JURNAL AGROTEKNOS Nopember 2011 Vol. 1 No. 2. Hal 141-146 ISSN: 2087-7706
PERBANYAKAN BIBIT JERUK SECARA IN-VITRO DAN BEBAS PENYAKIT CVPD Propagation of Citrus Stocks Through In-Vitro, and Free of CVPD TEGUH WIJAYANTO1*), MUH. TAUFIK1), DIRVAMENA BOER1), DAN NI WAYAN S. SULIARTINI1) 1)Jurusan
Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo, Kampus Bumi Tridharma Anduonohu Kendari
ABSTRACT Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD) is one of the most important diseases of citrus. Worldwide and national yield losses of citrus production due to this disease infection have been very significant. This research ultimately aimed at producing citrus stocks through in-vitro culture, and free of CVPD. Citrus seeds were used as explant and cultured on MS and WPM in-vitro media, supplemented with malt extract. Citrus plantlets were tested for the presence of CVPD DNA using CVPD specific primers in PCR reactions. Research results showed that MS basal medium supplemented with malt extract was quite good for invitro production of citrus plantlets. Plantlets were negative for CVPD infection based on PCR tests. CVPD-free seedlings (Citrus reticulata) have been grafted with citrus rootstock (Citrus sinensis). Grafted citrus seedlings were also proven to be negative for CVPD infection based on similar PCR tests. Citrus seedlings/stocks produced by in-vitro culture, and free of CVPD, are now available for further growth. Keywords: Citrus Vein Phloem Degeneration (CVPD), in-vitro culture, PCR
5
PENDAHULUAN
Sulawesi Tenggara telah menjadi salah satu daerah penyangga untuk memenuhi kebutuhan jeruk di dalam negeri. Namun demikian, dalam budidaya jeruk terdapat kendala dan ancaman yang cukup serius yaitu adanya serangan penyakit CVPD (Citrus Vein Phloem Degeneration). Penularan penyakit CVPD dapat melalui bibit jeruk, baik yang diperbanyak secara grafting maupun dengan mata tempel. Di Indonesia, CVPD menyerang pertanaman jeruk hampir di seluruh propinsi, dengan kehilangan hasil yang sangat signifikan (Wirawan et al., 2004). Di Sulawesi Tenggara peluang ancaman terjadinya outbreak CVPD pada tahun-tahun mendatang semakin terbuka, dengan telah ditemukannya gejala penyakit CVPD di lapangan (Taufik et al., 2008).
Alamat korespondensi: E-mail:
[email protected] *)
Berkembangnya teknologi seperti kultur jaringan tanaman sampai rekayasa genetika, dan teknik deteksi menggunakan enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) (Clark dan Adams, 1977) dan Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat membantu deteksi dini keberadaan patogen di lapang. Dengan teknik PCR ini, Taufik et al. (2008) membuktikan keberadaan CVPD di Sulawesi Tenggara. Selama penelitian berlangsung tidak ditemukan adanya serangga vektor CVPD yaitu Diaphorina citri. Kuat dugaan bahwa penyebaran CVPD di lapangan melalui bibit yang tidak bebas CVPD (Taufik et al., 2009). Penelitian awal perbanyakan jeruk secara invitro juga telah dilakukan dengan hasil yang cukup baik (Taufik et al., 2010). Didasari oleh penelitian tersebut maka tujuan penelitian ini adalah untuk menghasilkan metode perbanyakan tanaman jeruk secara in-vitro dan bebas CVPD melalui deteksi PCR, yang diharapkan juga dapat membantu kebutuhan bibit sehat bagi petani jeruk di Sulawesi Tenggara
142
WIJAYANTO ET AL.
