PERUBAHAN KARAKTERISTIK KRISTALIN PATI GARUT (Maranta arundinaceae L.) DALAM PENGEMBANGAN PATI RESISTEN TIPE III
DIDAH NUR FARIDAH
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
ii
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini penulis menyatakan bahwa disertasi yang berjudul: Perubahan Karakteristik Kristalin Pati Garut (Maranta arundinaceae L.) dalam Pengembangan Pati Resisten Tipe III adalah karya penulis dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum pernah diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Disertasi ini.
Bogor, 19 Januari 2011
Didah Nur Faridah NRP F261060061
iii
iv
ABSTRACT DIDAH NUR FARIDAH. The Changes on Crystalline in the Development of Resistant Starch Type III from Arrowroot Starch (Maranta arundinaceae L.). Under the supervision of DEDI FARDIAZ as the chairman, NURI ANDARWULAN and TITI C. SUNARTI as advisory committe members. Studies on functional properties of nutritious food for health and fitness are increasing in line with the increasing awareness of the importance of healthy living. People consume foods not only to meet the nutritional needs but also to be able to provide functional effects in maintaining health and fitness as well as to improve physiological function. Food that can play a role on the above health effects is known as a functional food. One of food ingredients that can be used as a raw material for the manufacturing of functional foods is resistant starch (RS). RS is part of starch that is not digestible in a small intestine of a healthy human but it is fermentable by intestinal microflora to produce short chain fatty acids that are related to health. Arrowroot starch is potentially used as a raw material to produce a resistant starch type III (RS3), since naturally it consists of DP 9-30 in amylopectin structure. The objective of this study was to modify the arrowroot starch to increase RS content by (1) autoclaving-cooling (2) acid hydrolysis (lintnerization) (3) debranching (4) combination of the treatments. This effect of above starch modification on the crystallinity changes of arrowroot starch was also studied. This research was conducted in three steps as follows: (1) arrowroot starch extraction and characterization, (2) determination of starch modification processes (autoclaving-cooling, acid hydrolysis and debranching conditions), and (3) arrowroot starch modifications. The third steps consisted of different modification treatments, i.e (a) autoclaving-cooling, (b) acid hydrolysis, (c) debranching and autoclaving-cooling cycles, (d) acid hydrolysis and autoclaving-cooling cycles; (e) acid hydrolysis, debranching and autoclaving-cooling cycles. Arrowroot starch before and after modification was monitored (1) the changes of its chemical components, (2) resistant starch, amylose, reducing sugar content, and in vitro starch digestibility, (3) starch gelatinization profile by Rapid Visco Analyzer (RVA), (4) surface morphology by a polarized microscope and SEM (Scanning Electron Microscope); (5) changes of molecular weight distribution by GPC (Gel Permeation Chromatography (GPC), (6) chain length distribution of amylopectin by FACE (Fluorophore-Assisted Capillary Elec; (7) thermal stability and degree of retrogradation by DSC, and (8) changes of the crystalline and amor-phous regions by FTIR and X-ray diffraction. A wet starch extraction method yielded 15.69% of arrowroot starch. The arrowroot starch contained starch (98.10%), amylose (24.64%), amylopectin (75.36%), reducing sugar (4.94%) and resistant starch (2.12%). The analysis by RVA showed that arrowroot starch had an A-type starch gelatinization profile. Autoclaving-cooling process (AC) was conducted by initially pre-heating at o 80 C for 5 minutes followed by three cycles of autoclaving at 121oC for 15 minutes and cooling at 4oC for 24 hours. Starch hydrolysis (H2) was conducted by
v
HCl 2.2N for 2 hours (H2) while debranching by pullulanase at concentration of 1.3 U/g starch (D1) and 10.4 U/g starch (D10) at 50oC for 24-hours incubation. GPC analysis showed that arrowroot starch modified by autoclaving-cooling (AC), acid hidrolysis (H2), combination of acid hidrolysis and autoclavingcooling (H2AC), combination of debranching at 1.3 U/g starch or 10.4 U/g starch and autoclaving-cooling (D1AC and D10AC), and combination of acid hidrolysis, debranching and autoclaving-cooling (H2D1AC and H2D10AC) reduced amylopectin fraction and increased amylose fraction. The distribution of linear chains by using FACE indicated four groups of degree of polymerization (DP), i.e. DP 6-8, 9-12, 13-24 and 25-30. Modification treatments of arrowroot starch (AC, H2AC, D1AC, and H2D1AC) increased degree of polymerization (DP) 25-30 which contributed to the formation of RS3. Arrowroot starch debranched at a high concentration of pullulanase (D10AC dan H2D10AC) increased DP 11-12. Autoclaving-cooling treatment increased DP 6-8, especially that of debranched at a high concentration of pullulanase (10.4 U/g starch). All modification treatments of arrowroot starch raised the levels of RS3 and lowered starch digestibility. The highest resistant starch (39.30%) as the result of modification of arrowroot starch that mimiced to a commercial resistant starch (Novelose 330) was obtained from the combination of acid hydrolisis, debranching (10.4 U/g starch) and 3-cycle autoclaving-cooling. The X-ray diffraction analysis showed that native arrowroot starch had an A-type crystalline. In exception to that of acid hydrolysis treatment, the arrowroot starch changed to a B-type crystalline after modifications which were accompanied by the decrease of crystallinity from 20.01% to 9.37%. The analysis of thermal stability by DSC exhibited that modified arrowroot starch increased the degree of retrogradation and the endothermic enthalpy. In addition, FTIR analysis revealed that modification treatments increased the amorphous region by raising the wave number ratio of 1022/995 ranging from 0.991 to 1.030. It is recommended that resistant starch (RS3) of arrowroot starch can be produced by following procedure: Starch suspension (20%w/w) was hidrolyzed by HCl 2.2N for 2 h at 35oC, preheated at 80oC for 5 minutes, debranched by pullulanase (10.4 U/g starch) at 50oC for 24 h, and 3-cycles of autoclaving at 121oC for 15 minutes and cooling at 4oC for 24 h. This modification process yielded 39.3% resistant starch with in vitro starch digestibility of 54.81%. Keywords: arrowroot starch, resistant starch, acid hydrolysis, debranching, autoclaving-cooling.
vi
RINGKASAN DIDAH NUR FARIDAH. Perubahan Karakteristik Kristalin Pati Garut (Maranta arundinaceae L.) dalam Pengembangan Pati Resisten Tipe III. Di bawah bimbingan DEDI FARDIAZ sebagai ketua komisi pembimbing, NURI ANDARWULAN dan TITI C. SUNARTI sebagai anggota komisi pembimbing. Fungsi pangan semakin berkembang, bukan hanya untuk memenuhi kebutuhan gizi saja tetapi juga untuk dapat memberikan efek fungsional dalam menjaga kesehatan dan kebugaran tubuh serta memperbaiki fungsi fisiologis. Pangan yang dapat memberikan efek terhadap kesehatan tersebut dikenal dengan pangan fungsional. Salah satu ingredien pangan yang dapat dijadikan sebagai bahan baku untuk pembuatan pangan fungsional adalah pati resisten tipe III (RS3). Pati resisten merupakan bagian dari pati yang tidak dapat dicerna oleh usus halus manusia yang sehat tetapi dapat difermentasi oleh mikroflora usus untuk menghasilkan asam lemak rantai pendek yang berkhasiat untuk kesehatan. Pati garut berpotensi untuk digunakan sebagai bahan baku untuk pembuatan RS3. Penelitian ini bertujuan memodifikasi pati garut untuk meningkatkan kadar pati resisten tipe RS3, yaitu melalui proses (1) autoclaving-cooling, (2) hidrolisis asam; (3) debranching; dan (4) kombinasi hidrolisis asam, debranching dan siklus autoclaving-cooling. Pengaruh modifikasi pati tersebut terhadap perubahan sifat kristalitas dari pati garut juga dipelajari. Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahapan sebagai berikut : (1) Tahap ekstraksi dan karakterisasi pati garut, (2) Tahap penentuan kondisi proses modifikasi pati garut (autoclaving-cooling, hidrolisis asam dan debranching), dan (3) Tahap modifikasi pati garut yang terdiri dari perlakuan hidrolisis asam (lintnerization), pemutusan ikatan cabang amilopektin secara enzimatis (debranching) dan pemanasan suhu tinggi dan pendinginan secara berulang (siklus autoclaving-cooling), dan kombinasinya. Tahap ketiga terdiri dari beberapa perlakuan modifikasi, yaitu: (a) autoclaving-cooling, (b) hidrolisis asam, (c) debranching dan siklus autoclaving-cooling, (d) hidrolisis asam dan siklus autoclaving-cooling; (e) hidrolisis asam, debranching dan siklus autoclaving-cooling. Analisis pati yang dilakukan mencakup (1) analisis proksimat; (2) kadar pati resisten, kadar amilosa, kadar gula pereduksi, dan daya cerna pati in vitro; (3) profil gelatinisasi dengan Rapid Visco Analyzer (RVA); (4) morfologi pati dengan mikroskop polarisasi dan SEM (Scanning Electron Microscope); (5) perubahan struktur pati dengan GPC (Gel Permiation Chromatography); (6) distribusi panjang rantai amilopektin dengan FACE (Fluorophore-Assisted Capillary Electrophoresis); (7) kestabilan panas dan derajat retrogradasi dengan DSC (Diffrential Scanning Calorimetry); (8) perubahan daerah kristalin dan amorf dengan FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) dan difraksi sinar X. Metode ekstraksi basah menghasilkan rendemen 15,69% pati garut. Pati garut mengandung kadar pati, amilosa, amilopektin, gula pereduksi dan kadar pati resisten masing-masing sebesar 98,10%; 24,64%; 75,36%, 4,94% dan 2,12%. Analisis RVA menunjukkan pati garut memiliki profil gelatinisasi pati tipe A. vii
Proses autoclaving-cooling dilakukan dengan pemanasan awal pada 80oC selama 5 menit dan dilanjutkan dengan 3 siklus autoclaving pada suhu 121oC selama 15 menit dan pendinginan pada suhu 4oC selama 24 jam (AC). Proses hidrolisis asam dilakukan dengan HCl 2,2N selama 2 jam (H2). Proses debranching dengan enzim pullulanase dilakukan pada konsentrasi 1,3 U/g pati (D1) dan 10,4 U/g pati (D10) pada 50oC selama 24 jam. Hasil analisis GPC memperlihatkan perlakuan modifikasi pati garut, baik dengan autoclaving-cooling (AC), hidrolisis asam (H2), kombinasi hidrolisis asam dan autoclaving-cooling (H2AC), kombinasi debranching dan autoclavingcooling (D1AC dan D10AC), serta kombinasi hidrolisis asam, debranching dan autoclaving-cooling (H2D1AC dan H2D10AC) menyebabkan penurunan fraksi amilopektin dan peningkatan fraksi amilosa. Distribusi rantai linear baik dari hasil debranching amilopektin maupun hidrolisis amilosa yang diukur dengan menggunakan FACE menunjukkan empat rentang derajat polimerisasi (DP), yaitu 6-8, 912, 13-24, dan 25-30. Perlakuan modifikasi pati garut (AC, H2AC, D1AC, dan H2D1AC) meningkatkan DP 25-30 yang berkontribusi pada pembentukan RS3. Perlakuan debranching dengan konsentrasi enzim pullulanase yang tinggi (D10AC dan H2D10AC) meningkatkan DP 11-12. Proses autoclaving-cooling meningkatkan DP 6-8 dengan peningkatan yang cukup besar terutama bila dikombinasikan dengan debranching pada konsentrasi enzim tinggi (H2D10AC). Semua perlakuan modifikasi pati garut di atas dapat meningkatkan kadar RS3 dan menurunkan daya cerna patinya. Kadar pati resisten tertinggi (39,30%) hasil modifikasi pati garut yang mendekati kadar pati resisten komersial (Novelose 330) diperoleh dari perlakuan hidrolisis asam, debranching dengan konsentrasi tinggi (10,4 U/g pati) dan autoclaving-cooling. Hasil analisis dengan menggunakan difraksi sinar X menunjukkan bahwa pati garut alami memiliki kristalin tipe A dan berubah menjadi kristalin tipe B setelah mengalami modifikasi dengan semua perlakuan, kecuali pati garut yang hanya diberi perlakuan hidrolisis asam. Perubahan tipe kristalinitas tersebut menyebabkan penurunan derajat kristalinitas dari 20,01% menjadi 9,37%. Hasil analisis kestabilan panas dengan DSC menunjukkan bahwa modifikasi pati garut dapat meningkatkan derajat retrogradasi dan entalpi endotermik. Hasil pengukuran dengan FTIR juga memperlihatkan bahwa modifikasi pati garut meningkatkan bagian amorf melalui peningkatan rasio bilangan gelombang 1022/ 995 dari 0,991 hingga 1,030. Berdasarkan hasil penelitian ini, maka dapat direkomendasikan bahwa kadar pati resisten (RS3) pati garut dapat diproduksi dengan proses modifikasi sebagai berikut: suspensi pati (20%b/b) dihidrolisis asam dengan HCl 2,2N selama 2 jam pada suhu 35oC, kemudian dilakukan pemanasan awal pada suhu 80oC selama 5 menit, dan perlakuan debranching dengan menggunakan enzim pullulanase 10,4 U/g pati pada suhu 50oC selama 24 jam.
viii
Selanjutnya pati garut tersebut dipanaskan pada suhu 121oC selama 15 menit dan pendinginan pada suhu 4oC selama 24 jam (proses autoclaving-cooling dilakukan sebanyak 3 kali siklus). Proses modifikasi tersebut dapat menghasilkan kadar pati resisten sebesar 39,3% dan daya cerna pati sebesar 54,81%. Kata kunci: hidrolisis asam, debranching, autoclaving-cooling, pati resisten, daya cerna pati in vitro
ix
x
© Hak Cipta milik IPB, Tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.
xi
xii
PERUBAHAN KARAKTERISTIK KRISTALIN PATI GARUT (Maranta arundinaceae L.) DALAM PENGEMBANGAN PATI RESISTEN TIPE III
DIDAH NUR FARIDAH
Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
xiii
xiv
Judul Disertasi Nama NRP
: Perubahan Karakteristik Kristalin Pati Garut (Maranta arundinaceae L.) dalam Pengembangan Pati Resisten Tipe III : Didah Nur Faridah : F261060061
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof.Dr.Ir. Dedi Fardiaz,MSc Ketua
Dr.Ir. Nuri Andarwulan,MS Anggota
Dr.Ir. Titi Candra Sunarti Anggota
Diketahui, Ketua Program Studi Ilmu Pangan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr.Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi,MSc
Prof.Dr.Ir. Khairil A. Notodiputro,MS
Tanggal Ujian : 19 Januari 2011
Tanggal Lulus : 19 Januari 2011
xv
Penguji Luar pada Ujian Tertutup: 1. Prof.Dr.Ir Suminar T. Achmadi 2. Dr.Ir. Feri Kusnandar,MSc
Penguji Luar pada Ujian Terbuka: 1. Prof.Dr.Ir, Deddy Muchtadi,MS 2. Prof.Dr. Ridwan Tahir
xvi
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah Subhanuhu Wata’ala, karena atas karunia dan rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan pendidikan program Doktor Ilmu Pangan di Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan sebesar-besarnya kepada Prof.Dr.Ir. Dedi Fardiaz,MSc sebagai ketua komisi pembimbing serta Dr.Ir. Nuri Andarwulan,MS dan Dr.Ir. Titi Candra Sunarti,MS sebagai anggota komisi pembimbing, karena dengan pengarahan dan bimbingannya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan disertasi ini dengan sebaik-baiknya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof.Dr. Makoto Hisamatsu dan Dr. Naoto Isono di Mie University Jepang yang telah memberikan dukungan fasilitas laboratorium dalam melaksanakan sebagian dari penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof.Dr. Suminar S. Achmadi dan Dr.Ir. Feri Kusnandar,MSc sebagai penguji luar komisi dalam ujian kualifikasi Doktor dan penguji pada ujian tertutup atas masukannya dalam menyempurnakan disertasi ini. Ucapan terima kasih juga kepada Prof.Dr. Ridwan Thahir dan Prof.Dr.Ir. Deddy Muchtadi,MS sebagai penguji luar komisi pada ujian terbuka. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dekan Fakultas Teknologi Pertanian (Dr.Ir. Sam Herodian) dan Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan (Dr.Ir. Dahrul Syah) di Institut Pertanian Bogor yang telah mengizinkan dan mendukung penulis dalam melanjutkan program pendidikan Doktor Ilmu Pangan ini. Terima kasih juga kepada Ketua Program Studi Ilmu Pangan (Dr.Ir. Ratih Dewanti-Hariyadi,MSc) dan Kepala Laboratorium Analisis Pangan (Dr.Ir. Dede R. Adawiyah,MS) yang selalu mendukung dan menjadi tempat berbagi suka dan duka selama penulis menyelesaikan tugas belajar ini. Terima kasih juga kepada seluruh kolega staf pengajar dan tenaga kependidikan di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB yang tidak penulis sebutkan satu persatu atas dukungannya selama penulis mengikuti program pendidikan ini. Terima kasih kepada Ditjen DIKTI atas dukungan beasiswa BPPS selama masa studi, pemberian dana penelitian melalui Program Hibah Bersaing dan beasiswa untuk mengikuti program sandwich-like di Mie University, Jepang. Juga kepada PT ISM-Bogasari Flour Mills atas dukungan dana penelitian melalui Program Hibah Indofood Riset Nugraha. Program-program tersebut sangat membantu penulis dalam menyelesaikan studi ini. Ucapan terima kasih juga kepada teman sejawat di Program Studi Magister dan Doktor Ilmu Pangan angkatan 2005, 2007 dan khususnya angkatan 2006 yang telah melewati masa perkuliahan dan penelitian bersama penulis dengan penuh kebersamaan dan persahabatan. Juga kepada semua mahasiswa bimbingan penulis di Program Studi Teknologi Pangan yang telah banyak membantu. Dengan penuh rasa hormat dan kecintaan, penulis ucapkan terima kasih yang tulus kepada kedua orang tua penulis, Ayahanda tercinta almarhum H Ma’mun dan Ibunda almarhumah tercinta Hj Aisyah yang telah membesarkan dan
xvii
mendidik penulis dengan penuh ketulusan dan kasih sayang. Semoga proses menuntut ilmu yang telah penulis jalani ini merupakan bukti kecintaan penulis kepada mereka berdua. Penulis berdoa agar apa yang telah penulis tempuh ini dicatat Allah SWT sebagai amal kebaikan yang pahalanya dapat mengalir kepada mereka. Amin Ya Rabbal Alamin. Penulis ucapkan pula terima kasih kepada ketujuh kakak kandung penulis atas dukungan, doa dan curahan kasih penulisngnya yang tiada putus kepada penulis sebagai adik bungsunya dalam menyelesaikan pendidikan ini. Khususnya kepada kakakku Teh Adah, sebagai kakak yang sekaligus juga telah penulis anggap sebagai pengganti ibu, juga keponakan penulis Budi dan Neli yang yang telah menjadi tempat tumpuan penulis untuk berbagi dalam segala hal. Penulis ucapkan terima kasih banyak. Kepada kedua anakku tercinta, Gaida Salsabila dan Muhammad Adzka Noor, Mamah ucapkan terima kasih banyak karena kalian sangat memahami kondisi Mama yang harus berbagi antara pekerjaan, sekolah dan waktu untuk bersama-sama dengan kalian. Mamah mohon maaf karena kadangkala meninggalkan kalian berdua. Tetapi hal itu bukan berarti Mamah mengabaikan kalian atau berkurang rasa kasih sayang Mamah kepada kalian berdua. Mamah persembahkan karya disertasi ini untuk kalian berdua. Akhirnya kepada semua pihak yang telah membantu, memberi dukungan dan berkontribusi baik secara langsung maupun tidak langsung yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, penulis ucapkan terima kasih. Semoga Allah SWT dapat membalas kebaikan Bapak Ibu sekalian. Semoga disertasi ini dapat bermanfaat bagi masyarakat secara umum dan berkontribusi dalam perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, khususnya di bidang ilmu pangan. Bogor, 19 Januari 2011 Penulis
xviii
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tasikmalaya pada tanggal 17 November 1971 sebagai putri bungsu dari delapan bersaudara pasangan H Ma’mun (almarhum) dan Hj Aisyah (almarhumah). Pendidikan sarjana ditempuh di Program Studi Teknologi Pangan, Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor (19911996). Pada tahun 1996 dengan beasiswa dari URGE Bank Dunia, penulis melanjutkan pendidikan Program Magister di Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor dan menamatkannya pada tahun 2001. Pada tahun 2006, penulis melanjutkan Program Doktor di Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor dengan dukungan beasiswa BPPS. Sejak tahun 1998 hingga sekarang, penulis bekerja sebagai staf pengajar di bagian Kimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selama mengikuti pendidikan program Doktor, penulis menjadi anggota Perhimpunan Ahli dan Teknologi Pangan (PATPI). Salah satu artikelnya yang berjudul “Perubahan Struktur Pati Garut (Maranta arundinaceae L.) sebagai Akibat Modifikasi Lintnerization, Debranching dan Siklus Autoclaving-cooling” telah diterima untuk dipublikasikan pada Jurnal Teknologi dan Industri Pangan pada Volume XXI No. 2 Tahun 2010. Salah satu makalah ilmiah yang berjudul “Effects of Lintnerization, Debranching and Autoclaving-cooling Cycle Modifications to the Structure Changes of Arrowroot (Maranta arundinaceae L.) Starch” telah memperoleh penghargaan kedua dalam Graduate Student Paper Competition yang diselenggarakan oleh Perhimpunan Ahli Teknologi Pangan (PATPI) dalam International Seminar on Emerging Issues and Technology Developments in Foods and Ingredients pada 29-30 September 2010 di Jakarta.
xix
xx
DAFTAR ISI
Halaman DAFTAR ISI…………………………………………………………….……. xxi DAFTAR TABEL............................................................................................. xxv DAFTAR GAMBAR......................................................................................... xxvii DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... xxxi 1. PENDAHULUAN......................................................................................... 1.1.Latar Belakang....................................................................................... 1.2.Perumusan Masalah…………………………………………………... 1.3.Tujuan Penelitian................................................................................... 1.4.Manfaat Penelitian.................................................................................
1 1 4 4 5
2. TINJAUAN PUSTAKA............................................................................... 2.1. Umbi Garut........................................................................................... 2.2. Struktur Amilosa dan Amilopektin....................................................... 2.3. Model Struktur Granula Pati................................................................. 2.4. Pengaruh Proses Pengolahan terhadap Gelatinisasi dan Retrogradasi Pati…………………………………..………….…………………….. 2.4.1. Gelatinisasi Pati ……………………………………………….. 2.4.2. Retrogradasi Pati………………………………………………. 2.5. Pati Resisten.......................................................................................... 2.5.1. Jenis Pati Resisten....................................................................... 2.5.2. Pemanasan Suhu Tinggi-Pendinginan (Autoclaving-cooling)…. 2.5.3. Hidrolisis Asam secara Lambat (Lintnerisasi)............................ 2.5.4. Debranching oleh Enzim Pullulanase…………......................
7 7 10 13
3. METODE PENELITIAN............................................................................ 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian............................................................... 3.2. Bahan dan Alat..................................................................................... 3.3. Tahapan Penelitian................................................................................ 3.3.1. Proses Ekstraksi dan Karakterisasi Pati Garut........................... 3.3.2. Penentuan Kondisi Proses Modifikasi Pati Garut...................... 3.3.2.1. Penentuan Kondisi Siklus Autoclaving-cooling........... 3.3.2.2. Penentuan Kondisi Hidrolisis Asam............................. 3.3.2.3. Penentuan Kondisi Debranching.................................. 3.3.2.4. Analisis Statistika......................................................... 3.3.3. Pengaruh Modifikasi Pati Garu terhadap Pembentukan Pati Resisten……………………………………………………….. 3.3.3.1. Perlakuan Siklus Autoclaving-cooling…...................... 3.3.3.2. Perlakuan Hidrolisis Asam dan Siklus Autoclaving-cooling………………………….....................
xxi
22 22 25 28 29 32 37 39 43 43 43 44 46 46 46 48 49 50 50 50 51
3.3.3.3. Perlakuan Debranching dan Siklus Autoclavingcooling……………………….……………………..... 3.3.3.4. Kombinasi Perlakuan Hidrolisis Asam, Debranching, dan Siklus Autoclaving-cooling................ 3.3.3.5. Analisis Statistika......................................................... 3.4. Prosedur Analisis…………………………………………………….. 3.4.1. Analisis Proksimat..................................................................... 3.4.1.1. Kadar Air...................................................................... 3.4.1.2. Kadar Abu.................................................................... 3.4.1.3. Kadar Lemak................................................................ 3.4.1.4. Kadar Protein................................................................ 3.4.1.5. Kadar Karbohidrat........................................................ 3.4.2. Kadar Total Gula........................................................................ 3.4.3. Kadar Amilosa........................................................................... 3.4.4. Kadar Gula Pereduksi................................................................ 3.4.5. Kadar Pati Resisten.................................................................... 3.4.6. Daya Cerna Pati in Vitro............................................................ 3.4.7. Analisis Profil Gelatinisasi Pati................................................. 3.4.8. Analisis Morfologi Pati...……………………………………... 3.4.8.1. Mikroskop Polarisasi…………………….................. 3.4.8.2. Scanning Electron Microscope…………………...… 3.4.9. Analisis Perubahan Struktur Pati Garut………………………. 3.4.9.1. Distribusi Amilosa dan Amilopektin……………….. 3.4.9.2. Distribusi Panjang Rantai Amilopektin…………….. 3.4.10. Analisis Kestabilan Panas dan Derajat Retrogradasi……...… 3.4.11. Analisis Sifat Kristalinitas…………………………………... 3.4.11.1. Perubahan Daerah Kristalin dan Amorf ………....... 3.4.11.2. Pola Difraksi Sinar X………………………..…….. 4. HASIL DAN PEMBAHASAN.................................................................... 4.1. Ekstraksi dan Karakterisasi Pati Garut................................................ 4.1.1. Ekstraksi Pati Garut……………………………….………….. 4.1.2. Komposisi Kimia…………………………….……………….. 4.1.3. Bentuk dan Ukuran Granula………………………………….. 4.1.4. Profil Gelatinisasi Pati Garut…………………………………. 4.2. Penentuan Kondisi Proses Modifikasi Pati Garut............................... 4.2.1. Penentuan Kondisi Siklus Autoclaving-cooling……………... 4.2.1.1. Penentuan Suhu Pemanasan Awal…………………… 4.2.1.2. Penentuan Waktu Autoclaving dan Jumlah Siklus Autoclaving-cooling…………………………………. 4.2.2. Penentuan Kondisi Hidrolisis Asam………………………….. 4.2.3. Penentuan Kondisi Debranching…………………………...… 4.2.3.1. Aktivitas Enzim Pullulanase………………………... 4.2.3.2. Penentuan Konsentrasi dan Waktu Inkubasi Enzim Pullulanase………………………………………….. 4.3. Pengaruh Perlakuan Modifikasi terhadap Karakteristik Pati Garut 4.3.1. Perubahan Komposisi Karbohidrat…………………………… 4.3.1.1. Kadar Gula Pereduksi……………...……..………….
xxii
51 52 52 52 52 52 52 53 54 55 55 56 57 58 59 61 62 62 62 62 63 64 65 66 66 67 71 71 71 71 73 74 77 77 78 83 86 90 90 91 92 93 93
4.3.1.2. Kadar Pati Resisten……………………….................. 4.3.2. Daya Cerna Pati in Vitro………………………........................ 4.3.3. Struktur Morfologi Permukaan Granula Pati ……………....... 4.3.4. Perubahan Struktur Pati Garut…...…………………………… 4.3.4.1. Distribusi Amilosa dan Amilopektin………………... 4.3.4.2. Distribusi Panjang Rantai Amilopektin dan Amilosa Rantai Pendek…………………………………... 4.3.5. Kestabilan Panas dan Derajat Retrogradasi Pati……………… 4.3.5.1. Kestabilan Panas……………………...……………... 4.3.5.2. Derajat retrogradasi..................................................... 4.3.6. Sifat Kristalinitas Pati…………………………...……………. 4.3.6.1. Perubahan Daerah Kristalin dan Amorf…………....... 4.3.6.2. Pola Difraksi Sinar X…………………………………
94 97 99 102 102 108 114 114 117 118 118 121
5. SIMPULAN DAN SARAN.......................................................................... 131 5.1. Simpulan............................................................................................... 131 5.2. Saran..................................................................................................... 132 DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 135 LAMPIRAN....................................................................................................... 145
xxiii
xxiv
DAFTAR TABEL
Halaman 1.
Komposisi kimia umbi garut kultivar creole dan banana......................
9
2.
Bentuk dan ukuran granula pati garut dibandingkan sumber pati lainnya....................................................................................................
10
3.
Distribusi panjang rantai amilopektin....................................................
13
4.
Kristalinitas pati tipe A, B dan C pada kandungan amilosa yang berbeda...................................................................................................
20
Rekapitulasi kondisi modifikasi untuk meningkatkan kadar pati resisten pada berbagai jenis sumber pati................................................
33
6.
Komposisi kimia pati garut alami hasil ekstraksi cara basah.................
72
7.
Profil gelatinisasi pati garut dari hasil pengukuran Rapid Visco Analyzer (RVA)............................................................................................
76
Nisbah total karbohidrat pati garut pada fraksi I dan II sebelum dan setelah perlakuan modifikasi dari hasil analisis GPC............................
104
Persentase distribusi panjang rantai pada amilopektin dan amilosa rantai pendek dari hasil pengukuran dengan FACE...............................
109
10. Hasil pengukuran Diffential Scanning Calorimeter (DSC) pada pati garut alami dan hasil modifikasi............................................................
116
11. Perubahan daerah amorf dan kristalin dari pati garut pada berbagai perlakuan modifikasi berdasarkan hasil pengukuran dengan FTIR.......
120
12. Derajat kristalinitas dan tipe kristalin pati garut alami dan yang mengalami modifikasi............................................................................
123
13. Kristalinitas tiap puncak dari hasil data olah difraksi sinar X dari pati garut alami dan yang mengalami modifikasi …………………………
129
5.
8. 9.
xxv
xxvi
DAFTAR GAMBAR
Halaman 1.
Tanaman garut.......................................................................................
7
2.
Umbi garut: (a) sebelum dikupas; dan (b) sesudah dikupas..................
8
3.
Model molekul amilopektin yang diadopsi dari (a) French (1972); (b) Hizukuri (1986); dan (c) Robin et al. (1974)........................................
12
4.
Model daerah amorf dan kristalin dari granula pati...........................
14
5.
Model superhelix daerah kristalin yang terbentuk dari amilopektin...........................................................................................................
14
APTS, derivatisasi gugus pereduksi karbohidrat (A) dan pelabelan amilopektin dengan APTS (B) penentuan distribusi panjang rantai amilopektin dengan FACE....................................................................
16
Model struktur granula pati. (A) Daerah kristalin; (B) lamella amorf dan lamella kristalin; (C) Struktur double helix dari rantai amilopektin yang berdekatan membentuk lamella kristalin...........................
17
8.
Struktur granula pati berdasarkan model “Blocklet”............................
19
9.
Profil kristal pati hasil pengukuran dengan difraksi sinar X.................
19
10. Perbedaan struktur kristalin tipe A dan B dari pati...............................
21
11. Perubahan granula pati (alami: I) selama proses gelatinisasi, terjadi pengembangan (IIa) pelepasan amilosa (IIb), retrogradasi, proses penggabungan kembali rantai linear pati setelah dekristalisasi akibat gelatinisasi.............................................................................................
23
12. Profil gelatinisasi dengan pengukuran menggunakan Rapid Visco Analyzer (RVA) dan perubahan granula pati selama pemanasan..........
24
13. Mekanisme gelatinisasi dan retrogradasi pati........................................
26
14. Ilustrasi perubahan pasta pati selama siklus freeze-thaw......................
27
15. Model pembentukan pati resisten (R3): (a) model micelle); (b) model lamella...................................................................................................
31
16. Mekanisme pembentukan RS3 dari rekristalisasi amilosa akibat proses autoclaving-cooling....................................................................
35
17. Ilustrasi degradasi daerah amorf selama hidrolisis asam.......................
38
18. Pemotongan ikatan α-1,6 pada titik percabangan molekul amilopektin oleh enzim pullulanase...............................................................
40
19. Tahapan penelitian dalam proses modifikasi pati garut dan karakterisasinya..............................................................................................
45
20. Proses ekstraksi pati garut………………………………………..…..
47
6.
7.
xxvii
21. Profil kurva gelatinisasi pati dengan Rapid Visco Analyzer (RVA)….
61
22. Kurva Differential Scanning Calorimetry (DSC)..................................
66
23. Kurva difraksi sinar X yang sudah dihaluskan dan dibuat model Gaussian dan Lorentz............................................................................
68
24. Struktur granula pati garut alami di bawah mikroskop polarisasi.........
73
25. Struktur granula pati garut di bawah Scanning Electron Microscope (SEM)…………………………………………………………………
74
26. Profil gelatinisasi pati garut alami yang diukur dengan Rapid Visco Analyzer (RVA)…………………………….........................................
75
27. Pati garut yang diotoklaf tanpa proses pemanasan awal ……………..
79
28. Pati garut yang diotoklaf dengan proses pemanasan awal ……………
79
29. Perubahan kadar amilosa pati garut sebagai akibat pengaruh suhu pemanasan awal sebelum proses siklus autoclaving-cooling................
80
30. Daya cerna pati garut sebagai akibat pengaruh suhu pemanasan awal sebelum proses siklus autoclaving-cooling...........................................
81
31. Perubahan kadar gula pereduksi pati garut sebagai akibat pengaruh suhu pemanasan awal sebelum proses siklus autoclaving-cooling.......
82
32. Perubahan kadar pati resisten pati garut sebagai akibat pengaruh suhu pemanasan awal sebelum proses siklus autoclaving-cooling................
83
33. Daya cerna pati garut sebagai akibat pengaruh waktu autoclaving dan jumlah siklus autoclaving-cooling.........................................................
84
34. Kadar resisten pati garut sebagai akibat pengaruh jumlah siklus autoclaving-cooling dengan waktu pemanasan 15 menit......................
86
35. Daya cerna pati garut sebagai akibat pengaruh konsentrasi HCl dan waktu inkubasi selama hidrolisis asam..................................................
88
36. Kadar amilosa sebagai akibat pengaruh konsentrasi HCl dan waktu inkubasi selama hidrolisis asam............................................................
90
37. Pengaruh konsentrasi enzim pullulanase dan waktu inkubasi terhadap kadar gula pereduksi..............................................................................
92
38. Pengaruh perlakuan modifikasi terhadap kadar gula pereduksi pati garut.......................................................................................................
94
39. Pengaruh perlakuan modifikasi terhadap kadar pati resisten pati garut
96
40. Pengaruh perlakuan modifikasi terhadap daya cerna pati garut............
98
41. Struktur granula pati garut yang dimodifikasi dengan perlakuan (1) Hidrolisis asam 2 jam (2) Hidrolisis asam-autoclaving-cooling (3x)
100
42. Struktur granula pati garut yang dimodifikasi dengan perlakuan debranching dan autoclaving-cooling………………………………...
101
xxviii
43. Struktur granula pati garut yang dimodifikasi dengan perlakuan hidrolisis asam, debranching dan autoclaving-cooling……………….
102
44. Profil GPC pati garut dan termodifikasi pada sepharose toyopearl HW-65F.................................................................................................
103
45. Distribusi panjang rantai pada amilopektin dan amilosa rantai pendek dari hasil pengukuran dengan FACE.....................................................
110
46. Persentase panjang rantai pada pati garut termodifikasi dibandingkan dengan pati garut alami..........................................................................
111
47. Profil DSC pati garut alami dan yang mengalami modifikasi………...
115
48. Kurva hasil pengukuran FTIR dari pati garut alami dan yang mengalami modifikasi………………………………………………………..
119
49. Difraktogram pati garut alami dan yang mengalami modifikasi dari hasil smoothing………………………………………………………..
122
50a. Perubahan daerah amorf dan kristalin dari pati garut alami dan hasil hidrolisis asam dan autoclaving-cooling………………………...
125
50b. Perubahan daerah amorf dan kristalin dari pati garut dari hasil kombinasi perlakuan debranching dan autoclaving-cooling………….
126
50c. Perubahan daerah amorf dan kristalin dari pati garut alami dan hasil kombinasi perlakuan hidrolisis asam, debranching dan autoclavingcooling………………………………………………….......................
127
xxix
xxx
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1a.
Difraktogram difraksi sinar X pada pati garut alami, pati yang diberi perlakuan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus (AC), dan pati yang dihidrolisis asam selama 2 jam dan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus (H2AC)........................................................................................
145
1b. Difraktogram difraksi sinar X pada pati garut yang diberi perlakuan debranching dan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus......................
146
1c.
Difraktogram difraksi sinar X pada pati garut yang diberi perlakuan hidrolisis asam selama 2 jam, debranching dan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus...................................................................................
147
Kurva difraktogram dari hasil pemodelan persamaan Lorentz dan Gaussian. H2=hidrolisis 2 jam………………………………………...
148
Kurva difraktogram dari hasil pemodelan persamaan Lorentz dan Gaussian. H2=hidrolisis 2 jam; D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati; AC=autoclaving-cooling 3 siklus………..
149
Kurva difraktogram dari hasil pemodelan persamaan Lorentz dan Gaussian. D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati; AC=autoclaving-cooling 3 siklus………………………………..
150
2d. Kurva difraktogram dari hasil pemodelan persamaan Lorentz dan Gaussian. H2=hidrolisis 2 jam; D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati; AC=autoclaving-cooling 3 siklus…….....
151
3.
Contoh kurva kristalinitas setiap peak pada pati garut alami…………
152
4.
Hasil uji korelasi antar parameter analisis………………………….....
153
2a. 2c.
2c.
xxxi
I. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Kajian mengenai sifat fungsional pangan yang berkhasiat untuk kesehatan dan kebugaran semakin mendapat perhatian sejalan dengan semakin meningkatnya kesadaran masyarakat akan pentingnya hidup sehat. Fungsi pangan pun semakin berkembang, bukan hanya ditujukan untuk memenuhi kebutuhan zat gizi saja tetapi juga untuk dapat memberikan efek fungsional dalam menjaga kesehatan dan kebugaran tubuh serta memperbaiki fungsi fisiologis. Pangan yang dapat memberikan efek terhadap kesehatan tersebut dikenal dengan pangan fungsional. Salah satu ingredien pangan yang dapat dijadikan sebagai bahan baku untuk pembuatan pangan fungsional adalah pati resisten atau resistant starch (RS). Pati resisten adalah pati dan produk hasil degradasi pati yang tidak dapat dicerna oleh enzim α-amilase dalam usus halus manusia yang sehat tetapi dapat difermentasi oleh mikroflora usus untuk menghasilkan asam lemak rantai pendek (Champ 2004). Sajilata et al. (2006) menyatakan bahwa pati resisten dapat berperan dalam mengurangi resiko timbulnya kanker kolon, mempunyai efek hipoglikemik, berperan sebagai prebiotik, mengurangi resiko pembentukan batu empedu, mempunyai efek hipokolesterolemik, menghambat akumulasi lemak, dan meningkatkan absorpsi mineral. Pati resisten juga memiliki nilai kalori rendah, yaitu sebesar 11,7 kJ/g RS (Bauer et al. 2005) atau (1,9 Kkal/g), sehingga dapat dijadikan sebagai ingredien untuk pangan rendah kalori (Taggart 2004). Pati resisten (RS) dapat dikelompokkan menjadi empat tipe, yaitu pati resisten yang secara fisik terperangkap dalam sel-sel tanaman dan matriks bahan pangan (RS1), pati resisten yang secara alami sangat tahan terhadap pencernaan oleh enzim α-amilase (RS2), pati resisten yang dimodifikasi secara fisik (RS3) dan pati resisten yang dimodifikasi secara kimia (RS4) (Bird et al. 2000; Champ 2004; Liu 2005). Di antara keempat jenis pati resisten tersebut, pati resisten tipe III (RS3) merupakan tipe pati resisten yang paling banyak digunakan sebagai bahan baku pangan fungsional.
