PERAN FUNGSIONAL MINUMAN SUSU KEDELAI HITAM YANG DIPERKAYA MIKROKAPSUL MINYAK SAWIT PADA PENDERITA DIABETES MELITUS TIPE-2
RENO IRWANTO
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Peran Fungsional Minuman Susu Kedelai Hitam yang Diperkaya Mikrokapsul Minyak Sawit pada Penderita Diabetes Melitus Tipe-2 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Agustus 2016 Reno Irwanto NIM F251130241
ABSTRAK
RENO IRWANTO. Peran Fungsional Minuman Susu Kedelai Hitam yang Diperkaya Mikrokapsul Minyak Sawit pada Penderita Diabetes Melitus Tipe-2. Dibimbing oleh DEDE ROBIATUL ADAWIYAH dan FRANSISKA RUNGKAT ZAKARIA. Diabetes melitus tipe-2 (DM tipe-2) ialah kondisi kadar glukosa dalam darah yang tinggi dan akan berimplikasi pada komplikasi timbulnya penyakit lain. Saat ini, angka prevalensi penderita DM tipe-2 semakin meningkat. Pola diet yang tepat dapat menjadi solusi terapi DM tipe-2. Minuman susu kedelai hitam (SKH) yang diperkaya mikrokapsul minyak sawit mentah (MSMn) adalah satu diantar pola makan sehat bagi pederita diabetes. Mikrokapsul MSMn diperoleh dengan teknik spray drying menggunakan bahan maltodekstrin dan isolat protein kedelai sebagai penyalut. Tujuan penelitian adalah mengetahui peran fungsional SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dalam mengontrol dan memperbaiki kondisi penyakit DM tipe-2. Penelitian ini dilakukan selama 28 hari dengan partisipasi 15 responden yang diberikan SKH sebanyak 240 mL + 0.4 g mikrokapsul MSMn dan 11 responden kontrol tanpa diberikan apapun. Obatobatan yang digunakan oleh semua responden tidak berubah dan dihentikan selama periode intervensi. Produk yang diintervensi berupa mikrokapsul MSMn memiliki kadar air 1.77±0.15%, kelarutan 65.39±2.71% dan total karoten 295.24±7.40 ppm sedangkan SKH memiliki kadar protein 2.76±0.13%, kadar lemak 1.17±0.06%, kadar abu 0.12±0.08%, kadar air 94.69±0.04% dan kadar karbohidrat by difference 1.27±0.10%. Konsumsi minuman SKH + mikrokapsul MSMn menunjukkan tidak ada pengaruh terhadap penurunan kadar GDP (p>0.05), penurunan kadar SGOT (p>0.05), penurunan kadar SGPT (p>0.05) dan terdapat pengaruh yang signifikan untuk penurunan kadar COX-2 (p<0.05), peningkatan kadar DPPH Plasma (p<0.05), penurunan kadar MDA (p<0.05) dan kadar O6-metilguanin (tidak terdeteksi). Pada responden kontrol, menunjukkan hasil yang tidak signifikan (taraf 5%) untuk penurunan GDP (p>0.05), peningkatan kadar MDA (p>0.05), dan berbeda signifikan untuk penurunan COX2 (p<0.05), peningkatan DPPH Plasma (p<0.05), dan kadar O6-metilguanin (tidak terdeteksi). Adanya perubahan nilai parameter uji menunjukkan bahwa minuman SKH + mikrokapsul dapat memperbaiki kondisi DM tipe-2. Kata Kunci : Diabetes melitus tipe-2, mikrokapsul MSMn, susu kedelai hitam
ABSTRACT
RENO IRWANTO. Functional Role of Black Soybean Milk and Microencapsulated Palm Oil on Diabetes Type-2 Patients. Supervised by DEDE ROBIATUL ADAWIYAH and FRANSISKA RUNGKAT ZAKARIA. Diabetes mellitus type-2 (DM type-2) is a condition of high level of glucose in the blood that would have implications for the complications of other diseases. At present, the tendency of DM type-2 disease to envolve and grow is increasing. Proper diet can be the solution treatment of DM type-2. Black soybean milk drink (BSM) enriched with microencapsulated crude palm oil (CPO) is among a healthy diet for diabetics. Microencapsulated CPO obtained using the technique of spray drying with maltodextrin and soy protein isolate as a coating material. The objective of the study was to determine the effectiveness of BSM + microencapsulated CPO in controlling and improving the condition of DM type-2 patient. This study was carried out for 28 days with the participation of 15 respondents given BSM 240 mL + 0.4 g microencapsulated MSMn and 11 control respondents without products intervention. Medication used by all respondents was not changed during the intervention period. Microencapsulan CPO given had moisture content of 1.77±0.15%, solubility of 65.39±2.71% and carotene total of 295.24 ± 7.40 ppm while BSM has protein content of 2.76±0.13%, fat content of 1.17±0.06%, ash content of 0.12±0.08%, water content of 94.69±0.04% and carbohydrate by difference 1.27±0.10%. Consumption of BSM + microencapsulated CPO showed a declining trend FBG level (p>0.05), decreased SGOT (p>0,05), SGPT (p>0,05), and significantly reduced COX-2 level (p<0.05), increased level of DPPH Plasma (p<0.05), reduced MDA level (p<0.05) and O6methylguanin (not detected). The control respondents, showed results that are not significantly different (α = 5%) for FBG (p>0.05), increased MDA level (p>0.05), and significantly decreased in COX-2 (p>0.05), increase DPPH Plasma (p<0.05). Their values change test parameters showed that SKH + mikrokapsul drinks can improve the condition of DM type-2. Keywords : Black soybean milk, diabetes mellitus type-2, microencapsulated CPO
RINGKASAN
