-beta), který produkují hepatocyty, když dosáhnou dostatečné celkové funkční kapacity. Progenitorové buňky…. (mají) na povrchu receptory pro (uvedené) růstové faktory spouštějící diferenciaci buněk”.
94
3. 6.2 Molekulární mechanismy regulace exprese genů Přepis strukturálních genů je řízen sekvencemi nukleotidů, které jsou umístěny na molekule DNA před startovacím nukleotidem tzv. strukturních genů. Tyto sekvence se označují jako regulační oblasti genu. Nejlépe a nejúplněji byl mechanismus exprese genů popsán u prokaryot na tzv. operonovém modelu. Operon je transkripční jednotka, která kromě strukturního genu(ů), kódujících např. enzymy pro rozklad laktózy nebo syntézu histidinu, obsahuje regulační sekvence nukleotidů, které jsou umístěny na DNA před jeho startovacím kodónem, označované jako tzv. promotor a operátor. Promotor je část operonu, na který se váže RNA polymeráza, která uskutečňuje proces transkripce. Operátor je regulační oblast, na kterou se váže molekula tzv. represoru, která je kódována částí operonu, zvanou regulátor. Represor navázaný na regulátor brání transkripci strukturního genu. Po inaktivace represoru se uvolní transkripce strukturních genů. Tento mechanismus regulace je dobře znám u operonu pro metabolismus laktózy (lac-peron) bakterií (viz níže). Laktózový operon (lac operon) kóduje enzymy rozkládající a metabolizující laktózu (disacharid glukózagalaktóza). V nepřítomnosti laktózy v živném médiu je transkripce operonu zablokovaná tzv. represorovým proteinem. Po přidání laktózy se tato váže na represor, který tím ztrácí schopnost se dále vázat na operátor. Výsledkem je uvolnění transkripce genů kódujících enzymy pro hydrolýzu laktozy a metabolismus uvolněné galaktózy. Podobným způsobem funguje i např. tzv. histidinový nebo tryptofánový operon. V tomto případě jde však o vypnutí genů kódujících enzymy pro syntézu histidinu nebo tryptofánu, vyvolaného přidáním příslušných aminokyselin do živného média. Přidaný histidin nebo tryptofán aktivuje represor a tím se zastavuje transkripce genů kódujících enzymy pro syntézu těchto aminokyselin (obr. 43).
Kromě genů operonového typu, existují u bakterií i geny neoperonové, ve kterých je transkripční jednotka řízena pouze promotorem. Regulace transkripce genů (exprese genů) u eukaryot je složitější, vícestupňová a dosud méně objasněna. Jak již uvedeno, prvním stupeň regulace u živočichů představuje změna míry kondenzace chromatinu, která určuje dostupnost transkripčních enzymů k molekule DNA. Kondenzaci chromatinu ovlivňuje např. stupeň acetylace, fosforylace histonů nebo metylace DNA. Fosforylace a defosforylace histonů H1 vede ke kondenzaci a dekondenzaci chromatinu. Podobně acetylace histonů neukleozomálního jádra, zajišťované rovněž enzymaticky (histon acetyltransferázy a histon deacetylázy). Pro vazbu těchto enzymů na chromatin je však třeba ještě dalších proteinů. Uplatňovat se mohou i jiné mechanizmy, např. ubiquitinace histonů (kap. ……). Proto se někdy hovoří i tzv. histonovém kódu. Expresi genů snižuje též metylace N- bazí DNA, zpravidla na 5 uhlíku cytozinu v dinukleotidu CpG. Takto je např. inaktivován jeden z X chromozomů u samic a tento mechanizmus se uplatňuje v rámci tzv. genového imprintingu, kdy je omezena exprese některých genů pouze na otcovskou nebo matčinu alelu. Dinukleotidy CpG se vyskytují převážně v repetitivní DNA a v promotorových oblastech genů, tj. jsou nečetné v genech strukturálních, kódujících pořadí aminokyselin. Metylace usnadňuje nebo zabraňuje vazbě transkripční faktorů nebo transkripci inhibujících komplexů (obsahujících shora zmíněné histon deacetylázy a jejich vazebné proteiny). Metylaci DNA zajišťují metyltransferázy. 95
Tzv. Dnmt1 metyláza připojuje metyl k nově vznikajícímu řetězci při replikaci DNA dle vzoru z mateřské předlohy.. Výsledkem je přenos stávajícího stupně exprese daného genů na dceřinné buňky. Nízký stupeň metylace DNA je charakteristický pro časný embryonální vývoj (preimplatační u savců), kdy se přepisuje relativně největší počet strukturálních genů. Poruchy metylace DNA v dospělosti jsou často spojeny s nádorovou transformací buněk. Jsou rovněž jednou z příčin či průvodních jevů stárnutí buněk a následně i tkání, orgánů a organizmu, vč. častějšího výskytu nádorů Uvedené změny transkripce mohou být dočasné nebo trvalé a přecházet i do dceřinných buněk, případně i potomstva celých organizmů v případě, že proběhnou již v gametách rodičů. Protože takto vyvolané změny vlastností nejsou provázeny změnou kódovacích vlastností tripletů DNA, označují se jako změny epigenetické Hlavními a specifickými, regulátory exprese genů eukaryot jsou však tzv. transkripční faktory (TF, viz kap. …..).TF jsou bílkoviny vážící se na DNA regulačních oblastí genu. Jejich prostorová (terciární) struktura zajišťuje vazbu na dvojšroubovici DNA a jsou schopny i rozlišovat jednotlivé triplety DNA. TF mají některé skupinové strukturální rysy, tzv. motivy. Nejčastějšími motivy jsou: (a) motiv zinkových prstů (atom zinku se váže na 4 protilehlé aminokyseliny tak, že příslušný úsek peptidu je držen v prstovité podobě), (b) motiv leucinového zipu (c) motiv helix-závit-helix (d) motiv helix-smyčka-helix (více v Molekulové biologii). TF lze rozdělit do dvou skupin. První tvoří tzv.obecné TF, které jsou ve většině buněk a podílí se na tzv. bazální a konstitutivní transkripci, která zajišťuje základní a tzv. provozní (housekeeping) funkce společné všem buňkám (viz kap……).. Umožňují RNA polymeráze II zahájit proces transkripce strukturálního genu, tj. DNA obsahující informaci pro daný protein nebo RNA. Podskupina tzv. konstitutivních TF zvyšuje intenzitu transkripce zahájené bazálními TF. Obecné TF jsou fylogeneticky vysoce konzervativní. Druhou skupinou jsou speciální TF ( gene-specificTF), které ovlivňují transkripci pouze genů specifických pro daný buněčný fenotyp. Tyto TF jsou indukovatelné signalizací z okolí buněk. Působí často v komplexu s hormony, např. štítné žlázy, kůry nadledvin, gonád, retinoidy aj.. Výsledkem je aktivace nebo změna intenzity transkripce příšlušného genu, následovaná í specifickými změnami proteomu a tím i morfologie a funkce buněk. To je podstatou diferenciace buněk za vývoje i v dospělosti (v obnovujících se populacích, např. epiteliáních výstelek, kostní dřeni), adaptace buněk na funkční zátěž apod. (viz shora kap. ….a Fyziologie živočichů). TF se váží na specifické nukleotidové sekvence v regulačních segmentech genu, zpravidla jeho promotoru, např. tzv. TATA boxech aj. (viz níže). Na rozpoznávání příslušných nukleotidových segmentů se podílí shora zmíněné motivy TF. Výsledná transkripce genomu v daném buněčném fenotypu vyžaduje koordinovanou spolupráci všech skupin TF. 96
Transkripci mohou TF ovlivňovat též rozvolňováním chromatinu a činit tak kódující sekvence genů lépe dostupné transkribujícím molekulám. . TATA box (syn. Hognessův box) obsahuje sekvenci TATAAAA v úseku -26 až 34. Váže se na něj TFIID. TFIID ve spolupráci s dalšími proteiny může rozeznávat i promotory bez TATA boxů (tzv. nulové promotory) a působit i despiralizaci nukleozomální vláken acetylací histonů. Kromě TATA boxů, promotory vážící bazální TF obsahují i další sekvence/boxy (CAAT box – GGCCAATCT, vážící CTF/NF1, GC box, tzv. oktamer se sekvencí ATTTGCAT, dále velmi důležitý tzv. startovací nukleotid A uvnitř úseku tvořeného pyrimidovými basemi, označovaný též jako Inhr element. TF vážící se na tyto sekvence zajišťují bazální transkripci. Patří sem TFIID, TFIIA,
TFFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH, TFIIJ viz též translace- syntéza bílkovin). Promotory provozních genů mají odlišné TF vážící nukleotidové sekvence (chybí TATA box a často CAAT box, mají více startovacích nukleotidů aj.). Tzv. posilovači transkripce (syn. enhancers) a zeslabovači (silencers) jsou sekvence nukleotidů v DNA před nebo za příslušným strukturním genem (tzv. down-stream a up-stream regulace transkripce). Jejich funkce vyžaduje navázání specifického transkripčního faktoru (TF).Funkce se uskutečňuje tzv. kličkovým (loopingovým) mechanismem (vlásenkové překlopení komplexu enhancer-TF na komplex promotor- RNA polymeráza II)
Genovou aktivitu mohou tlumit i některé malé molekuly RNA (microRNA). Tzv. small interference RNA) jsou např. krátké dvoušroubovice RNA, které mohou se mohou vázat a štěpit molekuly mRNA, což vede k potlačení funkční projevů produktů příslušného genu, viz kap. 3.3. micro RNA. Více v kurzu mol.biologie a Patobiologie živočišných buněk a tkání a http://en.wikipedia.org/wiki/Small_interfering_RNA http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/siRNA.htm
Viz též kap. … Pro podrobnějši výklad struktury a funkci TF viz učebnice genetiky (http://biology.ujep.cz/vyuka/file.php/1/opory/Genetika.pdf) a biochemie.
4. ADAPTACE, 4.1 4.2 4.3 4.4
REPARACE A REGENERACE BUNĚK, TKÁNÍ A ORGÁNŮ
Hlavní škodliviny a mechanizmy jejich působení Obranné a reparční reakce Regenerace buněk, tkání a orgánů. Kmenové buňky Buněčná smrt, její formy, mechanizmy a význam
(obr. 44) Viz též výběrový kurz Patobiologie buněk a tkáni 4.1 Hlavní škodliviny a mechanismy jejich působení Buňky i celé organizmy jsou trvale vystaveny mnoha škodlivým vlivům fyzikálním, chemickým a biologickým ze zevního prostředí. Některé škodlivé látky se tvoří v průběhu metabolizmu i v buňkách a organizmu samotném. Kritickou cílovou strukturou těchto fyzikálních a chemických škodlivin jsou nejčastěji lipidy a bílkoviny, a to jak volné v cytozolu tak v buněčných membránách, cytoskeletu. V jádře a mitochondriích jsou častým terčem škodlivin i nukleové kyseliny. Škodliviny mohou být povahy fyzikální (mechanické, teplo, chlad, elektromagnetické, ionizující a ÚV záření, tlak vzduchu, mikro- a nanočástice ve vzduchu a vodě, vč. cigaretového kouře aj.), chemické (některé kovy, kyseliny, louhy, těžké kovy, látky působící silně oxidačně redukčně, deaminačně, alkylačně pod., viz níže ROS a kancerogeny, bakteriální, rostlinné a živočišné jedy, změny pH, a pod.) nebo biologické (bakterie, viry, viroidy, priony, viz níže např. v-onkogeny). Mechanizmy působení těchto škodlivin v buňce jsou pestré a komplexní. Výsledkem je ale ve většině případů poškození jedné nebo vícero skupin makromolekul, Fyzikální vlivy (viz shora) a jednoduché chemické škodliviny (anorganické kyseliny a zásady, těžké kovy a pod), působí denaturaci mnoha molekul, především bílkovin. Někeré chemické jedy však vyřadí z funkce pouze jednu bílkovinu, např. enzym nebo strukturální protein tím, že blokují jejich klíčové funkční skupiny (např. aktivní centrum enzymu, vazné místo receptoru, membránového přenašeče, nebo místo nezbytné pro polymeraci strukturálních bílkovin cytoskeletu a buněčného dělení). Poškození může být zasáhnout pouze jednu skupinu organel. V případě, že poškození je rozsáhlé a neopravitelné buňka hyne cestou nekrózy nebo apoptózy (viz kap. 4.4). 97
Poškození DNA, které nebylo opraveno a nevedlo k eliminaci buňky apoptózou (viz kap. 4.4) může být příčinou vzniku nádoru. Cílené poškození DNA nebo bílkovin cytoskeletu se využívá k léčebnému usmrcování nádorových buněk tzv. cytostatiky.
Narušení metabolických procesů, především přeměny energie, vede v buňce a tělních tekutinách k hromadění kyselých metabolických zplodin, které narušují acidobazickou rovnováhu a tím funkci enzymů a výpadku jimi katalyzovaných reakcí. Častým a stále více aktuálním je poškozením molekul lipidů, bílkovin i DNA hyperoxidací. Příčinou jsou endogenně vznikající tzv. volné kyslíkové radikály (ROS, Radical Oxygen Species, především superoxid O2.- a hydroxylový radikál OH*. Oxidativně vysoce aktivní radikály se mohou tvořit i z dalších fyziologicky se vyskytujících molekul, např. oxidu dusnatého, sloužícího k intracelulární signalizaci (viz kap.3.4), nebo membránových fosfolipidů, ze kterých mohou vznikat lipoperoxidy, a to jako meziprodukt primárního oxidačního poškození fosfolipidů. Zdrojem mohou být i některé cizorodé potravinové doplňky či enviromentální chemické species. ROSy jsou molekulární species kyslíku s neúplným počtem elektronů v zevním orbitu atomu. K doplnění si „vytrhávají“ elektrony z okolních molekul, které tím ztrácí svou původní funkci. Poškození membránových bílkovin a lipidů vede k poruše jejich funkcí strukturálních, enzymatických, receptorových, transportních, adhezních aj.. Ztráta semipermeability vede k osmoticky podmíněné nadměrné hydrataci (edému, otoku) až ruptuře buňky. Oxidační poškození lipidů se v buňce lavinovitě šíří autogenně se tvořícími lipoperoxidy, které představují oxidační meziprodukty. Oxidační poškození DNA vede k mutacím nebo smrti buňky. Více ve výběrovém kurzu Obecná patobiologie buněk a tkání. ROSy vznikají v omezeném množství již fyziologicky, hlavně při transportu elektronů v mitochondriích nebo při samovolném rozpadu peroxidu vodíku, tvořeného v peroxizomech. Jsou však rychle inaktivovány (viz níže). V malých množstvích mají v některých případech fyziologickou signalizační funkci. Řízeným zvýšením tvorby reaktivních oxidačních radikálů (tzv. oxidační vzplanutím) zneškodňují i leukocyty fagocytované bakterie (viz fyziologie živočichů)
Tvorba ROS se však nadprahově zvyšuje po působení některých zevních škodlivin, především těch, které primárně naruší funkci mitochondrií, ve kterých se pak generují ROSy ve zvýšené (viz shora). Příčinou je např. nedostatek kyslíku (hypoxie), hyperthermie, působení některých jedů nebo ionizující záření. Tvorbu ROS mohou spustit též např. volné, tj. nevázané na proteinový nosič, ionty Fe++ a Fe++++ (Fentonova reakce, viz kurz Patobiologie). Z endogenních škodlivin je dnes v popředí hromadění homocysteinu (H), molekuly vznikající při metabolické přeměně aminokyseliny methioninu. H. je považován za jeden z rizikových faktorů vzniku kardiovaskulárních chorob. Preventivně působí dostatečný přívod vitaminu kyseliny listové, která je koenzymem enzymu přeměňujícího metylací H. zpět na metionin. Funkci buněk může poškodit též hromadění některých látek (lipidů, bílkovin), jejichž metabolická přeměna vázne. Výsledkem je útlak organel a degenerace až zánik buňky. Tyto stavy jsou časté při defektech lysozomálních enzymů nebo abnormitách nově syntetizovaných bílkovin. Vedou k buněčnému a orgánovému poškození např. jater, srdce, svalů, mozku aj. Střádání cholesterolu se podílí na vzniku aterosklerózy cév. Poškození může způsobit i porucha metabolismu jednoduchých organických molekul, např. aminokyseliny fenylalaninu nebo kyseliny glutamové v mozku. Více ve výběrovém kurzu Patobiologie živočišných buněk a tkání
98
4.2 Obranné a reparační mechanismy poškozených buněk Organizmus i jednotlivé buňky se mohou mnoha způsoby.
bránit
škodlivým vlivům a jejich následkům
Celotělově se na odstraňování chemických škodlivých látek podílejí orgány se hydrofobní látky přeměňují na hydrofilní a tím i lépe vylučitelnými z těla (viz níže např. konjugace s kyselinou glukuronovou. Na vylučování škodlivých látek z organizmu se takto podílí především játra a ledviny, ale i řada dalších orgánů (kůže, střevo, dýchací trakt a pod). Viz předmět fyziologie živočichů Na úrovni buněčné, chemické škodliviny mohou detoxifikovány oxidací nebo redukcí, především v hl-ER (cytochromem P450, viz kurz Obecné patobiologie) a peroxizomech (viz kap. 4) nebo oxidací látkami v cytozolu obsahujícími SH-skupiny rozpuštěných, tripeptidem glutathionem. Škodlivé látky mohou být též vyloučeny z buňky pomocí speciálních transportních mechanismů operujících na plazmatické membráně. Zvýšení aktivity těchto membránových „exportérů“ je nežádoucí jev při léčbě některých onemocnění, především nádorů cytostatiky.
Ke komplexnějším a obecným obranným reakcím aktivovaným řadou různých škodlivin patří zástava buněčného dělení (viz strážce genomu p53, kap. 3.5) aktivace enzymů zajišťujících reparační syntézu DNA (viz níže) a syntéza tzv. bílkovin tepelného šoku (heat shock proteins, viz níže). Poslední obrannou reakcí organizmu je eliminace neopravitelně poškozené buňky aktivací molekul genů spouštějících a realizujících apoptózu (viz shora a níže kap. 4.4). Tvorbu shora popsaných ROS(ů) a dalších reaktivních oxidačních radikálů omezují v buňce některé enzymy, např. kataláza v peroxizomech tím, že štěpí peroxid vodíku na vodu a neškodný molekulární kyslík. Enzym superoxidismutáza v mitochondriích a cytozolu nebo glutathionperoxidáza rozkládají peroxid vodíku na vodu a oxidovaný glutation, apod.. Shora uvedené enzymatické reakce totiž předcházejí spontánnímu, tzv. ne-enzymatickém rozpadu peroxidu vodíku, který je katalyzován Fe++ (Fentonova reakce) a při kterém vznikají nebezpečné ROS(y). Více v kurzu Obecná patobiologie živočišných buněk a tkání.
K zneškodnění již vytvořených reaktivních radikálů slouží v buňce molekuly, které je mohou neutralizovat ("zhášet" či „zametat“) pohotovou nabídkou svých elektronů, aniž by se samy staly pro buňku škodlivými. Mezi tyto "zhášeče" patří např. některé vitaminy C a E, dále flavonoidy obsažené ve slupkách barevného ovoce a zelenině, jakož i látky obsahující SH skupiny (metionin, cystein a tripeptid glutation). Bohatým zdrojem SH skupin je mléko a mléčné výrobky. Řada enzymatických detoxifikačních procesů je po zátěži buňky škodlivinou vystupňována zvýšením transkripce genů kódujících příslušné enzymy. Jejich zvýšené aktivity nacházíme v krvi a tkáních, např. chronických alkoholiků nebo uživatelů drog, ale i jako vedlejší nežádoucí účinek některých léků. Mezi důležité a fylogeneticky velmi staré reparační mechanismy poškozených bílkovin patří jejich rekonfigurace (renaturace) pomocí speciálních bílkovin, chaperonů (původně proteiny tepelného šoku, heat shock proteins, Hsp), objevených poprvé v bakteriích exponovaných tepelnému šoku. Hsp proteiny (syn. šokové bílkoviny, chaperony, chaperoniny, heat shock cognates – hsc, hs-příbuzné bílkoviny) tvoří několik skupin, které se liší molekulovou vahou (Hsp 10-110kDa) i některými dalšími vlastnostmi. Zvýšení jejich exprese je společnou odpovědí buněk na subletální poškození různými faktory,
99
např. zvýšení teploty, změnu pH a osmolarity, hypoxii, ionizující záření, cytostatika apod. Hsp typu chaperonů se uplatňují v protekci proteinů před denaturací a při renaturaci poškozených bílkovin. Některé chaperony se účastní na konformaci bílkovin i za fyziologických podmínek (např. Hsp 60 a 70 při importu bílkovin z cytozolu do mitochondriální matrix, nebo nově syntetizovaných peptidů do cisteren hr-ER, kdy molekula musí dočasně lineárně roztažena („roztavení“ prostorové organizace)a po průchodu membránou opět vrácena do svého původního prostorového uspořádání. Hsp 90 při receptorové signalizaci nadledvinkových hormonů. Více viz předmět Molekulární biologie
Poškození molekuly DNA, způsobená např. zářením nebo chemickými látkami, mohou opravit speciální enzymy cestou tzv. DNA repair syntézy. Endonukleázy a DNA glykozylázy mohou tak např. nahradit jednotlivé poškozené nebo informačně pozměněné báze (base excission repair). Větší nukleotidové segmenty (nucleotide excission repair), poškozené např. UV světlem, mohou být nahrazeny pomocí DNA helikázy, DNA polymerázy a DNA ligázy. Aktivace těchto enzymů je rovněž součástí shora zmíněné SOS reakce bakterií vystavených tepelnému šoku. V případě, že oprava DNA nezdaří, organizmus jí eliminuje spolu s celou buňkou formou apoptózy (viz 4.4). Tím se i zabrání propagaci mutace do dceřiných buněk, které by mohly stát např. zdrojem nádoru. V případě, že se oprava poškozené bílkoviny nezdaří, její molekula může být cíleně rozložena v proteazomech. Proteazomy jsou molekulární mikrobarely (15 nm dlouhé) tvořené cca 28 bílkovinnými podjednotkami uspořádanými do několika věncovitě uspořádaných molekul bílkovin, které mají peptidázovou aktivitu. Na každém konci takto vytvořeného soudku- jádra proteazomu (proteasome core), je zátkovitý bílkovinný komplex mající ATPázovou aktivitu. Tato zátka má schopnost rozpoznat poškozenou bílkovinu a dopravit ji dovnitř shora popsaného barelu, kde dojde k jejímu rozložení. Rozpoznání poškozené bílkoviny umožňuje její předchozí „označení“ krátkým peptidem ubiquitinem. Ubiquitin (U) je fylogeneticky vysoce konzervativní protein skládající se pouze ze 76 aminokyselin. Mezi kvasinkou a člověkem se U liší pouze ve 3 aminokyselinách. U patří do skupiny stressových proteinů. K proteolytickému rozkladu označuje i nepoškozené bílkoviny, např. ty které buňka potřebuje pouze dočasně, např. cykliny, řídící buněčný cyklus (viz kap. 5.6). Jeho vazba na příslušné proteiny se řídí určitými pravidly a vyžaduje součinnost dalších 3 bílkovin (E1-3) a ATP. Proteiny určené k rozkladu jsou zpravidla označeny ne pouze jednou, ale polymerem vícero molekul ubiquitinu. Označení pouze jednou molekulou ubiquitinu může mít jiný, zpravidla fyziologický regulační význam (změny transkripce genů cestou přechodné ubiquitinizace histonů, regulace transportu látek endozomálně-lysozomálním systémem a pod). Více v Molekulové biologii).
Rozklad peptidu v proteazomech bývá často neúplný úplný a peptidické zlomky (8-9 aminokyselin) jsou využívány např. k tzv. prezentaci antigenu v imunitním systému. Jde např. o fragmenty bílkovin bakterií, virů nebo nádorově transformovaných buněk presentovaných makrofágy lymfocytům. Více ve fyziologii, mikrobiologii a molekulární biologii
Větší struktury, např. vlastní poškozené organely, jsou v buňce rozkládány lysozomálními enzymy v autofagozomech. Nevratně poškozené buňky hynou a organizmus se jich zbavuje fagocytózou (viz kap. 4.1) Reparace biomembrán je možná cestou náhrady poškozených segmentů, tj. insercí nově vytvořených membrán v Hl-ER, přenášených transportními váčky. Větší poškození PM však vede často dříve k uhynu buňky v důsledku ztráty její semipermeability (viz kap. 4.4).
4.3 REGENERACE BUNĚK, TKÁNÍ A ORGÁNŮ. KMENOVÉ BUŇKY 4. 3. 1 Definice regenerace a její význam
Leccos se zahojí, ale nová vám ruka nenaroste (zatím)
Regenerace je proces, který vede k náhradě opotřebených či poškozených buněk, tkání nebo orgánů. Proces obnovy trvale probíhá ve většině epiteliálních tkání (přirozená, fyziologická regenerace). Vychází zpravidla z tzv. zárodečné (germinální) oblasti tkáně či 100
orgánu, která např. v plošných epitelech je v blízkosti bazální laminy (BL), která řídí prostorovou orientaci (uspořádání) nově vznikajících dceřiných buněk. BL brání např. prorůstání epitelových buněk do hlubších vrstev orgánů). Porucha této pozičně-informační funkce bazální laminy je jednou z příčin tvorby tzv. metastáz u nádorových onemocnění.
4. 3. 2 Výskyt a formy regeneračních procesů. Intensivní a celoživotně probíhá obnova buněk např. v populaci krevních elementů v kostní dřeni, v zárodečném epitelu samčích gonád, ve střevních kryptách, epidermis, apod. Regenerační schopnost je obecně vysoká u většiny bezobratlých. U suchozemských živočichů, např. plazů, ptáků, savců, probíhá většinou jen tzv. zhojení (zacelení) rány. Náhrada částí těla je možná však u ryb a ocasatých obojživelníků. Hypertrofie a hyperplázie. Zvýšená proliferace buněk může být též odpovědí na zvýšené funkční požadavky tkáně či orgánu. Výslednou změnu označujeme jako kompenzační hyperplazie. Pokud je proces doprovázen i zvětšováním buněk, označujeme jej jako kompenzační hypertrofii. Tyto procesy mohou kompenzovat např. ztrátu jednoho z párových orgánů (např. ledviny). Hypertrofie a hyperplázie hladké svaloviny ve stěně cév při vysokém krevním tlaku. vede k tvorbě lokálních ztluštění, do kterých se ukládá cholesterol. Následné zhoršení průtoku krve vede k hypoxii buněk v cílové oblasti (infarkt myokardu, mozkové mrtvice apod.).
V posledních letech bylo získání mnoho poznatků o tom, že proces regenerace vychází z velmi nezralých, tj. nediferencovaných, buněk, které lze označit jako kmenové buňky v širším slova smyslu. Podle toho, jak široké spektrum diferencovaných dceřiných buněk se může z nich vytvořit, označují se jako pluripotentní, totipotentní, z nichž se mohou diferencovat všechny typy buněk. Z tzv. determinovaných prekurzorových buněk se mohou diferencovat již pouze některé typy buněk. Jednou z důležitých vlastností kmenových buněk je schopnost tzv. asymetrického dělení (jedna dceřiná buňka si ponechává vlastnosti mateřské kmenové buňky a druhá se začíná již diferencovat-determinovat). Kmenová buňka si zachovává vysokou aktivitu enzymu telomerázy, která se účastní replikace koncových částí chromozomů (viz též kap. 3.5). Nejlepším příkladem omnipotentní buňky je zralé vajíčko. Tuto vlastnost si zachovají též blastomery rýhujících se vajíček. Velký počet buněčných typů se může diferencovat i z tzv. hematopoetických buněk kostní dřeně. Více ve speciálních předmětech. Kmenové buňky jsou dnes předmětem intenzivního výzkumu. Mohou být pěstovány i v podmínkách mimo organizmus v tzv. buněčných kulturách. Využívají se např. pro urychlení rozsáhlých popálenin kůže a pří léčbě leukémií (tzv. transplantace kostní dřeně). Předmětem výzkumu je možnost náhrady svalových buněk srdce poškozených infarktem, míšních buněk poškozených úrazy, mozkových buněk poškozených degenerativními procesy apod. Orgány na míru? Stále ale v nedohlednu
4. 4 BUNĚČNÁ SMRT, JEJÍ FORMY, MECHANIZMY A VÝZNAM
(obr. 45,46
Úhyn buněk v živočišném organizmu je fyziologicky nezbytný pro udržování rovnováhy počtu buněk v obnovujících se tkáních (epitely, krev, pojivové tkáně), odstraňování neopravitelně poškozených chemickými, fyzikálním nebo biologickými škodlivinami (viz níže). Odstraněny musí být z organizmu i nadbytečné buňky vytvořené v časných fázích ontogeneze (viz níže morfogenetická úloha buněčné smrti). Úhyn buňky může proběhnout buď procesem zvaným nekróza nebo apoptóza. Oba procesy jsou dnes podrobně R. I. P.
101
rozpracovány. Zde bude podán je velmi zkrácený přehled základních znaků a mechanizmů těchto dějů. 4. 4. 1 Nekróza Nekróza je forma rychlého a neorganizovaného úhynu buňky. Dochází k němu po větším a náhlém poškození buněčných organel a molekul, především plazmatické membrány. Výsledkem je zástava oxidativní fosforylace, následná ztráta semipermeability plazmatické membrány, neorganizovaný rozklad bílkovin, nukleových kyselin a dalších molekul lysozomálními hydrolytickými enzymy. Kromě ztráty funkce těchto makromolekul, jejich štěpy zvyšují osmotický tlak v buňce, v důsledku čehož dochází k její velké hydrataci, edému, následované rupturou plazmatické membrány. Autokatalyticky rozložený obsah buňky se vylévá do okolí buňky, kde vyvolává dráždivou zánětlivou reakci. 4. 4. 2 Apoptóza (programovaná smrt). V případě poškození, které není tak masivní aby vyvolalo nekrózu buňky, na př. při menším avšak neopravitelném poškození jaderné nebo mitochondriální DNA- (způsobené např. malými dávkami ionizujícího záření, mitotických jedů vč. léků používaných k léčbě nádorů, tzv. cytostatik, nebo volnými kyslíkovými radikály, které se tvoří ve velkém množství např. při nedostatku kyslíku při orgánových infarktech apod.), -je rozvoj patologických změn i proces buněčné smrti pomalejší a organizovanější. Proces se označuje jako apoptóza (apo řecky: padati dolů-opadávání, koncovka …óza označuje proces analogický, i když opačného významu, než mitóza). Synonymem širšího významu je programovaná smrt (Programmed Cell Death, PCD). Příčinou může být též stimulace specifických, tzv. Cell Death Receptorů na povrchu buněk (viz níže zevní cesta apoptózy) nebo chybění fyziologických stimulů pro přežití buňky (viz níže tzv. pasivní apoptóza). Tyto mechanizmy se významně uplatňují i za fyziologických podmínek, především v průběhu časného vývoje organizmu při vytváření orgánových základů a v některých orgánech i v dospělosti (viz níže) Aktivace a průběh apoptózy. Klíčovými molekulárními vykonavateli apoptózy jsou endopeptidázy zv. Caspázy (Cystein ASPartÁZY-, vyslov kaspázy, s pořadovým číslem 1 až 9, u člověka 1 až 15). Jde o fylogeneticky vysoce konzervativní proteiny, přítomné již u kvasinek a jednoduchých bezobratlých, viz např. níže gen ced-3 u hlístice Coenorhabditis elegans. Aktivace kaspáz spočívá v proteolytické aktivaci jejich neaktivních, tzv. zymogeních forem– prokaspáz. Proces probíhá postupně, kaskádovitě. Prvním článkem kaskády je zpravidla aktivace kaspázy-9 (viz níže tzv. vnitřní cesta) nebo kaspázy-8 (viz níže tzv. zevní cesta). Konečným exekučním článkem kaskády je kaspáza-3, která nevratně štěpí makromolekuly nezbytné pro život buňky, např. molekuly opravující poškozenou DNA (enzymy opravné syntézu DNA - Poly (ADP-ribose) polymerázu, zkratka PARP, laminy jaderné blány, molekuly cytoplazmatického cytoskeletu, a další). Štěpí rovněž chromatin na jednotlivé nukleozomy nebo jejich násobky. Důsledkem toho se DNA elektro-foreticky rozděluje do vícero dobře ohraničených proužků, čímž se vytváří v elektroforetogramu tzv. řebříček (DNA ladder), jehož příčky odpovídají molekulární hmotnosti jednotlivých nukleozomů a jejich násobků, což je jednou ze známek apoptózy.
102
Kaspáza-3 je podobná bílkovině kódované tzv. genem smrti hlístice Coenorhabditis elegans (cell death gene, ced-3, viz níže) jejíž studium významně přispělo o objasnění molekulárních mechanizmů apoptózy.. Morfologické a molekulární znaky apoptózy. a. Kondenzace cytoplazmy a jádra, při zachování základních funkcí plazmatické membrány a membránových organel v cytoplasmě, především. mitochondrií, jakožto zdroje ATP nezbytného pro funkci kaspáz. b. Akumulace kondenzovaného chromatinu u jaderné blány, která ztrácí pravidelnou kontůru a jádro vytváří vícečetné laloky, lobuly. c. Chromatin je štěpen do nukleozomálních segmentů (viz shora tzv. řebříček DNA rozdělené elektroforézou). d. Terminální rozpad buňky do malých fragmentů, tzv. apoptotických tělísek, která obsahují nukleozomální fragmenty chromatinu obalené zbytky cytoplasmy a plazmatickou membránou. Apoptotická tělíska jsou fagocytována okolními makrofágy. Fagocytózu usnadňuje přesmyk fosfatidylserinu (FS) z vnitřního do zevním listu fosfolipidové dvojvrstvy PM. To lze prokázat vazbou fluorescentně označené bílkoviny zv. Annexin V, která se váže na FS, který je za fyziologických okolností Annexinu nedostupný, neboť FS je na vnitřní straně PM.