1
Pati resisten tipe III (RS3) dapat dihasilkan dari proses pemanasan suhu tinggi dan pendinginan secara berulang atau disebut siklus autoclaving-cooling. Proses ini dapat menyebabkan terjadinya retrogradasi fraksi amilosa, dimana kadar RS3 secara proporsional berbanding lurus dengan kandungan amilosa dalam bahan pangan (Shu et al. 2007). Proses retrogradasi pati tersebut menyebabkan terjadinya rekristalisasi dan meningkatkan pembentukan RS3. Kristalisasi ini disebabkan oleh adanya pembentukan double helix baru di antara molekul-molekul amilosa. Double helix yang terbentuk tersebut akan membentuk pembesaran (agregasi) dengan double helix pada molekul amilosa lainnya melalui ikatan hidrogen sehingga membentuk kristalit (Vasanthan et al. 1998). Peningkatan fraksi amilosa rantai pendek yang berperan dalam pembentukan RS3 dapat dihasilkan melalui proses hidrolisis asam secara lambat (lintnerization) atau pemutusan ikatan percabangan α,1-6 pada rantai amilopektin (debranching). Hidrolisis secara lambat oleh asam dan debranching dapat memperpendek panjang rantai α-glukan sehingga derajat polimerisasi (DP) menurun. Schmiedl et al. (2000) menunjukkan bahwa nilai DP antara 10-35 cukup optimal untuk meningkatkan kadar RS3. Nilai DP tersebut dapat diperoleh baik dengan cara menghidrolisis amilosa secara parsial maupun memotong titik percabangan rantai amilopektin (Lehmann et al. 2003). Beberapa teknik modifikasi pati untuk meningkatkan kadar pati resisten tipe III (RS3) telah dilaporkan, yaitu siklus pemanasan suhu tinggi dan pendinginan (autoclaving-cooling cycles) (Mahadevamma et al. 2003; Shin et al. 2004; Aparicio-Saguilan et al. 2005; Zabar et al. 2008), hidrolisis asam secara lambat yang dilanjutkan dengan siklus autoclaving-cooling (Onyango et al. 2006 dan Lehmann et al. 2003), pemutusan ikatan cabang α-1,6 amilopektin (debranching) oleh enzim pullulanase yang dilanjutkan dengan siklus autoclaving-cooling (Leong et al. 2007; Ozturk et al. 2009; Pongjanta et al. 2009a) atau kombinasi perlakuan hidrolisis asam secara lambat, debranching dan siklus autoclaving-cooling (Lehmann et al. 2003; Gonzales-Soto et al. 2004 dan 2007; Koksel et al. 2008a; Miao et al. 2009; Zhao dan Lin 2009). Beberapa penelitian sebelumnya telah berhasil meningkatkan kadar RS3 pada berbagai sumber pati dengan menggunakan salah satu metode tersebut di
2
atas atau kombinasinya, yaitu pati sagu (Leong et al. 2007), pati pisang (AparicioSaguilan et al. 2005), pati kacang merah (Lehmann et al. 2003), pati jagung tinggi amilosa (Ozturk et al. 2009), pati beras (Pongjanta et al. 2009a dan 2009b), pati jagung (Koksel et al. 2008a dan 2008b, Zhao dan Lin 2009), pati jagung tinggi amilopektin (Miao et al. 2009), pati pisang (Gonzales-Soto et al. 2004 dan 2007), pati singkong (Mutungi et al. 2009; Onyango et al. 2006) dan pati beras (Shu et al. 2007). Pati garut berpotensi sebagai sumber bahan baku RS3. Hasil pengamatan dengan menggunakan difraksi sinar X menunjukkan bahwa pati garut memiliki tipe kristalin A, rantai amilopektin pati garut memiliki derajat polimerisasi (DP) berkisar 9-30 dalam jumlah yang tinggi (96,0%) (Srichuwong 2006). Pati garut juga memiliki densitas yang lebih tinggi pada daerah struktur helikal (Wang et al. 1998), proporsi lebih tinggi pada rantai cabang amilopektin yang berukuran pendek (Hizukuri et al. 1983), serta jumlah rantai per klaster yang relatif lebih banyak bila dibandingkan dengan tipe kristalin B (Takeda et al. 2003). Struktur pati garut tersebut sangat mendukung dalam pembentukan RS3 apabila dilakukan proses hidrolisis dengan asam atau pemutusan ikatan cabang α-1,6 amilopektin (debranching) atau kombinasi keduanya yang dapat menghasilkan amilosa rantai pendek. Hingga saat ini belum ada laporan yang menyebutkan pengaruh hidrolisis parsial dengan asam, debranching, siklus autoclaving-cooling dan kombinasinya terhadap peningkatan kadar RS3 dari pati garut. Berdasarkan penjelasan di atas, maka diperlukan penelitian untuk dapat meningkatkan kadar pati resisten (RS3) dari pati garut dengan cara proses pemanasan suhu tinggi dan pendinginan secara berulang (siklus autoclavingcooling), proses hidrolisis asam (lintnerisasi) dan pemutusan ikatan cabang amilopektin secara enzimatis (debranching), atau kombinasinya. Kondisi proses untuk tiap perlakuan modifikasi di atas juga perlu ditentukan agar peningkatan RS3 dapat maksimal. Pengamatan terhadap perubahan struktur dan kristalisasi pada pati garut yang telah mengalami proses modifikasi tersebut juga diperlukan untuk mengetahui mekanisme perubahan struktur pati yang menjadikannya lebih resisten.
3
1.2. Perumusan Masalah Pati garut berpotensi untuk dijadikan sebagai bahan baku untuk menghasilkan pati resisten. Secara alami sebagaimana sumber pati lainnya, pati garut memiliki kadar pati resisten yang rendah. Salah satu cara untuk meningkatkan pati resisten adalah dengan proses retrogradasi pati yang dapat menghasilkan pati resisten tipe III (RS3). Retrogradasi pati dapat dilakukan dengan cara pemanasan pada suhu tinggi (autoclaving) yang dilanjutkan dengan proses pendinginan (cooling) secara berulang-ulang. Pati lebih mudah mengalami retrogradasi dalam bentuk molekul amilosa rantai pendek dengan derajat polimerasi (DP) berkisar 10-35. Semakin banyak jumlah fraksi amilosa rantai pendek maka semakin besar peluang terbentuknya pati yang teretrogradasi. Jumlah fraksi amilosa rantai pendek dapat ditingkatkan dengan cara menghidrolisis secara parsial ikatan glikosidik pada rantai molekul amilosa dan amilopektin, baik dengan hidrolisis asam maupun secara enzimatis. Proses hidrolisis asam secara parsial dapat menyerang bagian amorf dari granula pati yang dapat menghasilkan amilosa rantai pendek. Hidrolisis secara enzimatis dapat dilakukan secara spesifik dengan memotong ikatan glikosidik pada titik percabangan α-1,6 dari molekul amilopektin (debranching), yaitu dengan menggunakan enzim pullulanase. Hasil hidrolisis secara enzimatis ini pun dapat menghasilkan amilosa rantai pendek. Dengan adanya kombinasi hidrolisis asam atau secara enzimatis dan autoclaving-cooling, diharapkan jumlah fraksi amilosa rantai pendek bertambah sehingga jumlah pati yang mengalami retrogradasi dapat meningkat, dan sebagai akibatnya terjadi peningkatan kadar RS3. 1.3. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan memodifikasi pati garut untuk meningkatkan kadar pati resisten tipe III (RS3), yaitu melalui proses (1) siklus autoclaving-cooling, (2) kombinasi proses hidrolisis asam (lintnerisasi) dan siklus autoclaving-cooling; (3) kombinasi pemutusan ikatan cabang α-1,6 amilopektin (debranching) secara enzimatis dengan enzim pullulanase yang dilanjutkan siklus autoclaving-cooling; (4) kombinasi antara hasil hidrolisis parsial oleh asam (lintnerisasi), pemutusan ikatan cabang (debranching) amilopektin oleh enzim pullulanase dan siklus
4
autoclaving-cooling, serta mengkaji pengaruh modifikasi tersebut terhadap perubahan sifat kristalitasnya. 1.4. Manfaat Penelitian Penelitian ini memberikan informasi ilmiah tentang metode modifikasi pati garut dengan proses siklus autoclaving-cooling, hidrolisis asam secara lambat, debranching dan atau kombinasinya untuk dapat meningkatkan kadar pati resistennya (RS3). Hasil penelitian ini diharapkan dapat mendukung dilakukannya penelitian aplikasi RS3 dari pati garut termodifikasi pada berbagai sistem pangan, sehingga hasilnya dapat dijadikan sebagai dasar untuk pengembangan pangan fungsional yang bermanfaat untuk kesehatan.
5
6
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Umbi Garut Tanaman garut (Marantha arundinacea L.) merupakan tanaman tropis yang termasuk jenis rumput-rumputan tegak dengan tinggi 60-80 cm. Batang sejati tanaman garut terdapat dalam tanah dan berbentuk silinder yang menebal di ujungnya. Daun tanaman garut berbentuk bulat telur hingga lanset bulat telur yang berwarna hijau polos atau dengan bercak putih (Gambar 1). Tanaman garut dapat tumbuh pada ketinggian 0-900 m di atas permukaan laut (dpl) dengan pertumbuhan terbaik pada ketinggian 60-90 m dpl, pada kondisi tanah yang lembab dan terlindung dari sinar matahari langsung (Sastrapradja et al. 1977).
Gambar 1. Tanaman garut Tanaman garut berasal dari Amerika Tengah dan Amerika Selatan yang kemudian menyebar luas ke negara-negara iklim tropis seperti Indonesia, India, Sri Langka dan Filipina. Di Indonesia, tanaman garut banyak ditemukan di Sumatra, Nias, Jawa, Madura dan Bali (Lingga et al. 1986). Tanaman garut terdiri atas dua jenis kultivar yang penting, yaitu creole dan banana. Tanaman garut kultivar creole dapat tumbuh dan menyebar di dalam tanah dengan lebih dalam, sedangkan kultivar banana tumbuh dengan tandan terbuka pada permukaan tanah yang tidak terlalu dalam sehingga lebih mudah dipanen (Villamajor dan Jurkema 1996). 7
Umbi garut merupakan rhizoma dari tanaman garut dan dibungkus dengan sisik-sisik secara teratur dan berbentuk silinder (Gambar 2a). Umbi garut dapat dipanen setiap tahun dengan waktu rotasi 5-7 tahun dan dapat tumbuh kembali dengan hanya meninggalkan sisa ujung umbi saat dipanen (Lingga et al. 1986). Baik umbi kultivar creole maupun kultivar banana memiliki umbi yang berwarna putih, namun berbeda dalam bentuk dan ukuran umbinya. Kultivar creole memiliki umbi yang lebih panjang dan langsing, sedangkan kultivar banana mempunyai umbi yang lebih pendek dan gemuk. Apabila kulitnya dikupas, bagian dalam umbi garut berwarna putih (Gambar 2b). Tanaman garut kultivar creole banyak dibudidayakan di daerah Bogor dan menjadi prioritas kultivar yang dikembangkan oleh Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika, Cimanggu, Bogor.
(a)
(b)
Gambar 2. Umbi garut sebelum dikupas (a) dan sesudah dikupas (b) (Faridah et al. 2007) Tabel 1 menyajikan komposisi zat gizi dari umbi garut kultivar creole dan banana. Umbi garut kultivar creole merupakan sumber karbohidrat, yaitu sebagian besar karbohidrat penyusunnya adalah pati. Kadar pati umbi kultivar creole sedikit lebih tinggi (20,96%) dibandingkan dengan kultivar banana (19,40%). Kedua kultivar umbi garut tersebut memiliki kandungan protein dan lemak yang relatif rendah. Menurut Lingga et al. (1986), komposisi kimia umbi garut ini dapat berubah yang dipengaruhi oleh pada umur tanaman dan kondisi tempat tumbuhnya.
8
Tabel 1. Komposisi kimia umbi garut kultivar creole dan banana Kultivar Umbi Garut Komposisi Creole 1 Banana2 Air (%) 72,66 72,00 Abu (%) 0,81 1,30 Karbohidrat (%) 24,67 24,4 Protein (%) 1,59 2,20 Lemak (%) 0,28 0,10 Pati (%) 20,96 19,40 Serat Pangan Total (%bk) 7,95 Serat kasar (%) 0,60 1 Faridah et al. (2008), 2Kay (1973) Umbi garut sering dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai bahan makanan dan ramuan obat-obatan. Umbi garut yang masih muda biasanya dikukus, direbus, atau dibakar untuk dikonsumsi sebagai makanan kecil. Umbi garut muda ini rasanya manis, tetapi berangsur hilang kemanisannya dengan bertambah umur, karena terjadinya sintesis pati dan serat yang banyak. Umbi garut yang sudah tua umumnya diolah menjadi tepung atau diambil patinya (Yustiareni 2000). Pati garut mudah dicerna, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai makanan bayi atau makanan bagi orang yang mengalami gangguan pencernaan. Pati garut juga dapat dijadikan sebagai makanan bagi anak yang menyandang penyakit autis dan makanan diet bagi orang tua lanjut usia dan pasien yang dalam masa penyembuhan (Ariesta et al. 2004). Di samping sebagai bahan pangan, pati garut juga digunakan sebagai bahan baku non-pangan, seperti digunakan di industri kosmetik, lem, alkohol, dan tablet yang diinginkan bersifat mudah larut (Kay 1973). Sebagaimana sumber pati yang lain, pati garut tersimpan dalam bentuk granula pati yang berperan sebagai cadangan makanan. Tester dan Karkalas (2002) melaporkan bahwa granula pati garut berbentuk oval seperti granula pati sagu (Tabel 2). Ada juga yang melaporkan bahwa granula pati garut berbentuk bulat (round) dan poligonal. Ukuran granula pati garut dilaporkan berbeda-beda oleh peneliti, yaitu 5-70,0 µm (Tester dan Karkalas 2002), 5-50,0 µm (Moorthy 2002), 22,3-26,7 µm (Perez dan Lares 2005), dan 20-42,2 µm (Srichuwong et al. 2005a).
9
Tabel 2. Bentuk dan ukuran granula pati garut dibandingkan sumber pati lainnya1 Pati
Tipe
Garut Barley
Umbi Serealia
Bentuk Granula Oval Lentikular/bola
Jagung Amylomaize Jewawut Oat
Serealia Serealia Serealia Serealia
Bola/polyhedral Tidak beraturan Polihedral Polihedral
Sagu Gandum
Serealia Serealia
Oval Lentikular / Bulat
Beras
Serealia
Polihedral
Gandum hitam
Serealia
Lentikular / Bola
Sorghum Kacang tanah
Serealia Polong-polongan
Bola Rentiform (tunggal)
Kentang Tapioka
Umbi Umbi
Lentikular (bersudut) Bola / lentikular (bersudut)
1
Ukuran Granula (μm) 5 – 70 15 – 25 2–5 2 – 30 2 – 30 4 – 12 3 – 10 (tunggal) 80 (campuran) 20 – 40 15 – 35 2 – 10 3 – 8 (tunggal) 150 (campuran) 10 – 40 5 – 10 5 – 20 5 – 10 5 – 100 5 – 45
Tester dan Karkalas (2002) Granula pati garut tersusun oleh molekul amilosa yang berantai lurus dan
molekul amilopektin yang memiliki rantai bercabang-cabang. Sebagaimana jenis pati lainnya, kandungan amilopektin dalam pati garut lebih tinggi dibandingkan amilosa. Naraya dan Moorthy (2002) menyebutkan bahwa kadar amilosa pati garut berada pada kisaran 16-27%. 2.2. Struktur Amilosa dan Amilopektin Amilosa dan amilopektin tersusun oleh monomer α-D-glukosa. Amilosa mempunyai struktur lurus, yaitu α-D-glukosa yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan glikosidik α-1,4 dan memiliki dengan berat molekul sekitar 1x105– 1x106. Amilopektin mempunyai struktur bercabang-cabang, yaitu titik percabangannya dihubungkan dengan ikatan glikosidik α-1,6. Karim et al. (2000) menyebutkan kisaran yang berbeda untuk jumlah α-D-glukosa penyusun titik percabangan pada amilopektin, yaitu 20-30 unit anhidroglukosa. Amilopektin memiliki berat molekul lebih tinggi bila dibandingkan dengan amilosa, yaitu
10
sekitar 106-109. Berat molekul amilosa dan amilopektin berbeda untuk sumber pati yang berbeda. Hingga saat ini, belum ada laporan yang menyebutkan berat molekul amilosa dan amilopektin dari pati garut. Gugus-gugus hidroksil yang banyak pada struktur amilosa dan amilopektin memungkinkan terbentuknya ikatan hidrogen, namun dengan kekuatan ikatan yang berbeda. Bentuk molekul amilosa yang linear dengan jumlah gugus hidroksil yang banyak memungkinkannya untuk lebih mudah membentuk ikatan hidrogen satu sama lain, sehingga ikatan hidrogen yang terbentuk menjadi lebih kuat. Adanya ikatan hidrogen ini membentuk struktur heliks pada amilosa. Karena molekul amilopektin memiliki ukuran yang besar dengan struktur yang bercabang-cabang, maka ikatan hidrogen antara molekul amilopektin lebih lemah dibandingkan dengan ikatan hidrogen antar molekul amilosa (Liu 2005). Beberapa model struktur amilopektin dilaporkan oleh beberapa peneliti, yaitu oleh French (1972) (Gambar 3a), Hizukuri (1986) (Gambar 3b) dan Robin et al. (1974) (Gambar 3c). Imberty et al. (1991) menyatakan bahwa rantai linear amilopektin dengan DP ∼15 membentuk daerah kristalin dalam struktur granula pati. Rantai-rantai pendek tersebut membentuk struktur double helix oleh adanya ikatan hidrogen dan tersusun dalam bentuk klaster. Hizukuri (1986) mengilustrasikan model amilopektin dalam bentuk struktur klaster, yaitu sebanyak 80-90,0% dari keseluruhan rantai amilopektin terletak pada klaster tersebut, sedangkan 10-20,0% sisanya berperan dalam pembentukan ikatan antar klaster (Gambar 3b). Berdasarkan pada panjang dan titik percabangannya, rantai amilopektin dapat dibagi menjadi tiga bagian, yaitu bagian rantai A, rantai B dan rantai C. Bagian rantai A tersusun oleh struktur linear beran-tai pendek dengan DP 6-12. Bagian rantai B membentuk stuktur bercabang amilo-pektin yang mengikat rantai A atau rantai B lainnya (B1, B2 dan B3). Rantai B1 memiliki DP 13-24, rantai B2 memiliki DP 25-36 dan rantai B3 memiliki DP >37. Bagian struktur amilopektin berantai pendek dengan DP sekitar 6-24 terdapat pada rantai A dan B1. Rantai tersebut dapat membentuk struktur double helix dan terletak pada bagian luar (eksternal) dari struktur amilopektin. Klaster yang tersusun oleh rantai A dan B1 tersebut menyusun daerah kristalin
11
dalam granula pati. Rantai C membentuk struktur linear yang panjang, yaitu klaster rantai B terikat di titik percabangannya.
Gambar 3. Model molekul amilopektin yang diadopsi dari (a) French (1972); (b) Hizukuri (1986); dan (c) Robin et al. (1974). Dalam model tersebut φ menunjukkan ujung gula pereduksi (reducing end). Keterangan rantai (A), (B), (B1, B2 dan B3), dan (C) dijelaskan di dalam teks. CL menunjukkan panjang rantai (chain length). Daerah kristalin dan amorf ditunjukkan dengan kode 1 dan 2. Profil rantai amilopektin dapat diketahui dengan pengukuran menggunakan Size Exclusion Chromatography (SEC), Ion-exchange Chromatography (IEC) atau Fluorophore-Assisted Capillary Electrophoresis (FACE) dengan cara memotong dahulu ikatan-ikatan percabangan pada amilopektin secara enzimatis. Nisbah rantai A dan B dalam amilopektin dapat ditentukan dengan menggunakan enzim yang dapat memutus ikatan percabangan (debranching enzyme), yaitu enzim iso-
12
amilase dan pullulanase. Kedua jenis enzim tersebut dapat memutus secara spesifik ikatan-ikatan glikosidik α-1,6 sehingga membentuk struktur linear amilosa rantai pendek (Morell et al. 1998). Tabel 3 memperlihatkan distribusi panjang rantai amilopektin dari beberapa sumber pati yang dianalisis dengan menggunakan FACE (Srichuwong et al. 2005a). Terlihat bahwa sumber pati yang berbeda memiliki distribusi rantai amilopektin yang berbeda. Dibandingkan jenis pati lainnya, pati garut memiliki distribusi panjang rantai amilopektin pada DP 6-8 paling sedikit (4,0%). Distribusi rantai amilopektin pati garut yang terbesar berada pada kisaran DP 9-30 (96,0%). Tabel 3. Distribusi panjang rantai amilopektin1 Distribusi Panjang Rantai (%) Nisbah Sumber Pati 2 APC DP 6-8 DP 9-12 DP 13-24 DP 25-30 Tipe A Ubi jalar 0,419 11,0 27,9 54,1 7,0 Garut 0,352 4,0 27,7 58,4 9,9 Sagu 0,397 9,0 28,1 56,2 6,7 Talas 0,388 7,4 28,9 57,3 6,4 Singkong 0,489 9,9 36,3 48,3 5,5 Jagung 0,392 5,1 31,4 56,7 6,8 Beras 0,449 8,0 34,5 52,1 5,4 Tipe B Ganyong 0,312 7,2 21,5 63,4 7,9 Kentang 0,364 10,2 23,5 58,9 7,4 Tipe C 0,394 11,6 24,9 56,2 7,3 Lesser yam 1 Srichuwong et al. (2005a) 2
Nisbah APC (Amylopectin unit-chain) merupakan nisbah relatif molar distribusi amilopektin dengan DP 6-12 terhadap DP 6-24.
2.3. Model Struktur Granula Pati Buleon et al. (1998) membagi struktur granula pati menjadi daerah kristalin dan daerah amorf (Gambar 4). Daerah kristalin disusun oleh rantai pendek dari amilopektin dalam bentuk klaster. Menurut Oostergetel dan van Bruggen (1993), daerah kristalin pada granula pati membentuk struktur superheliks (Gambar 5). Daerah amorf merupakan daerah titik-titik percabangan dalam rantai amilopektin terbentuk dan daerah dimana molekul amilosa umumnya berada. Menurut Liu 13
(2005), ikatan hidrogen yang menghubungkan antar molekul amilosa dan atau amilopektin di daerah kristalin lebih kuat dibandingkan dengan di daerah amorf.
Gambar 4. Model daerah amorf dan kristalin dari granula pati (Buleon et al. 1998)
Gambar 5. Model superhelix daerah kristalin yang terbentuk dari amilopektin (Oostergetel dan van Bruggen 1993)
14
Teknik pelabelan dengan fluorofor dapat digunakan untuk menganalisis struktur amilosa (Hanashiro dan Takeda 1998) dan amilopektin (Morell et al. 1998; Edwards et al. 1999; Hanashiro et al. 2002; Nakamura et al. 2002). Distribusi panjang rantai amilosa dan amilopektin dapat dilakukan dengan teknik pelabelan pada rantai tersebut dengan menggunakan metode Size-exclusion Chromatographic (SEC) (Hanashiro dan Takeda, 1998; Hanashiro et al. 2002) atau elektroforesis dengan detektor Laser-induced Fluorescence (Morell et al. 1998). Distribusi panjang rantai glukan berdasarkan satuan molar dapat dilakukan dengan menggunakan metode Fluorophore-Assisted Capillary Electrophoresis (FACE) yang merupakan jenis instrumen DNA squencer. Metode analisis lain yang dapat digunakan untuk menganalisis panjang rantai glukan adalah High Performance Anion Exchanger Chromatography–Pulse Amperometric Detection (HPAECPAD) (Schmiedl et al. 2000; Lehmann et al. 2002). Menurut Morell et al. (1998), panjang rantai glukan dengan derajat polimerisasi (DP) 6-30 dapat dianalisis dengan menggunakan FACE. Pati dihidrolisis dengan menggunakan enzim isoamilase dan dilabel dengan senyawa 8-amino1,3,6-pyrenetrisulfonic acid (APTS) yang berfungsi untuk menderivatisasi gula pereduksi pada rantai glukan dan APTS membentuk kompleks dengan rantai glukan sehingga membentuk senyawa kromofor atau fluorofor yang dapat terdeteksi oleh FACE (O’Shea et al. 1998; Edwards et al. 1999) (Gambar 6). Metode FACE banyak digunakan untuk menganalisis derajat polimerisasi dari pati dan umumnya digunakan untuk menentukan panjang rantai amilopektin dengan DP 630. Srichuwong et al. (2005a) telah melakukan analisis DP amilopektin pada 15 jenis pati baik dengan menggunakan FACE maupun dengan HPAEC-PAD. Metode FACE juga digunakan oleh Singh et al. (2008) untuk melihat DP amilopektin pada kentang dan pati mangga serta pisang (Espinosa-Solis et al. 2009). Metode HPAEC-PAD sudah banyak digunakan di antara pada pati RS3 dari pati pisang (Lehmann et al. 2002), kacang merah (Lehmann et al. 2003) dan pati beras (Shu et al. 2007). Donald et al. (1997) mengilustrasikan daerah amorf dan daerah semi-kristalin pada granula pati dengan bagian tengahnya merupakan hilum sebagai titik pertumbuhan (Gambar 7). Daerah amorf dan daerah semi-kristalin digambarkan
15
A
λex 488 nm λem 520 nm
Gambar 6. APTS, derivatisasi gugus pereduksi karbohidrat (A) dan pelabelan amilopektin dengan APTS (B) penentuan distribusi panjang rantai amilopektin dengan FACE (Srichuwong 2006)
16
berselang-seling. Struktur tersebut digambarkan seperti cincin yang berlapis-lapis yang dimulai dari hilum ke arah luar secara radial. Daerah semi-kristalin tersusun oleh lamella amorf dan lamella kristalin, sedangkan daerah amorf sebagian besar tersusun oleh amilosa dan ikatan antar klaster. Ukuran satu lamella amorf dan satu lamella kristalin berkisar 9-10 nm, sedangkan satu lamella kristalin berkisar 5-6 nm. Perbedaan istilah dikemukakan oleh Gallant et al. (1997) yang membagi granula pati menjadi daerah kristalin dan semi-kristalin. Daerah kristalin menurut Gallant et al. (1997) sama dengan daerah semi-kristalin, sedangkan daerah semikristalin sama dengan daerah amorf. Seluruh jenis granula pati, termasuk granula pati garut, memiliki daerah kristalin dan amorf sebagaimana dijelaskan di atas.
Gambar 7. Model struktur granula pati (Donald et al. 1997). (A) Daerah kristalin; (B) lamella amorf dan lamella kristalin; (C) Struktur double helix dari rantai amilopektin yang berdekatan membentuk lamella kristalin Model granula pati yang lain menurut Gallant et al. (1997) adalah berbentuk “Blocklets” (Gambar 8). Daerah lamella kristalin-amorf disusun dalam bentuk spherical blocklets yang merupakan hasil pengamatan dengan menggunakan Atomic Force Microscopy (AFM) pada permukaan pati kentang dan gandum. Berdasarkan pengukuran menggunakan instrumen difraksi sinar X, pati alami diketahui memiliki derajat kristalinitas sebesar 15-45,0% (Zobel 1988). Kristalinitas granula pati dapat diamati dengan menggunakan metode difraksi sinar X (Pomeranz dan Meloan 2000). Puncak intensitas dari difraksi sinar X berhubungan dengan jumlah daerah kristalin di dalam granula pati (Cullity 1978; Stute 1992).
Dengan menggunakan difraksi sinar X, Zobel (1988) membedakan daerah semi-
17
kristalin pati menjadi tipe A, B, C dan V (Gambar 9). Kristalin tipe A umumnya ditemukan pada pati yang berasal dari serealia, seperti beras, gandum, dan jagung. Kristalin tipe B banyak ditemukan pada pati yang berasal dari umbi-umbian, amilomaize dan pati yang teretrogradasi. Kristalin tipe C yang merupakan gabungan antara tipe A dan B biasanya terdapat pada pati biji-bijian. Kristalin tipe V terjadi apabila amilosa membentuk kompleks dengan senyawa lain, seperti lemak. Pola difraksi sinar X tersebut dapat berubah oleh pemanasan, misalnya pati kentang dengan tipe B dapat berubah menjadi tipe A atau C dengan perlakuan Heat Moisture Treatment (HMT) (Liu 1997). Beberapa peneliti menggunakan difraksi sinar X dalam mengkarakterisasi perubahan struktur kristal dari pati (Stute 1992; Hoover dan Vasanthan 1994a dan 1994b). Stute (1992) menemukan bahwa perlakuan modifikasi Heat Moisture Treatment (HMT) pati kentang mengubah kristalinitas pati dari tipe B menjadi tipe A. Hoover dan Vasanthan (1994a) menemukan bahwa modifikasi dengan annealing juga mengubah kristalinitas pati non-sereal dari kristalin tipe B menjadi campuran kristalin tipe A dan B. Sebagaimana telah dijelaskan di atas, bagian non-kristalin dari granula pati disebut dengan amorf. Berdasarkan model klaster amilopektin (Gambar 7), daerah percabangan amilopektin merupakan daerah amorf. Molekul amilosa juga berada sebagian besar di daerah amorf tersebut dan dapat berinteraksi dengan rantai amilopektin. Berbeda dengan daerah kristalin, daerah amorf tidak menunjukkan pola difraksi sinar X (Zobel 1992). Daerah amorf ini mudah mengalami reaksi kimia, misalnya dihidrolisis oleh asam atau bereaksi dengan suatu gugus fungsional. Daerah amorf merupakan bagian yang dapat mengembang dalam proses gelatinisasi pati (Liu 2005). Distribusi daerah kristalin dan amorf dari pati telah didekati melalui hidrolisis asam. Hidrolisis oleh asam, terutama di awal proses, terjadi secara cepat pada daerah amorf yang mengandung titik percabangan α-1,6 dari molekul amilopektin dan sebagian besar amilosa. Selanjutnya, proses hidrolisis terjadi secara lambat di daerah kristalin. Kristalilitas granula pati dapat ditentukan dengan menggunakan pemisahan dan integrasi kurva di bawah puncak daerah kristalin dan daerah amorf dari pola difraksi sinar X. Derajat kristalinitas bervariasi dari
18
Gambar 8. Struktur granula pati berdasarkan model “Blocklet” (Gallant et al. 1997)
Gambar 9. Profil kristal pati hasil pengukuran dengan difraksi sinar X (Buleon et al. 1998)
19
15-45,0% (Tabel 4), tergantung pada sumber pati dan metode penghitungannya. Kristalinitas pati juga sangat dipengaruhi oleh kadar air dari granula. Kristalinitas pati tipe A dipengaruhi oleh kadar amilosa. Pada pati tipe B yang memiliki kadar amilosa yang cukup tinggi (seperti amilomaize), derajat kristalinitasnya lebih kecil dibandingkan dengan pati jenis lain pada tipe yang sama (ganyong dan kentang). Untuk pati tipe C, derajat kristalinitas tidak menunjukkan pola yang sistematis (Zobel 1988 dan Tang et al. 2001). Tabel 4. Kristalinitas pati tipe A, B dan C pada kandungan amilosa yang berbeda1 Pati Kristalinitas (%) Amilosa (%) Struktur Pati Tipe A Barley 22-27 22-27 Gandum 36 23 Beras ketan 37 Sorgum 37 25 Beras 38 17 Jagung 40 27 Waxy maize 40 0 Struktur Pati Tipe B Amilomaize 15-22 55-75 Edible canna 26 25 Kentang 28 22 Struktur Pati Tipe C Ubi jalar 38 20 Tapioka 38 18 1 Zobel (1988) dan Tang et al. (2001) Pola difraksi sinar X menunjukkan kristalin pati garut tergolong tipe A dengan karakteristik amilopektin pati garut memiliki derajat polimerisasi (DP) 930 yang cukup tinggi, densitasnya lebih padat pada daerah struktur heliks (menunjukkan semakin banyak double helix yang terbentuk) (Gambar 10) dengan derajat kristalinitas sebesar 31,5% (Wang et al. 1998; Srichuwong et al. 2005a), proporsi rantai cabang berukuran pendek pada amilopektin lebih tinggi (Hizukuri et al. 1983) dan jumlah rantai per klaster lebih banyak (10-23 per klaster) dibandingkan dengan kristalinitas tipe B (6-7 per klaster) (Takeda dan Hanashiro 2003). Apabila pati garut dengan jumlah rantai per klaster lebih banyak pada 20
molekul amilopektin dihidrolisis oleh enzim pullulanase (debranching) maka akan dihasilkan lebih banyak fraksi amilosa rantai pendek.
Gambar 10. Perbedaan struktur kristalin tipe A dan B dari pati (Tang et al. 2006) Karakteristik pati garut yang diukur dengan difraksi sinar X sebagaimana dijelaskan di atas menunjukkan potensinya untuk dijadikan sebagai bahan baku dalam pembuatan pati resisten. Semakin banyak fraksi amilosa rantai pendek baik hasil pemutusan ikatan percabangan amilopektin (debranching) atau hidrolisis asam, maka akan semakin banyak fraksi amilosa yang teretrogadasi sehingga kadar pati resisten yang terbentuk akan semakin tinggi. Menurut Lehmann et al. (2003), amilopektin dengan derajat polimerisasi (DP) kurang dari 10 dapat menghalangi pembentukan pati resisten, namun struktur linear dengan DP bekisar 1035 merupakan panjang rantai yang optimal untuk pembentukan pati resisten. Sementara itu, distribusi panjang rantai amilopektin pada pati garut dengan DP 13-24 cukup tinggi, yaitu sebesar 58,4%. Bila rantai-rantai tersebut dihidrolisis oleh enzim pullulanase pada titik percabangannya, maka diharapkan dapat meningkatkan pati resisten yang terbentuk.
21
2.4. Pengaruh Proses Pemanasan terhadap Gelatinisasi dan Retrogradasi Pati Gelatinisasi dan retrogradasi merupakan fenomena yang paling penting dari pati dan sangat berkaitan dengan sifat fungsional pati. Studi mengenai gelatinisasi dan retrogradasi pati dapat juga menjelaskan hubungan antara struktur dan sifat fungsional pati. 2.4.1. Gelatinisasi Pati Granula pati alami bersifat tidak larut dalam air, namun dapat menjadi larut dalam air bila suspensi pati dipanaskan di atas suhu gelatinisasinya. Bila pati disuspensikan dalam air yang berlebih dan dipanaskan pada suhu dan waktu tertentu, maka granula pati secara berangsur-angsur mengalami perubahan yang bersifat ireversibel, artinya tidak dapat kembali pada kondisi granula semula. Gelatinisasi pati ditandai dengan terjadinya pengembangan (swelling) granula pati, peluruhan (melting) dari bagian kristalit, hilangnya sifat birefringence, peningkatan kekentalan dan peningkatan kelarutan pati (Gambar 11). Suhu awal terjadinya gelatinisasi yang teramati dipengaruhi oleh konsentrasi pati, metode analisis, jenis pati dan keseragaman ukuran granula pati. Mekanisme gelatinisasi pati tersebut dapat dipelajari dengan beberapa teknik, yaitu dengan menggunakan instrumen viskometer, mikroskop optik, mikroskop elektron, difraksi sinar X, Differential Scanning Calorimetry (DSC), Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy dan X-ray scatting (Liu 2005). DSC digunakan untuk analisis termal dalam menentukan transisi kristalinitas pati yang diakibatkan oleh penambahan panas (Schenz dan Davis 1998). Pemecahan kristal pati adalah reaksi endotermik karena dibutuhkan sejumlah energi yang dapat diserap untuk memutuskan ikatan antara molekul. Perubahan panas dapat dideteksi dengan membandingkan panas yang diserap oleh sampel pati dengan referensi kosong. DSC dapat digunakan untuk mengamati dan mengukur suhu dan besarnya entalpi pada saat pati mulai mengalami pelelehan. Dalam proses gelatinisasi pati ini, granula pati secara berangsur-angsur mengalami pengembangan (swelling) dengan meningkatnya suhu pemanasan. Pengembangan granula pati terjadi karena molekul-molekul air masuk ke dalam granula pati dan terperangkap pada susunan molekul-molekul amilosa dan amilopektin. Dengan naiknya suhu suspensi pati, maka granula pati semakin membesar. 22
Gambar 11. Perubahan granula pati (alami: I) selama proses gelatinisasi, terjadi pengembangan (IIa) pelepasan amilosa (IIb), retrogradasi, proses penggabungan kembali rantai linear pati setelah dekristalisasi akibat gelatinisasi (Srichuwong 2006) Mekanisme pengembangan tersebut disebabkan ikatan-ikatan hidrogen yang menghubungkan molekul-molekul amilosa dan amilopektin semakin melemah dengan meningkatnya suhu pemanasan, sehingga mengganggu kekompakan granula pati. Di sisi lain, dengan meningkatnya suhu, maka molekul-molekul air mempunyai energi kinetik yang lebih tinggi sehingga dengan mudah berpenetrasi ke dalam granula pati. Dengan demikian, bila suhu suspensi pati meningkat, maka air akan terikat secara simultan dalam molekul amilosa dan amilopektin yang mengakibatkan pengembangan ukuran granula pati tersebut. Setelah pengembangan granula mencapai maksimum pada suhu pemanasan tertentu, maka granula pati akan pecah (rupture), sehingga pemanasan pada suhu yang lebih tinggi akan menyebabkan penurunan kekentalan pasta pati secara tajam (Meyer 2003, Parker 2003). Proses gelatinisasi pati seperti dikemukakan di atas dapat diamati dengan menggunakan alat Brabender Viscoamilograph (BVA) atau Rapid Visco Analyzer (RVA). BVA dan RVA mencatat data-data profil gelatinisasi selama fase pemanasan dan pendinginan, yaitu suhu awal gelatinisasi, viskositas puncak, viskositas breakdown, viskositas setback dan viskositas akhir (Gambar 12). Setiap jenis pati
23
memiliki profil gelatinisasi yang khas yang membedakan antara satu jenis pati dengan jenis pati yang lainnya. Dari parameter profil gelatinisasi tersebut, viskositas setback dapat menggambarkan kecenderungan pasta pati untuk mengalami retrogradasi selama fase pendinginan, yaitu semakin tinggi viskositas setback maka kecenderungan retrogradasi semakin meningkat (Srichuwong 2006).
Gambar 12. Profil gelatinisasi dengan pengukuran menggunakan Rapid Visco Analyzer (RVA) dan perubahan granula pati selama pemanasan (Srichuwong 2006) Schoch dan Maywald (1968) mengelompokkan pati berdasarkan profil gelatinisasinya ke dalam empat jenis, yaitu tipe A, B, C dan D. Profil gelatinisasi pati tipe A menunjukkan pati yang memiliki kemampuan mengembang yang tinggi yang ditunjukkan dengan tingginya viskositas maksimum dan diikuti dengan penurunan viskositas selama pemanasan (mengalami breakdown), contohnya pati kentang, dan tapioka. Profil gelatinisasi pari tipe B mirip dengan tipe A, tetapi dengan viskositas maksimum lebih rendah, contohnya pati dari serealia. Profil 24
gelatinisasi pati tipe C terdapat pada pati yang mengalami pengembangan yang terbatas yang ditunjukkan dengan tidak adanya viskositas maksimum dan viskositas breakdown (menunjukkan ketahanan panas yang tinggi), contohnya pati kacang hijau, pati yang dimodifikasi dengan ikatan silang dan heat moisture treatment (HMT). Profil gelatinisasi pati tipe D terdapat pada pati yang mengalami pengembangan terbatas yang ditunjukkan dengan rendahnya profil viskositas, misalnya pati yang mengandung amilosa lebih dari 55,0%. Proses gelatinisasi pati juga menyebabkan terjadinya diasosiasi double helix dari amilopektin dan peluruhan (melting) dari kristalit. Disosiasi double helix dari rantai amilopektin menyebabkan hilangnya sifat birefringence dan kristalinitas granula pati. Mekanisme disosiasi double helix selama proses gelatinisasi pati ini dapat diamati dengan menggunakan Differential Scanning Calorimetry (DSC). Puncak endotermik pada DSC menunjukkan hilangnya double helix dari amilopektin. Semakin tinggi suhu dan semakin besar total energi maka semakin kuat struktur kristalin pada granula pati (Cooke dan Gidley 1992). Proses gelatinisasi terjadi pertama-tama pada granula pati dengan ukuran besar, kemudian pada granula pati yang lebih kecil (Whisler dan BeMiller 1997). Pelepasan amilosa (amylose leaching) umumnya terjadi setelah pemanasan suspensi pati di atas suhu gelatinisasinya. Namun, beberapa amilosa juga dapat mengalami pelepasan dari granulanya pada pemanasan di bawah suhu gelatinisasinya. Hal ini disebabkan lokasi amilosa pada granula pati berada di daerah nonkristalin, di samping juga ukuran molekul amilosa yang relatif kecil serta berbentuk linear, sehingga lebih mudah berdifusi keluar dari granula pati (Whisler dan BeMiller 1997). 2.4.2. Retrogradasi Pati Fenomena retrogradasi pati disebabkan oleh terjadinya pembentukan kembali ikatan hidrogen antar molekul amilosa dan amilopektin. Retrogradasi pati terutama dipercepat dengan penyimpanan gel pati pada suhu rendah, yaitu umumnya pada suhu sekitar 4oC (Champ 2004). Retrogradasi pati terutama disebabkan oleh molekul amilosa, karena pembentukan ikatan hidrogen antar molekul amilosa lebih mudah terbentuk (Gambar 13). Semakin banyak fraksi amilosa yang keluar
25
dari granula selama proses gelatinisasi, maka semakin banyak pati teretrogradasi yang terbentuk selama proses retrogradasi (Srichuwong 2006).
