Physiological functions of biliary lipid secretion
SAMENVATTING
De lever neemt een centrale plaats in in de regulering van de cholesterol huishouding. I: De lever speelt een belangrijke rol in de handhaving van het cholesterol gehalte in het bloed via de opname uit en uitscheiding naar het bloed van cholesterol-bevattende lipoproteinen en via de aanmaak van enzymen die het lipoproteinen metabolisme in de circulatie beïnvloeden. II: De lever maakt cholesterol in relatief grote hoeveelheden aan: de aanmaak van cholesterol in het lichaam is aanzienlijk groter dan de inname via de voeding. III: De lever is het enige orgaan dat in staat is cholesterol uit het lichaam te verwijderen in kwantitatief belangrijke hoeveelheden, namelijk via de uitscheiding in de gal. De uitscheiding vindt plaats in de vorm van vrij cholesterol of na omzetting van cholesterol in galzouten: in beide vormen verlaat het cholesterol uiteindelijk het lichaam via de faeces. Onder andere uit eerdere studies in ons laboratorium i s gebleken dat, naast de genoemde uitscheidingsfunctie, gal en het galvormingsproces op zich van belang zijn in de regulering van het cholesterol metabolisme op de verschillende niveaus in het lichaam. Gal bevat behalve cholesterol en galzouten ook hoge concentraties fosfolipiden. De hoeveelheid cholesterol en fosfolipiden die per dag via de gal in de darm wordt uitgescheiden is vele malen groter dan de hoeveelheid die via de voeding de darm binnenkomt. Bijna alle gal fosfolipiden en ongeveer 60% van het gal cholesterol worden heropgenomen uit de darm. Gal fosfolipiden hebben verschillende belangrijke taken. In de gal vormen fosfolipiden en cholesterol samen met galzouten “gemengde micellen” en beschermen op deze wijze de cellen die langs de galgangen liggen tegen de detergerende werking van de galzouten. Bovendien i s gesuggereerd dat fosfolipiden ook een functie vervullen in de absorptie van voedingsvet uit de darm. Omdat de galuitscheiding van fosfolipiden en cholesterol sterk gekoppeld is aan die van galzouten, was het tot voor kort moeilijk om de specifieke functies van deze lipiden onafhankelijk van die van de galzouten te onderzoeken. Een gerichte aanpak werd mogelijk door de recent sterk toegenomen kennis van het galvormingsproces en de daarbij betrokken transporteiwitten. Zo bleek het eiwit dat wordt gemaakt na aflezing van het mdr2 gen, het mdr2 P-glycoproteine (Pgp), betrokken te zijn bij de translocatie van fosfolipiden van de binnenste naar de buitenste “leaflet” van het gal canaliculaire membraan in de lever. Deze stap is essentieel voor de galuitscheiding van fosfolipiden. In 1993 is in het Nederlands Kanker Instituut te Amsterdam een muizenmodel ontwikkeld waarin middels homologe recombinatie het mdr2 gen i s (-/-) muis. In de Mdr2(-/-) muis bleek geen uitscheiding van geïnactiveerd: de Mdr2 fosfolipiden uitscheiding naar de gal plaats te vinden. Deze bevinding heeft het inzicht in de regulering van dit uitscheidingsproces sterk vergroot, hoewel het exacte moleculaire mechanisme ervan nog steeds onduidelijk is. Ook de (-/-) muis cholesterol uitscheiding in de gal is sterk verminderd (-98%) in de Mdr2 omdat deze gekoppeld is aan de fosfolipiden uitscheiding. De galzout uitscheiding (-/-) muizenmodel is het dus is echter normaal in deze muizen. Met het Mdr2 mogelijk om de gevolgen van een specifieke afwezigheid van gal fosfolipiden en cholesterol te onderzoeken. Het doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek is de fysiologische rol van deze gallipiden in de regulering van het cholesterol gehalte in het bloed, het galzout metabolisme en in vetabsorptie processen in de darm. 149
Samenvatting