RENO IRWANTO. Peran Fungsional Minuman Susu Kedelai Hitam yang Diperkaya Mikrokapsul Minyak Sawit pada Penderita Diabetes Melitus Tipe-2. Dibimbing oleh DEDE ROBIATUL ADAWIYAH dan FRANSISKA RUNGKAT ZAKARIA. Diabetes melitus (DM) merupakan penyakit kronis yang terjadi akibat tubuh tidak bisa menghasilkan hormon insulin dalam jumlah yang cukup atau tidak dapat memanfaatkan insulin yang ada dalam tubuh dengan benar. Salah satu jenis DM adalah (DM) tipe-2. Penderita DM tipe-2 biasanya memiliki tingkat stres oksidatif tinggi di dalam tubuhnya yang berdampak pada kerusakan atau komplikasi penyakit mikrovaskular dan makrovaskular. Usaha yang dapat dilakukan untuk menekan penyakit DM tipe-2 dan dampak komplikasi penyakit lain adalah dengan mengonsumsi pangan fungsional. Susu kedelai hitam (SKH) merupakan salah satu pangan fungsional dengan indeks glikemik rendah, serat yang cukup dan senyawa fitokimia yang cukup lengkap seperti isoflavon, flavonoid dan antosianin sebagai minuman yang tepat untuk menurunkan tingkat keparahan DM tipe-2. Dalam melengkapi dan meningkatkan kualitas pangan fungsional tersebut, penambahan minyak sawit mentah (MSMn) adalah salah satu cara yang dapat dilakukan. MSMn kaya akan antioksidan yaitu karotenoid, tokoferol, tokotrienol, fitosterol, senyawa fenolik, dan fitonutrien lainya. Namun, MSMn memiliki kelemahan yaitu dari flavornya yang kurang disukai selain itu kandungan karotenoidnya juga rentan akan mengalami oksidasi. Penanganan hal tersebut adalah dengan metode mikroenkapsulasi. Proses mikroenkapsulasi dengan teknik spray drying memberikan hasil terbaik dalam mempertahankan karoten dan tingkat keseragaman mikrokapsul dibandingkan dengan teknik lain. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui peran fungsional SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dalam menekan dan mengontrol penyakit DM tipe-2. Penelitian dilakukan dalam tiga tahap yaitu tahap pertama proses pembuatan SKH, mikrokapsul MSMn dan analisanya, tahap kedua proses pemilihan responden dan intervensi produk terakhir tahap tiga yaitu analisa darah responden. Penelitian dilakukan selama 28 hari terhadap 26 orang responden dengan 15 responden yang diintervensi produk dan 11 responden lain sebagai kontrol tanpa intervensi produk. Hasil penelitian yang telah dilakukan, produk berupa mikrokapsul MSMn memiliki kadar air 1.77±0.15%, kelarutan 65.39±2.71% dan total karoten 295.24±7.40 ppm sedangkan SKH memiliki kadar protein 2.76±0.13%, kadar lemak 1.17±0.06%, kadar abu 0.12±0.08%, kadar air 94.69±0.04% dan kadar karbohidrat by difference 1.27±0.10%. Konsumsi minuman SKH + mikrokapsul MSMn oleh responden menunjukkan bahwa tidak ada pengaruh penurunan kadar GDP (p>0.05), penurunan SGOT (p>0.05), SGPT (p>0.05) dan terdapat pengaruh yang signifikan untuk penurunan kadar COX-2 (p<0.05), peningkatan kadar DPPH Plasma (p<0.05), penurunan kadar MDA (p<0.05), dan kadar O6-metilguanin (tidak terdeteksi). Pada responden kontrol, menunjukkan hasil yang tidak signifikan (taraf 5%) untuk penurunan GDP (p>0.05), peningkatan kadar MDA (p>0.05), dan berbeda signifikan untuk
penurunan COX-2 (p<0.05), peningkatan DPPH Plasma (p<0.05), dan kadar O6metilguanin (tidak terdeteksi). Adanya perubahan nilai parameter uji menunjukkan bahwa minuman SKH + mikrokapsul dapat memperbaiki kondisi DM tipe-2. Perbaikan nilai parameter pada responden yang diintervensi produk SKH + mikrokapsul MSMn menunjukkan bahwa produk memiliki kemampuan dalam menekan dan mengontrol penyakit DM tipe-2. Kata kunci : Diabetes melitus tipe-2, mikrokapsul MSMn, susu kedelai hitam
SUMMARY
RENO IRWANTO. Functional Role of Black Soybean Milk and Microencapsulated Palm Oil on Diabetes Type-2 Patients. Supervised by DEDE ROBIATUL ADAWIYAH and FRANSISKA RUNGKAT ZAKARIA. Diabetes mellitus (DM) is a chronic disease caused by the body can not produce insulin in sufficient quantities or can not use insulin in the body properly. One type DM is DM type-2. Patients with DM type-2 typically have high levels of oxidative stress in their bodies that have an impact on the damage or microvascular and macrovascular complications of the disease. Effort can be done to suppress the disease with DM type-2 and the impact of other complications is by consuming functional food. Black soybean milk (BSM) is one of the functional foods with a low glycemic index, fiber-sufficient and fairly complete phytochemical compounds such as isoflavones, flavonoids and anthocyanins as the right beverage for reducing the severity of DM type-2. In complement and enhance the quality of functional foods, the addition of crude palm oil (CPO) is one way to do. MSMn rich in antioxidants are carotenoids, tocopherols, tocotrienols, phytosterols, phenolic compounds, and other phytonutrients. However, it has the disadvantage of CPO of flavor less favored than that of carotenoids is also susceptible to undergo oxidation. Handling it is the method of microencapsulation. The process of microencapsulation by spray drying technique gives the best results in maintaining uniformity microcapsules carotene and level compared to other techniques. The purpose of this study was to determine the functional role SKH written microcapsules MSMn suppress and control the disease in type 2 DM. The study was conducted in three stages, the first stage of the manufacturing process BSM, microcapsules CPO and analysis, the second stage of the process of selecting respondents and product intervention last three stages, namely the respondent blood analysis. Research carried out for 28 days against 26 respondents with 15 respondents who intervened product and 11 other respondents as a control without intervention products. The results of the research that has been done, in