Apoptóza, na rozdíl od nekrózy, je tedy řízený aktivní proces, který vyžaduje energii (ATP), expresi specifických genů a aktivací kaskády enzymů, kaspáz (viz shora). Apoptóza, na rozdíl od nekrózy, nevede k poškození tkáňového okolí uvolněním lysozomálních enzymů, což nastává vždy v procesu nekrózy. Proto je apoptóza označována též jako organizovaná či altruistická smrt buňky. Synonymem je rovněž programovaná smrt, neboť vyžaduje aktivaci předem naprogramovaných, geneticky kódovaných,signalizačních a exekutivních procesů Někdy je pro programovanou smrt používán i ne zcela vhodný termín buněčná sebevražda. Součástí apoptózy je i aktivace enzymu transglutaminázy, která způsobí „zesíťování“ bílkovin a tím svrašťování buňky a jejich funkčnímu vyřazení
jejich “kondenzaci” vedoucí k
Proces apoptózy může být spuštěn tzv. vnitřní nebo vnější signální cestou. (i) Vnitřní signální cesta Tato cesta je aktivována nejčastěji poškozením jaderné DNA, hladkého endoplazmatického retikula nebo mitochondrií. Kritickým společným krokem je vyplavení cytochromu c z mitochondrií do cytozolu (viz níže). Při poškození DNA se fosforylací současně aktivuje protein kódovaný genem p53 (viz shora "strážce genomu", kap. 5.6), který tím získává schopnost vazby na DNA jako transkripční faktor a zastavuje buněčný cyklus. Pokud není poškození DNA opraveno, spustí se proces apoptózy aktivací kaspázové kaskády. Vyplavení cytochromu c z mitochondrií se děje přes tzv. mega mitochondriální kanály (permeability-transition pores), které procházejí zevní i vnitřní mitochondriální membránou v místech, kde se obě membrány k sobě těsně přikládají. Cytochrom c vytvoří komplex s cytosolickým proteinem Apaf-1 a ATP, tzv. apoptozóm, který je aktivátorem kaspázy-9, která aktivuje kaskádu, na jejímž konci je exekuční kaspáza-3 (viz též shora). Z poškozených mitochondrií se může uvolnit též molekula AIP (Apoptosis v intermembránovém prostoru), který po transportu do jádra spustí štěpení chromatinu.
Induction
Protein
lokalizovaný
fyziologicky
Mitochondrie mohou být poškozeny primárně např. kyslíkovými radikály, tvořícími se v nadměrném množství např. při hypoxii, radiací, nebo vysokou koncentrací Ca++ uvolněných nadměrně z hladkého endoplazmatického retikula, nebo vstupem Ca++ u okolí buňky
103
např. po nadměrném otevření Ca++ iontových kanálů v plazmatické membráně (v mozku po hyperstimulaci glutamátových receptorů, více ve Fyziologii).
Do doby aktivace kaspáz je proces vratný. Uvolnění cytochromu c brání produkty některých anti-apoptotických genů, např genu bcl-2 (viz shora). Opačně působí produkty genů bax a bak. Viz též níže anti- a proapoptotické působení virů. Rozvoji apoptózy zabraňují též látky blokující nadměrný influx Ca++ do poškozené buňky (viz též níže) a dále ionty zinku. Do skupiny látek inhibujících apoptózu patří též tzv." promotory" nádorové transformace buněk (aktivátory protein kinázy C) tím, že podporují přežívání a další nekontrolované množení mutovaných buněk. Dále, apoptózu blokuje baculovirům strukturálně blízká, a fyziologicky se vyskytující bílkovina, zv. survivin Survivin inhibuje apoptózu potlačením Fas receptorů na povrchu buňky (viz níže). Její nadměrný obsah v nádorových buňkách však působí nežádoucně, neboť brání apoptóze vyvolávané buňkami imunitního systému v rámci sebeobrany organizmu (viz též shora kap…. c- a v-onkogeny a níže zevní aktivační cesta apoptózy přes TNF/Fas receptory, viz níže).
Potlačení apoptózy v některých orgánech je jednou z příčin nezhoubného zvětšení, hypertrofie, některých orgánů ve stáří, např. prostaty u mužů, některých forem rakoviny prsu apod. Vnitřní cestu apoptózy mohou spustit i hydrolytické enzymy uvolněné částečnou permeabilizací lysozomů (nikoliv masivní aktivací těchto organel) v důsledku nahromadění některých lipidů, tenzidů, nebo vlivem reaktivních forem kyslíku. Uvolněné enzymy (katepsiny B,K,L,S) aktivují v cytozolu tzv. Bid protein, který permeabilizuje zevní membránu mitochondrií. To vede k uvolnění cytochromu c a aktivaci kaspáz (viz shora).
(ii) Vnější apoptotická signální dráha Tato dráha je spouštěna nejčastěji aktivací tzv. receptorů smrti na povrchu plazmatické membrány. Tyto receptory patří do skupiny tzv. Tumor Necrosis Factor-alpha, která zahrnuje rovněž tzv. Fas receptory (proto Fas/TNF receptory). Látky aktivující tyto receptory se označují jako Fas ligandy (FasL, viz též níže TNF-alfa, TRAIL molekuly, inferferony a další). Výsledkem je spuštění kazpázové kaskády, s klíčovou startovací úlohou kaspázy-8, která aktivuje exekuční kaspázu-3. Zkratka Fas pochází zřejmě z angl. apoptosis stimulated Fragment. TRAIL = Tumour Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand neboť v nádorech byl tento ligand poprvé objeven. Celé názvy se ale nepoužívají.
K vyvolání apoptózy vnější cestou může dojít z četných fyziologických a patologických příčin. Tento mechanizmus je fyziologicky součástí morfogenetického utváření řady orgánů a vyzrávání buněčných populací, především imunitních buněk, v časném vývoji organizmu. Je součástí tíž specifické imunologické obrany organizmu v dospělosti (viz následující odstavec). Fyziologické morfogenetické funkce apoptózy-příklady Segmentální apoptotický zánik buněk v základech končetin embrya vede např. k oddělení základů jednotlivých prstů ruky a nohy. Apoptóza vede fyziologicky k odpadnutí ocasu u pulců při metamorfóze. Spouštěčem je hormon tyroxin, objevený českým fyziologem W. Laufbergerem začátkem 20. století. Fyziologicky zevní apoptotickou cestou hynou nadpočetné motoneurony v míše zárodků některých obratlovců. Hynou neurony, které „včas“nenavázaly kontakt se svalovými vlákny v periferii. Příčinou je chybění signálů pro přežití („pasivní“ apoptóza). 104
Význam apoptózy ve vývoji specifické imunity. Vnější cestou apoptózy jsou též fyziologicky eliminovány v embryonálním thymu tzv. zakázané klony T-lymfocytů, které by mohly reagovat s bílkovinami vlastního organizmu a tím vyvolat poškození buněk a orgánů (více ve Fyziologii). Eliminaci spouští interakce mezi tzv. školícími epiteliálním buňkami stromatu thymu a povrchovými receptory embryonálních lymfocytů.
Apoptóza vs. některé patologické stavy Chybění signálů „pro přežití“, v dospělosti vede k úhynu neuronů v mozku a vzniku stařecké demence a degenerativních chorob mozku vč. Alzheimerovy nemoci. Chybějícím signálem je nedostatek peptidu zv. Nerve Growth Factor. Vnější signalizační apoptotická cesta se významně uplatňuje při eliminaci buněk obsahujících cizorodé bílkoviny, ať již virové, parazitární nebo vlastní nádorově transformované bílkoviny buňkami imunitního systému. Mezi významné aktivátory apoptózy patří TNF-alfa, peptid ze skupiny tzv. cytokinů produkovaných makrofágy. Jejich aktivaci působí lymfocyty stimulované cizorodými molekulami- antigeny, vč. molekul nádorově transformovaných buněk. Jde o přirozený obranný mechanizmus organizmu. Zevní apoptotickou dráhu spouští vazbou na receptory buněčné smrti v plazmatické membráně rovněž intenzivně studované molekuly TRAIL , viz též shora. Vyvoláním apoptózy zevní cestou usmrcují rovněž některé lymfocyty buňky infikované viry. Po přilnutí na infikovanou buňku vypustí bílkovinu granzym B, který je endocytován infikovanou buňkou, ve které aktivuje kaspázy 7 a 3 a uvolní cytochrom C z mitochondrií, více ve Fyziologii živočichů). Buňky infikované viry, nebo obsahující cizorodé bílkoviny jiného původu, usmrcuje apoptoticky též interferon-gama produkovaný imunitními buňkami. Apoptózu buněk významně ovlivňují viry. Jejich antiapoptoticky působící bílkoviny prodlužují život hostitelské, virem napadené buňky a tím prodlužují fázi svého intracelulárního množení (např. tzv. CmrA protein kravských neštovic a další. Vyšší aktivita antiapoptotického NS faktor reguluje mj. též nebezpečnost chřipkových virů). Některé viry jsou schopny apoptózu i stimulovat, což jim usnadňuje šíření do okolních zdravých buněk. V neposlední řádě, apoptotické kaspázy hostitelské buňky mohou samy působit protivirově tím, že štěpí bílkoviny důležité pro replikační cyklus virů.
Jiné formy apoptózy Vzácněji se vyskytuje apoptóza nezávislá na kaspázách. Výkonnou molekulou je flavoprotein, tzv. apoptózu vyvolávající faktor a endonukleáza G. Zvláštní formou programované buněčné smrti (tzv.PCD II, zkratka Programmed Cell Death) je cestou autofagocytózy, tj. rozkladem poškozených organel vlastním lysozomálně-fagocytárním systémem. Klasická shora popsaná apoptóza je označovaná jako PCD I. Existují i další méně časté formy PCD.
Geny života a smrti. Mnoho obecně platných poznatků o apoptóze byla získána na modelu mikroskopické hlístice Caenorhabditis elegans. Její časný zárodek je tvořen na začátku 1090 buňkami, z nichž 131 hyne procesem apoptózy. Studium mutantů, u kterých byla tato redukce počtu buněk nadměrná nebo naopak chyběla, bylo zjištěno, že proces apoptózy je spouštěn bílkovinou molekulou kódovanou tzv. genem ced-3, tzv. genem buněčné smrti (cell death gene, ced-3), kódujícím bílkovinu s proteázovou aktivitou, která spouští shora zmíněnou kaskádu kaspáz štěpících životně důležité makromolekuly buňky (viz shora). Na tomto modelu byly rovněž zjištěny geny, jejichž produkty působí antiapoptoticky- především gen ced 9 tzv. gen nesmrtelnosti. Jeho savčím ekvivalentem je gen bcl-2, viz shora (geny ced-1,2,5,6,7,10 mají pravděpodobně funkce fagocytární, uklízecí, viz shora). What is C. elegans? C. elegans is a nematode - a member of the phylum Nematoda ……. a phylum of smooth-skinned, unsegmented worms with a 1 mm long cylindrical body shape tapered at the ends. ……t survives by feeding on microbes such as bacteria. It is of no economic importance to man. Why study C. elegans? Between October, 1994 and January, 1995 73 scientific articles about this creature appeared in international science journals. Why invest so much effort into the study of such an insignificant organism? The worm is conceived as a single cell which undergoes a complex process of development, starting with embryonic cleavage, proceeding through morphogenesis and growth to the adult. It has a nervous system with a 'brain' (the circumpharyngeal nerve ring). It exhibits behavior and is even capable of rudimentary learning. It produces sperm and eggs, mates and reproduces. After reproduction it gradually ages, loses vigor and finally dies. Embryogenesis, morphogenesis, development, nerve function, behavior and aging, and how they are determined by genes: the list includes most of the fundamental mysteries of modern biology. C. elegans …. is only 1 mm long and … is usually grown on petri plates seeded with bacteria. All 959 somatic cells of its transparent body are visible with a microscope, and its average life span is a mere 2-3 weeks. Thus C. elegans provides the researcher with the ideal compromise between complexity and tractability. C. elegans project was initiated by the South African biologist Sydney Brenner…..C. elegans is a free-living nematode. There are two sexes: a self-fertilizing hermaphrodite and a male. The adult essentially comprises a tube, the exterior cuticle, containing two smaller
105
tubes, the pharynx and gut, and the reproductive system. Most of the volume of the animal is taken up by the reproductive system. Of the 959 somatic cells of the hermaphrodite some 300 are neurons. Neural structures include a battery of sense organs in the head which mediate responses to taste, smell, temperature and touch - and although C. elegans has no eyes, it might respond slightly to light. Among other neural structures is an anterior nerve ring with a ventral nerve cord running back down the body. (There is also a smaller dorsal nerve cord.) There are 81 muscle cells. C. elegans moves by means of four longitudinal bands of muscle paired sub-dorsally and sub-ventrally. Alternative flexing and relaxation generates dorsal-ventral waves along the body, propelling the animal along. The development and function of this diploid organism is encoded by an estimated 17,800 distinct genes. http://www.cbs.umn.edu/CGC/WhatisCe/wormintro.htm (kráceno VM).
Příčiny apoptózy. Spektrum škodlivin vyvolávajících apoptózu je obrovské a neustále se rozrůstá. Kromě již shora zmíněných fyzikálních a chemických vlivů poškozujících DNA a biomembrány, především mitochondrie, apoptózu může vyvolat hypertermie, ionizující a UV záření, virové infekce, autoimunitní reakce, ischémie, malnutrice, glukokortikoidy, ethanol, hyperstimulace glutamátových receptorů v mozku, volné kyslíkové radikály, cytostatika a další. Při některých onemocněních, např. infarktu myokardu nebo mozkové mrtvici, se vyskytuje jak nekrotická tal apoptotická smrt buněk. Ve středu ložiska s maximálních hypoxií převládá nekróza, v širším okolí apoptóza
Requiescant in Pacem Addendum
Rest in peace Ať odpočívaji v pokoji
Molekulárně Biologická Pohádka (pro 16+) E-mail:
[email protected] +
++
Náměty: O hluchém receptoru, O neposedných fosfolipidech , O ucpaném kanálku (Cl-, K , Ca ), O cyklinovém budíku, O strašidlech na buněčném hřbitově, o popravčí kaspazové četě, atd. Pošlete na
[email protected] Jednoho krásného dne šla malá DNA jako obvykle do školy. Ráno vstala, učesala si histony, starý taťka templát ji pomohl s taškou a říkal jí: " Ne abys chodila do cytoplazmatického lesa, tam nesmíš ". Ten den se malá DNA ve škole učila polymerovat levé ruce, ty pravé už uměla odmala. Levá ruka to byl problém, musela ji skládat z kousků jako puzzle a ne vždy se jí to povedlo. O přestávce zhltly něco nukleotidů, které jim naservíroval starý školník Klenow. Jen co skončila škola začaly malé DNA pronásledovat přidrzlé RNA, které je od rána zlobily štípáním mezi histony. V zápalu hry se dostala malá DNA až na pokraj cytoplazmatického lesa, když tu před sebou uviděla jednu obzvlášť protivnou RNA rozběhla se za ní a nakopla jí přímo do ramene. S pocitem uspokojeni se DNA rozhlédla kolem a s úžasem zjistila, že to tady vůbec nezná. Nechápala zákazy rodičů, proč se sem nesměla podívat, když je tu tak pěkně. K večeru dostala hlad a řekla si, že se sem určitě zítra zase přijde podívat. Začala tedy hledat cestu zpět, ale nebyly tady číslované pravoúhlé ulice jako doma, kde se nikdy neztratila. Když konečně došla na kraj cytoplazmatického lesa narazila na vysokou zeď, šla tedy podél zdi až našla bránu, která byla zavřená. Zabušila na ni a čekala. V okně se objevil strážný Semipermeabil a zeptal se: " Kdo je tam? " " Tady malá DNA, co se ztratila v lese " odpověděla DNA. " Kecáš a vypadni nebo na tebe pošlu kousavou nukleázu! " Úplně se setmělo a DNA začala mít strach, zalezla tedy do jeskyně. U vchodu byl poustevník Golgi, slušně se ho zeptala, jestli může dovnitř přespat. Řekl jí, že proti tomu nic nemá, ale že tady straší sladké strašidlo a každého, kdo se mu namane, toho strašlivě upatlá. Unavená malá DNA si nastlala něco lipidů a rychle usnula. Ráno poděkovala poustevníkovi a vydala se opět k bráně. Vládl tam čilý provoz. Ven utíkaly RNA všech možných druhů, dovnitř se na povozech zase vezly hromady nukleotidů a sem tam nějaký ten obr, který div nezbořil bránu. Ze stínu cytoplazmatického lesa na malou DNA kdosi syčel. Za stromem stála dokulata zamotaná stuha a říkala : " DNA, prosím tě vem mě sebou domů, já ti poradím, jak projdeš přes bránu, stačí, když si mě zapleteš do vlasů - jenom tři nukleotidy vyštípnu a pak zase hned půjdu, nebudu ti nijak vadit, ještě stihneš ráno školu." Malá DNA souhlasila." Musíš si dát pozor na toho zlého a strašného Semipermeabila stačí, když si otočíš rukávy naruby a nalepíš si na mě kus listí co roste tamhle na tom stromu Ribosomu a když se tě bude Semipermeabil ptát tak mu řekni, že jseš Transkripční faktor, co jde navštívit svou starou tetu DNA", poradila jí stuha. Když přešly přes bránu, bylo akorát za 10 minut osm a tak DNA běžela se stuhou rovnou do školy. Stará, přísná a nekompromisní polymeráza měla zrovna dneska zkoušet polymeraci levé ruky. Když na ní došla řada a začala vzpomínat, jak to včera bylo ve škole, zašeptala jí stuha: " Rozvaž mě já ti pomůžu." DNA začala polymerovat levou ruku a staré polymeráze se to velmi líbilo. Dala malé DNA výborně a vyvolala další. DNA řekla stuze: " Tak už prestaň to už stačí!" , ale stuha neposlechla. DNA se lekla, aby si nikdo nevšiml kdo jí pomohl, tak strčila ruku do tašky. Do konce školy chybělo jen pár minut, a tak si to potom se stuhou vyřídí. Konečně zvonek. DNA chtěla dát svůj sešit do batohu, ale už se tam nevešel. Batoh byl plný stuh, rychle ho zavřela a šla ven. U dveří stál starý dobrý školník Klenow. Co kdyby se mu svěřila. Vytáhla levou ruku z batohu, ze kterého vypadla jedna stuha a mazala pryč. Školník Klenow spráskl ruce, zašlápl plazící se stuhu a běžel rychle volat 155. Za chvíli už bylo slyšet sirénu přijízdějící sanitky, která naložila malou plačící DNA i s batohem a rychle se rozjela do nemocnice. Tam již čekaly sestřičky nukleázy a chirurgický tým doktora Restriktora a začali hned operovat. Naštěstí toto je jen pohádka, a proto vše dobře dopadlo a malá DNA se uzdravila. Doma jí taťka templát pohrozil, že jestli ještě jednou půjde do cytoplazmatického lesa, dostane výprask pyrofosfátem. Ve skutečnosti byl moc rád, že je malá DNA zase doma. A jestli je nikdo neosekvenoval, žijí na pokraji cytoplazmatického lesa dodnes. Pohádka o DNA a nukleasách (Martin Hassman, biochemické pohádky) http://www.met.cz/tvorba/pohadky/dna-a-nukleasy/ Za jednou buněčnou stěnou a cytoplasmatickou membránou, v jedné gramnegativní bakterii žila, byla, replikovala se jedna Deoxyribonukleová kyselina. Z žití, bytí a replikování ji nejvíce bavilo replikování. To přišla RNA-polymerasa, holka jedna ureplikovaná. Poklepala lehce na DNA, ta jí nabídla své rámě a začaly replikovat. Všechno se zdálo být v pořádku, až se holky najednou nějak nepohodly, pohádaly, vjely si do vlasů, RNApolymerasa si sebrala fidlátka a odbrownovala si to replikovat někam jinam. DNA bylo smutno. "Co si jen počnu," naříkala rozreplikovaná, "kdo mne doreplikuje?" Sotva na to pomyslela, jak už to v pohádkách bývá, kde se vzala, tu se vzala DNA-polymerasa a postavila se rychle do pozoru, až se jí rozcuchaly alfahelixy. Rychle je učísla svými beta-hřebeny, představila se a dala se do replikování. Vlastně doreplikování. A tak si holky spolu replikovaly, replikovaly a replikovaly, rep... až...... Konečně. "Hotovo!" prohlásila pyšně DNA-polymerasa. "To bylo krásné," povzdechla si DNA, "cítím se teď tak nějak dvojnásob šťastná." "Já jsem se tou prací musela opít, vidím tě totiž jaksi dvakrát," vzdychla DNA-polymerasa, "ale to se mi stává po každé dobře vykonané práci." "Teď ale už musím jít." "Počkej, to už se neuvidíme?" dvojhlasně zaznělo. "Vydrž do dalšího dělení, pak snad. ALE PAMATUJ! Dávej pozor na nukleasy. Potvory jedny darebný. Jsou ze všech nejhorší a vlezou všude. Ale znám starého inhibitora a ten je chytá." ….atd viz adresa shora Zkuste te napsat tu svou (aspoň pro 6+ let)
106
5 ORGANIZACE BUNĚK DO TKÁNÍ, ORGÁNŮ A ORGÁNOVÝCH SYSTÉMŮ
5.1
Buněčná složka a extracelulární matrix. .
5.2
Základní typy živočišných tkání a jejich charakteristiky 5.2.1 Epitely 5.2.2 Pojiva 5..2.3 Svalová tkáň 5.2.4 Nervová tkáň
5.1 Buňky a extracelulární matrix Živočišné organizmy, s výjimkou jednobuněčných a nejjednodušších vícebuněčných, jsou tvořeny orgány a orgánovými systémy. Orgány sestávají z různých druhů tkání. Tkáně jsou soubory morfologicky a funkčně podobných buněk a jejich derivátů. Vývoj tkáně v průběhu ontogenetického vývoje se nazývá histogeneze, vývoj orgánů, organogeneze. Každá tkáň se skládá z buněk a mezibuněčné (mimobuněčné) hmoty (extracelulární matrix, EXCM), kterou buňky syntetizují a secernují do svého okolí. Ve všech tkáních, s výjimkou krve, jsou buňky mezi sebou, a často i s EXCM- viz níže např. epitely, spojeny mezibuněčnými spoji a speciálními adhezními molekulami (viz kap. 2.3). Buněčná složka je nositelem hlavních funkčních vlastností tkáně, a to buď přímo (epitely, svalová, nervová tkáň) nebo tím, že buňky syntetizují EXCM, která dává tkáni další specifické fyzikální a chemické vlastnosti (viz níže např. pojiva). Spektrum buněk v jednotlivých tkáních je různě široké a bude uvedeno při výkladu jednotlivých typů tkáně. V diferencovaném stavu, se buňky v jednotlivých typech tkání liší svým vzájemným a prostorovým uspořádáním, morfologií, počtem, metabolickými a funkčními vlastnostmi. Důležitým znakem tkáňové příslušnosti buněk je chemické složení středních filament jejich cytoskeletu (viz kap. 2.4 i níže). Jsou však i rozdíly ve složení a obsahu dalších bílkovin, případně jejich isoforem, podílejících se na specifických funkcích jednotlivých buněk a tkání. EXCM různých tkání se liší svou funkcí, množstvím i složením. Nejméně je zastoupena v epitelech, svalové a nervové tkáni. Nejvíce v pojivech, kde určuje jejich fyzikální vlastnosti tkání (pružnost, pevnost, turgor). Ve většině tkání má však EXCM je i zdrojem signálů, které přes receptory v plazmatické membráně (viz např. integriny v kap. 4.1) ovlivňují metabolismus, dělení, migraci a diferenciaci buněčné složky tkáně. EXCM představuje i molekulární filtr pro přísun plynů a živin a odvod metabolických zplodin. Přibývá poznatků rovněž o informační úloze EXCM. To je dobře patrné v tkáních epiteliálních, ve kterých EXCM tvoří tzv. lamina basalis, která představuje nejen molekulární oporu, ale též informaci o prostorovém uspořádání (organizaci) buněk tj. usměrňuje migraci dceřinných buněk k povrchu tkáně (sliznic) při fyziologické obnově i regeneraci po poškození.
107
Společným rysem EXCM různých tkání je její vzhled ve světelném mikroskopu, kde lze rozlišit tzv. část amorfní a fibrilární. Podíl obou komponent EXCM v různých tkáních se liší a liší se do jisté míry i jejich chemickým složením. Nicméně, existují i následující společné vlastnosti. Amorfní část (pars amorpha) EXCM obsahuje vodou, ionty, v některých případech i anorganické soli a minerály (hydroxyapatit v kostní tkáni), tzv. nekolagenní bílkoviny a polysacharidy – glykosylaminoglykany (GLG, dříve kyselé mukopolysacharidy), které se váží na molekuly bílkovin a tvoří velké komplexy proteoglykanů (PGL). GAG (dříve kyselé mukoproteiny, mukopolysacharidy nebo aminopolysacharidy) jsou lineárně uspořádané řetězce, ve kterých se pravidelně střídají N-acetylované aminocukry a jejich alduronové kyseliny (syn. uronové kyseliny), spojené vazbami beta-1,4 a beta-1,3. Aminocukry jsou často sulfatovány. Anionické sulfátové a karboxylové skupiny sacharidových reziduí přitahují sodíkové kationty, které jsou silně hydratovány. Důsledkem je zvýšený turgor EXCM, který dodává tkáni pružnost a tlakovou odolnost, vč. absorbce mechanické energie (viz funkce chrupavky v kloubech). Hlavní skupiny GAG, představuje kyselina hyaluronová, chondroitin sulfáty A, B, C, dermatan sulfát a heparansulfát. U hmyzu se vyskytuje poly-N-acetylglukosamin (chitin) v exoskeletu. Kyselina hyaluronová (KH, syn. hyaluronát, hyaluronan) je polymer zhruba 50 000 disacharidových residuí tvořených N-acetyl-D-glukozaminu a kyseliny glukuronové. Vyskytuje téměř ve všech typech PT. Je vysoce hydrofilní a váže velký počet molekul vody. Objem hydratovaného polymeru HA je několika tisíckrát větší než samotné KH). Komplex je silně viskózní a transparentní (uplatňuje se na např. v synoviálně tekutině jako tzv. kloubní maz, nebo hmotu ve sklivci oka). KH snižuje adhesivní vlastnosti buněk a je proto hojná na povrchu migrujících buněk ve vyvvíjejích sse tkáních a orgánech, ve kterých se váže na specifický porvchový receptor těchto buněk (tzv. CD44 receptor, CD = Cell Differentiation antigen) Chondrotin sulfát (polymer N-acetyl-delta-galaktosaminu a delta-glukuronové kyselina) je zastoupen hlavně v chrupavce, kosti, stěně velkých cév. Jeho izomerní formu představuje dermatalsulfát, který je obsažen v dermis, šlachách, srdečních chlopních. Keratansulfát (polymer N-acetyl-delta-galaktosaminu a delta galaktózy) se vyskytuje v rohovce, chrupavce a meziobratlových ploténkách. Heparansulfát (v podobě perlecanu, viz níže) je častou složkou bazální laminy. Většina GAG se váže „kolmo“ na tzv. osový či centrální protein protein a vytváří větší komplexy označované jako proteoglykany . Vyskytují v mnoho obměnách (aggrecan, syndecany, betaglykan, decorin, perlecan, serglycin- viz níže). Molekuly proteoglykanů se často dále váží na molekulu kyseliny hyaluronové (přes malé spojovací proteiny) a vytváří obrovské supramolekulární komplexy viditelné již v elektronovém mikroskopu, připomínající větvičky jehličnanu, či kartáče. V jednom takovém komplexu může být zastoupeno vícero typů GAG. Viz obr. 47. Molekuly proteoglykanů lze klasifikovat podle jejich velikosti a tkáňové výskytu. Mezi tzv. velké, patří aggrekany vyskytující se v chrupavce. Mezi malé proteoglykany patří řada molekul s triviálními názvy (biglykany, dekoriny, perlekan, brevikan, neurokan, cerebroglykan, syndekany a další).
108
Některé GAG a PGL zůstávají uvnitř buňky jako součást sekrečních váčků (serglycin), kde slouží k organizaci jiných sekretovaných molekul. V jiných případech, jsou součástí plazmatické membrány (syndecany) a spolu s integriny fungují jako receptory pro kolagen, fibronektin a další proteiny EXCM. Váží též tzv. růstové faktory, které stimulují dělení buněk. Např. syndecany (heparansulfáty) váží Fibroblastový růstový faktor (FGF) a „presentují“ jej receptorům v plazmatické membráně okolních buněk. Tzv. betaglycan se podobně účastní na signalizační funkci tzv. Transformačního růstového faktoru-beta (TGF-beta, viz též růstové faktory v kapitole o regulaci buněčného cyklu). Podrobněji ve speciální literatuře, např. Alberts, Základy buněčné biologie nebo Molecular Biology of the Cell, viz doporučená literatura)
Fibrilární složka (pars fibrillaris) EXCM je tvořena kolagenními, elastickými a retikulárními vlákny a skupinou tzv. nekolagenních bílkovin, které mohou mít monomerní nebo polymerní fibrilání formu (fibronektin). Kolagenní vlákna jsou tvořena glykoproteinem kolagenem, která několik isoforem (IXVIII), s vysokým obsahem glycinu, prolinu a hydroxyprolinu. Jednotlivé isoformy se liší primární strukturou, stupněm hydroxylace a glykozylace. Kolagen je z buněk vylučován jako prekurzorová molekula, protokolagen, který je upravován extracelulárně (hydroxylace prolinu a lysinu, glykosylace hydroxylysinu, cástečná proteolýza-odštěpení konvových segmentů) a tvoří se z něj postupně polymerací protofibrily a mikrofibrily, fibrily a typická kolagenní vlákna a jejich svazky, které vidíme v mikroskopických preparátech po použití specifických barvících postupů. V mikrofibrilách se molekuly uspořádány tak, že se překrývají vždy jen o 1/4 délky, čímž vzniká příčné pruhování o periodicitě 60-70 nm. Kolagenní vlákna mají vysokou pevnost. Zvláštní typ kolagenu tvoří i retikulární vlákna, která tvoří jemné sítě, které jsou nosným stromatem pro buňky. Jednotlivých typy tkání obsahují různé isoformy kolagenu. Např. kolagen I ve vazivech, II v chrupavce, IV a XVIII v bazální lamině, VII v pod vícevrstevnými rohovějícími epitely apod.. Elastická vlána jsou tvořena glykoproteinem elastinem, který obsahuje aminokyseliny glycin a desmozin a isodesmozin. Vlákna mají vinutou podobu a elastické vlastnosti. Fibronektin se receptorově váže na integriny plazmatické membrány, především fibroblastů ve vazivech a na kolagenní vlákna EXCM. Integriny se v buňce spojují s aktinovými mikrofilamenty a tím tvoří EXCM a buňka morfologický a funkční vazebný komplex, který může dynamicky reagovat na aktuální potřeby buněk a tkáně. Vazba fibronektinu se uskutečňuje v tom místě molekuly, která obsahuje tripeptidické sekvence tvořené argininem-glycinem-aspartovou kyselinou (tzv. RGD sekvence). Analogicky, chondronektin (váže chondrocyty ke kolagenu v chrupavce). Významnou další bílkovinou EXCM je laminin, který má rovněž schopnost vázat se jak na buňky tak i kolagenní vlákna. Váže především epiteliální buňky k lamina basalis (viz níže).
5. 2 Základní typy živočišných tkání a jejich charakteristika Tkáně: (i) Epitelové
(ii) Pojivové
(iii) Svalové
(iv) Nervová
5. 2.1 EPITELOVÉ TKÁNĚ (ET) (obr. 47, 48, histol. příloha A-I, P,Q, Z3) ET vznikají za vývoje ze všech 3 embryonálních listů. Mají málo extracelulární matrix a s výjimkou epitelu retikulárního, buňky k sobě těsně přiléhají většinou svého povrchu. Jedním svým pólem, tzv. basálním, jsou buňky připojeny k tenké vrstvičce speciální mezibuněčné hmoty tv. bazální lamina (BL). Tvar buněk v různých typech epitelů může být dlaždicový, kubický, cylindrický až polyedrický, výjimečně hvězdicovitý. Tvar a počet 109
vrstev buněk , spolu s jejich ukotvením v bazální lamině, jsou jedním z kriterií morfologické klasifikace epitelů, především plošných (viz níže). Ve většině případů mají epitelové buňky mají relativně hojnou cytoplasmu a jsou morfologicky a funkčně polarizovány (viz níže). Střední filamenta jsou tvořena cytokeratiny (viz kap. 2.4). V ET chybí cévy (viz níže výměna látek v ET) Cytokeratiny se vyskytují v řadě isoforem (viz kap. 2.4), kterými se buňky mohou lišit jak v různých typech epiteliálních tkání či orgánů. Mění se též i v průběhu diferenciace v rámci jednoho typu tkáně, např. v procesu diferenciace a keratinizace ve vícevrstevných epitelech, např. epidermis.
Stavba a funkce BL. BL je 100-200 nm silná vrstva mezibuněčné hmoty. Je viditelná pouze v elektronovém mikroskopu. BL slouží jako molekulární síto pro látky difundující z cév v přilehlé vrstvě vaziva (např. podslizničního vaziva). BL slouží rovněž jako funkční a signalizační opora epitelových buněk, která zajišťuje správné prostorové začleňování dceřiných buněk při fyziologické obnově a hojení tkáně po poškození. Elektron mikroskopicky lze v BL rozlišit 3 podvrstvy: tmavší střední-lamina densa a 2 světlejší-laminae rarae (syn. laminae lucidae, --ae, koncovky v množ.čísle). Chemicky je BL tvořena nevláknitým kolagenem typu IV (více ve střední lamina densa), glykoproteinem lamininem (hlavně v zevní lamina rara mezi PM epiteliálních buněk a lamina densa), fibronektinem (ve vnitřní lamina rara), který váže BL k podkladovému vazivu nebo lamina fibroreticularis a proteoglykanem heparansulfátem (viz tníže EXCM). BL se vyskytuje i pod endotheliemi vlásečnic, kolem buněk hladké svalové tkáně, kosterních svalů, adipocytů a Schwanových buněk v periferních nervech. BL spolu s lamina fibroreticularis tvoří tzv. bazální membránu, která je silnější (0.ř až 1 um) a kterou lze vidět již ve světelném mikroskopu po speciálním barvení (tzv. PAS reakce a některé impregnace)
Polarizace epiteliálních buněk. Jak již uvedeno shora , basální pól buněk je přivrácen k BL, opačný pól, tzv. apikální, směřuje často do orgánových nebo tělních dutin, či cévního lumen. Morfologicky, na apikálním pólu mohou být např. mikroklky (kartáčový lem) nebo řasinky, cilie. U apikálního pólu jsou buňky mezi sebou spojeny těsnými spoji (tight junctions) a pásovými desmozomy (viz shora mezibuněčná spojení, kap. 2.3). Na bazálním pólu některých epitelů tvoří plazmatická membrána často četné invaginace. Mechanickou soudržnost epiteliálních mezi sebou buněk a s BL zajišťují četné bodové desmozomy a hemidesmozomy (viz kap. 2.3). Buněčné póly mají rovněž svá molekulární specifika. Na apikálním pólu např. střevního epitelu jsou v PM enzymy štěpící některé molekuly potravy (např. disacharidázy) a přenašeči jejich štěpů (monosacharidy, aminokyseliny apod.) do nitra buněk. Na bazálním pólu bývají jiné typy transportérů látek (viz kap. 3.1). V myoepiteliu jsou pak zde kontraktilní myofilamenta (viz též níže). Molekuly PM integrinového typu (viz kap. ….) na bazálním pólu epiteliálních buněk jsou spojeny s molekulami bazální laminy (viz membránový cytoskelet, kap. 2.4). Morfologická klasifikace ET: (a) E. plošné (b) E. „trámčité“ (varianta plošných) (c) E. retikulární, rozvlákněné Nejrozšířenější skupinou jsou epitely plošné. Plní funkce krycí, žlazové a resobční (sliznice dutých orgánů, epidermis, výstelky tělních dutin, endothel, tubuly ledvin aj.). Do této skupiny 110
by bylo možno de facto řadit i epitely trámčité ((játra, žlázy s vnitřní sekrecí aj.), neboť trámčitý vzhled viditelný ve světelném mikroskopu je v prostorovém pohledu dán řezy quasi paralelně probíhajících listů buněk, oddělených BL a vmezeřenými kapilárami. Pro epitel zárodečný a jeho deriváty viz kap. 5.2., gametogeneza. Epitel retikulární má omezaný výskyt (stroma thymu, mízních uzlin, zubní pulpa) Morfologické členění a výskyt plošných epitelů: I. E. jednovrstevné: a) dlaždicový, syn. squamosní (plicní sklípky, Henleova klička, serosní obaly orgánů a blanité výstelky tělních dutin=mesothel, endothel cév aj.) b) kubický (tubuly ledvin, tyreoidea, plexus chorioideus) c) cylindrický, děloha, vývody žláz s žíhaným lemem, sliznice dolního zažívacího traktu, vláskové bb. v Cortiho orgánu vnitřního ucha) II. E. víceřadé (všechny buňky jsou v přímém kontaktu s basální laminou): a) cylindrický s řasinkami (horní respirační trakt, vejcovod) a) přechodný: V hloubce malé, na povrchu 2-3 větší nepravidelné větší buňky, např. v močových cestách III. E. vícevrstevné (název je specifikován vlastnostmi povrchní vrstvy): a) dlaždicový rohovějící (epidermis) b) dlaždicový nerohovějící (ústní sliznice,jícen, pochva, žalud penisu) c) cylindrický, málo často se vyskytuje (část spojivky, epiglotis, nosohltanu) Funkční klasifikace ET: a) krycí, b) žlázový, c) resorpční, d) zárodečný, e) smyslový, f) myoepitel, g) pigmentový, h) „školící“ V myoepiteliu jsou pak zde kontraktilní myofilamenta (nezmar, mléčná žláza savců, duhovka oka Ad a) E. krycí tvoří pokrávají slizniční povrchy vnitřních orgánů a povrch těla (viz shora) Ad b) E. žlazový tvoří žlázy s vniřní sekrecí (E. trámčitý) a žlázy se zevní sekrecí Typy žlaz se zevní sekrecí I. Jednobuněčné (pohárkové buňky zažívacího a dýchacího traktu, sekrece hlenu, mucinu) II. Vícebuněčné: a)Tubulární: Jednoduché a větvené (zažívací trakt), stočené (potní žlázy) b) Acinární: Jednoduché (např. jedové žlázy), větvené (mazové žlázy), složené (slinné žlázy) c) Tuboacinární (např. pankreatické žlázy, slzné žlázy,mléčná žláza) /Pozn. Sekret je obvykle vylučován vyprázdněním sekrečních váčků, exocytózou, při které membrána váčku splyne s plazmatickou membránou. Jde o tzv. sekreci merokrinní, např. ve slinných žlázách, zažívacím traktu a pod, viz obr. 48 C. V některých případech do sekretu odchází celý apikální pól epithelové buňky (sekrece apokrinní, např. v mléčné žláze). Buňka se též může zcela naplnit sekretem a celá uvolnit do sekretu (sekrece holokrinní, např. v mazových žlázách kůže).