BAHAN DAN METODE Penelitian ini terdiri dari dua tahapan utama, yaitu (1) produksi bibit (plantlet) jeruk secara in-vitro yang bebas CVPD dan diaklimatisasi di rumah kasa; (2) perbanyakan bibit jeruk dan penyambungan entris jeruk bebas CVPD asal kultur in-vitro. Perbanyakan Jeruk Bebas CVPD secara In-vitro dan Aklimatisasi Plantlet. Penelitian ini sebagian besar dilaksanakan di Laboratorium in-vitro dan rumah kasa Jurusan Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Haluoleo. Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah biji jeruk keprok (C. reticulata), diantaranya jeruk keprok Siompu (khas Sulawesi Tenggara), dan jeruk siam (C. sinensis). Pada tahap awal penelitian dicobakan medium dasar MS dan WPM, dengan didasari percobaan pendahuluan yang dilakukan Taufik et al. (2009), dengan berbagai modifikasi untuk meningkatkan efisiensi. Secara umum prosedur kerja dalam penelitian ini adalah: sterilisasi alat dan media dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1210C, tekanan 15 psi selama 15-20 menit. Eksplan diperoleh dari biji jeruk keprok/siam. Biji jeruk yang akan ditanam dalam media dikupas dan disterilkan. Sterilisasi eksplan dilakukan tiga tahap, yakni : 1) disterilkan dengan alkohol 70% selama 2-3 menit; 2) disterilkan 2 kali dengan 50 : 50 bayclin (sodium hipoklorit 5.25%) + Tween selama minimal 5 menit; 3) dibilas dengan aquadest steril sebanyak tiga kali. Setelah sterilisasi, biji jeruk tersebut dikeringanginkan dan ditanam dalam media (MS atau WPM, sesuai percobaan), yang diberi pemadat bubuk agar 8 g.L-1, keasaman media sekitar pH 5,7. Dalam penelitian juga dicobakan penambahan malt extract, BA, maupun amoxycillin untuk menekan kontaminasi. Media dituang ke dalam botol kultur sebanyak 20 mL dan selanjutnya disterilkan dalam autoklaf pada
J. AGROTEKNOS
suhu 1210C, tekanan 15 psi selama 15-20 menit. Penanaman eksplan dilakukan dalam laminair air flow cabinet yang sudah disterilkan. Botol yang telah diisi eksplan diletakkan pada rak kultur. Suhu ruang kultur diupayakan sekitar 250C. Lampu fluorescent digunakan sebagai sumber cahaya dalam ruang kultur. Parameter yang diamati meliputi : persentase tumbuh (%), tinggi tanaman, jumlah daun, dan panjang akar. Penyiapan Batang Bawah dan Penyambungan Entris bebas CVPD. Jeruk keprok yang telah diperbanyak secara in-vitro dan bebas CVPD digunakan sebagai entris. Entris disambung (grafting) dengan batang bawah yang telah dipersiapkan. Batang bawah (rootstock) adalah jeruk siam (C. Sinensis), yang diketahui toleran terhadap berbagai penyakit dan memiliki sistem perakaran yang baik. Perbanyakan batang bawah dilakukan dengan menanam biji langsung dilapangan (polibag), atau secara invitro. Planlet jeruk hasil kultur jaringan (batang bawah dan batang atas) dan bibit jeruk hasil penyambungan dideteksi keberadaan CVPD dengan menggunakan teknik PCR. Teknik ekstraksi DNA dan prosedur PCR dilakukan berdasarkan teknik yang sebelumnya telah kami kembangkan (Taufik et al., (2010) dan teknik yang digunakan oleh Himawan et al. (2010).
HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan Medium Tumbuh Perkecambahan In-vitro Jeruk. Untuk pertumbuhan dan perbanyakan jeruk secara in-vitro, maka penting untuk menentukan dan menguji terlebih dahulu jenis dan komposisi medium yang tepat. Hasil jenis media yang dapat digunakan untuk menumbuhkan eksplan biji jeruk dapat dilihat pada Tabel 1 (Percobaan I) berikut:
Tabel 1. Presentase tumbuh eksplan jeruk in-vitro dan perkembangan plantlet 2 MST Medium
Jumlah Biji
Persentase Presentase (%) plantlet, dengan Tumbuh Tunas (daun) & Akar saja Tunas (daun) (%) 2MST akar saja MS 24 41.6 25.0 16.7 0 MS(m) 24 62.5 (79.2) * 29.2 29.2 4.2 MS(m) + BA 24 58.3 0 58.3 0 WPM(m) 54 70.3 (74) * 25.9 44.4 0 Keterangan: *) Angka dalam kurung menunjukkan presentase tumbuh (%) 8 MST
Vol. 1 No.3, 2011
Perbanyakan Bibit Jeruk Secara In-Vitro dan Bebas CVPD
Dari hasil Percobaan I (Tabel 1) diatas, terlihat bahwa media dasar yang diberi malt extract tanpa zat pengatur tumbuh BA, yaitu medium MS(m) dan WPM(m) memberikan
143
hasil yang lebih baik. Untuk lebih meyakinkan, maka dilakukan percobaan lanjutan (Percobaan II), yang hasilnya terlihat di Tabel 2 berikut.
Tabel 2. Presentase tumbuh eksplan jeruk in-vitro dan perkembangan plantlet 3 MST Medium Dasar
Jumlah Biji
Persentase Presentase (%) plantlet, dengan Tumbuh (%) Tunas (daun) & Akar saja Tunas (daun) 3 MST akar saja MS(m) 54 (24) * 87.5 70.8 16.7 0 WPM(m) 58 (42) * 73.8 28.6 45.2 0 Keterangan: *) Angka dalam kurung menunjukkan explan sehat, tidak terkontaminasi
Penggunaan medium MS (m), yaitu medium MS yang ditambahkan malt extract, menghasilkan persentase tumbuh 87% (Tabel 2, Gambar 2); lebih besar dibandingkan dengan bila ditumbuhkan pada medium WPM (m), yang hanya 73.8%. Demikian juga, persentase plantlet yang memiliki tunas (daun) dan akar jauh lebih besar pada medium
MS (m), yaitu 70.8%, dibanding pada medium WPM (m), yang hanya 28.6%. Medium MS (m) juga memberikan rata-rata jumlah daun dan tinggi plantlet (3 MST) yang lebih baik dibanding dengan medium WPM (m). Data rata-rata jumlah daun dan tinggi plantlet pada kedua media tersebut, dapat dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 2.
Tabel 3. Rata-rata jumlah daun dan tinggi plantlet jeruk umur 3 MST Medium Dasar
Jumlah Plantlet yang diamati 24 42
MS(m) WPM(m)
Rata-Rata Jumlah Daun (helai) 1.79 0.33
A
B
Rata-Rata Tinggi Plantlet (cm) 1.29 0.49
C
Gambar 2. Perkembangan plantlet: A) plantlet jeruk di medium MS(m) sekitar umur 5 MST, B) plantlet jeruk di medium MS(m) sekitar umur 7 MST, dan C) plantlet jeruk di medium MS(m) sekitar umur 9 MST
A
B
C
Gambar 3. Bibit jeruk (C. sinensis) untuk batang bawah. (A) Bibit jeruk yang masih dalam medium kultur in-vitro, (B) bibit jeruk asal kultur in-vitro yang sedang diaklimatisasi, dan (C) bibit jeruk yang dikecambahkan langsung dalam polibag
Penyiapan Batang Bawah untuk Penyambungan Entris. Perbanyakan batang bawah (C. sinensis) dilakukan baik secara in
vitro maupun penanaman langsung (perkecambahan), pada media tanam dalam polibag (Gambar 3).
144
WIJAYANTO ET AL.