the form of microcapsules CPO product had a moisture content of 1.77 ± 0.15%, the solubility of 65.39 ± 2.71% and total carotene 295.24 ± 7.40 ppm while BSM had a protein content of 2.76 ± 0.13%, the fat content of 1.17 ± 0.06%, ash content of 0.12 ± 0.08%, the water content of 94.69 ± 0.04% and carbohydrate by difference 1.27 ± 0.10 %. Consumption of drinks BSM + microcapsules CPO by respondents indicated that there was no effect of reduction in fasting blood glucose level (p>0.05), a decrease of AST (p>0.05), SGPT (p>0.05) and a significant difference to decreased levels of COX-2 (p<0.05), increased levels of DPPH Plasma (p<0.05), decreased levels of MDA (p<0.05), and levels of O6-metilguanin (not detected). In the control respondents, showed a not significant (5% level) for the GDP decline (p>0.05), levels of MDA (p>0.05), and significantly different to decrease COX-2 (p<0.05 ), an increase in Plasma DPPH (p<0.05), and levels of O6-metilguanin (not detected). Their values change test parameters indicate that the beverage BSM + microcapsules CPO can
improve the condition of DM type-2. Improvements parameter values in respondents who intervened SKH + microcapsules MSMn product indicates that the product has the capability to suppress and control the disease with DM type-2. Keywords: Diabetes mellitus type 2, microcapsulated CPO, black soybean milk
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PERAN FUNGSIONAL MINUMAN SUSU KEDELAI HITAM YANG DIPERKAYA MIKROKAPSUL MINYAK SAWIT PADA PENDERITA DIABETES MELITUS TIPE-2
RENO IRWANTO
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains Pada Program Studi Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof. Dr. Ir. Sedarnawati Yasni, M. Agr
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala limpahan nikmat dan karunia-Nya sehingga penelitian dan karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian tersebut berjudul “Peran Fungsional Susu Kedelai Hitam yang Ditambahkan Mikrokapsul Minyak Sawit pada Penderita Diabetes Melitus Tipe2”. Shalawat beriring salam semoga tercurah kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW. Penyelesain penulisan karya ilmiah dan penelitian ini tidak terlepas dari do’a dan bantuan banyak pihak. Terutama dan pertama sekali penulis mengucapkan terima kasih yang teramat sangat mendalam kepada kedua orang tua penulis yaitu Papa Apardi, S.Pd.I dan Mama Daryani, S.Pd.I karena berkat kasih sayang, do’a yang tak pernah putus, dorongan, dan semuanya yang penulis dapatkan hingga bisa bertahan dan mempersembahkan gelar ini untuk kalian. Ungkapan terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Ir. Dede Robiatul Adawiyah, MS selaku ketua komisi pembimbing dan Prof. Dr. Ir. Fransiska Rungkat Zakaria, M.Sc selaku anggota komisi pembimbing atas pemikiran, arahan, bimbingan, nasehat, motivasi, dan waktu serta kepada Prof. Dr. Ir. Sedarnawati Yasni. M.Agr selaku Dosen Penguji Luar Komisi. Penulis sangat berterima kasih dan kerelaan hati Ibu Dr. Ir. Dede Robiatul Adawiyah. MS yang memperbolehkan penulis melakukan penelitian dengan mengambil proyek ini walaupun penulis sering kali tidak bisa tidak dan tidak berani menemui Ibu karena konflik batin penulis sendiri. Tidak lupa penulis menyampaikan terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Harsi Dewantari Kusumaningrum selaku Ketua Program Studi Pascasarjana Ilmu Pangan serta para staff sekretariat program studi lainnya yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Selanjutnya ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Klinik dr. Katili yang telah bersedia membantu dalam pelaksanaan penelitian, para responden yang telah bersedia kami kunjungi setiap hari dan mengikuti arahan yang kami berikan. Berikutnya terima kasih kepada seluruh staff laboran di Laboratorium ITP IPB dan Pilot Plant Seafast Center IPB, Ibu Hening selaku pembimbing di Laboratorium Biomolekuler RS Kanker Dharmais Jakarta, Ibu Prof. Yahdiana Harahap, Mba Siti, Mba Wulan Laboratorium Bioekivalen dan Bioavaibilitas Fakultas Farmasi UI atas bantuan dan kemurahan hatinya. Penulis tidak akan pernah lupa pertolongan Allah SWT melalui Ibu Cici Dosen Ilmu Keperawatan UNAND, Kak Kiki, Bg Dally, dan Bg Rei dan perjuangan penulis bersama (Alm) Bg Rudi, Kak Ova, dan Felga terbayar sudah untuk mendapatkan hak sebagai penerima BPPDN 2013 dari DIKTI. Terakhir penulis juga berterima kasih kepada sahabat-sahabat yaitu Kristian Edo Zulfamy (Botong) dan Sabri Ella Afni (Memen) atas semua bantuan, kebersamaan, tawa canda, sedih, bahagia dan semuanya, terima kasih telah menjadi bagian dari perjalan nidup mendapatkan Gelar Master. Semoga kita sukses bersama dan dapat berkolaborasi kembali. Terima kasih juga buat Gusti Adi Nirwansyah, Nanda Triandita dan Bagus yang telah bersedia antar jemput kesana kemari dan mau disusahkan dengan menerima pertolongan dari penulis. Penulis juga menyampai ucapan terima kasih buat semua bantuan, kebersamaan, canda tawa dan semuanya kepada teman-teman IPN angkatan 2012, 2013, 2014 dan 2015. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2016 Reno Irwanto
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR
ii
DAFTAR LAMPIRAN
ii
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Tujuan Penelitian Hipotesis Penelitian
1 1 2 3 3