111
Při sekreci exokrinní je sekret vylučován do vývodů ústících na povrch sliznic nebo kůže. Při sekreci endokrinní je sekret vylučován do krve. Při sekreci parakrinní do mezibuněčného prostoru v okolí buňky. Jako sekreci autokrinní označujeme proces, kdy sekret vyloučený z buňky působí zpětně na receptory buňky, ze které sekret pochází.
Ad e) smyslový tvoří sensorickou část smyslů (sítnice, čichový epitel, vláskové buňky audio-vestibulárního aparátu, chuťových pohárků) Ad f) myoepitel V myoepitelu jsou na bazálním pólu kontraktilní myofilamenta (nezmar, mléčná žláza savců, duhovka oka) Ad g) E. pigmentový obsahuje četná mezaninová granula, absorbující světlo, např. pod retinou oka Ad h) „školící“ je retikulárního typu, např. stromatu thymu. Řídí zrání T-lymfocytů a eliminaci klonů rozpoznávající tělu vlastní antigeny (více ve Fyziologii) V případě sekundárního „natěsnání „ buněk, hovoříme o jejich epiteloidním (t. nepravém epitelovém) uspořádání (oontoblasty, osteoblasty).
5. 2. 2 POJIVOVÉ TKÁNĚ (PT) (Obr. 47, histologická příloha J-V) PT vznikají z mesenchymu ze středního (mesodermálního) zárodečného listu. Proto jsou též označovány jako tkáně mezenchymálního původu. Mesenchym je tvořen síťovitě uspořádanými buňkami, mezi kterými je hojná mezibuněčná hmota (syn. extracelulární matrix, EXCM). V průběhu ontogenetického vývoje mezenchymální buňky se diferencují v několik buněčných typů, které jsou pak hlavními buňkami základních skupin PT (viz níže). Základní tkáňový strukturální vzorec mesenchymu, byť v některých případech značně modifikovaný, zůstává zachován i v diferencovaných PT. Mají volně, síťovitě nebo skupinově uspořádané buňky, mezi kterými je hojná mezibuněčná hmota. Střední filamenta většiny buněk PT obsahují bílkovinu vimentin (viz kap.2.4). PT plní řadu funkcí. Některé jsou součástí výstelek tělních dutin (vazivová složka poplicnice, pobřišnice, mozkových plen apod.), vyplňují nebo spojují mezi sebou jiné tkáně (svazků nervových a svalových vláken), slouží jako pevné opory těla nebo jeho jednotlivých jeho částí (chrupavky a kosti), tvoří spoje (šlachy, kloubní pouzdra a vazy apod.) a pevnější obaly (fascie, serózy) vnitřních orgánů, uskladňují lipidy látky, rozpoznávají, zneškodňují, pohlcují cizorodé látky a částice (krevní buňky a jejich tkáňové deriváty) apod. (viz níže jednotlivé typy PT). Buňky PT lze s jistými omezeními dělit na tzv. stálé a bloudivé. Stále buňky jsou v tkáni trvale přítomny a odpovídají za tvorbu většiny EXCM. Dle typu PT (viz níže) jsou to fibrocyty, chondrocyty, osteocyty, ev. s příponou -blasty, adipocyty, histiocyty (usedlé makrofágy), žírné buňky a nediferencované mesenchymální buňky. Skupinu buněk přechodně přítomných, bloudivých, tvoří lymfocyty, plazmatické buňky, granulocyty a monocyty, migrující do tkáně z krve. Stále buňky syntetizují a sekretují molekuly EXCM do svého okolí. Počet bloudivých buněk se zvyšuje po lokálním dráždění tkáně mechanicky, infekcí nebo některými chemickými látkami.
112
EXCM dává jednotlivým typům PT specifické fyzikální a chemické vlastnosti (viz níže). Její chemické složení je uvedeno na začátku kapitoly. Určujícím je relativní objem, chemické složení a molekulární a supramolekulární organizace jednotlivých složek EXCM (viz shora). Dělení PT dle konsistence extracelulární matrix (EXCM): a)
polotuhá
b) tuhá
c) tekutá
Funkční členění PT: I. Pojiva „pravá“, nebo-li vaziva mechanicky spojují kosti a svaly, též různé buněčné komponenty orgánech, tvoří obaly orgánů a výstelky tělních dutin, poskytují mechanickou oporu některým orgánům. Kromě těchto mechanických funkcí mají některé typy pojiv i funkce střádací, váží vodu a účastní se obranných imunitních reakcí (zánět). Tento typ vaziv je bohatý na buňky a EXCM má řidší konsistenci v důsledku převahy amorfní, zpravidla vysoce hydratovanou složky. Vaziva s mechanickými funkcemi mají méně buněk a v ECXM hustě organizovaně uspořádanou fibrilární složku, podle které se dělí do několika skupin (viz níže). Vaziva mají cévní zásobení a značnou schopnost regenerace. Nahrazují jizvou poškozené neregenerující tkáně (např. myokardu a kosterních svalů, i větší defekty epidermis). Vaziva lze dále členit do následujících podskupin. a) Vazivo rosolovité (v pupečníku, pulpě dočasných zubů a duhovce) b) Vaziva řídká, syn.areolární: ba) embryonální – mezenchymálního typu bb) kolagenní, syn. fibrilární, (výstelky tělních dutin, obaly orgánů, mezi svalovými a nervovými vlákny, vazivové vrstvy sliznic aj.). Kromě funkcí mechanických má i funkce střádací a fagocytární. Vlákna jsou převážně kolagenní s příměsí elastických a retikulárních. Buněčná složka je tvořena převážně fibroblasty, makrofágy a bloudivými buňkami. bc) retikulární (stroma kostní dřeně lymfatických uzlin, sleziny). Je tvořeno málo diferencovanými retikulárními buňkami mezenchymálního typu a retikulárními vláky. c ) Hustá ( tuhá): ca) nepravidelná (škára, skléra oka, vazivové obaly orgánů, okostice, ochrustavice), tvořená plstí nepravidelně uspořádaných kolagenních vláken, mezi kterými jsou nečetné fibroblasty. cb) pravidelná (šlachy, vazy - bílá ligamenta), tvořená snopci paralelně hustě uspořádaných kolagenních vláken, mezi kterými jsou řady oploštěných fibroblastů s četnými výběžky. cc) Elastické (tzv. žlutá ligamenta kolem páteře, hlasivkové vazy, suspensorium penis aj.) mají podobnou stavbu jako shora sub cb, avšak s tím rozdílem, že převažující fibrilární složkou EXCM jsou vlákna elastická. Jejich svazky jsou však obaleny tenkou vrstvou vláken kolagenních 113
II. Pojiva oporná: a) Chrupavka má v EXCM hojnou interfibrilární amorfní složku bohatou na chondroitin a keratansulfát a glykoproteiny, které jí dávají mléčný vzhled a pevnost. Vláknitá složka je většinou špatně viditelná. Hlavní skupinou buněk jsou chondrocyty, které jsou uloženy v hladkostěnných komůrkách- lakunách- tvořených EXCM sekretovanou chondrocyty do okolí. Dceřiné buňky zůstávají blízko sebe a tak vznikají tzv. isogenní skupiny chondrocytů. Chybí cévní zásobení a schopnost regenerace s výjimkou perichondrálních oblastí. Podle složení a vzhledu EXCM se chrupavky dělí na a) chondroidní b) hyalinní- průhledná až bělavá (kloubní a žeberní chrupavky, některé části hrtanu, tracheální prstence, též chrupavčité kostní základy před osifikací) b) elastická (ušní boltec, Eustachova trubice, některé části hrtanu a v malých bronchách) c) fibrózní, syn. vazivová, s četnými a v mikroskopu viditelnými kolagenními vlákny (meziobratlové destičky, symphysis ossis pubis, chrupavka v kloubu čelistním a akromioklavikulárním) b. Kostní tkáň Hlavní buněčnou složku představují osteoblasty, diferencované a nedělící se osteocyty a osteoklasty. Osteoblasty syntetizují vláknitou a amorfní část EXCM (kolagenní vlákna z kolagenu typu I, proteoglykany a glykoproteiny, sialoprotein, osteokalcin, souborné označení ossein), do které se ukládají anorganické vápenaté soli (hydroxyapatit- kalcium fosfát a kalcium karbonát). Osteoblasty jsou tak postupně uzavírány do komůrek EXCM a mění se ve vřetenovité buňky s dlouhými výběžky, uloženými v jemných kanálcích (canaliculi ossium) v EXCM. Přes výběžky jsou sousední buňky propojeny vodivými spoji (gap junctions, nexy), počínaje buňkami v blízkosti cév. Tím je zajištěn přísun živin, kyslíku a odvod metabolických zplodin do cév i do vzdálenějších, a EXCM isolovaných, osteocytů. Osteoklasty jsou obrovské více jaderné buňky krevního původu (z monocytů), které mají osteolytickou aktivitu. Osteosyntetická aktivita osteoblastů a osteolytická aktivita osteoklastů zajišťuje trvalou obměnu (přestavbu) kostní tkáně a to jak v období časné osifikace, tak v dospělosti. Činnost obou skupin buněk je hormonálně řízena (více ve Fyziologii živočichů a člověka). V poslední době jsou popisovány též tzv. osteoprogenitorní buňky, mající charakter buněk kmenových, nacházející se na vnitřní straně periostu, v endosteu a podél krevních cév. EXCM je tvořena osteoblasty. Obsahuje kolagenní fibrily, které poskytují kostní tkáni pružnost. Složka amorfní složku, tvořená glykosyalaminoglykany a anorganickými solemi (hydroxyapatit, tj. kalcium karbonát a fosfát), dává kostní tkáni pevnost. Podle uspořádání kolagenních fibril a amorfní složky EXCM lze rozlišit 2 typy kostní tkáně. ba) Kost plsťovitá či vláknitá (embryonální forma, v dospělosti např. zubní alveoly) má v EXCM kolagenní fibrily uspořádány nepravidelně, síťovitě 114
bb) lamelární (lamelózní), ve které jsou fibrily a amorfní složka EXCM uspořádány do koncentrických lamel kolem centrálního, tzv. Haversova kanálku, ve kterém probíhají krevní a mízní cévy a nervová vlákna. Cévy vstupují do těchto kanálků bočně, tzv. kanálky Volkmanovými. Lamely jsou od sebe odděleny velmi tenkou vrstvičkou modifikované amorfní hmoty, označovanou jako cementová linie. Sloupec koncentrických lamel se středovým kanálkem se označuje jako osteon, syn. Haversův systém. U dlouhých kostí (i povrchu kostních trámců kosti houbovité, spongiózní, viz níže) jsou též lamely zv. plášťové, tj. probíhající rovnoběžně s celým povrchem kosti. Podobně je tomu i na dutinové (dřeňové) straně kosti. V důsledku trvale probíhající přestavby kosti (viz shora) jsou některé části osteonů neúplné („vykousnuté“) a nahrazeny lamelami nově tvořených osteonů (viz obrazová příloha). Lamelární kost je přítomna v: bba) kosti houbovité syn. spongiózní (epifýzy dlouhých kostí) bbb) kosti kompaktní (diafýza dlouhých kostí) bbc) zubovině syn. dentin, šupiny ryb, kožní kosti krokodýlů Kostní tkáň se tvoří až v průběhu ontogenetického vývoje procesem zv. osifikace, který spočívá v přeměně mezechymálního (desmogeního) nebo chondrogeního základu. Více v somatologii. III. a)
Pojiva speciální: Tuková tkáň (TK) se vyskytuje jako tzv. bílá a hnědá.
V bílé tukové tkáni mají zralé hlavní buňky – adipocyty- v cytoplasmě zpravidla jednu velkou tukovou kapku, bez membránového obalu. Jádro i ostatní cytoplazmatické organely jsou zatlačeny k plazmatické membráně. V nezralých adipocytech bývají mnohočetné malé kapky lipidů, které v průběhu zrání buňky splývají v jednu. Buňky jsou obklopeny kapilárami a tenkou vrstvičkou ECXM, tvořené kolagenními a elastickými vláky, mezi kterými jsou fibroblasty, lymfocyty a žírné buňky. Na mechanicky namáhaných místech se tvoří lalůčky ohraničené hustším kolagenním vazivem. Funkce TK: podkožní tuk, tuk okolo srdce, ledvin, kolem břišních orgánů a pod. slouží jako tepelná isolace a energetická reserva. Významné jsou též funkce mechanické. V podkoží dlaní a plosky nohou slouží např. TK jako tlumič nárazů. Podobnou funkci má TK kolem kloubů, srdce a ledvin, kde nedochází k mobilizaci tuku ani při hladovění. Tukový polštářek v kůži lící malých dětí zpevňuje tváře a napomáhá sání mléka. Nově zjištěné jsou funkce metabolické a endokrinní (viz níže) Tuková tkáň byla donedávna považována za málo metabolicky aktivní. Opak se ukazuje jako pravda. Jako příklad lze uvést mechanismy řídících syntézu a rozklad lipidů v adipocytech. Pro spuštění rozkladu lipidů (lipolýza) adipocyty musí aktivovat kaskádu chemických reakcí popsaných v kap. 5.4. Nejprve musí adipocyt přijmout hormonální signál (adrenalin, glukagon, adrenokortikotropní hormon hypofýzy) receptory v plazmatické membráně, přenést podnět do nitra buňky cestou G-proteinů a syntézy sekundárního posla cAMP, který dále aktivuje fosfoproteinkinázy, které teprve aktivují enzymy vlastního štěpení triglyceridů. Podněty přijímané jinými receptory v PM, představované především hormonem insulinem, vedou podobnou cestou aktivaci enzymu štěpících cAMP a tím lipolýzu tlumit. Další projevem aktivity adipocytů je syntéza a sekrece hormonu regulujícího kalorický příjem organismu, leptinu. V poslední době se ukazuje, že tuková tkáň je i zdrojem tkáňových hormonů typu cytokinů. Jejich nadměrná tvorba je zřejmě jednou z příčin aterosklerózy.
115
Hnědá tuková tkáň – je tvořena adipocyty s četnými vakuolami a mitochondriemi (hnědá barva železa v dýchacím řetězci), které obsahují tzv. odpřahující proteiny (uncoupling proteins), které odpřahují protonový gradient od syntézy ATP a mění jeho energii na teplo. Vyskytuje se např. v mezilopatkové krajině novorozenců (též u hibernujících savců) a má význam termoregulační. b) Trofická pojiva (tělní tekutiny: krev, lymfa, perienterická a celomová tekutina, hemolymfa, tkáňový mok). ba) Krev- vyskytuje se u živočichů s uzavřeným oběhovým systémem. Je tvořena částí buněčnou a nebuněčnou. Část nebuněčná -plasma: voda (90%), ionty (Na+, K+, Ca++, Mg++, Mn++, aj., jednoduché organické molekuly (soli-NaCl, NaHCO3 aj., glukóza, mastné kyseliny, aminokyseliny, Nbaze, signální molekuly, vitaminy aj.), bílkoviny (albuminy, globuliny-α,β,γ, fibrinogen, protrombin a další proteiny koagulační kaskády, peptidy s hormonálními účinky, aj.), lipoproteiny a další. Část buněčná: erytrocyty (červené krvinky) leukocyty (bílé krvinky) : granulární (neutrofilní, eosinofilni, bazofilní, dle povahy cytoplazmatických granul) : agranulocyty (lymfocyty T a B, monocyty) trombocyty (krevní destičky) Tvorba krve = hematopoeza. Začíná z kmenových pluripotentních kmenových buněk v kostní dřeni. Myelopoeza = tvorba erytrocytů a granulocytů, monocytů a trombocytů ze společné prekurzorové buňky. Lymfopoeza= tvorba lymfocytů ze společné blastového prekurzoru. Erytrocyty (erc) savců a člověka jsou v diferencované formě bikonkávní bezjaderné elementy (cave: ve fetálním období vývoje, v časných fázích erytropoeze i dospělých a u některých živočichů po celý život i zralé erc obsahují jádro). Pod plazmatickou membránou je bohatý membránový (kortikální) skelet, tvořený řadou bílkovin (spektrin, aktin aj., viz kap. 2.4), který činí PM poddajnou a pružnou, což usnadňuje průchod erytrocytů kapilárami. Erc jsou bohaté na enzymy glykolytické a hexozomonofosfátové metabolické dráhy. Podstatnou část obsahu erc (35 % jejich hmotnosti, 28-32 pg/erc) je červený transportní metaloprotein- hemoglobin (Hb). Od objevu Hb (1851) ke a stanovení jeho funkce (C.Bernard 18…) a molekulární struktury (1959 M.Perutz aj. kendrew, Nobelova cena) uplynulo více jak sto let. Hb je tvořený bílkovinnou částí – globinem a prostetickou (nebílkovinnou) částí – hemem. Hem je tvořen 4 pyrolovými jádry na jejichž atom dusíku je vázán Fe++, z nichž každý reverzibilně váže 1 molekulu kyslíku. Globin stejně jako jiné bílkoviny vzniká na ribozomech, hem v mitochodriích a cytozolu. Hb člověka se vyskytuje v několika variantách (HbA, HbA2, HbAo, HbF), které se liší bílkovinou složkou. HbA je hlavní frakcí v dospělosti. Skládá se ze 4 podjednotek, dvou alfa (α) a dvou beta (ß). Minoritní frakcí (2-3%) je u dospělého člověka HbA2, který místo ß podjednotek obsahuje dvě δ podjednotky. HbF je fetální forma Hb. V malém množství (0.5%) je přítomen i u dospělých žen. Místo ß podjednotek má dvě γ podjednotky. 116
Hydrofilní aminokyseliny globinu komunikují s okolním vodním prostředím a hydrofobní AK jsou uvnitř molekuly, kde vytváří tzv. hydrofobní kapsu. Mezi aminokyseliny His F8 a His E7 (písmeno určuje α-helix a číslo pořadí AK v daném α-helixu) v hydrofobní kapse se zasunuje planární (rovninná) molekula hemu. Ve středu tetrapyrrolového jádra hemu je vázáno dvojmocné železo (Fe2+), které je v hydrofobní kapse globinu chráněnopřed oxidací na Fe +++.
Hemoglobin (Hb) přenáší kyslík z plic nebo žaber tkání a opačně oxid uhličitý. Oxygenací deoxyhemoglobinu (tmavě červený) vzniká oxyhemoglobin (světle červený). Množství kyslíku vázaného v oxyhemohlobinu zavisí na na parciálním tlaku kyslíku. 1 gram tetrameru hemoglobinu může vázat 1,4 ml kyslíku.Saturační křivka HB kyslíkem má sigmoidní (esovitý) tvar (viz fyziologie živočichů), což usnadňuje pro uvolňování kyslíku v tkáních. Afinita HbF ke kyslíku je vyšší, což usnadňuje jeho přechod z krve matky (příčinou je rozdíl v podjednotách globinu). U člověka může 1 l krve vázat až 200ml kyslíku. Životnost erc člověka je 110-120 dní Vazbou CO na Hb vzniká karboxyhemoglobin, jehož vazba na HB je asi 200x pevnější než kyslíku. Proto již při nízké koncentraci ve vzduchu vytlačí oxid uhelnatý molekulu kyslíku z vazby na Hb. Dusičnany v potravě nebo v pitné vodě způsobují oxidaci Fe2+na Fe3+ za vzniku namodralého methemoglobinu, který již nepřenáší kyslík. Redukci methemoglobinu na hemoglobin zajišťuje methemoglobireduktáza, která má nízkou aktivitu u kojenců. Ukládání methemoglobinu v periferních tkáních vede k modrání kojenců (blue babies).
Leukocyty se dělí podle granul v cytoplazmě viditelných ve světelném mikroskopu, na granulocyty a agranulocyty, resp. granulární a agranulární leukocyty. Neutrofilní granulocyty jsou nejpočetnější (u člověka 60-70%). Ve zralé formě mají laločnaté jádro a v cytoplazmě specifická jemná a slabě až modrofialově se barvící granula (váčky), která obsahují enzymy a některé další biologicky účinné látky. Dle obsahu a barvitelnosti se dělí do 2 skupin, granula tzv. azurofilní a tzv. specifická. V cytozolu jsou zrnka glykogenu (viz též inkluze v kap.2.5) a enzymy pro glykolýzu. Azurofilní granula (váčky) se barví jemně fialově obsahují enzymy skupiny lysozomálních hydroláz (např. kyselou fosfatázu, arylfosfatázu, beta galaktozidázu, peroxidázu a další, viz shora kap. ….), dále baktericidní bílkovinu lysozym (odlišuj od lysozom!!) a tzv.kationický antimikrobiální protein. Specifická granula jsou menší a proto i po obarvení málo výrazná. Obsahují alkalickou fosfatázu, kolagenázu , laktoferin, lysozom a některé další antimikrobiální proteiny.
Neutrofilní granulocyty jsou schopny migrace a fagocytózy (mikrofagocyty). Pohlcený materiál je v heterofagozomech denaturován nízkým pH (4.0), které zajišťuje protonová pumpa v membráně fagozomu, se kterým posléze splynou azurofilní granula, která provedou konečný rozklad pohlceného materiálu. Plazmatická membrána je bohatá na specifické bílkoviny, které plní funkce receptorů a adhezních molekul (viz kap. 2.1), které jsou nezbytné pro imunitní funkce, vč. vycestování z krevního řečiště. Jejich životnost v krvi je krátká (několik hodin). Po vycestování z krevního řečiště do tkání žijí 2-4 dny (více ve Fyziologii živočichů). Eozinofilní granulocyty představují minoritní skupinu (1-4%) leukocytů. Jádro je zpravidla méně laločnaté. V cytoplasmě jsou větší, ovoidní a eosinofilní granula resp. váčky, která obsahují kyselou fosfatázu, arylfosfatázu, beta galaktozidázu, peroxidázu a další specifické proteiny schopné usmrcovat některé parazity (např. bilharzie) i ovlivňovat místní zánětlivé reakce. Jejich zmnožení provází některé typy alergií. Životnost 7-14 dní. Bazofilni granulocyty jsou nejméně početné (0.3-1%). Jádro je relativně velké a málo členěné. V cytoplazmě jsou nečetná hrubší bazofilní granula obsahující biologicky aktivní molekuly, např. heparin, histamin, leukotrieny apod. Po výstupu z krevního řečiště se mění nebo podporují žírné buňky. 117
Lymfocyty tvoří 20-30% leukocytů. Většinou jsou malé, kulaté s relativně velkým kulovitým jádrem. V tenkém cytoplazmatickém lemu jsou ojedinělé polyzomy, cisterny Golgiho aparátu, ojedinělé mitochondrie a jemná bazofilní granula. Po aktivaci antigenem se zvětšují. Tzv. B-lymfocyty, vyzrávající u ptáků v Burza Fabritii a u člověka v kostní dřeni, se po setkání s antigenem aktivují a mění na tzv. plazmatické buňky (plazmocyty) . Aktivace zahrnuje růst objemu buněk, zmnožení hrubého endoplazmatického retikula, zvýšeni syntézy bílkovin- imunoglobulinových protilátek, které se pak uvolňují do krevní plazmy. Tzv. T-lymfocyty vyzrávají v v thymu a odpovídají za tzv. buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď (více ve Fyziologii živočichů). Monocyty, tvoří 3-8% leukocytů a jsou největší. Jádro je většinou ledvinovitého tvaru, Cytoplazma je lehce bazofilní a obsahuje jemná azurofilní granula vybavená hydrolytickými enzymy. Jsou vysoce ameboidně pohyblivé a po vycestování z krevního řečiště se mění na tzv. profesionální makrofágy. Trombocyty, krevní destičky jsou fragmenty cytoplazmy megakaryoblastů, s nečetnými organelami, zrníčky glykogenu dalšími granuly. Alfa granula obsahují fibrinogen a některé další proteiny, delta granula serotonin, ionty vápníku, adeninové nukleotidy a pyrofosfát. Lambda granula obsahují lysozomální enzymy. Trombocyty se účastní stavění krvácení. Životnost 10-12 dní. Více ve Fyziologii). bb) Lymfa je tvořena mízní plazmou a lymfocyty, které do ní vstupují při průtoku mízními uzlinami. Lymfa přitékající od břišních orgánů obsahuje chylomikrony a lipoproteinové částice (LDL, VLDL, IDL, HDL, více ve Fyziologii Živočichů a člověka) bc) Tkáňový mok, syn. intersticiální či mezibuněčná tekutina je ultrafiltrát krevní plazmy bez buněčných elementů. Obsahuje metabolity prostupující z krevních cév a metabolické zplodiny vylučované tělními buňkami. bd) Hemolymfa. Vyskytuje se u bezobratlých s otevřeným cévním systémem. Obsahuje jen malý počet buněk- hemocytů, které obvykle nenesou dýchací pigmenty. Dýchací pigmenty mohou být volně rozpuštěny v plazmě (modrý Cu++ hemocyanin u korýšů, měkýšů, zelený chlorocruorin a Fe++ hemoglobin u annelid, též kospuskulární hemocyninu podobný Fe-non-porfyrinový hemerythrin) Mohou se vyskytovat i současně.
5. 2. 3 CHARAKTERISTIKA SVALOVÉ TKÁNĚ (ST) (Obr. 41, 49-51, histologická příloha S-U) ST, s výjimkou m. sfincter pupilae, je derivátem středního zárodečného listu, mesodermu. ST má málo mezibuněčné hmoty. Buňky obsahují velké množství kontraktilních vláken, typu mikrofilament (myofilament), organizovaných do větších svazků- myofibril. ST se vyskytuje se ve 2 základních typech, jako svalovina hladká a příčně pruhovaná (žíhaná), která se u obratlovců dále člení na svalovinu kosterní a srdeční. Střední filamenta cytoskeletu svalových buněk jsou tvořena bílkovinou desminem (viz kap. 2.4). I.
Hladká svalovina
Výskyt: stěna dutých orgánů obratlovců, pohybový aparát některých bezobratlých, stěna cév, duhovka. Je tvořena vřetenovitými jednojadernými buňkami, která obsahují četná prostorově nepravidelně (síťovitě) orientovaná myofilamenta, která jsou tvořena aktinovými a myosinovými vlákny (myosin II, viz kap….) a upínají se do „ztluštěnin“ plazmatické membrány, tzv. tmavých tělísek (dense bodies, viz obr. 51 C), která jsou analogy Z-linií kosterních svalů, viz níže ). Úpon myofilament je zprostředkován bílkovinami středních filament (desmin, vimentin). Zkrácení hladké svalové buňky se uskutečňuje ve směru 118
uspořádání většiny myofilament. Mezi buňkami jsou četné vodivé spoje typu nexů (gap junctions, viz kap.2.1), které umožňují rychlé přesuny iontů (šíření depolarizace) mezi buňkami a tím i synchronizaci stahů velkých skupin buněk. II. Příčně pruhovaná svalová tkáň Vyskytuje se už u bezobratlých (kroužkovci, měkkýši, členovci). U členovců se upíná na vnější kutikulární kostru. U obratlovců na kostru vnitřní. a)
kosterní
Je tvořena mnohojaderným cylindrickými buňkami (syn. svalovými vlákny), které mohou mít různou délku a jsou obklopeny velmi tenkou vrstvou řídkého (syn. areolárního) kolagenního vaziva (endomyzium). Svalová vlákna se sdružují do svalových snopečků a snopců, krytých silnější vazivovou vrstvičkou, perimyziem. Na povrchu svalu je pak blanka neuspořádaného hustého vaziva, epimyzium, které přechází v pevnou vazivovou fascií, která odděluje jednotlivé svaly a přechází ve šlachu upínající se na kost. Příčně pruhovaná svalovina vyskytuje nejen u obratlovců, ale již i bezobratlých (žahavci, měkkýši, kroužkovci, členovci). Plazmatická membrána (PM, syn sarkolemma) tvoří hluboké tubulární vchlípeniny do cytoplasmy buňky (T-tubuly), kolem kterých je jsou rozšířené cisterny hladkého sarkoplazmatického (syn. sarkoplazmatického) retikula, které je zásobárnou kalciových iontů nezbytných pro kontrakci svalu. V EM řezech vzniká tak obraz tzv. triád (viz obrázek). Jádra svalových buněk jsou v blízko pod sarkolemmou.V cytoplazmě jsou v EM patrná zrnka glykogenu. V cytoplasmě jsou paralelně, ve směru podélné osy, uspořádaná myofilamenta, aktinová a myosinová vlákna, která se částečně překrývají, což je odpovědné za tzv. příčné žíhání. Místa jejich částečného překrytí jsou v mikroskopu tmavší v důsledku vyššího obsahu bílkovin a lomu světla (anisotropní A-segment), místa bez myosinových vláken jsou světlejší (isototropní I-segmenty). Segment mezi dvěma Z-liniemi se nazývá sarkomera (viz obr. 49,50). Ve středu sarkomery lze v EM rozlišit ještě užší světlý proužek s tmavším středem, tzv. H zonu (něm. Helles, světlý), viz níže. Zkratky označující segmenty sarkomer jsou ze starší německé terminologie (Z-: Zwischenscheibe, M-: Mittel, H-: Heller). Název sarkomera je odvozen z řečtiny: sark-maso, meros:dělit
Aktinová vlákna jsou zakotvena kolmo do tzv. Z-linií (viditelných jen v EM), tvořených bílkovinou středních filament- desminem a dalšími proteiny (alfa- aktinin, CapZ, viz níže). Myozinová vláka obsahuj tzv. myozin II (více o těchto molekulách v kap. 4.2). Kolem jednoho myosinového vlákna je pravidelně rozloženo 6 tenkých vláken aktinových. K aktinovým vláknům jsou přidruženy další bílkoviny, nezbytné pro zkrácení („kontrakci“) sarkomer. Troponin je Ca++ vážící protein a tropomyosin blokuje v klidovém stavu vazbu myozinových hlaviček na aktinová vlákna (více ve Fyziologii živočichů). Délka sarkomery je kolem 2 um. Svazky myofilament a řetěz sarkomer tvoří myofibrily, mezi kterými je cytozol a cytoplazmatické organely. Myofibrily procházejí celou svalovou buňkou (svalovým vláknem), jehož délka může být několik desítek mm až cm a sarkomer desítky až stovky tisíc. Při kontrakci svalu se sarkomery zkrácují (tzv. klouzavý model svalové kontrakce) tím, že myosinová a aktinová filamenta se vzájemně vůči sobě podélně posouvají, tj. zasunou se hlouběji mezi sebe. Více o svalové kontrakci v kurzu Fyziologie živočichů. 119
Pro morfologickou organizaci samrkomer a funkci svalů jsou důležité i další vláknité bílkoviny. Titin je zakotven do Z linie a probíhá podél myozinových vláken až do středu sarkomery. Funguje jako elastická pružina, která udržuje osovou polohu myozinových vláken při kontrakci svalu a brání i nadměrnému pasivnímu protažení svalu. Bílkovina nebulin, je uložena podél aktinových vláken a podílí se na jejich zakotvení do Z-linií. Na tomto zakotvení se podílejí i další proteiny, např. CapZ a alfa-aktinin. Ve středu sarkomer se na myosinová filamenta váží bílkoviny myomesin a C-protein, kde tvoří EM tmavší, tzv. M-linii. Titin a nebulin se považují za „pravítka“ odpovědná na podélnou organizaci sarkomer.