J. AGROTEKNOS
Penyambungan entris (batang atas) pada batang bawah. Bibit jeruk keprok yang telah dihasilkan secara in-vitro digunakan sebagai batang atas atau entris (scion materials), yang disambungkan ke batang bawah yang juga telah disiapkan (Gambar 4). Karena tingkat kesulitan dan kontaminasi yang tinggi dan tingkat keberhasilan yang
(A)
(B )
(C)
(D)
masih sangat rendah dari penyambungan invitro (micrografting), maka sebagian besar penyambungan dilakukan secara langsung (grafting). Bibit hasil sambungan dipelihara dengan ditutup plastik pembungkus selama beberapa hari agar kelembaban terjaga, sampai bibit benar-benar tumbuh baik.
Gambar 4. Penyambungan (grafting) antara batang bawah (jeruk siam) dengan batang atas (jeruk keprok) hasil kultur in-vitro. (A) bibit jeruk yang baru selesai disambung, (B) ditutup dengan kantong plastik selama beberapa hari agar tetap lembab, (C) dan (D) bibit jeruk hasil sambungan mulai tumbuh normal.
Deteksi CVPD dengan Teknik PCR. Hasil PCR dengan primer OI1 dan OI2c (Taufik et al., 2010), tidak menghasilkan produk PCR CVPD, dengan demikian dapat dikatakan bahwa semua sampel yang diuji negatif untuk penyakit CVPD (Gambar 5). Produk PCR yang diharapkan untuk menggunakan kedua primer diatas adalah sekitar 1000 pasang basa (bp). M
1
2
3
4
Demikian pula menggunakan metode Himawan et al. (2010) diperoleh hasil yang sama, semua sampel yang diuji (1-10) tidak mengandung CVPD (Gambar tidakl ditampilkan). Produk PCR yang diharapkan dengan primer yang digunakan Himawan et al. (2010 adalah sekitar 600 pasang basa (bp).
5
6
7
8
9
10
1000 bp
Gambar 5. Semua sampel daun jeruk yang diuji (nomor 2 - 10) negatif atau tidak mengandung CVPD DNA. Sumuran M: marker DNA 100 bp (Fermentas); Sumuran 1 : kontrol negatif CVPD (akuabides)
Vol. 1 No.3, 2011
Perbanyakan Bibit Jeruk Secara In-Vitro dan Bebas CVPD
Kultur jaringan menawarkan alternatif penyediaan bibit yang secara potensial lebih cepat, sehat dan bebas penyakit. Dalam perbanyakan secara in-vitro, pemilihan eksplan, penentuan medium tumbuh, dan pemberian zat pengatur tumbuh atau unsur tertentu sangat perlu diperhatikan karena akan mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan eksplan (Moore, 1986). Perlakuan medium MS dengan ditambahkan malt extract terbukti meningkatkan persentase perkecambahan invitro, penambahan jumlah daun dan tinggi plantlet tanaman jeruk dibandingkan dengan perlakuan medium WPM (Tabel 1, 2, dan 3) (Wijayanto et al., 2010; Wijayanto, 2011). Kandungan zat pengatur tumbuh dan hara yang cukup dalam malt extract kemungkinan ikut memicu pertumbuhan vegetatif tanaman jeruk yang ditumbuhkan secara in-vitro (Gambar 2). Meskipun belum diperoleh teknik/medium aklimatisasi yang optimum, namun beberapa plantlet jeruk yang ditumbuhkan secara invitro telah berhasil diaklimatisasi di media arang sekam (sekitar 40-50%). Penelitian lanjutan perlu dilakukan untuk mendapatkan media atau perlakuan aklimatisasi yang lebih baik untuk meningkatkan presentase keberhasilan tahap aklimatisasi ini. Menggunakan sepasang primer spesifik dari sekuen DNA bakteri CVPD, telah dilakukan pengujian menggunakan teknik PCR, seperti juga telah dilakukan oleh beberapa peneliti terdahulu (Jagoeuix et al., 1994; Dwiastuti et al., 2001; dan Taufik et al., 2010). Hasil pengujian PCR berdasarkan metode Taufik et al. (2010) berhasil membuktikan bahwa plantlet jeruk yang dihasilkan tidak menghasilkan pita DNA CVPD setelah proses PCR dan elektroforesis