2 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Bahan dan Alat Pembuatan Susu Kedelai Hitam (SKH) Pembuatan Pembuatan Mikrokapsul MSMn Jumlah dan Cara Pemilihan Responden Intervensi Produk Penanganan Darah Analisis Susu Kedelai Hitam (SKH) Kadar Air Kadar Abu Kadar Protein Kadar Lemak Kadar Karbohidrat Analisis Mikrokapsul MSMn Kadar Karotenoid Kelarutan dalam Air Analisis Darah Kadar Glukosa Darah Kadar Enzim Siklooksigenase (COX-2) Antiradikal Bebas Plasma dengan Metode DPPH Kadar Malonaldehida Kadar Enzim SGOT/SGPT DNA Adduct Analisis Data
3 3 3 4 4 5 6 6 6 6 7 7 7 8 8 8 8 8 8 9 9 9 10 10 11
3 HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Responden DM Tipe-2 Karakteristik Susu Kedelai Hitam (SKH) Karakteristik Mikrokapsul MSMn Kadar Glukosa Darah Puasa (GDP) Kadar Enzim Siklooksigenase 2 (COX-2)
12 12 12 13 14 16
Aktivitas Antiradikal Bebas Plasma Kadar Malonaldehid (MDA) Kadar Enzim SGOT dan SGPT DNA ADDUCT
18 20 22 23
4 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran
26 26 26
DAFTAR PUSTAKA
26
LAMPIRAN
31
DAFTAR GAMBAR
1
Nilai kadar glukosa darah puasa (mg/dL) responden produk
15
2
Nilai kadar glukosa darah puasa (mg/dL) responden kontrol
16
3
Nilai OD enzim COX-2 responden intervensi produk
17
4
Nilai OD enzim COX-2 responden kontrol
18
5
Nilai kapasitas antioksidan (%) responden intervensi produk
19
6
Nilai kapasitas antioksidan (%) responden kontrol
20
7
Nilai konsentrasi MDA responden intervensi produk
21
8
Nilai konsentrasi MDA responden kontrol
21
9
Nilai kadar SGOT responden intervensi produk
22
10 Nilai kadar SGPT responden intervensi produk
23
DAFTAR TABEL
1
Formula Mikrokapsul MSMn
4
2
Karakteristik Responden DM Tipe-2
12
3
Karakteristik Minuman Susu Kedelai Hitam
13
4
Karakteristik Mikrokapsul MSMn
14
5
Data Kadar O6 metilguanin Responden SKH + mikrokapsul MSMn
24
6
Data Kadar O6-metilguanin Responden Kontrol
25
DAFTAR LAMPIRAN
1
Flowchart Pembuatan Minuman Sari Kedelai Hitam
32
2
Flowchart Pembuatan Mikrokapsul MSMn
33
3
Ethical Clearance
34
3
Tabel Analisis Sidik Ragam
4
35 6
Hasil pengukuran Kurva Kalibrasi Standar O -metilguanin dan penentuan LOD dan LOQ
44
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang Diabetes melitus (DM) merupakan penyakit yang berhubungan dengan kesalahan metabolis, ciri utamanya adalah hiperglikemia akut akibat kerja insulin yang tidak baik (Seino et al. 2010). Prevalensi pertumbuhan penderita DM di dunia dari tahun ke tahun semakin meningkat. Menurut WHO, dan pada tahun 2000 jumlah penderita DM di dunia mencapai 171 juta jiwa. Pada tahun 2030, jumlah penderita DM di dunia diperkirakan meningkat menjadi 366 juta jiwa. Penderita DM di Indonesia pada tahun 2000 mencapai 8.426.000 jiwa, dan pada tahun 2020, diperkirakan jumlahnya meningkat menjadi 21.257.000 jiwa (WHO 2001). DM tipe-2 adalah salah satu jenis penyakit DM. DM tipe-2 yang terjadi karena tubuh tidak bisa merespon insulin walaupun tubuh dapat menghasilkan insulin atau yang lebih dikenal dengan insulin resisten. Penderita DM tipe-2 biasanya memiliki tingkat stres oksidatif yang tinggi di dalam tubuhnya sehingga berdampak pada kerusakan atau komplikasi penyakit lainnya (IDF 2013). Tingkat stres oksidatif pada penyakit DM tipe-2 dapat dikontrol melalui konsumsi pangan fungsional. Pangan fungsional merupakan pangan yang tidak hanya mengandung zat gizi tapi juga memiliki komponen bioaktif yang dapat memberikan dampak positif bagi kesehatan dengan tidak mengesampingkan nilai sensorinya.Pangan yang ideal bagi penderita DM tipe-2 adalah yang memiliki nilai gizi yang baik dan berimbang, indeks glikemik (IG) rendah, mengandung senyawa antioksidan, komponen bioaktif, dan serat pangan (Biglari et al. 2008). Salah satunya bahan pangan yang cocok untuk penderita DM adalah kedelai. Di Indonesia kedelai sudah bukan bahan yang asing lagi karena telah banyak dikonsumsi dalam bentuk pangan olahan seperti kecap, tahu, tauco, dan tempe. Selama beberapa tahun terakhir terjadi perkembangan pesat konsumsi kedelai khususnya kedelai hitam karena timbulnya kesadaran konsumen akan manfaatnya. Sejumlah penelitian telah mengungkapkan kelebihan dari kedelai hitam yaitu senyawa fitokimianya seperti isoflavon, saponin, dan antosianin (Kim et al. 2006; Slavin et al. 2013). Kandungan polifenol dari biji kedelai hitam lebih tinggi dibandingkan dengan biji kedelai kuning (Takahashi et al. 2005). Dalam pengobatan China kedelai hitam digunakan sebagai bahan untuk detoksifikasi dan anti inflamasi (Liao et al. 2004). Kedelai memiliki nilai indeks glikemik (IG) yang rendah yaitu 30 (Powell et al. 2002). Konsumsi susu kedelai hitam bagi penderita DM tipe-2 diharapkan dapat mengurangi tingkat keparahan penyakitnya. Hal ini dapat terjadi karena susu kedelai merupakan minuman yang mengenyangkan dengan serat cukup tinggi dan kaya akan senyawa fitonutrien, sehingga penderita DM tipe-2 akan dapat mengurangi konsumsi nasi dan makanan berkarbohidrat tinggi. Pada akhirnya hormon insulin di dalam tubuh penderita DM tipe-2 dapat memanfaatkan glukosa darah yang ada dan berdampak pada menurunnya tingkat keparahan penyakitnya. Kelapa sawit juga diketahui sebagai hasil produk perkebunan yang Indonesia dinobatkan menjadi negara produsen terbesar di dunia dengan total produksi CPO (Crude Palm Oil) atau MSMn (Minyak Sawit Mentah) dan turunannya hingga tahun 2013 sekitar 26 juta ton per tahun (GAPKI 2014).