Větší počet mitochondrií, spolu s větším množstvím kyslík vázajícího Fe++ myoglobinu, je přítomen v tzv. červených svalových vláknech, která jsou tenčí a kontrahují se pomaleji i menší silou. Jsou i méně unavitelné. Získávají energii (ATP) převážně oxidativní fosforylací. Patří sem svaly končetin a antigravitační svaly, prsní svaly migrujících ptáků. Silnější, tzv. bílá svalová vlákna (syn. rychlá vláka) získávají energii převážně cestou anaerobní glykolýzy. Tato vlákna se vyznačují rychlými a silnějšími kontrakcemi (např. okohybné svaly, svaly zajišťující hybnost prstů a další). Jejich unavitelnost je rychlejší. Mají i bohatší inervaci, což umožňuje velmi jemnou funkční regulaci. Odlišení obou typů svalových vláken umožňují některé histochemické reakce (např. aktivita mitochondriální sukcinát dehydrogenázy je vyšší v červených vláknech). V cytoplasmě svalových buněk, především bílých vláken, jsou četná zrnka glykogenu (viz inkluze kap.2.6). Glykogen, spolu s glukózou a mastnými kyselinami z krve, jsou hlavní zdroje pro syntézu ATP. Specifickou zásobárnou makroergních fosfátových vazeb je fosfokreatin. Více ve Fyziologii živočichů. Mezi svalovými buňkami jsou malé, tzv. satelitní buňky, které mají povahu kmenových buněk. Mohou se totiž po poškození svalu dělit a diferencovat v myoblasty a zralé svalové buňky (syn. svalová vlákna). Po větším poškození je svalová tkáň nahrazována vazivovou jizvou. Diferencované svalové buňky se prakticky nedělí. b)
srdeční (myokard)
Je tvořen jedno až dvoujadernými buňkami (kardiomyocyty), uspořádanými do dlouhých řad. Buňky jsou jedno až dvoujaderné, oddělené tzv. interkalárními disky (ID). Mezi buňkami jsou cytoplasmatické můstky. ID představují komplexní mezibuněčné spoje tvořené hlavně pásovými a bodovými desmozomy a vodivými spoji (nexů). ID zajišťují vzájemnou soudržnost buněk a umožňují rychlé přesuny iontů při depolarizaci PM a tím synchronizaci stahu myokardu. Buňky jsou jedno nebo dvoujaderné Jádra buněk jsou uložena spíše ve středu cytoplazmy, ve které jsou dlouhé mitochondrie, sarkoplazmatické retikulum, Golgiho aparát, kapénky lipidů a zrnka glykogenu. T-tubuly plazmatické membrány jsou pouze ve svalovině komor a na rozdíl od kosterní svaloviny, nešíří se jimi depolarizace a nevytváří typické triády. Hl-ER se totiž na rozdíl od kosterních svalů přikládá k T-tubulům přikládá „pouze z jedné strany“ a v EM řezech tvoří s T-bubuly „diády“, nikoliv triády, přítomné v kosterních svalech. V myokardu jsou některé specifické izoformy řady bílkovin zmíněných již v kosterních svalech. Např. Troponin C, Nebulejte aj. Rozdíly jsou v receptorech a iontových kanálech plazmatické membrány. Více ve Fyziologii.
V síňové svalovině jsou v cytoplazmě granula obsahující natriuretický hormon. Častá jsou zrnka glykogenu. S věkem přibývá zrnek lipofuscinu (zbytkový střádaný hnědý pigment). Více ve Fyziologie živočichů a Obecné patobiologii. 120
Sarkomery mají základní stavbu podobnou kosterním svalům. Jsou však kratší a sousední myofibrily často navzájem anastomozují. Rozdíly jsou ve složení shora zmíněných bílkovin přidružených k myofilamentům. Více ve Fyziologii živočichů.
5. 2. 4 CHARAKTERISTIKA NERVOVÉ TKÁNĚ (NT) (Obr. 47, 52, histologická příloha V-R) NT vzniká z neuroektodermu (viz kap. 6.3). U obratlovců tvoří mozek, míchu, periferní ganglia a nervy, dřeň nadledviny. U bezobratlých NT tkáň tvoří sítě, ganglia a provazce. Obsahuje buňky nervové a gliové, mezi kterými, s výjimkou nedávno objevené velmi jemné pericelulární sítě proteoglykanů a tenkého filmu extracelulární tekutiny, není prakticky žádná mezibuněčná hmota. Morfologické spektrum buněk se zvyšuje s fylogenetickou vývojovou řadou. Přibývá výrazně i gliových buněk. NT je silně vaskularizovaná. V míše a mozku jsou mezi endotheliemi kapilár těsné spoje (viz kap. 2.1), které omezují transport látek mezi nervovou tkání a krví. Spolu s membránovými obaly astrocytů (viz níže) tvoří tzv. hematoencefalickou barieru. Na nervové buňce rozlišujeme tělo (perikaryon, syn. soma) a výběžky. Perikaryon je tvořený jádrem a cytoplasmou. V případě velkých buněk, např. míšních motoneuronů, jsou v cytoplazmě agregáty hr-ER, které v histologických preparátech obarvených toluidinovou nebo metylénovou modří vypadají jako modré „obláčky“, tzv. Nisslova substance (syn. „tygroid“, protože to dodává cytoplazmě skvrnitý vzhled). V takovýchto neuronech je velké a jadernými barvivy se silně barvící jadérko. V perikaryu a výběžcích, především axonu, střední filamenta cytoskeletu obsahují tzv. neurofilamentové proteiny (3 isoformy, viz kap. 2,4). Jisté specifity v chemickém složení mají i mikrotubulární komponenty cytoskeletu. Neurony se nedělí. Nezralé prekurzory nervových a gliových buněk mají ve středních filamentech cytoskeletu specifickou bílkovinu nestin. Plazmatická membrána (PM) nervových buněk obsahuje mnoho funkčně důležitých bílkovin, které odpovídají za její excitabilitu. Jsou to především, iontové kanály, transportéry iontů, především Na+K+ATPáza (sodíko-draslíková pumpa), která spolu se semipermeabilitou PM, udržuje klidový membránový potenciál PM (viz kap. 3.1). Funkčně velmi důležité jsou receptory pro synaptické neuromediátory v post-synaptických membránách. Nejvyšší hustota iontových kanálů je v PM v místě odstupu axonu (tzv. hrbolek či hillock). Více v kurzu Fyziologie živočichů Výběžky nervových buněk jsou dvojího typu. Silnější, zpravidla kratší a vícečetné, se nazývají dendrity. Solitární, delší a tenký je neurit (syn axon). Dendrity slouží k vedení nervových vzruchů do buňky (centripetálně, proto též výběžky aferentní). Axon vede vzruchy z buňky (centrifugálně, eferentně) k dalšímu neuronu nebo jiné efektorové buňce (sval, žlazový epitel aj). Svazky axonů tvoří v míše a mozku nervové trakty (syn. dráhy, fascikuly nebo komisury) a v periferním systému různé typy nervů. Neurity v periferních nervech jsou obaleny velmi jemnou vrstvou vaziva (endoneurium) a jejich svazky tzv. perineuriem. Na povrchu nervu je další vazivový obal, epineurium. Délka axonu může být několik desítek mikrometrů až 1 m (v míše a periferních nervech). Dlouhé axony se někdy označují jako nervová vlákna. Axon obsahuje svazky podélně uspořádaných vláken cytoskeletu uložené v axoplasmě. Jsou tvořeny středními filamenty tvořenými tzv. neurofilametovými peptidy. Mikrotubuly (viz kap. 2.4), slouží jako transportní 121
dráhy pro váčky s neuromediátory, syntetizované v perikaryu. V minulosti se impregnace cytoskeletu solemi stříbra používala k mikroskopickému zobrazování nervových buněk a vláken. Od axonu mohou odstupovat tzv. kolaterály a na konci se bohatě větví (tzv. telodendron). Axon může být kryt jen plazmatickou membránou (axolema), tzv. vlákna nahá (zvláště na jejich konci), nebo být obalen myelinovou pochvou. Myelin (řecky myelos = bílý) je tvořen koncentricky uspořádanými plazmatickými membrány gliových buněk, s modifikovanou strukturou jejich lipidické i bílkovinné složky. V mozku a míše vytvářejí myelin buňky oligodendrogliové, v periferních nervech Schwannovy buňky (viz níže). Myelinový obal je periodicky přerušován tzv. Ranvierovými zářezy, kde je axon kryt pouze základní membránou oligodendroglie nebo Schwannovy buňky. Oblasti mozku a míchy bohatá na myelinizovaná vlákna představují bílou hmotu míšní a mozkovou. Šedá hmota je tvořena neuronálními perikaryi, jejich vlákny a buňkami gliovými. Síť vláken mezi buněčnými těly se označuje jako neuropil. Na koncích axonálních výběžků jsou mikroskopická rozšíření, tzv. presynaptická zakončení („knoflíky“ či „butony“, odvozeno od „boutons terminaux“), která se přikládají na povrch další nervové buňky a tvoří chemické synapse. Podle postsynaptické lokalizace se synapse dělí na axosomatické (na PM perikarya), axodendritické a axoaxonální. Každá synapse je tvořena presynaptickým knoflíkem, synaptickou štěrbinou a postsynaptickou částí, kterou je specificky ztluštělá plazmatická membrána následujícího neuronu. V presynaptické části jsou četné mitochondrie a synaptické váčky, obsahující neuromediátory, které se po podráždění nervové buňky vylévají (exocytóza) do synaptické štěrbiny a váží na receptory v postsynaptické membráně. Receptory jsou buď chemicky regulované iontové kanály, nebo receptory spřažené s G-proteiny (viz kap. 5.4), které iontové kanály regulují. V synaptické štěrbině jsou enzymy, které neuromediátory rozkládají. Více ve Fyziologii živočichů a člověka. Kromě chemických synapsí se v NT vyskytují též elektrické synapse, které představují mezibuněčné spoje typu gap junctions (nexy) Neurony se v dospělém mozku nedělí a většina ani neobnovuje. Pouze v minoritních oblastech mozku (gyrus dentatus hipokampu savců, jádra řídící zpěv ptáků apod.) existuje možnost jejich obnovy za některých funkčních okolností. Výrazným změnám však může podléhat počet a rozložení synapsí (tzv. synaptická plasticita), která se mění již v průběhu učení. Obnovy, resp. regenerace jsou schopny prakticky všechny axony periferních nervů.
Nervové buňky vykazují značnou morfologickou variabilitu, tj. liší se velikosti, tvarem, počtem a uspořádáním výběžků, typem neurotransmiterů v synapsích. Liší se i některými svými funkcemi. Morfologická klasifikace neuronů dle tvaru a velikosti perikarya: a) neurony pyramidové b) neurony stelární (hvězdicové) c) neurony granulární (malé) d) neurony speciálních tvarů (např. Purkyňovy buňky mozečku) 122
Podle počtu výběžků a) b) c) d)
neurony unipolární neurony bipolární neurony multipolární neurony pseudounipolární
Klasifikace dle funkce a) b) c) d) e) f)
neurony projekční (s dlouhými axony spojujícími vzdálené oblasti CNS a CNS s periferními orgány těla) neurony asociační (vmezeřené) s krátkými výběžky spojujícími jiné málo vzdálené neurony mezi sebou neurony sensorické a motorické neurony excitační a inhibiční a pod. neurony neurosekreční
Klasifikace dle typu neurotransmiteru v synaptických váčcích a) b) c) d) e) f)
neurony acetylcholinergni noradrenergní GABAergní serotoninergní peptidergní glutamátergní atd., (více ve Fyziologii)
Gliové buňky Jsou většinou menší a svým počtem převyšují u většiny obratlovců počet nervových buněk. V mozku laboratorního potkana je to zhruba 3x, u člověka v některých oblastech mozku až 5x. Jejich fyziologické funkce jsou uvedeny níže. Po poškození nervové tkáně v míše nebo mozku se aktivuje dělení a fagocytární schopnosti některých jejich podskupin (astrocyty a mikroglie), které pak zajišťují tzv. úklidovou reakci a tvorbu gliové jizvy, která nahradí poškozené nervové buňky. Podle morfologie a funkce jsou gliové buňky děleny do několika skupin: Astrocyty. Hvězdicovité buňky v preparátech impregnovaných solemi stříbra. Jejich výběžky obalují kapiláry a těla nervových buněk, udržují vodní, ionotovou a neurotrasmiterovou homeostázu mezibuněčněho prostoru nervové tkáně, do kterého se vyplavují tyto molekuly z aktivovaných neuronů- viz Fyziologie živočichů. V cytoplasmě a výběžcích astorcytů bílé hmoty jsou četná střední filamenta tvořená specifickou bílkovinou zv. GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein, Kyselý Fibrilární Gliový Protein). Astrocyty šedé hmoty jsou více plazmatické a mají méně GFAP. Oligodendrocyty. Menší buňky s nečetnými výběžky. Metabolicky kooperují s neurony a tvoří myelinové obaly axonů v mozku a míše.
123
Mikroglie. Nejméně četná skupina giových buněk. Buňky jsou zpravidla velmi malé s krátkými výběžky. V impregnovaných preparátech připomínají malé pavoučky. Uplatňují se při imunitních a fagocytárních úklidových reakcích poškozené tkáně. Schwannovy buňky tvoří myelinové obaly periferních nervů. Ependymální buňky. Jsou epiteliálně uspořádané, kubické, nebo dlaždicovité buňky pokrývající vnitřní stěnu komorového systému míchy a mozku. Podílejí se na transportu látek mezi mozkomíšní tekutinou v komorách a tkáňovém parenchymu. Zvláštní non-neuronální („gliovou“) skupinou jsou epiteloidní buňky pokrývající tzv. houbovitá tělesa mozkových komor (chorioideální plexy) tvořící mozkomíšní (cerebrospinální) mok. V místě úponu plexů, plynule přecházejí v ependym. Poznámka. Klky plexů mají uvnitř osovou pojivovou tkáň nesoucí krevní kapiláry.
124
6 ROZMNOŽOVÁNÍ ŽIVOČICHŮ. GAMETOGENEZE A BLASTOGENEZE (obr.53-56) 6.1 Nepohlavní rozmnožování
Láska je když…….
6.2 Pohlavní rozmnožování 6.2.1 Evoluční význam 6.2.1 Vývoj gamet (gametogeneza) (meióza a další zrání gamet,) 6. 2 .2 Determinace pohlaví a pohlavní znaky 6.2.3 Blastogeneza 6.2.3.1 Osemenění a oplození 6.2.3.2 Rýhování. 6.2.3.3 Gastrulace 6.2.4 Genetické aspekty rozmnožování
Účelem rozmnožování je zachování živočišného druhu. Proces rozmnožování je spojen s tzv. vertikálním přenosem genetické informace tj. z rodičovských organizmů na potomstvo. Život jedince lze rozdělit na fázi prenatální, zahrnující vznik zygoty, blastogenezi, a organogenezi, porod a fázi postnatální, zahrnující dospívaní, stáří a smrt. Zygota vzniká splynutím zárodečných buněk v procesu oplození. Následuje stádium blastogeneze, které zahrnuje rýhování, tvorbu blastuly a gastrulaci (u člověka zhruba v prvních 2 týdnech). Výsledkem je vznik zárodku tvořeného 3 zárodečnými listy, ektodermem, entodermem a mesodermem. Následuje stádium organogeneze, ve kterém se tvoří základy jednotlivých orgánů. U savců rozlišujeme v prenatálním období fázi embryonální (do vývoje orgánových základů) a fázi fetální (plodovou), pokračující až do porodu. U člověka je za plod považován zárodek od 9. týdne těhotenství.
Postembryonální vývoj živočichů může být tzv. přímý, kdy zárodek má při narození již hlavní charakteristické znaky tělesné stavby rodičů (předpokladem je větší množství žloutku, ochranné obaly, nebo přívod živin z mateřského organizmu jak tomu je u plazů, ptáků a savců) nebo nepřímý, vývoj s tzv. vývoj s proměnou (metamorfózou), kdy zárodek se svou základní tělesnou stavbou od rodičovských organizmů velmi liší a získává je až později tzv. proměnou (metamorfózou). Zárodek- larva, však je schopná samostatného života. U některých živočichů opouštějí larvy vajíčko ještě ve stavu blastuly nebo gastruly (viz níže). Larvy se dělí na tzv. primární (fylektické) a sekundární (hmyz). Larvy procházejí proměnami, metamorfózou, která je buď tzv. evolutivní, nekrobiotická nebo regresivní. U hmyzu jsou stádia larválního vývoje (instary) oddělena svlékáním, řízeným hormony, produkovanými neurosekretorickými buňkami mozku (aktivační hormon, svlékací hormon-ekdyzon a juvenilní hormon). Více ve speciální zoologii.
6.1 NEPOHLAVNÍ ROZMNOŽOVÁNÍ Při nepohlavním (asexuálním) rozmnožování vzniká nový jedinec ze somatických buněk mateřského organizmu mitotickým dělením. Nepohlavní rozmnožování je dominantní způsob rozmnožování u jednobuněčných a některých primitivních mnohobuněčných živočichů. Při nepohlavním rozmnožování nedochází k tvorbě a splývání gamet. Ze zhruba 3 milionů živočišných druhů se jich výhradně nepohlavně rozmnožuje jen asi 1 tisíc. Zhruba 15 tisíc druhů střídá rozmnožování nepohlavní a pohlavní. Výsledkem nepohlavního rozmnožování je potomstvo geneticky identické s mateřským organizmem. 125
Omezuje se tak různorodost potomstva, což může mít negativní dopad na jeho adaptaci a přežívání při nepříznivé změně okolních životních podmínek. Výhodou je rychlejší způsob množení, jakož i to, že tento způsob rozmnožování může probíhat i při řídké populační hustotě jedinců. Vyžaduje optimální okolní podmínky. Při jejich změně často přechází v rozmnožování pohlavní (viz níže). Protozoa Tzv. ekválním dělením vznikají noví jedinci stejné velikosti. Dělením inekválním (pučením) vzniká dceřiný jedinec, který je podstatně menší (u přisedlých nálevníků) a který nese jeden mitoticky rozdělený mikronukleus a odškrcenou část makronukleu. Tzv. binární dělení probíhá v rovině podélné (bičíkovci) nebo příčné (nálevníci). Při dělení mnohonásobném se opakovaně dělí jádro bez bezprostředního dělení cytoplazmy rodičovského organizmu. Vzniká vícejaderné plazmódium, které se posléze rozpadá na jednojaderné buňky. Vznikat mohou takto vegetativní formy organizmu (schizogonie), spory (sporogonie) nebo gamety (gamogonie). Metazoa Nepohlavní rozmnožování se vyskytuje především u bezobratlých živočichů. Dělení (fisiparie) je většinou příčné a může mít mnoho podob, určovaných pozdějším vývojem dceřiného organizmu. Nový jedinec se může oddělit buď v kterémkoliv místě mateřského organizmu nebo v určité, tzv. blastogenní, zóně. V tomto případě je nový jedinec vybaven všemi orgány již před oddělením od organizmu mateřského. Proces se označuje jako paratomie (hvězdice, polypovci). V předchozím případě, výstavba nového organizmu je dokončena až po jeho oddělení a proces se označuje jako architomie (ploštěnky a někteří kroužkovci). Zvláštní formou příčného dělení je strobilace (medúzovci), při kterém dochází k odškrcování nových buněk vznikajících příčným dělením na apikálním konci rodičovského organizmu. Při schizogenezi vzniká celá skupina nových jedinců (zooidů), kteří jsou dočasně navzájem spojeni. Při metamerické disociaci se tělo mateřského organizmu rozpadne do skupiny článků, z nichž vznikají noví jedinci (máloštětinatci). Při polyembryonii se rýhující vajíčko nebo blastula rozpadne do vícero blastomer, z nichž každá dá vzniku novému jedinci (někteří žahavci, máloštětinatci, blanokřídlý hmyz, pásovci, výjimečně i člověka- vznik tzv. jednovaječných dvojčat). Podélné dělení (lacerace), je málo časté (sasanky).
Pučení (gemiparie) je rozšířenějším a velmi rozmanitým způsobem nepohlavního rozmnožování vícebuněčných bezobratlých. Mateřský jedinec si při tom zachovává svou základní organizaci. Pučení může být tzv. vnější (gematio) nebo vnitřní (gemulatio). Dceřiní jedinci mohou zůstat v trvalém spojení a vytvořit kolonii (např. trubýši). Při množení rozpadem, fragmentaci (např. živočišné houby, pásnice, sasanky aj.) se od rodičovského organizmu oddělují části těla, které se pak vyvíjejí v samostatné jedince, přičemž individualita mateřského organizmu zůstává zachována. Více o nepohlavním rozmnožování v předmětu Bezobratlí. Nepohlavní formou rozmnožování je i vznik jednovaječných dvojčat člověka (z prvních 2 blastomer vytvořených mitotickým dělením se vytvoří 2 samostatní jedinci). Viz polyembronie shora.
126
6. 2 POHLAVNÍ ROZMNOŽOVÁNÍ
sex nejen pro radost
6.2.1 Evoluční a adaptační význam Při pohlavním (sexuálním) rozmnožování nový jedinec vzniká splynutím dvou odlišných zárodečných buněk, samčí a samičí gamety, za vzniku zygoty. Pohlavní rozmnožování umožňuje vznik potomstva s větší genotypovou i fenotypovou variabilitou, což zvyšuje adaptabilitu a tím i šanci živočišného druhu na přežití. Variabilita potomstva je podmíněna náhodností (i) kombinace rodičovských organizmů i (ii) gamet účastnících se vzniku zygoty, (iii) přesuny genetického materiálu při tvorbě zárodečných buněk redukčním dělení- meióze (výměna částí chromatid v průběhu tzv. crossing-over prvního meiotického dělení a náhodný rozchod homologních chromozomů, tzv. independent assortment na konci prvního meiotického dělení, viz níže). Pohlavní rozmnožování v plném slova smyslu se vyskytuje jen u mnohobuněčných, i když některé prvky tohoto procesu se vyskytují i u prvoků (gametogamie a gamontogamie, viz předmět Bezobratlí) 6.2.2 Tvorba gamet, gametogeneza
(obr. 53, 55, histologická příloha P,Q)
Gamety jsou speciální haploidní buňky tvořené mnohobuněčnými živočichy za účelem pohlavního rozmnožování. Jsou produkované zárodečnými žlázami (gonádami): varlaty – testes u samců a vaječníky – ovárii u samic. Zárodečné žlázy jsou primárním pohlavním znakem živočichů. Živočichové mající gonády pouze jednoho pohlaví se označují jako gonochoristé. Nositelé obou typů gonád jsou hermafrodité (viz níže kap. 6.2). Gametogeneza probíhá u obou pohlaví ve třech fázích: (i) (ii) (iii)
fáze rozmnožovací (mitotické dělení primordiálních oogonií spermatogonií) fáze růstová (zvětšování objemu cytoplasmy, vznik primárních spermatocytů a oocytů) fáze zrání (vznik haploidních sekundárních spermatocytů a oocytů.
V procesu spermatogeneze vznikají 4 zralé spermatocyty, v procesu oogeneze jeden zralý oocyt (ootida, vajíčko) a 3 malé pólové buňky. Zralé gamety se u jednotlivých druhů živočichů morfologicky liší tvarem, velikostí i některými stavebními prvky. Vajíčka se rovněž liší množství žloutku a jeho rozložením v buňce, stavbou obalů a determinovaností další diferenciace blastomer. Viz níže druhové rozdíly gamet. Zatímco ootida je po druhém meiotickém dělení zralou vaječnou buňkou, spermatidy musí projít dalším procesem diferenciace, tzv. spermateliozou. V průběhu spermateliozy spermatocyt ztrácí většinu cytoplasmy a tvoří se typická morfologie spermie : hlavička s kondenzovaným chromatinem jádra a akrozomálním váčkem na předním pólu jádra, krček s mitochondriemi a bičík s bazálním tělískem – derivátem centrioly). Akrozomální váček (syn. akrozom, řecky akron = koncový vrchol) je derivátem Golgiho aparátu a obsahuje granula s hydrolytickými lysozomálními enzymy, které se uplatňují při oplození vajíčka (viz níže). Druhové rozdíly viz níže.
127
Spermatelioza u savců probíhá v kontaktu a pod kontrolou Sertoliho buněk v semenotvorných kanálcích. Proces spermatogeneze probíhá ve všech shora uvedených fázích po celou dobu života, počínaje pohlavní dospělostí. Proliferační fáze oogeneze probíhá u některých živočišných druhů (savci) již v embryonálním období života a neopakuje se. U člověka je to v 7. – 8. měsíci embryogeneze. Dle novějších poznatků však proliferace oogonií může probíhat u savců v jisté míře i v dospělosti. V embryonálním období probíhá i růstová fáze oogeneze a vajíčka vstupují i do prvního stádia fáze zrání, profáze I. Proces zrání se však v profázi I zastavuje a pokračuje až v období pohlavní dospělosti. Končí v klimakteriu. Počet vajíček, která současně dozrávají se u různých druhů liší. Konečné zrání vajíček má zpravidla cyklický charakter (měsíční cyklus u člověka) řízený hypotalamem. U některých druhů probíhá jen v jistých ročních obdobích (říje, estrus). Zrací fáze zárodečných buněk má 2 fáze: Meiosu I a meiosu II (obr.53). Meiosa I, tzv. dělení heterotypické. Meiose I předcházející interfáze je podobná interfázi mitotického dělení. Replikace DNA (cca 5%) končí u některých species až v profázi I. Proto se uvádí, že často chybí typická G2 fáze. Dělení jádra se od dělení mitotického liší svým průběhem i výsledkem. Profáze I, má 5 stádií: Leptotene: Rozpadá se jadérko a jaderná blána, formují se dlouhé a tenké chromozomy Zygotene: tvoří se páry homologních chromozomů, tzv. bivalenty (syn. tetrády tj. čtyř-chromatidové struktury, spojené synaptonemálním komplexem v místě centromer Pachytene: kondenzují a zkracují se chromozomy, výměna části chromatid – crossing-over (místo překřížení zv. chiasma Diplotene: chromozomy se opět oddalují, zůstávají však spojeny v chiasmatech Diakineze: další kondenzace chromozomů, chiasma se posunuje na jejich konce, mizí jaderná blána). Metafáze I: tetrády se posunují a uspořádávají do ekvatoriální roviny , tvoří se mitotické vřeténko. Anafáze I: oddělení chromozomů z bivalentů a náhodný rozchod homologních chromozomů k pólům buňky. Telofáze I a cytokineze I: dokončení heterotypického dělení, vznik haploidních sekundárních oocytů a spermatocytů (s polovičním počtem chromozomů, tvořených však stále 2 chromatidami). Nondisjunction –Důsledky poruch rozchodu chromozomů v meiose I. http: en.Wikipedia.org The normal separation of chromosomes in Meiosis I or sister chromatids in meiosis II is termed disjunction. When the separation is not normal, it is called nondisjunction. This results in the production of gametes which have either more or less of the usual amount of genetic material, and is a common mechanism for trisomy or monosomy. Nondisjunction can occur in the meiosis I or meiosis II, phases of cellular reproduction, or during mitosis. This is a cause of several medical conditions in humans:
128
Down Syndrome - trisomy of chromosome 21 Patau Syndrome - trisomy of chromosome 13 Edward Syndrome - trisomy of chromosome 18 Klinefelter Syndrome - extra X chromosomes in males - ie XXY, XXXY, XXXXY Turner Syndrome - atypical X chromosome dosage in females - ie XO, XXX, XXXX XYY Syndrome Supermale - an extra Y chromosome in males
[ Meiosa II, tzv. dělení homeotypické. Spočívá v mitotickém rozdělení chromatid do dceřiných buněk, chybí typická interfáze vč. bez replikace DNA. Výsledkem meiosy jsou 4 haploidní gamety u samců a 1 gameta a 3 pólové buňky u samic. Morfologie samčích a samičích gamet. Nejsou-li gamety odlišeny velikostí a tvarem hovoříme o isogametii. V opačném případě o anisogametii. Gamety samičí bývají zpravidla větší (makrogamety), gamety samčí menší (mikrogamety) Zralé samičí gamety. Vajíčka- oocyty Vajíčka různých druhů živočichů se liší: a. velikostí: U ptáků dosahuje až několik desítek centimetrů, zatímco u savců pouze mikrometrů. b.množstvím žloutku: vajíčka polylecitální- vysoký obsah, v. oligolecitální-malý obsah a vajíčka alecitální (velmi malý až žádny obsah žloutku, c. polohou žloutku: vajíčka izolecitální- žloutek je rovnoměrně rozložený, vajíčka heterolecitální- nerovnoměrně rozložený žloutek, vajíčka telolecitální- žloutek je nahromaděn na jednom pólu (pól vegetativní), vajíčka centrolecitální-žloutek je ve středu vajíčka. d. primárními obaly: plazmatická membrána a její ekvivalent vitelinní membrána u ptáků, zona pellucida u savců, chorion u ryb apod. e. sekundárními a terciárními obaly, vznikajícími činností okolních buněk a přídatných pohlavních orgánů pohlavní (rosolovité obaly u obojživelníků, chitinový obal u hmyzu, bílek, papírová blanka a skořápka u ptáků, vrstva folikulární buněk u savců f. stupněm determinovanosti dalšího směrování vývoje jednotlivých oblastí cytoplasmy vajíčka a prvních blastomer (vajíčka mosaiková, determinační a indeterminační, viz níže) Zralé samčí zárodečné buňky. Spermie . Spermie vznikají v konečné fázi spermatogeneze procesem zv. spermatotelióza. Je to proces probíhající v interakci se Sertoliho buňkami semenotvorných kanálků, především membránových bílkovin zrajících spermií a Sertoliho buněk, řízených testosteronem, tvořeným Leydigovými intersticiálními buňkami varlete.
129
Ztralá spermie je tovřena hlavičkou, krčkem a bičíkem.. Hlavička je tvořena převážně haploidním jádrem na jehož předním pólu je tzv. akrozomální váček V průběhu spermateliózy se kondenzuje chromatin, mění se jeho bílkoviny (tvoří se protaminy a pozměňují histony). Většina cytoplazmy je odvržena s vyjímkou Golgiho aparátu, který se přesunuje na přední pól jádra v podobě tzv. akrozomálního váčku. Ten obsahuje lysozomální hydrolázy, které se aktivují při kontaktu s obaly vajíčka (akrozomální reakce). Tvar hlavičky se u různých živočišných druhů liší. Je např. ovoidní u člověka a prohnutě kopínatý u malých hlodavců. U bičíkatých spermí, které jsou u u obratlovců, i většiny bezobratlých, se tvoří zpravidla jeden bičík, obsahující mitkrotubuly v typickém uspořádání („9x2+1x2 ve středu) a dyneinu, vyrůstající z jedné ze dvou centriol.. Oblast krčku spirálovitě obklopují mitochondrie, které jsou zdrojem ATP pro vlnitý pohyb bičíku. 6. 2. 3 Determinace pohlaví
Who is who (a proč?)
U většiny živočichů rozmnožujících se pohlavně je pohlaví určeno (determinováno) genotypově (chromozomálně), pohlavními chromozomy (syn. gonozomy). U savců je to párem nestejných chromozomů XX u samic a XY u samců (typ Drosophila, syn. typ savčí ). U ptáků, motýlů, některých ryb a obojživelníků, jsou určující chromozomy ZW u samic a ZZ u samců (typ ptačí, syn typ Abraxas, Abraxas glosulariata = motýl píďalka morušová). U rovnokřídlého hmyzu má samčí pohlaví jen jeden chromozom (X0 samci, XX samic, typ Protenor), příp. jsou rozdíly v počtu chromozomálních sad (samice 2n, samci 1n, typ Habrobracon). U některých druhů je pohlaví určeno až epigeneticky, tj. tvorba samčích či samičích gamet je dána vlivem vnějších podmínek (zdroje potravy, stupeň vlhkosti aj.) nebo polohou prekurzorových pohlavních buněk v těle, fyziologickým stavem organizmu, aktuální velikostí živočicha, ektohormony apod. Genotypovou determinaci mužského pohlaví u člověka zajišťuje SRY gen na krátkém raménku Y chromozomu (zkratka odvozena od Sex Region on Y). Účastní se však i některé další geny (viz níže). SRY gen byl objeven v r.1990. Pokud se SRY uměle zavede do oplodněného vajíčka, vždy se z něj vyvine samec, i když jeho rýhovaná buňka nesla dva chromozomy X. To byl případ myšího samce Randy, který měl dva X chromozomy, čili byl geneticky samicí, ale choval se jako samec a samice ho jako samce braly. Jediným navenek patrným rozdílem vůči jiným samcům byla menší varlata, ale ve styku se samicemi byl převelice čilý, kopuloval až šestkrát denně. Později byly objeveny i další geny, které se účastní procesu determinace pohlaví DAX1-kontroluje tvorbu ovárií, SOX9- v kombinaci s SRYdeterminuje vývoj testes, WNT4 potlačuje vývoj testosteron produkujících Leydigových buněk a je lokalizován dokonce na chromozomu 1. Viz např. http://www.biologie.uni-mburg.de/bonline/library/cat-removed/graves.htm http://home.vicnet.net.au/~aissg/the_scientist.htm.l) Pro správný vývoj samčích pohlavních orgánů lidského embrya je kritický 7. týden života, kdy aktivace exprese SRY genu na chromozomu Y vede k vývoji varlat. Po aktivaci SRY genu se z varlat začne vylučovat testosteron, který zajišťuje formování přídatných pohlavních orgánů. Na objevu genu SRY měl svůj podíl francouzský vědec, který zkoumal příčiny neplodnosti dvou mužů. Ke svému velkému překvapení zjistil, že oba mají v genomu dva chromozomy X (tedy jako ženy). V jednom X z jejich páru objevil malý fragment chromozomu Y s genem SRY. To embryu stačilo, aby se vyvíjelo v muže i přes přítomnost páru XX chromozomů. Co ale oba muži neměli, byly další geny řídící tvorbu spermií. Více na http://www.katedrala.cz/netem/article.php?sid=524. Tato poruch je vzácná (1: 20 000 mužů). Častější jsou hrubší změny v gonozomech člověka. Např. ženy s gonozomy X0 trpí tz. Turnerovým syndromem. Muži s gonozomy XXY syndromem Kleinfelterovým. O těchto a dalších poruchách více v kurzu Obecná patobiologie.
V současnosti je známo více genů, které determinují pohlaví a přídatné pohlavní orgány u různých živočišných taxonů. Více v Mol. Biol.
130
6.2. 4 Sexuální dimorfismus U gonochoristů je gonáda samčí v jiném jedinci, než gonáda samičí. U hermafroditů (obojetníků) jsou gonády obojího typu neseny tímž jedincem. Výlučnými gonochoristy jsou hlavonožci, členovci, ostnokožci a obratlovci. Výjimku představují některé hermafrodické ryby. U hermafroditů se spermie a vajíčka mohou vyvíjet v oddělených žlázách, někdy však v jediné (ovotestis). Ve všech případech však existují mechanismy, které zabraňují oplození vajíček vlastními spermiemi (autofekondaci). Gonochorismus je zpravidla provázen dalšími znaky sexuálního dimorfismu (není patrný např. u málo pohyblivých přisedlých bezobratlých). Dimorfismus je výsledkem působení pohlavních hormony vylučovaných gonádami, které podmiňují vývoj sekundárních pohlavních znaků (rozdíly v morfologii pomocných pohlavních orgánů, velikosti těla, utváření kostry, množství svalové hmoty, ochlupení, orgánech sloužících k páření, péči o potomstvo, signálních znacích, zbraních, atp.). Druhotné pohlavní znaky mohou být přítomny trvalé nebo se periodicky objevovat v období rozmnožování (svatební šat, tance, mateřské instinkty aj.).
6. 2. 5 OSEMENĚNÍ A OPLOZENÍ (obr.54 A)
Na počátku je ..