Gambar 13. Mekanisme gelatinisasi dan retrogradasi pati (Srichuwong 2006) Retrogradasi pati dapat menyebabkan perubahan pada sifat gel pati. Perubahan yang terjadi di antaranya adalah peningkatan resistensi molekul amilosa dan amilopektin terhadap hidrolisis oleh enzim amilolitik, penurunan kemampuan transmisi cahaya dan hilangnya reaksi pembentukan kompleks berwarna biru dengan penambahan yodium. Retrogradasi pati juga meningkatkan kekuatan gel, menyebabkan gel pati kehilangan kemampuan mengikat air, dan terbentuknya kembali kristalinitas dengan ukuran yang besar (Ratnayake et al. 2002 dan Jane 2004). Perubahan akibat retrogradasi pati biasanya tidak diinginkan pada produk pangan berbasis pati atau tepung (Karim et al. 2000), karena retrogradasi dapat mengubah struktur dan sifat organoleptik pada produk pangan berbasis pati atau tepung, seperti pada sereal sarapan dan parboiled rice. Retrogradasi pati dapat menyebabkan produk tersebut menjadi keras atau kurang lengket. Apabila pasta pati atau gel pati dibekukan, maka air dalam larutan pasta pati tersebut berubah bentuk menjadi kristal es dan terpisah dari struktur gel pati. Air yang telah berubah bentuk menjadi kristal es tersebut mengakibatkan peristiwa retrogradasi dalam larutan pasta pati. Apabila pasta larutan pati yang telah beku 26
diletakkan kembali pada suhu kamar, kristal es tersebut akan kembali mencair dan air akan terpisah dari struktur pasta pati. Hal ini mengakibatkan terjadinya fenomena sineresis, yaitu keluarnya air dari pasta pati (Gambar 14). Derajat pemisahan air sering dinyatakan dengan persen sineresis, yaitu menunjukkan jumlah air yang terpisah setelah pasta pati disimpan pada siklus penyimpanan beku (-18oC). Semakin tinggi persentase jumlah air yang terpisah, maka pati tersebut semakin tidak stabil terhadap penyimpanan suhu beku. Analisis tersebut sering digunakan untuk mengukur tingkat kecenderungan retrogradasi pati (Karim et al. 2000; Srichuwong 2006).
Gambar 14. Ilustrasi perubahan pasta pati selama siklus freeze-thaw (Srichuwong 2006). Retrogradasi pati dipengaruhi oleh jenis pati, nisbah amilosa dan amilopektin, panjang dan distribusi rantai luar amilopektin, berat molekul amilosa dan amilopektin, dan distribusi ukuran granula pati. Molekul amilosa lebih cepat mempengaruhi pembentukan gel dan retrogradasi pati dibandingkan molekul amilopektin, sehingga pati yang mengandung amilosa cenderung mengalami retrogradasi lebih cepat (Gudmundsson 1994). Sebagai contoh, urutan kecenderungan pembentukan gel dan retrogradasi pati adalah sebagai berikut: pati jagung > pati gandum > pati kentang. Kandungan air dalam gel pati dan suhu penyim27
panan dapat mempengaruhi laju retrogradasi pati (Orford et al. 1987; Goodfellow dan Wilson 1990). Pada kadar air gel pati tertentu, air dapat berperan sebagai plastisizer yang dapat mempengaruhi suhu transisi gelas (Tg) dari daerah kristalin (Slade dan Levine 1987). Sebagai contoh, kristalisasi maksimum dari gel pati gandum terjadi pada kadar air 40-50,0% (Longton dan LeGrys 1981; Zeleznak dan Hoseney 1986), sedangkan pati jagung pada kisaran kadar air 50-80,0% (Liu dan Thompson 1998). Penyimpanan beku secara berulang (freeze-thaw) pada amilosa juga dilaporkan dapat meningkatkan retrogradasi sehingga dihasilkan struktur gel pati seperti sponge (Jane 2004; Liu 2005). Terjadinya proses retrogradasi pati dapat dipelajari dengan beberapa metode, yaitu (1) teknik makroskopis dengan memonitor perubahan sifat-sifat fisik/tekstur dengan menggunakan Brabender Viscoamilograph (BVA) atau Rapid Visco Analyzer (RVA), Differential Scanning Calorimetry (DSC), light scattering, pengukuran derajat sineresis, serta (2) teknik molekuler dengan mempelajari perubahan konformasi pati atau mobilitas air dalam gel pati pada tingkat molekul dengan menggunakan difraksi sinar X, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), spektroskopi vibrasi/Raman spectroscopy dan Fourier Transform Infrared (FTIR) (Karim et al. 2000). Pengukuran dengan difraksi sinar X memperlihatkan bahwa pati yang teretrogradasi memiliki pola kristalin tipe B (Zobel 1988). 2.5. Pati Resisten Pati dapat diklasifikasikan menjadi pati yang dapat dicerna dan yang tidak dapat dicerna (resisten). Pati yang dapat dicerna adalah pati yang dapat dipecah (didegradasi) menjadi glukosa oleh enzim di dalam saluran pencernaan. Pati yang dapat dicerna ini dapat dikategorikan lebih lanjut ke dalam kelompok pati yang dapat dicerna dengan cepat (rapidly digestible starch) dan pati yang dapat dicerna secara lambat (slowly digestible starch) (Liu 2005). Selanjutnya dijelaskan bahwa proses ekstraksi pati, terutama pada tahap penggilingan, dapat menyebabkan struktur sel tanaman mengalami kerusakan dan menghasilkan pati yang mudah mengalami gelatinisasi dan menghasilkan pati yang lebih mudah dicerna di dalam usus halus.
28
Pati yang tidak dapat dicerna (non-digestible starch) atau pati resisten atau resistant starch (RS) merupakan bagian dari pati yang tidak dapat dicerna oleh enzim pencernaan dan tidak diserap di dalam usus halus, namun dapat mengalami proses fermentasi secara lambat oleh mikroflora di usur besar (Liu 2005). Pati resisten pertama kali diperkenalkan oleh Englyst et al. (1992). Sebagaimana pada serat pangan, pati resisten dapat difermentasi oleh mikroflora pada dinding kolon dan menghasilkan asam lemak rantai pendek (short chain fatty acid atau SCFA). Profil SCFA yang diperoleh dari pati resisten banyak mengandung asam asetat, propionat dan butirat. Dibandingkan sumber serat lainnya, hasil fermentasi dari pati resisten lebih banyak mengandung asam butirat. Pati resisten memiliki sifat dan fungsi seperti serat pangan, yaitu mengandung nilai energi yang rendah, dapat menurunkan indeks glikemik, menurunkan level kolesterol dalam darah dan menurunkan resiko kanker kolon dengan cara memperbanyak produksi asam lemak rantai pendek, terutama asam butirat (Liu 2005). Di samping memiliki efek fisiologis terhadap kesehatan, pati resisten juga mempunyai sifat fungsional yang dapat diaplikasikan dalam proses pengolahan pangan (Liu 2005). Pati resisten dapat digunakan sebagai bahan pengisi (bulking agent) dalam produk pangan rendah gula dan lemak. Pati resisten mempunyai daya ikat air yang lebih rendah dibandingkan serat pangan, sehingga tidak berkompetisi dengan ingredien lain untuk memperoleh air, lebih mudah diolah dan tidak menyebabkan produk menjadi lengket. Dengan demikian, pati resisten dapat berguna dalam formulasi pangan dengan kadar air rendah, seperti cookies dan cracker. Penggunaan pati resisten dalam produk pangan seperti roti, cracker, dan muffin memberikan rasa, mouthfeel dan penampakan yang lebih baik dibandingkan bila ditambahkan serat pangan. Dalam beberapa aplikasi lainnya, pati resisten tidak mengubah rasa, tekstur dan penampakan produk. Kandungan pati resisten dalam beberapa produk pangan telah dilaporkan, seperti pada roti (2,2-4,3%), sereal sarapan (0,0-9,0%), dan produk pasta (1,3-4,2%) (Wursch 1999). 2.5.1. Jenis Pati Resisten Pati resisten (RS) diklasifikasikan dalam empat kelompok berdasarkan pada asal dan cara proses pembuatannya, yaitu tipe RS1, RS2, RS3 dan RS4. Pati resisten tipe I (RS1) merupakan pati yang terdapat secara alamiah. RS1 secara 29
fisik terperangkap dalam sel-sel tanaman dan matriks dalam bahan pangan kaya pati, terutama dari biji-bijian dan sereal, di antaranya pati dari padi yang digiling kasar. Jumlah RS1 dipengaruhi oleh proses pengolahan dan dapat dikurangi atau dihilangkan dengan penggilingan. Pati resisten tipe II (RS2) merupakan pati yang secara alami sangat resisten terhadap pencernaan oleh enzim α-amilase, biasanya granula pati yang termasuk bentuk kristalin tipe B berdasarkan hasil pengukuran difraksi sinar X, seperti pisang dan kentang yang masih mentah, serta jenis pati jagung dengan kadar amilosa yang tinggi. Pati resisten tipe III (RS3) adalah pati teretrogradasi. Pati ini diproses dengan pemanasan (gelatinisasi) suspensi pati dan dilanjutkan dengan pendinginan pada suhu rendah (4oC) sehingga mengalami retrogradasi. Retrogradasi pati terjadi melalui penyusunan kembali terutama rantai linear (amilosa) setelah proses gelatinisasi. RS3 dapat diperoleh dalam gel pati, tepung, adonan, produk yang dipanggang, dan amilosa hasil fragmentasi. Sifat resisten tersebut disebabkan oleh adanya pati yang teretrogradasi. Pati resisten tipe IV (RS4) adalah pati termodifikasi secara kimia, seperti pati ester, pati eter atau pati ikatan silang (Bird et al. 2000; Champ 2004; Liu 2005). Menurut Liu (2005), sumber pati resisten komersial berasal dari pati dengan kadar amilosa tinggi (pati resisten tipe II), misalnya amilomaize dan pati dari bijibijian. Pati ini lebih tahan terhadap enzim pencernaan, karena berhubungan dengan susunan amilosa dan amilopektin dalam struktur kristal granula pati. Pati resisten tipe III (RS3) juga merupakan sumber pati komersial yang penting, karena dapat dihasilkan melalui proses pengolahan (Kim et al. 2003). Di antara jenis RS3 komersial adalah Novelose 330 yang diproses dari pati jagung kaya amilosa yang terhidrolisis (retrograded hydrolysed high amylose corn starches). Novelose 330 mengandung 40,40% RS3 dan terdiri atas fraksi berbobot molekul rendah dengan panjang rantai α-1,4-D-glukan antara 10-40 unit anhidroglukosa (Jacobash et al. 2006). Kecepatan pembentukan struktur double helix amilosa sangat tergantung pada ukuran molekul amilosa, konsentrasi dan suhu pemanasan (Jane 2009). Proses pembentukan RS3 atau rekristalisasi amilosa akan menghasilkan dua model pembentukan RS3 yaitu micelle (Gambar 15a) dan lamella (Gambar
30
15b). Ikatan yang terbentuk sangat kuat dan sulit untuk dipecah oleh enzim pencernaan, sehingga dapat menurunkan daya cerna pati.
Gambar 15. Model pembentukan R3: (a) model micelle; (b) model lamella (Sajilata et al. 2006) Kandungan RS3 dari pati dapat ditingkatkan dengan beberapa cara, yaitu dengan memperbanyak rantai linear, seperti proses hidrolisis asam dari suspensi pati di bawah suhu gelatinisasi (proses lintnerisasi) atau dengan pemutusan rantai cabang amilopektin (debranching) dengan enzim pullulanase yang dikombinasikan dengan proses pemanasan dan pendinginan suhu rendah (Leu et al. 2003). Kandungan RS3 dipengaruhi oleh nisbah amilosa dan amilopektin, konsentrasi enzim debranching, konsentrasi pati, suhu pemanasan, siklus pemanasan dan pendinginan, dan kondisi penyimpanan, dan adanya lipid atau substansi bermolekul rendah seperti gula (Lehmann et al. 2002; Liu 2005; Sajilata et al. 2006). Analisis daya cerna pati merupakan salah satu parameter yang digunakan untuk mengetahui pengaruh perlakuan modifikasi pati, karena daya cerna pati dapat berkolerasi dengan kadar RS3 yang dihasilkan (Muchtadi et al., 1992). 31
Daya cerna pati yang lebih rendah mengindikasikan kadar RS3 yang meningkat. Pengujian daya cerna pati dapat dilakukan secara in vitro. Pati dihidrolisis dengan menggunakan enzim α-amilase menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana. Hasil akhir reaksi enzimatis ini diukur sebagai maltosa yang merupakan molekul disa-karida yang terdiri atas dua molekul glukosa. Konsentrasi maltosa dalam sampel yang meningkat menunjukkan pati lebih mudah dihidrolisis oleh enzim αamilase sehingga daya cerna pati akan semakin besar. Tinjauan pustaka berikut menjelaskan prinsip dan penelitian-penelitian terdahulu yang terkait dengan penggunaan teknik pemanasan suhu tinggi dan pendinginan, hidrolisis asam dan debranching dalam meningkatkan kadar pati resisten Tipe III (RS3). Secara ringkas, rekapitulasi kondisi perlakuan dalam menghasilkan kadar RS3 dari berbagai jenis sumber pati yang telah dilaporkan oleh peneliti lain disajikan pada Tabel 5. 2.5.2. Pemanasan Suhu Tinggi dan Pendinginan (Autoclaving-cooling) Modifikasi pati untuk menghasilkan pati resisten adalah dengan proses autoclaving-cooling. Proses autoclaving-cooling dilakukan pada suhu tinggi di atas suhu gelatinisasinya. Suspensi pati bersifat tidak larut dalam air dan mudah mengendap sesaat sebelum dan selama proses autoclaving. Pengendapan pati selama autoclaving tidak dikehendaki, karena dapat menyebabkan proses gelatinisasi pati tidak seragam di seluruh bagian suspensi pati. Adanya pemanasan awal sebelum proses autoclaving diharapkan dapat menghasilkan pasta pati yang lebih homogen. Penelitian sebelumnya tidak ada yang menjelaskan kondisi suhu dan waktu pemanasan awal sebelum proses autoclaving. Oleh karena itu, dalam penelitian ini perlu dilakukan tahapan penentuan kondisi pemanasan awal suspensi pati sebelum proses autoclaving. Proses pemanasan pada suhu tinggi di dalam otoklaf (autoclaving) menyebabkan suspensi pati mengalami gelatinisasi. Pada saat gelatinisasi pati, sifat birefringence granula pati hilang akibat penambahan air secara berlebih dan pemanasan pada waktu dan suhu tertentu, sehingga granula pati membengkak dan tidak dapat kembali pada kondisi semula (ireversibel) (Belitz dan Grosch 1999). Sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya, selama pemanasan suspensi pati di atas suhu gelatinisasinya menyebabkan terjadinya pemutusan (disosiasi) ikatan 32
33
34
hidrogen dari struktur double helix amilopektin, pelelehan (melting) bagian kristalit dan pelepasan amilosa dari granulanya (amylose leaching) (Tester dan Debon 2000; Waigh et al. 2000). Proses autoclaving-cooling secara berulang dapat menyebabkan semakin banyaknya pembentukan fraksi amilosa teretrogradasi atau terkristalisasi. Fraksi amilosa yang berikatan dengan fraksi amilosa lainnya melalui ikatan hidrogen membentuk struktur double helix. Struktur double helix berikatan dengan struktur double helix lainnya membentuk kristalit sehingga terjadi rekristalisasi fraksi amilosa yang dikenal dengan proses pembentukan RS3. Rekristalisasi amilosa ini terjadi selama proses pendinginan (cooling) (Gambar 16) (Haralampu 2000).
Gambar 16. Mekanisme pembentukan RS3 dari rekristalisasi amilosa akibat proses autoclaving-cooling (Haralampu 2000) Modifikasi fisik pati melalui proses pemanasan suhu tinggi dan pendinginan dapat meningkatkan kadar pati resisten. Proses pemanasan suhu tinggi, misalnya dengan proses pemanasan dalam otoklaf, mengakibatkan pati tergelatinisasi secara sempurna. Proses penyimpanan suhu rendah dari pasta pati yang dihasilkan akan mempercepat terjadinya retrogradasi pati (Liu 2005). Menurut Sajilata et al. (2006), faktor-faktor yang mempengaruhi proses pembentukan RS3 adalah nisbah pati dan air atau konsentrasi pati, suhu autoclaving, jumlah siklus autoclavingcooling, nisbah amilosa dan amilopektin, panjang rantai amilosa, hidrolisis asam (lintnerisasi) dan debranching amilopektin. Salah satu teknik untuk meningkatkan kadar RS3 adalah dengan menggunakan siklus autoclaving-cooling. Metode modifikasi pati ini telah dilaporkan oleh banyak peneliti, seperti Edmonton dan Saskatoon (1998); Mahadevamma et al. (2003); Shin et al. (2004); Aparicio-Saguilan et al. (2005); Zabar et al. (2008). 35
Prinsipnya, pati disuspensikan dahulu dalam air dengan nisbah penambahan air tertentu (1:3,5 hingga 1:5). Suspensi pati tersebut kemudian dipanaskan dengan menggunakan otoklaf yang mengakibatkan pati tergelatinisasi secara sempurna dan keluarnya fraksi amilosa dari granula pati. Selanjutnya pasta pati didinginkan yang dapat menyebabkan fraksi amilosa mengalami retrogradasi. Kadar RS3 dapat ditingkatkan dengan perlakuan autoclaving-cooling secara berulang. Sajilata et al. (2006) melaporkan bahwa proses autoclaving-cooling pada pati gandum dapat meningkatkan kadar pati resisten menjadi sembilan kali lipat dari pati gandum alami (9,0%). Jumlah siklus autoclaving-cooling juga mempengaruhi kadar pati resisten yang dihasilkan, misalnya pati gandum yang diproses dengan tiga kali siklus autoclaving-cooling meningkat kadar RS3-nya menjadi 7,8% bila dibandingkan hanya satu kali siklus (6,2%). Demikian juga pati resisten dari biji barley meningkat kandungan RS3-nya dari 6% menjadi 26% setelah melewati 20 kali siklus autoclaving-cooling (Szczodrak dan Pomeranz 1991). Jumlah air yang ditambahkan dalam suspensi pati akan mempengaruhi konsentrasi pati dan berpengaruh dalam proses autoclaving-cooling. Hal ini karena nisbah pati dan air sangat mempengaruhi proses ekspansi matriks pati dan gelatinisasi granula (Raja dan Shindu 2000). Jumlah air yang terlalu sedikit kurang menggangu struktur heliks amilosa pada gelatinisasi siklus selanjutnya sehingga jumlah amilosa yang keluar dari granula tidak optimum (Sajilata et al. 2006). Hal ini mengakibatkan jumlah amilosa-amilosa dan amilosa-amilopektin yang berasosiasi pada saat retrogradasi lebih sedikit sehingga kadar pati resistennya pun menjadi lebih rendah. Proses autoclaving-cooling yang berulang dapat menyebabkan terjadinya peningkatan penyusunan amilosa-amilosa dan amilosa-amilopektin dan peningkatan pembentukan kristalin yang lebih sempurna yang berakibat pada peningkatan kadar RS3 (Leong et al. 2007). Faktor lain yang berpengaruh terhadap pembentukan RS3 melalui proses autoclaving-cooling adalah konsentrasi pati dan suhu otoklaf, yaitu pembentukan RS3 yang paling optimum berlangsung bila konsentrasi suspensi pati dalam air sebesar 20% (b/b) dengan suhu otoklaf sebesar 121oC.
36
Pembentukan RS3 dengan metode autoclaving-cooling dipengaruhi oleh konsentrasi suspensi pati. Beberapa laporan menyebutkan bahwa konsentrasi suspensi pati yang optimum untuk pembentukan RS3 adalah 20% (b/b) (Vasanthan dan Bhatty 1998; Lehmann et al. 2002; Lehmann et al. 2003). Konsentrasi suspensi pati yang lebih kecil atau lebih besar dari 20% (b/b) menghasilkan kadar RS3 yang cenderung menurun. Proses gelatinisasi granula pati juga sangat dipengaruhi oleh nisbah pati dan air. Penambahan air yang terlalu sedikit ke dalam suspensi pati menyebabkan jumlah amilosa yang keluar dari granula tidak optimum (Raja dan Shindu 2000). Hal ini dapat mengurangi kadar pati resisten yang terbentuk yang disebabkan oleh menurunnya peluang terjadinya reasosiasi amilosa-amilosa dan amilosa-amilopektin (Sajilata et al. 2006). Pemilihan siklus autoclaving-cooling tersebut juga telah dilakukan oleh Zhao dan Lin (2009) pada pati jagung. Kadar RS3 hasil modifikasi pati jagung meningkat dari 4,10% (1 siklus) menjadi 11,2% (6 siklus), sedangkan untuk 3 siklus sebesar 8,5%, hanya naik sekitar 2,7% dari 6 siklus. Peneliti lain telah melaporkan bahwa siklus autoclaving-cooling sebanyak 3 kali dapat meningkatkan kadar RS3, yaitu dari pati gandum meningkat dari 6,2% menjadi 7,8% (Bjorck et al. 1987), pati barley 3,8% menjadi 7,0% (Vasanthan dan Bhatty 1998), dan pati pisang dari 1,51% menjadi 16,02% (Aparicio-Saguilan et al. 2005). Peningkatan siklus menjadi 5 kali pada pati gandum dapat meningkatkan kadar RS3 sampai 11,5% (Ranhotra et al. 1991). Eerlingen dan Delcour (1995) melaporkan siklus autoclaving-cooling hingga 20 kali yang dapat meningkatkan jumlah RS3 lebih dari 40% pada sampel pati jagung tinggi amilosa (kadar amilosa 70%). 2.5.3. Hidrolisis Asam secara Lambat (Lintnerisasi) Perlakuan hidrolisis pati secara lambat (lintnerisasi) dimaksudkan untuk meningkatkan jumlah fraksi amilosa rantai pendek dengan bobot molekul rendah yang merupakan hasil degradasi fraksi amilosa rantai panjang dan titik percabangan α-1,6 inter-klaster dari rantai amilopektin. Apabila jumlah fraksi amilosa rantai pendek meningkat, maka semakin banyak fraksi amilosa yang teretrogradasi atau terkristalisasi, sehingga proses pembentukan RS3 semakin tinggi dan berdampak pada penurunan daya cerna pati. Fraksi amilosa sebagai struktur linear 37
akan memfasilitasi ikatan silang dengan adanya ikatan hidrogen sehingga struktur amilosa membentuk kristalit yang kompak (Lehmann et al. 2003; Aparicio-Saguilán et al. 2005; Zhao dan Lin 2009). Hidrolisis pati secara lambat dengan asam dilakukan dengan menggunakan asam kuat, seperti asam klorida atau asam sulfat. Asam kuat tersebut akan menghidrolisis ikatan glikosidik, sehingga memperpendek panjang rantai dan berat molekul amilosa menjadi lebih rendah (Wurzburg 1989). Proses modifikasi dengan hidrolisis asam dibuat dengan mensuspensikan pati dalam larutan asam (kira-kira 36-40,0% padatan) dan memanaskannya pada suhu di bawah suhu gelatinisasi pati (umumnya 40–60oC), kemudian dilakukan pengadukan secara kontinyu selama inkubasi. Apabila telah tercapai tingkat kekentalan atau derajat konversi yang dikehendaki, suspensi dinetralkan dan residu pati disaring atau disentrifusi, kemudian dicuci, dan dikeringkan (Wurzburg 1989). Modifikasi pati dengan metode hidrolisis asam tidak mengubah bentuk granula pati yang dihasilkan, tetapi menyebabkan penurunan kemampuan mengembang (swelling), viskositas dan kestabilan pasta pati selama proses gelatinisasi (Ferrini et al. 2008). Proses hidrolisis asam terjadi dalam dua tahap penyerangan pada granula pati, yaitu tahap penyerangan secara cepat pada daerah amorf, dan tahap penyerangan yang lebih lambat terhadap fraksi amilopektin di daerah kristalin (Wurzburg 1989; Franco et al. 2002; Wang et al. 2003; Ferrini et al. 2008 dan Jayakody dan Hoover 2008). Gambar 17 memperlihatkan bagaimana asam menghidrolisis daerah amorf dan daerah kristalin dari granula pati.
Gambar 17. Ilustrasi degradasi daerah amorf selama hidrolisis asam (Srichuwong 2006) 38
Daerah kristalin merupakan daerah residu resisten asam yang merupakan struktur klaster amilopektin. Hasil pengamatan dengan menggunakan Small-Angle Neutron Scattering dan Small-Angle X-ray Scattering menunjukkan hilangnya ruang di antara kristalin dan amorf sebagai akibat hidrolisis asam. Hal ini mengindikasikan bahwa terjadi pemutusan di dalam klaster dan hidrolisis amilosa menjadi amilosa dengan rantai lebih pendek yang ditandai dengan penurunan kemampuan pengikatan iodin pada pati (Muhr et al. 1984). Wurzburg (1989) menunjukkan bahwa jumlah amilosa atau fraksi linear meningkat pada tahap awal proses modifikasi asam. Hal tersebut menunjukkan bahwa asam turut menghidrolisis bagian amilopektin yang mudah dijangkau. Wurzburg (1989) juga menjelaskan bahwa selama modifikasi asam, granula pati tidak mengalami kehilangan sifat birefringence dan pembengkakan. Hal ini membuktikan bahwa asam cenderung menyerang daerah amorf dibandingkan daerah kristalin. Beberapa peneliti melaporkan pengaruh kombinasi pengasaman dan autoclaving-cooling terhadap kadar RS3. Zhao dan Lin (2009) melaporkan bahwa pati pisang yang dihidrolisis dengan HCl 1N selama 6 jam yang dilanjutkan dengan proses pemanasan pada 121oC selama 1 jam dan pendinginan pada 4oC (proses dilakukan sebanyak 3 siklus) meningkatkan kadar RS3 dari 1,51% menjadi 16,02%. Pati jagung yang dihidrolisis dengan asam sitrat 0,1M selama 12 jam yang dilanjutkan dengan proses pemanasan pada 121oC selama 20 menit dan pendinginan 4oC dengan jumlah siklus yang sama juga meningkatkan kadar RS3 dari 8,0% menjadi 11,0%. Hidrolisis asam lebih atau kurang dari 12 jam menghasilkan pembentukan RS3 yang lebih rendah. Mun dan Shin (2006) melaporkan bahwa pati jagung yang dihidrolisis dengan HCl 0,1N selama 6 jam menyebabkan peningkatan kadar RS3 menjadi 13,8-14,9%. 2.5.4. Debranching oleh Enzim Pullulanase Enzim pullulanase (EC 3.2.1.4.1 atau pullulan 6-glucanohydrolase) merupakan enzim mikrobial yang dihasilkan dari Klebsiella pneumoniae. Enzim ini memecah ikatan glikosidik α-1,6 yang merupakan ikatan percabangan pada molekul amilopektin atau limit desktrin. Pemutusan ikatan percabangan (debranching)
39
oleh pullulanase terjadi pada ikatan glikosidik α-1,6 secara acak pada bagian dalam (Gambar 18).
Gambar 18. Pemotongan ikatan α-1,6 pada titik percabangan molekul amilopektin oleh enzim pullulanase. Garis miring pada titik percabangan amilopektin menunjukkan titik pemotongan oleh enzim pullulanase (modifikasi dari Sajilata et al. 1998) Pengaruh perlakuan debranching rantai amilopektin dengan enzim pullulanase dalam meningkatkan kadar RS3 telah dilaporkan oleh beberapa peneliti (Gon-zales-Soto et al. 2004; 2007; Leong et al. 2007; Pongjanta et al. 2009a; Miao et al. 2009; Mutungi et al. 2009; Ozturk et al. 2009). Hasil penelitian tersebut memberikan kadar RS3 yang berbeda-beda untuk jenis pati dan kondisi proses debranching yang berbeda. Secara umum, kadar RS3 dipengaruhi oleh konsentrasi enzim pullulanase dan waktu inkubasi selama proses debranching, serta suhu dan waktu pemanasan (autoclaving) dan pendinginan (cooling) setelah proses debranching. Pongjanta et al. (2009a) membandingkan proses debranching pati beras tinggi amilosa dengan menggelatinisasi dahulu suspensi pati (15%) pada suhu 95oC dan 121oC selama 30 menit, lalu dihidrolisis oleh enzim pullulanase (8 U/g pati) pada 55oC dan waktu inkubasi pada selang 0-24 jam. Hasilnya menunjukkan bahwa pati beras yang dipanaskan pada 121oC memberikan kadar RS3 lebih tinggi dibandingkan pada 95oC untuk kondisi debranching yang bersesuaian. Semakin lama proses debranching maka proses hidrolisis amilopektin semakin banyak sehingga dihasilkan amilosa rantai pendek yang dapat memperbanyak peluang pembentukan RS3. Kombinasi pemanasan pada 121oC dengan waktu inkubasi 40
selama 24 jam memberikan kadar RS3 paling tinggi (18,33%) bila dibandingkan kombinasi suhu dan waktu inkubasi lainnya. Pongjanta et al. (2009a) juga melaporkan bahwa proses debranching meningkatkan kadar RS3 pati beras tinggi amilosa sebanyak 4 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan yang diproses tanpa debranching pada kondisi autoclaving-cooling yang sama. Pengaruh debranching terhadap kadar RS3 juga dilaporkan oleh GonzalesSoto et al. (2004; 2007). Mereka melakukan proses modifikasi pati pisang melalui proses debranching-autoclaving-cooling dengan menggunakan enzim pulullanase pada berbagai konsentrasi (0,5; 2,6; 5,3; 10,6; 15.9 dan 21,1 U/g pati) pada suhu inkubasi 50oC dengan selang waktu 2-10 jam. Hasilnya menunjukkan bahwa penggunaan enzim pullulanase pada konsentrasi 10,6 U/g pati dengan waktu inkubasi 5 jam memberikan kadar RS3 yang optimal (Gonzales-Soto et al. 2004). Gonzales-Soto et al. (2007) juga membandingkan suspensi pati pisang yang dihidrolisis oleh enzim pullulanase dan dipanaskan di dalam otoklaf 121oC selama 30 menit dengan waktu pendinginan yang berbeda (suhu 4oC dan 32oC). Hasilnya menunjukkan bahwa suhu pendinginan 4oC dan 32oC tidak memberikan kadar RS3 yang berbeda nyata. Penelitian ini juga menunjukkan bahwa nilai Water absorpstion index (WAI) dari pati hasil perlakuan debranching-autoclavingcooling menurun dengan meningkatnya kadar RS3. Mutungi et al. (2009) melakukan proses debranching pati singkong dengan enzim pullulanase (25 U/g pati) selama 24 jam. Proses debranching dilakukan setelah pemanasan dahulu di dalam otoklaf pada 121oC selama 15 menit. Hasil modifikasi tersebut dapat meningkatkan kadar RS3 dari 21,4% menjadi 88,4%. Peningkatan kadar RS3 yang menyolok ini berhubungan dengan peningkatan jumlah fraksi amilosa rantai pendek (DP 10-24) sebesar 58,9%. Mutungi et al. (2009) juga melaporkan bahwa pencucian pati singkong yang telah mengalami debranching dengan air deionisasi dapat menurunkan jumlah rantai glukan dengan DP<10. Sebagaimana telah dijelaskan oleh Lehmann et al. (2003), rantai glukan dengan DP<10 dapat menghalangi pembentukan RS3. Proses penghilangan rantai glukan dengan DP<10 juga berkontribusi pada peningkatan peluang terjadinya pembentukan RS3.
41
Ozturk et al. (2009) melakukan modifikasi pati jagung tinggi amilosa, yaitu Hylon V (H5) dan Hylon 7 (H7), dengan perlakuan debranching oleh enzim pullulanase dengan konsentrasi 1,5 U/g pati pada suhu 60oC selama 48 jam. Proses autoclaving-cooling dilakukan pada suhu 123oC dan 133oC dan dilanjutkan dengan penyimpanan pada suhu rendah (4oC), selanjutnya dikeringkan dengan menggunakan oven dan freeze dryer. Hasilnya menunjukkan bahwa pengeringan pati yang telah dimodifikasi dalam oven memberikan kadar RS3 lebih tinggi bila dibandingkan dengan freeze dryer. Berat molekul menurun dan kadar RS3 meningkat dengan meningkatnya waktu inkubasi selama debranching. Kadar RS3 pati jagung H7 lebih tinggi dibandingkan dengan H5 pada kondisi proses debranching yang sama. Berdasarkan hasil analisis menggunakan DSC, proses debranching-autoclaving-cooling menurunkan suhu puncak (Tp) dan meningkatkan nilai entalpi pada kedua jenis pati jagung tersebut. Kelarutan dan kapasitas pengikatan air juga lebih tinggi dibandingkan dibandingkan pati alaminya. Kadar RS3 dari pati sagu yang optimal diperoleh dari hasil perlakuan debranching menggunakan enzim pullulanase pada konsentrasi 40 U/g pati dengan waktu inkubasi 8 jam dan dilanjutkan dengan penyimpanan pasta pati sagu pada suhu 80oC selama 7 hari (Leong et al. 2007). Perlakuan ini dapat menghasilkan kadar RS3 sebesar 11,6%. Leong et al. (2007) juga menunjukkan bahwa proses debranching dari pati sagu dapat menurunkan fraksi amilopektin. Semakin lama waktu inkubasi, maka semakin menurun kadar amilopektin yang memiliki bobot molekul besar dan semakin meningkat fraksi amilosa berbobot molekul rendah. Hasil pengukuran dengan menggunakan difraksi sinar X menunjukkan bahwa derajat kristalinitas pati sagu hasil modifikasi tersebut menurun menjadi 15,73% bila dibandingkan dengan pati sagu alaminya (26,47%). Miao et al. (2009) melakukan proses debranching pati jagung tinggi amilopektin (waxy maize) dengan konsentrasi 10, 20 atau 40 U/g pati dengan waktu inkubasi 6 jam, kemudian dilanjutkan dengan pemanasan di dalam otoklaf pada 121oC selama 30 menit dan disimpan pada 4oC selama 2 hari. Hasilnya menunjukkan bahwa kadar RS3 meningkat dengan meningkatnya konsentrasi enzim pullulanase yang digunakan.