2
MSMn kaya akan sumber antioksidan yaitu karotenoid, tokoferol, tokotrienol, fitosterol, senyawa fenolik dan senyawa fitonutrien lainya yang diperlukan tubuh (Boateng dan Lee 2013). Senyawa tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang dapat menurunkan tingkat stres oksidatif yang sering dihubungkan dengan penyakit degeneratif seperti jantung, kanker, dan diabetes melitus (Biglari et al. 2008). Kandungan karotenoid yang dijumpai pada MSMn cukup tinggi yaitu berkisar 500-800 µg/g dan lebih dari 80% terdapat dalam bentuk α-, β-, γkaroten (Lim 2012a). MSMn dalam bentuk murni kurang dapat diterima secara sensori karena flavornya selain itu karotenoid yang dimilikinya rentan akan teroksidasi. Oksidasi dapat disebabkan oleh suhu, cahaya, paparan oksigen, matrik pangan, asam, kadar air, dan enzim antioksidan lainnya yang prooksidan (Chen et al. 2014). Dalam usaha untuk mendapatkan manfaat MSMn dengan menghindarkan dari kerusakan akibat oksidasi dan menutupi atribut sensori yang tidak sedap adalah dengan metode mikroenkapsulasi. Mikroenkapsulasi merupakan suatu metode penyalutan zat aktif (padatan, cairan, dan gas) dengan bahan lain untuk melindunginya dari pengaruh lingkungan seperti aroma, rasa, dan atribut sensori lainnya (Dubey et al. 2009). Hasil penelitian dengan berbagai teknik, yaitu spray dyer, drum dryer, dan tray dyer yang telah dilakukan oleh Wulandari et al. (2014) menyatakan bahwa total karoten yang dihasilkan dengan metode tray dyer adalah yang tertinggi yaitu 230 ppm, kemudian metode spray dryer 160 ppm, dan total karoten paling rendah adalah dengan metode drum dryer sekitar 78 ppm. Namun metode spray dryer menghasilkan mikrokapsul yang lebih homogen dan tingkat kelarutan yang lebih baik dibandingkan teknik lainnya. Oleh karena itu, sehingga dipilihlah teknik spray dryer dengan bahan penyalut berupa yaitu isolat protein kedelai dan maltodekstrin. Menurut Widowati (2008) pemberian antioksidan dan komponen senyawa polifenol menunjukkan kemampuan senyawa tersebut menangkap radikal bebas, mengurangi stres oksidatif, menurunkan ekspresi TNF-α. Minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn merupakan pangan fungsional yang memiliki zat gizi yang baik dan kaya kandungan senyawa antioksidan dan polifenol. Penderita DM tipe-2 biasanya mengalami gangguan senyawa radikal bebas dengan terbentuknya ROS. Peran fungsional minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn diduga dapat menekan dan mengontrol kadar glukosa darah serta efek komplikasi mikro maupun makrovaskular yang mungkin muncul. Maka sebagai suatu usaha untuk mengetahui kemampuan produk intervensi dilakukan pengujian terhadap perubahan gejala pada pasien DM tipe-2 ini adalah dengan mengukur kadar glukosa darah puasa, kadar enzim COX-2 akibat inflamasi serangan senyawa radikal bebas, aktivitas antiradikal bebas plasma metode DPPH, kadar MDA akibat oksidasi lipid oleh ROS, enzim SGOT, dan SGPT serta adanya komplikasi akibat DNA adduct oleh radikal bebas.
Perumusan Masalah Kedelai hitam adalah kelompok leguminase yang belum banyak dimanfaatkan sebagai pangan fungsional dengan kandungan gizinya yang tinggi, nilai IG rendah, serat, dan kaya senyawa bioaktif. Selain itu, Indonesia diketahui
3
sebagai penghasil utama kelapa sawit dan menjadi pemasok hampir 50% permintaan dunia. MSMn memiliki kandungan β-karoten dan provitamin A yang tinggi. MSMn ini memiliki kelemahan yakni rentan akan proses oksidasi sehingga diperlukan suatu penanganan khusus yakni mikroenkapsulasi. Penambahan mikrokapsul MSMn pada minuman susu kedelai hitam bagi penderita DM tipe-2 diharapkan dapat menurunkan dan menekan gejala penyakit DM tipe-2 melalui pengukuran parameter kadar glukosa darah puasa, kadar MDA, kadar enzim COX-2, enzim SGOT, dan SGPT serta pembentukan DNA adduct. Proses mikrokapsul MSMn telah banyak diteliti namun belum ada kajian mendalam terhadap pengaruhnya bagi penderita DM tipe-2. Begitupun dengan susu kedelai hitam, saat ini kajian mengenai susu kedelai terhadap penyakit umumnya menggunakan susu kedelai kuning, sehingga kajian kombinasi konsumsi minuman susu kedelai hitam yang ditambahkan mikrokapsul MSMn penting untuk dilakukan.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari peran fungsional minuman susu kedelai hitam yang ditambahkan mikrokapsul MSMn terhadap reaksi inflamasi, stres oksidatif, dan marker kanker pada penderita DM tipe-2.
Hipotesis Penelitian Pemberian minuman susu kedelai hitam yang ditambahkan mikrokapsul MSMn memiliki peran fungsional dalam menurunkan gejala penyakit DM tipe-2.
2 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian ini telah dilaksanakan pada Bulan Oktober 2014 sampai November 2015 bertempat di Laboratorium ITP, Laboratorium Seafast Center, Teknopark Fateta, Laboratorium Terpadu FKH IPB, Klinik dr. Katili, Laboratorium Biomolekuler Rumah Sakit Kanker Dharmasi Jakarta, dan Laboratorium Bioekivalen dan Bioaviabilitas Fakultas Farmasi UI.
Bahan dan Alat Bahan baku utama yang digunakan adalah kedelai hitam varietas cikuray dari petani binaan IPB di Palembang, minyak sawit mentah (CPO) dari PT Smart, maltodekstrin food grade, dan Soy Isolate Protein. Bahan penunjang lainnya adalah standar N7-metilguanin (Sigma Aldrich, Jerman) O6-metilguanin (Sigma
4
Aldrich, Jerman) asam format HPLC grade (Merck, Jerman) metanol HPLC grade (Merck, Jerman) asam asetat HPLC grade (Merck, Jerman) asetonitril HPLC grade (Merck, Jerman) aquabides, dan bahan kimia untuk analisis lainnya. Peralatan yang digunakan adalah perangkat pembuatan susu kedelai, gelas piala (pyrex) gelas ukur (pyrex) termometer, timbangan analitis, hot plate, spray dryer (Buchi 190, Switzerland), homogenizer (Armfield L4R, Inggris), HPLC MS/MS (Shimadzu), spektrofotometer, dan alat untuk analisis darah serta alat penunjang lainnya.