Proces osemenění má zajistit přiblížení samčích a samičích gamet do vzájemné blízkosti. Osemenění může být vnější (ryby, obojživelníci a další) nebo vnitřní (savci aj.). Vnitřnímu osemenění slouží přídatné pohlavní orgány a dochází k němu počas páření (syn. kopulace, koitus). Rovněž následné oplození vajíčka může být zevní nebo vnitřní. V procesu oplozování (fertilizace) se spermie při kontaktu s látkami vylučovanými vajíčkem aktivují (kapacitace spermií), což se projeví zvýšením jejich pohyblivosti a aktivací hydrolytických enzymů v akrozomálním váčku. Předpokadem oplození je navázání se spermie na druhově specifický receptor v zoně pellucida (molekuly ZP3, ZP2). Následuje akrozomální reakce (uvolnění hydrolytických enzymů z akrozomálního váčku), kterou se rozruší proteinové a glykanové obaly vajíčka, což umožní se přiblížení a fúzi PM obou typů gamet. Toto spojení zajišťuje speciální protein PM hlavičky spermie, tzv. fertilin (blízký svou strukturou fúzním proteinům virů, které umožňují proniknutí virů do buněk), který se musí specificky spojit s jeho integrinovým receptorem v PM vajíčka. Tím je zajištěna druhová specifika oplození. U obratlovců musí spermie nejprve ještě překonat obal folikulárních buněk uvolněných s vajíčkem při ovulaci. Rozvolnění této přékážky se uksutečňuje enzymem hyaluronidázou. Po fúzi PM obou gamet dojde k vniknutí hlavičky spermie do vajíčka. Prvojádro samčí a samičí splynou a vytvoří diploidní zygotu. Oplození 1 vajíčka se u většiny živočichů účastní pouze 1 spermie. Vniknutí většího počtu spermií do vajíčka (polyspermie) zabraňuje: (a) depolarizace PM vajíčka, ke které dojde okamžitě po fúzi PM obou gamet (tzv. rychlý, elektrický blok polyspermie) (b) oplozovací membrána (trvalý blok polyspermie), která vzniká přestavbou zóny pellucidy vajíčka. Spočívá v jejím "zpevnění" a inaktivaci rozpoznávacích receptorových proteinů (viz ZP2 a 3 shora). Proces je provázen exocytozou tzv. kortikálních granul z vajíčka, spuštěnou receptorově zprostředkovaným zvýšením inositoltrifosfátu (viz 131
sekundární posli, kap. 3.4) a přechodným zvýšením koncentrace kalciových iontů v cytozolu vajíčka (uvolněných z hl-ER) . Z kortikální granul uvolněné glykosylaminoglykany vytvoří hyperosmotické prostředí, čímž se prostor mezi PM vajíčka a zonou pellucidou osmoticky hydratuje, což představuje novou překážku průniku spermií k vajíčku.
U oligolecitálních vajíček může vniknout spermie kdekoliv, u telolecitálních v oblasti animálního pólu, u některých vajíček s pevným obalem pak otvůrky, zv. mikropyle. Vývoj vajíčka bez účasti spermie, tzv. partenogeneza, se vyskytuje u přisedlých a parazitických bezobratlých, kde je malá hustota populace a malá pravděpodobnost setkání gamet opačného pohlaví nebo u některých druhů jako rychlá forma množení za příjemných podmínek (viz předmět Bezobratlí). Partenogeneze u žraloka a varanů komodských. J.Robovský, Vesmír 86, 477, 2007/8 Partenogeneze – schopnost živočichů rozmnožovat se z neoplozených vajíček – je známá pouze asi u 70 obratlovců (například u pozoruhodných kavkazských ještěrek) a považuje se za vzácný jev. V poslední době však byla popsána u dalších dvou obratlovců, nejprve u velkého ostrovního varana komodského z jedné britské zoo a nejnověji také u kladivouna tiburo (Sphyrna tiburo) ze zoo v Nebrasce. Protože v obou případech existovala i možnost, byť málo pravděpodobná, že si samice skladovaly spermie po léta, bylo nutno partenogenezi potvrdit molekulárními analýzami. Ukázalo se, že mláďata skutečně mají partenogenetický původ. Do budoucna jistě bude zajímavé sledovat, u kterých dalších obratlovců se partenogeneze objeví, popř. jak moc a za jakých okolností byla či je těmto zvířatům užitečná (mohla se osvědčit třeba při osídlování ostrovů apod.). Ačkoli byla zaznamenána už také u jiných varanů, v rámci paryb jde patrně o její první prokázaný výskyt. (http://news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/6196225...., http://news.bbc.co.uk/2/hi/science/nature/6681793....)
Cytoplasma oplozeného vajíčka rotuje směrem k místu kde vnikla spermie. Na rozhraní animálního a vegetativního pólu dojde tím k posunu pigmentových granul, které jsou pod povrchem PM. Odhalí se méně pigmentovaná výseč, tzv. šedý srpek, které je místem budoucí hřbetní strany zárodku. V místě protilehlém (tj. oblasti vniknutí spermie) pak se vytvoří strana břišní. Molekulární mechanizmy tohoto procesu …………v přípravě..
6. 3 BLASTOGENEZE Blastogeneze zahrnuje vývoj oplodněného vajíčka od splynutí jader zralého vajíčka a spermie (zygota) do stadia gastruly, tvořené u Triblastik 3-mi zárodečnými listy. U člověka trvá toho období zhruba 3 týdny. Blastogenezi dělíme do několika fází, označovaných jako rýhování vajíčka, tvorba blastuly-( „blastulogeneze“- nepoužívaný termín) a gastrulace. Tyto procesy mají u většiny živočichů mnohé společné rysy. Podle tzv. Haecklova pravidla je „Ontogeneze zkrácené opakování fylogeneze“, což je však v poslední době kritizováno jako přílišné zjednodušení. http://en.wikipedia.org/wiki/Recapitulation_theory
6. 3. 1 RÝHOVÁNÍ (obr. 54 B) Zygota, která vznikla splynutím samčího a samičího prvojádra, se mitoticky dělí, rýhuje. Buňky, které vznikají, blastomery, Velikost oplozeného vajíčka se však příůiš nemění, takže blastomery jsou stále menší. Průběh rýh je určován polohou mitotického vřeténka. Proces rýhování je ovlivňován množstvím a distribucí žloutku, jehož větší nahromadění, představuje překážku rýhování. Vajíčka s malým množstvím žloutku (oligo- a isolecitální) rýhující se celá, se označují jako holoblastická. Vajíčka s velkým množstvím žloutku, u kterých se rýhuje jen oblast animálního pólu obsahující zygotické jádro, se označují jako meroblastická. V oblasti 132
animálního pólu tohoto typu vajíček se rýhováním vytvoří zárodečný terčík, ve kterém vytvoří základ těla organismu (viz níže). Rýhování, které vede ke vzniku blastomer se zcela oddělenou cytoplazmou se označuje jako celkové (totální). V případě, že blastomery jsou stejně velké, je to rýhování totální a ekvální (vajíčka hub, žahavců, placentální savců, ostnokožců). První a druhá rýha probíhají souběžně s vegetativně-animální osou zárodku, tj. podélně (tzv. meridionální rýhy). Tím se zygota rozdělí na 4 blastomery. Jejich příčným rozdělením, tzv. rýhou ekvatoriální (tj. kolmo na předchozí meridionální rýhu), vzniká 8 blastomer. Dalšími opakovanými děleními vzniká kompaktní morušovitý mnohobuněčný útvar, morula. Rýhování totální inekvální vede ke vzniku moruly, ve které jsou některé blastomery jsou relativně menší (mikromery na pólu animálním a makromery na pólu vegetativním např. u obojživelníků). Rýhování parciální (částečné, syn. terčíkovité, diskoidální) se vyskytuje u vajíček s větším množstvím žloutku (vajíčka poly- a telolecitální). Jeho výsledkem je nerozrýhovaná část obsahující žloutek a rýhováním vytvořený plochý terčík, blastodisk, který leží na žloutkové mase a ze kterého se vyvíjí vlastní zárodek (plazi, ptáci, hlavonožci). Při povrchovém (superficiálním, hmyz) rýhování se nově vznikající jádra neoddělují plazmatickou membránou. Rýhování radiální (paprsčité) je charakterizován střídavě meridionálně a equatoriálně probíhajícími rýhami a zárodek má proto radiální symetrii (žahavci, houby a ostnokožci). Dalšími typy rýhování je rýhování bilaterální (pláštěnci), disymetrické (žebernatky) a spirální (kroužkovci, měkkýši). Viz předmět speciální zoologie. Při rýhování determinačním odstranění jedné blastomery vede k chybění části těla, pro kterou byla blastomera určena (determinovaná). Při rýhování indeterminačním je defekt kompenzován ostatními blastomerami.
6. 3. 2 TVORBA BLASTULY (Obr. 54 B, 56 A) Uvnitř moruly se vytvoří dutina (blastocel, prvotní tělní dutina) a vzniká další vývojové stádium, blastula. Blastula je tvořena blastodermem s epiteliálně uspořádanými buňkami v jedné nebo více vrstvách, obklopujících blastocel. Dle polohy blastocelu, lze blastuly rozdělit do několika skupin. (i) Archiblastula: centrálně uložený velký blastocel, (ii) Amfiblastula: blastocel je menší a je posunut k jednomu pólu vajíčka, (iii) Diskoblastula: blastocel je štěrbinovitý a silně zatlačen k jednomu pólu, (iv) Sterroblastula nebo též periblastula: blastoderm (periblast) obklopuje nerozrýhovaný žloutek, např. při superficiálním rýhování centrolecitálních vajíček hmyzu) (v) Blastocysta s dutinou zv. lecitocel (placentální savci): je tvořená vnitřní masou buněk, embryoblastem (budoucí tělo zárodku) a vnější masou buněk –trofoblastem, základu placenty. Osud jednotlivých blastomer je u vajíček mozaikových (rýhování determinační) od počátku předurčen (determinován) k vývoji určitých částí zárodků (obojživelníci). 133
U vajíček regulačních je rýhování indeterminační, tj. blastomery jsou determinovány až později. Odstranění části blastomer u těchto zárodků pak nevede k vývoji neúplného jedince, je pouze menší (žahavci, obratlovci).
6. 3. 3 GASTRULACE (obr. 56 B,C) Gastrulace je proces, v průběhu kterého dochází k reorganizaci blastodermu, která vede k vytvoření dvou (Diblastika, houby žahavci a žebernatky) až 3 zárodečných listů (triblastika, většina živočichů): ektodermu (vnější list), entodermu (vnitřní list, angl. syn. endoderm) a mezodermu (list střední, syn. mezoblast). Mezi ekto- a entodermem diblastických živočichů se může vyskytovat nebuněčná, průzračná, inertní gelatinosní substance, tzv. mesogela, která poskytuje mechanickou oporu tělu ve vodním prostředí.
U vajíček s totálním rýhováním začíná proces gastrulace vchlipováním blastodermu budoucí hřbetní strany blastuly do blastocelu. Vchlípenina, resp. její vstupní otvor, se označuje jako tzv. prvoústa (blastoporus). Vchlipením se vytvoří dvojvrstevný útvar, jehož zevní list představuje ektoderm a vnitřní entoderm. Dutina obklopena entodermem představuje prvostřevo (archenteron). Blastoporus zůstává otvorem ústním u tzv. prvoústých živočichů - Prostomií (např. ploštěnci, hlísti, kroužkovci, členovci), U druhoústých-Deuterostomií blastoporus zaniká a v jeho blízkosti vzniká otvor řitním. Otvor ústní se u těchto živočichů prolamuje později během ontogeneze v hlavové čáti (ostnokožci, postrunatci, strunatci).
Buňky v oblasti dorsálního rtu blastoporu jsou velmi aktivní. Dělí se a migrují do dutiny blastuly, kde vytváří endodermální list a dutrinu prvostřeva (gasrulace, viz níže). Některé vcestovávájí mezi i ekto- a entoderm a diferencují se v buňky mesodermální (viz níže), V r. 1920 Spemann a spol. prokázali na zárodcích obojživelníků, že transplantace dorsálního rtu na břišní stranu zárodku tam indukuje atopickou gastrulaci a následnou tvorbu hřbetní strany organizmu, vč. tviorby neurální trubice. Dorzální ret blastoporu se proto označuje jako tzv. primární (Speemanův) organizátor (též primární induktor), a proces, který vyvolává jako primární embryonální indukce. U živočichů vyvíjejících se telolecitálních vajíček (viz níže), se inekválním rýhováním na animálním pólu vytváří čepička blastomer, tzv. zárodečný terčík. Dorzálnímu rtu blastoporu zde odpovídá tzv. Hensenův uzel, což je malé knoflíkovité ztluštění na konci rýhy, která prochází podélně-předozadně, středem zárodečného terčíku, resp. primitivního proužku. Imigrací buněk z tohoto místa se postupně vytváří endoderm a mezoderm. Zárodečný terčík ptačího vajíčka je při pohledu shora tvořen střední tmavší oblastí (area pellucida) a světlejší periferií (area opaca).Area pellucida je vlastní blastoderm, ze kterého se vyvíjí tělo zárodku. Za indukci hřbetní strany zárodku (notogeneze) odpovídají molekuly sekretované z buněk dorzálního rtu. Jejich účinek spočívá v inaktivaci růstovového faktoru BMP-4 (kostní morfogenetický protein 4, Bone Morphogenetic Protein 4), který určuje vývoj břišní strany zárodku. Podobné indukční mechanizmy byly zjištěny i v jiných oblastech zárodku. Např. při pozdější tvorbě očních plakod, induktivní molekuly vylučované z neurální oční výchlipky základu mozku, indukijí přeměnu přilehlých povrchových ektodermálních buněk na buňky čočky. Jsou označovány jako sekundární indukce.
Proces gastrulace probíhá zárodků různých živočišných druhů několika různými způsoby. Závisí na typu vajíčka a blastuly.
134
Hlavní způsoby gastrulace jsou: (i) Invaginace- vchlipování do prvotní tělní dutiny archiblastuly (kopinatec), (ii) Epibolie - ektoderm vzniká rychlým dělením mikromer telolecitálních vajíček, které makromery postupně obrůstají a archenteron a blastoporus vznikají sekundárně (obojživelníci, ryby), (iii) Imigrace, unipolární a multipolární- vycestováním buněk z blastodermu směrem dovnitř se vytváří postupně vnitřní zárodečný list (láčkovci), (iv) delaminace-podélným rozdělením všech buněk blastodermu se vytvoří zevní a vnitřní list (někteří láčkovci, ptáci, savci vč. člověka). Mesodermální list , který je u tz. triblastik mezi ekto- a entodermem, se tvoří několika způsoby. (1) Přeměnou buněk ektodermu (proces fylogeneticky starší a méně častý, např. u primitivních žahavců) (2) Přeměnou buněk entodermu, a to vycestováním buněk ze stropu prvostřeva nebo jeho váčkovým bilaterálním paraaxiálním vychlípením. Z entodermu se mesoderm tvoří u většiny živočichů. Tento proces je nejlépe patrný u zárodků s velkým blastocelem, např. u kopinatce. Tvorba mesodermu vycestováním jednotlivých buněk začiná z oblasti horního rtu blastoporu, nebo jeho analogu, tzv. Hensenova uzlu zárodečného terčíku (ptáci některé ryby, plazi nebo blastocysta savců). Dle aktuálního mechanizmu je mesoderm označovaný jako endomesoderm nebo ektomesoderm. Materiál vchlipovaný primárně v oblasti dorsálního rtu blastoporu strunatců je základem chordy dorsalis (chordomesoderm). Na řízení tvorby mesodermu se podílí speciální molekuly-morfogeny (bílkoviny- typu růstových fakorů, především FGF, TGF-beta – activin a další molekuly kódované např. Vg1 a Wnt geny. Jednotlivé molekuly působí v časově a prostorově koordinových kaskádách . Více ve vývojové molekulové biologii. Mesoderm lze členit dle lokalizace v zárodku na osový syn.axiální, (viz též shora chordomesomderm), dále více laterálně lokalizovaný mesoderm paraaxiální, intermediární a laterální. Jak již uvedeno, z axiálního mesodermu se u strunatců tvoří chorda dorsalis, která v přiléhajícím ektodermu indukuje tvorbu základu centrální nervové soustavy. Proces začíná tvorbou neurální rýhy v ektodermu hřbetní části zárodečného terčíku. Pokračuje jejím prohlubováním a posléze uzavřením v neurální trubici, která představuje embryonální základ centrální nervové soustavy obratlovců. Mesodermální buňky postupně migrují do stran a vytváří paraaxiální, intermediární a laterální část mesodermálního listu. Paraxiální mesoderm je tvořen shluky buněk- zv. somity, které představují primární předozadní segmentaci těla zárodku U bezobratlých (členovci) se v článkovaném endomesodermu vytvářejí dutinky, coelomové váčky. Jsou naplněné tekutinou, která podpírá kožněsvalový vak a má funkci vnitřní kapalinové kostry - hydroskeletu. Ve ventrální zárodku mizí přepážky a vytváří se tzv. laterální destička (jeho další vývoj viz níže). U obratlovců lze somity rozčlenit na 3 části, resp. podskupiny buněk. Tzv. sklerotom, dermatom a myotom, ze kterých vzniká kosterní, kožní a svalová část trupu (viz níže). Tkáně těchto anatomických částí těla se tvoří z rozvolněného mesodermu, mesenchymu, obsahujícího velké množství mezibuněčné hmoty. Laterální destička (laterální mesoderm, splanchotom) je nesegmentovaná a posléze se rozestupuje ve 2 listy, somatopleuru a 135
splanchnopleuru, které uzavírají mezi sebou spojitou pravou tělní dutinu, coelom, vystlanou epiteloidně uspořádanými buňkami. Kromě shora zmíněné hydroskeletální funkce, coelom umožňuje nezávislý pohyb břišní tělní stěny na vnitřních orgánech, především zažívacího traktu a srdce. Umožňuje též složitější stavbu a prostorové uspořádání vnitřních orgánů v těle (břišní orgány např. jejich závěsem na tzv. mesenteriu-okruží, pocházejícím ze spanchnopleury) Tekutá výplň coelomu chrání srdce a gonády, umožňuje rozpínání plic pohybem hrudníku. U nižších živočišných taxonů coelom napomáhá též výměně plynů, vylučování metabolických zplodin a termoregulaci. Více ve speciálních předmětech zoologie. Poznámka. Jednodušší formou tělní dutiny je tzv. nepravá tělní dutina, schizocoel, která nemá souvislou epiteloidní výstelku, vyskytující se u prostomii. Je vyplněná parenchymem s drobnými skulinkami, kterými prostupuje tělní míza (ploštěnci, mechovnatci, pásnice). Pseudocoel je rovněž forma nepravé tělní dutiny, která se vyvinula ze schizocelu větším roztlačením tělního parenchymu. V osové části těla tak vzniká mízou vyplněná dutina mízou a u endoparazitů navíc i zplodinami anaerobního metabolizmu. Podélně touto dutinou probíhá trávicí trubice (hlísti, hlavatci).
6. 3. 4 TKÁŇOVÉ A ORGÁNOVÉ DERIVÁTY ZÁRODEČNÝCH LISTŮ Z ektodermu se vyvíjí epidermis a její adnexy, nervový systém a oční čočka. Z entodermu vznikají epiteliální výstelky vnitřních orgánů, např. zažívacího a močového traktu, játra a plíce, slinné žlázy. Ze středního listu, mesodermu, se diferencují pojivové tkáně (vaziva, kosti, chrupavky, krev, krevní a lymfatické cévy), dále hladká a kosterní kosterní svalovina, myokard, gonády, ledviny, výstelky tělních dutin a obaly vnitřních orgánů aj.. Tvorba pojivových tkání vychází z přechodné nezralé formy pojiva, mesenchymu, tvořeného rozvolněnými buňkami a velkého množství mezibuněčné hmoty. Vznik uvedených tkání a orgánů z mesodermu je pevně vázán na jeho jednotlivé shora zmíněné tělní segmenty – viz speciální embryologie
6. 4 GENETICKÉ ASPEKTY ROZMNOŽOVÁNÍ ŽIVOČICHŮ Při rozmnožování živočichů jsou předávány vlastnosti rodičovských organizmů potomkům. Dědičnost (syn. heredita) je proto jednou ze základních a klíčových vlastností, která zajišťuje zachování jednotlivých druhů organizmů počas mnoha generací (vertikální přenos genetické informace). Potomstvo vznikající pohlavním rozmnožováním však vykazuje v rámci druhu i jistou variabilitu danou především kombinací allel při oplození vajíčka, tj. vznikem zygoty z geneticky 2 odlišných zárodečných buněk a specifickými procesy provázejícími redistribuci genetického materiálu v průběhu gametogeneze (viz shora meioza). Některé geneticky podmíněné vlastnosti organizmu mohou být ovlivněny faktory zevního prostředí. Dědičnost lze proto definovat jako vědu o dědičnosti a proměnlivosti živých organizmů. Molekulární nosiče genetické informace (DNA, chromozomy, geny-vlohy, allely-vlastnosti, genom, genotyp) byly popsány v kap. 4.3. Vlastnosti přenášené geny lokalizovanými v jádře nazýváme jadernou dědičností. Některé vlastnosti organizmu jsou však přenášeny geny mitochondrií (mitochondriální dědičnost). Tyto geny se dědí pouze po mateřské linii, neboť mitochondrie spermie do vajíčka při oplození nevstupují (maternální dědičnost, matroklinita). Viz též níže. Základní zákonitosti, kterými se řídí přenos dědičných znaků kódovaných jadernými geny psal Johann Gregor Mendel na hrachu, jako rostlinném modelu v r. 1865 tj. v době kdy nebyly známy chromozomy, DNA ani zákonitosti redukčního dělení. Došel přesto ke 136
správnému předpokladu, že každá vlastnost organizmu je přenášena 2 na sobě nezávislými faktory, které jsou dnes označovány jako allely příslušného genu. U každého diploidního potomka se allelární pár skládá z jedné allely otcovské a jedné allely mateřské. Dominantní allely se označují velkými písmeny, tzv. recesivní (neprojevující se) allely písmeny malými (viz níže Aa, Bb apod.). Nositele stejných alllel (AA, BB, aa, bb apod.) apod. označujeme jako homozygoty, nositele nestejných allel (Ab, Bb, a pod) jako heterozygoty. Přenos allel na potomky podléhá základním pravidlům kombinatoriky. Tato pravidla shrnul Mendel do 3 zákonů: (1)
Zákon o stejnorodosti první filiální (F1) populace (syn. zákon o dominanci allel)
Při vzájemném křížení 2 homozygotů vznikají potomci genotypově i fenotypově jednotní. Pokud jde o 2 různé homozygoty jsou potomci vždy heterozygotními hybridy. Při křížení dvou homozygotů (dominantního - AA a recesivního - aa) vzniká jednotná generace potomků - heterozygotů se stejným genotypem (Aa) i fenotypem.
(2)
Zákon o různorodosti F2 populace (syn. zákon o segregaci allel)
Při křížení 2 heterozygotů může být potomkovi předána každá ze dvou allel (dominantní i recesivní) se stejnou pravděpodobností. Dochází tedy ke genotypovému a tím pádem i fenotypovému štěpení = segregaci. Pravděpodobnost pro potomka je tedy 25% (homozygotně dominantní jedinec) : 50% (heterozygot) : 25% (homozygotně recesivní jedinec). Tudíž genotypový štěpný poměr 1:2:1. Fenotypový štěpný poměr je 3:1, pokud je mezi allelami vztah kodominance, odpovídá fenotypový štěpný poměr štěpnému poměru genotypovému (tj. 1:2:1).
(3) Zákon o volné kombinovatelnosti allel (syn. zákon o nezávislém dědění jedné allely na allele druhé) Při zkoumání 2 allel současně dochází k téže pravidelné segregaci. Máme li 2 dihybridy AaBb může každý tvořit 4 různé gamety (AB, Ab, aB, ab). Při vzájemném křížení tedy z těchto 2 gamet vzniká 16 různých zygotických kombinací. Některé kombinace se ovšem opakují, takže nakonec vzniká pouze 9 různých genotypů (poměr 1:2:1:2:4:2:1:2:1). Nabízejí se nám pouze 4 možné fenotypové projevy (dominantní v obou znacích, v 1. dominantní a v 2. recesivní, v 1. recesivní a v 2. dominantní, v obou recesivní). Fenotypový štěpný poměr je 9:3:3:1. Tento zákon platí pouze v případě, že sledované geny se nachází na různých chromozomech, nebo je jejich genová vazba natolik slabá, že nebrání jejich volné kombinovatelnosti.
Uvedené kombinatorické zákonitosti lze zobrazit tzv. Mendelovými čtverci (syn. Punnettovy čtverce, kombinatorické čtverce (viz předmět Genetika). Přenos některých znaků se však od shora uvedených Mendelových pravidel odchyluje. Je to důsledek mitochondriální dědičnosti, nestability některých repetitivních úseků DNA tzv. genomického imprintingu ("vtisknutí", zpravidla se však nepřekládá). Více o této tzv. nonMendelianské dědičnosti v předmětu Genetika. Mitochondriální Eva ??
YcA?
Téměř 150 žen nejrůznějších ras a národností se zúčastnilo pokusu porovnávajícího jejich mtDNA…. . Programem PAUP, Phylogetetic Analysis Using Parsimony, byl sestaven pomocí výskytu a četnosti určitých mutací mtDNA pravděpodobný lidský vývojový strom. Největší rozdíly v mtDNA jsou mezi obami afrického původu. Z toho vyplývá, že tato mtDNA je nejstarší, protože při konstantní rychlosti mutací dokázala nahromadit nejvíce odchylek. V této nejstarší vývojové větvi stromu sahající do Afriky můžeme hledat ženu, po které jsme zdědili svoji mtDNA. Odvozovat, kde a kdy žila mitochondriální Eva je mnohem obtížnější než dokázat myšlenku, že někdy existovala, což v současnosti (téměř) nikdo nepopírá. O mitochondriální Evě s jistotou víme pouze, že byla žena, která měla nejméně dvě dcery, jejichž potomci přežili do dnešních dní. Rychlost mutací mtDNA je pro člověka asi 2 – 4% změn za 1 milion let. Protože největší odchylky v lidské mtDNA byly necelých 0,6%, musela mitochondriální Eva žít před 140 000 – 280 000 lety. Ve své době nebyla jediná žijící žena, ale přesto pouze její genetická linie z mnoha přežila.Tehdy pravděpodobně ve východní Africe vznikla vývojově úspěšná populace Homo sapiens, která začala postupně vytlačovat dřívější příslušníky rodu Homo nejprve v Africe a pak i ostatních částech světa. Odhadem v této zárodečné populaci žilo před 200 000 lety cca. 10 000 lidí moderního typu. Svojí expanzí nahradila potomky první migrační vlny Homo erectus, kteří se rozšířili z Afriky již před několika sty tisíci let. Homo sapiens byl ve svém tažení velmi úspěšný, neboť “vyhubil” všechny starší formy člověka a ovládnul Zemi.Základní chyba, které se autoři teorie mitochondriální Evy dopustili, byl předpoklad, že všechny mitochondrie jednoho jedince jsou stejné. Jejich článek vyšel rok před objevením prvního onemocnění způsobeného mutací mtDNA a formulování pojmů homoplazmie a heteroplazmie.Další námitka odpůrců teorie mitochondriální Evy se týká spolehlivosti “molekulárních hodin”. Kdyby autoři teorie pramatky vycházeli z asi 4 – 5 krát nižší mutační frekvence, posunul by se čas existence Evy na
137
období před 1 milionem let. To by vyřešilo problém druhé migrace z Afriky: pramatka by byla příslušnicí Homo erectus, který tehdy opouštěl Afriku a začal kolonizovat svět.Autoři teorie mitochondriální Evy použili pro srovnání mutační rychlosti mtDNA lidoopů, opic a jiných savců, které jistě více odpovídají rychlostí mutace lidské mtDNA, než nízké mutační rychlosti některých druhů ryb, o které se opírali oponenti.Jiná skupina odpůrců poukázala na fakt, že změny mitochondriálního genomu mohou být podstatně rychlejší. Správnost časových odhadů A. C. Wilsona a jeho teamu zpochybňuje heteroplazmií. Heteroplazmie by změnila pohled na minulost. Podle nové kalkulace by mitochondriální Eva žila před neuvěřitelnými 6000 lety. Toto číslo odporuje všem historickým poznatkům (kromě Bible). Také by se zkrátila doba osídlení Evropy i dalších kontinentů. Protože tyto propočty zjevně nejsou reálné, je možné, že “mitochondriální hodiny” by v průběhu času změnily (zrychlily) svůj rytmus.Někteří paleoantropologové zpochybňují teorii mitochondriální Evy a rozšíření jejích potomků, protože nebyly objeveny žádné nálezy dokazující migraci člověka moderního typu z Afriky a vyhubení starých populací v době asi před 200 000 lety.Tuto hypotézu vyvracejí sérií kosterních nálezů z určitých oblastí (jmenovitě např. Čína), dokazujících postupný vývoj místních populací směrem k modernímu člověku. Představa, že by nově příchozí vyhubili své předchůdce bezezbytku, není snadno pochopitelná, natož proveditelná. Takový jev se objevuje velmi zřídka. Spíše se populace alespoň částečně smísí nebo dokonce splynou. Zastánci teorie mitochondriální Evy tvrdí, že by v případě smísení populací zvláště v okrajových oblastech, kam by noví emigranti z Afriky přišli zřejmě nejpozději (například východní Asie), musely přetrvat některé linie mtDNA podstatně starší než 200 000 let. Speciální výzkum mtDNA obyvatel východní Asie nic takového nepotvrdil. Odpůrci teorie mitochondriální Evy také zpochybnili funkci programu, pomocí kterého byla zpracovávána získaná data…….. Dosud tedy neznáme optimální vývojový strom mtDNA. Přesto o starobylosti afrických mtDNA svědčí především největší procento odchylek mezi nimi. Je o polovinu větší než u asijských mtDNA a dvakrát větší než mezi australskými nebo evropskými mtDNA.Je možné, že potomci jedné ženy žijící ve zmíněném období se rozptýlili a smísili se svými sousedy. Shodou nejrůznějších okolností její dcery a dcery jejich dcer pronikaly do dalších populací a vytlačovaly potomstvo dalších žen – současnic své pramatky. Během 200 000 let se mohlo vystřídat kolem 12 000 generací, což je dostatečně dlouhá doba pro převládnutí na celém světě. Toto šíření mtDNA by nevyžadovalo kompletní vyhubení starých populací nově příchozími. Existence mitochondriální Evy není tedy pouze teorie, ale matematický fakt. Y-chromosomový Adam Protože pouze muži mohou přenést chromozom Y, je možno definovat také Adama ). Existuje mnohem méně variací chromozomu Y než mutací mitochondrií (samozřejmě vezmou-li se v úvahu jejich různé mutační frekvence). To znamená, že poslední společný předchůdce mužů, Y-chromosomový Adam (značí se “YcA”), žil mnohem později než mitochondriální Eva. Je datován do období před 27 000 lety (další zdroje uvádějí 37 000 – 49 000 let a dokonce až před 188 000 lety [V-25]). Rozmnožení pouze jedné linie bylo způsobeno pohlavní selekcí ovlivněnou ekonomickým postavením jedinců. Atd……převzato s mírným krácením a bez obrázků z http://mujweb.cz/Veda/mitochondrie/15/15.htm
Historie vývoje poznání v genetice ve zkratce (http://old.mendelu.cz/~agro/af/genetika/vsg2/uvod1/history.htm) 1865 J.G. Mendel oznámil a publikoval svou teorii dědičnosti, dnes známou jako Mendelovy principy 1869 v buňkách byla zjištěna chemická látka DNA 1875 Ch. Darvin navrhl myšlenku „gemmulí“, které volně kolují v organizmu, jako mechanizmus dědičnosti. Dědičnost vykládal jako hypotézu pangeneze ve své knize "O proměnlivosti zvířat a rostlin během domestikace"; Darwin spekulativně věřil i v dědičnost vlastností získaných během ontogeneze 1882 německý biolog W. Fleming (1843 - 1905) použil barviva k zbarvení buněk; objevil struktury, které nazval “chromozomy” 1903 Walter Sutton a Theodor Boveri na sobě nezávisle dokázali, že spermie a vaječné buňky mají jeden z každého páru chromozomů. Sutton předpokládal, že Mendelovy „faktory“ jsou lokalizovány na chromozomech; Objevil pohyb chromozomů během meiózy a jejich rekombinaci a spojil jej s tříděním Mendelových párových faktorů. Dal Mendelovým „faktorům“ název geny 1907 americký biolog T.H. Morgan začal svou práci s ovocnými muškami, která prokázala, že chromozomy mají jednoznačnou funkci v dědičnosti, založila teorii mutace a vedla k základnímu porozumění mechanizmů dědičnosti 1909 dánský botanik Wilhelm Ludvig Johannsen (1857 - 1927) navrhl, že každá část chromozomu, která kontroluje fenotyp se bude nazývat „gen“ (řecky: „dávat vznik”), „genotyp“ k popisu genetické konstituce a „fenotyp“ k popisu aktuálního organizmu, který je výsledkem působení genotypu a prostředí - položil tak základy kvantitativní genetiky; bylo zjištěno chemické složení DNA 1911 T.H. Morgan vysvětlil oddělení určitých vlastností, které jsou obvykle děděny vázaně, jako příčina zlomení chromozomů během procesu buněčného dělení (crossing-over); Morgan začal mapovat pozice genů na chromozomech ovocné mušky 1912 Lawrence Bragg objevil, že rentgenové záření se může použít ke studiu molekulární struktury jednoduché krystalické substance; tento objev vedl k vývoji krystalografie, která umožňuje další vývoj tří dimenzionální struktury nukleových kyselin a proteinů 1920 zjistilo se, že v mechanizmu přenosu dědičných vlastností hrají úlohu chromozomy 1941 George W. Beadle (1903 - 1989) a Edward L. Tatum (1909 - 1975), oba z USA, zjistili, že geny kontrolují produkci enzymů - hypotéza „jeden gen – jeden enzym“ 1944 jako nositelka genetické informace byla určena DNA 1947 Barbara McClintock poprvé oznámila objev „transposibilních elementů“, známé jako skákající geny 1950 Erwin Chargaff zjistil, že množství adeninu a tyminu je stejné jako množství guaninu a cytozinu – později známa jako „Chargaffova pravidla“ 1951 byl získán první jasný rentgenový snímek DNA 1953 Crick a Watson popsali strukturu dvojitého helixu DNA 1957 M. Meselson a F. Stahl dokázali replikační mechanizmus DNA. F. Crick a George Gamov vypracovali „centrální dogma“, vysvětlující jak DNA funguje, aby vytvořila protein. Jejich „sekvenční hypotéza“ předpokládala, že DNA sekvence specifikuje sekvenci aminokyselin v proteinu; také předpokládali, že genetická informace proudí pouze jedním směrem, z DNA do mRNA a do proteinu, ústřední koncept centrálního dogmatu 1958 A. Kornberg (1918- ) z USA vytvořil DNA ve zkumavce, poté co objevil a izoloval DNA polymerázu; Crick objevil existenci mRNA 1959 Francois Jacob a Jacques Monod objevili základní princip genetické regulace – operonový model. Zmapovali kontrolní funkce lokalizované na chromozomech v DNA sekvenci, které nazvali represor a operon 1966 bylo zjištěno, že DNA se nachází také mimo jádro buňky (např. mitochondrie); byl rozluštěn genetický kód; M. Nirenberg, H. Mathaei a S. Ochoa dokázali, že sekvence tří nukleotidových bazí (kódon) určuje každou z 20 aminokyselin; to vedlo k genetickému inženýrství, genetickému poradenství atd. 1969 byl naizolován první gen 1970 byl vyroben první umělý gen 1972 Paul Berg z USA vyrobil první rekombinantní molekulu DNA; izolovanou restrikční endonukleázou rozstříhal DNA a použil ligázu ke spojení dvou řetězců DNA společně do hybridní kruhovité molekuly 1973 začala rozvoj genetického inženýrství a experimentování s geny 1976 byla poprvé dekódována DNA viru 1977 do baktérie byl poprvé uměle vložen gen, který normálně fungoval 1978 geneticky modifikovaná baktérie produkuje inzulín 1981 vědci z Ohio University vyprodukovali první transgenní zvíře transferem genů z jiných druhů zvířat do myši 1983 vytvořen první umělý chromozom 1984 A. Jeffreys zavedl techniku DNA fingerprintingu k identifikování jedinců, která o rok později vstoupila do soudních síní 1988 mezinárodní tým vědců začal pracovat na projektu mapování lidského genomu (Human Genome Project) 1990 byla provedena první genová terapie u čtyřletého děvčátka s nemocí imunitního systému zvaného ADA deficiency 1993 genovou terapií byla vyléčená myš s cystickou fibrózou 1996 po šestiletém úsilí byl dekódován genom kvasinky 1998 byl poprvé sekvencován celý živočišný genom červa C. elegans 2000 ohlášeno ukončení první fáze mapování lidského genomu
138
7 PRINCIPY GENOVÉHO INŽENÝRSTVÍ A BIOTECHNOLOGIÍ Genové inženýrství (syn. DNA biotechnologie) se zabývá zaváděním cizorodých genů, nebo sekvencí DNA, do genomu jiných organizmů, nebo cíleným ovlivňováním struktury nebo exprese genu. Nezbytným prvním krokem vnesení cizího genu je jeho isolace, a to buď celého nebo specifického segmentu. To lze provést „vyštěpením“ příslušného úseku DNA tzv. restrikčními enzymy (zdrojem jsou bakterie, viz též konec této kapitoly) nebo přepisem příslušné zralé mRNA do DNA reversní transkripcí (kap. 3.3). Reverzní transkripcí vytvořený segment DNA se označuje jako cDNA (complementary DNA) a neobsahuje introny příslušného genu. Přenos genu do cizího genomu se provádí tak, že vyštěpený gen nebo segment cDNA se vloží do tzv. vektoru, kterým může být bakteriální plasmid, bakteriofág nebo virus. Pro velké segmenty DNA jako vektor může sloužit tzv. umělý kvasinkový chromozom (YAC – Yeast Arteficial Chromosome) nebo umělý bakteriální chromosom (BAC). Výsledný komplex obsahující původní geny plasmidu i požadovaný přenášený gen se označuje jako rekombinantní DNA. Plasmid s rekombinantní DNA se po vrácení do bakterie replikuje a transkribuje jejími vlastními molekulárními mechanizmy. Výsledkem je vytvoření mnoha kopií přenášeného cizího genu i kódovaných molekul peptidu. Speciálními postupy se pak z populace bakterií vytřídí ty, které požadovaný gen nesou a přepisují. Tento proces se označuje jako klonování (viz Molekulová biologie). Přenos genetické informace plasmidovým vektorem je možný i do eukaryotní buňky po jejím předchozím „otevření“ např. tzv. elektroporací, kdy se krátkými elektrickými pulzy vytvoří v plazmatické membráně hostitelské buňky velmi malé a jen krátce existující „otvory“ . Do rostlinných buněk je možné tyto vektory vpravit tak, že se připojí ke kovovým mikrosférám, které se „vstřelují“ pomocí tzv. genové děla. Soubory izolovaných genů, resp. jejich klonů, tvoří tzv. genomové knihovny (plasmidové a fágové). Soubory DNA štěpů získaných reverzní transkripcí tvoří tzv. cDNA knihovny. V případě, že isolovaná sekvence DNA je pomocí některého z vektorů (nejčastěji virového) vnesena do vajíčka, objeví se po jeho oplození ve všech buňkách nově vzniklého jedince. Takovéto organizmy nazýváme transgenní. V případě, že cizí gen je vnesen pouze do somatických buněk, organizmus označujeme jako geneticky manipulovaný, GMO, organizmus. Buňky, nebo organizmus, ve kterých došlo vnesením definovaných sekvencí nukleotidů k umlčení projevu genu cestou inhibice translace se označují jako knock-out (ované) organizmy. Pomocí DNA biotechnologií se dnes vyrábí řada tzv. genových sond (viz níže), bílkovinných hormonů potřebných pro veterinární a humánní medicínu (inzulín, růstový hormon, interferon, erytropoetin, interleukiny, antihemofilické faktory 8 a 9), virové antigeny sloužící k výrobě vakcín i některá antibiotika, diagnostické přípravky a další. Transgenní rostliny a zvířata se mohou v důsledku exprese vneseného genů měnit morfologicky i funkčně (zvýšená odolnost rostlin proti plísním, vznik tzv.obřích mutantů 139
hlodavců apod.). Mohou však být též zdrojem bílkovin, např. lidského mléčného kaseinu, který je produkován jako součást mléka, např. transgenních krav. Izolovaný kasein pak je používán jako doplněk výživy kojenců. Tzv. “genové sondy”, slouží k mapování genomu. Sonda se označí např. radioaktivním isotopem nebo flurochromem. Sonda se známou sekvencí nukleotidů charakteristickou např. pro normální nebo mutovaný gen se exponuje vyšetřovanému genomu po jeho předchozím rozvláknění DNA, tzv. denaturaci DNA (zvýšením teploty), na kterou se naváže komplementárním párováním (tzv. hybridizace nukleových kyselin). Navázání sondy s informací pro normální gen se nenaváže na genom nesoucí gen mutovaný a obráceně v případě aplikace sondy mutované. Tento postup slouží např. k prenatální diagnostice vrozených metabolických poruch. Hybridizace DNA sondy s vyšetřovanou DNA se může provést buď s DNA rozdělenou gelovou elektroforesou (viz blottovací metody v kap…..) nebo v celých buňkách tzv. hybridizací in situ (lat. – na původním místě), čímž lze zjistit i polohu klonovaného genu na konkrétních chromozomech. Genetické sondy se dnes multiplikují většinou v bezbuněčných systémech pomocí tzv. polymerázové řetězové reakce (PCR: Polymerase Chain Reaction). Obr. 60. PCR je založena na opakovaném kopírování počáteční sekvence DNA. V tomto procesu se na klonovaném segmentu nukleotidů vytvoří nejprve druhé vlákno komplementárním párováním bazí. V dalším kroku se obě vlákna oddělí (denaturace DNA zvýšenou teplotou). Na oddělené jednovláknové úseky se mohou připojit komplementárně nové baze, které se opět v dalším cyklu zahřátí oddělí. Opakováním těchto cyklů, zpravidla 20-30, počet příslušné nukleotidové sekvence exponenciálně roste. Každý cyklus trvá přibližně 5 minut a celý proces je plně automatizován a nevyžaduje přítomnost živých buněk. K syntéze nového vlákna DNA se nejčastěji používá termostabilní DNA polymeráza izolovaná z bakterie Thermophilus aquaticus (Taq polymeráza).