Hoofdstuk 1 geeft een inleiding over het cholesterol en galzout metabolisme in de lever en het lipoproteinen metabolisme. Verder wordt de huidige kennis van galvorming en uitscheiding van gallipiden samengevat. In hoofdstuk 2 worden de effecten van de afwezigheid van lipiden secretie in de gal op het cholesterol gehalte in lever en plasma en op de cholesterol kinetiek beschreven. Er werden geen verschillen waargenomen in het gehalte aan (-/-) en cholesterol(ester), fosfolipiden en triglyceriden in de lever tussen Mdr2 controle muizen. Plasma HDL-cholesterol en apolipoproteine A-I concentraties (-/-) muizen, terwijl plasma apolipoproteine B waren sterk verlaagd in Mdr2 concentraties in de VLDL en LDL fracties verhoogd waren. De activiteit van het HMG-CoA reductase, het snelheidsbepalende enzym in de cholesterol biosynthese, in de lever was verhoogd. Cholesterol absorptie uit de darm bleek (-/-) met 50% verlaagd te zijn in de Mdr2 muis en de fecale uitscheiding van neutrale sterolen was 4 maal hoger dan in controle muizen. Deze laatste bevinding geeft aan dat de totale cholesterol synthese in het lichaam verhoogd moet zijn en dat het darmstelsel daarin een belangrijke rol speelt. Om te bepalen of het fenotype (deels) genormaliseerd kan worden via dieet manipulatie zijn fosfolipiden en cholesterol aan het voedsel van de muizen toegevoegd. Suppletie van fosfolipiden en/of cholesterol in de voeding had geen (-/-) muizen (Hoofdstuk 3). effect op het plasma cholesterol gehalte in Mdr2 Blijkbaar hebben de lipiden uitgescheiden via de gal een specifieke rol en is de aanwezigheid van deze lipiden in het darmlumen op zich niet van cruciaal belang (-/-) in dit opzicht. Wel bleek de toevoeging van cholesterol in de voeding van Mdr2 muizen te leiden tot een “cholestatisch beeld” met sterk verhoogde plasma galzout (-/-) en bilirubine concentraties, vooral in vrouwelijke Mdr2 muizen. De galvorming en de galzout- of bilirubinesecretie in de gal bleken niet te veranderen na cholesterol suppletie, maar de expressie van transporter eiwitten verantwoordelijk voor opname van galzouten uit het bloed door levercellen was sterk verlaagd in de (-/-) cholesterol-gevoede Mdr2 muis. De lever scheidt cholesterol uit zowel naar de gal als naar het bloed. Bij dit laatste proces wordt cholesterol in de lever verpakt in VLDL deeltjes en zo uitgescheiden in de circulatie. Er zijn aanwijzingen in de literatuur dat de flux van lipiden naar de gal bijdraagt aan de regulatie van VLDL uitscheiding. VLDL deeltjes worden door de lever uitgescheiden om perifere weefsels van energierijke substraten te voorzien tijdens periodes van vasten. Deze deeltjes bevatten, naast cholesterol(esters), ook triglyceriden en zijn de voorlopers van atherogene LDL deeltjes. Diverse factoren (o.a. insuline, cholesterol synthese, fosfolipiden synthese) zijn betrokken bij de regulatie van het VLDL (-/-) uitscheidingsproces. De afwezigheid van gal lipiden secretie in de Mdr2 muizen bleek geassocieerd met een veranderde secretie van VLDL deeltjes door de lever (-/-) muizen waren (Hoofdstuk 4). VLDL deeltjes geïsoleerd uit plasma van Mdr2 groter en bevatten meer triglyceriden dan VLDL van controle muizen. Uit het feit dat onder ‘steady state’ condities het plasma triglyceriden gehalte gelijk was terwijl het (-/-) muis kan worden plasma apolipoproteine B gehalte verhoogd was in de Mdr2 (-/-) muizen dan in afgeleid dat de triglyceriden efficiënter geklaard worden in Mdr2 controles. Galzouten spelen een belangrijke rol in de regulering van het cholesterol metabolisme, zowel op lever- als op darmniveau. Na uitscheiding in de gal worden galzouten efficiënt geresorbeerd en teruggevoerd naar de lever om daar opnieuw 150
Physiological functions of biliary lipid secretion