42
III. METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2009 sampai April 2010. Proses ekstraksi pati garut menggunakan lini proses ekstraksi pati di F-Technopark, Fakultas Teknologi Pertanian (Fateta), Institut Pertanian Bogor (IPB). Pengujian/analisis menggunakan beberapa laboratorium di dalam dan di luar IPB, yaitu Laboratorium Kimia Pangan dan Laboratorium Biokimia Pangan di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fateta-IPB; Laboratorium Rekayasa Proses Pangan di South East Asia Food Agricultural Science and Technology (Seafast) Center IPB, dan Food Chemistry Laboratory, Department of Sustainable Resource Science, Mie University, Jepang. 3.2. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah umbi garut kultivar creole berumur 10-11 bulan yang diperoleh dari Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika, Cimanggu, Bogor. Sebagai pembanding digunakan pati resisten tipe III (RS3) komersial (Novelose 330) dari National Starch and Chemical Co. Bahan kimia yang digunakan untuk proses modifikasi pati terdiri atas larutan HCl dan NaOH, enzim pullulanase (Sigma P-2986) dan bufer asetat 0,1M pH 5,2. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis proksimat pati garut adalah heksana, K2SO4, HgO, H2SO4, NaOH, Na2S2O3, HCl, H3BO3, merah metil dan biru metil (E. Merck). Analisis karakterisasi kimia pati garut alami dan yang telah dimodifikasi menggunakan bahan kimia sebagai berikut: bufer fosfat pH 6,0 dan pH 7,0, enzim Thermamyl (α-amilase Sigma A-3403), NaOH, enzim protease (Sigma P-3910), enzim amiloglukosidase (Sigma A-9913), enzim pepsin (Sigma P-7000), enzim pankreatin (Sigma P-1750), enzim isoamilase (Haya Shibara Biochemical Laboratories Inc.), enzim α-amilase (Fluca), etanol, aseton, NaBH3CN, APTS (C16H8NNa3O9S3, 8-ami-nopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium), air bebas ion, akuades, NaHCO3, HCl, heksana, asam borat, asam asetat, KI, I2, asam dinitrosalisilat (DNS), pati murni (E. Merck), maltosa murni, waxy maize (E. Merck), H3BO3, dan Na2S2O5, NaK tartarat, fenol, glukosa, indikator fenolftalin,
43
kuprisulfat, HClO4, Na2HPO4, Na2SO4, amonium molibdat, Na2HPO4.7H2O dan Sepharose toyopearl 65F, SephadexTM G-25, butanol, dan bufer Na-asetat pH 5,2 dan 3,5. Instrumen yang digunakan untuk analisis pati garut alami dan yang telah dimodifikasi adalah ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foreter City, CA, USA), polimer POP, 36-cm capillary, pelapis emas E-1010 ion sputter (Hitachi Science Systems, Ltd, Hitachinaka, Jepang), SEM (S-4000 Scanning Electron Microscope (Hitachi Science Systems, Ltd, Hitachinaka, Jepang), Gel Permeation Chromatography (GPC) HW 65F (Toyopearl, Tosoh Coorporation Akasaka, Minatoku Jepang), pompa peristaltik (Perista Pump SJ1211, Chromatograph Atto), kolom kromatografi (2,6 cm IDx100 cm), spektrofotometer UV-Vis (UV min 1240, Shimadzu, Jepang), spectronic 20D+, difraksi sinar X (Ultima IV, Rigaku, Jepang); dan Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy (Shimadzu, Jepang). Peralatan lain yang digunakan dalam analisis adalah inkubator bergoyang (Personal 11, Jepang), inkubator pengering (Iwaki Asahi Thecno Glass, Thermo Alumni Bath, ALB-121), vorteks (Vortek-2-Geni, Scientific Industries), otoklaf (Tomy SX-300, High-Pressure Steam Sterilizer, Tomy Seiko Co, Ltd, Jepang), pengering beku (DC 800 Yamato Scientific Co, Ltd, Jepang), shaker ( Bioshaker, BR 23 FP, Taitec, Jepang), crucible, blender, mortar, pH meter, penggiling tepung, refrigerator, freezer, freeze dryer, termometer, neraca analitik, inkubator, oven, sentrifus, soxhlet, labu Kjeldahl, dan labu distilasi, serta alat-alat kaca lainnya. 3.3. Tahapan Penelitian Penelitian ini dilakukan dalam tiga tahapan sebagai berikut : (1) Tahap ekstraksi dan karakterisasi pati garut, (2) Tahap penentuan kondisi proses modifikasi pati garut, dan (3) Tahap modifikasi pati garut. Tahap modifikasi pati garut terdiri atas perlakuan hidrolisis asam secara lambat (lintnerization), pemutusan ikatan cabang amilopek-tin secara enzimatis (debranching) dan pemanasan suhu tinggi dan pendinginan secara berulang (siklus autoclaving-cooling), dan kombinasinya. Secara garis besar, skema penelitian disajikan pada Gambar 19. Penjelasan rinci masing-masing tahapan penelitian adalah sebagai berikut. 44
45
3.3.1. Tahap I: Proses Ekstraksi dan Karakterisasi Pati Garut Proses ekstraksi pati garut dilakukan dengan metode ekstraksi basah dengan memodifikasi metode Lingga et al. (1986) sebagai berikut. umbi garut dibersihkan, dikupas dan dicuci dengan air bersih. Umbi garut yang telah dikupas kemudian direndam dalam air bersih selama 1 jam. Umbi garut selanjutnya dihancurkan dengan parutan dengan penambahan air (1 : 3,5). Hancuran umbi garut kemudian disaring dengan ayakan bergoyang untuk memperoleh bagian patinya. Bagian suspensi yang melewati ayakan bergoyang kemudian didiamkan selama 12 jam pada suhu ruang untuk mengendapkan bagian patinya. Bagian pati yang mengendap kemudian dipisahkan dari bagian ampasnya. Proses ekstraksi pati diulang dua kali dengan mengekstrak kembali ampas dengan air (1:3,5). Pati yang diperoleh kemudian dicuci dengan air bersih dan dikeringkan dalam oven pada suhu 50oC selama 6 jam. Pati garut kering digiling dengan menggunakan disc mill, kemudian disaring dan diayak. Pati yang dihasilkan dikemas dan disimpan di dalam freezer -18oC sampai digunakan. Diagram alir proses ekstraksi pati garut secara garis besar disajikan pada Gambar 20. Pati garut yang diperoleh kemudian dianalisis yang meliputi: (1) komposisi kimia, yaitu kadar proksimat (kadar air, abu, lemak, protein, dan karbohidrat), kadar pati, kadar amilosa, kadar gula pereduksi, dan kadar pati resisten, (2) profil gelatinisasi dengan Rapid Visco Analyzer (RVA); (3) morfologi pati dengan mikroskop polarisasi dan Scanning Electron Microscope (SEM). 3.3.2. Tahap II: Penentuan Kondisi Proses Modifikasi Pati Garut 3.3.2.1. Penentuan Kondisi Siklus Autoclaving-cooling Tahap ini bertujuan menentukan suhu pemanasan awal, waktu proses pemanasan dalam otoklaf (autoclaving), dan jumlah siklus autoclaving-cooling. Penelitian untuk menentukan kondisi proses yang terpilih dilakukan secara bertahap sebagai berikut:
46
Umbi Garut Pengupasan dan Pencucian Perendaman selama 1 jam Pemarutan dengan rasper Ektraksi dengan penambahan air (1 : 3,5) 3x Suspensi pati
Ampas + air
Pengendapan Pengeringan (50oC, 6 jam) Penggilingan Pengayakan Pati Garut Gambar 20. Proses ekstraksi pati garut (modifikasi dari Lingga et al. 1986) (a) Penentuan suhu pemanasan awal. Sebanyak 20,0 g pati garut dalam erlenmeyer 300 mL yang disuspensikan dalam akuades (20% b/v) diberi perlakuan pemanasan awal pada suhu 80oC dan 90oC selama 5 menit. Sampel kemudian dipanaskan pada suhu tinggi di dalam otoklaf 121oC selama 15 menit. Selanjutnya pasta pati didinginkan selama satu jam pada suhu ruang dan disimpan di dalam refrigerator pada suhu 4oC selama 24 jam. Proses pemanasan dan pendinginan kemudian diulang lagi sebanyak dua kali sehingga mengalami total 3 siklus autoclaving-cooling. Sampel pati kemudian dikeringkan, digiling dan diayak. Selanjutnya, sampel dikemas dan disimpan dalam freezer -18oC hingga digunakan. 47
(b) Penentuan waktu dan siklus autoclaving-cooling. Tahapan penelitian dilakukan seperti di atas pada suhu pemanasan awal yang terpilih, tetapi dengan waktu autoclaving 15 dan 30 menit dan jumlah siklus autoclaving-cooling sebanyak 1, 3, dan 5 siklus. Pati garut hasil proses modifikasi 3.2.2.1(a) di atas kemudian dianalisis daya cerna pati in vitro, kadar amilosa, gula pereduksi, dan pati resisten. Pati yang dimodifikasi pada tahap 3.2.2.1(b) di atas dianalisis kadar pati resisten dan daya cerna pati in vitro-nya. 3.3.2.2. Penentuan Kondisi Hidrolisis Asam Tahap penelitian ini bertujuan menentukan konsentrasi asam klorida (HCl) dan waktu inkubasi yang digunakan untuk hidrolisis asam secara lambat sebagai berikut: Sebanyak 250 g pati garut disuspensikan dalam larutan HCl (nisbah 1:1) dengan konsentrasi yang berbeda (HCl 1,1N dan 2,2N). Suspensi pati diinkubasi pada suhu 35oC dengan waktu yang berbeda (2, 4, dan 6 jam) dengan terus dilakukan pengadukan. Suspensi pati garut yang telah mengalami perlakuan hidrolisis asam tersebut kemudian dinetralkan dengan menggunakan larutan natrium hidroksida (NaOH 1M) hingga mencapai pH 6,0. Suspensi pati tersebut kemudian dikeringkan pada suhu 50oC selama 24 jam hingga mencapai kadar air 10-12%. Setelah kering, pati digiling dengan menggunakan disc mill dan disaring dan diayak kemudian dikemas dan disimpan di dalam freezer -18oC sampai digunakan. Pati garut hasil hidrolisis asam (20,0 g) dalam erlenmeyer 300 mL disuspensikan kembali dalam akuades (20%b/v), kemudian diberi perlakuan pemanasan awal pada suhu yang terpilih dari tahap 3.3.2.1(a) dan dipanaskan di dalam otoklaf 121oC pada waktu dan siklus autoclaving-cooling terpilih dari tahap 3.3.2.1(b). Sampel yang telah diberi perlakuan didinginkan selama 1 jam pada suhu ruang dan selanjutnya disimpan dalam refrigerator 4oC selama 24 jam. Sampel pati garut dari perlakuan tersebut kemudian dikeringkan, digiling, diayak, dikemas dan disimpan dalam freezer -18oC sampai digunakan. Pati garut hasil modifikasi dengan perlakuan di atas dianalisis daya cerna pati in vitro dan kadar amilosanya.
48
3.3.2.3. Penentuan Kondisi Debranching Tahap penelitian ini bertujuan menentukan aktivitas enzim pullulanase, konsentrasi enzim pullulanase, dan waktu inkubasi. Hasil penelitian pada tahap ini digunakan dalam penelitian tahap III. (a) Pengujian aktivitas enzim pullulanase (Gonzalez-Soto et al. 2004 dan 2007). Larutan enzim pullulanase dibuat dengan cara menambahkan 30 μL larutan enzim pullulanase stok dan ditambahkan 720 μL asetat bufer (pH 5,2 dan 0,1 M). Sebanyak 62,5 μL larutan enzim tersebut ditambahkan dengan 125 μL larutan waxy maize (0,4 mg/mL) dan 62,5 μL larutan asetat bufer 0,1 M dan pH 5,2. Campuran larutan tersebut kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 50oC. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 0,5 mL larutan 0,5 M NaOH. Kadar gula pereduksi (glukosa) ditentukan dengan menggunakan metode Park-Johnson (Takeda et al. 1993). Aktivitas enzim pullulanase (dinyatakan dalam μmol/menit atau U/mL) diperoleh dengan membagi kandungan glukosa (dalam μmol) dibagi dengan waktu inkubasi (10 menit). (b) Penentuan konsentrasi dan waktu inkubasi (Gonzales-Soto et al. 2004). Larutan pati garut (20%b/v) kemudian diberi perlakuan pemanasan awal pada suhu yang terpilih dari tahap 3.3.2.1(a) dan dipanaskan di dalam otoklaf 121oC pada waktu dan siklus autoclaving-cooling terpilih tahap 3.3.2.1(b). Gel pati yang terbentuk kemudian diencerkan dengan air deionisasi sampai konsentrasi 10% b/v. Enzim pullulanase ditambahkan pada konsentrasi yang berbeda (1,3; 5,2; dan 10,4 U/g pati), kemudian diinkubasi pada suhu 50oC dengan waktu yang berbeda (0, 16, 24 dan 40 jam). Inaktivasi enzim pullulanase dilakukan dengan pemanasan di atas penangas air 100oC selama 10 menit. Pati garut hasil proses modifikasi 3.3.2.3(a) dan (b) di atas dianalisis kadar gula pereduksinya (metode Park-Johnson, Takeda et al. 1993). Data gula pereduksi digunakan untuk menentukan derajat hidrolisis pati oleh enzim pullulanase, yaitu dengan membagi kadar gula pereduksi setelah waktu hidrolisis tertentu dengan konsentrasi gula pereduksi tertinggi selama proses hidrolisis (dinyatakan dalam persen).
49
3.3.2.4. Analisis Statistika Uji beda nyata pada taraf kepercayaan 95% atau α=0,05 digunakan untuk menentukan pengaruh perlakuan pada penelitian tahap II terhadap parameter uji yang relevan. Analisis statistika dilakukan dengan menggunakan program SPSS 16. 3.3.3. Tahap III: Perlakuan Modifikasi Pati Garut Pati garut dimodifikasi dengan empat jenis perlakuan sebagai berikut. (1) siklus autoclaving-cooling, (2) kombinasi perlakuan hidrolisis asam secara lambat dan siklus autoclaving-cooling, (3) kombinasi perlakuan pemutusan ikatan cabang amilopektin (debranching) secara enzimatis dan siklus autoclaving-cooling; dan (4) kombinasi perlakuan hidrolisis asam secara lambat, debranching secara enzimatis dan siklus autoclaving-cooling. 3.3.3.1. Perlakuan Siklus Autoclaving-cooling (Lehmann et al. 2003) Proses modifikasi pati garut dengan perlakuan siklus autoclaving-cooling dilakukan berdasarkan kondisi terpilih dari tahap 3.3.2.1(a) dan (b). Sampel hasil modifikasi dikeringkan dengan menggunakan pengering beku (freeze dryer) selama 48 jam, digiling dengan menggunakan mortar dan diayak. Sampel kemudian dikemas dan disimpan dalam freezer -18oC hingga digunakan. Pati garut hasil modifikasi di atas dianalisis yang meliputi: (1) kadar gula pereduksi, kadar pati resisten, dan daya cerna pati in vitro, (2) profil gelatinisasi dengan Rapid Visco Analyzer (RVA); (3) morfologi pati dengan Scanning Electron Mi-roscope (SEM), (4) distribusi amilosa dan amilopektin dengan Gel Permeation Chromatography (GPC); (5) distribusi panjang rantai amilopektin dengan Fluorophore-Assisted Capillary Electrophoresis (FACE); (6) kestabilan panas dan derajat retrogradasi dengan Diffrential Scanning Calorimetry (DSC); dan (7) perubahan daerah kristalin dan amorf dengan analisis Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) dan difraksi sinar X); dan. Pati garut alami (pati yang tidak dimodifikasi) juga dianalisis dan digunakan sebagai pembanding.
50
3.3.3.2. Perlakuan Hidrolisis Asam dan Siklus Autoclaving-cooling (Aparicio-Saguilan et al. 2005) Proses modifikasi pati garut dengan perlakuan hidrolisis asam dan siklus autoclaving-cooling dilakukan berdasarkan kondisi terpilih dari tahap 3.3.2. Sampel hasil modifikasi dikeringkan dengan menggunakan pengering beku (freeze dryer) selama 48 jam, digiling dengan menggunakan mortar dan diayak. Sampel kemudian dikemas dan disimpan dalam freezer -18oC hingga digunakan. Pati garut hasil modifikasi dengan perlakuan hidrolisis asam secara lambat dan siklus autoclaving-cooling kemudian dianalisis sama dengan analisis sampel pati garut yang diberi perlakuan siklus autoclaving-cooling pada tahap 3.3.3.1. 3.3.3.3. Perlakuan Debranching dan Siklus Autoclaving-cooling (Zhao dan Lin 2009) Pati garut sebanyak 20,0 g dibuat menjadi suspensi pati garut 20% b/v dan diberi perlakuan pemanasan awal pada suhu terpilih dari tahap 3.3.2.1(a). Pasta pati kemudian dipanaskan pada suhu tinggi dengan otoklaf pada kondisi terpilih pada tahap 3.3.2.1(b). Setelah didinginkan selama satu jam pada suhu ruang, pasta pati disimpan di dalam refrigerator 4oC selama 24 jam. Pasta pati yang telah mengalami modifikasi satu siklus ini kemudian dipanaskan kembali hingga suhu 50oC. Pasta pati garut yang telah mengalami perlakuan autoclaving-cooling sebanyak satu siklus kemudian dihidrolisis oleh enzim pullulanase dengan dua konsentrasi yang terpilih pada tahap 3.3.2.3(b). Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 50oC dan pH 5,2 dan digoyang pada kecepatan 160 rpm. Untuk menghentikan reaksi enzimatis ini, inaktivasi enzim dilakukan dengan cara memanaskan pasta pati terhidrolisis di dalam otoklaf pada kondisi terpilih pada tahap 3.3.2.1(b). Sampel dari perlakuan tersebut kemudian dianalisis sama seperti analisis sampel pati garut yang diberi perlakuan siklus autoclaving-cooling pada tahap 3.3.3.1.
51
3.3.3.4. Kombinasi Perlakuan Hidrolisis Asam, Debranching, dan Siklus Autoclaving-cooling (Lehmann et al. 2003) Pati garut dimodifikasi dengan perlakuan hidrolisis asam, debranching dan siklus autoclaving-cooling dengan kondisi yang terpilih dari tahap 3.3.2. Pati yang telah diberi perlakuan di atas dianalisis sama seperti analisis sampel yang diberi perlakuan siklus autoclaving-cooling pada tahap 3.3.3.1. 3.3.3.5.Analisis Statistika Uji beda nyata pada taraf kepercayaan 95% atau α=0,05 digunakan untuk menentukan pengaruh perlakuan pada penelitian tahap III terhadap parameter uji yang relevan. Analisis statistika dilakukan dengan menggunakan program SPSS 16. Uji korelasi dilakukan antar parameter yang relevan (pada tingkat kepercayaan 95%). 3.4. Prosedur Analisis 3.4.1. Analisis Proksimat 3.4.1.1. Kadar Air (925.10 AOAC 1998) Kadar air sampel pati garut dianalisis dengan menggunakan metode gravimetri. Cawan aluminium dikeringkan dengan oven pada suhu 130+3°C selama 15 menit, kemudian didinginkan dalam desikator selama 10 menit. Cawan yang sudah kering ditimbang sebelum digunakan. Sekitar 2,0 g sampel pati garut ditimbang ke dalam cawan tersebut, kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 130°C selama 1 jam, didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai beratnya konstan. Kadar air dihitung dengan rumus sebagai berikut (persamaan 1): Kadar air (%bb) =
a – (b - c) x 100 a
(1)
dengan: a = bobot sampel awal (g); b = bobot sampel dan cawan setelah dikeringkan (g); c = bobot cawan kosong (g) 3.4.1.2. Kadar Abu (923.03 AOAC 1998) Kadar abu pati garut dianalisis dengan menggunakan metode gravimetri. Cawan porselin kosong dan tutupnya dikeringkan dalam oven bersuhu 105°C selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator. Cawan porselin kering tersebut ditimbang dan dicatat bobotnya sebelum digunakan. Sebanyak 3,0-5,0 g sampel 52
pati garut ditimbang di dalam cawan porselen tersebut dan dimasukkan dalam tanur listrik bersuhu 550°C sampai pengabuan sempurna. Setelah pengabuan selesai, cawan contoh didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang. Penimbangan diulangi kembali hingga diperoleh bobot tetap. Perhitungan kadar abu dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut (persamaan 2 dan 3): Kadar abu (%bb) =
Kadar abu (%bk) =
b a
x 100
(2)
Kadar abu (%bb) x 100 (100 – kadar air)
(3)
dengan: a = bobot sampel awal (g); b= bobot abu (g) 3.4.1.3. Kadar Lemak (SNI 01-2891-1992) Kadar lemak pati garut dianalisis dengan menggunakan soxhlet. Labu lemak dikeringkan di dalam oven 105°C selama 15 menit, didinginkan di dalam desikator dan ditimbang sebelum digunakan. Sebanyak 1-2,0 g sampel pati garut dimasukkan ke dalam selongsong kertas saring yang dialasi dengan kapas. Selongsong kertas yang berisi sampel disumbat dengan kapas, kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu tidak lebih dari 80°C selama ± 1 jam. Selongsong kertas tersebut kemudian dimasukkan ke dalam alat soxhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak. Lemak dalam sampel diekstraksi dengan heksana selama ± 6 jam. Heksana disuling sehingga diperoleh ekstrak lemak. Ekstrak lemak di dalam labu lemak kemudian dikeringkan dalam oven 105°C selama 12 jam, kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang beratnya. Pengeringan diulangi sampai diperoleh bobot tetap. Kadar lemak dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan menggunakan rumus sebagai berikut (persamaan 4 dan 5): Kadar lemak (%bb) =
Kadar lemak (%bk) =
a–b x 100 c
Kadar lemak (%bb) (100 – kadar air)
(4)
x 100
(5)
53
dengan: a = bobot labu lemak setelah proses ekstraksi (g); b = bobot labu lemak sebelum proses ekstraksi (g); dan c = bobot sampel (g) 3.4.1.4. Kadar Protein (960.52 AOAC 1998) Kadar protein pati garut dianalisis dengan menggunakan metode Kjeldahl. Sebanyak 100-250,0 mg sampel dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl kemudian ditambahkan dengan 1,9 ± 0,1 g K2SO4, 40,0 ± 10 mg HgO, 2,0 ± 0,1 mL H2SO4 pekat, dan 2-3 butir batu didih. Sampel dipanaskan dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai mendidih selama 1-1,5 jam sampai diperoleh cairan jernih. Setelah didinginkan, isi labu dipindahkan ke dalam labu destilasi dengan dibilas menggunakan 1-2,0 mL air destilata sebanyak 5-6 kali. Air cucian dipindahkan ke labu destilasi kemudian ditambahkan dengan 8-10,0 mL larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3. Di tempat yang terpisah, 5,0 mL larutan H3BO3 dan 2-4 tetes indikator merah metil-biru metil dimasukkan ke dalam erlenmeryer. Labu erlenmeyer kemudian diletakkan di bawah kondensor dengan ujung kondensor terendam di bawah larutan H3BO3. Proses destilasi dilakukan sampai diperoleh sekitar 15,0 mL destilat. Destilat yang diperoleh diencerkan sampai 50,0 mL dengan akuades, kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N yang telah distandarisasi sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Volume larutan HCl 0,02 N terstandar yang digunakan untuk titrasi dicatat. Tahap yang sama dilakukan untuk larutan blanko sehingga diperoleh volume larutan HCl 0,02N untuk blanko. Kadar protein dihitung berdasarkan kadar nitrogen (%N) (persamaan 6). Kadar protein dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan menggunakan faktor koreksi 6,25 sebagai berikut (persamaan 7 dan 8): Kadar N (%) =
(v1 – v2) x NHCl x 14,007 w
x 100
(6)
dengan : v1= volume larutan HCl untuk sampel (mL); v2=volume larutan HCl untuk blanko (mL); NHCl= konsentrasi larutan HCl (0,02N), w=berat sampel (mg) Kadar protein (% bb) = % N x faktor konversi (6,25) Kadar protein (%bk) =
kadar protein (%bb) (100 – kadar air)
x 100
(7) (8)
54
3.4.1.5. Kadar Karbohidrat Kadar karbohidrat dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan metode by difference (persamaan 9 dan 10). Kadar karbohidrat (%bb) = 100–(% air+% abu+% lemak+% protein) Kadar karbohidrat (%bk) =
kadar karbohidrat (%bb) (100 - kadar air)
x 100
(9) (10)
3.4.2. Kadar Total Gula dan Pati (Dubois et al. 1956) Kadar total gula dan pati sampel pati garut dianalisis dengan menggunakan metode fenol sulfat yang mencakup tahapan pembuatan kurva standar larutan glukosa, persiapan sampel, dan analisis sebagai berikut. Pembuatan Kurva Standar Larutan Glukosa Larutan glukosa murni (0,5 mL) yang masing-masing mengandung 0,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0; 60,0; 70,0 dan 80,0 µg larutan glukosa ditempatkan dalam tabung reaksi. Ke dalam masing-masing tabung reaksi tersebut ditambahkan 0,5 mL fenol 5%, kemudian diaduk dengan menggunakan vorteks. Sebanyak 2,5 mL larutan H2SO4 pekat ditambahkan secara cepat ke dalam tabung reaksi tersebut (terjadi reaksi eksoterm yang menghasilkan panas). Larutan tersebut didiamkan selama 10 menit, kemudian diaduk lagi dengan vorteks. Sampel disimpan pada suhu ruang selama 20 menit sebelum diukur absorbansi dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 490 nm. Persamaan dan kurva standar larutan glukosa dibuat sebagai hubungan antara konsentrasi larutan glukosa (pada sumbu x) dan absorbansi (pada sumbu y). Persiapan Sampel Analisis Kadar Pati Sebanyak 1 g pati dimasukkan secara perlahan ke dalam 100 mL etanol 95% dan dihomogenkan menggunakan pengaduk magnetik. Suspensi pati kemudian disaring menggunakan kertas saring. Kertas yang berisi residu pati didiamkan semalam dalam desikator. Residu pati ditimbang sehingga diketahui beratnya untuk menghitung pati pada sampel sebelum mengalami pencucian dengan etanol. Setelah pati kering, pati yang terdapat dalam kertas saring diambil, kemudian dihaluskan dengan mortar. Sebanyak 40 mg pati yang telah dihaluskan ditambah
55
dengan 20 ml akuades, lalu diotoklaf pada suhu 105oC selama 1 jam. Setelah diotoklaf, sampel didinginkan pada suhu kamar lalu diencerkan sebanyak 40 kali. Analisis Sampel Sebanyak 0,5 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 0,5 mL fenol 5% dan dihomogenkan dengan menggunakan vorteks. Sebanyak 2,5 mL larutan H2SO4 pekat lalu ditambahkan secara cepat ke dalam tabung reaksi, sehingga terjadi reaksi eksoterm yang menghasilkan panas. Larutan sampel kemudian didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang, diaduk dengan vorteks dan didiamkan kembali selama 20 menit pada suhu ruang. Nilai absorbansi diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 490 nm. Kadar glukosa (µg/mL) ditentukan dengan menggunakan kurva standar. Kadar total gula (%bb) diperoleh dari kurva standar, sedangkan kadar pati (%bb) dihitung dengan mengalikan kadar total gula dengan faktor 0,9. 3.4.3. Kadar Amilosa (IRRI 1978) Kadar amilosa dianalisis dengan metode spektroskopi. Analisis kadar amilosa mencakup tahapan pembuatan kurva standar larutan amilosa dan analisis sampel sebagai berikut. Pembuatan Kurva Standar Amilosa Sebanyak 40,0 mg amilosa murni dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL. Ke dalam labu tersebut kemudian ditambahkan 1,0 mL etanol 95% dan 9,0 mL larutan NaOH 1 N. Labu takar kemudian dipanaskan dalam penangas air pada suhu 95oC selama 10 menit. Setelah didinginkan, larutan gel amilosa yang terbentuk ditambah dengan akuades sampai tanda tera. Larutan amilosa ini digunakan sebagai larutan stok amilosa standar. Dari larutan stok amilosa standar tersebut dipipet 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL untuk dipindahkan masing-masing ke dalam labu takar 100 mL. Ke dalam masing-masing labu takar tersebut kemudian ditambahkan 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mL larutan asam asetat 1 N. Sebanyak 2,0 mL larutan iod (0,2 g I2 dan 2,0 g KI yang dilarutkan dalam 100,0 mL air destilata) dipipet ke dalam setiap labu, lalu ditambahkan air destilata hingga tanda tera. Larutan dibiarkan selama 20 menit dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang
56
gelombang 625 nm. Persamaan dan kurva standar dibuat sebagai hubungan antara kadar amilosa (sumbu x) dan absorbansi (sumbu y). Analisis Sampel Sebanyak 100,0 mg sampel pati garut dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL, kemudian ditambahkan 1,0 mL etanol 95% dan 9,0 mL larutan NaOH 1 N. Labu takar ini lalu dipanaskan dalam penangas air pada suhu 95ºC selama 10 menit. Setelah didinginkan, larutan gel pati ditambahkan air destilata sampai tanda tera dan dihomogenkan. Dari labu takar ini dipipet 5,0 mL larutan gel pati dan dipindahkan ke dalam labu takar 100 mL. Ke dalam labu takar tersebut kemudian ditambahkan 1,0 mL larutan asam asetat 1 N dan 2,0 mL larutan iod, lalu ditambah akuades hingga tanda tera. Larutan sampel ini dibiarkan selama 20 menit pada suhu ruang sebelum diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 625 nm. Kadar amilosa (dalam persen) ditentukan dengan menggunakan persamaan kurva standar larutan amilosa. 3.4.4. Kadar Gula Pereduksi (Takeda et al. 1993) Kadar gula pereduksi sampel dianalisis dengan metode Park-Johnson yang terdiri atas tahapan pembuatan kurva standar gkukosa, persiapan sampel, dan analisis sampel sebagai berikut. Pembuatan Kurva Standar Larutan Glukosa Sebanyak 1,0 mL larutan glukosa murni yang masing-masing mengandung 0,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; dan 10,0 µg glukosa dalam tabung reaksi ditambahkan dengan 0,5 mL bufer sodium karbonat-sodium hidrogen karbonat dan 0,5 mL larutan potasium ferisianida. Sampel dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit kemudian didinginkan dalam air mengalir selama 10 menit. Selanjutnya 5,0 mL larutan ferri-amonium sulfat ditambahkan ke dalam sampel, kemudian diaduk dengan menggunakan vorteks. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit. Sampel diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UVVis pada panjang gelombang 715 nm. Persamaan dan kurva standar larutan glukosa dibuat sebagai hubungan antara konsentrasi larutan glukosa (pada sumbu x) dan absorbansi (pada sumbu y).
57
Persiapan Sampel Sebanyak 1,0 g pati dimasukkan secara perlahan ke dalam 100,0 mL etanol 95% dan dihomogenkan dengan menggunakan pengaduk magnetik. Suspensi pati tersebut kemudian disaring menggunakan kertas saring. Kertas yang berisi residu pati didiamkan semalam di dalam desikator. Setelah kering, pati yang terdapat dalam kertas saring diambil, lalu dihaluskan dengan mortar. Sebanyak 40,0 mg pati yang telah dihaluskan ditambahkan dengan 20,0 mL akuades, kemudian dipanaskan dalam otoklaf 105oC selama 1 jam. Setelah pemanasan selesai, pasta pati didinginkan pada suhu kamar dan dilakukan 40 kali pengenceran sebelum digunakan. Analisis Sampel Sebanyak 1,0 mL larutan pati dalam tabung reaksi ditambahkan dengan 0,5 mL bufer sodium karbonat-sodium hidrogen karbonat dan 0,5 mL larutan kalium ferisianida. Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit kemudian didinginkan dalam air mengalir selama 10 menit. Sebanyak 2,5 mL larutan feriamonium sulfat ditambahkan ke dalam larutan sampel kemudian diaduk dengan vorteks. Larutan sampel tersebut lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit dan diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 715 nm. Gula pereduksi (dalam persen) ditentukan dengan menggunakan persamaan kurva standar larutan glukosa. 3.4.5. Kadar Pati Resisten (Goñi et al. 1996) Kadar pati resisten sampel dianalisis dengan metode spektroskopi yang mencakup tahapan pembuatan kurva standar glukosa dan analisis sampel sebagai berikut. Pembuatan Kurva Standar Glukosa Kurva standar glukosa ditentukan dengan menggunakan kit glukosa. Larutan glukosa standar dengan konsentrasi 0,0; 0,5; 1,0; 1,5; dan 2,0 mg/mL disiapkan. Sebanyak 10 μL dari masing-masing larutan glukosa standar tersebut ditambahkan kit bufer sebanyak 500 μL dan 500 μL akuades. Sampel diinkubasi dahulu pada suhu 37oC selama 5 menit sebelum diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 525 nm.
58
Analisis Sampel Sebanyak 50,0 mg pati dimasukkan ke dalam tabung sentrifus, lalu ditambahkan 5,0 mL larutan bufer KCl-HCl pH 1,5 dan 0,1 mL pepsin (4000 U/10 mL bufer KCl-HCl). Setelah diaduk dengan menggunakan vorteks, sampel diinkubasi pada suhu 40oC selama 60 menit pada penangas bergoyang. Sampel kemudian didinginkan pada suhu ruang. Sebanyak 4,5 mL larutan bufer fosfat pH 6,9 dan 0,5 mL larutan porcine αamilase (15,2 mg α-amilase per mL bufer fosfat) ditambahkan ke dalam sampel. Sampel kemudian diaduk dengan vorteks dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 16 jam sambil terus digoyang. Setelah sampel disentrifus (15 menit, 3000 g), bagian residu diambil dan dicuci dengan 10,0 mL akuades. Proses sentrifusi diulang lagi dengan cara yang sama seperti di atas dan residunya kembali diambil dan dicuci. Ke dalam residu sampel di atas ditambahkan 3,0 mL akuades dan 1,5 mL larutan KOH 4 M, lalu diaduk dengan menggunakan vorteks dan didiamkan selama 30 menit pada suhu ruang. Secara berturut-turut ke dalam sampel tersebut ditambahkan 2,75 mL 2 M HCl dan 1,5 mL bufer sodium asetat pH 4,75, dan 40 µl enzim amiloglukosidase. Sebelum diinkubasi pada suhu 60oC selama 45 menit, sampel diaduk dengan menggunakan vorteks dalam penangas air bergoyang. Sampel disentrifus (15 menit, 3000 g), kemudian bagian supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar. Bagian residu dicuci dengan 10 mL akua-des, lalu disentrifus kembali. Bagian supernatan kemudian dicampurkan dengan supernatan sebelumnya. Sebanyak 25-1000,0 mL sampel diencerkan dengan akua-des (tingkat pengenceran tergantung pada kandungan pati resisten dalam sampel). Kadar glukosa (mg) yang terkandung di dalam sampel diukur dengan menggunakan kit glukosa. Kadar pati resisten (%bb) dihitung dengan mengalikan kadar glukosa dalam sampel dengan faktor 0,9. 3.4.6. Daya Cerna Pati in Vitro (Anderson et al. 2002) Daya cerna pati in vitro dianalisis secara spektroskopi yang mencakup tahapan pembuatan kurva standar maltosa dan analisis sampel sebagai berikut.
59
Pembuatan Kurva Standar Larutan Maltosa Sebanyak 1,0 mL larutan maltosa standar yang mengandung 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 mg maltosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup, kemudian ditambahkan masing-masing 2,0 mL larutan dinitrosalisilat (DNS). Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 12 menit, lalu segera didinginkan dengan air mengalir. Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 10 mL akuades, kemudian diaduk hingga homogen dengan menggunakan vorteks. Sampel diukur absorbansinya dengan spektrotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm. Analisis Sampel Sebanyak 1,0 g sampel pati garut dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 mL, lalu ditambahkan dengan 100,0 mL akuades. Labu erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan dalam penangas air hingga mencapai suhu 90oC sambil terus diaduk, lalu didinginkan. Sebanyak 2,0 mL larutan sampel tersebut dipipet ke dalam tabung reaksi bertutup, lalu ditambahkan 3,0 mL akuades dan 5,0 mL larutan bufer fosfat pH 7,0. Masing-masing sampel dibuat dua kali, yang salah satunya digunakan sebagai blanko. Tabung ditutup dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 15 menit. Larutan sampel dan blanko diangkat dan ditambahkan 5,0 mL larutan enzim α-amilase (1 mg/mL dalam larutan bufer fosfat pH 7,0). Kedua tabung tersebut diinkubasi kembali selama 30 menit, lalu dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup berisi 2,0 mL larutan DNS (asam dinitrosalisilat). Larutan dipanaskan dalam air mendidih selama 12 menit, lalu segera didinginkan dengan air mengalir. Sebanyak 10,0 mL akuades kemudian ditambahkan, lalu diaduk hingga homogen dengan menggunakan vorteks. Larutan sampel dan blanko tersebut kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 520 nm. Daya cerna pati (dalam persen) dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut (persamaan 11): Daya cerna pati (%bb) =
A–a x 100 B–b
(11)
dengan : A = maltosa dalam sampel (mg); a= maltosa dalam blanko (mg), B = maltosa dalam pati murni (mg); b = maltosa dalam blanko pati murni (mg).
60
3.4.7. Analisis Profil Gelatinisasi Pati (RVA Standar 2) Profil gelatinisasi pati garut alami dianalisis dengan menggunakan Rapid Visco Analyzer (RVA). Sebanyak 3,0 g sampel (berat kering) ditimbang dalam wadah RVA, lalu ditambahkan 25,0 g akuades. Pengukuran dengan RVA mencakup fase proses pemanasan dan pendinginan pada pengadukan konstan (160 rpm). Pada fase pemanasan, suspensi pati dipanaskan dari suhu 50oC hingga 95oC dengan kecepatan 6oC/menit, lalu dipertahankan pada suhu tersebut (holding) selama 5 menit. Setelah fase pemanasan selesai, pasta pati dilewatkan pada fase pendinginan, yaitu suhu diturunkan dari 95oC menjadi 50oC dengan kecepatan 6oC/menit, kemudian dipertahankan pada suhu tersebut selama 2 menit. Instrumen RVA memplot kurva profil gelatinisasi sebagai hubungan dari nilai viskositas (cP) pada sumbu y dengan perubahan suhu (oC) selama fase pemanasan dan pendinginan pada sumbu x (Gambar 21).
Gambar 21. Profil kurva gelatinisasi pati dengan Rapid Visco Analyzer (RVA) Data yang diperoleh dari pengukuran RVA adalah suhu awal gelatinisasi (SAG), viskositas puncak atau maximum viscosity (MV), viskositas pada 95oC atau hot paste viscosity (HPV), viskositas breakdown (VB), viskositas setelah mencapai suhu 50oC, viskositas akhir setelah dipertahankan di 50oC atau cold paste viscosity (CPV), viskositas setback atau setback viscosity (SV), dan stabili-
61
tas pengadukan pada 50oC. SAG (oC) adalah suhu pada saat nilai viskositas mulai terbaca yang menandakan pati mulai mengalami gelatinisasi. MV diukur saat pasta pati mencapai viskositas maksimum selama fase pemanasan. VB menunjukkan kestabilan viskositas terhadap pemanasan yang dihitung dari selisih antara PV dengan HPV. SV menunjukkan kecenderungan pati untuk mengalami retrogradasi yang dihitung sebagai selisih antara CPV dengan HPV. Tipe profil gelatinisasi pati selanjutnya ditentukan berdasarkan pengelompokan oleh Schoch dan Maywald (1968). 3.4.8. Analisis Morfologi Pati Perubahan morfologi pati garut sebelum dan setelah perlakuan modifikasi diamati dengan menggunakan mikroskop polarisasi dan Scanning Electron Microscope (SEM) sebagai berikut. 3.4.8.1. Mikroskop Polarisasi (Ridal 2003) Pati garut alami dibuat suspensi encer dengan melarutkan 1 sudip sampel dalam + 20 mL air. Selanjutnya beberapa tetes suspensi diambil dan diletakkan di atas sebuah gelas objek. Gelas penutup dipasang, lalu preparat diamati dengan menggunakan mikroskop polarisasi cahaya pada skala pembesaran 200 kali dan gambar yang teramati dipotret dengan kamera dan foto granula pati yang dihasilkan dicetak pada film. Ukuran granula pati dibaca dari gambar (dalam satuan μm). 3.4.8.2. Scanning Electron Microscope (Srichuwong 2006) Morfologi permukaan granula pati garut sebelum dan setelah modifikasi diamati di bawah Scanning Electron Microscope (SEM). Serbuk pati diletakkan di atas tempat sampel dengan menggunakan isolasi double-side. Sampel kemudian dilapisi dengan emas, lalu dimasukkan ke dalam instrumen SEM. Struktur pati diamati di layar monitor dengan menggunakan skala pembesaran 500 dan 800 kali. Hasil pengamatan kemudian difoto dengan menggunakan kamera digital. 3.4.9. Analisis Perubahan Struktur Pati Garut Perubahan struktur pati garut sebelum dan setelah perlakuan modifikasi diamati dengan menganalisis distribusi amilosa dan amilopektin dengan GPC dan distribusi panjang rantai amilopektin dengan FACE sebagai berikut.