SIMPULAN Berdasarkan hasil penelitian dan pengamatan yang telah dilakukan, maka dapat ditarik beberapa kesimpulan, antara lain: 1. Medium dasar Murashige & Skoog (MS) tanpa ZPT memberikan perkecambahan dan pertumbuhan biji jeruk secara in-vitro yang lebih baik dibanding medium Woody Plant Medium (WPM), serta penambahan malt extract memberikan pengaruh positif
145
(Gambar 5). Hal ini mengindikasikan bahwa plantlet jeruk yang dihasilkan secara in-vitro bebas dari infeksi CVPD. Hasil ini juga menguatkan hipotesis bahwa CVPD tidak terbawa benih. Bibit jeruk (C. sinensis) yang berasal dari perkecambahan langsung (pada medium tanah dalam polibag) maupun dari kultur invitro, telah digunakan sebagai batang bawah untuk penyambungan (Gambar 4). Bibit jeruk keprok yang telah dihasilkan secara in-vitro digunakan sebagai entris, yang disambungkan ke batang bawah. Karena tingkat kesulitan dan kontaminasi yang tinggi dan tingkat keberhasilan yang masih sangat rendah dari penyambungan secara in-vitro (micrografting), maka sebagian besar penyambungan pada penelitian ini dilakukan secara langsung (grafting). Meskipun dari penelitian ini telah diperoleh bibit jeruk hasil sambungan (yang saat ini sekitar 50 bibit sambungan), namun perbaikan teknik dan kondisi penyambungan masih perlu dilakukan untuk meningkatkan persen keberhasilan penyambungan (grafting), yang masih sekitar 50%. Bibit hasil penyambungan dipelihara, yang pada tahap awal ditutup plastik pembungkus selama beberapa hari untuk menjaga kelembaban, sampai bibit benar-benar tumbuh baik. Untuk memastikan bibit hasil sambungan benar-benar bebas CVPD, maka kembali dilakukan deteksi CVPD pada bibit jeruk setelah penyambungan, dengan teknik PCR. Seperti hasil pengujian sebelumnya, hasil pengujian PCR berdasarkan metode Himawan et al. (2010) juga berhasil membuktikan bahwa bibit jeruk hasil sambungan tidak menghasilkan pita DNA CVPD setelah proses PCR dan elektroforesis (Gambar 6). Hal ini kembali menunjukkan bahwa bibit jeruk tersebut bebas dari infeksi CVPD. bagi perkecambahan dan pertumbuhan biji jeruk secara in-vitro. 2. Perlunya perbaikan teknik aklimatisasi bagi plantlet jeruk hasil kultur in-vitro. 3. Bibit jeruk siam (C. sinensis) sebagai batang bawah telah berhasil disambung (grafting) dengan bibit jeruk keprok (C. reticulata) hasil kultur in-vitro, meskipun tingkat keberhasilannya (sekitar 50%) masih perlu ditingkatkan. 4. Penyambungan secara micrografting belum memberikan hasil yang
146
WIJAYANTO ET AL.
memuaskan, dan perlu penelitian lebih lanjut. 5. Hasil pengujian PCR membuktikan bahwa planlet jeruk yang dihasilkan secara invitro maupun bibit jeruk hasil penyambungan tidak mengandung DNA CVPD, yang mengindikasikan bahwa bibit jeruk yang dihasilkan bebas dari infeksi CVPD.
UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih terutama disampaikan kepada Proyek DP2M Dikti Kemdiknas yang telah mendanai kegiatan penelitian Hibah Bersaing ini selama 2 (dua) tahun: 2010 dan 2011, sesuai dengan Surat Perjanjian Penelitian Hibah Penelitian, No: 026/SP2H/PP/DP2M/III/2010 dan Surat Perjanjian Pelaksanaan Pekerjaan No: 641/PK-UPT/UNHALU/2011.