Pembuatan Susu Kedelai Hitam (SKH) Pembuatan SKH berdasarkan metode yang dilakukan oleh Muchtadi (2010) dan telah dimodifikasi dengan melakukan percobaan hingga didapatkan metode yang digunakan. Langkah awal pembuatan SKH dengan persiapan kedelai hitam yang telah disortasi. Kedelai hitam direndam selama 12 jam dengan perbandingan kedelai hitam dan air sebanyak 1:3 (w/v). Kemudian dicuci lalu ditiriskan dan digiling beserta kulitnya dengan penambahan air panas (suhu 80oC) untuk perbandingan 1:8 (w/v). Selanjutnya dilakukan penyaringan dengan kain saring 80 mesh dan hasil tersebut dipindahkan ke alat pasteurisasi pada suhu 85oC selama 15 menit hingga didapatkan SKH. Pada SKH yang telah dihasilkan dilakukan analisa proksimat.
Pembuatan Mikrokapsul MSMn Pembuatan mikrokapsul MSMn, diawali dengan pencampuran maltodektrin dan isolat protein kedelai kemudian tambahkan air hangat (50-60oC) setelah itu dihomogenisasi dengan homogenizer (Armfield L4R, Inggris) pada 1100 rpm selama 1 menit lalu ditambahkan MSMn dan dihomogenisasi kembali pada 1200 rpm selama 3 menit hingga didapatkan emulsi MSMn. Langkah berikutnya yaitu pembuatan mikrokapsul dengan alat spray dryer (Buchi 190, Switzerland) pada suhu inlet 180oC, suhu outlet 80oC, dan laju alir bahan 8.3 mL/menit. Hasil mikrokapsul dianalisis kadar air, kelarutan dan total karoten. Mikrokapsul MSMn dibuat dalam 4 formula awal dan kemudian dipilih 1 formula dengan total karoten dan kelarutan yang tinggi serta kadar air yang rendah. Pada prosesnya 4 formula pembuatan mikrokapsul tersebut adalah sebagai berikut : Tabel 1. Formula Mikrokapsul MSMn Bahan Emulsi Mikrokapsul MSMn Formula Maltodekstrin SPI CPO Air (MD) A 28.57 14.29 42.86 200 B 28.57 14.29 51.43 220 C 28.57 14.29 60.00 240 D 28.57 14.29 68.57 260
Total 285.71 314.27 342.84 371.41
Keterangan : Formula A (CVO : MD+SPI 1:1), Formula B (CVO : MD+SPI 1:1.2), Formula C (CVO : MD+SPI 1:1.4), Formula D (CVO : MD+SPI 1:1.6)
5
Jumlah dan Cara Pemilihan Responden Tahap ini meliputi penyusunan kuisioner dan kriteria inklusi eklusi untuk menentukan status dan kondisi responden DM tipe-2. Selanjutnya pengurusan ethical clearance hingga didapatkan persetujuan dengan no : 576/III/LPPMPM.10.05/07/2014 dari Universitas Atmajaya Jakarta dan survei responden. Populasi target responden yang digunakan adalah pasien DM tipe-2 yang datang berobat ke Klinik dr. Katili Dramaga Bogor. Pemilihan responden dilakukan secara purposive dengan kriteria inklusi sebagai berikut penderita DM tipe-2, usia dalam rentang 25-70 tahun, tidak sedang hamil, tidak menderita gangren dan penyakit kronis (berdasarkan hasil pemeriksaan) bersedia mengonsumsi produk selama masa intervensi (28 hari) dan bersedia ikut serta dalam penelitian dengan menandatangani lembar “informed consent”. Subjek tidak dipilih sebagai responden bila memenuhi kriteria eklusi berikut yaitu tidak penderita DM tipe-2, usia diluar rentang yang ditetapkan, menderita ganggren dan penyakit kronis, tidak bersedia mengonsumsi produk selama masa intervensi, tidak bersedia menandatangani “informed consent”. Responden yang dipilih sebagai subjek penelitian diambil dalam satu kawasan yang sama untuk memudahkan proses intervensi. Responden yang diintervensi berlokasi di Kelurahan Babakan Lebak, Kecamatan Darmaga, Kabupaten Bogor. Sebelum dipilih sebagai responden dilakukan pemeriksaan berupa pengukuran glukosa darah puasa awal, tekanan darah dan antropometri. Apabila hasil pemeriksaan menunjukkan responden yang diperiksa sesuai kriteria inklusi maka pasien tersebut diminta dan ditetapkan sebagai responden. Penentuan jumlah responden minimal dilakukan dengan menggunakan minimum sample size for estimating difference mean between groups (Lameshow et al. 1997) yaitu dengan rumus : ( ) ( ( Keterangan : n S
) )
= jumlah responden minimal = standar deviasi = 42 mg/dL (Chang et al. 2008) = 1.64 (α = 5%) = 1.28 (β = 10%) power of test = 90% = rata-rata kadar glukosa darah puasa setelah intervensi = 170 mg/dL (Chang et al. 2008) = rata-rata kadar glukosa darah puasa sebelum intervensi = 110 mg/dL (Chang et al. 2008)
Jumlah responden yang digunakan berpatokan pada penelitian yang dilakukan oleh Chang et al. 2008. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Chang et al. 2008 dimasukkan kedalam formula diatas, hinga didapatkan jumlah minimal responden yang diperlukan dalam penelitian ini adalah 8.77 atau dibulatkan menjadi 9 orang responden untuk tiap perlakuan. Dalam penelitian ini jumlah responden yang digunakan diatas nilai minimal responden yang dianjurkan berdasarkan hasil perhitungan untuk mengantisipasi pengurangan jumlah responden selama intervensi berlangsung. Responden yang diperoleh pada tahap awal seleksi berdasarkan data pasien DM tipe-2 dari Klinik dr. Katili adalah 34
6
orang dengan pembagian 17 untuk 2 kelompok perlakuan. Selama proses intervensi berlangsung jumlah responden yang tersisa adalah 26 orang, 15 orang responden perlakuan dan 11 orang responden kontrol. Jumlah responden tersisa ini masih memenuhi nilai hasil perhitungan jumlah responden minimal berdasarkan formula yang digunakan.