62
3.4.9.1. Distribusi Amilosa dan Amilopektin (Sunarti et al. 2001; Ozturk et al. 2009) Analisis distribusi amilosa dan amilopektin dilakukan dengan menggunakan Gel Permeation Chromatography (GPC). Analisis mencakup tahapan persiapan sampel dan injeksi sampel ke dalam GPC. Persiapan Sampel Tahapan persiapan sampel bertujuan menghilangkan lemak dalam sampel pati garut. Sebanyak 2,0 g sampel disuspensikan ke dalam 40 mL dimetil sulfoksida (DMSO) dan disimpan pada penangas bergoyang pada suhu 37oC selama 12 jam. Suspensi sampel kemudian dituangkan sedikit demi sedikit ke dalam 100,0 mL etanol dan disimpan pada suhu 4oC selama selama 12 jam. Sampel disaring dengan menggunakan 3G-4 glass-filter dan dicuci 4 kali dengan etanol. Sampel kemudian dikeringkan di dalam desikator. Injeksi Sampel ke Dalam GPC Sampel pati garut yang sudah dihilangkan lemaknya (40,0 mg) ditimbang dan ditambahkan 20,0 mL akuades dalam tabung sentrifus 15 mL, sehingga diperoleh konsentrasi suspensi pati 2,0 mg/mL. Tabung sentrifus berisi sampel tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan di dalam otoklaf pada suhu 105oC selama 1 jam. Larutan pati diaduk dengan vorteks, lalu disentrifusi pada 1.000g selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan yang diperoleh kemudian dianalisis total karbohidratnya dengan metode fenol-sulfat (Dubois et al. 1956) sebelum diinjeksikan dalam kolom GPC. Total karbohidrat yang diinjeksikan ke dalam kolom memiliki konsentrasi antara 4-6 mg per 10 mL. Fase gerak yang digunakan adalah 50 mM NaCl. Kondisi yang digunakan dalam analisis GPC adalah sebagai berikut. Gel
: Toyopearl HW-65S (Tosoh Co, Japan)
Ukuran sampel : 2,6 cm ID x 100 cm Eluen
: NaCl 50 mM
Laju alir
: 60 ml/jam
Volume/tabung : 10,0 ml Volume injeksi : 10,0 ml
63
Sampel pada setiap nomor fraksi dari hasil pemisahan GPC ditampung dan dianalisis kadar total karbohidratnya dengan menggunakan metode fenol-sulfat (Dubois et al. 1956). Persentase nisbah karbohidrat ditentukan dari kadar total karbohidrat setiap nomor fraksi dibagi dengan total jumlah karbohidrat seluruh nomor fraksi. Selanjutnya dibuat plot hubungan antara nomor fraksi (pada sumbu x) dan persen nisbah karbohidrat (pada sumbu y). Kurva GPC dikelompokkan menjadi dua (2) kelompok fraksi (I dan II). Fraksi I merupakan penjumlahan dari nomor fraksi 1-30 dan fraksi II dari nomor fraksi 31-48. Masing-masing fraksi I dan II ditentukan persentasenya dengan menghitung jumlah total karbohidrat di masing-masing fraksi dengan total karbohidrat seluruh fraksi. Persentase peningkatan fraksi II dihitung dari sebagai selisih persentase fraksi II dari pati modifikasi dengan fraksi II dari pati alami dibagi dengan fraksi II pati alami. 3.4.9.2. Distribusi Panjang Rantai Amilopektin (Srichuwong et al. 2005a) Analisis distribusi panjang rantai amilopektin dan amilosa rantai pendek dari pati garut dan pati garut yang dimodifikasi diukur dengan FluorophoreAssisted Capillary Electrophoresis (FACE). Analisis mencakup tahap persiapan sampel, dan analisis dengan FACE sebagai berikut. Persiapan Sampel Sampel pati garut (10,0 mg) ditimbang dan ditambahkan 5,0 mL akuades dalam tabung sentrifus 15 mL, sehingga diperoleh konsentrasi suspensi pati 2,0 mg/mL. Tabung sentrifus berisi sampel tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil dan dipanaskan di dalam otoklaf pada suhu 105oC selama 1 jam. Larutan pati diaduk dengan vorteks, kemudian dipindahkan sebanyak 100 μL ke dalam tabung reaksi (suhu di bawah 37oC). Ke dalam tabung reaksi tersebut kemudian ditambahkan 5 μL 50 mM bufer asetat pH 3,5 dan 5 μL larutan enzim isoamilase yang sudah dimurnikan. Sampel diaduk kembali dengan vorteks dan disimpan di dalam inkubator 37oC selama 24 jam. Larutan yang telah diinkubasi tersebut kemudian dididihkan pada suhu 100oC selama 5 menit dan disentrifusi pada 1.500g selama 5 menit. Sebanyak 50 μL supernatan dikeringkan dengan menggunakan evaporator, lalu ditambahkan 2 μL larutan NaBH3CN 1 M dan 2 μL APTS 0,2 M (8-aminopyrene-1,3,6-trisul-
64
furic acid trisodium). Setelah diaduk dengan menggunakan vorteks, sampel disimpan kembali di dalam inkubator 37oC selama 24 jam. Selanjutnya sampel ditambah 1 mL akuades, diaduk dengan vorteks, dan disimpan di dalam freezer -30oC sebelum dianalisis dengan menggunakan FACE. Analisis Sampel Sampel beku yang telah di-thawing diencerkan 3000 kali dan 6000 kali, kemudian dipipet sebanyak 20 μL. Larutan sampel dimasukkan ke dalam 96-well dan disentrifusi. Larutan sampel yang berada di dalam 96-well dimasukkan ke dalam Genetic Analyzer dengan polimer POP-6 dan 36 cm kapiler (FACE). Alat elektroforesis dijalankan dengan bufer Genetic Analyzer pada 15kV selama 2 jam. Data yang diperoleh dari pengukuran FACE diolah dengan menggunakan software Genescan 3.7 (Applied Biosystems) untuk menghasilkan kurva hubungan antara derajat polimerasi (DP) amilopektin atau amilosa rantai pendek (DP 6-30) (pada sumbu x) dan persen distribusi panjang rantai amilopektin atau amilosa rantai pendek (pada sumbu y). Berdasarkan kurva tersebut ditentukan Δdistribusi DP yang dihitung dari selisih persen distribusi DP pada masing-masing perlakuan dengan persen distribusi DP pada pati garut alami (dinyatakan dalam persen). Selanjutnya dibuat plot hubungan antara persen Δ distribusi DP (pada sumbu y) dengan derajat polimerisasi (pada sumbu x). Pengelompokan fraksi amilosa rantai pendek hasil perlakuan modifikasi ditentukan menurut Hizukuri (1986), yaitu DP 6-8, 9-12, 13-24, dan 25-30. Setiap kelompok DP tersebut dihitung dengan cara menjumlahkan persen distribusi untuk setiap DP dalam kelompoknya. 3.4.10. Analisis Kestabilan Panas dan Derajat Retrogradasi (Wang et al. 2003) Analisis kestabilan panas dan derajat retrogradasi pati sebelum dan setelah modifikasi dapat diukur dengan menggunakan Differential Scanning Calorimetry (DSC). Sebelum analisis sampel dilakukan, DSC dikalibrasi dahulu dengan menggunakan indium. Sebanyak 3,0 mg sampel ditempatkan dalam wadah aluminium hermetis. Air deionisasi ditambahkan sebanyak 10 μL ke dalam wadah aluminium tersebut, kemudian dikelim dengan rapat dan disimpan di dalam refrigerator pada suhu 4oC selama 12 jam. Sampel dianalisis dengan menggunakan DSC dengan
65
suhu awal 30oC dan dipertahankan selama 3 menit. Suhu dinaikkan secara bertahap hingga suhu 250oC dengan kenaikan 5oC/menit. DSC memplot kurva hubungan antara suhu pada sumbu x dengan aliran panas (endothermic heat flow) pada sumbu y (Gambar 22).
Gambar 22. Kurva Differential Scanning Calorimetry (DSC). To (onset temperature), Tp (peak temperature), Tc (conclusion temperature) Data-data yang diperoleh untuk menunjukkan kestabilan pati terhadap panas adalah suhu onset atau onset temperature (To), suhu puncak atau peak temperature (Tp), dan suhu akhir atau conclusion temperature (Tc). Nilai entalpi (ΔH, J/g) ditentukan dari daerah di bawah kurva antara To dan Tc (Gambar 22). Derajat retro-gradasi (%) dari pati garut dihitung sebagai persentase dari nilai ΔH pati yang telah dimodifikasi terhadap ΔH pati alami (sebelum dimodifikasi). 3.4.11. Analisis Sifat Kristalinitas Perubahan daerah kristalin dan amorf pada struktur pati sebelum dan setelah modifikasi diamati dengan difraksi sinar X dan FTIR sebagai berikut. 3.4.11.1. Perubahan Daerah Kristalin dan Amorf (Lopez-Robio et al. 2008) Analisis dengan spektroskop Fourier Transform Infrared (FTIR) bertujuan untuk menentukan seberapa besar perubahan daerah kristalin dan amorf sebagai akibat dari perlakuan modifikasi. Sebanyak 90,0 mg garam potasium bromida (KBr) kristal dihancurkan dengan menggunakan agate mortar, lalu ditambahkan
66
ke dalam sampel pati garut alami atau yang telah dimodifikasi (10,0 mg). Campuran tersebut kemudian dihomogenkan dengan menggunakan mortar. Sejumlah kecil sampel tersebut kemudian diambil dan ditempatkan ke dalam tempat sampel (DRS) yang terdapat pada alat FTIR. Sampel selanjutnya di-scan pada bilangan gelombang (wavenumber) 800-1200 cm-1. Pengamatan dititikberatkan pada spektrum dengan bilangan gelombang 995, 1022 dan 1045 cm-1. Bilangan gelombang pada 1022 cm-1 menunjukkan daerah amorf, sedangkan bilangan gelombang pada 1045 cm-1 menunjukkan daerah kristalin. Data yang diperoleh adalah kurva hubungan antara bilangan gelombang (pada sumbu x) dan absorbansi (pada sumbu y). Perubahan daerah kristalinitas dihitung sebagai nisbah antara absorbansi pada bilangan gelombang 1045 cm-1 dengan absorbansi pada 1022 cm-1. Dengan semakin tinggi nisbahnya, maka tingkat kristalinitas semakin tinggi. Perubahan daerah amorf ditujukan dari nisbah antara absorbansi pada bilangan gelombang 1022 cm-1 dengan absorbansi pada 995 cm-1, dengan semakin tinggi nisbahnya, maka daerah amorf semakin tinggi. 3.4.11.2. Pola Difraksi Sinar X (Frost et al. 2009) Analisis difraksi sinar X ditujukan untuk mengamati adanya perubahan wilayah amorf dan kristalin dari struktur pati, serta menentukan relatif kristalinitas dan kristalinitas tiap peak dari pati garut sebelum dan setelah dimodifikasi. Sejumlah kecil sampel diletakkan pada wadah sampel, kemudian dimasukkan ke dalam alat difraksi sinar X. Analisis dilakukan pada 40kV dan 40 mA dan di-scan pada 2 tetra 2-30o pada suhu kamar dengan kenaikan 0,02o. Data yang diperoleh adalah kurva hubungan antara 2 tetrao pada sumbu x dengan intensitas (a.u.) pada sumbu y. Kurva yang diperoleh kemudian dihaluskan (smoothing) dengan menggunakan software algoritma Filter Kalman (Rudiyanto et al. 2006) (Gambar 23). Kurva yang sudah dihaluskan (smoothing) kemudian digunakan untuk menentukan daerah amorf dan kristalin. Penentuan Daerah Amorf dan Kristalin dari Struktur pati Plot dan luas daerah amorf dan kristalin dari kurva yang sudah dihaluskan (Gambar 23) ditentukan dengan menggunakan model persamaan Lorentz dan Gaussian (persamaan 12) (software Macro Visual Basic pada MS Excel 2007). Nilai sum square error (SSE) (persamaan 13) dihitung untuk mengetahui kede67
katan data dari model persamaan Lorentz dan Gaussian dibandingkan dengan data hasil pengukuran dengan difraksi sinar X yang telah dihaluskan (smoothing).
Gambar 23. Kurva difraksi sinar X yang sudah dihaluskan dan dibuat model Gaussian dan Lorentz. 0
1
∆
1
exp
0 2 ∆
(12)
dengan: Y0 : tinggi maksimum kurva A : bobot antara Lorentz dan Gaussian x : nilai observasi data x0L : nilai parameter mean Lorentz Δxl : deviasi parameter Lorentz xoG : nilai parameter mean Gaussian ΔxG : deviasi parameter Gaussian (13) dengan: SSE : Sum Square Error yi : nilai observasi dari data ym : nilai model yang diperoleh dari persamaan kombinasi Lorentz dan Gaussian
68
Derajat Kristalinitas Derajat kristalinitas merupakan nisbah luas daerah kristalin terhadap luas daerah di bawah kurva difraksi sinar X yang dihaluskan (penjumlahan antara daerah kristalin dan daerah amorf) (persamaan 14). Derajat kristalinitas =
Daerah kristalin x 100 (Daerah kristalin + Daerah amorf)
(14)
Penentuan Tipe Kristalinitas Pati Tipe kristalinitas pati (A, B, C atau V) ditentukan menurut pengelompokkan oleh Zobel (1988) berdasarkan kurva hasil pengukuran difraksi sinar X (difraktogram). Kristalinitas Tiap Peak Kristalinitas tiap peak merupakan nisbah luas daerah kristalin tiap peak terhadap luas total daerah kristalin dari kurva difraksi sinar X yang telah dihaluskan dikali 100 (persamaan 15). Kristalinitas setiap peak =
Daerah kristalin tiap peak Total daerah kristalin
x 100
(15)
69
70
TAHAPAN PENELITIAN
ANALISIS
Tahap I: Ekstraksi dan Karakterisasi Umbi garut
Ekstraksi pati
Pati garut alami Tahap II: Penentuan Kondisi Proses Modifikasi
• Proksimat (air, abu, protein, lemak, karbohidrat) • Kadar pati • Kadar amilosa • Profil gelatinisasi (RVA) • Morfologi granula pati (mikroskop polarisasi, SEM)
1. Siklus autoclaving-cooling: a Pemanasan awal sebelum a. autoclaving (80,90oC, 5 menit) b. Jumlah siklus dan waktu (15, 30 menit pada 121oC, 1, 3, 5 siklus)
• Kadar amilosa • Kadar gula pereduksi • Kadar pati resisten • Daya cerna pati in vitro
2. Hidrolisis asam (HCl 0.1N, 0.2N; 2, 4, 6 jam) + siklus autoclavingcooling g1
• Kadar amilosa • Daya cerna pati
3. Debranching (pullulanase (1,3; 5,2; 10,4 U/g pati; 0, 16, 24, 40 jam)
• Derajat hidrolisis
1
Siklus autoclaving-cooling terpilih Tahap II.1)
Tahap III: Perlakuan Modifikasi Pati Garut 1. Siklus autoclaving-cooling1 2. Hidrolisis asam2 + siklus autoclavingcooling2 3. Debranching + siklus autoclavingcooling3 4. Hidrolisis asam2 + debranching3 + siklus ikl autoclaving-cooling l i li 5. Pati garut alami (sebagai kontrol) 1Siklus
autoclaving-cooling terpilih Tahap II.1 hidrolisis asam terpilih Tahap II.2 3Perlakuan debranching terpilih Tahap II.3 2Perlakuan
• Kadar gula pereduksi • Kadar pati resisten • Daya cerna pati in vitro • Morfologi pati (SEM) • Distribusi amilosa dan amilopektin (GPC) • Distribusi panjang rantai amilopektin (FACE) • Kestabilan p panas dan derajat retrogradasi pati (DSC) • Amorf dan kristalin (FTIR, difraksi sinar X)
Gambar 19. Tahapan penelitian dalam proses modifikasi pati garut dan k kt i i karakterisasinya
LAMPIRAN
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Ekstraksi dan Karakterisasi Pati Garut 4.1.1. Ekstraksi Pati Garut Dalam penelitian ini, pati garut digunakan sebagai bahan baku untuk menghasilkan pati resisten tipe III (RS3), dengan menguji pengaruh berbagai perlakuan modifikasi yang berbeda, yaitu autoclaving-cooling, hidrolisis asam, pemutusan ikatan percabangan amilopektin (debranching) dan atau kombinasi dari ketiga perlakuan tersebut. Pati garut yang digunakan dalam penelitian ini diekstraksi dari umbi garut kultivar creole. Sebagaimana telah dijelaskan di bagian metode penelitian, pati garut diekstraksi dengan cara basah. Ekstraksi pati garut cara basah terdiri atas tahapan pembersihan, pengupasan, pencucian, perendaman, dan penghancuran umbi garut, yang dilanjutkan dengan tahap proses pemisahan pati melalui penyaringan, pengayakan dan pengendapan, serta pencucian. Pati garut basah yang diperoleh kemudian dikeringkan, digiling, dan diayak. Proses ekstraksi cara basah tersebut menghasilkan rendemen pati garut kering sebanyak 15,69% dengan kadar air 11,48%. 4.1.2. Komposisi Kimia Komponen proksimat dari pati garut yang dihasilkan dari metode ekstraksi basah dapat dilihat pada Tabel 6. Pati garut mengandung kadar karbohidrat (by difference) yang tinggi, yaitu 98,74%. Kadar protein, lemak dan abu (mineral) dari pati garut relatif rendah yang menunjukkan bahwa proses ekstraksi pati cara basah yang digunakan dapat menghasilkan kandungan pati yang tinggi sehingga berpotensi untuk digunakan sebagai bahan baku RS3. Selain itu, kadar lemak yang rendah juga diharapkan selama proses pembuatan RS3, karena lemak dapat menghambat proses pembentukan RS3. Kandungan lemak yang tinggi dapat membentuk kompleks dengan amilosa sehingga membentuk kompleks lemakamilosa.
71
Tabel 6. Komposisi kimia pati garut alami hasil ekstraksi cara basah Komponen Kadar1 Proksimat Air (%)
11,48
Abu (%)
0,34
Protein (%)
0,24
Lemak (%)
0,68
Karbohidrat (by difference) (%) Pati (%)
98,74 98,10
Amilosa (%)
24,64
Amilopektin (%)
73,46
Pati resisten (%)
2,12
Gula pereduksi (%)
4,96
1
Konsentrasi dinyatakan dalam basis kering, kecuali kadar air dalam basis basah
Tabel 6 menunjukkan bahwa pati garut mengandung kadar pati yang tinggi, yaitu 98,10%. Pati garut yang dihasilkan dari ekstraksi cara basah ini lebih besar dibandingkan dengan kadar pati garut yang diperoleh oleh Faridah et al. (2008), yaitu 94,89%,. Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan umur panen umbi garut yang digunakan. Pada penelitian ini, umbi garut yang digunakan berumur 10-11 bulan, sedangkan yang digunakan oleh Faridah et al. (2008) berumur 4-5 bulan. Pati garut yang dihasilkan dari penelitian juga mengandung sebagian kecil gula pereduksi (4,96%). Pati garut mengandung amilosa 24,64% dan 73,46% amilopektin (Tabel 6). Kadar amilosa dan amilopektin pati garut ini sedikit berbeda dari yang dilaporkan oleh Sobur (2009) untuk kultivar yang sama (23,58%). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa pati dengan kandungan amilosa yang cukup tinggi berpotensi untuk digunakan sebagai bahan baku pembuatan pati resisten tipe III (RS3) (Gudmundsson 1994; Lehmann et al. 2003; Shu et al. 2007). Oleh karena itu, pati garut dari kultivar creole berpotensi untuk digunakan sebagai bahan baku untuk memproduksi RS3. Pati garut secara alami memiliki kadar pati resisten sebesar 2,12% (Tabel 6). Pati resisten dalam pati garut alami ini termasuk jenis pati resisten tipe II 72
(RS2). Sebagai perbandingan, pati pisang memiliki kadar pati resisten 1,51% (Aparicio-Saguilán et al. 2005), sedangkan pati beras beramilosa tinggi memiliki 3,98% (Pongjanta et al. 2009a). 4.1.3. Bentuk dan Ukuran Granula Pati Pengamatan di bawah mikroskop polarisasi (Gambar 24) menunjukkan bentuk granula pati garut dengan penampakan birefrigence-nya. Adanya penampakan birefringence ini menunjukkan bahwa pati garut hasil ekstraksi belum mengalami gelatinisasi. Sebagaimana dilaporkan oleh peneliti terdahulu (Tester dan Karkalas 2002), bentuk granula pati garut berbentuk oval dengan ukuran ratarata granula sebesar 50-60,0 μm.
Gambar 24. Struktur granula pati garut alami di bawah mikroskop polarisasi (pembesaran 200x) Gambar 24 memperlihatkan bahwa granula pati garut masih terlihat utuh dengan bentuknya yang oval yang menunjukkan bahwa granula pati garut belum mengalami kerusakan struktur granula pati garut. Pengamatan dengan menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM) (Gambar 25a dan 25b) juga menunjukkan struktur granula pati garut dengan permukaan yang masih halus dan utuh.
73
Gambar 25. Struktur granula pati garut di bawah Scanning Electron Microscope (SEM). (a) pembesaran 500x; (b) pembesaran 800x 4.1.4. Profil Gelatinisasi Pati Garut Gambar 26 memperlihatkan profil gelatinisasi pati garut yang diukur dengan menggunakan RVA. Sebagaimana pati alami umumnya, pati garut memiliki profil gelatinisasi dengan puncak viskositas (maximum viscosity) yang cukup tinggi dan diikuti dengan penurunan viskositas (breakdown viscosity) yang cukup tajam selama fase pemanasan. Hal ini menunjukkan granula pati garut kurang tahan atau kurang stabil oleh proses pemanasan. Pada fase pendinginan, viskositas
74
pasta pati kembali berangsur meningkat yang disebabkan oleh terjadinya penggabungan kembali (re-association) molekul-molekul amilosa dan amilopektin melalui ikatan hidrogen. Peningkatan viskositas selama fase pendinginan juga menunjukkan kecenderungan retrogradasi dari pasta pati garut. Kandungan amilosa yang cukup tinggi memiliki kontribusi yang besar terhadap kecenderungan terjadinya retrogradasi pasta pati selama fase pendinginan (Gudmundsson 1994; Lehmann et al. 2003; Shu et al. 2007). Profil gelatinisasi pati garut sebagaimana diuraikan di atas sama dengan yang dilaporkan oleh Srichuwong (2006).
Gambar 26. Profil gelatinisasi pati garut alami yang diukur dengan Rapid Visco Analyzer (RVA) Menurut Chen (2003), pengukuran kecenderungan pati untuk mengalami retrogradasi dapat dilakukan dengan dua metode yaitu dengan pengukuran freezethaw stability dan pengukuran nisbah viskositas setback pasta. Sineresis yang terjadi pada saat dilakukan siklus freeze-thaw berulang menunjukkan adanya peningkatan ikatan hidrogen intermolekuler antara amilosa dengan amilosa, amilosa dengan amilopektin, serta amilopektin dengan amilopektin. Sementara itu, viskositas setback pasta menunjukkan kecenderungan retrogradasi yang terjadi pada molekul amilosa karena amilosa lebih mudah terpapar oleh air dan mudah mengalami rekristalisasi dibandingkan amilopektin.
75
Tabel 7 memperlihatkan data-data profil gelatinisasi pati garut yang diolah dari kurva RVA pada Gambar 26. Pati garut mulai mengalami gelatinisasi pada suhu yang cukup tinggi, yaitu 76,3oC. Suhu awal gelatinisasi pati masih berada dalam rentang suhu yang dilaporkan oleh Perez dan Lares (2005), yaitu 67,7581,40oC. Viskositas puncak tercapai pada suhu 85,1oC dengan nilai viskositasnya sebesar 2715 cP. Viskositas puncak pati garut hampir sama dengan pati ganyong, lesser yam dan water yam (Srichuwong 2006). Pada pemanasan di atas suhu 85oC, pati garut mengalami penurunan viskositas yang cukup tajam dengan viskositas breakdown sebesar 1434 cP. Pasta pati garut secara berangsur-angsur mengalami peningkatan viskositas selama fase pendinginan. Viskositas setback selama fase pendinginan ini sebesar 806 cP. Viskositas setback pati garut ini relatif tinggi, yang menunjukkan kecenderungan pati garut untuk lebih mudah mengalami retrogradasi. Kecenderungan retrogradasi dari pati garut ini diharapkan, karena akan lebih memudahkan dalam pembentukan RS3. Tabel 7. Profil gelatinisasi pati garut dari hasil pengukuran Rapid Visco Analyzer (RVA) Parameter Nilai o Suhu awal gelatinisasi ( C) 76,3 Viskositas maksimum (cP) 2715 o 2246 Viskositas pada 95 C (cP) o Viskositas setelah holding pada 95 C (cP) 1311 Viskositas breakdown (cP) 1434 o Viskositas pada 50 C (cP) 1932 o 935 Stabilitas pemanasan pada 95 C (cP) o Viskositas setelah holding pada 50 C (cP) 2087 Viskositas setback (cP) 806 Berdasarkan kurva RVA pada Gambar 26, maka pati garut memiliki profil gelatinisasi pati tipe A berdasarkan pengelompokkan oleh Schoch dan Maywald (1968). Profil gelatinisasi pati tipe A ini ditandai dengan nilai viskositas puncak yang cukup tinggi dan viskositas breakdown yang cukup tajam. Dengan demikian, profil gelatinisasi pati garut satu kelompok dengan pati tapioka, kentang, ubi jalar, sagu, waxy corn dan waxy barley (Collado et al. 2001; Wattanachant et al. 2002; Singh et al. 2005a; Herawati 2009).
76
4.2. Penentuan Kondisi Proses Modifikasi Pati Garut Penelitian tahap II ini mencakup penentuan kondisi terbaik dalam proses modifikasi pati garut yang terdiri atas proses siklus autoclaving-cooling, hidrolisis asam dan debranching. Penentuan kondisi terbaik dari masing-masing perlakuan didasarkan pada parameter uji yang dapat meningkatkan pembentukan pati resisten (RS3) yang optimal. 4.2.1. Penentuan Kondisi Siklus Autoclaving-cooling Proses autoclaving-cooling dalam proses modifikasi pati garut untuk meningkatkan kadar pati resisten (RS3) dilakukan dengan cara memanaskan pasta pati garut pada suhu tinggi di dalam otoklaf bersuhu 121oC (tahap autoclaving), kemudian dilanjutkan dengan penyimpanan dingin pada suhu 4oC (tahap cooling). Proses autoclaving-cooling tersebut diulang beberapa kali untuk meningkatkan jumlah pati yang teretrogradasi. Sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya, semakin banyak jumlah pati yang mengalami retrogradasi, maka semakin meningkat kandungan pati resisten (RS3) yang dihasilkan (Shin et al. 2004; Zabar et al. 2008). Tahap proses pemanasan di dalam otoklaf bertujuan menggelatinisasi pati dan mempercepat keluarnya molekul amilosa dari granula pati. Hal ini disebabkan fraksi amilosa lebih mudah dan cepat mengalami retrogradasi dibandingkan amilopektin (Shin et al. 2007). Tahap proses pendinginan (cooling) bertujuan untuk mempercepat retrogradasi pati. Selama proses pendinginan terjadi retrogradasi pati, yaitu molekul amilosa dengan amilosa dan amilosa dengan amilopektin berikatan kembali satu sama lain melalui ikatan hidrogen yang menyebabkan struktur pati menjadi lebih kompak dan lebih sulit mengalami hidrolisis oleh enzim amilase. Kondisi proses autoclaving-cooling dilaporkan berbeda-beda oleh peneliti, yaitu jumlah siklus autoclaving-cooling, dan waktu proses pemanasan selama autoclaving. Oleh karena itu diperlukan penelitian untuk menentukan kondisi proses autoclaving-cooling yang dapat memberikan kandungan pati teretrogradasi yang tertinggi. Beberapa parameter analisis, yaitu daya cerna pati in vitro, kadar
77
amilosa, kadar gula pereduksi dan kadar pati resisten, digunakan sebagai parameter untuk memilih kondisi terbaik. 4.2.1.1. Penentuan Suhu Pemanasan Awal Suspensi pati bersifat tidak larut dalam air sebelum dilakukan proses gelatinisasi, sehingga granula pati berangsur-angsur mengendap bila didiamkan. Pengendapan granula pati ini terjadi pada saat suspensi pati garut dilakukan proses autoclaving. Karena granula pati terkumpul dan mengendap di bagian bawah suspensi, maka pasta pati yang dihasilkan tidak seragam dan terjadi pemisahan bagian pasta pati dan air (Gambar 27). Pasta pati yang dihasilkan menjadi sulit untuk ditangani saat pengeringan, sehingga tidak dapat diperoleh pati hasil modifikasi (tidak dianalisis lebih lanjut). Seperti telah dijelaskan sebelumnya, pati garut mengalami gelatinisasi pada suhu 76,3oC (Tabel 7). Pati garut yang tergelatinisasi ini bersifat larut dalam air dan tidak mengalami pengendapan. Dalam penelitian tahap II ini, pati dilakukan pemanasan awal di atas suhu gelatinisasinya (80oC dan 90oC) selama 5 menit, kemudian dilakukan proses siklus autoclaving-cooling pada suhu 121oC selama 15 menit. Pasta pati yang dihasilkan dengan cara tersebut lebih seragam dan tidak mengalami pengendapan (Gambar 28). Pasta pati yang dihasilkan selanjutnya dikeringkan dan dianalisis nilai kadar amilosa, daya cerna pati in vitro, gula pereduksi dan pati resistennya. (a) Kadar amilosa Gambar 29 memperlihatkan kadar amilosa pati garut alami sebesar 24,64%. Proses pemanasan awal pada suhu 80oC dan 90oC meningkatkan secara nyata kadar amilosa, yaitu secara berturut-turut sebesar 30,37% dan 30,54%. Namun, hasil uji beda nyata menujukkan bahwa kadar amilosa antara pati yang diberi pemanasan awal pada 80oC dan 90oC tidak berbeda nyata (p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan kadar amilosa pada pati garut yang diberi perlakuan pemanasan awal dibandingkan dengan pati garut alaminya lebih disebabkan oleh perlakuan autoclaving-cooling. Di samping berasal dari amilosa yang ada, peningkatan kadar amilosa disebabkan oleh adanya pembentukan molekul amilosa baru yang lebih pendek dari hasil depolimerisasi amilosa dan amilopektin
78
Gambar 27. Pati garut yang diotoklaf tanpa proses pemanasan awal (pasta pati tidak seragam dan mengendap)
Gambar 28. Pati garut yang diotoklaf dengan proses pemanasan awal (pasta pati seragam dan tidak terbentuk endapan)
akibat pemanasan suhu tinggi. Hal ini dibuktikan dari hasil analisis dengan Gel Permeation Chromatography (GPC) yang dibahas lebih lengkap pada sub-bab 4.3.4.1. Peningkatan kadar amilosa sebagai akibat perlakuan pemanasan awal dan siklus autoclaving-cooling ini diharapkan, karena peningkatan kadar amilosa dapat meningkatkan peluang pembentukan ikatan hidrogen yang lebih mudah pada saat pendinginan, sehingga lebih banyak pati yang dapat teretrogradasi. Hasil penelitian ini bersesuaian dengan yang dilaporkan oleh Mujoo dan Ali (1999), Leong et al. (2007), Mutungi et al. (2009) dan Otzurk et al. (2009).
79
35 30,37a
30,54a
80
90
Amilosa (%)
30 25
24,64b
20 15 10 5 0 Pati alami
Perlakuan Pemanasan Awal (oC)
Gambar 29. Perubahan kadar amilosa pati garut sebagai akibat pengaruh suhu pemanasan awal sebelum proses siklus autoclavingcooling. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) (b) Daya cerna pati in vitro Gambar 30 menunjukkan pengaruh suhu pemanasan awal terhadap daya cerna pati garut. Pati garut alami yang tidak mengalami perlakuan apapun, baik pemanasan awal maupun proses autoclaving-cooling, memiliki nilai daya cerna sebesar 84,35%. Perlakuan pemanasan awal menyebabkan penurunan daya cerna pati secara tajam dibandingkan pati garut alaminya, yaitu menjadi 46,07% pada suhu 80oC dan 44,65% pada suhu 90oC. Hasil uji beda nyata menunjukkan tidak ada perbedaan (p>0,05) nilai daya cerna pati garut antara yang diberi pemanasan awal pada suhu 80oC dan 90oC. Penurunan daya cerna pati garut setelah proses pemanasan awal dan dilanjutkan dengan siklus autoclaving-cooling berkaitan dengan peningkatan jumlah amilosa yang terbentuk sebagai akibat proses autoclaving-cooling sebagaimana telah dijelaskan di atas. Dengan meningkatnya jumlah amilosa yang terbentuk dari hasil depolimerisasi amilosa dan amilopektin, maka peluang terbentuknya pati yang teretrogradasi lebih besar dan berakibat pada penurunan daya cerna pati garut.
80
100
Daya Cerna Pati (%)
84,35a 80
60 46,07b
44,65b
80
90
40
20
0 Pati Alami
Pemanasan Awal (oC)
Gambar 30. Daya cerna pati garut sebagai akibat pengaruh suhu pemanasan awal sebelum proses siklus autoclaving-cooling. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) (c) Kadar gula pereduksi Pati garut alami memiliki kadar gula pereduksi yang relatif rendah, yaitu 4,96% (Gambar 31). Perlakuan pemanasan awal yang dilanjutkan dengan siklus autoclaving-cooling dapat meningkatkan kadar gula pereduksi pati garut menjadi 6,08% pada suhu 80oC dan 7,01% pada suhu 90oC. Hasil uji beda nyata menunjukkan perubahan kadar gula pereduksi pada suhu pemanasan 80oC dan 90oC berbeda nyata (p<0,05), walaupun peningkatannya tidak terlalu besar. Peningkatan gula pereduksi dari pati garut dari proses tersebut lebih dipengaruhi oleh proses siklus autoclaving-cooling. Peningkatan gula pereduksi ini berkaitan dengan peningkatan kadar amilosa rantai pendek yang terukur sebagai gula pereduksi. Peningkatan jumlah amilosa rantai pendek tersebut meningkatkan jumlah ujung reduksi (reducing end) yang terukur sebagai gula pereduksi.
81
8
Gula Pereduksi (%)
7,01a 6,08b 6 4,96c 4
2
0 Pati Alami
80
90
Pemanasan Awal (oC)
Gambar 31. Perubahan kadar gula pereduksi pati garut sebagai akibat pengaruh suhu pemanasan awal sebelum proses siklus autoclaving-cooling. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) (d) Kadar pati resisten Gambar 32 memperlihatkan kadar pati resisten dari pati garut alami dibandingkan dengan pati garut yang telah diberi perlakuan pemanasan awal. Di samping itu, ditambahkan kadar pati resisten komersial (Novelose 330). Pati resisten pati garut meningkat tajam dari 2,12% menjadi 11,71% (untuk pemanasan awal 80oC) dan 12,44% (untuk pemanasan awal 90oC). Hasil uji beda nyata menunjukkan perbedaan yang nyata (p<0,05) antara perlakuan pemanasan awal 80oC dan 90oC, namun peningkatannya tidak terlalu besar. Hal ini pun menunjukkan bahwa perubahan kadar pati resisten lebih banyak dipengaruhi oleh perlakuan siklus autoclaving-cooling. Hasil ini bersesuaian dengan peningkatan kadar amilosa dan kadar gula pereduksi serta penurunan daya cerna pati sebagaimana telah dijelaskan di atas. Kadar pati resisten yang diperoleh dari perlakuan pemanasan awal dan autoclaving-cooling masih jauh lebih rendah dibandingkan pati resisten komersial (Novelose 330), yaitu sebesar 42,68%. Novelose 330 merupakan pati jagung kaya amilosa yang terhidrolisis (retrograded hydrolysed high amylose corn starches). Proses hidrolisis pati jagung kaya amilosa akan menghasilkan fraksi berbobot molekul rendah dengan panjang rantai α-1,4-D-glukan
82
antara 10-40 unit anhidroglukosa sehingga pada saat retrogradasi akan dihasilkan peningkatan RS3 yang cukup tinggi (Jacobash et al. 2006) 42,68a
45 40
Pati Resisten (%)
35 30 25 20 15
11,71c
12,44b
80
90
10 5
2,12d
0 Pati alami
Nevolose
Pemanasan Awal (oC)
Gambar 32. Perubahan kadar pati resisten pati garut sebagai akibat pengaruh suhu pemanasan awal sebelum proses siklus autoclavingcooling. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) Berdasarkan hasil analisis kadar amilosa, daya cerna pati in vitro, kadar gula pereduksi dan kadar pati resisten sebagaimana dijelaskan di atas, maka pemanasan awal suspensi pati garut pada suhu 80oC selama 5 menit sebelum proses autoclaving-cooling sudah memadai untuk menggelatinisasi pati dan menghasilkan pasta pati yang homogen, sehingga perlakuan tersebut dipilih pada tahap penelitian selanjutnya. 4.2.1.2. Penentuan Waktu Autoclaving dan Jumlah Siklus Autoclavingcooling Pada tahap penelitian ini, pati garut diberi perlakuan autoclaving-cooling dengan siklus yang berbeda (1, 3 dan 5 siklus) dan waktu pemanasan di dalam otoklaf selama 15 dan 30 menit. Parameter yang digunakan untuk menentukan kondisi terpilih adalah daya cerna pati in vitro dan kadar pati resisten.
83
(a) Daya cerna pati in vitro Gambar 33 memperlihatkan pengaruh jumlah siklus autoclaving-cooling dan waktu autoclaving terhadap daya cerna pati garut. Daya cerna pati garut yang diproses dengan 1 siklus autoclaving-cooling lebih tinggi dibandingkan dengan 3 dan 5 siklus, baik yang dipanaskan dalam otoklaf selama 15 menit maupun 30 menit. Pati garut yang diproses dengan 5 siklus autoclaving-cooling memiliki daya cerna pati paling rendah yang mengindikasikan kandungan pati resisten yang paling tinggi. Siklus autoclaving-cooling yang lebih banyak dapat menyebabkan terjadinya depolimerisasi amilosa atau amilopektin rantai terluar di bagian kristalin (Mahadevamma et al. 2003 dan Shin et al. 2004). 100 84,35a
Daya Cerna (%)
80
80,02b 70,81c 62,08d
60
48,44e
1 siklus 40
33,01f
28,35g
3 siklus 5 siklus
20 0 Pati Alami
15"
30"
Perlakuan Siklus Autoclaving
Gambar 33. Daya cerna pati garut sebagai akibat pengaruh waktu autoclaving danjumlah siklus autoclaving-cooling. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) Gambar 33 juga memperlihatkan bahwa proses autoclaving-cooling dengan waktu pemanasan selama 30 menit memberikan nilai daya cerna pati lebih besar dibandingkan yang diberi perlakuan pemanasan selama 15 menit. Proses autoclaving yang semakin lama menyebabkan semakin banyak molekul amilosa dan amilopektin yang terhidrolisis menjadi molekul-molekul sakarida yang lebih kecil. Sebagai akibatnya, pati menjadi lebih mudah dicerna yang diindikasikan dari peningkatan nilai daya cernanya. Sebagaimana dijelaskan oleh Lehmann et
84
al. (2003), molekul kecil dengan derajat polimerisasi (DP) kurang dari 10 dapat menghambat proses pembentukan pati resisten sehingga pati lebih mudah dicerna. Berdasarkan analisis sidik ragam, daya cerna pati garut yang diberi perlakuan 5 siklus autoclaving-cooling dengan waktu pemanasan selama 30 menit berbeda nyata (p<0,05) dengan yang dipanaskan selama 15 menit dengan jumlah siklus yang sama. Namun, daya cerna pati yang dipanaskan selama 30 menit lebih tinggi dibandingkan dengan yang dipanaskan selama 15 menit (Gambar 33). Dalam tahap analisis pati resisten, kondisi yang dipilih adalah proses autoclaving-cooling dengan 5 siklus dengan waktu pemanasan selama 15 menit. Perlakuan dengan 3 siklus autoclaving-cooling dengan waktu pemanasan 15 menit juga dipilih. Hal ini karena jumlah siklus yang lebih sedikit dan waktu pemanasan lebih singkat juga perlu dipertimbangkan untuk efisiensi proses pem-buatan RS3. Pati garut yang diproses dengan kondisi terpilih tersebut kemudian dianalisis kadar pati resistennya. (b) Kadar pati resisten Gambar 34 membandingkan kadar pati resisten pati garut alami dan yang dimodifikasi dengan autoclaving-cooling sebanyak 3 dan 5 siklus dengan waktu pemanasan 15 menit. Sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya, pati garut alami memiliki kadar pati resisten (RS2) yang relatif rendah, yaitu sebesar 2,12%. Pati garut yang diberi perlakuan 3 dan 5 siklus autoclaving-cooling dengan waktu pemanasan selama 15 menit mengalami peningkatan kadar pati resisten yang cukup tinggi, yaitu berturut-turut 10,12% dan 12,15%. Kadar pati resisten dari perlakuan tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan pati kentang (5,6%) dan pati ubi jalar yang diberi perlakuan autoclaving-cooling sebanyak 5 siklus dengan waktu pemanasan 60 menit (5,4%) (Shin et al. 2004). Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Kim dan Kwak (2009) pada pati jagung. Pati jagung yang diberi perlakuan dengan autoclaving-cooling sebanyak 2 siklus pada suhu otoklaf 120oC memiliki kadar RS3 sebesar 10,85%, dan meningkat kadarnya menjadi 12,44% dengan menerapkan 4 siklus. Demikian pula, peningkatan suhu pemanasan dari 100oC hingga 120oC secara nyata (p<0,05) meningkatkan kadar RS3 pati jagung dari 9,56% menjadi 10,85%. Namun, peningkatan suhu otoklaf lebih dari 121oC 85
menyebabkan penurunan pembentukan RS3. Hasil penelitian Kim dan Kwak (2009) tersebut mempertegas penjelasan di atas bahwa pembentukan RS3 sangat dipengaruhi oleh suhu pemanasan dan siklus autoclaving-cooling. 14 12,15b
Pati Resisten (%)
12
10,91b
10 8 6 4 2,12a 2 0 Pati Alami
S3, 15'
S5, 15'
Siklus dan Waktu Autoclaving
Gambar 34. Kadar pati resisten pati garut sebagai akibat pengaruh jumlah siklus autoclaving-cooling dengan waktu pemanasan 15 menit. S3= 3 siklus autoclaving; S5= 5 siklus autoclaving. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) Berdasarkan Gambar 34, perlakuan autoclaving-cooling pati garut dengan 3 siklus juga dapat meningkatkan kadar RS3 hingga lebih dari lima kali lipat sedangkan yang diproses dengan 5 siklus hampir enam kali lipat. Namun demikian, hasil uji beda nyata menunjukkan tidak ada perbedaan kadar RS3 yang nyata (p>0,05) antara pati garut yang diberi perlakuan 3 siklus dan 5 siklus. Dengan pertimbangan efisiensi proses pembuatan RS3, maka perlakuan autoclavingcooling 3 siklus dengan waktu pemanasan selama 15 menit dipilih pada tahap penelitian selanjutnya (tahap penentuan kondisi hidrolisis asam dan debranching). 4.2.2. Penentuan Kondisi Hidrolisis Asam Sebagaimana telah diulas dalam tinjauan pustaka, perlakuan hidrolisis pati dengan HCl (lintnerization) dimaksudkan untuk meningkatkan jumlah fraksi amilosa rantai pendek dengan bobot molekul rendah yang merupakan hasil degradasi fraksi amilosa rantai panjang dan amilopektin. Apabila jumlah fraksi amilosa 86
rantai pendek meningkat, maka semakin banyak fraksi amilosa yang teretrogradasi atau terkristalisasi, sehingga proses pembentukan RS3 semakin tinggi dan diharapkan dapat berdampak pada penurunan daya cerna pati. Fraksi amilosa sebagai struktur linear akan memfasilitasi ikatan silang dengan adanya ikatan hidrogen sehingga struktur amilosa membentuk kristalit yang kompak (Shin et al. 2004; Lehmann et al.2003; Aparicio-Saguilán et al.2005; Zhao dan Lin 2009). Pada tahap penelitian ini, pati garut diberi perlakuan hidrolisis asam dengan menggunakan larutan HCl 1,1 N dan 2,2 N dan waktu hidrolisis selama 2, 4 dan, 6 jam pada suhu 35oC. Suspensi pati yang digunakan dalam tahap ini adalah sebesar 20% b/b, sedangkan proses autoclaving-cooling yang dipilih adalah dengan menerapkan 3 siklus dan waktu pemanasan (autoclaving) selama 15 menit. Proses hidrolisis asam pada granula pati berlangsung dalam dua tahap. Pada tahap pertama, rantai amilosa dan titik percabangan (ikatan glikosidik α-1,6) pada amilopektin pada daerah amorf mengalami degradasi oleh asam. Hasil hidrolisis ini menghasilkan fraksi amilosa rantai pendek dan residu kristalit (klaster amilopektin yang sudah terhidrolisis bagian rantai panjangnya atau rantai C). Pada tahap kedua, residu kristalit yang berada daerah kristalin mengalami hidrolisis dengan laju yang lebih lambat. Hal ini disebabkan oleh struktur kristalit yang lebih kompak sehingga penetrasi asam dalam bentuk H3O+ lebih sulit (Jayakody dan Hoover 2002; Aparicio-Saguilan et al. 2005; Mun dan Shin 2006). (a) Daya cerna pati in vitro Gambar 35 memperlihatkan pengaruh konsentrasi HCl dan waktu hidrolisis terhadap daya cerna pati. Daya cerna pati garut yang diproses dengan kombinasi hidrolisis asam dengan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus pada konsentrasi HCl 1,1N dan waktu hidrolisis selama 2, 4 dan, 6 jam secara berturut-turut adalah 32,13%, 48,37% dan 55,9%. Nilai daya cerna pati tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan pati garut yang dihidrolisis dengan larutan HCl 2,2N pada waktu hidrolisis yang sama, yaitu sebesar 22,04%, 25,41% dan 31,40%. Seluruh pati garut hasil perlakuan tersebut memiliki daya cerna pati yang lebih rendah dibandingkan dengan pati garut alaminya (84,35%). Daya cerna pati semakin rendah dengan meningkatnya konsentrasi HCl pada waktu hidrolisis yang sama. Peningkatan konsentrasi asam berakibat pada 87
peninngkatan hiddrolisis frakksi amilosa rantai panj njang dan menghasilka m an molekul lineaar glukan deengan bobott molekul yang lebih reendah, sehinngga pati leebih mudah menggalami retrrogradasi yang y dapat memicu peningkatan p kadar RS33. Dengan demiikian, pati yang y sudah dihidrolisiss asam dan dikombinaasikan denggan modifikasi autoclavingg-cooling semakin sulit untuk diccerna serta berakibat ppada penurunann daya cernnanya.