DNA biotechnologické metody mají aplikace diagnostické, badatelské, forenzní a kriminalistické aplikace. Soudní aplikace se týkají např. stanovení genetické příbuznosti osob, identifikace zbytků těl, osob z biologických stop zanechaných na místě zločinu či neštěstí apod. To umožňuje tzv. DNA polymorfizmus, který poskytuje individuálně specifické znaky, podobně jako otisky prstů. Proto se tyto DNA znaky označují též jako DNA finger prints. Lze tak určovat genetickou příbuznost při např. sporech o otcovství, identifikaci pachatelů trestných činů v kriminalistice, identifikaci ostatků lidí při hromadných neštěstích apod. Pravděpodobnost nálezu stejného obrazu u dvou jedinců je jedna ku mnoha desítkám až stovkám miliónů. Vysoká variabilita nukleotidové stavby nekódující DNA je důsledkem náhodných bodových mutací, které se však funkčně neprojevují a proto se mohou hromadit. DNA polymorfizmus je vázaný přednostně na tzv. nekódující jadernou DNA, tvořenou z velké části jednou, nebo vícenásobně se opakujícími nukleotidovými sekvencemi. Pořadí nukleotidových bazí, délka a počtem těchto tandemových repeticí se mezi jednotlivci téhož druhu liší (též nekódující DNA. Zdrojem této interindividuální variability dané nestejnou délkou a počtem repeticí jsou tzv. VNTR sekvence DNA (Variable Number of Tandem Repeats). Dalším zdrojem jsou tzv. RFLT tandemy (Restricted Fragments Length Tandems), které se mezi jedinci liší „jen“ 140
bodovými mutacemi. určitého pořadí nukleotidů. Tím však z této DNA vznikají při štěpení restrikční i enzymy u různých jedinců fragmenty různé délky. Různá délka fragmentů se po elektroforetické separací DNA projeví jejím nejednotným rozložením v separačním gelu neboť jejich pozice závisí na migrační pohyblivostí jednotlivých frakcí v elektrickém poli. Ta je úměrná jejich molekulární hmotnosti, která je daná délkou fragmentů. Rozložení těchto fragmentů (proužků v gelu) je pro každého jedince vysoce specifické a označuje jako tzv. DNA finger prints. O dalších typech DNA fingerprints více v Molekulové biologii. DNA fingerprinting vyžaduje namnožení vzorku DNA získaného z malého počtu buněk, zanechaných např. pachatelem trestného činu (krevní stopy, vlasy, kožní otěry, sperma, buňky ve slinách apod.) nebo ze zbytku těla nebo buněk zanechaných na používaných předmětech (hřebeny, kartáčky), pomocí PCR.
Diagnostika vrozených metabolických chorob je umožněna tím, že DNA mutovaného genu je štěpena restrikčními endonukleázami na fragmenty jiné délky než obyvkle. To vede k odlišné poloze příslušného proužku v elektroforetickém gelu. Pro badatelské účely je často používáno tzv. „vyřazení“ či „umlčení“ genu (gene knock-out, gene silencing). Toho lze dosáhnout vnesením tzv. anti-sense/protismyslové DNA, dsRNA, siRNA a pod (viz též kap.3.3., 3.6 a další zdroje). Funkci genu lze měnit též . cílenou mutagenezí. Změny vlastností buněk, nebo celého organizmu, nesoucích mutovaný nebo vyřazený gen ukazují pak na funkci obměněného genu, resp. funkci jim kódované molekuly. Genetické manipulace jsou i nadějným léčebným postupem, cestou vnášení nepoškozených genů do mutovaných buněk. Pomocí DNA sond a jejich hybridizace se používá též diagnostice bakteriálních a virových onemocnění. Poznámka. „Místa rozpoznávané restrikčními endonukleasami jsou většinou palindromatické sekvence (palindromatické sekvence mají stejné pořadí nukleotidů čtené ve směru od 5' konce na obou dvou vláknech DNA). Příklad palindromatické sekvence u enzymu Eco RI (mezi červeně označenými nukleotidy dochází ke štěpení): 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' ….u enzymu Eco RI (endonukleasa izolována z Escherichia coli) může docházet ke štěpení mezi nukleotidy, které neleží naproti sobě; konce rozštěpené dvoušroubovice jsou pak nestejně dlouhé. Takovéto konce označujeme jako lepivé (kohezní). Pokud restrikční endonukleasa štěpí mezi protilehlými nukleotidy, potom jsou konce dvoušroubovice zarovnané tupé konce. Restrikční endonukleasy ….. umožňují specificky vyštěpovat různé DNA sekvence. ……izolovaných z různých bakterií, tudíž ….. velké možnosti vyštěpování žádaných úseků DNA (existují tzv. restrikční mapy, kde jsou v genomových sekvencích naznačena místa, kde lze sekvenci určitou endonukleasou štěpit). http://genetika.wz.cz/rekombinantni_dna.htm
141
8 MIKROSKOPICKÁ ZAŘÍZENÍ A METODY POUŽÍVANÉ PRO STUDIUM BUNĚK A TKÁNÍ (obr.61-65)
SPOLEČNÝM POŽADAVKEM NA VŠECHNA TATO ZAŘÍZENÍ A METODY JE UMOŽNIT ANALÝZU CO NEJMENŠÍCH BIOLOGICKÝCH OBJEKTŮ, JEJICH STRUKTURY, FYZIKÁLNÍCH VLASTNOSTÍ, CHEMICKÉHO SLOŽENÍ A FUNKČNÍCH PROJEVŮ. 8.1 Světelná mikroskopie (SM) 8.1.1 SM v průchozím světle (trasmisní mikroskopie) 8.1.2 SM v emitovaném světle (fluorescenční mikroskopie) 8.1.3 Typy a vlastnosti objektivů pro SM 8.1.4 Konfokální mikroskopie 8. 1.5 Preparační a disekční mikroskopy 8.2. Elektronová mikroskopie (EM) 8.3 Doplňková zařízení k SM a EM: 8.4 Další speciální zařízení 8.5 Příprava mikroskopických preparátů a přehledné (nespecifické) barvení 8.6 Principy speciálních histochemických a cytochemických metod 8.6.1 Přímé barvení organických molekul 8.6.2 Katalytická histochemie enzymů 8.6.3 Autoradiografie 8.6.4 Imunocytochemie 8.6.5 Hybridizace nukleových kyselin. Microarrays. DNA čipy 8.6.6 8.6.7
SLOVO O KONSTRUKTÉRU (-ECH)
MIKROSKOPU
……... ANTONY THONISZON, muž, který první spatřil bakterie. Pocházel z holandského městečka Delft a byl majitelem obchodu se smíšeným zbožím. ……. začal používat jména Anthony van Leeuwenhoek, podle nároží se sochou lva, kde stál jeho rodný dům. Jednoho dne si na výročním trhu koupil jednoduchý zvětšovací přístroj, jemuž se tehdy říkalo „bleší sklo". Dvěma čočkami bylo možno docela dobře pozorovat blechy, takže prý vypadaly jako mouchy. Leeuwenhoek byl touto hračkou nadšen. Využil každé volné chvíle k zhotovování stále dokonalejších čoček, až se mu podařilo, ačkoli neměl žádné vědomosti z fyziky, sestrojit drobnohled tak dokonalý, že jím bylo možno zvětšovat 270krát. Tímto podivuhodným přístrojem prohlížel všechno, co se mu dostalo do ruky. Včelí žihadla, oko vši, nožky brouka - a to vše mu připadalo jako zjevení. Byl zkoumáním malých předmětů tak posedlý, že ho sousedé začali považovat za blázna. Jednoho dne přišel na zvláštní myšlenku. Do sklenice vložil hrstku sena a zalil ji vodou z rybníka. Za 14 dní dal kapku nálevu pod mikroskop a zaměřil na ni skla zvětšovacího přístroje. Užasl. Spatřil nesmírné množství zvířátek, která překypovala životem. Oznámil svůj objev příteli, lékaři a badateli dr.Graafovi, jehož zásluhou se později stal dopisujícím členem londýnské Královské společnosti. Po několika týdnech dostal další nápad. Chtěl prozkoumat, proč má pepř ostrou chuť. Když anglická Královská společnost dostala od Leeuwenhoeka tuto senzační zprávu, rozhodli se dva její členové, že údaje přezkoušejí. Stalo se to 15. listopadu 1677. I tito učení mužové užasli. Oslněni tímto drobnohledným zážitkem neotáleli a zvolili nevzdělaného kramáře z Delft členem anglické Královské společnosti. Tím však Leeuwenhoekovy pokusy nekončily. V roce 1683 provedl další pokus. Seškrábl bílý povlak se svých zubů, rozředil jej dešťovou vodou a vložil pod mikroskop. A opět spatřil zázrak. Objevilo se množství čile se pohybujících zvířátek, ale byla úplně jiná než která vídal dříve…. A tak putoval členům anglické Královské společnosti jeden dopis za druhým. Všechny jsou uchovány v muzeích. Veliké pozornosti se těší kupříkladu list, v němž neúnavný Leeuwenhoek sděloval, že objevil pod mikroskopem, jak kukly blech jsou napadeny malými tvorečky. … objevil, že bleší kukla je napadena parazity. To .. inspirovalo satirika Jonathana Swifta k napsání epigramu: Přírodovědci se domnívají, že na bleše menší blesky sají. Na těch bleškách ještě menší sedí, kde to končí, to zatím nevědí. Dnes víme, že Leeuwenhoek vlastně objevil (i !!!) bakterie, původce infekčních nemocí. To však tehdy on ani jeho současníci ještě netušili. MUDr. Stanislav Trča, CSc.(Cesty k dlouhověkosti. www.bakterie1 http://www.avicenna.cz/item/muz-ktery-prvni-spatril-bakterie
142
Pozn. VM : Jako první konstruktér mikroskopu se uvádí Galileo Galelii a někteří brusiči brýlových čoček v Amsterodamu již na konci 16. století. A. v . L. však pomocí své modifikace drobnohledu jako první pozoroval a popsal biologické objekty, a to nejen bakterie ale i některé prvoky, vířníky, erytrocyty, spermie apod. Robert Hook, člen Londýnské královské učené společnosti, použil později pojem cellula (=klášterní cela, komůrka, sklípek, buňka) pro komůrky, které pozoroval v korku. Ty však neměly mnoho společného s objekty, popisované A.v.L. Skutečné rostlinné a živočišné buňky popsali až o téměř 200 let později J. E. Purkyně, T. Schwan, M. J. Schleiden, R. Virchow a další, kteří postulovali a rozvinuli buněčnou teori (vz kap. i,2).
8. 1 SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE (SM) 8.1. 1 SM v průchozím světle (transmisní mikroskopie). Visualizace (barvení) buněk pomocí: (i) diachromů (hematoxylin, eosin, toluidinová modř, pararosanilin, basický fuchsin, kresylová violeť, soli těžkých kovů a pod). Pohlcují doplňkovou část světelného spektra (ii) lomem světla (fázový kontrast). Při průchodu prostředím s různou lomivostí se dochází k posunu fáze světelné vlny. Ve speciálním optickém systému se objekty s větší lomivostí jeví tmavší. (iii) zástinem, pozorování v temném poli (světlo přichází ze strany, (iv) objekt se jeví jako světlý na temném pozadí) 8.1. 2 V emitovaném světle (fluorescenční mikroskopie: Visualizace buněk pomocí fluorochromů excitovaných světlem výbojky dopadajícím na preparát (viz níže imunochemické techniky) 8 .1. 3 Typy a vlastnosti objektivů pro SM: 1. Suché 2. Imersní: (olejové, nebo vodní) Optické vady objektivů a jejich korekce Typy vad: 1. Vada chromatická: Části spektra s odlišnou λ mají různý fokus→ neostrý obraz Objektivy s korekcí pro 2 barvy: achromáty; pro 3 barvy : apochromáty 2. Vada sférická: Střed čočky láme světlo více než okraje →neostrý obraz 3. Nerovnoměrné zakřivení zorného pole. Objektivy s korekcí: plan-apochromáty (dokonale ploché pole) Způsob korekce: Kombinací vícero čoček z různých druhů skla (flintové, korunové, borosilkátové apod., lišící se indexem lomu) Rozlišovací schopnost objektivu (RS) = Nejmenší rozlišitelná vzdálenost mezi 2 body (tj. kdy 2 body ještě „nesplývají v jeden“) RS = 0. 61 x λ/n.sin alfa n= refrakterní index skla, montovacího a imersního media sin alpha = sinus 1/2 vstupního úhlu světla = numerická apertura objektivu !!! (NA), která je nepřímo úměrná ohniskové vzdálenosti objektivu. λ=vlnová délka světla. 0.61= konstanta pro tzv. inkoherentní světlo. 143
Cave: modré světlo 400- 470 nm; zelené: 565 nm; červené : >600nm; Max. RS oka: 500-1000 um , SV: 0.2 um (200nm) , Informaci o vlastnostech objektivu získáme z nápisů uvedených na objektivu, kde bývá uveden výrobce, zvětšující schopnost/NA (např. Zeiss 40/0.65). V dolní části je údaj o vyžadované vzdálenosti od okuláru. Na starších objektivech to bývá 160 mm, na novějších značka nekonečna. Černý nebo bílý kroužek na konci objektivu nás upozorňuje na imersní objektiv (černý je zpravidla pro imerzi olejovou). Kroužky jiných barev mají usnadňovat kontrolu jednotlivých používaných objektivů při práci. Na objektivu je někdy uveden i údaj o doporučené maximální tloušťce krycího skla, kterou lze použit (obvykle 0.17 mm) 8. 1. 4 Konfokální mikroskopy pracují s laserovým (i) paprskem(y), které excitují fluorochrom navázaný na molekuly buňky. Mikroskop provádí automaticky skenování objektu v různých hloubkách (preparátu) ostrosti. Získané obrazy automaticky zaznamenává a umožňuje tak posouzení prostorové-vertikální („3D“) lokalizace molekul a organel v buňce. 8. 1. 5 Preparační a disekční mikropy Mikroskopické lupy. Slouží nejčastěji k manuální preparaci objektů při menších zvětšeních. Mikrodisekeční mikroskopy. Umožňují disekci tkáňových segmentů nebo i jednotlivých definovaných buněk, či jejich segmentů z heterogenního vzorku, pomocí laserového paprsku.Takto izolovaný materiál lze použít k mikrochemické analýze.
8. 2 ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE 1. Transmisní EM (TEM) Místo světla (fotonů) objektem procházejí elektrony, které se uvolňují na vysokonapěťové katodě mikroskopického tubusu. Místo skleněných čoček jsou použity elektromagnety. Elektrony, které procházejí materiálem dopadají na obrazovku. Elektrony procházející buněčnými strukturami o menší specifické hmotnosti jsou více pohlcovány a poskytují na obrazovce tmavší obraz. Po fotografické konverzi jsou tyto struktury světlejší. Cave: vlnová délka elektronů je 0.005 nm (při napětí 50 000 V na katodě) Maximální RS EM je proto až 0.0002 um (0.2 nm, 2A (Angstromy)) 2. Skenovací EM (SEM). Zobrazuje povrch buněk. Pracuje podobně jako TEM se svazkem elektronů. Registruje se však jejich odraz od povrchu biologického vzorku.
8. 3. DOPLŇKOVÁ ZAŘÍZENÍ K SM A EM: 1. Kreslící zařízení pro SM (Abbeho zrcátko, ramenový tubus, grafické tablety aj. ) 2. Fotografická zařízení pro SM a EM ( fotografické aparáty a digitalizační kamery) 3. Počítačová analýza mikroskopických obrazů 4. X-ray mikrodensitometrie pro stanovení chemických prvků
144
8. 4 DALŠÍ POMOCNÁ A SPECIÁLNÍ ZAŘÍZENÍ PRO STUDIUM BUNĚK 1. Průtokové (flow-) cytofluorometry 2. „Třídiče“ buněk (Cell sorters) 3. Separační centrifugy (pro isolaci buněk a organel) 4. Robotická zařízení pro tzv. microarrays (mikrořady) viz kap. 9.10 5. Atomové mikroskopy (Atom Force Microscopes, AMS) 6. Blottovací systémy (viz kap. 8.6) Ad. 1 a 2. Suspense buněk označených flurochromem (přímo, např. DNA propidium iodidem) nebo imunochemicky (viz níže kap. 8) se pod tlakem vstřikuje velmi tenkou kapilárou pod objektiv. Fluorochrom je excitován laserem a fluorescence je měřena a registrována počítačem. Tímto způsobem je možno změřit několik tisíc buněk za několik desítek vteřin. Ke shora popsanému zařízení může být přidáno zařízení, které vychyluje proud buněk v závislosti na obsahu fluorochromu. Vychýlené buňky jsou automaticky sbírány do oddělených zkumavek. Ad 3. Hrubý homogenát buněk nebo tkáně se odstřeďuje při vysokých otáčkách v chlazené ultracentrifuze v např. sacharozovém gradientu. Organely s vyšší specifickou hmotnosti sedimentují při nižších otáčkách nebo dříve. Jednotlivé frakce je pak možno odděleně sbírat a chemicky analyzovat. Viz obr. 61 Ad 4. Viz kap. 8… Ad 5 Atomové mikroskopy používají mikrohrotové sondy, které skanují povrchu objektů, vč. individuálních molekul. Viz Katedra fyziky PřF UJEP Ad 6 Viz kap. 8………. níže
8. 5 PŘÍPRAVA TRVALÝCH MIKROSKOPICKÝCH PREPARÁTŮ A JEJICH BARVENÍ
(OBR.66)
8. 5. 1 Typy preparátů: a. Nátěry b. Otisky c. Roztlače d. Řezy 8. 5. 2. Fixace biologického materiálu. Při tzv. fixaci biologického materiálu nastává denaturace a inaktivace bílkovin, především enzymů. Tím se zabrání samovolnému rozkladu tkáně lyszomálními enzymy (konservace tkáně). Denaturace bílkovin vyvolá rovněž změny prostorové konfigurace bílkovin a tím se změní, někdy i zlepší dostupnost reaktivní funkční skupiny molekul buňky („obnaží“ se). K tomu přispívá extrakce některých molekul. Fixace fyzikální (zmražení, mrazové vysoušení, krátkodobé zvýšení teploty, mikrovlnné záření) Fixace chemická (formaldehyd, ethanol, methanol, aceton, kyselina octová, pikrová, osmičelá a j.)
145
Nejčastěji používané fixační směsi: Carnoyova tekutina (ethanol + octová kys.+ ev. chloroform, 6:3:1, Bakerova tekutina: 10% formol-chlorid vápenatý, Buinova tekutina: formalin 37% 25 ml, pikrová kyselina nasycená 75ml, octová kyselina ledová 5 ml). 8. 5. 3 Zalévání vzorku do zpevňujících medií Prosycení biologického vzorku pevnou látkou (viz níže) umožní krájení tenkých řezů. Tomu má předcházet vyprání fixativa, dehydratace tkáně a její prosycení rozpustidlem příslušícím k použité zalévací hmotě. Nejčastější zalévací hmoty: parafin, Paraplast-Plus (+ DMSO pro urychlení průniku parafinu do vzorku ), Celoidin (nitrocelulóza v ethanolu), sacharóza (nevyžadující odvodnění tkáně), polymerizující pryskyřice pro EM. 8. 5. 4 Krájení Pro studium tkání pod mikroskopem je nezbytné, aby tloušťka prohlíženého objektu nebyla větší než průměrná velikost buněk (7-20 um). V opačném případě se totiž obrazy buněk překrývají. Řezy tkání se pro SM připravují na speciálních zařízeních, tzv. mikrotomech s kovovým nožem. Dle konstrukce se mikrotomy dělí na sáňkové (objekt je pevně zachycen a pohybuje se nůž) a rotační (nůž je pevně uchycen a objekt se pohybuje). Krájení zmražených tkání se provádí na tzv. zmrazovacím mikrotomu nebo kryostatu pracujícím při minus 20-30oC. Mikrotomy pro EM používají velmi tvrdý a ostrý skleněný nůž, který umožní krájet tvrzenou pryskyřici o tloušťce řezu ve zlomcích mikrometru.
8. 5.5 BARVENÍ Cílem barvení je zobrazit buňky pro pozorování ve SM nebo EM. Před vlastním barvením je nutno ze vzorku odstranit zalévací medium (např. parafin xylenem , pryskyřice methanolem a peroxidem vodíku. Preparáty pro EM se „barví“ ionty těžkých kovů (Osmiové a uranové soli apod.) ještě před zalitím do pryskyřice. Barvení ortochromatické: barva buněk a barviva je stejná. Barvení metachromatické: Barvivo barví některou komponentu biologického vzorku odlišně (např modře a červeno-fialově). 8. 5 .1 Přehledné (nespecifické) barvící metody: Princip histologického barvení diachromy (chromogeny): Vytvoření kovalentní vazby mezi ionizovanými skupinami organických molekul buněk a ionty barviva (barviva jsou látky s aromatickým řetězcem a vysoce pohyblivými elektrony) . Kationická (basická) barviva (pararosanilin, basický fuchsin, kresylvioleť, toluidinová modř, hematoxylin) obsahují volné kationtové skupiny a váží se proto na aniontové skupiny organických molekul buněk (karboxylové, hydroxylové, fosfátové, sulfátové a další). Barví proto hlavně nukleové kyseliny a tzv. ”kyselé” proteiny, obsahující četnější dikarboxylové aminokyseliny.
146
Anionická (kyselá) barviva (žlutá kyselina pikrová, červený eosin aj.) obsahují volné aniontové skupiny se váží na kationtové skupiny organických molekul buněk (aminoskupiny, iminoskupiny sulfhydrylové, β-indolylové a imidazolylové, aj.). Barví např. “basické” tj. diamino aminokyseliny obsahující proteiny (histony). 8. 5. 2. Specifické barvící metody: Slouží pro zobrazení chemicky definovaných strukturálních bílkovin a enzymù, nukleových kyselin, mukopolysacharidů a dalších molekul) pomocí tzv. histo a cytochemických metod. Pokud se takto detekovaná molekula vyskytuje pouze, nebo převážně, v jednom typu organel, dojde tím současně i k jejich zobrazení. Po obarvení se preparát tzv. montuje tj., prosytí mediem stejných refrakčních vlastností jako tkáň a překryje tenkým krycím sklíčkem. Jako montovací medium může být použity látky rozpustné ve vodě (pufr, glycerin, Holtův sirup: 0.88% sacharóza s 1% arabské gumy). Při použití montovacího média nerozpustného ve vodě musí být řez nejprve odvodněn (např. k etanolu) a prosycen rozpustidlem montovacího média. Nejběžnějším bezvodým montovacím médiem ke kanadský balzám. Existuje však mnoho komerčních preparátů s různými chemickými (pH) a fyzikálními vlastnostmi (např. trvalá polymerace).
8. 6 SPECIÁLNÍ HISTOCHEMICKÉ A CYTOCHEMICKÉ METODY (příklady na konci obrazové přílohy – str. 71-74)
8. 6.1 Přímé barvení organických molekul (např. DNA Feulgenovou reakcí, polysacharidů alciánovou modří, RNA galocyanimem apod.) 8. 6. 2 Katalytická histochemie enzymů (příloha str. 74) Enzym + jeho substrát---> štěp substrátu, který se převede na barevný produkt. Barevný produkt vzniká: (i) Srážením produktu enzymatické reakce s kationty těžkých kovù (Gomoriho reakce: kationtem těžkého kovu se sráží štěpný produkt, vzniklý činností enzymu. Průkaz fosfatáz, cholinesterázy, sulfatázy, glukuronidázy). Příklad: glycerofosforečnan sodný jako substrát fosfatáz + enzym + Ca++ ----> fosforečnan vápenatý. Přidání AgNO3 ---> fosforečnan stříbrný, který se redukuje na stříbro
(i) tzv. azokopulací. Bezbarvá diazoniová sùl je zbytkem syntetického štěpného substrátu přemění na azobarvivo. Vhodné pro fosfatázy, esterázy karboxylových kyselin, aminopetidázy aj. Příklad: fosforečný fosfát alfa naftolu + fosfatáza --> štěpný produkt na který se váže bezbarvá diazoniová sůl (Fast Blue B, Fast Red TR Salt a j.), která se přemění na barevný pigment (iii) Tzv. Indigogenní reakcí: Indoxyl, uvolněný enzymem z indoxyl-substrátu se oxiduje kyslíkem na indigo. Vhodné pro nespecifické esterázy, glukozidázy, galaktosidázy, fosfatázy. (iv) Tzv.tetrazoliovou reakcí: Tetrazoliová sůl je redukovaná vodíkem, který se uvolňuje ze syntetických substrátů flavinovými enzymy (jejichž přítomnost chceme prokázat), a která se mění na barevný a nerozpustný formazan. Vhodné pro dehydrogenázy, monoaminoxidázy, disacharidázy
147
8. 6. 3 IN VIVO Izotopové „značení“ molekul, organel a buněk- autoradiografie (Příloha str./panel 73) Po podání radioaktivně značené a jednodušší prekurzorové molekuly dojde k jejímu zabudování (inkorporaci) do molekuly, organely a buňky, které chceme studovat. Místo inkorporace se zobrazí fotografickým principem pomocí speciální fotoemulse, která se navrství na histologický řez nebo jiný preparát buněk (autoradiografie). Studovat lze takto i rozložení např. iontů a anorganických molekul. Příklad: 3H-thymidin se podá zvířeti nebo živým buňkám v tkáňové kultuře. Inkorporuje se do DNA buněk v Sfázi buněčného cyklu. Nad buňkami se objeví mikroskopická černá zrníčka stříbra (viz preparáty na praktiku).
Podobným způsobem je možno zobrazit radioaktivně značené fragmenty nukleových kyselin nebo bílkoviny rozdělené elektroforézou. Využití autoradiografie pro tento účel (tzv. Southern blott, viz též 8.6.4 ) je dnes nejčastější. Neposkytuje však informaci o lokalizaci inkorporovaného izotopu v buňce. Pro shora popsanou topografii molekul, organel a buněk se dnes častěji využívá průkaz inkorporované prekurzorové molekuly imunocytochemicky (viz níže). Příklad. Místo 3H-thymidinu se podá zvířeti nebo živým buňkám v tkáňové kultuře atypický nukleotid (nejčastěji bromodeoxyuridin), který buňka nerozpozná jako pozměněný a inkorporuje jej do DNA místo thymidinu. Způsob detekce pomocí protilátky proti bromdeoxyuridinu je uveden v následující kapitoly. Uvedené izotopové i imunocytochemické značení jaderné DNA se využívá k nepřímému studiu buněčného cyklu. Podíl takto „značených“ buněk v celkové populaci určuje relativní délku S-fáze. V případě, že buňky již později nedělí (např. neurony), inkorporovaná „značka“ ukazuje kde a kdy buňka procházela časnou proliferační fází (tzv. tracing buněk). Tato místa jsou v některých orgánech značně vzdálená místům konečné lokalizace diferencovaných buněk. Příklady na praktiku.