Intervensi Produk Intervensi produk dilakukan terhadap 15 orang responden perlakuan dengan memberikan 240 mL minuman SKH + 0.4 g mikrokapsul MSMn, 11 orang sebagai responden kontrol tidak menerima produk. Produk diantar setiap hari ke rumah responden untuk menjaga kesegaran produk dan memastikan responden mengonsumsinya. Penambahan mikrokapsul MSMn dilakukan sesaat sebelum produk diintervensikan pada responden. Penambahan dilakukan dengan mencampurkan 0.4 g mikrokapsul MSMn pada setiap 240 mL SKH yang telah disiapkan. Semua responden yang terpilih mendapatkan sosialisasi pengetahuan mengenai program, produk, informasi terkait diabetes, pola makan hidup sehat dan responden diminta untuk menandatangani "Informed Consent" serta dilakukan pengecekan glukosa darah awal, penimbangan berat badan, pengukuran tekanan darah, dan pengambilan darah. Penggunaan oat-obatan yang sebelumnya telah digunakan oleh responden tidak dihentikan. Intervensi produk terhadap responden dilaksanakan selama 28 hari.
Penanganan Darah Pengambilan darah puasa responden dilakukan sebelum dan sesudah konsumsi minuman susu kedelai hitam yang ditambahkan mikrokapsul MSMn selama 28 hari. Darah diambil atas bantuan jasa perawat terlatih di Klinik dr. Katili Darmaga. Jumlah darah yang diambil sebanyak 15 mL dengan venojact yang telah ditambahkan EDTA. Darah yang telah diambil dipisahkan antara plasma dan eritrosit kemudian disimpan pada suhu dingin -20oC sebelum dilakukan analisis.
Analisis Susu Kedelai Hitam (SKH) Kadar Air (AOAC 2005) Kadar air sampel SKH dianalisis dengan menggunakan metode gravimetri. Cawan aluminium dikeringkan dengan oven pada suhu 105oC selama 15 menit, kemudian didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Cawan yang sudah kering ditimbang sebelum digunakan (c). Sekitar 2.0 g sampel ditimbang ke dalam cawan tersebut (a), kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 105°C selama 6 jam, didinginkan dalam desikator selama 15 menit dan ditimbang sampai beratnya konstan (b). Kadar air dihitung dengan rumus sebagai berikut : ( )
(
)
7
Kadar Abu (AOAC 2005) Kadar abu dianalisis dengan menggunakan metode gravimetri. Cawan porselin kosong dan tutupnya dikeringkan dalam oven bersuhu 105 oC selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator. Cawan porselin kering tersebut ditimbang dan dicatat bobotnya sebelum digunakan (a). Sebanyak 3.0-5.0 g sampel SKH ditimbang di dalam cawan porselen tersebut dan dimasukkan dalam tanur listrik bersuhu 550oC sampai pengabuan sempurna (b). Setelah pengabuan selesai, cawan contoh didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang (c). Penimbangan diulangi kembali hingga diperoleh bobot tetap. Perhitungan kadar abu dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : ( )
Kadar Protein (AOAC 2005) Kadar protein SKH dianalisis dengan menggunakan Metode Kjeldahl. Sebanyak 100.0-250.0 mg sampel dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl (W). Kemudian ditambahkan dengan 1.9±0.1 g K2SO4, 40.0±10 mg HgO, 2.0±0.1 mL H2SO4 pekat, dan 2-3 butir batu didih. Sampel dipanaskan dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai mendidih selama 1-1.5 jam sampai diperoleh cairan jernih. Setelah didinginkan, isi labu dipindahkan ke dalam labu destilasi dengan dibilas menggunakan 1-2.0 mL air destilata sebanyak 5-6 kali. Air cucian dipindahkan ke labu destilasi kemudian ditambahkan dengan 8-10 mL larutan 60% NaOH - 5% Na2S2O3. Di tempat yang terpisah, 5.0 mL larutan H3BO3 dan 2-4 tetes indikator merah metil-biru metil dimasukkan ke dalam erlenmeryer. Labu erlenmeyer kemudian diletakkan di bawah kondensor dengan ujung kondensor terendam di bawah larutan H3BO3. Proses destilasi dilakukan sampai diperoleh sekitar 15.0 mL destilat. Destilat yang diperoleh diencerkan sampai 50.0 mL dengan aquades, kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0.02 N yang telah distandarisasi sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu (V1). Volume larutan HCl 0.02 N terstandar yang digunakan untuk titrasi dicatat. Tahap yang sama dilakukan untuk larutan blanko sehingga diperoleh volume larutan HCl 0.02N untuk blanko (V2). Kadar protein dihitung berdasarkan kadar nitrogen (%N). Kadar protein SKH dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan menggunakan faktor koreksi 6.25 sebagai berikut : (
( )
(
)
)
(
)
Kadar Lemak (AOAC 2005) Pada analisis kadar lemak sampel, labu lemak yang akan digunakan dioven selama 30 menit pada suhu 100-105ºC, kemudian didinginkan dalam desikator untuk menghilangkan uap air dan ditimbang (a). Sampel ditimbang sebanyak 2 gram (b) lalu dibungkus dengan kertas saring, ditutup dengan kapas bebas lemak dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi sokhlet yang telah dihubungkan dengan labu lemak yang telah dioven dan diketahui bobotnya. Pelarut heksan atau pelarut lemak lain dituangkan sampai sampel terendam dan dilakukan refluks atau
8
ektraksi lemak selama 5-6 jam atau sampai pelarut lemak yang turun ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut lemak yang telah digunakan, disuling dan ditampung setelah itu ekstrak lemak yang ada dalam labu lemak dikeringkan dalam oven bersuhu 100-105ºC selama 1 jam, lalu labu lemak didinginkan dalam desikator dan ditimbang (c). Tahap pengeringan labu lemak diulangi sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar lemak dihitung dengan rumus : ( )