Gam mbar 35. Daaya cerna paati garut seebagai akibaat pengaruhh konsentrassi HCl dan waaktu inkubasi selama hidrolisis h asam. Angka pada histogram yang dissertai huruf yang berbeeda menyataakan berbedda nyata (α= =0,05) Pati garutt yang dihiddrolisis selaama 2 jam pada konseentrasi HCll 1,1N dan 2,2N N memiliki daya cernaa lebih renndah dibandingkan yaang dihidroolisis asam selam ma 4 dan 6 jam j (Gamb bar 35). Prooses hidrolisis pati garuut selama 2 jam dapat mengghasilkan frraksi amilossa rantai peendek yang berasal darri hasil degrradasi amilosa rantai panjaang. Fraksi amilosa ranntai pendek hasil hidrolisis pati gaarut selama 2 jam m kemungkinan adalahh fraksi yang cukup op ptimum untuuk pemben--tukan RS3 sebaggai akibat kombinasi perlakuan hidrolisis asam dan siklus autto-clavingcooliing. Semakkin lama prooses hidroliisis pati gaarut dengan HCl selam ma 4 dan 6 jam, maka semaakin banyakk amilosa raantai panjan ng yang terhhidrolisis m mem-bentuk hidroolisat-hidrollisat dengann bobot mollekul yang terlalu t rendah (DP<10)), sehingga tidakk optimal untuk u pembbentukan RS3 R dan mengakibatk m kan peningkkatan daya cernaa patinya.
88
Menurut Schmiedl et al. (2000) derajat polimerisasi yang baik untuk terjadinya retrogradasi pati adalah dengan derajat polimerisasi (DP) antara 10-35 pada konsentrasi gel pati yang tinggi. Dijelaskan pula bahwa panjang rantai α-1,4-Dglukan dengan DP ∼20 dapat membentuk RS3 yang optimum. Penghilangan hidrolisat dengan DP<10 dapat dilakukan dengan pencucian menggunakan etanol 80%, kemudian dikeringkan dan dimodifikasi dengan autoclaving-cooling sehingga diharapkan proses pembentukan RS3 semakin optimal (Mutungi et al. 2009). Penelitian lain menunjukkan hasil yang berbeda terhadap kondisi optimum untuk terjadinya retrogradasi pati, yaitu DP 20-25 pada pati gandum (Slijestrom et al. 1989), DP 19-26 pada pati kentang (Eerlingen et al. 1993), dan DP 16-26 pada pati garut (Srichuwong et al. 2005a). Namun, Bjorck et al. (1987) melaporkan bahwa retrogradasi pati umumnya terjadi pada DP 20-30. Berdasarkan hasil di atas dan dengan mempertimbangkan efisiensi proses, maka kondisi hidrolisis asam yang dipilih adalah hidrolisis asam dengan menggunakan larutan HCl 2,2N selama 2 jam. Untuk tahap penelitian selanjutnya, kombinasi perlakuan hidrolisis asam tersebut yang dipilih. (b) Kadar Amilosa Gambar 36 menunjukkan bahwa kadar amilosa pati garut hasil hidrolisis asam pada konsentrasi HCl 2,2N selama 2 jam lebih tinggi (30,13%) dibandingkan kadar amilosa pati garut alami (24,64%) dan yang hanya diberi perlakuan siklus autoclaving-cooling (28,12%). Kadar amilosa tertinggi dicapai pada pati garut dihidrolisis dengan HCl 2,2N selama 2 jam yang dilanjutkan dengan proses autoclaving-cooling selama 3 siklus, yaitu 31,55%. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan kadar amilosa bukan hanya disebabkan oleh perlakuan hidrolisis asam tetapi juga dari akibat proses autoclaving-cooling. Peningkatan kadar amilosa ini bersesuaian dengan perubahan distribusi profil amilosa dan amilopektin dengan menggunakan GPC yang dibahas selengkapnya pada sub-bab 4.3.4.1.
89
35 30,13b 30
Amilosa (%)
25
31,55a 28,12c
24,64d
20 15 10 5 0 Pati alami
H2
AC
H2AC
Perlakuan Modifikasi
Gambar 36. Kadar amilosa sebagai akibat pengaruh konsentrasi HCl dan waktu inkubasi selama hidrolisis asam. H2=Hidrolisis asam dengan HCl 2,2N selama 2 jam; AC= 3 siklus autoclavingcooling; H2AC=Kombinasi hidrolisis asam (HCl 2,2N selama 2 jam) dan siklus autoclaving-cooling. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) 4.2.3. Penentuan Kondisi Debranching 4.2.3.1. Aktivitas Enzim Pullulanase Pengujian aktivitas enzim pullulanase penting untuk dilakukan karena enzim pullulanase ini merupakan enzim murni dari Promozyme yang dalam katalognya hanya mencantumkan aktifitasnya >400 U/ml. Pengujian aktivitas enzim pullulanase dilakukan untuk mengetahui nilai aktivitasnya yang biasanya dinyatakan dalam satuan U/ml atau U/g. Satu pullulanase unit (U/ml atau PUN) didefinisikan sebagai sejumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1 μmol gula pereduksi setiap menit. Selama proses penyimpanan dan transportasi sebelum digunakan, enzim pullulanase kemungkinan mengalami penurunan aktivitasnya. Oleh karena itu, tahap ini juga menjadi penting untuk dilakukan untuk mengetahui nilai aktivitas enzim pullalanase yang sesungguhnya pada saat digunakan dalam proses debranching pati garut.
90
Hasil pengujian menunjukkan bahwa enzim pullulanase memiliki aktivitas sebesar 416,04 U/ml. Hasil pengujian ini hampir sama dengan yang dilaporkan oleh Gonzales-Soto et al. (2004), yaitu 423 U/ml. Pati garut dihidrolisis oleh enzim pullulanase yang dapat memutuskan ikatan pada titik percabangan α-1,6. Semakin banyak titik percabangan α-1,6 terhidrolisis, maka semakin banyak gula pereduksi yang terbentuk. 4.2.3.2. Penentuan Konsentrasi dan Waktu Inkubasi Enzim Pullulanase Beberapa penelitian melaporkan penggunaan enzim pullulanase pada konsentrasi dan waktu inkubasi yang berbeda-beda untuk menghasilkan kadar RS3 yang optimum, yaitu 12 U/g pati selama 16 jam pada pati beras (Pongjanta et al. 2009b), 10,6 U/g pati selama 5 jam pada pati pisang (Gonzalez-Soto et.al. 2004), dan 25 U/g pati selama 24 jam pada pati singkong (Mutungi et al. 2009). Oleh karena penggunaan konsentrasi enzim dan waktu inkubasi yang beragam dan spesifik untuk jenis pati tertentu, maka penentuan konsentrasi dan waktu inkubasi untuk debranching pati garut perlu ditentukan. Tahap penelitian ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi dan waktu inkubasi enzim pullulanase pada saat menghidrolisis titik percabangan α-1,6 pada amilopektin (debranching) pati garut. Parameter yang digunakan untuk mengetahui kemampuan menghidrolisis titik percabangan amilopektin ini adalah konsentrasi gula pereduksi, yaitu semakin tinggi konsentrasi gula pereduksi maka semakin banyak titik percabangan pada ikatan glikosidik α-1,6 pada amilopektin yang terhidrolisis. Pada tahap ini, kondisi perlakuan yang diberikan sama seperti untuk modifikasi pati garut dengan autoclaving-cooling. Enzim pullulanase ditambahkan pada suhu 50oC setelah 1 siklus dengan konsentrasi 1,3; 5,2; dan 10,4 U/g pati dengan waktu inkubasi yang berbeda yaitu 0, 16, 24 dan 40 jam. Gambar 37 menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi enzim pullulanase, maka derajat hidrolisis pati garut semakin meningkat. Derajat hidrolisis mengalami peningkatan pada semua konsentrasi enzim hingga waktu inkubasi 24 jam. Waktu inkubasi pada 40 jam menyebabkan penurunan derajat hidrolisis, terutama pada penggunaan enzim konsentrasi rendah (1,3 dan 5,2 U/g pati). Penu-
91
runan ini disebabkan oleh waktu inkubasi yang terlalu lama yang memungkinkan terjadinya pertumbuhan mikroba. Pertumbuhan mikroba menyebabkan penurunan gula pereduksi, karena gula yang terbentuk digunakan oleh mikroba untuk pertumbuhannya. Sebagai akibatnya, gula pereduksi yang terukur menjadi lebih rendah. Pertumbuhan mikroba terjadi karena kondisi substrat mendukung (pH 5,2 dan suhu 50oC) dan pada penelitian ini tidak ditambahkan natrium azida sebagai antimikroba.
Derajat Hidrolisis (%)
100 1,3 U/g 5,2 U/g 10,4 U/g
80 60 40 20 0
0
8
16
24
32
40
48
Waktu Hidrolisis (jam)
Gambar 37. Pengaruh konsentrasi enzim pullulanase dan waktu inkubasi terhadap derajat hidrolisis Berdasarkan hasil di atas, maka waktu inkubasi selama 24 jam merupakan waktu yang dipilih untuk proses debranching. Untuk tahap penelitian selanjutnya perlakuan yang dipilih adalah konsentrasi enzim 10,4 U/g pati dengan waktu inkubasi selama 24 jam. Dalam penelitian tahap III, penggunaan enzim pullulanase dengan konsentrasi rendah (1,3 U/g pati) juga dilakukan, sebab harga enzim pullulanase yang cukup mahal. Hal ini ditujukan untuk mengetahui kemungkinan penggunaan konsentrasi enzim yang rendah yang dikombinasikan dengan hidrolisis asam untuk dapat menghasilkan jumlah amilosa rantai pendek yang optimum. 4.3. Pengaruh Perlakuan Modifikasi terhadap Karakteristik Pati Garut Tahap III penelitian ini bertujuan menentukan perlakuan terbaik dari proses modifikasi pati yang dapat meningkatkan kadar RS3 dan mengetahui perubahan 92
kristalinitasnya. Kondisi proses modifikasi yang dipilih berdasarkan hasil penelitian tahap II, yaitu (1) proses 3 siklus autoclaving-cooling pada suhu 121oC selama 15 menit dan pendinginan pada suhu 4oC selama 24 jam; (2) hidrolisis asam dengan larutan HCl 2,2 N selama 2 jam pada suhu 35oC; dan (3) debranching dengan enzim pullulanase (1,3 U/g pati dan 10,4 U/g pati) dengan waktu inkubasi 24 jam pada suhu 50oC. Dalam penelitian tahap III ini terdapat enam perlakuan modifikasi pati garut, yaitu hidrolisis asam tanpa dan dengan autoclaving-cooling (H2 dan H2AC), debranching (1,3 U/g pati dan 10,4 U/g pati) dengan autoclaving-cooling (D1AC dan D10AC), dan hidrolisis asam, debranching dan autoclaving-cooling (H2D1AC dan H2D10AC). Pati garut alami juga dianalisis sebagai kontrol. 4.3.1. Perubahan Komposisi Karbohidrat 4.3.1.1. Kadar Gula Pereduksi Kadar gula pereduksi merupakan salah satu parameter yang dapat digunakan untuk mengetahui hidrolisis pati. Hidrolisis pati terkait erat dengan pemutusan pati menjadi rantai glukan dengan ujung pereduksi (reducing end). Jumlah rantai glukan dari hasil hidrolisis pati yang semakin banyak menunjukkan kadar gula pereduksi yang semakin tinggi. Pati garut alami mengandung kadar gula pereduksi sebesar 4,96% (Gambar 38). Semua perlakuan modifikasi pati garut menyebabkan peningkatan kadar gula pereduksi. Pati garut yang mengalami modifikasi dengan hidrolisis asam dan proses autoclaving-cooling (H2AC) memiliki kadar gula pereduksi lebih tinggi (8,72%) dibandingkan dengan yang hanya mengalami proses autoclaving-cooling saja (AC) (6,08%). Pati garut yang diberi perlakuan debranching pada konsentrasi 10,4 U/g pati dan siklus autoclaving-cooling (D10AC) mengandung kadar gula pereduksi lebih tinggi (9,62%) dibandingkan dengan yang diberi perlakuan debranching pada konsentrasi 1,3 U/g pati dan siklus autoclaving-cooling (D1AC) (7,38%). Bila dikombinasikan antara hidrolisis asam, debranching, dan autoclaving-cooling, kadar gula pereduksi lebih meningkat lagi, yaitu 9,36% untuk H2D1AC) dan 10,22% untuk H2D10AC. Hal ini menunjukkan semakin tinggi konsentrasi enzim pullulanase yang digunakan, maka jumlah rantai glukan
93
hasil hidrolisis pati yang memiliki ujung reduksi semakin banyak terbentuk dan menyebabkan kadar gula pereduksi yang terukur semakin meningkat. 12
Gula Pereduksi (%)
10
10,22f
9,62e
9,36e
D10AC
H2D1AC
8,72d 7,38d
8 6,08b 6
4,96a
4 2 0 Pati garut alami
AC
H2AC
D1AC
H2D10AC
Perlakuan Modifikasi
Gambar 38. Pengaruh perlakuan modifikasi terhadap kadar gula pereduksi pati garut. AC=autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) 4.3.1.2. Kadar Pati Resisten Pati garut alami memiliki kadar pati resisten yang cukup rendah, yaitu 2,12%. Kadar pati resisten pati garut meningkat pada semua perlakuan modifikasi. Pati garut yang mengalami proses autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus (AC) memiliki kadar pati resisten sebesar 13,80%, yaitu meningkat sekitar 6,5 kali lipat dibandingkan dengan pati garut alami. Proses autoclaving dapat menghidrolisis amilosa atau amilopektin rantai terluar di daerah kistralin (Mahadevamma et al. 2003 dan Shin et al. 2004). Siklus autoclaving yang semakin banyak menyebabkan semakin banyak amilosa dan amilopektin yang terhidrolisis membentuk fraksi amilosa rantai pendek. Jumlah fraksi amilosa rantai pendek yang semakin banyak memberikan peluang terjadinya retrogradasi atau rekristalisasi selama siklus pendinginan (Gambar 17). Fraksi amilosa berikatan dengan fraksi amilosa lainnya melalui ikatan hidrogen membentuk struktur double helix. Struktur double helix berikatan 94
dengan struktur double helix lainnya membentuk kristalit sehingga terbentuk fraksi amilosa rekristalisasi tersebut (Haralampu 2000). Kombinasi perlakuan hidrolisis asam dengan menggunakan HCl 2,2 N selama 2 jam dan proses autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus (H2AC) memiliki kadar RS3 sebesar 19,85% lebih tinggi dibandingkan dengan pati garut alami (2,12%) dan proses autoclaving-cooling (AC) (13,80%) (Gambar 39). Peningkatan kadar RS3 tersebut 9,4 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan pati garut alami. Proses hidrolisis asam menyebabkan terjadinya hidrolisis pati garut pada daerah amorf yang banyak mengandung amilosa dan titik-titik percabangan α,1-6 pada amilopektin sehingga dihasilkan fraksi amilosa rantai pendek. Sebagai akibatnya, proses pembentukan RS3 lebih optimal dibandingkan dengan yang diberi perlakuan proses autoclaving-cooling saja (AC). Amilosa rantai pendek ini terukur sebagai gula pereduksi sehingga kadar gula pereduksi meningkat (Gambar 38). Hasil analisis korelasi (Lampiran 4) menunjukkan bahwa kadar pati resisten berkorelasi positif dengan kadar gula pereduksi (r=0,918; α=0,01). Sebagai perbandingan, pati pisang yang mengalami hidrolisis asam dengan menggunakan HCl 1M selama 6 jam dan proses autoclaving-cooling 3 siklus meningkatkan kadar RS3 dari 1,51% menjadi 19,34% (Aparicio-Saguilan et al. 2005). Pati jagung yang mengalami hidrolisis dengan asam sitrat 0,1M selama 24 jam dan proses 3 siklus autoclaving-cooling (121oC selama 20 menit dan 4oC selama 24 jam) menghasilkan RS3 sebesar 8,6-11,00% (Zhao dan Ling 2009). Pati garut yang mengalami proses debranching dan proses autoclavingcooling 3 siklus memiliki kadar RS3 sebesar 28,83% dan 35,53% untuk masingmasing konsentrasi enzim pulullanase 1,3 U/g pati (D1AC) dan 10,4 U/g pati (D10AC). Proses debranching dapat memotong titik-titik percabangan α,1-6 amilopektin sehingga dihasilkan rantai glukan dengan DP yang dapat dikelompokkan menjadi 4, yaitu DP 6-8, 9-12, 13-24 dan 24-30 (penjelasan lebih lanjut mengenai pengelompokkan DP pada amilopektin dapat dilihat di sub-bab 4.3.4.2). Rantai glukan pada pati garut (kristalin tipe A) lebih banyak sekitar 10-23 per klaster dibandingkan dengan pati dengan kristalin tipe B sekitar 6-7 per klaster (Takeda dan Hanashiro 2003). Kondisi ini mendukung untuk pembentukan rantai glukan yang lebih banyak apabila pati garut dihidrolisis oleh enzim pullulanase. Semakin
95
42,68a
45
Pati Resisten (%)
40
35,53d
36,8c
39,3b
35 30
28,83e
25
19,85f
20 13,8g
15 10 5
2,12h
0 Pati garut alami
AC
H2AC
D1AC
D10AC
H2D1AC H2D10AC Novelose
Perlakuan Modifikasi
Gambar 39. Pengaruh perlakuan modifikasi terhadap kadar pati resisten pati garut. AC=autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) banyak rantai glukan dengan DP sekitar 10-35, maka semakin besar peluang pembentukan RS3. Pati garut yang dihidrolisis dengan enzim pullulanase 1,3 U/g pati (D1AC) memiliki kadar RS3 lebih rendah dibandingkan dengan yang dihidrolisis dengan enzim pullulanase 10,4 U/g pati (D10AC). Hal ini disebabkan proses pemutusan titik-titik percabangan ikatan glikosidik α,1-6 amilopektin pada konsentrasi enzim pulullanase 1,3 U/g pati lebih sedikit dibandingkan dengan pada konsentrasi tinggi (10,4 U/g pati), sehingga jumlah rantai glukan yang terhidrolisis lebih sedikit. Semakin tinggi konsentrasi enzim pullulanase, maka proses hidrolisis amilopektin untuk menghasilkan amilosa rantai pendek semakin banyak sehingga dapat memperbanyak peluang pembentukan RS3. Hasil penelitian ini sejalan dengan yang dilaporkan oleh peneliti sebelumnya, yaitu perlakuan debranching rantai amilopektin dengan enzim pullulanase dapat meningkatkan kadar RS3 (Gonzales-Soto et al. 2004 dan 2007; Leong et al. 2007; Miao et al. 2009; Mutungi et al. 2009; Ozturk et al. 2009; Pongjanta et al. 2009a)
96
Kombinasi perlakuan hidrolisis asam, debranching dan proses autoclavingcooling dapat meningkatkan kadar RS3 dari 2,12% menjadi 36,80% (untuk H2D1AC) dan 39,3% (untuk H2D10AC). Kadar RS3 ini masih lebih rendah dibandingkan dengan RS3 komersial Novelose 330, yaitu 42,68%. Kombinasi perlakuan hidrolisis asam dan debranching yang dikombinasikan dengan autoclaving-cooling dapat meningkatkan jumlah rantai glukan dengan DP 10-35 sehingga proses pembentukan RS3 dapat optimal (Schmiedl et al. 2000). Sebagai perbandingan, kadar RS3 kacang merah dengan perlakuan hidrolisis asam dengan HCl 7,5% selama 24 jam yang dikombinasikan dengan debranching (0,05 U/g pati) dan 1 siklus autoclaving-cooling (autoclaving pada 121oC selama 30 menit dan cooling pada 4oC selama 24 jam) menghasilkan RS3 sebesar 51,3%. Hidrolisis asam dengan HCl 7,5% selama 7 hari dengan debranching dan autoclaving-cooling dengan kondisi yang sama menghasilkan RS3 sebesar 17,20% (Lehmann et al. 2003). Penurunan kadar RS3 seiring dengan meningkatnya waktu hidrolisis asam disebabkan oleh semakin banyaknya rantai glukan dengan DP <10 yang dapat menghambat proses pembentukan RS3. 4.3.1. Daya Cerna Pati in Vitro Pengukuran daya cerna pati in vitro dilakukan untuk melihat tingkat kemudahan suatu jenis pati untuk dapat dihidrolisis oleh enzim pemecah pati menjadi unit-unit yang lebih kecil. Daya cerna pati yang rendah menunjukkan bahwa pati sulit untuk dicerna yang kemungkinan pada pati tersebut terdapat komponen yang sulit atau tidak dapat dicerna. Komponen bahan pangan yang tidak dicerna tersebut dapat berupa pati resisten atau serat pangan. Pati resisten digolongkan ke dalam serat pangan tidak larut tetapi memiliki fungsi fisiologis sama dengan serat larut (Ranhotra et al. 1991 dan Haralampu 2000). Kadar RS3 yang tinggi pada pati garut yang telah mengalami kombinasi modifikasi hidrolisis asam selama 2 jam, debranching 1,3 U/g pati atau 10,4 U/g pati dan autoclaving-cooling (H2D1AC dan H2D10AC) menyebabkan daya cerna pati menurun (Gambar 40). Pati garut yang dimodifikasi dengan hidrolisis asam, debranching pada konsentrasi 10,4 U/g pati dan siklus autoclaving-cooling (H2D10AC) memberikan daya cerna yang paling rendah (54,81%) dengan kadar
97
RS3 paling tinggi (39,3%). Sebagai perbandingan, pati komersial Novelose 330 dengan kadar RS3 42,68% memiliki daya cerna pati sebesar 47,85%. 100 84,35a
Daya Cerna Pati (%)
80
73,18b
72,56b 62,79c
60,38d
58,81e
60
54,81f 47,85g
40
20
0 Pati garut alami
AC
H2AC
D1AC
D10AC
H2D1AC H2D10AC Novelose
Perlakuan Modifikasi
Gambar 40. Pengaruh perlakuan modifikasi terhadap daya cerna pati garut. AC=autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati. Angka pada histogram yang disertai huruf yang berbeda menyatakan berbeda nyata (α=0,05) Analisis korelasi (Lampiran 4) menunjukkan bahwa kadar pati resisten berkolerasi negatif dengan daya cerna pati (r=-0,777; α=0,05). Hal ini menunjukkan semakin tinggi kadar RS3 maka semakin rendah daya cerna patinya. Daya cerna pati garut pada semua perlakuan modifikasi menurun karena pada saat siklus autoclaving-cooling terjadi penyusunan ulang molekul antara amilosa-amilosa atau amilosa-amilopektin, yang berakibat pada penguatan ikatan hidrogen pada pati, sehingga pati lebih sulit untuk dicerna (Shin et al. 2004). Proses hidrolisis asam dan debranching sebelum proses autoclaving-cooling ditujukan untuk memperoleh lebih banyak jumlah rantai-rantai glukan dengan DP yang optimal untuk pembentukan RS3. Daya cerna pati yang rendah sebagai akibat kadar RS3 yang tinggi merupakan salah satu indikasi rendahnya nilai indeks glikemik (IG) produk pangan. Nilai IG yang rendah pada produk pangan menunjukkan produk pangan lambat
98
dicerna karena lambat melepaskan glukosa. Faridah et al. (2008) melaporkan bahwa produk cookies yang dibuat dengan pati garut termodifikasi dengan perlakuan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus memiliki nilai IG sebesar 31. Nilai IG cookies pati garut ini lebih rendah dibandingkan dengan nilai IG cookies tepung terigu (42). Rendahnya nilai IG cookies pati garut termodifikasi disebabkan oleh kadar RS3 yang cukup tinggi pada pati garut termodifikasi tersebut. Daya cerna yang rendah pada pati garut termodifikasi menyebabkan pati tidak dapat dicerna tetapi dapat difermentasi di usus besar yang menghasilkan asam lemak rantai pendek seperti asam asetat, propionat dan butirat yang diketahui bermanfaat untuk kesehatan (Sajilata et al. 2006). 4.3.3. Struktur Morfologi Permukaan Granula Pati Perubahan permukaan dan bentuk granula pati dapat dilihat dengan menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM). Proses hidrolisis asam dengan menggunakan HCl 2,2N selama 2 jam menyebabkan terjadinya perubahan struktur granula dibandingkan dengan granula pati garut tanpa perlakuan hidrolisis asam (Gambar 41). Namun, granula pati garut masih tetap utuh dengan permukaan yang sudah mengalami kerusakan akibat hidrolisis asam selama 2 jam. Granula pati garut hasil hidrolisis asam sebagian mengalami perubahaan bentuk dan sebagian lagi masih utuh bentuk granulanya tetapi granula seperti terkelupas. Hasil penelitian Jayakody dan Hoover (2002) menunjukkan bahwa hidrolisis asam dengan menggunakan HCl 2,2N pada suhu 35oC selama 8 hari pada amylomaize V menyebabkan terbentuknya lubang yang banyak pada permukaan granula patinya, sementara pada beras, granula pati terfragmentasi dan pada granula pati jagung masih utuh tetapi pada permukaan granula banyak sekali ditemukan lubang. Proses autoclaving-cooling 3 siklus (AC) menyebabkan granula pati garut hancur (tidak membentuk granula pati yang utuh) dengan permukaan lebih halus dibandingkan dengan perlakuan modifikasi lainnya (Gambar 41 dan 42). Hancurnya granula pati garut pada perlakuan autoclaving-cooling disebabkan gelatinisasi selama proses autoclaving. Proses gelatinisasi pati ditandai dengan terjadinya pengembangan (swelling) granula pati, peluruhan (melting) dari bagian kristalit, hilangnya sifat birefringence, dan peningkatan kekentalan serta kelarutan pati. 99
Setelah pengembangan granula mencapai maksimum pada suhu pemanasan tertentu, maka granula pati akan pecah (rupture). Pemanasan pada suhu yang lebih tinggi menyebabkan penurunan kekentalan pasta pati secara tajam (Meyer 2003, Parker 2003).
(1a)
(1b)
(2a)
(2b)
Gambar 41. Struktur granula pati garut yang dimodifikasi dengan perlakuan (1) Hidrolisis asam 2 jam (2) Hidrolisis asam-Autoclacving-cooling 3 siklus. a=pembesaran 500x; b=pembesaran 800x. Tanda panah pada gambar menunjukkan bagian granula pati yang mengalami hidrolisis. Kombinasi perlakuan debranching dengan enzim pullulanase baik pada konsentrasi 1,3 U/g pati (D1AC) maupun 10,4 U/g pati (D10AC) menyebabkan granula pati garut hancur dan tidak beraturan. Pada pati D10AC, permukaan pati garut tampak seperti sponge dengan lubang yang lebih banyak dibandingkan dengan pada pati D1AC. Pati garut yang hanya mengalami autoclaving-cooling tanpa debranching (AC) memiliki permukaan yang lebih halus dibandingkan pati garut yang mengalami proses debranching (Gambar 42). Hasil SEM pati garut yang mengalami proses debranching dan proses autoclaving-cooling tersebut bersesuaian morfologinya dengan pati waxy maize (Miao et al. 2009) dan pati singkong (Mutungi et al. 2009).
100
(1a)
(1b)
(2a)
(2b)
(3a)
(3b)
Gambar 42. Struktur granula pati garut yang dimodifikasi dengan perlakuan debranching dan autoclaving-cooling. (1) Autoclacving-cooling (3x); (2) Debranching 1,3 U/g - Autoclacving-cooling (3x); (3) Debranching 10,4 U/g - Autoclacving-cooling (3x). a=pembesaran 500x; b=pembesaran 800x. Tanda panah pada gambar menunjukkan bagian granula pati yang mengalami hidrolisis. Hasil pengamatan dengan menggunakan SEM memperlihatkan bahwa pati garut yang mengalami proses hidrolisis asam, debranching pada konsentrasi pullulanase tinggi dan siklus autoclaving-cooling (H2D10AC) memiliki permukaan yang berlubang (berpori) lebih banyak dan ditemukan banyak serpihan-serpihan dibandingkan dengan pati yang dihidrolisis pada konsentrasi enzim rendah (H2D1AC) (Gambar 43). Permukaan nampak berlubang seperti sponge sebagai akibat hidrolisis baik oleh asam maupun oleh enzim pullulanase. Semua granula pati garut yang mengalami perlakuan hidrolisis asam menunjukkan titik-titik berwarna putih. 101
(1a)
(1b)
(2a)
(2b)
Gambar 43. Struktur granula pati garut yang dimodifikasi dengan perlakuan hidrolisis asam, debranching dan autoclaving-cooling. (1) Hidrolisis asam-debranching 1,3 U/g -autoclacving-cooling (3x); (2) Hidrolisis asam-debranching 10,4 U/g+autoclacving-cooling (3x). a= pembesaran 500x; b=pembesaran 800x. Tanda panah pada gambar menunjukkan bagian granula pati yang mengalami hidrolisis. 4.3.4. Perubahan Struktur Pati Garut 4.3.4.1. Distribusi Amilosa dan Amilopektin Perubahan profil distribusi amilosa dan amilopektin dari pati garut sebagai akibat dari perlakuan modifikasi pati garut dianalisis dengan menggunakan Gel Permeation Chromatography (GPC) dan dinyatakan sebagai nisbah total karbohidrat. Kromatogram GPC pada seluruh pati garut, baik sebelum maupun setelah modifikasi, memiliki dua fraksi, yaitu fraksi I (Fr-I) dan fraksi II (Fr-II) (Gambar 44). Hasil penelitian terdahulu juga memperlihatkan dua fraksi pada kromatogram GPC, yaitu pada pati beras (Mujoo dan Ali 1999), pati gandum, kentang dan tapioka (Singh dan Ali 2000), dan pati jagung tinggi amilosa (Ozturk et al. 2009). Fraksi I merupakan fraksi amilopektin dengan bobot molekul besar, sedangkan fraksi II (Fr-II) merupakan fraksi amilosa dan gula-gula sederhana dengan bobot molekul kecil. Fraksi I terdapat pada fraksi nomor 1 sampai 30, sedangkan fraksi II terdapat pada fraksi nomor 31 sampai 48.
102
4 Profil GPC G pati gaarut dan teermodifikasii pada shepparose toyo opearl Gambar 44. HW-65F F. AC=Autooclaving-co ooling 3 sikklus; H2= hhidrolisis 2 jam, D1=Debbranching 1.3 1 U/g pati, D10=Debrranching 100.4 U/g patii Gam mbar 44 seecara umum m memperliihatkan peru rubahan nisbbah total karbok hidrat padda fraksi I dan d fraksi II I untuk settiap perlakuuan modifikkasi, baik diband dingkan dengan d pati garut alamii maupun paati yang dibberikan perllakuan. Seb berapa besar perrubahan terrsebut terjaadi dianalissis secara kuantitatif sebagai ju umlah persentasee nisbah tootal karbohhidrat pada masing-m masing frakssi sebagai-mana dapat dilihhat pada Tabel 8. Tabbel tersebutt juga mem mperlihatkann perubahan n persentase peeningkatan total t karbohhidrat pada fraksi II unntuk menunnjukkan seb berapa besar peruubahan frakksi amilosaa dengan bobot b moleekul rendahh sebagai akibat a perlakuan modifikasi. Data-datta tersebut memperlihhatkan adannya pening gkatan f II (y yang menunnjukkan penningkatan fraksi f nisbah tottal karbohiddrat pada fraksi amilosa dan d gula sedderhana) yaang selalu diikuti d denggan penuruunan nisbah h total karbohidraat pada frakksi I (yang menunjukka m an penurunaan fraksi am milopektin).