8. 6. 4 IMUNOCYTOCHEMIE (obr. 66 a příloha str. 71) Proti molekule, kterou chceme studovat se na vhodném zvířecím modelu nebo pomocí tzv. hybridomu v buněčné kultuře (viz níže) nejprve vyrobí (dnes již skoro vždy koupí) specifická protilátka, se kterou se buňky inkubují. Protilátka se tak specificky a pevně naváže pouze na molekuly, které chceme studovat. Tato tzv. primární protilátka je však bezbarvá a proto se musí vizualizovat přímým, nebo nepřímým navázáním-konjugací, s vhodným flurochromem (nejčastěji tzv. FITC, TRITC, Texas Red-Cy3, Cy5 a další s emisními spektry různé vlnové délky, barva zelená, modrá červena aj.). V součsnosti existují fluoreskující nanočástice s širokou volbou emisních spekter , určovaných velikostí částic (Quantum dots, Qdots) Tento postup se označuje tzv. přímá metoda. Při nepřímé metodě, která je ciltivější a proto i častěji pužívaná, je fluorochrom nejprve konjugován s jinou protilátkou, namířenou proti imunuglobulinu živočišného druhu, na kterém byla primární protilátka vyrobena. V případě hybridomu vyrobeného z myších imunitních buněk bude sekundární protilátkou anti-myší imunoglobulin konjugovaný s např. FITC. Příklad: Průkaz vimentinu, bílkoviny středních filamet cytoskeletu. Buňky se inkubují s primární protilátkou proti vimentinu, isolovanou ze séra např. králíka imunizovaného vimentinem. Následuje inkubace s protilátkou proti králičímu imunoglobulinu (vyrobenou např. na praseti nebo ovci a pod.), konjugovanou s některým fluorochromem (viz shora). Struktury obsahující vimentin zeleně fluoreskují po excitaci svìtlem specifické vlnové délky). Viz praktikum
Poznámka: (a) Protilátky izolované z krve imunizovaného zvířete obsahují imunoglobuliny proti mnoha epitopům (= úsekům polypeptidického rětězce) dané látky-antigenu, např. 148
vimentinu, který byl použit k imunizaci zvířete. Tyto protilátky jsou proto nazývány polyklonálními, neboť jsou tvořeny vícero klony lymfocytů. Protilátky monoklonální se připravují tak, že v prvním kroku se provede imunizace zvířete, nejčastěji myš, známým antigenem (např. vimentinem). V dalším kroku se z imunizované myši isolují lymfocyty, které se jednotlivě “spojí” (hybridizují) s nádorovými buňkami myší sleziny (myelomové buňky). Takto vznikne řada buněčných hybridů- hybridomů, z nichž každý tvoří protilátky proti pouze jednomu epitopu (= úseku polypeptidického řetězce) použitého antigenu. Jednotlivé hybridomy se pak množí v kulturách in vitro a protilátky izolované z kultivačního média se označují jako monoklonální. (b) Sekundární protilátka může být též konjugovaná s enzymem, např. křenovou peroxidázou (KPx), alkalickou fosfatázou a pod. Komplex je pak vizualizován inkubací s bezbarvým substrátem, který specificky reaguje s konjugovaným enzymem. Vzniklý produkt se v dalším kroku mění na pigment viditelný v denním světle (např. KP rozkládá H2O2, který dále oxiduje přidaný bezbarvý diaminobenzidin na hnědý pigment. Podobným postupem lze zobrazit i bílkoviny isolované elektroforézou. Z elektroforetogramu se bílkoviny přenesou tzv. blotovaním (blott angl. Přenos na sací papír) nebo elektrickým nábojem na speciální membránu, která se inkubuje s příslušnými protilátkami a dalšími reagenciemi. Metoda se označuje jako tzv. Western blotting v případě, že jsou takto studovány bílkoviny pomocí příslušných protilátek. Northern nebo Southern blotting se používá pro studium nukleotidových sekvencí nukleových kyselin. Viz další kapitola. V posledních 2 aplikacích se místo imunochemické koncovky může použít i autoradiografie (viz shora). Poznámka k terminologii. Blottovací metoda byla prvně navržena F.M. Southernem pro izotopové studium DNA. Názvy jejích modifikací podle světových stran jsou slovní hříčky. Termín eastern blott se nepoužívá.
8. 6. 5 HYBRIDIZACE
NUKLEOVÝCH KYSELIN. DNA MICROARRAYS A DNA ČIPY
Dvouvláknová DNA (double stranded DNA, dsDNA) se denaturací teplem rozvlákní a na každé vlákno (single stranded DNA, ssDNA) se naváže komplemenárním párováním předem připravená jednovláknová molekula RNA, nebo fragment DNA (tzv. DNA sonda), které jsou „označena“ isotopem nebo fluorochromem. Tento proces spojení nukleových kyselin se označuje jako hybridizace. Komplex se zviditelní autoradiograficky nebo ve fluorescenčně. V případě, že objektem stdua jsou celé buňky, lze takto lokalizovat např. geny v jádře i na jednotlivých chromozomech, studovat jejich expresi, vyhledávat mutované geny atp. Jde o tzv. hybridizaci in situ. Zkratka často používané FISH metody pak znamená „Fluorescence In Situ Hybridization“. Hybridizační postup lze použít i pro molekuly obsažené v homogenátu buněk či tkáně, a to po jejich předchozím rozdělení dle jejich hmotnosti pomocí elektroforézy. Hybridizace pak proběhne v následně zhotoveném blottu (Hybridizace DNA-radioaktivní DNA = Southern blott, DNA-radioaktivní RNA= Northern blott, viz „blotting“ na konci předchozí kapitoly). Další aplikací hybridizační metody představují tz. DNA microarrays (arrays= řady, šiky, nepřekládá se do češtiny). Na malou pevnou podložku (cca 2x2 cm) se roboticky nanese formou mikroteček několik set i více známých molekulárních nukleotidových sond do sloupců a řádků. Na takovýto „čip“ se nanese nukleová kyselina jednoho nebo vícero studovaných vzorků. Molekuly vzorků jsou označeny odlišnými fluorochromy. V místě komplementární vazby nukleotidových sekvencí sondy a vyšetřovaného vzorku 149
(hybridizace), se objeví odpovídající fluorescence (např. zelená nebo červená). V případě vazby molekul 2 vzorků pak pak sumaci spektra obou fluorochromů (v daném případě (žlutá až bílá). Vazba se vyhodnocuje se počítačově. Více v molekulární genetice. Protein microarays. Pracují na podobném principu. Reagovat se však nechává protein s protilátkou. Podrobněji, i další modifikace „microarrayových“ technik, v předmětu molekulární biologie. Poznámka. Elektroforéza je způsob separace látek v elektrickém poli, ve kterém se látky pohybují ve směru opačného náboje. Klasickým nosičem je agarozový nebo polyakrylamidový gel, který funguje rovněž jako síto přes které se molekuly pohybují rychlostí nepřímo úměrnou jejich molekulové hmotnosti. Metoda má mnoho variant. Provádí se pomocí řady komerčních zařízení. V předkládaných skriptech je zmíněna ELFO separace bílkovin např. pro Western blotty, nukleových kyselin pro DNA finger printing, hybridizaci nukleových kyselin (Southern a Northern blotty, viz shora). Více v Základech chemie a fyziky a Molekulové biologii.
8. 6. 6 In vivo fluorescentní „tracing“ molekul a organel Umožňuje prostorové studium molekul a organel v živých buňkách. Spočívá ve vložení cizorodého genu kódujícího přirozeně fluoreskující protein (nejčastěji tzv. Green Fluorescence Protein , GFP isolovaný z mořské medúzy Aequora victoria, http://www.osel.cz/index.php?clanek=349&music=&x= eme ) do genu hostitele jehož produkt chceme studovat. Viz též . http://cs.wikipedia.org/wiki/Zelen%C3%BD_fluorescen%C4%8Dn%C3%AD_protein V případě, že sledovaná molekula se vyskytuje specificky pouze v organelách jistého typu, tato metoda umožňuje i jejich zobrazení. Buňky lze dlouhodobě průběžně pozorovat ve fluorescenčním mikroskopu a obraz časosběrně snímat (tzv. time-lapse microcinematography) Přéloha ke kap. 1.3
Diurnální cykly člověka
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Biological_clock_human.PNG
150
9 PROCVIČOVACÍ ÚLOHY Pomohou vám ověřit efektivitu vašeho studia shora uvedeného materiálu. Prohlédnutím úkolů a otázek před započetím studia získáte představu o tom, jak podrobně je třeba jednotlivé partie znát. U otázek typu ANO-NE Doplňte A pro pravdivé a N pro tvrzení nepravdivé. Tyto odpovědi se však nikdy neučte nazpaměť, neboť u zkoušky mohou významově změněny. V případě, že otázka vyžaduje odpověď N, zkuste ji přeformulovat tak, aby vyzněla pravdivě. To vám dále pomůže v upevnění naučeného v paměti. Na správnou odpověď se ptejte nejprve sebe, pak učebnice a až nakonec spolužáků.
9.1 Otázky vyžadující víceslovnou opověď 9.2 Ano-Ne otázky 9.3 Úvahové úlohy 9.4 Grafická cvičení
Úkoly a otázky si však doporučuji "prohlédnout" již před započetím studia. Získáte tím představu o tom, jak podrobně je třeba jednotlivé partie znát. Na správná řešení se ptejte nejprve sebe, pak učebnice a až nakonec spolužáků. 9. 1 Otázky vyžadující víceslovnou odpověď Ke kapitole 1.1 Které jsou hlavní znaky živočichů? Co se rozumí pod pojmem hierarchie morfologické stavby těla živočichů? Do které říše živé přírody se zařazují živočichové? Co je základem molekulárně fylogenetické klasifikace živé přírody? Vysvětlete přínos endosymbiotické teorie pro chápaní vývoje eukaryontní buňky Co se rozumíme pod pojmem pragenot? Jaká se měnila zemská atmosféra a jaký byl dopad jejich změn na vývoj živých organizmů Jaký je rozdíl mezi kladogramem a fylogenogramem? Co se rozumí vnitřním prostředím organizmů? Které jsou hlavní tělesné osy a roviny těl živočichů? Jaké jsou rozdíly mezi klasickou binomickou a kladiatickou taxonomií? Kterou tzv. Hlavní biologickou teorii postuloval J.E.Purkyně, Cl. Bernard, L.Pasteur? Která z Hlavních biologických teorií se vztahuje ke vzniku života? Jsou viry živé organizmy? Uveďte důvody pro tu či onu alternativu Ve kterých organických molekulách se vyskytuje funkční skupina –COOH? Jaké terciární struktury bílkovin jsou nejčastější? Co to je kvartérní struktura bílkovin? Uveďte 10 bílkovin které se běžně vyskytují ve vaší stravě Ve kterých organických molekulách se vyskytují atomy dusíku Ve kterých anorganických a organických molekulách je funkční skupina –OH? Co jsou chemicky steroidy? Kterých prvků máte v těle nejvíce? Co to je protoplasma? Jak tento pojem vznikl proč jsem jej v OZ nepoužil? Ve kterých molekulách se vyskytuje funkční skupina –COOH? Ve kterých organických molekulách se vyskytují atomy dusíku ? Ve kterých organických molekulách se vyskytuje funkční skupina –OH? Definujte pH, jeho význam a způsoby udržování v buňce: Uveďte názvy 5 monosacharidů , 3 disacharidů a 3 polysacharidů Uveďte funkční skupiny molekul cukrů, aminokyselin, nukleových kyselin Jakým způsobem urychlují enzymy chemické reakce? Uveďte 6 základních skupin enzymů dle mezinárodní klasifikace Čím jsou charakterizovány tzv. polární molekuly?
151
Definujte chemický pufr (ústoj) a uveďte konkrétní příklady pufrů v živočišném organizmu: Uveďte hlavní biogenní prvky Uveďte názvem hlavní skupiny jednoduchých organických molekul Uveďte názvem hlavní skupiny polymerů jednoduchých organických molekul Uveďte hlavní skupiny monosacharidů Uveďte názvem a chemickým vzorcem hlavní funkční skupiny jednoduchých organických molekul Uveďte názvy 3 molekul disacharidů a jejich složení (názvem) Uveďte jména všech pyrimidinových bazí nukleových kyselin Definujte enzym chemicky a funkčně Co to je osmóza? Na čem závisí funkce enzymu? Jaké jsou hlavní typy chemických vazeb? (uveďte jen slovně) Uveďte názvy několika aminokyselin Jaký je rozdíl mezi peptidem a bílkovinou? Která vlastnost atomu kyslíku je rozhodující pro oxidativni fosforylaci (buněčné dýchání)? Proč je voda dobré rozpouštědlo pro sloučeniny s iontovou vazbou (např. NaCl)? Napište chemickou rovnici kondenzační reakce dvou aminokyselin. Které z dosud probraných molekul se vyskytují pouze v určitých živočišných tkáních (tj. vyskytuji se pouze v jednom nebo několika, ne však všech typech tkání) Které skupiny fosfolipidů jsou v plasmatické membráně? Které alkoholy jsou obsaženy ve fosfolipidech plasmatické membrány? Definujte obecně chemicky lipidy. Uveďte názvy pěti aminokyselin. Definujte chromoproteiny a uveďte dva konkrétní příklady. Jaký je rozdíl mezi koenzymem a apoenzymem? Uveďte hlavní skupiny enzymů podle mezinárodní klasifikace. Které molekuly organizmu slouží jako tzv. pufry (ústoje)? Čím je v buňce určován osmotický tlak a v jakých se vyjadřuje jednotkách? Ke kapitole 1.2 Uveďte názvy organel endomembránového systému. Které organely nepatří k endomembránovému systému a proč? Jaký je rozdíl v lokalizaci integrálních a periferních bílkovin plasmatické membrány? Jak se nazývá dnes přijímaný model biomembrán? Které faktory mění fluiditu plasmatické membrány a jak? Které funkce plní lipidy v plasmatické membráně? Které jsou hlavní typy mezibuněčných spojení? Které jsou hlavní typy adhezních molekul? Co jsou a k čemu slouží proteazomy? Co to je endozom? K čemu slouží? Které jsou hlavní společné znaky plasmatické membrány buněk? Jaký je předpokládaný fylogenetický vztah mezi prokaryonty a eukaryonty? Jak se liší strukturou molekula DNA prokaryontů a eukaryontů? Na kterých membránových organelách v buňce jsou vázány ribozomy? Z čeho se skládají ribozomy? Kde se v buňce vyskytují molekuly zvané laminy? Které organely v buňce vyžadují pro funkční aktivaci kyselé pH? Který enzym je typický pro peroxizomy? Kde v buňce probíhá syntéza biomembrán? Jaké znáte molekulární pláště transportních váčků? Jak se liší chromozom mitochondrií a buněčného jádra? Které jsou hlavní vnitřní oddíly mitochondrií? Kolik genů obsahují mitochondrie? Pro které molekuly obsahuje mitochondrie geny? Kde jsou lokalizovány ostatní geny pro mitochondrie? Uveďte dva hlavní důvody, kvůli kterým se mitochondrie označují jako semiautonomní organely. Které jsou hlavní struktury buněčného skeletu? Které jsou hlavní bílkoviny buněčného skeletu? Kde se v buňce vyskytuje gama tubulin? Jak se liší svou strukturou a funkcí cilie a centrioly? Uveďte názvy molekulových motorů a vysvětlete jejich funkci. Které komponenty a molekuly cytoskeletu jsou spojeny s pohybovými funkcemi celé buňky a jejich organel? Uveďte hlavní MTOC. Jaký je rozdíl mezi karyotypem a genotypem?
152
Co označuje pojem telomery? Popište stavbu a funkci jadérka. Které jsou hlavní podmínky pro funkci enzymů? Které jsou hlavní fáze buněčného cyklu? Které molekuly obsahuje cytosol a jaká je jejich funkce?
Která skupina enzymů je přítomna v lysozomech a k čemu slouží? Jak se do živočišné buňky dostává voda? Uveďte konkrétní procesy vyžadující ATP? Jaký je rozdíl mezi obsahem pojmů genetická informace a genetický kód? Uveďte hlavní skupiny molekul, které řídí buněčné dělení (b. cyklus): Které funkce plní bílkoviny v plasmatické membráně? Vysvětlete vznik klidového membránového potenciálu. Které organely v buňce mohou zneškodnit škodlivé chemické látky? Kde v buňce probíhá glykosylace bílkovin? Jaké jsou funkce endozomů? K čemu slouží t- a v-snares? Které procesy probíhají v jednotlivých oddílech mitochondrií? Kde všude v buňce probíhá oxidace mastných kyselin? Co je příčinou tzv. generačního stárnutí buněk? K čemu slouží v buňce tzv. nekódující DNA? Jaká je funkce NOR? Definujte transpozon a uveďte jeho význam ve funkci buněk. Ke kapitole 2 Které jsou základní typy transportu látek do buněk? Jaký je vztah mezi tzv. primárním aktivním transportem (Na+K+pumpou) a tzv. sekundárním aktivním transportem (Na+ kotransportem)? Které typy přenašečů molekul obsahují tzv. hradla? Proč přes plasmatickou membránu lépe pronikají molekuly hydrofobní než hydrofilní? Popište průběh receptorově zprostředkované endocytozy. Jak je do procesu receptorově zprostředkované endocytozy zapojen endozom? Popište tzv. sekreční dráhu v buňce Jaký je rozdíl mezi tzv. konstitutivní a regulovanou sekrecí? Vysvětlete funkci NAD+ v buňce. Vysvětlete podstatu tzv. centrálního dogmatu v biologii. Jaký je rozdíl mezi pre-mRNA a mRNA? Definujte genetický kód a uveďte jeho vlastnosti Uveďte 3 hlavní vlastnosti genetického kódu. Která jsou hlavní stadia translační fáze bílkovin? Které skupiny molekul slouží v organizmu jako tzv. signální molekuly? Co to jsou Okazakiho fragmenty, kde, proč a jak se tvoří? Které fyzikální vlivy mají v organizmu signalizační funkci? Definujte pojem receptoru a uveďte jejich výskyt v buňce. Co to jsou tzv. primární a sekundární posli? Které molekuly se v buňce uplatňují jako tzv.sekundární posli? Jaký je obecně význam buněčného dělení? Který proces v buňce řídí molekuly cyklinů? Které molekuly brzdí buněčné dělení? Co to jsou růstové faktory a jak působí? Co to jsou v buňce protoonkogeny a jaký je rozdíl mezi tzv. c- a v-onkogeny? Uveďte hlavní vlastnosti a význam kmenových buněk. Jak je v buňce regulovaná transkripce genu? Kde a jak se v buňce uplatňují tzv. transkripční faktory? Jakým mechanismem může vysoká teplota poškodit funkci buňky? Co rozumíme pod pojmem kyslíkových radikálů? Které molekuly v potravě mají schopnost inaktivovat volné kyslíkové radikály? Ve kterých organelách v buňce probíhá rozklad bílkovin? Jak se v buňce uplatňují tzv. proteiny tepelného šoku (heat shock proteins)? Ve kterých tkáních probíhá celoživotně buněčná obnova? Vysvětlete rozdíl mezi zánikem buňky cestou nekrózy a apoptózy. Které geny se označují jako geny života a smrti? Které jsou hlavní znaky apoptózy?
153
Jaký je biologický význam apoptózy? Jaké jsou nejčastější příčiny programované buněčné smrti (apoptozy)? Čím se liší prokaryotní a eukaryotní buňka? Uveďte alespoň 10 rozdílů Ke kapitole 5 Které jsou hlavní typy živočišných tkání? Jaké jsou hlavní znaky epitelových tkání? Jaká je morfologická klasifikace epitelových tkání? Jaká je funkční klasifikace epitelových tkání? Jaké druhy žláz tvoří epitelové tkáně? Jaké jsou hlavní typy žláz se zevní sekrecí? Uveďte základní členění pojivových tkání. Které buňky se vyskytují v pojivových tkáních? Které tkáně patří do tzv. speciálních pojiv? Jaké jsou hlavní funkce pojivových tkání? Které molekuly jsou obsaženy v tzv. mezibuněčné hmotě (extracelulární matrix)? Které jsou základní typy svalové tkáně? Čím se liší kosterní a srdeční svalovina? Kde v těle živočichů je obsažena hladká svalová tkáň? Kde v těle je obsažen víceřadý epitel s řasinkami? Kde v těle je obsažen přechodný epitel? Jak se tvoří kostní tkáň? Které jsou hlavní skupiny krevních buněk? Co obsahuje krevní plasma? Které jsou hlavní skupiny buněk nervové tkáně? Uveďte klasifikaci nervových buněk dle morfologických a funkčních kriterií? Které buňky v mozku a míše tvoří myelin? Ze kterých zárodečných listů mohou vznikat epitely? Ze kterých zárodečných listů vznikají pojivové tkáně? Ke kapitole 6 Jaké jsou výhody pohlavního rozmnožování pro živočichy? Popište proces spermatogeneze a oogeneze u savců. Které jsou primární pohlavní znaky? Které organizmy označujeme jako gonochoristy? Jakými způsoby může být determinováno pohlaví? Jakou funkci má tzv. SRY gen? Které jsou hlavní fáze gametogeneze? Popište proces meiotického dělení zárodečných buněk Popište hlavní morfologické části spermií a jejich funkci Jak se liší vajíčka různých druhů živočichů? Jaký je rozdíl mezi tzv. regulačními a mosaikovými vajíčky? Jaký je vztah mezi vajíčky s různým obsahem a polohou žloutku a typem z nich se tvořících blastul? Co určuje dorsální a ventrální stranu zárodku? Které zárodečné listy se se podílejí na tvorbě kompletní stěny střeva člověka? Popište proces oplození vajíčka a vysvětlete tzv. bloky polyspermie. Vysvětlete pojem zygota. Uveďte názvy obalů vajíčka a jejich význam Co to tzv. šedý srpek? Jaké jsou hlavní způsoby rýhování vajíček? Jaké znáte typy blastul? Co se podílí na tzv. neurální indukci v zárodku strunatců? Jaké jsou hlavní mechanismy gastrulace? Vysvětlete mechanismus tvorby mesodermálního listu a jeho význam. Vysvětlete vznik a význam coelomu u bezobratlých a obratlovců. Vysvětlete pojem zárodečný terčík, jeho výskyt a význam Lze na gastrule vyšších obratlovců najít útvar odpovídající prvoústům? Ke kapitole 7 K čemu se v biotechnologii používají tzv. DNA vektory Které vektory znáte?
154
Uveďte základní morfologické členění epitelů: Co znamená v biotechnologiích zkratka PCR? K čemu se používá takto označovaný proces? Co to jsou DNA finger prints? Co rozumíme pod pojmem genetická sonda? Vysvětlete co rozumíme pod pojmem GMO organizmy? Co to jsou zvířata? Jak slouží DNA biotechnologie člověku? Jak a kde se metodicky v biotechnologiích využívá princip komplementárního párování bazí nukleových kyselin? Ke kapitole 8 Jak je definována rozlišovací schopnost objektivu a jaký je její význam? Jako jsou hlavní typy a vlastnosti objektivů pro světelnou mikroskopii? Jaké jsou hlavní konstrukční vady objektivů? Proč je rozlišovací schopnost elektronového mikroskopu vyšší než světleného mikroskopu? K čemu slouží tzv. průtokové cytofluorometry? Co to jsou monoklonální protilátky a k čemu se používají? Co to jsou hybridomy a čemu se používají? Co to jsou tzv. „blottovací“ metody a k čemu se používají? Co to jsou DNA microarrays a k čemu se používají? Jaký je význam fixace tkáně pro přípravu trvalých preparátů? Co to jsou hybridizační metody a k čemu se používají?
9. 2 Ano-Ne odpovědi Vepište P pro pravdivé tvrzení a N pro Nepravdivé tvrzení Odpovědi se neučte nazpaměť, neboť u zkoušky mohou významově změněny. V případě, že otázka vyžaduje odpověď N, zkuste ji přeformulovat tak, aby vyzněla pravdivě. To vám dále pomůže v upevnění naučeného v paměti. Ke kapitole 1.1 .... pH nižší než 7 označujeme jako zásadité .... Řepný cukr (sacharóza) se skládá ze 2 molekul glukózy ... -COH je karboxylová funkční skupina …..Sacharóza je tvořena 2 molekulami glukózy ….Fosfolipidy obsahují glycerol ….Triglyceridy jsou deriváty glycerolu ….Glycerol je alkohol ….Arginin je dusíkatá base nukleových kyselin ….Glukóza je pentóza ….Aminokyseliny mohou mít jednu nebo 2 karboxylové skupiny ….Glukóza obsahuje aldehydickou funkční skupinu ….NAD je zkratkou pro nitrogen-adenin-di-nukleotid .... Galaktóza je monosacharid ….Tryptofán je glykosylaminoglykan ….Na 1 litr 5% roztoku kuchyňské soli je potřeba 50 gramů KCl .... Při změně Fe++ na Fe+++ je atom Fe++ redukován …Definujte slovy peptidickou vazbu a napište její chemický vzorec ….5ˇkonec vlákna DNA je tvořen funkční skupinou PO3…cholesterol je lipidická molekula … pro chemické reakce kyslíku jsou rozhodující elektrony ve vnitřních orbitech ….tzv. uronové kyseliny jsou deriváty sacharidů ….bíkoviny mohou být součástí pufrů (ústojů, nárazníkových roztoků) živočichů …. Glykogen je polymerem glukózy a fruktózy …. Tělní roztoky živočichů mají zhruba 300 mOsm …. Alfa helix poskytuje bílkovině větší mechanickou pevnost než skládaný beta-list …. Hemoglobin je nukleoprotein …. Holonenzym neobsahuje ionty kovu … Přenos elektronů mohou zajišťovat dehydrogenázy … Molekulová hmotnost atomu uhlíku je větší než atomu kyslíku
155
…. Kyselina arachidonová je mastná kyselina …..Membránové sfingolipidy jsou odvozeny od glycerinu a sfingozinu Ke kapitole 2 -3 ….. Eukaryontní buňky vznikly zhruba před 0. 5 miliardou let. ….V endosomu stoupá pH za účelem oddělení receptoru od transportované látky ….Integriny jsou součástí středních filament cytoskeletu ….Bodové desmosomy zabraňují volnému prostupu látek mezi buňkami ….Tzv. hemisdemosomy jsou připojují buňky k extracelulární matrix ….Desmin je bílkovina středních bílkovin ….Bílkovina vinkulin je součástí středních filament cytoskeletu ....Cholesterol snižuje „tekutost“ plazmatické membrány … Kartáčový lem střevního epitelu je tvořen paralelními svazky středních filament … V peroxisomech se významně uplatňuje enzym peroxidáza ….Protonový gradient se tvoří mezi matrix a vnitřní membránou mitochondrií ….Tzv. dýchací řetězec je uložen na zevní mitochondriální membráně ….Myosin je asociovaná bílkovina mikrofilamet …..Dynein je molekulový motor středních filament cytoskeletu … Tzv. cadheriny jsou bílkoviny tvořící iontové kanály buňky ….Vitronectin je bílkovina v extracelulární matrix ….Kolagen je součástí středních filament cytoskeletu ….ATP může v buňce plnit úlohu tzv. sekundárního posla ….Tzv. NOR struktury slouží v buňce k receptorovému příjmu a přenosu informací …. Centromera je součástí basálního tělíska bičíku ….Kinesin je molekulový motor řasinek ….Keratansulfát extracelulární matrix pojiv je glykoprotein ….Cilie jsou tvořeny svazky aktinových filament ….Centriola je tzv. organizátorem mikrofilamet ….V heterochromatinu je transkripce RNA zpravidla vyšší než v euchromatinu ….Histony tvoří kinetochor chromozomů ….Kinetochory patří mezi tzv. NOR struktury ….Molekuly t-SNARES jsou přítomny v membráně transportních váčků ….GTP je molekula, která se účastní polymerace mikrofilament ….Nexus je označení pro těsnící mezibuněčné spoje ….Introny nesou genetický kód pro primární strukturu bílkovin ….Tzv. antikodón je součástí rRNA …. V buňce je 64 typů t-RNA ….Jadérko je tvořeno tzv. fibrózní a kompaktní komponentou ….Ionty sodíku mohou z buňky unikat difusí po koncentračním spádu ….Tzv. beta-oxidace mastných probíhá v hladkém endoplazmatickém retikulu ….Glykosylace bílkovin začíná v hr-ER ….Laktóza je monosacharid ….Helikáza je bílkovina, která je součástí bičíku ….Tzv. operon je součástí MTOC ….MTOC je zkratka pro tzv. MiTochodriální Oxidační Compartment buňky ….V mitochondriích je přítomna mRNA ....Polysomy jsou ribosomy vázané na hr-E ….K syntéze histonů dochází v S-fázi buněčného cyklu ….Cyklin B kontroluje vstup buněk z Go do G1 fáze …..Histony jsou součástí velké podjednotky ribosomů ….Ribosomy jsou v eukaryotních buňkách tvořeny 3 podjednotkami ….Při transkripci DNA dochází k tvorbě Okazakiho fragmentů ….Střední filamenta cytoskeletu se váží k pásovým desmozomům ….Translace je fáze syntézy bílkovin probíhající v jádře ….Při replikaci DNA se tvoří m-RNA ….Tzv. RNA primer se účastní replikace DNA ….Histony jsou "kyselé" bílkoviny jádra ….Telomera je součástí centrosomu ….Hl-ER je zásobárnou káliových iontů ….Tzv. asociované bílkoviny prostupují celou plazmatickou membránou ….Tzv. G-proteiny jsou tzv. integrální bílkoviny plazmatické membrány ….Zevní list plazmatické membrány obsahuje proteoglykany
156
….Rozpad jaderné blány začíná v anafázi mitozy ….Proces cytokineze zajišťuje vzájemný posun mikrotubulů ….Cykliny jsou bílkoviny syntetizované v jádře dělící se buňky ….Sodíko-draslíková pumpa čerpá ionty draslíku z buňky ….Tzv. sodíkový ko-transport vyžaduje energii uvolňovanou z ATP ….Usnadněná difuse je nespecifickým a na ATP nezávislým transportem látek do buněk ….Peptidická vazba vzniká v replikační fázi syntézy bílkovin ….Fibronektin je obsažen v lamině jaderné blány ….Telomery jsou koncové části mikrotubulů, opatřené tzv. GTP čepičkou ….V mitotickém vřeténku operují molekuly myosinu jako molekulové motory ….Transkripční faktory se účastní tvorby peptidických vazeb na ribosomech hr-ER ….Tzv. zinkové prsty se váží na ribosomy ….Centriola je nezbytnou organelou pro organizaci mikrofilament ….Ve středu centrioly je triplet (trojice) mikrotubulů ….Bičík je tvořen mikrofilamenty propojenými molekulami dyneinu ….Endosom se tvoří při receptorově zprostředkované endocytóze ….Lysosomy obsahují enzymy patřící do skupiny oxidoreduktáz ….Kyselý fibrilární protein je součástí mikrofilament astrocytů ….Molekuly proteoglykanů jsou součástí plazmatické membrány ….Lymfocytů je v periferní krvi více než granulárních leukocytů ….Lymfocyty patří do skupiny leukocytů ….Mikrotubuly tvoří rovnoměrně se opakující podjednotky alfa, beta a gama tubulinu ….Myosin má zpravidla GTPázovou aktivitu ….ATPáza je oxidoreduktáza ….Peroxid vodíku vzniká v lysozomech při rozkladu bílkovin ….Mléčný cukr je tvořen molekulou laktózy a fruktózy ….Rozpad jaderné blány je na začátku mitózy spouštěn fosforylací laminu C ….Na kinetochory chromozomů se napojují tzv. polární mitrotubuly mitotického vřeténka ….Energie uvolněná glykolytickým rozkladem glukózy je ekvivalentem 6 molekul ATP ….Při merokrinní sekreci se odděluje i apikální část buňky … Albuminů je v krevní plasmě dospělého člověka více než globulinů .…Princip komplementárního párování basí se uplatňuje při replikaci i transkripci DNA …..Při úplném rozkladu 1 molekuly glukózy se uvolněná energie přemění na 42 molekul ATP …..Při expresi genů se regulačně uplatňují transkripční faktory s motivem zinkových prstů .…Správně fungující gen p53 zabraňuje apoptóze poškozených buněk .…V tzv. cyklinových hodinách dochází k periodickému rozpadu cyklinů i jejich kináz .…Cytochromy jsou součástí dýchacího řetězce v mitochondriích .…V průběhu oxidativní fosforylace dochází k dekarboxylaci Acetyl-koenzymu A .…Rozklad buňky při apoptóze zajišťují lysozomální enzymy .… K tzv. posunu čtecího rámce genomu může dojít při bodové mutaci RNA .…Monocyty jsou nejméně početnou skupinou granulocytů .…Erytrocyty obsahují bílkovinu spektrin .…Golgi byl německý badatel .…Purkyně žil na konci 17. století .…Ve správně prováděném biologickém pokuse mohou být nejvýše 2 proměnné .…U některých živočišných druhů může docházet ke změně pohlaví v dospělosti .…Vimentin je složkou diferencovaných epiteliálních buněk .…Nestin je složkou diferencovaných pojivových buněk .…Fibronektin je součástí cytoplasmatického cytoskeletu .…Integriny jsou součástí tzv. buněčných hodin regulujících buněčný cyklus .…Kolagen je bohatý na aminokyselinu prolin .…Zkratka hsp se používá pro tzv. heterogenní skupinu proteoglykanů .…Ubiqutin je molekula, která se podílí na translační fázi syntézy bílkovin .… Proteasomy slouží k syntéze proteinů .… Nernstova rovnice vyjadřuje 2. termodynamický zákon ..... Mitochondrie obsahují ribosomy ..... Plazmatická membrána obsahuje cukerné molekuly pouze na zevním povrchu ..... Centromera je místo tzv. primární konstrikce chromozomu .... Hladké endoplasmatické retikulum je místem syntézy fosfolipidů ..... Bičík živočišné buňky je tvořen svazky aktinových filament (mikrofilament) ..... Cilie obsahují svazky středních (intermediárních) filament uspořádaných dubletů (dvojic) ......Lysozomy obsahují hydrolytické enzymy, které jsou aktivní při pH vyšším než 7.0 ......Plazmatická membrána je lépe propustná pro látky hydrofilní než hydrofobní ..... Jadérko je místem syntézy ribosomální RNA pro obě podjednotky ribosomů
157
.....Cyklus citronové kyseliny (Krebsův cyklus) probíhá v cytosolu buňky . ... Protozoa jsou eukaryota .…Mesom je součástí endomembránového systému eukaryontní buňky …. Glykolýza probíhá v cytosolu buňky .....Na vzniku membránového potenciálu buňky se podílejí převážně ionty draslíku .... K rozpadu jaderné blány dochází v anafázi mitózy .... Ribosomy obsahují RNA, DNA a řadu bílkovin .....V Golgiho aparátu probíhá syntéza lipidů .....Vimentin je bílkovina středních filament epiteliálních buněk ..... Tzv. genetický kód tvoří triplety nukleotidů v molekule DNA ..... Laminin je bílkovina středních filament jaderného skeletu .... Tzv. akrosom představuje koncovou část chromozomu ..... Desmin je molekula, která se vyskytuje ve středních filamentech některých buněk .... Monocyty představují nejméně početnou skupinu granulocytů .... Tzv. Okazakiho fragmenty se při replikaci DNA tvoří střídavě na tzv. vedoucím a zpožďujícím se vláknu .... Proces cytokineze uskutečňují hlavně aktinová vlákna (mikrofilameta) .... Laminy jsou bílkoviny cytoskeletu jádra .... Epiteliální buňky obsahují ve středních filamentech cytokeratin .... Tzv. sestřih (splicing) hn-RNA probíhá v cytoplasmě buněk .... Prokaryota obsahují mitochondrie ….. K pásovým desmozomům se upínají aktinová filamenta Ke kapitole 5 ….Astrocyty tvoří myelinové pochvy v míše a mozku ….Nisslova substance je tvořena shluky hladkého ER ….Osteocyty jsou mezi sebou propojeny nexy a bodovými desmozomy ….Fibroblasty jsou, podobně jako epiteliální buňky, strukturálně a funkčně polarizovány ….Víceřadý epitel se vyskytuje ve střevní sliznici ….Střevo je pokryto jednovrstevným epitelem s řasinkami ….Oligodendrocyty se podílí na tvorbě obalů kapilár v nervové tkání mozku a míchy ….Tukové buňky patří mezi stále (fixní) buňky areolárního (řídkého kolagenního) vaziva ….Buňky hnědé tukové tkáně obsahují více mitochondrií než buňky bílé tukové tkáně ...Víceřadý cylindrický epitel s řasinkami se vyskytuje v močovodech a močovém měchýři ....Tzv. přechodný epitel se vyskytuje v dýchacím traktu ...Tzv. Nisslova substance (tygroid) neuronů je tvořena shluky hladkého endoplasmatického retikula ….Dendrit je tzv. dostředivý (aferentní) výběžek nervové buňky Ke kapitole 6 …Axiální skelet je derivátem somitů …Oplozovací membrána je první bariérou polyspermie …"DNA finger prints" jsou dány variabilitou exonů mezi jedinci téhož druhu …Chalazy jsou součástí sekundárních obalů vajíčka ptáků …Epitel střeva je derivátem entodermu …Mezi deriváty entodermu patří i srdce a plíce ….Splanchnopleura kryje tělní stěnu zárodku ….Archiblastula je typem coeloblastuly ….Gastrulace lidského zárodku se uskutečňuje delaminací …Šedý srpek vzniká v místě vniku spermie do vajíčka …U mosaikových vajíček je vývoj každé blastomery determinován …Mesoderm vzniká u některých živočichů vychlípením prvostřeva …Hensenův uzel je struktura přítomná na zárodečném terčíku ptačích zárodků …Akrosom označuje koncovou část chromozomu …Při oplození do vajíčka vniká pouze jádro a krček spermie …Myotom je součástí parietálního listu laterálního mesodermu …Notogeneze probíhá v místě protilehlém k tzv. šedému srpku …Leydigovy buňky jsou uvnitř semenotvorných kanálků varlete ... Tzv. synaptický uzlík se tvoří ve druhém meiotickém dělení …První meiotické dělení se označuje též jako heterotypické …Stadium zygotene meiosy předchází stádiu leptogene …Podmínkou oplození vajíčka je vždy dokončení 2. meiotického dělení …Ledviny jsou derivátem mesodermu
158
…Mozek a mícha jsou deriváty ektodermu …Hladká svalovina střeva je derivátem mesodermu …Zona pellucida se tvoří po oplození vajíčka a brání polyspermii …Mléčná žláza patří mezi primární pohlavní znaky samic …Vajíčka člověka jsou po narození všechna ve stádiu homotypického dělení …Gamontogamie je jednou z forem nepřímého vývoje …Blastocysta je název pro blastulu obojživelníků …Každý dědičný znak je kódovaný dvěma allelami …RNA polymeráza III je enzym operující v translační fázi syntézy bílkovin …Telolecitální vajíčka se rýhují totálně a ekválně ….Barrovo tělísko představuje buněčnou inklusi v jádře …Gonochoristé mohou mít obě pohlavní žlázy, pokud nejsou obě aktivní ve stejnou dobu …Homogenita F1 generace kříženců je vyjádřením 2. Mendelova zákona …Balbianiho prstence jsou přechodné struktury na mikrotubulech mitotického vřeténka ....Hřbetní strana zárodku se tvoří v místě protilehlém k místu vniku spermie do vajíčka .... Desmin je molekula, která se vyskytuje ve středních filamentech některých buněk .... Zona pelucida vajíčka zajišťuje tzv. primární blok polyspermie . .. Coelom se označuje též jako primární (prvotní) tělní dutina .... Haploidní počet chromozomů vzniká v oocytu již po prvním meiotickém dělení .... Vyměšovací a sekundární pohlavní orgány jsou deriváty mesodermu ….Epibolie je jedním ze stádií meiosy Ke kapitole 7 …..Tzv. cDNA označuje komplementární DNA .…Tzv. restrikční enzymy jsou polymerázy nukleových kyselin . .…Plasmidy jsou vhodným vektorem cDNA do eukaryotních buněk ….Mezi tzv. vektory cizorodé DNA patří viry .... Tzv. cDNA vzniká reversní transkripcí Další tvořte sami ……………………………………………
9. 3 Úvahové úlohy Aplikujte tzv. „vědeckou metodu“ či „kritické myšlení“ na následující problém: V jisté průmyslové oblasti dlouhodobě znečištěné černým smogem byl pozorován četnější výskyt černých molů a úbytek jejich světlých variant Navrhněte způsob ověření této domněnky (hypotézy) a způsob jejího experimentální ověření Ryby v 2 nádržích mají různou hmotnost. Napište několik hypotéz, které by mohly tuto změnu vysvětlit. Pro každou hypotézu navrhněte i její experimentální ověření O tkáňovém vzorku, který jste získali při sekci ryby se domníváte, že je tvořen epiteliální tkání. Navrhněte metodický postup, kterým byste tuto hypotézu ověřili Prvotní zemská atmosféra byla bezkyslíková. Jak mohla probíhat oxidace energetických substrátů prvotním organizmy? Buňka byla ponořena do 1,5 % roztoku kuchyňské soli. Jak se změní její vzhled? Fluidita plasmatické membrány granulárního neutrofilního leukocytu se snížila. Co mohlo být příčinou? Jaké mohou být důsledky? Na buňku epitelu střevní sliznice dopadla mikrokapka Jaru na mytí nádobí. Jaké mohu být molekulární a funkční důsledky? V buňce byla zablokovaná depolymerace tubulinu. Jaké to může mít důsledky? V buňce došlo ke značnému zvětšení jadérka. Co se dá z toho usuzovat? V epiteliální tkáni se porušila funkce bazální laminy. Jaké budou důsledky za fyziologických podmínek a při hojení např. řezného poranění?