DAFTAR PUSTAKA Balai Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura (BPTPH), 2007. Laporan Tahunan Balai Proteksi Tanaman Pangan dan Hortikultura, Sulawesi Tenggara Clark, M.F., and A.N. Adams, 1977. Characteristics of the microplate method of ELISA for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34: 475-483. Dwiastuti, M.E., 2001. Perkembangan deteksi penyakit CVPD jeruk di Indonesia, Aplikasi dan Implikasi Pengendaliannya. Makalah Seminar dan Pameran Nasional dan Hortikultura,Universitas Brawijaya. 7 – 11 Nov. 2001. Himawan, A., Y.B. Sumardiyono, S. Somowiyarjo, Y.A. Trisyono, dan A. Beattie, 2010. Deteksi menggunakan PCR candidatus Liberibacter asiaticus, penyebab huanglongbing pada jeruk siem dengan beberapa tipe gejala pada daun. J. Hama dan Penyakit Tumbuhan Tropika 10 (2): 178-183. Hoy, M.A., A. Jeyaprakash, and R. Nguyen, 2001. Long PCR is a sensitive method for detecting Liberobacter asiaticum in parasitoids undergoing risk assessment in quarantine. Biol. Control 22: 278-287. Jagoeuix, S., J.M. Bove, and M. Garnier, 1994. The Phloem limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the -
J. AGROTEKNOS
subdivision of the proteobacter. Int. J. of Syst. Bacteriology 44:379-386. Moore, 1986. In vitro propagation of Citrus rootstock. Hortscience 21: 300-301. Taufik, M., A. Khaeruni, T. Pakki, S. Wahyuni dan Baharuddin, 2009. Induksi Embriogenesis Somatik Tanaman Jeruk Manis Secara In Vitro Pada Beberapa Konsentrasi BAP. Siap diterbitkan pada Jurnal Agroland. Taufik, M., A. Khaeruni, T. Pakki, dan Gianto, 2010. Deteksi keberadaan CVPD dengan teknik PCR di Sulawesi Tenggara. J. Hama dan Penyakit Tumbuhan Tropika 10(1) 7379. Wijayanto, T., M. Taufik, D. Boer, dan N.W.S. Suliartini, 2010. Perbanyakan massal jeruk keprok dan jeruk siam secara in-vitro yang bebas penyakit CVPD di Sulawesi Tenggara. Laporan Akhir Penelitian Hibah Bersaing Tahun 2010 (Tahun I). Lembaga Penelitian Universitas Haluoleo, Kendari. Wijayanto, T., 2011. Produksi bibit jeruk keprok (Citrus reticulata) dan jeruk siam (Citrus sinensis) secara in-vitro yang bebas penyakit CVPD di Sulawesi Tenggara. J. Agriplus 21 (2). Wirawan, I.G.P., L. Sulistyowati, dan I.N. Wijaya, 2004. Penyakit CVPD pada Tanaman Jeruk. Analisis Baru Berbasis Bioteknologi. Direktorat Jenderal Bina Produksi Hortikultura, Departemen Pertanian. Wignarajah, 1995. Mineral nutrition pf Plant, pp. 193-221. Di dalam. Passarakli, M., (Eds), Hand Book of Plant and Crop Physiology. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel. Hongkong. Wirausaha Online Terkini, 2010. Hasil Tanaman Hidroponik di Buru di Singapura. Diakses 5 Oktober 2011. www.dapurusaha.com/ index.php option=com content view=article & view=article & id=182: hasil-tanamanhidroponik-diburu-di-singapura &catid=25=agrobisnis &Itenid =111. Yudi, Ikrar, Emi, Anna, dan Sostenis. 2009. Pengkajian Pupuk Organik Pengganti Pupuk Kimia Hingga Seratus Persen pada Hidroponik Tomat, Selada, Sawi, Bayam dan Kangkung. Balai Pengkajian Teknologi Pertanian Jakarta.