103
Table 8. Nisbah total karbohidrat pati garut pada fraksi I dan II sebelum dan setelah perlakuan modifikasi dari hasil analisis GPC Perlakuan1
1 2
Pati garut alami AC H2 H2AC D1AC D10AC H2D1AC H2D10AC
% Fraksi I (nomor fraksi 1-30)
% Fraksi II (nomor fraksi 31-48)
%Peningkatan fraksi II2
70,80 66,91 22,67 10,06 35,56 8,20 5,70 8,13
29,20 33,09 77,33 89.94 64,44 91,80 94,30 91,87
13,33 164,84 208,03 120,67 214,40 222,96 214,64
AC=autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati. Dihitung dari sebagai selisih persentase fraksi II dari pati modifikasi dengan fraksi II dari pati alami dibagi dengan fraksi II pati alami
Analisis GPC menunjukkan persentase fraksi amilosa (Fr-II) pada pati garut alami sebesar 29,20%, sedangkan fraksi amilopektin (Fr-I) sebesar 70,80%. Fraksi amilosa ini lebih tinggi dibandingkan kadar amilosa dari hasil analisis spektroskopi (24,64%). Hal ini disebabkan Fr-II dari analisis GPC juga mengukur fraksi gula-gula sederhana dengan bobot molekul rendah, terutama yang terdapat pada fraksi nomor 48. (a) Pengaruh Autoclaving-cooling Nisbah total karbohidrat fraksi amilopektin (Fr-I) dari pati garut yang diberi perlakuan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus (AC) mengalami penurunan, sedangkan pada fraksi amilosa (Fr-II) mengalami peningkatan sebesar 13,33% (Tabel 8). Hasil ini bersesuaian dengan yang dilaporkan oleh Ozturk et al. (2009) pada jagung tinggi amilosa (Hylon 7 dan Hylon 5) yang diberi perlakuan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus. Fraksi berbobot molekul tinggi (dengan bobot molekul >3,200 KDa) pada Hylon 7 dan Hylon 5 secara berturut-turut menurun sebesar 50,0% dan 23,71%. Sementara itu, fraksi berbobot molekul rendah pada Hylon 5 (3,200-960 KDa, 960-30 KDa dan <30 KDa) meningkat sebesar 18,5%. Penurunan fraksi I dan peningkatan fraksi II ini berasal dari hidrolisis amilosa dan amilopektin rantai terluar. Penurunan fraksi amilopektin (Fr-I) pada pati garut yang diberi perlakuan autoclaving-cooling tersebut (AC) disebabkan
104
oleh degradasi molekul amilopektin sebagai akibat proses pemanasan suhu tinggi secara berulang-ulang. Peningkatan fraksi II lebih kecil dibandingkan peningkatan kadar amilosanya (14,20%). Perbedaan antara kadar amilosa dengan fraksi amilosa setelah autoclaving-cooling disebabkan oleh recovery hasil pengukuran total karbohidrat dari fraksi pati garut dari proses autoclaving-cooling sebesar 97,09% sehingga fraksi amilosa yang terukur dengan GPC menjadi lebih rendah dibandingkan dengan kadar amilosa yang berasal dari hasil analisis dengan menggunakan spektrofotometer. Penelitian yang dilakukan oleh Mujoo dan Ali (1999) menyebutkan bahwa recovery total karbohidrat pada sampel pati beras dengan menggunakan GPC adalah sebesar 71,4-98,1% dengan rata-rata sebesar 84,2%. Degradasi pati tidak hanya terjadi karena proses autoclaving-cooling tetapi juga karena proses lain yang menggunakan panas seperti roasted-parboiled rice dan proses ekstruksi pada gandum, jagung dan kentang (Mujoo dan Ali 1999). Proses autoclaving dengan suhu tinggi memicu terjadinya depolimerisasi parsial pati singkong yang menyebabkan pembentukan molekul dengan bobot yang lebih rendah (Mutungi et al. 2009). Hal yang sama juga terjadi pada pati sagu yang mengalami perlakuan autoclaving (Leong et al. 2007). (b) Pengaruh Hidrolisis Asam dan Siklus Autoclaving-cooling Perlakuan hidrolisis asam dengan hanya menggunakan HCl 2,2N selama 2 jam (H2) menyebabkan peningkatan Fr-II hingga 164,84%, sedangkan yang dikombinasikan dengan siklus autoclaving-cooling (H2AC) meningkat hingga 208,03% dibandingkan pati garut alaminya (Tabel 8). Peningkatan Fr-II pada pati garut yang mengalami hidrolisis tersebut (H2AC) disebabkan oleh terjadinya degradasi molekul amilopektin dan amilosa pada daerah amorf. Kehilangan puncak terjadi pada Fr-I dan peningkatan komponen berbobot molekul rendah (Fr-II) (Singh dan Ali, 2000; Franco et al. 2002; Ferrini et al. 2008). Fraksi II mengandung fraksi amilosa, amilopektin dan amilosa hasil hidrolisis oleh asam. Degradasi daerah amorf terjadi karena asam berdifusi ke dalam granula pati dan menyerang atom oksigen pada ikatan glikosidik yang terdapat pada α-1,4 atau α-1,6 sehingga menghasilkan senyawa intermediet karbokationik
105
yang tidak stabil dan dapat bereaksi dengan air dalam granula pati (Chung dan Lai 2007). Pati garut yang mengalami hidrolisis asam selama 2 jam (H2) mengalami peningkatan Fr-II yang cukup besar (168,84%) yang diikuti dengan menurunnya puncak Fr-I secara tajam (Gambar 44). Hal ini berkaitan dengan struktur pati garut yang tergolong kristalin tipe A yang ditandai dengan struktur yang lebih rapat di bagian heliks pada molekul amilopektin di daerah amorf (Gambar 10). Dengan struktur heliks yang lebih rapat tersebut, maka jumlah ikatan α-1,6 dan jumlah rantai per klaster menjadi lebih banyak (Wang et al. 1998; Takeda dan Hanashiro 2003; Srichuwong et al. 2005a). Karena hidrolisis asam lebih mudah menyerang daerah amorf, maka akan lebih banyak titik percabangan α-1,6 yang dapat dihidrolisis asam dan menyebabkan Fr-II meningkat cukup tinggi. Hal ini berbeda dengan pati kentang yang memiliki kristalin tipe B dengan struktur heliks yang lebih jarang, sehingga jumlah titik percabangan α-1,6 lebih sedikit. Dengan demikian, hidrolisis oleh HCl 0,5N selama 1,5 jam hanya meningkatkan Fr-II sebesar 31% (Singh dan Ali 2000). Pati garut yang diberi perlakuan hidrolisis asam dan autoclaving-cooling (H2AC) mengalami peningkatan Fr-II lebih besar (208,03%) dibandingkan dengan yang hanya diberi perlakuan asam (H2) (164,84%) (Tabel 8). Hal ini disebabkan amilopektin dan amilosa pati garut mengalami degradasi selama proses hidrolisis dan autoclaving-cooling. Selama proses autoclaving, depolimerasi amilopektin dan amilosa menjadi amilosa rantai pendek lebih mudah apabila pati sudah mengalami hidrolisis asam. Hal ini sesuai dengan yang dinyatakan oleh Mujoo dan Ali (1999), (Mutungi et al. 2009) dan (Leong et al. 2007) sebagaimana telah dijelaskan di atas. (c) Pengaruh Debranching dan Siklus Autoclaving-cooling Perlakuan debranching dilakukan pada dua konsentrasi enzim pulllanase, yaitu 1,3 dan 10,4 U/g pati garut (D1AC dan D10AC). Enzim pullulanase ditambahkan setelah proses autoclaving. Hal ini dimaksudkan untuk menggelatinisasi granula pati secara sempurna sehingga enzim pullulanase dapat menghidrolisis pati lebih efisien. Hidrolisis pati oleh enzim pullulanase menghasilkan amilosa rantai pendek yang diharapkan dapat menghasilkan DP yang optimal untuk proses 106
pembentukan RS3 yang merupakan pati hasil retrogradasi (Pongjanta et al. 2009a). Semakin banyak fraksi amilosa berantai pendek, maka semakin banyak kemungkinan untuk meningkatkan pembentukan RS3 selama proses autoclavingcooling (Pongjanta et al. 2009a; Ozturk et al. 2009). Profil DP dari pati garut hasil perlakuan dibahas secara lengkap pada sub-bab 4.3.4.2 tentang hasil analisis Fluorophore-Assisted Capillary Electrophoresis (FACE). Analisis GPC menunjukkan bahwa masih ditemukan puncak pada Fr-I baik pada penggunaan konsentrasi pullulanase 1,3 U/g pati maupun pada konsentrasi 10,4 U/g pati (Gambar 44). Hal ini menunjukkan bahwa tidak semua amilopektin terhidrolisis sempurna dan menghasilkan fraksi amilosa rantai pendek. Pada penggunaan konsentrasi enzim pullulanase konsentrasi rendah (D1AC) puncak pada Fr-I lebih tinggi dibandingkan dengan puncak yang terbentuk pada penggunaan enzim pullulanase konsentrasi tinggi (D10AC). Hal ini mengakibatkan peningkatan Fr-II pada D1AC lebih rendah (120,67%) dibandingkan D10AC (214,40%) (Tabel 8). Pati D10AC mengalami penurunan puncak pada Fr-I dan mengalami peningkatan puncak pada Fr-II. Hasil ini berkesesuaian dengan hasil penelitian Ozturk et al. (2009) pada pati jagung Hylon 7 dan Hylon 5, yaitu semakin lama waktu hidrolisis dengan enzim pullulanase (0-48 jam) maka semakin rendah puncak Fr-I dan semakin meningkat puncak Fr-II (Gambar 44). (d) Pengaruh Hidrolisis Asam, Debranching dan Siklus Autoclaving-cooling Pengaruh kombinasi perlakuan asam, debranching dan autoclaving-cooling (H2D1AC dan H2D10AC) terhadap profil GPC dapat dilihat pada Gambar 44. Pada Fr-I tidak ditemukan adanya puncak karena pati garut sudah mengalami hidrolisis asam. Namun, nisbah total karbohidrat pada Fr-I pada setiap nomor fraksi lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan hidrolisis asam dengan autoclaving-cooling (H2AC). Pada Fr-II terjadi peningkatan nisbah total karbohidrat yang lebih tinggi baik pada konsentrasi enzim pullulanase 1,3 U/g pati (H2D1AC) (222,96%) maupun pada konsentrasi 10,4 U/g pati (H1D10AC) (214,60%) dibandingkan dengan perlakuan modifikasi lainnya. Peningkatan nisbah karbohidrat FrII mengindikasikan lebih banyak fraksi amilosa rantai pendek yang terbentuk.
107
4.3.4.2. Distribusi Panjang Rantai Amilopektin dan Amilosa Rantai Pendek Panjang rantai amilopektin dan amilosa rantai pendek dengan derajat polimerisasi (DP) 6-30 dapat diketahui dengan menggunakan FACE. Amilopektin pada pati garut baik yang alami dan yang mengalami proses modifikasi, dihidrolisis secara sempurna dengan menggunakan enzim isoamilase sehingga semua titik percabangan α-1,6 terputus dan menghasilkan rantai glukan dengan ujung pereduksi. Semakin banyak yang terhidrolisis maka semakin tinggi kadar gula pereduksinya. Ujung pereduksi kemudian diderivatisasi dengan APTS (8-aminopyrene-1,3,6-trisulfuric acid trisodium) sehingga pati dapat dianalisis dengan menggunakan FACE. Ujung pereduksi rantai glukan dapat diperoleh baik dari hasil hidrolisis amilopektin maupun dari degradasi amilosa. Analisis DP rantai glukan dengan menggunakan FACE tidak dapat membedakan ujung pereduksi rantai glukan hasil hidrolisis amilopektin atau hasil degradasi amilosa. Namun, kenaikan persentase distribusi rantai glukan merupakan indikasi telah terjadinya degradasi amilosa menjadi amilosa rantai pendek. Profil distribusi DP baik pada pati garut alami maupun pati garut yang diberi perlakuan dapat dilihat pada Gambar 45. Puncak distribusi DP banyak terdapat pada DP 11-13 dengan komposisi terbanyak pada DP 13. Srichuwong et al. (2005a) juga melaporkan bahwa pati garut memiliki DP 13 yang paling banyak. (a) Pengaruh Autoclaving-cooling Profil distribusi panjang rantai amilopektin dan amilosa rantai pendek pada pati dengan perlakuan autoclaving-cooling (AC) dapat dilihat pada Gambar 45 dan Tabel 9. Persen distribusi amilopektin dan amilosa rantai pendek pada pati garut dengan perlakuan autoclaving-cooling adalah sebagai berikut: DP 6-8 (6,68%), DP 9-12 (32,09%), DP 13-24 (54,91%) dan DP 25-30 (6,32%). Dibandingkan dengan pati garut alami, maka persen distribusi pada DP 6-8, 9-12 dan 25-30 meningkat sedangkan DP 13-24 menurun. Hal ini menunjukkan bahwa proses autoclaving-cooling dapat meningkatkan rantai amilosa rantai pendek yang kemungkinan berasal dari depolimerisasi amilosa rantai panjang. Hal ini telah dijelaskan pada sub-bab mengenai pengaruh autoclaving-cooling terhadap profil amilopektin dan amilosa dengan menggunakan GPC. Kemungkinan yang lain 108
adalah terjadinya degradasi amilopektin dengan DP 13-24 sehingga persen distribusi DP 13-24 menurun dibandingkan dengan pati garut alami. Penurunan DP 1324 kemungkinan disebabkan oleh degradasi amilopektin pada DP tersebut dan membentuk amilosa rantai pendek dengan DP 6-8 atau 9-12. Semua pati garut yang diberi perlakuan autoclaving-cooling (AC) mengalami peningkatan DP 6-8 dibandingkan dengan pati garut alaminya. Peningkatan tersebut disebabkan oleh terjadinya degradasi amilosa rantai panjang atau amilopektin rantai medium (Gambar 46 dan Tabel 9). Table 9. Persentase distribusi panjang rantai pada amilopektin dan amilosa rantai pendek dari hasil pengukuran dengan FACE Distribusi Panjang rantai (%) Perlakuan1 DP 6-8 DP 9-12 DP 13-24 DP 25-30 Pati garut alami 5,98 31,77 56,04 6,21 AC 6,68 32,09 54,91 6,32 H2 6,69 30,66 55,31 7,33 H2AC 7,08 30,86 55,34 6,72 D1AC 8,13 31,52 53,68 6,67 D10AC 16,81 33,37 44,65 5,17 H2D1AC 7,59 30,53 54,80 7,08 H2D10AC 14,79 31,55 47,92 5,75 1
AC=autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati
(b) Pengaruh Hidrolisis Asam dan Siklus Autoclaving-cooling Profil distribusi panjang rantai amilopektin dan amilosa rantai pendek pada pati garut yang dihidrolisis dengan HCl 2,2 N selama 2 jam dan dilanjutkan dengan proses autoclaving-cooling (H2AC) dapat dilihat pada Gambar 46 dan Tabel 9. Dibandingkan dengan pati garut alaminya, pati yang diberi perlakuan tersebut mengalami peningkatan persentase distribusi panjang rantai dengan DP 6-8 dan 25-30 dan penurunan pada DP 9-12 dan 13-24. Peningkatan persentase panjang rantai dengan DP 6-8 dan 25-30 pada perlakuan hidrolisis asam disebabkan oleh terjadinya depolimerisasi amilosa rantai panjang membentuk amilosa rantai pendek. Hidrolisis asam terjadi pada daerah amorf yang umumnya banyak mengandung amilosa dan titik percabangan α,1-6 pada amilopektin. Kemungkinan lainnya adalah hidrolisis panjang rantai medium
109
Gambar 45. Distribusi panjang rantai pada amilopektin dan amilosa rantai pendek dari hasil pengukuran dengan FACE. AC=autoclavingcooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati
110
Gambar 46. Persentase panjang rantai pada pati garut termodifikasi dibandingkan dengan pati garut alami. AC=autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati
111
amilopektin sehingga persentase distribusi panjang rantai dengan DP 9-12 dan 1324 menurun dan dihasilkan rantai glukan dengan DP 6-8. Peningkatan persentase distribusi panjang rantai glukan dengan DP 25-30 dapat juga disebabkan oleh depolimerisasi amilosa rantai pendek. (c) Pengaruh Debranching dan Siklus Autoclaving-cooling Proses hidrolisis pada titik percabangan α,1-6 amilopektin pati garut dilakukan dengan menggunakan enzim pullulanase dengan konsentrasi 1,3 dan 10,4 U/g pati (D1AC dan D10AC). Pati garut yang sudah mengalami debranching kemudian dipanaskan dengan otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit dan didinginkan pada suhu 4oC selama 24 jam dengan total 3 siklus autoclaving-cooling. Proses debranching amilopektin menghasilkan banyak rantai glukan dengan DP 6-8, 9-12, 13-24 dan 25-30 (Tabel 9). Rantai glukan hasil debranching kemudian dipanaskan dengan otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Proses pemanasan pada rantai glukan hasil debranching amilopektin menyebabkan depolimerisasi rantai glukan lebih mudah dibandingkan dengan dalam bentuk struktur amilopektinnya. Hal ini menyebabkan panjang rantai glukan dengan DP 6-8 pada pati garut yang dimodifikasi dengan debranching dan autoclaving-cooling menjadi lebih tinggi dibandingkan dengan modifikasi lainnya. Peningkatan persentase panjang rantai glukan dengan DP 6-8 dapat juga disebabkan oleh depolimerisasi amilosa rantai panjang sebagai akibat proses autoclaving-cooling. Pada konsentrasi enzim pullulanase 1,3 U/g pati (D1AC), peningkatan persentase panjang rantai dengan DP 6-8 lebih rendah dibandingkan dengan pada konsentrasi enzim 10,4 U/g pati (D10AC). Hal ini karena penggunaan konsentrasi enzim pullulanase yang rendah belum menyebabkan semua titik percabangan α,16 terhidrolisis sehingga peluang untuk depolimerisasi rantai glukan hasil debranching amilopektin lebih rendah. Peningkatan persentase panjang rantai dengan DP 6-8 pada penggunaan enzim pullulanase konsentrasi rendah diikuti dengan penurunan pada rantai glukan dengan DP 13-24. Hal ini menjelaskan kemungkinan terjadinya depolimerisasi rantai glukan dengan DP 13-24 sebagai akibat proses autoclaving-cooling. Peningkatan panjang rantai dengan DP 25-30 disebabkan oleh depolimerisasi amilosa rantai panjang akibat proses autoclavingcooling. 112
Penggunaan enzim pullulanase konsentrasi tinggi (D10AC) menyebabkan peningkatan persentase distribusi rantai glukan dengan DP 6-8 dan 9-12 lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan pada konsentrasi rendah (D1AC). Semakin tinggi konsentrasi enzim pullulanase maka semakin banyak titik percabangan α,16 amilopektin yang terputus sehingga peluang terhidrolisisnya rantai glukan hasil debranching amilopektin meningkat pada saat proses autoclaving-cooling dan menyebabkan penurunan panjang rantai glukan dengan DP 25-30. (d) Pengaruh Hidrolisis Asam, Debranching dan Siklus Autoclaving-cooling Kombinasi perlakuan asam, debranching dan siklus autoclaving-cooling pati garut menunjukkan kecenderungan perubahan distribusi panjang rantai glukan yang hampir sama dengan yang diberi perlakuan debranching dan siklus autoclaving-cooling. Pada konsentrasi enzim yang tinggi (H2D10AC), panjang rantai glukan dengan DP 6-8 mengalami peningkatan, sedangkan DP 13-24 dan 25-30 mengalami penurunan (Tabel 9). Penjelasan perubahan persentase distribusi panjang rantai glukan ini sama dengan yang telah dibahas pada su-bab sebelumnya. Pengujian pati garut dengan menggunakan FACE yang telah dilakukan Srichuwong et al. (2005b) dan Srichuwong (2006) menunjukkan bahwa panjang rantai dengan DP 16-26 berkorelasi positif dengan tingginya derajat retrogradasi pati garut yang berakibat pada tingginya pembentukan RS3. Tabel 9 memperlihatkan bahwa semua pati garut yang diberi perlakuan memiliki proporsi DP 13-24 yang paling tinggi, yaitu 44,65-56,04% dengan DP 25-30 cukup tinggi dibandingkan dengan pati garut alaminya, sedangkan pada perlakuan dengan konsentrasi enzim pullulanase tinggi (10,4 U/g pati) terjadi peningkatan pada DP 11-12. Sebagai perbandingan, Lehmann et al. (2002) melakukan modifikasi pati pisang dengan proses debranching dengan enzim pullulanase, pemanasan dalam otoklaf pada suhu 121oC selama 30 menit dan pendinginan pada suhu 4oC dan 25oC. Hasil analisis panjang rantai dengan menggunakan High-Performance Anion Exchanger Chromatography (HPAEC) menunjukkan adanya DP 6-30 yang dominan dan DP 6-22 cukup tinggi dibandingkan dengan pati pisang alami. Chung et al. (2009) melaporkan bahwa pati singkong yang mengalami proses debranching dan autoclaving-cooling memiliki DP 5-48, yaitu jumlah yang 113
tinggi terdapat pada DP 10-24 (58,9%) dan DP >24 (31,2%), sedangkan DP <10 hanya sekitar 8%. Rendahnya jumlah panjang rantai glukan dengan DP<10 disebabkan pencucian pati dengan air deionisasi yang dapat menghambat proses pembentukan RS3. Pati jagung yang dimodifikasi dengan HMT baik yang dikombinasikan dengan modifikasi annealing maupun tanpa annealing ternyata dapat meningkatkan DP 6-8 dan menurunkan DP>37 (Chung et al. 2009). Dari hasil tersebut maka dapat disimpulkan bahwa proses pemanasan dapat memutuskan ikatan kovalen pada rantai glukan sehingga terbentuk rantai glukan yang lebih pendek baik pada amilopektin maupun pada amilosa (Chung et al.2009). Shu et al. (2007) menjelaskan bahwa pembentukan RS3 bukan hanya dipengaruhi oleh kadar amilosa tetapi juga oleh panjang rantai amilopektin. Peningkatan proporsi rantai pendek (DP < 12) dan penurunan proporsi rantai medium (13
37) pada amilopektin beras berkontribusi pada peningkatan kadar RS3. Demikian pula pada pati sereal yang yang teretrogradasi mengalami peningkatan pada DP 6, DP 18 dan DP>40 (Silverio et al. 2000). 4.3.5. Kestabilan Panas dan Derajat Retrogradasi Pati 4.3.5.1. Kestabilan Panas Gambar 47 memperlihatkan grafik hasil pengukuran dengan DSC, sedangkan Tabel 10 memperlihatkan suhu onset (To), suhu puncak (Tp) dan suhu conclusion (Tc), entalpi transisi (ΔH) dan derajat retrogradasi (nisbah entalpi pati garut perlakuan dengan entalpi pati garut alami) yang diolah dari grafik DSC tersebut. Suhu transisi yang tinggi menunjukkan tingginya derajat kristalinitas, yaitu struktur granula lebih stabil dan pati lebih tahan untuk tergelatinisasi. Nilai To dan ΔH merupakan parameter mengenai jumlah rantai glukan dengan DP tinggi (DP>12). Pati dengan rantai glukan dengan DP yang tinggi membutuhkan suhu yang tinggi untuk meluluhkan (disosiasi) double helix secara sempurna dibandingkan dengan pati dengan rantai glukan dengan DP rendah.
114
Gambar 47. Profil DSC pati garut alami dan yang mengalami modifikasi. H2= hidrolisis 2 jam; D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10 U/g pati; AC=autoclaving-cooling 3 siklus Pati garut H2D10AC dan D10AC memiliki To masing-masing 100,11oC dan 102,31oC, sedangkan pati garut H2D1AC dan D1AC memiliki To masing-masing 113,41oC dan 137,74oC (Tabel 10). Hal ini disebabkan proses debranching pada konsentrasi tinggi menghasilkan distribusi rantai glukan dengan DP 6-8 yang tinggi, yaitu 16,81% untuk D10AC dan 14,79% untuk H2D10AC (Tabel 9). 115
Tabel 10. Hasil pengukuran Diffential Scanning Calorimeter (DSC) pada pati garut alami dan hasil modifikasi Kestabilan Panas Perlakuan
To (oC)
Tp (oC)
Tc (oC)
Tc-To (oC)
ΔH (J/g)
Derajat Retrogradasi (%)
Pati garut alami
48,27
49,04
59,01
10,74
134,78
-
93,55
103,98
112,18
18,63
336,35
-
H2
129,99
130,21
134,88
4,85
538,08
159,97
AC
84,88
98,55
104,10
19,20
197,20
58,60
H2AC
76,90
100,45
112,14
35,24
918,15
272,97
D1AC
137,74
138,56
142,66
4,92
519,71
154,50
D10AC
100,11
106,23
112,71
12,60
591,10
175,70
H2D1AC
113,41
121,96
128,29
14,88
726,34
215,90
H2D10AC 102,33 106,51 115,13 12,80 662,26 196,90 o To= suhu onset ( C), Tp = suhu puncak, Tc=suhu akhir/conclusion tempe-rature; ΔH= entalpi. Derajat retrogradasi= % nisbah ΔH pati garut perlakuan terhadap ΔH pati alami; H2= Hidrolisis 2 jam; AC= autoclaving-cooling 3 siklus; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati
Pati garut alami memiliki 2 (dua) suhu puncak (Tp) yaitu pada suhu 49,04oC (endoterm I) dan 103,98oC (endoterm II), sehingga disebut juga biphasic endothermic. Endoterm I (suhu 50-80oC) menunjukkan peluluhan (melting) dari double helix rantai glukan dengan DP rendah (DP 6-11), sedangkan endorterm II menunjukkan peluruhan dari double helix rantai glukan dengan DP>11. Sebagai perbandingan, pati waxy maize juga dilaporkan memiliki karakteristik sama dengan pati garut dengan dua suhu puncak, yaitu pada 56,59oC dan 103,74oC (Miao et al. 2009). Nilai Tc-To menunjukkan ukuran kestabilan kristalin. Semakin tinggi nilai Tc-To, maka semakin besar variasi kestabilan kristalinnya. Semakin tinggi nilai Tc-To mengindikasikan semakin banyak titik percabangan amilopektin yang terpotong sehingga semakin lebar suhu peluluhannya (Singh et al. 2005b). Hal ini dibuktikan dengan nilai Tc-To pada H2D10AC (12,80oC) yang lebih rendah daripada H2D1AC (14,88oC), disebabkan jumlah titik percabangan pada H2D1AC lebih banyak dibandingkan dengan H2D10AC. Entalpi transisi (ΔH) berkorelasi dengan jumlah double helix dan kristalin. Entalpi transisi juga menunjukkan hilangnya susunan ikatan double helix dan merupakan salah satu parameter yang sangat dipengaruhi oleh kadar amilosa, 116
panjang rantai dari amilopektin dan kompleks amilosa-lipid (Chung et al 2009; Mutungi et al. 2009). Endoterm I pada pati garut alami memiliki nilai ΔH yang lebih rendah (134,78 J/g) dibandingkan dengan ΔH pada endoterm II yaitu sebesar 336,35 J/g (Tabel 10). Nilai ΔH yang rendah pada endoterm I menunjukkan (1) susunan double helix dengan kestabilan yang rendah; (2) membutuhkan waktu yang lebih lama lagi untuk membuat secara terus-menerus struktur double helix yang stabil; atau (3) jumlah rantai glukan dengan DP rendah (6-11) (Garcia-Rosas et al. 2009). Rantai glukan dengan DP 6-12 terlalu pendek untuk membentuk struktur double helix yang stabil dan hanya memerlukan energi yang sedikit untuk meluluhkannya (Chung et al. 2009). Sebagaimana telah dijelaskan pada sub-bab sebelumnya bahwa minimum panjang rantai glukan yang dapat menyusun double helix yang stabil adalah pada DP 10 (Lehmann et al. 2009). Pati garut yang mengalami debranching pada konsentrasi enzim pullulanase rendah dan autoclaving-cooling (D1AC) memiliki nilai ΔΗ lebih rendah (519,71 J/g) dibandingkan dengan yang mengalami debranching pada konsentrasi enzim yang tinggi (D10AC) (591,10 J/g). Hal ini menunjukkan bahwa D10AC membutuhkan energi lebih besar untuk disosiasi/peluluhan (melting) struktur double helix-nya atau jumlah struktur double helix yang terbentuk lebih banyak dibandingkan dengan D1AC. Tabel 10 memperlihatkan bahwa nilai ΔH pada H2D1AC (726,34 J/g) lebih besar dibandingkan dengan H2D10AC (662,26 J/g). Perlakuan kombinasi hidrolisis asam dan debranching pada konsentrasi tinggi (H2D10AC) menyebabkan jumlah rantai glukan dengan DP rendah (DP 6-8) meningkat sehingga struktur double helix yang terbentuk lebih sedikit. Sebagai akibatnya, energi untuk peluluhan H2D10AC lebih rendah dibandingkan dengan H2D1AC. 4.3.5.2. Derajat retrogradasi Derajat retrogradasi adalah nisbah nilai entalpi pati hasil modifikasi dengan entalpi pati garut alami. Derajat retrogradasi pati pada pati D10AC lebih tinggi (175,7%) dibandingkan dengan D1AC (154,5%). Derajat retrogradasi D10AC lebih tinggi karena proses debranching pada konsentrasi enzim pullulanase 10,4 U/g pati memutuskan lebih banyak titik-titik percabangan α,1-6 amilopektin
117
sehingga dihasilkan jumlah rantai glukan yang lebih banyak dan menyebabkan peluang terjadinya retrogradasi pati garut selama proses pendinginan lebih besar. Derajat retrogradasi pada H2D1AC (215,9%) lebih tinggi dibandingkan dengan H2D10AC (196,9%). Hal ini menunjukkan bahwa H2D10AC menghasilkan hidrolisat dengan rantai glukan yang pendek sehingga proses pembentukan struktur double helix tidak dapat dilakukan yang menyebabkan rendahnya derajat retrogradasi pati. Namun, kadar RS3 pada H2D10AC lebih tinggi (39,30%) dibandingkan dengan H2D1AC (36,80%) (Gambar 39). Analisis kadar RS3 dilakukan dengan menggunakan enzim porcine α-amilase pada suhu 37oC selama 16 jam. Selama proses tersebut kemungkinan terjadi peningkatan retrogradasi dari amilosa hasil hidrolisis oleh enzim. Kecepatan retrogradasi ini dapat lebih tinggi dibandingkan dengan kecepatan reaksi hidrolisis enzimatis pada pati (Lopez-Rubio et al. 2008). Hal ini menjelaskan mengapa kadar pati resisten pada H2D10AC lebih tinggi dibandingkan H2D1AC, meskipun derajat retrogradasi dari hasil analisis DSC lebih rendah pada H2D10AC (Tabel 10). 4.3.6. Sifat Kristalinitas Pati 4.3.6.1. Perubahan Daerah Kristalin dan Amorf FTIR digunakan untuk menentukan tingkat susunan heliks dari pati untuk melihat perubahan pati akibat proses gelatinisasi, retrogradasi atau penyimpanan. Polisakarida seperti pati dapat diabsorpsi pada bilangan gelombang 800-1200 cm-1 yang merupakan fingerprint dari konformasi dan hidrasi pati (Savenou et al. 2002). Bilangan gelombang 1022 cm-1 menunjukkan vibrasi dari deformasi C-OH yang dapat dihubungkan dengan daerah amorf dan kristalin dari granula pati. Bilangan gelombang 1045-1047 cm-1dan 1020-1022 cm-1 merupakan band untuk daerah kristalin dan daerah amorf pada granula pati. Nisbah intensitas 1045/1022 dan 1022/995 digunakan untuk menentukan perubahan konformasi pati terutama pada daerah kistralin dan amorf. Peningkatan nisbah 1045/1022 mengindikasikan peningkatan susunan daerah kristalin (Chung et al. 2009), sebaliknya peningkatan nisbah 1022/955 memperlihatkan adanya peningkatan susunan daerah amorf (Htoon et al. 2009). Sementara menurut Lopez-Rubio et al. (2008), peningkatan nisbah 995/1022 menunjukkan peningkatan susunan daerah kistralin. Bilangan gelombang 1151 cm-1 digunakan sebagai standar internal untuk meng118
hindari variasi dari ketebalan sampel dan pengukuran transmitan atau absorban pada saat pengukuran (Ottenhof et al. 2005; Bello-Perez et al. 2005). Nisbah 1045/1151 digunakan untuk menentukan struktur heliks selama proses retrogradasi. Kurva hasil pengukuran dengan FTIR dari pati garut alami dan yang diberi perlakuan dapat dilihat pada Gambar 48. Perubahan daerah amorf dan kristalin dari pati garut pada berbagai perlakuan berdasarkan hasil analisis dari kurva FTIR dapat dilihat pada Tabel 11. Sebagaimana dijelaskan di atas, nilai nisbah 1022/ 995 merupakan nilai yang memperlihatkan susunan daerah amorf dari granula pati. Semua perlakuan pati garut meningkatkan daerah amorf yaitu AC (1,021), H2AC, D1AC dan H2D1AC sebesar 1,010, D10AC (1,019) dan H2D10AC (1,030) dibandingkan dengan pati garut alami (0,991).
Gambar 48. Kurva hasil pengukuran FTIR dari pati garut alami dan yang mengalami modifikasi. AC= autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati
119
Tabel 11. Perubahan daerah amorf dan kristalin dari pati garut pada berbagai perlakuan modifikasi berdasarkan hasil pengukuran dengan FTIR Absorbansi (A) Kristalin Amorf Perlakuan1 -1 -1 -1 Pati garut alami AC H2AC D1AC D10AC H2D1AC H2D10AC 1
1045 cm
1022 cm
995 cm
A1045/A1022
A1022/A955
0,6167 0,4847 0,4050 0,4927 0,5854 0,4996 0,4751
0,6212 0,4948 0,4194 0,4972 0,5962 0,4962 0,4825
0,6268 0,4848 0,4152 0,4924 0,5849 0,4914 0,4683
0,993 0,979 0,966 0,991 0,982 1,007 0,985
0,991 1,021 1,010 1,010 1,019 1,010 1,030
AC=autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati
Peningkatan daerah amorf pada pati garut yang diproses autoclavingcooling (AC) (1,021) lebih tinggi dibandingkan dengan pati garut alami (0,991). Pemanasan dengan otoklaf dapat menyebabkan hidrolisis amilosa dan amilopektin bagian terluar dari klaster (Mujoo dan Ali 1999; Mutungi et al. 2009; Leong et al. 2007) sehingga daerah kristalin menurun dan daerah amorf meningkat. Fraksi amilosa dan titik-titik percabangan α-1,6 berada pada daerah amorf. Susunan daerah kristalin mengalami penurunan seiring dengan meningkatnya konsentrasi enzim pullulanase dan diikuti dengan peningkatan susunan daerah amorf. Pemutusan titik-titik percabangan α-1,6 yang berada dalam daerah amorf oleh enzim pullulanase dapat meningkatkan daerah amorf. Semakin tinggi konsentrasi enzim pullulanase, maka semakin banyak titik-titik percabangan yang terputus sehingga meningkatkan daerah amorf dan menurunkan daerah kistralin. Nisbah 1045/1022 pada D1AC (0,991) lebih tinggi dibandingkan dengan D10AC (0,982). Begitu pula pada H2D1AC (1,007) lebih tinggi dibandingkan dengan H2D10AC (0,985). Sebagai perbandingan, hasil penelitian Chung et al. (2009) menunjukkan bahwa proses modifikasi HMT pada pati jagung, pea dan lentil menyebabkan penurunan nisbah 1045/1022 atau penurunan daerah kristalin. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh pemutusan beberapa ikatan hidrogen yang berdekatan
120
dengan double helix atau terjadi reorientasi struktur double helix di daerah kristalin. Proses hidrolisis asam dengan menggunakan HCl pada pati garut dapat menurunkan absorbansi pada bilangan gelombang 1022 cm-1 baik pada H2AC, H2D1AC maupun H2D10AC. Penurunan ini terjadi karena daerah amorf dari granula pati merupakan daerah sensitif oleh hidrolisis asam dan daerah pertama yang diserang oleh asam dan tahap penyerangan selanjutnya adalah daerah kristalin (Mumny 2000; Jayakody dan Hoover 2002; Aparicio-Saguilan et al. 2005; Mun dan Shin 2006). Penurunan absorbansi pada sampel pati garut yang mengalami perlakuan hidrolisis asam berdampak pada penurunan nisbah 1022/995 dibandingkan dengan sampel tanpa perlakuan hidrolisis asam (AC). Pati H2AC dan H2D1AC masing-masing memiliki nisbah 1022/995 sebesar 1,010 dan 1,010 yang lebih rendah dibandingkan dengan AC (1,021), sedangkan pati H2D10AC lebih tinggi (1,030) dibandingkan dengan pati yang mengalami hidrolisis asam dan debranching pada konsentrasi rendah (H2D1AC). 4.3.6.2. Pola Difraksi Sinar X (a) Kristalinitas Gambar 49 menunjukkan difraktogram dari hasil rekapitulasi gambar hasil smoothing dengan menggunakan program Filter Kalman (Lampiran 1a-1c) yang kemudian digunakan untuk menghitung daerah amorf dan kristalin dari pati garut alami dan hasil modifikasi (Lampiran 2a-2d). Perhitungan kedua daerah tersebut menggunakan persamaan Gaussian dan Lorentz (Frost et al. 2009). Tipe kristalin dari pati garut alami dan yang telah dimodifikasi dari hasil pengukuran difraksi sinar X dapat dilihat pada Tabel 12. Srichuwong et al. (2005a) menyatakan bahwa pati garut alami memiliki kristalin tipe A. Hal ini bersesuaian dengan yang diperoleh dalam penelitian ini yang juga menunjukkan kristalin tipe A. Kristalin tipe A ditandai dengan puncak pada 2 tetra yaitu 15o, 17o, 20o dan 23o. Pati garut alami memiliki derajat kristalinitas sebesar 20,01% sedangkan pati garut hasil hidrolisis asam selama 2 jam (H2) sebesar 20,80%. Hidrolisis asam selama 2 jam pada pati garut hanya menyerang daerah amorf sehingga derajat kristalinitas setelah hidrolisis asam tidak banyak berubah dan tidak
121
menggubah tipe kristalin. Selisih S intennsitas (deltaa) pada patti garut alam mi dengan yangg mengalam mi hidrolisis (H2) dapat dilihat padaa Gambar 50a. 5
Gam mbar 49. Difraktogram m hasil smooothing dari pati garut alami a dan yyang mengallami modifikasi. AC= autoclaving a g-cooling 3 siklus; H2= =Hidrolisis assam 2 jam; D1=debrannching 1,3 U/g U pati; D10=debran D ching 10,4 U pati U/g Semua peerlakuan hiidrolisis asam dengan n atau tanppa debrancching yang dikom mbinasikann dengan auutoclaving-ccooling men ngubah krisstalinitas daari kristalin tipe A menjadi kristalin k tippe B (2 tetraa pada 17o dan d 23o) (Tabel 12). L Leong et al. (2007) melaporrkan bahwa proses pem mbuatan RS S3 dari patti sagu denggan mengngubah krisstalinitas dari tipe A gunaakan prosess autoclavinng-cooling dapat men menjjadi tipe B. Pati jagungg dan pati jagung tingg gi amilosa yang y diberii perlakuan autocclaving-coooling 3 dan 5 siklus meengalami peerubahan krristalinitas ddari tipe A menjjadi tipe B (Zabar et al. 2008). Stute (1992 2) menemukkan bahwa perlakuan modiifikasi heatt moisture treatment (HMT) ( pati kentang mengubah m kkristalinitas pati dari tipe B menjadi tipe A. Hooover dan Vasanthan (1994a) m menemukan bahw wa modifikaasi dengan annealing mengubah kristalinitas pati non-sereal dari tipe B menjadi campuran c tiipe A dan B. B Perubahann kristalinitaas dari krisstalin tipe A pada patii garut alam mi menjadi kristaalin tipe B pada sem mua perlakuuan modifik kasi dengann proses auutoclavingcooliing (Tabel 12) disebabbkan oleh teerbukanya struktur s douuble helix pada daerah 122
kristalin yang tersusun terutama oleh amilopektin. Pada saat proses pendinginan, terjadi rekristalisasi dari amilosa rantai pendek yang membentuk struktur double helix, sehingga perubahan bentuk kristalin dan penurunan derajat kristalinitas. Rekristalisasi amilopektin selama proses autoclaving dapat juga terjadi, namun memerlukan waktu yang lebih lama dibandingkan rekristalisasi amilosa. Tabel 12. Derajat kristalinitas dan tipe kristalin pati garut alami dan yang dimodifikasi Perlakuan1 Derajat Kristalinitas (%) Tipe Kristalin Pati garut alami 20,01 A H2 20,80 A AC 12,83 B H2AC 11,36 B D1AC 13,38 B D10AC 14,14 B H2D1AC 9,37 B H2AD10AC 12,99 B 1
AC=autoclaving-cooling 3 siklus; H2= Hidrolisis 2 jam; D1= debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati
Proses autoclaving-cooling 3 siklus (AC) menurunkan derajat kristalinitas dari 20,01% (pada pati garut alami) menjadi 12,83%. Perbedaan antara pati garut alami dan yang diberi perlakuaan autoclaving-cooling dapat dilihat pada Gambar 50a. Proses autoclaving-cooling menyebabkan hilangnya puncak pada 2 tetra 15o dan 23oC dan yang tersisa pada 2 tetra 17o sehingga hasil modifikasi dengan autoclaving-cooling mengubah kristalin tipe A menjadi tipe B. Proses autoclaving dapat menyebabkan pati garut mengalami gelatinisasi yang ditandai dengan terjadinya pengembangan granula pati, peluruhan daerah kristalin, hilangnya sifat birefringence, peningkatan kekentalan dan peningkatan kelarutan pati. Proses gelatinisasi pati juga menyebabkan terjadinya diasosiasi double helix dari amilopektin dan peluruhan daerah kristalin. Disosiasi double helix dari rantai amilopektin menyebabkan hilangnya sifat birefringence dan kristalinitas granula pati (Liu 2005). Pati garut dengan modifikasi hidrolisis asam dengan autoclaving-cooling (H2AC) memiliki derajat kristalinitas sebesar 11,32% lebih rendah dari pati garut alami (20,01%) dan AC (12,83%). Perlakuan tersebut menyebabkan perubahan
123
jenis tipe kristalin dari tipe A menjadi tipe B, yaitu masih terdapatnya puncak tetra 17o tetapi kehilangan 2 puncak pada tetra 15o dan 23o. Selisih antara AC dengan H2AC dapat dilihat pada Gambar 50a. Modifikasi pati garut dengan debranching dan proses autoclaving-cooling juga menurunkan derajat kristalinitas karena proses debranching dapat memutuskan titik-titik percabangan amilopketin penyusun daerah kristalin untuk menghasilkan fraksi amilosa rantai pendek sehingga reasosiasi dan rekristalisasi amilosa menjadi lebih banyak pada pati garut yang dihidrolisis dengan konsentrasi enzim pullulanase 10,4 U/g pati dibandingkan dengan 1,3 U/g pati. Pati D1AC memiliki derajat kristalinitas sebesar 13,38% lebih rendah dibandingkan dengan D10AC sebesar 14,14% (Gambar 50b), sedangkan untuk pati yang dimodifikasi dengan hidrolisis
asam,
debranching
dan
autoclaving-coooling
(H2D1AC
dan
H2D10AC) memiliki derajat kristalinitas masing-masing sebesar 9,37% dan 12,99% (Gambar 50c). Hasil analisis korelasi (Lampiran 4) menunjukkan bahwa daya cerna pati berkorelasi secara positif dengan derajat kristalinitas hasil pengujian dengan difraksi sinar X (r=0,794; α=0,05). Daya cerna pati semakin kecil berkaitan dengan menurunnya derajat kristalinitas pati garut. Penurunan derajat kristalinitas berkaitan erat dengan peningkatan daerah amorf. (b) Kristalinitas Setiap Puncak Kristalinitas setiap puncak merupakan nisbah luas masing-masing puncak terhadap luas daerah kristalin. Data ini diperoleh dari persamaan Gauss dan Lorentz dengan tahapan yang sama seperti ketika mendapatkan data untuk relatif kristalinitas. Gambar pada Lampiran 3 menunjukkan contoh kurva kristalinitas setiap puncak untuk garut pati alami dan pati garut hasil modifikasi (H2D10AC). Tabel 13 memperlihatkan kristalinitas setiap puncak pada pati garut alami dan yang mengalami perlakuan dengan masing-masing nilai 2 tetra pada setiap puncaknya. Pada kristalin tipe A ditemukan dua puncak yang berdekatan, yaitu pada 2 tetra di 17o dan 18o. Hal ini ditemukan juga pada pati garut alami dan yang sudah mengalami proses hidrolisis asam dengan HCl 2,2N, yaitu masing-masing pada 2 tetra 17,14o dan 18,20o dengan kristalinitas masing 10,89% dan 26,18% serta
124
Gambar 50a. Daerah amorf dan kristalin dari pati garut alami dan hasil hidrolisis asam dan autoclaving-cooling. H2=hidrolisis asam 2 jam; AC=autoclaving-cooling 3 siklus; Delta=selisih antara nilai intensitas relatif pati garut alami dengan pati garut termodifikasi pada 2 tetra yang bersesuaian 125
Gambar 50b. Perubahan daerah amorf dan kristalin dari pati garut dari hasil kombinasi perlakuan hidrolisis dan autoclavingcooling. H2= hidrolisis 2 jam; AC=autoclaving-cooling 3 siklus. Delta=selisih antara nilai intensitas relatif pati garut alami dengan pati garut termodifikasi pada 2 tetra yang bersesuaian 126
Gambar 50c. Daerah amorf dan kristalin dari pati garut alami dan hasil kombinasi perlakuan hidrolisis, debranching dan autoclaving-cooling. H2=hidrolisis 2 jam; D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10 U/g pati; AC=autoclaving-cooling 3 siklus; Delta= selisih antara nilai intensitas relatif pati garut alami dengan pati garut termodifikasi pada 2 tetra yang bersesuaian 127
11,27% dan 26,72%. Selain itu, ditemukan juga 2 puncak yang cukup besar yaitu pada 2 tetra 15,46o dan 23,54o. Kristalinitas tiap puncak dihitung untuk melihat puncak-puncak yang besar dan kecil yang berkontribusi terhadap kristanilitas dari pati. Selain itu dapat juga dilihat pada 2 tetra mana ditemukan puncak yang besar. Lopez-Rubio et al. (2008) menemukan 10 puncak pada kristalin tipe A, yaitu ditemukan 4 puncak yang besar pada 2 tetra (15,11o; 17,14o; 18,14o dan 23,68o). Frost et al. (2009) melaporkan bahwa pati jagung tinggi amilosa (80%) memiliki 8 puncak dengan puncak paling besar terdapat pada 2 tetra 17,1o.