in de gal te worden uitgescheiden. Deze zogenaamde enterohepatische circulatie berust op de aanwezigheid van specifieke transport systemen voor opname uit het bloed (“Sodium-dependent taurocholate co-transporting protein”, Ntcp), uitscheiding naar de gal (“bile salt export pump”, bsep) en reabsorptie uit de darm (-/-) muizen zijn (“apical sodium-dependent bile salt transporter”, abst). In Mdr2 plasma galzout concentraties licht verhoogd ten opzichte van controle waarden, ook wanneer de muizen op een laag-cholesterol dieet worden gehouden. De natrium-afhankelijke galzout opname en de eiwit expressie van Ntcp waren lager (-/-) in de lever van Mdr2 muizen dan die van controle muizen (Hoofdstuk 5). Op het niveau van de mRNA gehalte werden geen veranderingen waargenomen tussen (-/-) de groepen, hetgeen impliceert dat down-regulatie van Ntcp in Mdr2 muizen op posttranscriptioneel niveau wordt gereguleerd.. De afwezigheid van gallipiden in de gal en de daarmee gepaard gaande galgang proliferatie bleek geassocieerd te zijn met een verhoogde expressie van (-/-) muizen. De verhoogde de apicale galzout transporter (abst) in lever van Mdr2 uitscheiding van lipiden-vrije galzouten via de gal was tevens geassocieerd met (-/-) muizen (Hoofdstuk 6). een verhoogde abst expressie in de darm van Mdr2 Lever expressie van abst is beperkt tot de cholangiocyten die de galgangen (-/-) muizen bleek bekleden. Deze verhoogde eiwit expressie van abst in de Mdr2 geassocieerd te zijn met een 70% toename van de galzout pool grootte. Echter, pool grootte, fractionele ‘turnover’ en synthese van het primaire galzout cholaat, een relatief hydrofoob galzout, was niet veranderd, hetgeen een aanwijzing is dat (-/-) muizen worden de meer hydrofiele galzout soorten die in de gal van Mdr2 gevonden efficiënter in de enterohepatische circulatie worden geconserveerd dan het meer hydrofobe cholaat. De laatste hoofdstukken van dit proefschrift behandelen de effecten van afwezigheid van gal lipiden secretie op de intestinale vet- en cholesterolabsorptie. Chylomicronen vorming en secretie door de darm bleek sterk vertraagd te zijn in (-/-) de Mdr2 muizen ten opzichte van de controle muizen (Hoofdstuk 7). Door gal in (-/-) muizen te infunderen bleek de vorming van de darm van deze Mdr2 chylomicronen gedeeltelijk te kunnen worden hersteld. De resultaten laten zien dat voedingsvetten wel in het darmepitheel worden opgenomen en vervolgens daar accumuleren. Een interessante bevinding was dat de totale vetabsorptie uit de (-/-) darm, gemeten met een 72-uurs vetbalans, niet was verminderd in de Mdr2 muizen. Een verklaring hiervoor kan zijn dat het lichaam de verminderde chylomicronen vorming compenseert door gedurende een langere tijdsperiode een groter deel van de darm actief in het absorptie proces te betrekken. Ondersteuning voor deze hypothese kan gevonden worden in het feit dat het (-/-) muizen. Het i s voedingsvet meer distaal in de darm accumuleert in Mdr2 theoretisch ook mogelijk dat vet deels direct via de poortader naar de lever wordt getransporteerd. De afwezigheid van gal lipiden secretie leidde tot een vertraagde opname in het plasma maar niet tot een veranderde totale absorptie van linoleenzuur, een (-/-) muizen essentieel vetzuur dat het lichaam niet zelf kan aanmaken, in de Mdr2 (-/-) (Hoofdstuk 8). Ook de lever en plasma status van linoleenzuur in Mdr2 muizen bleek niet aangetast te zijn. De resultaten van Hoofdstuk 7 en 8 gezamenlijk duiden er op dat gal lipiden secretie een rol speelt in de kinetiek van chylomicronen vorming/uitscheiding maar minder van belang is voor ‘overall’ efficiëntie van vet absorptie. 151
Samenvatting
Recente gegevens uit de literatuur duiden er op dat cholesterol in de gal een regulerende functie kan hebben in de efficiëntie waarmee voedingscholesterol uit de darm wordt opgenomen. Het SR-BI eiwit, de HDL receptor, is recent aangetoond in de darm van konijnen en het is gepostuleerd dan dit eiwit een rol vervult in de cholesterol absorptie. SR-BI bleek aanwezig te zijn in de apicale membraan van enterocyten in ratten en muizen en de expressie was hoger in de proximale delen van de darm (Hoofdstuk 9). In ratten en muizen waarbij de galgang werd afgebonden, leidend tot afwezigheid van gal in de darm en cholestase, bleek het SR-BI eiwit praktisch afwezig te zijn in de darm. In ratten waarin de gal via een canule buiten het lichaam werd geleid, een situatie waarbij geen gal in de darm komt, maar geen cholestase wordt geïnduceerd, was SR-BI nog wel