159
V měňavce došlo k poruše polymerace aktinu. Které funkce organizmu budou vyřazené? Vyskytuje se v těle člověka améboidní pohyb? Pokud ano, kde, pokud ne, proč ne? Je v těle člověka bičíkový nebo řasinkový pohyb? Pokud ano, kde, pokud ne, proč nemůže být? V epiteliální buňce došlo v důsledku mutace k vyřazení funkce G-proteinu. Které receptory v buňce ztratí svou funkci? Buňka byla ponořena do 200 mmol roztoku KCl. Jaké budou důsledky pro klidový membránový potenciál? Buňka byla ponořena do 5 mmol roztoku KCl. Jaké budou důsledky pro klidový membránový potenciál? Po kousnutí jedovatým hmyzem došlo k zablokování sodíkodraslíkové pumpy na plasmatické membráně. Jaké budou funkční důsledky? Které specifické enzymy se aktivují při procesu apoptózy? V epiteliální buňce došlo v důsledku mutace ke ztrátě funkce t-snares. Které funkce budou narušeny? V epiteliální buňce se změnily autoagregační vlastnosti klathrinu. Které funkce budou narušeny? O Kolonie paramecií byla vystavena teplotě 40 C. Syntéza kterých bílkovin mohla být indukována jako obranná reakce?
Proč se vařením stává vaječný bílek neprůhledným? Může se člověk rozmnožovat nepohlavně (ano-kdy a jak ??) Jsou všechny sacharidy sladké? Mohou být v tepelně opracované potravě přítomny některé enzymy? Pokud ano či ne, uveďte proč. Které procesy v buňce a organizmu vyžadují minoritní nebo stopové prvky? Uveďte konkrétně na molekulární úrovni. Jaké důsledky muže mít pro funkci buňky ztráta funkce lysozomů? Které organely se podílejí na syntéze ptyalinu (bílkovina) v epiteliálních buňkách slinných žláz a jeho vyloučení do vývodů těchto žláz?
Náměty na procvičení studované látky na praktikách . Losem vybrani 3 posluchači při dopoledním a 3 při odpoledním bloku pohovoří v 5 minutách o jedné vybrané otázce. Doporučuji si procvičit i o doma, nejlépe před nějakým posluchačem, nebo sám(a) před zrcadlem 1. Proč má plazmatická membrána všech živých buněk elektrický náboj? 2. Jaký je strukturální a funkční vztah mezi nukleozomální a chromatinovým vláknem? 3. Jaké funkce plní váčkový transport v buňce (odpověď endo a exocytózu je nedostačující) 4. Které molekuly zajišťují pohyb buněk a jejich organel? 5. Jak a kde probíhá v buňce rozklad poškozených bílkovin? 6. Které molekuly se účastní příjmu signálu, kterým je např. peptidický hormon? 7. Které molekuly se účastní příjmu signálu, kterým je např. steroidní hormon? 8. Lze opravit poškozenou bílkovinu? Jak? 9. Přes které organely musí projít bílkovina ptyalin dříve než se objeví ve slinách vašich úst? 10. K čemu v biologii slouží pokus a jaké jsou zásady jeho správného provedení? 11. Jaký je rozdíl v syntéze ATP v cytosolu a mitochondriích? 12. Jaký je rozdíl mezi tzv. Růstovými a transkripčními faktory? 13. Jakými mechanismy se přes plazmatickou membránu dostávají ionty? 14. Které organely buňky jsou nezbytné pro syntézu bílkovin? 15. Co řídí posun dělící se buňky z jedné fáze buněčného cyklu do fáze následující?
160
16. Co drží buňky v tkáních pohromadě? 17. Které molekuly tvoří mezibuněčnou hmotu a jaké jsou funkce jednotlivých molekul? 18. Uveďte alespoň 10 rozdílů mezi prokaroytí a eukarotní buňkou 19. Která vlákna cytoskeletu dominují v epitelu epidermis? 20. V čem se liší střední filamenta buněk epiteliálních a nervových? 21. V čem se morfologicky a funkčně liší kmenové buňky od buněk ostatních? 22. Jaký je význam kalciových iontů a co udžuje jejich homeostázu v bňce a jejich organelách? 23. Jaké jsou možné mechanismy transportu glukózy do buňky a z buňky? 24. Kde v buňce mohou zneškodňovány škodlivé chemické látky a jak? 25. Které funkce buňky budou narušeny při zástavě polymerizace tubulinu? 26. Funkce buňky budou narušeny při zástavě polymerizace aktinu? 27. Kde a za jakých okolností vznikají v buňce tzv. ROS? 28. Jaký je tozdíl mezi časným a pozdním endozomem? 29. Které molekuly se vyskytují v „pláštích“ buněčných váčků a jaká je jejich funkce? 30. Které jsou hlavní postranslační úpravy bílkovin a kde se uskutečňují? 31. Která buněčná signalizační cesta se přeruší vyřazením G-proteinů? 32. Mutace kterých skupin molekul může vést k nádorové transformaci buňky? 33. Definujte proces buněčné diferenciace na molekulární úrovni. Uveďte i konkrétní příklad. 34. Které všechny metabolické dráhy probíhají v mitochondriích? 35. Jaký je vztah Golgiho aparátu k endozomům? 36. Ve kterých metabolických procesech v buňce a živočišných tkáních se uplatňuje vitamin C? 37. Čím se může snížit fluidita plazmatické membrány a jaké jsou funkční důsledky? 38. Kde všude se v eukaroyntních buňkách vyskytují protonové pumpy a k čemu slouží? 39. Které jsou typické znaky apoptózy? 40. Navrněte pomyslné inhibitory (označte třeba látka A,B,C atd) a vysvětlete který krok-stádium apoptózy zablokují (např. A- blokátor (antagonista) TRAIL receptorů na plazmatické membráně, atd 9. 4
Grafická cvičení
Nakreslete čárovou kresbou schéma následujících struktur a napište názvy jednotlivých jejich částí: Endosymbiotického vzniku mitochondrií Vznik endoplazmatickho retikula a jaderné blány vchlipováním plazmatické membrány Molekulární stavby plazmatické membrány s vyznačením asymetrické distribuce lipidů Golgiho aparátu a jeho vztahu k tvobě lysozomů Tvorbu a jednotlivá stádia endozomu Stavbu nukleosomu, mitochondrie ribosomu Endozom-lysozomálního systému Sodíkodraslíkovou pumpu na plazmatické membráně ve vztahu k sodíkovému ko-transportu Nerstovu rovnici a její význam Iontový kanál Receptor spřažený s G-proteiny Amplifikaci signálů přes sekundární posly Váčky opláštěnýé klatrinem a coatomery s vyznačením v-SNARES Receptorově zprostředkovanou endocytozu Buněčného cyklu Buňky hynoucí apoptózou Spermatocytu a spermie Hlavních skupin adhezních bílkovin mezi buňkami a buňkami a mezibuněčnou hmotou Mikrotubulu v příčném řezu Bičíku v příčném řezu Centrioly v příčném řezu Sarkomery kosterního svalu Srdeční svaloviny Areolárního vaziva Víceřadého epitelu s řasinkami Přechodného epitelu Nervové buňky Ptačího vejce v řezu Průřez neurulou kopinatce a schéma neuronu Schema imunochemického barvení Objektiv mikroskopu s údaji o jeho vlastnostech
161
Vzorec rozlišovací schopnosti objektivu Schema tvorby hybridomu Dodatky ke Kapitolám 1-6 Pravdivé vs. nepravdivé tvrzení ANO- NE ..... V mitochondriích probíhá syntéza bílkovin ...... V hladkém endoplazmatickém retikulu probíhá syntéza lipidů ...... V hrubém endoplazmatickém retikulu začíná glykosylace bílkovin ...... Lipidické složení obou listů plazmatické membrány se liší ..... Hydrofilní molekuly pronikají plazmatickou membránou buňky převážně difuzí ..... Ribosomy jsou tvořeny malou, střední a velkou podjednotkou ......Lysozomy obsahují enzymy, které jsou aktivní při pH vyšším než 7.0 ...... Kolagen je součastí vláken cytoskeletu v buňce ..... Jadérko je místem syntézy i tzv. zrání ribosomální RNA ...... Histony se účastní přenosu elektronů v tzv. dýchacím řetězci buňky . ... Glykolýza probíhá pouze v cytosolu buòky ...... Energii pro syntézu ATP cestou oxidativní fosforylace poskytuje tzv. protonový gradient ..... H1 histony jsou vázány na DNA mezi jednotlivými nukleozomy .....Pro vznik membránového potenciálu buňky jsou rozhodující ionty draslíku .... Anafáze je 2. stadium mitotického dělení .... Peroxizomy rozkládají peroxid vodíku enzymem peroxidázou .....Golgiho aparát je organela, ve které probíhá syntéza lipidů .... -COH je karboxylová funkční skupina ..... Cytochromoxidáza je enzym operující v matrix mitochondrií .....Množství ATP syntetizované v citrátovém cyklu je větší než při oxidativní fosforylaci v dýchacím řetězci .... Transport iontů sodíku do buňky se uskutečňuje převážně difuzí .....Tzv. dýchací řetězec buňky je lokalizován na zevní membráně mitochondrií ..... V tzv. pentózovém cyklu probíhá oxidace glukózy .... Transferová RNA se účastní translační fáze syntézy bílkovin ..... Genetický kód může obsahovat uridin .... Dynein je bílkovina obsažena v bičících živočišných buněk ..... Cukerná zakončení se v plazmatické membráně vyskytují pouze na její zevní straně .... Tzv. zralá messenegrová (informační) RNA (mRNA) obsahuje segmenty nukleotidů zvané introny a exony .... Histony jsou bílkovinou součástí ribozomů .... Klathirn je jedna z bílkovin cytoskeletu .... Střední filamenta cytoskeletu zajišťují ameboidní pohyb buněk .... Cyklin B se podílí na regulaci vstupu buňky do G1 fáze buněčného cyklu .... Počet nukleotidů v nukleozomech závisí na typu buněk a živočišném druhu .....Cholesterol zvyšuje fluiditu plazmatické membrány .....V buňce je více sodíkových iontů než iontů draslíku .... Peroxizomy jsou místem oxidace některých aminokyselin ...... V hladkém endoplazmatickém retikulu probíhá syntéza lipidů a oxidace škodlivin ...... V hrubém endoplazmatickém retikulu začíná glykosylace bílkovin ...... Lipidické složení zevního a vnitřního listu biomembrán se liší v obsahu fosfatidylinositolu ..... Hydrofilní receptorové ligandy (agonisté) volně pronikají plazmatickou membránou do buňky ..... Ribosomy jsou tvořeny malou, střední a velkou podjednotkou ..... Nositelkou genetickou kódu je molekula jaderné nebo mitochondriální DNA ......Bílkovina tubulin je obsažena ve středních filamentech cytoskeletu některých eukaryotních buněk ..... Jadérko je místem syntézy i tzv. zrání ribosomální RNA ..... Histony jsou obsaženy v ribozomech, které syntetizují bílkoviny určené k sekreci cestou exocytózy ... Glykolýza probíhá pouze v cytosolu buňky i v přítomnosti kyslíku ..... Ubichinon (CoQ) je součástí dýchacího řetězce mitochondrií ..... H1 histony jsou vázány na DNA mezi jednotlivými nukleozomy .....Pro vznik membránového potenciálu buňky jsou rozhodující ionty draslíku .... K mitotickému rozpadu jadérka dochází na začátku anafáze .... Peroxizomy rozkládají peroxid vodíku enzymem peroxidázou .....Golgiho aparát je organela, ve které probíhá syntéza fosfolipidů pro nově tvořené biomembrány . .... Molekula sacharózy je disacharid tvořený 2 molekulami glukózy
162
.... Cytochromoxidáza je enzym operující v matrix mitochondrií .....Množství ATP syntetizované v citrátovém cyklu je větší než v dýchací řetězci .... Laminy jsou bílkoviny tvořící vlákna bazální laminy epitelů .....Telolecitální vajíčka obojživelníků se rýhují totálně a inekválně ..... Zárodečná buňka se stává haploidní již po oddělení tetrád .... Peptidická vazba se tvoří na P místě ribozomu za účasti ATP ..... Genetický kód může obsahovat uridin .... Nestin je bílkovina středních filament cytoskeletu .....Cukerná zakončení se v plazmatické membráně vyskytují pouze na její zevní straně .... Tzv. hnRNA obsahuje introny a exony .... Nukleozomální histony se syntetizují v jádře za účasti rRNA .... Klathrin je bílkovina tvořící plášť pozdních endozomů .... Střední filamenta cytoskeletu zajišťují ameboidní pohyb buněk .... Cyklin B se podílí na regulaci vstupu buňky do G1 fáze buněčného cyklu .... V průběhu diferenciace buněk se počet nukleotidů v nukleozomech zvyšuje nebo snižuje .....Cholesterol zvyšuje fluiditu plazmatické membrány .....V buňce je více vápníkových iontů než v jejím okolí
Doporučená literatura (použitá i při přípravě těchto skript. Doporučované elektronické zdroje jsou pouze pro osobní studijní potřeby. Jiné použití/šíření vyžaduje souhlas autorů použitých materálů). Základní knižní a internetové zdroje Obecná Biologie, O. Nečas, Grada 2001, kapitola II B Obecná Zoologie („modrá“ kniha), Romanovský a kol., APN Praha, 1985, kapitola 3, Rozmnožování živočichů www.lf3.cuni.cz/histologie/materiály/doc/skripta/_02.pdf http://www.sci.muni.cz/ptacek/zoologie.htm (viz též adresa níže v odstavci 2) PTÁČEK, Vladimír - ŽALUDOVÁ, Renata Další zdroje Kubišta V., Buněčné základy životních dějů, Scientia, 1998, kapitola 2.2.1 Alberts, Základy buněčné biologie, kapitola 2, Espero 1998. Nový přehled biologie, Rozsypal et al. 2003 (pouze toto vydání) Papáček, M.: Zoologie. Praha, Scientia 1994. Campbell, N. A.; Reece, J. B., Biologie 2000 Zrzavý J., Fylogeneze živočišné říše. Scientia 2006 Flégr J., Evoluční biologie, Academia, Praha, 2005 Růžičková K., Kotlík B., Chemie II. V kostce (pro střední školy), Fragment, 2004 R. A. Weinberg, Jediná odrodilá buňka. Jak vzniká rakovina. Edice mistři, vědy Academia 1998/2003 J. Petr, Klonování, hrozba nebo naděje? Paseka 2003
Pozor: Intenetové adresy nutno znovu vypsat ve vašem vyhledávači. Jsou vesměs staršího data. Proto hledejte nově dle klíčových slov Embryologie a reprodukce živočichů. 2005. WWW. více...poklep sem event. http://www.sci.muni.cz/ptacek/REPRODUKCE2.htmEmbryologie a reprodukce živočichů http://www.Ibp.cz/labs/PDG/Skriptum.pdf http://www.cellsalive.com/cell_cycle.htm dynamické zobrazení buňky (v angličtině) http://www.cellsalive.com/ živá buňka, dostupné též přes www.moje škola.cz, viz níže
http://www.mojeskola.cz/SkolaHrou/Linky/biologie.php?PHPSESSID=a9f0169dd3f85cf6c14 ecd05150af403 163
Vesmír z r. 1995-2005 http://www.vesmir.cz/
Další informace z Internetu (up-grade v přípravě. Novější informace vyhledat samostatně) 1. Širší a celo-oborové adresy Buňky a tkáně http://biology.ujep.cz/vyuka/mod/resource/view.php?id=272 (Studijní opory pro jednotlivé kurzy na KBI UJEP)
www.mujweb.cz/www/tyto/* www.zdravcentra.cz (možno i přes Seznam--Postup:rozšířené vyhledávání--odborné články nebo Nobelovy ceny nebo články časopisecké, event. klíčová slova) www.zdravcentra.cz (Postup: rozšířené vyhledávání--knihy-- Patobiochemie buňky). Pro Obecnou zoologii vždy jen uvodní odstavec každé kapitoly, kde je popis buněčných organel a funkcí. Autor knihy Masopust mujweb.cz/Veda/biologie/slovnicek.htm
http://callisto.si.usherb.ca:8080/rblouin/histo/menu.htm (callisto: atlas histologický. Možno též hledat dle klíčových slov animals tissue, histology, názvy jednotlivých typů tkání v češtině, angličtině nebo jiném jazyku)
http://cs.wikipedia.org/wiki/Cytologie http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/biobk/BioBookCELL2.html 2. Dílčí témata (viz Konečné heslo www. adresy) Vznik živé hmoty, fylogeneza eukaryontní buňky, taxonomie http://cs.wikipedia.org/wiki/Autotrofie Stránky Faunistické komise ČR http://bebecha.wz.cz/potkan.htm Taxomie motýlů viz http://spider.webzdarma.cz/motyli_text.htm, atp. http://wikipedia.infostar.cz/s/sc/scientific_classification_1.html http://cs.wikipedia.org/wiki/Systematika_%28biologie%29 http://www.langara.bc.ca/biology/mario/Biol1215notes/biol1215chap26.html
http://wikipedia.infostar.cz/s/sc/scientific_classification_1.html http://trishul.sci.gu.edu.au/courses/ss12bmi/microbe_structure.html (angl., vynikající srovnání pro- a eukaryotní buňky) Historie vynálezu mikroskopu http://www.quido.cz/objevy/mikroskop.htm Enzymy, biochemické reakce http://biomikro.vscht.cz/documents/oek.pdf http://www.espero.cz/pdf/kap3.pdf fosfolipidy biomembrán http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/part2/lipid.htm bílkoviny http://cs.wikipedia.org/wiki/B%C3%ADlkovina Jadérko http://genetika.wz.cz/oddil1.htm http://mujweb.cz/Veda/mitochondrie/6/6.htm) Bílkoviny http://www.ueb.cas.cz/laboratory_of_pollen_biology/pdf_subor/RNAsvet11.pdf obrazová presentace, česky www.vscht.cz/eds/knihy/uid_es-002/hesla/bilkoviny.html Prokaryonta genetika.wz.cz/prokaryota.htm Plazmatická membrána cs.wikipedia.org/wiki/Cytoplazmatick%C3%A1_membr%C3%A1na Organely, genová exprese kfrserver.natur.cuni.cz/cz/edu/FC_text/bb.htm (jádro, exprese genů, syntéza bílkovin) Metabolické dráhy – obecně http://www.espero.cz/pdf/kap3.pdf
164
http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/11/11.htm (ixidat fosforylace) Nukleové kyseliny, jádro, genomika www.biology.webz.cz/nuk.php http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/project/info.shtml http://www.genomeeducation.ca/GEcurious/index.asp?pg=health/ http://genetika.wz.cz/ http://cs.wikipedia.org/wiki/DNA Proteomika česky http://www.czproteo.cz/proteomics.cs.php Živočišné tkáně http://www.lfhk.cuni.cz/VIP/
Krev http://oldwww.upol.cz/resources/zoologie/hemat2.htm Další tkáně, vč. obrazové dokumentace dle klíčových slov Biotechnologie a genové inženýrství www.gjs.cz/vedy-o-zemi/genove-ing.htm genetika.upol.cz/syl/kbc_cgi.htm www.spotrebitele.cz/clanek.shtml?x=200160 www.osel.cz/tisk.php?clanek=112 www.strube-dieckmann.cz/Co%20jsou%20geneticke%20modifikace%20a%20 ... http://futurologie.czweb.org/archiv2003/genomika.htm http://genetika.wz.cz/rekombinantni_dna.htm http://genetika.wz.cz/clanky/genove_manipulace.php Apoptóza http://www.sanquis.cz/clanek.php?id_clanek=40 http://cs.wikipedia.org/wiki/Apopt%C3%B3za http://cs.wikipedia.org/wiki/Apopt%C3%B3za#Apopt.C3.B3zu_podporuj.C3.AD_.28proapoptick.C3.A9_f aktory.29 http://www.sanquis.cz/clanek.php?id_clanek=40 Syntéza bílkovin http://www.pawpaw.kysu.edu/biotech/ http://referaty.atlas.sk/prirodne_vedy/biologia_a_geologia/9940/?print=1 http://www.ueb.cas.cz/laboratory_of_pollen_biology/pdf_subor/RNAsvet11.pdf obrazová presentace, česky http://www.med.uottawa.ca/patho/devel/ Obranné mechanizmy buňky. Heat shock proteins, chaperony: http://www.antigenics.com/products/tech/hsp/ http://en.wikipedia.org/wiki/Heat_shock_protein, http://www.answers.com/topic/heat-shock-protein-1 Jiné mechanizmy: http://www.vesmir.cz/clanek.php3?CID=1052 Jádro,chromozomy, geny, genom http://iupui.edu / biomg817/content/11-1.pdf http://genetika.wz.cz/chromosomy.htm http://www.zdrava-rodina.cz/med/med0500/med0500_1.html http://cs.wikipedia.org/wiki/Gen http://cs.wikipedia.og/wiki/Alela http://www.biologyreference.com/Mo-Nu/Nucleus.html Genetika http://www.otevrena-veda.cz/ImgPageC1/Biolog/7paces.pdf (vznik života) http://genetika.wz.cz/dedicnost.htm http://mujweb.cz/Veda/mitochondrie/15/15.htm (matroklinita) http://voluta.unas.cz/2001_24/taxonomie.html i genetika, genetický drift http://biol.lf1.cuni.cz/ucebnice/en/information.htm#pristupnost (genetika, anglicky) Příjem informací buňkou http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/part2/signals.htm (anglicky) Proteazomy http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2004/public.html Mitochondrie http://genetika.wz.cz/clanky/clanek2.php http://www.ewa.cz/index.php?in=vypis&id=549&sekce=11&d=1>forum.living/ http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/4/4.htm http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/10/10.htm
165
http://www.qub.ac.uk/bb-old/provan/powerpoint/110BBC335s.ppt#284,3,The mitochondrion http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/19/19.htm (Mtch Eva) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/6/6.htm (fylogeneza mtch) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/7/7.htm (genom mtch) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/8/8.htm (mitoribosomy) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/9/9.htm (mtch membrány) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/11/11.htm (oxid fosforylace) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/12/12.htm (Krebsův cyklus) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/13/13.htm (oxid fosforylace II) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/14/14.htm Dělení mtch) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/15/15.htm (matroklinita) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/16/16.htm (rozpad mtch) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/17.htm (mtch a smrt buňky) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/18/18.htm (mtch a antropologie) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/20.htm (mtech a kriminalistika) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/21/21.htm (mtch a dědičné choroby) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/22/22.htm (mtch metody studia) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/23.htm (mtch závěr) http://mujweb.atlas.cz/Veda/mitochondrie/24.htm (mtch literatura) Buněčný cyklus, mitóza http://mujweb.cz/Veda/mitochondrie/7/7.htm http://www.barrettsinfo.com/content/5_how_does_cancer_develop_in_barretts.htm http://www.wormatlas.org/index.htm C.elegans stavba i barevné orázky http://www.cbs.umn.edu/CGC/ C.elegans hlavní vstup http://referaty.atlas.sk/prirodne_vedy/biologia_a_geologia/9940/?print=1 Meiosa
http://en.wikipedia.org/wiki/Meiosis
Apoptóza http://cs.wikipedia.org/wiki/Apopt%C3%B3za Nádorová tranformace buněk, onkogeny: http://www.vesmir.cz/clanek.php3?CID=1842 http://genetika.wz.cz/clanky/onkogenni_viry.php Embryologie a rozmnožování živočichů http://www.uoguelph.ca/zoology/devobio/splab2/sld003.htm rýhovaní vč. obr. http://en.wikipedia.org/wiki/Embryogenesis http://members.aol.com/BearFlag45/Biology1A/LectureNotes/lec27.html vc.oplození http://www.porodnice.cz/default.asp?rubrika=1&podrubrika=58 http://www.vesmir.cz/clanek.php3?CID=7295 polyspermie u člověka?
http://www.volny.cz/fledermaus/ homeotické gény http://www.osel.cz/index.php?clanek=258 homeotické gény http://rocek.gli.cas.cz/Courses/Morfologie3def.pdf The Basic Animal Groups By Laura Klappenbach http://animals.about.com/od/animal-facts/tp/animal-groups.htm Scientists estimate that there may be between 3 and 30 million species of animals on our planet. If you're just starting to learn about animals and wildlife, it would be an overwhelming task to try and memorize species, one by one. Instead, an understanding of the main groups of animals provides a good foundation for further learning. In this article, we'll take a look at six groups of animals, their characteristics and the types of organisms that belong to each group. Once you have a understanding of these six groups, you'll be on your way to grasping the basic characteristics of virtually every animal on the planet. Invertebrates were the first animals to evolve. Fossil evidence of invertebrates dates back to the late Precambrian, 600 million years ago. Invertebrates evolved from single-celled microorganisms. Since then, invertebrates have diversified into countless forms. An estimated 97 percent of all species are alive today are invertebrates. Invertebrates are united more by what they lack (a backbone) than by shared characteristics. Invertebrates include animal groups such as sponges, cnidarians, flatworms, molluscs, arthropods, insects, segmented worms, and echinoderms as well as many other lesserknown groups of animals.
166
Key Characteristics:
•
no backbone
•
earliest animals were invertebrates
•
more than 97 percent of all living species are invertebrates
•
ectothermic
Fishes were among the first vertebrates to evolve. The earliest known fishes were the ostracoderms, a now-extinct group of jawless fishes that appeared in the Cambrian Period, about 510 million years ago. Other early fish include the conodonts and the agnanthans (the hagfish and the lamprey). Fishes later evolved jaws and diversified into a number of lineages including cartilaginous fishes, ray-finned fishes and lobe-finned fishes. The ray-finned fishes are the most diverse of all vertebrate groups, with some 24,000 species. There are about 810 species of cartilaginous fishes and 8 species of lobe-finned fishes. Key Characteristics:
•
vertebrates
•
first animals to evolve jaws
•
breathe using gills
•
no limbs
•
ectothermic
Amphibians were the first vertebrates to make the move from life in water to life on land. Despite their early colonization of terrestrial habitats, most lineages of amphibians have never fully severed their ties with aquatic habitats. The first amphibians evolved from lobe-finned fishes approximately 370 million years ago during the Devonian Period. Amphibians include newts and salamanders, frogs and toads, and caecilians. There are between 5000 and 6000 species of known amphibians alive today. Amphibian species are in decline around the world due to a variety of threats including of invasive species, habitat destruction, disease, climate change and toxins. Key Characteristics:
•
vertebrates
•
tetrapods
•
ectothermic
•
aquatic larvae
•
first vertebrates to colonize terrestrial habitats
Reptiles are cold-blooded vertebrates that diverged from ancestral amphibians about 340 million years ago during the Carboniferous Period. Early reptiles included organisms such as Hylonomus, Petrolacosaurus, Archaeothyris and Paleothyris. The oldest evidence of reptiles is a set of footprints found in Nova Scotia. Two characteristics distinguish early reptiles from amphibians: scales and the ability to lay hard-shelled amniotic eggs. Reptiles include turtles, squamates, crocodiles and tuataras. There are about 8,000 species of reptiles alive today. Key Characteristics:
•
vertebrates
•
tetrapods
•
ectothermic
•
scales and scutes
•
amniotic eggs
167
Birds evolved from reptiles during the Mesazoic Era about 150 million years ago. Today, more than 9,000 species inhabit virtually every terrestrial habitat on the planet. Birds have a number of characteristics that sets them apart from other vertebrates such as feathers, bills and a furcula. Birds, best known for their ability to fly, are unmatched in their command of the skies. Albatrosses glide over the vast open sea, hummingbirds hover motionless in mid-air, and birds of prey capture prey with pinpoint accuracy. But not all birds are aerobatic experts. Some species such as ostriches, kiwis and penguins, lost their ability to fly long ago in favor of lifestyles suited more for land or water. Key Characteristics:
•
vertebrates
•
tetrapods
•
endothermic
•
feathers
•
bills
•
furcula
•
lightweight bones (bones that are either hollow or spongy/strutted)
•
fused bones in pelvis, feet, hands, and head
•
no teeth or maxillary bones of the jaw (reduces anterior weight)
•
four-chambered heart and high metabolic rates
•
produce large, richly provisioned external eggs
Mammals are vertebrates that evolved from therapsid reptiles during the Jurassic Period about 200 million years ago. The first mammals, known as morganucodontids, were nocturnal insect eaters that resembled modern-day shrews. For the better part of 130 million years, mammals remained small and lived in a world dominated by the dinosaurs. But around 65 million years ago, a drastic shift in climate caused the extinction of more than two-thirds of the animal species on the planet, including the dinosaurs. Today, mammals are remarkably varied, with some 5,400 species occupying every continent on the globe. Some of the better-known mammal groups include carnivores, rodents, elephants, marsupials, rabbits, bats, primates, seals, anteaters, cetaceans, odd-toed ungulates and even-toed ungulates. Key Characteristics:
•
vertebrates
•
tetrapods
•
endothermic
•
hair
•
mammary glands
•
lower jaw consists of a single bone
•
diphyodonty
•
three middle ear bones
•
diaphram
•
three-chambered heart
168
169