128
V. SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan Pati garut yang diperoleh dengan cara ekstraksi basah memiliki kadar amilosa 24,64% dan amilopektin 73,46%. Hasil pengukuran dengan RVA menunjukkan bahwa pati garut alami memiliki profil gelatinisasi tipe A yang ditandai dengan nilai viskositas puncak yang cukup tinggi dan viskositas breakdown yang cukup tajam. Berdasarkan parameter kadar RS3 dan daya cerna pati in vitro, proses autoclaving-cooling yang terbaik dilakukan dengan pemanasan awal pada 80oC dan dilanjutkan dengan 3 siklus proses autoclaving pada suhu 121oC selama 15 menit dan pendinginan pada suhu 4oC selama 24 jam. Proses hidrolisis asam dilakukan dengan HCl 2,2N selama 2 jam pada suhu 35oC. Proses debranching dengan enzim pullulanase dengan konsentrasi 10,4 U/g pati pada 50oC selama 24 jam. Analisis GPC menunjukkan bahwa perlakuan modifikasi pati garut dengan autoclaving-cooling (AC), hidrolisis (H2), kombinasi hidrolisis dan autoclavingcooling (H2AC), kombinasi debranching 1,3 U/g pati atau 10,4 U/g pati dan autoclaving-cooling (D1AC dan D10AC), serta kombinasi hidrolisis, debranching dan autoclaving-cooling (H2D1AC dan H2D10AC) menyebabkan penurunan fraksi amilopektin dan peningkatan fraksi amilosa. Distribusi rantai linear baik dari hasil debranching amilopektin maupun hidrolisis amilosa yang diukur dengan menggunakan FACE menunjukkan empat rentang derajat polimerisasi (DP), yaitu 6-8; 9-12; 13-24 dan 25-30. Perlakuan modifikasi pati garut (AC, H2AC, D1AC, dan H2D1AC) meningkatkan DP 25-30 yang berkontribusi pada pembentukan RS3. Pada perlakuan debranching dengan konsentrasi enzim pullulanase 10,4 U/g pati (D10AC dan H2D10AC), peningkatan terjadi pada DP 11-12. Proses autoclaving-cooling dapat meningkatkan DP 6-8 dengan peningkatan yang cukup besar ditemukan pada pati garut dengan proses debranching konsentrasi tinggi (H2D10AC).
131
Semua perlakuan modifikasi pati garut di atas dapat meningkatkan kadar RS3 dan menurunkan daya cerna patinya. Kadar pati resisten tertinggi (39,30%) hasil modifikasi pati garut yang mendekati kadar pati resisten komersial (Novelose 330) diperoleh dari perlakuan hidrolisis asam, debranching dengan konsentrasi tinggi (10,4 U/g pati) dan autoclaving-cooling. Hasil analisis dengan menggunakan difraksi sinar X menunjukkan bahwa pati garut alami memiliki kristalin tipe A dan berubah menjadi kristalin tipe B setelah mengalami modifikasi untuk semua perlakuan kecuali pati garut yang hanya mengalami hidrolisis asam selama 2 jam. Perubahan tipe kristalinitas tersebut menyebabkan penurunan derajat kristalinitas. Hasil analisis kestabilan panas dengan DSC menunjukkan bahwa modifikasi pati garut dapat meningkatkan entalpi endotermik dan derajat retrogradasi. Analisis FTIR juga memperlihatkan bahwa modifikasi pati garut dapat meningkatkan bagian amorf melalui peningkatan nisbah bilangan gelombang 1022/995. Berdasarkan penelitian ini, maka dapat direkomendasikan bahwa kadar pati resisten (RS3) pati garut dapat ditingkatkan dengan proses modifikasi sebagai berikut: suspensi pati (20%b/b) dihidrolisis asam dengan HCl 2,2N selama 2 jam pada suhu 35oC, kemudian dilakukan pemanasan awal pada suhu 80oC selama 5 menit, perlakuan debranching dengan menggunakan enzim pullulanase 10,4 U/g pati. Selanjutnya pati garut tersebut diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit dan pendinginan pada suhu 4oC selama 24 jam (proses autoclaving-cooling dilakukan sebanyak 3 kali siklus). Proses modifikasi tersebut dapat menghasilkan kadar pati resisten sebesar 39,3% dan daya cerna pati sebesar 54,81%. 5.2 Saran Penelitian ini belum menghubungkan antara pati garut hasil modifikasi dengan indeks glikemik secara in vitro sebagai landasan dalam melakukan pengujian secara in vivo. Sampel pati garut yang dimodifikasi dengan cara hidrolisis asam, debranching (10,4 U/g) dan autoclaving-cooling berpotensi untuk diuji. Proses debranching pati garut dalam penelitian ini belum menggunakan enzim pullulanase yang optimum. Oleh karena itu, masih diperlukan penelitian lanjutan untuk memastikan konsentrasi enzim pullulanase yang dapat memotong 132
ikatan percabangan α-1,6 yang maksimal untuk menghasilkan amilosa rantai pendek yang lebih banyak. Peningkatan kadar RS3 dapat dilakukan melalui hidrolisis asam dan debranching dengan tahapan proses pencucian dengan air deionisasi atau etanol 80% sebelum dilakukan proses autoclaving-cooling. Hal tersebut dilakukan untuk mengurangi atau menghilangkan rantai linier glukan dengan DP<10 sehingga kemungkinan kadar RS3 dapat lebih meningkat. Pada penelitian ini distribusi rantai linear glukan hasil degradasi amilosa dan debranching amilopektin dianalisis dengan menggunakan FACE yang hanya dapat mendeteksi DP 6-30. Sebagian rantai B2 dengan DP 31-36 dan rantai B3 dengan DP>37 pada pati garut dapat diketahui dengan analisis menggunakan HPAE-PAD (High Performance Anion Exchange Chromatography-Pulse Amperometric Detection). Selain itu, bobot molekul amilosa dan amilopektin dapat diketahui dengan menggunakan SEC (Size Exclusion Chromatography). Perubahan bobot molekul baik amilosa maupun amilopektin selama proses modifikasi pati garut dengan hidrolisis asam dan atau debranching dan proses autoclavingcooling dapat diketahui dengan metode SEC tersebut. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa RS3 dari hasil modifikasi hidrolisis asam dengan HCl selama 2 jam masih lebih rendah bila dibandingkan dengan debranching. Penelitian lain melaporkan bahwa hidrolisis asam pada pati dapat juga dilakukan dengan menggunakan asam sitrat, asam laktat atau asam asetat untuk meningkatkan kadar RS3. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa kombinasi hidrolisis asam, debranching dan autoclaving-cooling yang dikombinasikan dengan modifikasi heat moisture treatment (HMT) dapat meningkatkan kadar RS3 yang sangat tinggi hingga mencapai 84% (Lehmann et al. 2002). Penelitian lanjutan diperlukan untuk mengetahui pengaruhnya pada pati garut. Penelitian ini belum dapat menjelaskan mekanisme penghambatan rantai linear glukan dengan DP<10 terhadap pembentukan RS3 dan mekanisme kompetisi antara kecepatan hidrolisis pati secara enzimatis dengan kecepatan pembentukan RS3 atau pati teretrogradasi selama proses pengukuran RS3 secara in vitro.
133
Analisis dengan NMR, difraksi sinar X, FTIR dan DSC dapat membantu untuk menjelaskan mekanisme tersebut. Hasil penelitian pengembangan R3 diharapkan dapat memberikan manfaat bagi peningkatan nilai tambah berbagai sumber pati lokal sebagai ingredien pangan, terutama untuk menghasilkan pati yang dapat memberikan sifat fisikokimia yang sesuai untuk proses pengolahan pangan dan sekaligus memberikan sifat fungsional bagi kesehatan. Adanya potensi pengembangan industri pati termodifikasi (RS3) diharapkan dapat mendorong usahatani sumber karbohidrat lokal yang dapat berdampak pada peningkatan kesejahteraan petani. Dukungan pemerintah dalam bentuk bantuan modal, pembinaan petani, dukungan kebijakan dan terbangunnya kemitraan antara petani dan produsen pati sangat diperlukan. Industri pati termodifikasi (RS3) dari umbi garut berpotensi untuk dikembangkan, karena umbi garut mengandung pati yang cukup tinggi sehingga dapat menghasilkan rendemen RS3 yang tinggi pula. Walaupun umur panen umbi garut cukup lama (9-10 bulan), tetapi tanaman garut dapat dibudidayakan sebagai tanaman tumpang sari. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, pati kacang merah pun dapat diproses menjadi RS3. Dengan kondisi modifikasi pati (hidrolisis asam, debranching dan autoclaving-cooling) yang mirip, pati garut dan kacang merah dapat menghasilkan konsentrasi RS3 yang hampir sama. Kacang merah memiliki umur panen yang relatif pendek (3-4 bulan), namun mengandung pati yang lebih rendah sehingga akan dihasilkan rendemen pati dan RS3 yang lebih rendah dibandingkan dengan umbi garut.
134
DAFTAR PUSTAKA AOAC. 1998. Official Methods of Analysis of the Association Analytical Chemistry Inc, Washington D.C. Anderson AK, Guraya HS, James C, Salvaggio L. 2002. Digestibility and pasting properties of rice starch heat-moisture treated at the melting Temperature (tm). Starch/Stärke 54: 401–409. Aparicio-Saguilan, Flores-Huicochea E, Tovar J, García-Suárez F, GutiérrezMeraz F, Bello-Pérez LA. 2005. Resistant starch-rich powders prepared by autoclaving of native and lintnerized banana starch: partial characterization. Starch/ Starke 57: 405-412. Apriyadi, MS. 2009. Modifikasi Pati Garut (Marantha arundinaceae L.) dengan Perlakuan Hidrolisis Asam dan Siklus Pemanasan-Pendinginan untuk Menghasilkan Pati Resisten Tipe III [Skripsi]. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Ariesta E, Setyono N, Ardiati, Rahmat S, Sofyan. 2004. Umbi-umbian yang Berjasa dan Terlupa. Simpul Pangan Yogja. Yayasan KEHATI. Yogyakarta. Bauer BA, Wiehie T, Knorr D. 2005. Impact of high hydrostatic pressure treatment on the resistant starch content of wheat starch. Starch/Starke 57: 124133. Belitz HD, Grosch W. 1999. Food Chemistry. Berlin: Springer Verlage. Bello-Perez LA, Ottenhof MA, Agama-Acevedo E, Farhat IA. 2005. Effect of storage time on the retrogradation of banana starch extrudate. Journal of Agriculture and Food Chemistry 53:1081-1086. Bird AR, Brown IL, Topping DL. 2000. Starches, resistant starches, the gut microflora and human health. Current Issues Intest. Microbial. 1(1): 25-37. Bjorck I, Nyman M, Pedersen P, Siljestrom M, Asp NG, Eggum BO. 1987. Formation of enzyme resistant starch during autoclaving of wheat starch: studies in vitro and in vivo. Journal of Cereal Science 6: 159–72. Buleon A, Colonna P, Planchot V, Ball S. 1998. Starch granules: structure and biosynthesis. International Journal of Biological Macromolecules 23: 85112. Champ M. 2004. Resistant Starch. Di dalam: Starch in Food. Woodhead Publishing Limited dan CEC Press LLC. Boca Raton. USA. Chen Z. 2003. Physicochemical Properties of Sweet Potato Starches and Their Application in Noodle Products [Thesis]. The Netherland Wageningen University. ChungYL, Lai HM. 2007. Properties of cast films made of HCl-methanol modified corn starch. Starch/Starke 59: 583-592. Chung HJ, Liu Q, Hoover R. 2009. Impact of annealing and heat-moisture treatment on rapidly digestible, slowly digestible and resistant starch levels 135
in native and gelatinized corn, pea and lentil starches. Carbohydrate Polymers 75: 436-447. Collado LS, Mabesa LB, Oates CG, Corke H. 2001. Bihon-type of noodles from heat-moisture treated sweet potato starch. Journal of Food Science 66(4): 604-609. Cooke D, Gidley MJ. 1992. Loss of crystalline and molecular order during starch gelatinization: origin of the enthalpy transition. Carbohydrate Research 227: 103-112. Cullity BD. 1978. Elements of X-ray Diffraction (Edisi 2). Reading, Massachusetts: Addison-Wesley Publishing Company, Inc. Donald AM, Waigh TA, Jenkins PJ, Gidley MJ, Debet M, Smith A. 1997. Internal structure of starch granules revealed by scattering studies. Di dalam: Frazier PJ, Donald AM, Richmond P. (Editor). Starch: Structure and Functionality. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, hlm. 172–179. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Calorimetric method for determination of sugars and related substance. Analytical Chemistry 28: 350-356. Edmonton TV, Saskatoon RSB. 1998. Enhancement of resistant starch III in amylomaize barley, field pea and lentil starches. Food Chemistry 4: 527532. Edwards A, Fulton DC, Hylton, CM, Jobling SA, Gidley M, Rossner U, Martin C, Smith M. 1999. A combined reduction in activity of starch synthases II and III of potato has novel effects on the starch of tubers. The Plant Journal 17: 251-261. Eerlingen RC, Crombez M, Delcour JA. 1993. Enzyme resistant starch I: quantitative and qualititative influence of inhibition time and temperature of autoclaved starch on resistant starch formation. Cereal Chemistry 70(3): 339334. Eerlingen RC, Delcour JA. 1995. Formation, analysis, structure and properties of type III enzyme resistant starch. Journal of Cereal Science 22: 129–38. Englyst HN, Kingman SM, Cummings JH. 1992. Classification and measurement of nutritionally important starch fractions. European Journal of Clinical Nutrition 46: 533-550. Espinosa-Solis V, Jaylin J, Bello-Perez LA. 2009. Physicochemical characteristics of starches from unripe fruits of mango and banana. Starch/Stärke 61: 291– 299. Faridah DN, Prangdimurti E, Adawiyah DR. 2008. Pangan Fungsional dari Umbi Suweg dan Garut: Kajian Daya Hipokolesterolemik dan Indeks Glikemiknya. Laporan Penelitian Hibah Bersaing, LPPM-IPB, Bogor. Ferrini LMK, Rochaa TS, Demiate IM, Franco CLM. 2008. Effect of acid-methanol treatment on the physicochemical and structural characteristics of cassava and maize starches. Starch/Stärke 60: 417-425.
136
Franco CML, Cabral RAF, Tavares DQ. 2002. Structural and physicochemical characteristics of lintnerized native and sour cassava starches. Starch /Starke 54: 469-475. French AD. 1972. Fine structure of starch and its relationship to the organization of the granules. Journal of Japanese Society Starch Science 19: 8-25. Frost K, Kaminski D, Kirwan G, Lascaris E, Shanks R. 2009. Crystallinity and structure of starch using wide angle X-ray scattering. Carbohydrate Polymers 78: 543–548. Gallant D, Bouchet B, Baldwin P. 1997. Microscopy of starch: evidence of a new level of granule organization. Carbohydrate Polymers 32: 177-191. García-Rosas M, Bello-Pérez A, Yee-Madeira H, Ramos G, Flores-Morales A, Mora-Escobedo R. 2009. Resistant starch content and structural changes in maize (Zea mays) tortillas during storage. Starch/Stärke 61: 414-421. Goñi L, García-Diaz L, Mañas E, Saura-Calixto F. 1996. Analysis of Resistant Starch : A Method for Food and Food Products. Elsevier Science Ltd. 56(4): 445-449. Gonzales-Soto RA, Agama-Acevedo E, Solorza-Feria J, Rendón-Villalobos R, Bello-Pérez LA. 2004. Resistant starch made from banana starch by autoclaving and debranching. Starch/Stärke 56: 495–499. Gonzales-Soto RA, Mora-escobedo R, Hernandez-Sanchez H, Sanchez-Rivera M, Bello-Perez LA. 2007. The influence of time and storage temperature on resistant starch formation from autoclaved debranched banana starch. Food Research International 40: 304–310. Goodfellow BJ, Wilson RH. 1990. A fourier transform IR study of the gelation of amylose and amylopectin. Biopolymers 30: 1183-1189. Gudmundsson M. 1994. Retrogradation of starch and the role of its components. Thermochimica Acta 246: 329-341. Hanashiro I, Takeda Y. 1998. Examination of number – average degree of polymerization and molar-based distribution of amylose by fluorescent labeling with 2-aminopyridine. Carbohydrate Research 306: 421-426. Hanashiro I, Tagawa M, Shibahara S, Iwata K, Takeda Y. 2002. Examination of molar-based distribution of A, B and C chains of amylopectin by fluorescent labeling with 2-aminopyridine. Carbohydrate Research 337: 1211-1215. Haralampu SG. 2000. Resistant starch—a review of the physical properties and biological impact of RS3. Carbohydrate Polymer 41: 285–92. Herawati D. 2009. Modifikasi Pati Sagu dengan Teknik Heat Moisture Treatment (HMT) dan Aplikasinya dalam Memperbaiki Kualitas Bihun [Tesis]. Sekolah Pasca Sarjana, IPB. Hickman BE, Janaswamy S, Yao Y. 2009. Autoclave and β-amylolysis lead to reduced in vitro digestibility of starch. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 2009(57): 7005–7012.
137
Hizukuri S, Kaneko T, Takeda Y. 1983. Measurement of the chain length of amylopectin and its relevance to the origin of crystalline polymorphism of starch granules. Biochimica et Biophysicia Acta. 760: 188–191. Hizukuri S. 1986. Polymodal distribution of the chain lengths of amylopectin and its significance. Carbohydrate Research 147: 342-347. Htoon A, Shrestha AK, Flanagan BM, Lopez-Rubio A, Bird AR, Gilbert EP, Gidley MJ. 2009. Effects of processing high amylose maize starches under controlled conditions on structural organisation and amylase digestibility. Carbohydrate Polymers 75: 236–245. Hoover R, Vasanthan T. 1994a. Effect of heat-moisture treatment on the structure and physicochemical properties of cereal, legume and tuber starches. Carbohydrate Research 252: 33-53. Hoover R, Vasanthan T. 1994b. The effect of annealing on the physicochemical properties of wheat, oat, potato and lentil starches. Journal of Food Biochemistry 17: 303-325. Imberty A, Bule´on A, Tran V, Perez S. 1991. Recent advances in knowledge of starch structure. Starch/Starke 43: 375–384. Jacobash G, Dongowski G, Schiemidl D, Schmehl KM. 2006. Hydrothermal treatment of novelose 330 results in high yield of resistant starch type 3 with beneficial prebiotic properties and decreased secondary bile acid formation in rats. British Journal of Nutrition 95: 1063-1074. Jane JI. 2004. Starch: Structure and Properties. CRC Press LLC. Jayakody L, Hoover R. 2002. The effect of lintnerization on cereal starch granules. Food Research International 35: 665-680. Jayakody L, Hoover R. 2008. Effect of annealing on the molecular structure and physicochemical properties of starches from different botanical origins – a review. Carbohydrate Polymers 74: 691–703. Karim AA, Norziah MH, Seow CC. 2000. Methods for the study of starch retrogradation. Food Chemistry 71: 9-36. Kay DE. 1973. Root Crops Tropical Product Institute. London: Foreign and Commonwealth Office. Kim, SK, Kwok JK, Kim WK. 2003. A simple method for estimation of enzymeresistant starch content. Starch/Starke 55: 366-368. Kim SK, Kwak JE. 2009. Formation of resistant starch in corn starch and estimation of its content from physicochemical properties. Starch/Stärke 61: 514–519. Koksel H, Masatcioglu T, Kahraman K, Ozturk S, Basman A. 2008a. Improving effect of lyophilization on functional properties of resistant starch preparations formed by acid hydrolysis and heat treatment. Journal of Cereal Science 47(2): 275-282. Koksel H, Ozturk S, Kahraman K, Basman A, Ozbas OZ, Ryu GH. 2008b. Evaluation of molecular weight distribution, pasting and functional properties, 138
and enzyme resistant starch content of acid-modified corn starches. Food Science and Biotechnology 17(4): 755-760. Lehmann U, Jacobasch G, Schmiedl D. 2002. Characterization of resistant starch type III from banana (Musa acuminata). Journal of Agriculture and Food Chemistry 50: 5236-5240. Lehmann U, Rossler C, Schmiedl D, Jacobash G. 2003. Production and physicochemical characterization of resistant starch type 3 derived from pea. Starch/Nahrung/Food 43: 60-63. Leong YH, Karim AA, Norziah MH. 2007. Effect of pullulanase debranching of sago (Metroxylon sagu) starch at subgelatinization temperature on the yield of resistant starch. Starch/Starke 59: 21-32. Leu RKL, Brown IL, Hu Y, Young GP. 2003. Effect of resistant starch on genotoxin-induced apoptosis, colonic epithelum, and luminal contents in rats. Carcinogenesis. 24(8): 1347-1352. Lingga PB, Sarwono F, Rahadi PC, Raharja JJ, Afistini, Rini W, Apriadi WH. 1986. Bertanam Umbi-umbian. Penebar swadaya. Jakarta. Liu Q, Thompson DB. 1998. Effects of moisture content with different initial heating temperature on retrogradation from different maize starches. Carbohydrate Research. 314: 221-235. Liu Q. 1997. Characterization of Physicochemical Properties of Starch from Various Potatoes and Other Sources, University Laval, Quebec City, Canada. Liu Q. 2005. Understanding Starches and their Role in Foods. Di dalam: Food Carbohydrates: Chemistry, Physical Properties and Applications. Cui SW (editor). RC Taylor & Francis, Boca Ratn FL. Longton J, LeGrys GA. 1981. Differential scanning calorimetry studies on the crystallinity of ageing wheat starch gels. Starch/Starke 33: 410-414. Lopez-Rubio A, Flanagan BM, Shrestha AK, Gidley MJ, Gilbert EP. 2008. Molecular rearrangement of starch during in vitro digestion: toward a better understanding of enzyme resistant starch formation in processed starches. Biomacromolecules 9: 1951–1958. Mahadevamma MS, Harish KVP, Tarathanan RN. 2003. Resistant starch derived from processed legumes: purification and structural characterization. Journal of Carbohydrate Polymers 54: 215-219. Meyer LH. 2003. Food Chemistry. Textbook Publisher, New York. Miao M, Jiang B, Zhang T. 2009. Effect of pullulanase debranching and recrystallization on structure and digestibility of waxy maize starch. Carbohydrate Polymers 76: 214–221. Moorthy SN. 2002. Physicochemical and functional properties of tropical tuber starches: a review. Starch/Starke 54: 559-592.
139
Morell MK, Samuel, MS, O’Shea MG. 1998. Analysis of starch structure using fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis. Electrophoresis 19: 2603-2611 Muchtadi D, Palupi NS, Astawan M. 1992. Petunjuk Laboratorium Metode Kimia Biokimia dan Biologi dalam Evaluasi Nilai Gizi Pangan Olahan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. Muhr AH, Blanshard JMV, Bates DR. 1984. The effect of lintnerization on wheat and potato starch granules. Carbohydrate Polymers 4: 399–425. Mujoo R and Ali SZ.1999. Molecular degradation of rice starch during processing to flakes. Journal of the Science of Food and Agriculture 79:941-949. Mumny P. 2000. Starch. Di dalam : Phillips GO, William PA (Editor). Handbook of Hydrocolloids. Boca Raton : CRC Press. Hlm. 41-65. Mun SH, Shin M. 2006. Mild hydrolysis of resistant starch from maize. Food Chemistry 96:115–121. Mutungi C, Rosta F, Onyangob C, Jarosa D, Rohma H. 2009. Crystallinity, thermal and morphological characteristics of resistant starch type III Produced by hydrothermal treatment of debranched cassava starch. Starch/Starke 61: 1-12. Nakamura Y, Sakurai A, Inaba Y, Kimura K, Iwasawa N, Nagamine T. 2002. The fine structure of amylopectin in endosperm from asian cultivated rice can be largely classified into two classes. Starch/Starke 54: 117-131. Naraya S, Moorthy. 2002. Physicochemical and functional properties of tropical tuber starches : A review. Starch/Starke 54: 559-592. Onyango C, Bley T, Jacob A, Henle T, Rohm H. 2006. Influence of incubation temperature and time on resistant starch type III formation from autoclaved and acid hydrolysed cassava starch. Carbohydrate Polymers 66: 494–499. Oostergetel GT, Bruggen EFJV. 1993. The Crystalline domains in potato starch granules are arranged in a helical fashion. Carbohydrate Polymers 21: 7–12. O'Shea MG, Samuel MS, Konik CM, Morell MK. 1998. Fluorophore-assisted carbo-hydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: effeciency of labelling and high-resolution separation. Carbohydrate Research 307: 1-12. Ottenhof MA, Hill SE, Farhat IA. 2005. Comparative study of the retrogradation of intermediate water content waxy maize, wheat, and potato starches. Journal of Agriculture and Food Chemistry 53: 631-638 Ozturk S, H Koksel, Kahraman K. 2009. Effect of debranching and heat treatments on formation and functional properties of resistant starch from highamylose corn starch. Eur Food Tes Technol 229: 115-125. Orford PD, Ring SG, Carroll V, Miles MJ, Morries V. 1987. The effect of concentration and botanical source on the gelation and retrogradation of starch. Journal of the Science of Food and Agriculture 39: 169-173.
140
Parker R. 2003. Introduction to Food Science. United States of America: Delmar, Thomson Learning. Perez E, Lares M. 2005. Chemical composition, mineral profile, and functional properties of canna (Canna edulis) and arrowroot (Maranta spp.) starches. Plant Foods for Human Nutrition. 60: 113–116. Pomeranz Y, Meloan CE. 2000. X-ray methods. In: Food Analysis: Theory and Practice (3rd ed). hlm. 158-171. Gaithersburg, Maryland: Aspen Publishers, Inc. Pongjanta J, Utaipattanaceep O, Naivikul, Piyachomkwan K. 2009a. Effect of preheated treatments on physicochemical properties of resistant starch type III from pullulanase hydrolysis of high amylose rice starch. American Journal of Food Technology 4(2): 79-89. Pongjanta J, Utaipattanaceep O, Naivikul, Piyachomkwan K. 2009b. Debranching enzyme concentration effected on physicochemical properties and αamylase hydrolysis rate of resistant starch type III from amylose rice starch. Carbohydrate Polymers 78: 5–9. Raja MKC, Shindu P. 2000. Properties of starch-treated arrowroot (Marantha arundinacea) starch. Starch/Starke 52: 471-476. Ranhotra GS, Gelroth JA, Astroth K, Eisenbraun GJ. 1991. Effect of resistant starch on intestinal responses in rats. Cereal Chemistry 68(2): 130–132. Ratnayake WS, Hoover R, Warkentin T. 2002. Pea starch: composition, structure and properties: a review. Starch/Starke 54: 217-234. Ridal S. 2003. Karakterisasi Sifat Fisikokimia Tepung dan Pati Talas (Colocasia escilenta Crantz.) dan Kimpul (Xanthosoma Sp.) dan Uji Penerimaan αAmilase terhadap Patinya [Skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian IPB. Bogor. Robin JP, Mercier C, Charbonniere R, Guilbot. A. 1974. Lintnerized starches gel filtration and enzymatic studies of insoluble residues from prolonged acid treatment of potato starch. Cereal Chemistry 51: 389-406. Rudiyanto BI, Setiawan and Saptomo SK. 2006. Algorithm of kalman filter for smoothing measurement data. Jurnal Keteknikan Pertanian 20: 287-292. Sajilata MG, Singhal RS, Kulkarni PR. 2006. Resistant starch: a review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. Vol. 5. Sastrapradja S, Soetjipto NW, Danimihardja S, Soejono R. 1977. Ubi-Ubian. Bogor : Lembaga Biologi Nasional. LIPI. Balai Pustaka. Schenz TW, Davis EA. 1998. Thermal Analysis. In Nielsen SS. (Ed.). Food Analysis (2nd ed, hlm. 587-598). Gaithersburg, Maryland: Aspen Publishers, Inc. Schmiedl D, Bauerlein M, Bengs H, Jacobasch G. 2000. Production of heatstable, butyrogenic resistant starch. Carbohydrate Polymers 43: 183-193 Schoch TJ, Maywald E. 1968. Preparation and properties of various legume starches. Cereal Chemistry 45: 564-573.
141
Sevenou A, Hill SE, Farhat IA, Mitchell JR.2002. Organisation of the external region of the starch granule as determined by infrared spectroscopy. International Journal of Biological Macromolecules 31: 79-/85. Shin S, Byun J, Park KW, Moon TW. 2004. Effect of partial acid and heat moisture treatment of formation of resistant tuber starch. Journal of Cereal Chemistry 81(2): 194-198. Shu X, Jia L, Gao J, Sing Y, Zhao H, Nakamura Y, Wu D. 2007. The influence of chain length of amilopectin on resistant starch in rice (Oryza sativa L). Starch/Starke 59: 504-509. Silverio J, H Fredriksson, R Andersson, AC Eliasson and P Aman. 2000. The effect of temperature cycling on the amylopectin retrogradation of starches with different amylopectin unit-chain length distribution. Carbohydrate Polymers 42: 175–184. Singh N, Raina CS, Bawa AS, Saxena DC. 2005a. Effect of heat moisture treatment and acid modification on rheological, textural and differential scanning calorimetry characteristics of sweetpotato starch. Journal of Food Science 70(6): 373-378. Singh N, Inouchi N, Nishinari K. 2005b. Morphological, structural, thermal and rheological characteristics of starches separated from apples of different cultivars. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53: 10193-10199. Singh V, Ali SZ. 2000. Acid degradation of starch. The effect of acid and starch type. Carbohydrate Polymers 41: 191–195. Singh N, Isono N, Srichuwong S, Noda T, Nishinari K. 2008. Structural, thermal and viscoelastic properties of potato starches. Food Hydrocolloids 22(6): 979-988. Slade L, Levine H. 1987. Recent Advances in Starch Retrogradation. In: Industrial Polysaccharides. Stilva SS, Crescenzi V dan Dea ICM (editor). Gordon and Breach Sci, New York, hlm. 387-430. Slijestrom M, Elliason AC, Bjork I. 1989. Characterization of resistant starch from autoclaved wheat starch. Starch/Starke 41(4): 147-151. SNI. 1992. Cara uji makanan dan minuman. Badan Standarisasi Nasional. Jakarta Srichuwong S, Sunarti TC, Mishima T, Isono N, Hisamatsu M. 2005a. Starches from different botanical sources I: contribution of amylopectin fine structure to thermal properties and enzyme digestibility. Carbohydrate Polymers 60(4): 529-538. Srichuwong S, Sunarti TC, Mishima T, Isono N, Hisamatsu M. 2005b. Starches from different botanical sources II: contribution of starch structure to swelling and pasting properties. Carbohydrate Polymers 61(1): 25-34. Srichuwong S. 2006. Starches from Different Plant Origins: From Structure to Physicochemical Properties [Disertasi]. Mie University. Japan. Stute R. 1992. Hydrothermal Modification of Starches: The difference between annealing and heat/moisture-treatment. Starch/Stärke 44: 205-214. 142
Sunarti TC, Nunome N, Yashio, Hisamatsu M. 2001. Study on outer chains from amylopectin between immobilized and free debranching enzymes. Journal Applied Glycoscience 48(1): 1-10. Szczodrak J, Pomeranz Y. 1991. Starch and enzyme-resistant starch from highamylose barley. Cereal Chemistry 68(6): 589–96. Taggart P. 2004. Starch as Ingredients: Manufacture and Applications. Di dalam: Eliason AC (editor). Starch in Food: Structure, Function, and Application. CRC Press, Baco Raton, Florida. Takeda Y, Guan HP, Preiss J. 1993. Branching of amylase by the branching isoenzymes of maize endosperm. Carbohydrate Research 240: 253-263. Takeda Y, Hanashiro M. 2003. Examination of the structure of amylase and amylopectin by fluorescent labeling terminal. Journal of Applied Glycoscience. 48: 123-130. Tang H, Ando H, Watanabe K, Takeda Y, Mitsunaga T. 2001. Physicochemical properties and structure of large, medium and small granule starches in fractions of normal barley endosperm. Carbohydrate Research 330: 241248. Tester RF, Debon SJJ. 2000. Annealing of starch - a review. International Journal of Biological Macromolecules 27: 1–12. Tester RF, Karkalas J. 2002. Starch. Di dalam: Steinbuchel A, Vandamme EJ, De Baets S, Steinbuchel A. (Editor). Biopolymers, Volume 6. Polysaccharides. II. Polysaccharides from Eukaryotes. Weinheim: Wiley–VCH, hlm. 381438. Vasanthan T, RS Bhatty. 1998. Enhancement of resistant starch III in amylomaize barley, field pea and lentil starches. Starch/Stärke 50: 286-291. Vasanthan T, Edmonton, Bhatty RS, Saskatoon. 1998. Enhancement of resistant starch (RS3) in amylomaize, barley field pea and lentil starches. Starch/ Starke 50: 286-291. Villamajor Jr FG, Jurkema J. 1996. Maranta arundinacea L. Di dalam: Plants Yielding Non-seed carbohydrate. Prosea. 9: 113-116. Waigh TA, Gidley MJ, Komanshek BU, Donald AM. 2000. The phase transformations in starch during gelatinisation: a liquid crystalline approach. Carbo-hydrate Research 328: 165–17. Wang TL, Bogracheva TY, Hedley CL. 1998. Starch: as simple as A, B, C? Journal of Experimental Botany 49: 481-502. Wang YL, Truongb VD, Wang L. 2003. Structures and rheological properties of corn starch as affected by acid hydrolysis. Carbohydrate Polymers 52: 327– 333. Wattanacant S, Muhammad SKS, Hasyim DM, Rahman RA. 2002. Characterization of hydroxypropylated crosslinked sago starch as compared to commercial modified starches. Songklanakarin Journal Science and Technology 24(3): 439-450. 143
Whisler RL, BeMiller JN. 1997. Starch. In RL Whisler and JN BeMiller (Editor). Carbohydrate Chemistry for Food Scientists. St Paul: American Association of Cereal Chemists, hlm. 117-151. Wursch P. 1999. Production of Resistant Starch. Di dalam: Complex Carbohydrate in Foods. Cho S, Prosky L, Dreher ML (editor). Marcel Dekker, New York, hlm. 385. Wurzburg OB. 1989. Modified Starches: Properties and Uses. Boca Raton: CRC Press. Yustiareni E. 2000. Kajian Substitusi Terigu oleh Tepung Garut dan Penambahan Tepung Kedelai pada Pembuatan Mie Kering [Skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Zabar S, Shimoni E, Peled HB. 2008. Development of nanostructure in resistant starch type III during thermal treatments and cycling. Journal of Macromolecule Bioscience 8: 163-170. Zeleznak KJ, Hoseney RC. 1986. The role of water in the retrogradation of wheat starch gels and bread crumb. Cereal Chemistry 32: 33-50. Zhao XH, Lin Y. 2009. The impact of coupled acid or pullulanase debranching on the formation of resistant starch from maize starch with autoclaving–cooling cycles. European Food Research Technology 230: 179–184. Zobel HF. 1988. Starch crystal transformations and their industrial importance. Starch/Starke 40: 1-7. Zobel HF. 1992. Starch Granule Structure. Di dalam: Developments in Carbohydrate Chemistry. Alexander A, Zobel HF (editor). The American Association of Cereal Chemistry, St. Paul, MN. 1-36.
144
Lampiran 1a. Difraktogram difraksi sinar X pada pati garut alami, pati yang diberi perlakuan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus (AC), dan pati yang dihidrolisis asam selama 2 jam dan autoclavingcooling sebanyak 3 siklus (H2AC)
Lampiran 1b. Difraktogram difraksi sinar X pada pati garut yang diberi perlakuan debranching dan autoclaving-cooling sebanyak 3 siklus. D1 D1=debranching debranching 1,3 U/g pati, D10 D10=debranching debranching 10,4 U/g pati
Lampiran 1c. Difraktrogram difraksi sinar X pada pati garut yang diberi kombi-nasi perlakuan hidrolisis asam 2 jam, debranching dan 3 siklus autoclaving cooling. H2=hidrolisis asam 2 jam; D1= debranching deb anching 1,3 ,3 U/g ppati;; D10=debranching 0 deb anching 100 U/g ppati;; AC=3 C 3 siklus auto-claving-cooling
Lampiran 2a. Kurva difraktogram dari hasil pemodelan persamaan Lorentz dan Gaussian. H2=hidrolisis 2 jam
Pati Garut Alami
H2
Lampiran 2b. Kurva difraktogram dari hasil pemodelan persamaan Lorentz dan Gaussian. H2=hidrolisis 2 jam; D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati; AC=autoclaving-cooling 3 siklus ikl
AC
H2AC
Lampiran 2c. Kurva difraktogram dari hasil pemodelan persamaan Lorentz dan Gaussian. D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati; AC=autoclaving-cooling 3 siklus
D1AC
D10AC
Lampiran 2d. Kurva difraktogram dari hasil pemodelan persamaan Lorentz dan Gaussian. H2=hidrolisis 2 jam; D1=debranching 1,3 U/g pati; D10= debranching 10,4 U/g pati; AC=autoclaving-cooling 3 siklus
H2D1AC
H2D10AC
Lampiran 3. Contoh kurva kristalinitas setiap peak pada pati garut alami
Lampiran 4. Hasil uji korelasi antar parameter analisis Correlations Parameter
Gula pere- RS3 duksi (%) (%)
Pearson Gula pereduksi Correlation
.918**
-.737
-.042
.657
-.657
.004
.059
.928
.109
.109
7
7
7
7
7
7
.918**
1
-.777*
.219
.678
-.660
.040
.638
.094
.107
1
Sig. (2-tailed) N RS3
Pearson Correlation Sig. (2-tailed) N
7
7
7
7
7
-.737
.777*
1
-.063
-.590
.794*
.059
.040
.892
.163
.033
7
7
7
7
7
7
Pearson Correlation
-.042
.219
-.063
1
-.286
.015
Sig. (2-tailed)
.928
.638
.892
.534
.975
7
7
7
7
7
7
Pearson Correlation
.657
.678
-.590
-.286
1
-.554
Sig. (2-tailed)
.109
.094
.163
.534
7
7
7
7
7
7
Pearson Correlation
-.657
-.660
.794*
.015
-.554
1
Sig. (2-tailed)
.109
.107
.033
.975
.196
7
7
Sig. (2-tailed) N
N Amorfos
N Kristalinitas
.004 7
Daya cerna Pearson Correlation
Kristalin
Daya Kristalicerna Kristalin Amorfos nitas (%) (%)
N 7 7 7 ** Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed) * Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed)
.196
7
153