aanwezig in de darm maar met een aanzienlijk lagere expressie dan in (-/-) controle ratten. Ook de Mdr2 muizen vertoonden een lagere eiwit expressie van SR-BI in de darm dan controle muizen. In alle diermodellen was sprake van een gestoorde cholesterol absorptie. Deze studies ondersteunen de hypothese dat gallipiden een rol spelen in de regulering van SR-BI expressie in de darm. Echter de exacte rol van SR-BI in de cholesterol absorptie is nog onduidelijk. De resultaten van deze studies tonen aan dat de flux van cholesterol (en fosfolipiden) van de lever via de gal naar de darm een belangrijke rol speelt in de regulering van het cholesterol metabolisme, die aanzienlijk verder gaat dan een functie in de verwijdering van overmaat cholesterol via deze route. 1. De afwezigheid van gal lipiden secretie leidt in de muis tot een verhoogd fecale cholesterol uitscheiding. Dit is paradoxaal, gezien het feit dat gal kwantitatief aanzienlijk meer (~2 maal) cholesterol levert aan de darm dan het dieet. Echter, ook in ratten met een permanente galfistel is de fecale sterol uitscheiding sterk toegenomen. Waarschijnlijk is de cholesterol synthese in de darm verhoogd als gevolg van afwezigheid van gal lipiden. Dit is in overeenstemming met het feit dat het mRNA gehalte van HMG-CoA reductase verhoogd is in de darm van de galfistel rat (Hoofdstuk 9). Kinetische studie geven aan dat veranderingen in cholesterol synthese in de darm niet per definitie reflecteren in de kinetiek van het sterol in het plasma compartiment (Hoofdstuk 3). (-/-) muizen. Laag HDL i s 2. Het plasma HDL gehalte is sterk verlaagd in de Mdr2 een belangrijke risicofactor voor het ontstaan van hart- en vaatziekten in de mens. Het is waarschijnlijk dat de verminderde chylomicronen vorming bijdraagt aan deze verlaging, aangezien overdracht van oppervlakte componenten van chylomicronen een belangrijke stap is in de vorming van HDL deeltjes. Andere factoren spelen echter mogelijk ook een rol, zoals een veranderde HDL kinetiek. De VLDL-triglyceriden en apoB secretie door de lever in de in vivo situatie is toegenomen, hetgeen bijdraagt aan verhoogde (-/-) muizen. Zowel apolipoproteine B spiegels in VLDL en LDL in Mdr2 verhoogde VLDL als LDL gehaltes zijn geassocieerd met een hoger risico op hart- en vaatziekten in de mens. 3. De afwezigheid van gallipiden secretie leidt tot galgang proliferatie. De hiermee geassocieerde verhoogde expressie van de apicale galzout transporter in lever (-/-) muis gaat en darm en de verlaagde Ntcp expressie in de lever van de Mdr2 gepaard met verhoogde plasma galzoutconcentraties en een toegenomen galzout pool. De verhoogde expressie van abst en de verlaagde expressie van (-/-) muizen zijn waarschijnlijk uitingen van Ntcp in de lever van de Mdr2 152
Physiological functions of biliary lipid secretion
compensatoire aanpassingen van het galzouttransport als reactie op de vorming van lipiden-vrije gal. De toegenomen eiwit levels van abst bij de galgang proliferatie lijkt geassocieerd met ‘cholehepatic shunting’ van (-/-) galzouten, wat leidt tot een hogere choleretische activiteit in Mdr2 muizen. 4. Afwezigheid van gallipiden is geassocieerd met een veranderde kinetiek van (-/-) vetabsorptie. De chylomicronen vorming is sterk vertraagd in de Mdr2 muizen, terwijl de totale vetabsorptie onveranderd is. Cholesterol absorptie, daarentegen, is wel verlaagd is deze muizen. Blijkbaar liggen andere mechanismen ten grondslag aan de absorptie van vetzuren en van cholesterol. De kennis is van belang in de ontwikkeling van cholesterol-verlagende therapieën in de mens, gebaseerd op specifieke blokkering van cholesterolabsorptie uit de darm. De vergrootte galzout pool (zie hierboven) (-/-) draagt mogelijk bij aan de efficiënte vetabsorptie in Mdr2 muizen. Gal vormt de “fysiologische verbinding” tussen lever en darm en beïnvloedt op beide niveaus de regulering van plasma lipoproteinen concentraties en dus het risico op hart- en vaatziekten.
153
Samenvatting
154