Kadar Karbohidrat Kadar karbohdrat TTM dihitung dalam basis basah (bb) dan basis kering (bk) dengan metode by difference sebagai berikut : Kadar karbohidrat (%bb) = 100 – (% air + % abu + % lemak + % protein)
Analisis Mikrokapsul MSMn Kadar Karotenoid (PORIM 2005) Sebanyak 0.1 g sampel dilarutkan dengan heksana dalam labu takar 25 mL sampai tanda tera, lalu dikocok hingga benar-benar homogen. Selanjutnya absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 446 nm. Pengenceran dilakukan apabila absorbansi yang diperoleh nilainya lebih dari 0.700. Total Karotenoid dapat dihitung dengan cara : (
)
( )
Kelarutan dalam Air (AOAC 1995) Mikrokapsul ditimbang sebanyak 1 g (a) dan dilarutkan dalam 20 mL aquades kemudian disaring dengan kertas saring whatman no. 42. Sebelum digunakan, kertas saring dikeringkan dalam oven 105OC selama 30 menit dan ditimbang (b). Setelah penyaringan, kertas saring dikeringkan kembali dalam oven selama 1 jam pada suhu 105oC. Setelah itu, kertas saring didinginkan di desikator kemudian ditimbang sampai tercapai bobot tetap (c). ( ) ( ) ( ( )
Analisis Darah Kadar Glukosa Darah Kadar glukosa darah ditentukan menggunakan alat tes uji glukosa darah (One Touch, USA). Darah diambil dari jari dengan cara dibersihkan dengan alkohol, lalu dipijat atau diurut perlahan-lahan, kemudian bagian ujung ditusuk dengan jarum (lancet). Tetesan darah ditempelkan pada strip glucometer (One Touch, USA). Kadar glukosa darah akan terukur pada alat setelah 5 detik, dinyatakan dalam mg/dL. Pengukuran dilakukan setiap minggunya dan pada tahap awal seleksi responden.
9
Kadar Enzim Siklooksigenase 2 (COX-2) (Zakaria et al. 2014) Sebanyak 100 µL plasma yang telah diencerkan dengan carbonatebicarbonate buffer (Sigma Aldrich, Singapura) (COX-2 = 1:700) (Genetex, USA) dimasukkan ke dalam lempeng mikro 96 sumur (nunc maxisorp F96) kemudian diinkubasi pada suhu pada suhu 4oC selama semalam. Cairan dalam lempeng mikro dibuang dan dicuci dengan larutan PBST (Sigma Aldrich, Singapura) (larutan PBS dengan 0.05% tween 20) sebanyak 250 µL/sumur, dibiarkan 1 menit dan buang larutan pencuci. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali. Selanjutnya ditambahkan 100 µL susu skim 5% disetiap sumur dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam. Cairan dalam lempeng mikro kemudian dibuang dan dicuci dengan PBST sebanyak 3 kali. Setelah itu, tambahkan 100 µL antibodi primer ke dalam setiap sumur (antibodi monoklonal anti human COX-2 1:500.000) lalu diinkubasi kembali pada suhu 37oC selama 1 jam. Cairan dalam lempeng mikro dibuang dan dicuci dengan PBST sebanyak 3 kali. Antibodi poliklonal sekunder [HRP anti kelinci terkonjugasi antibodi poliklonal tikus (Genetex, USA)] ditambahkan sebanyak 100 µL (1:6.000) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam. Cairan dalam lempeng mikro dibuang dan dicuci dengan PBST sebanyak 3 kali. Ditambahkan 50 µL substrat TMB (Sigma Aldrich, Singapura) diruang gelap dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit. Kemudian ditambahkan H2SO4 1 N (Merck, Jerman) sebagai larutan stok. Waktu inkubasi dimulai setelah penambahan setiap larutan pada sumur terakhir. Intensitas warna yang terbentuk dapat dibaca dengan benchmark microplate reader (Bio rad, US) pada panjang gelombang 450 nm. Aktivitas Antiradikal Bebas Plasma dengan Metode DPPH (Modifikasi metode Quassinti et al. 2013) Sebanyak 180 μL plasma dipipet ke dalam mikrotube 2 mL, kemudian ditambah dengan 1620 μL reagen DPPH 0.004 % w/v (Sigma Aldrich, Singapura). Kontrol yang digunakan berupa reagen DPPH sebanyak 1620 μL. Sampel maupun kontrol kemudian disimpan dalam ruang gelap selama 60 menit, kemudian disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 800 g. Supernatan dipipet ke lempeng mikro sebanyak 100 μL, kemudian diukur menggunakan microplate reader spectrophotometer pada panjang gelombang 540 nm dan analisis dilakukan secara triplo. Absorbansi dari tiap sampel didapat dan aktivitas antioksidannya dihitung dengan menggunakan rumus : ( )
Kadar Malonaldehida (Modifikasi metode Singh et al. 2002; Erniati et al. 2012) Larutan induk tetraetoxy propane (Sigma Aldrich, Singapura) konsentrasi 50 nmol/mL dibuat menjadi larutan kerja dengan konsentrasi sebagai berikut : 0.0 nmol/mL; 2.0 nmol/mL; 4.0 nmol/mL; 6.0 nmol/mL; 8.0 nmol/mL; 10.0 nmol/mL; 12.0 nmol/mL; 14.0 nmol/mL; 16.0 nmol/mL; 18.0 nmol/mL; 20.0 nmol/mL. Sebanyak 375 μL larutan standar atau plasma darah pada masingmasing tabung mikro sentrifus ditambahkan 1.5 mL larutan HCl 0.25 N (Merck, Jerman) yang mengandung 15% trichloroacetic acid (Merck, Jerman) 0.38% thiobarbituric acid (Sigma Aldrich, Singapura) dan 0.5% butylated
10
hydroxytoluene (Sigma Aldrich, Singapura). Campuran dipanaskan dalam penangas air (Memmert, Jerman) suhu 80oC selama 1 jam. Setelah dingin, campuran disentrifus 3500 rpm 10 menit suhu 4oC. Supernatan jernih diambil dan diukur absorbansi menggunakan benchmark mikroplate reader (Bio rad, US) 540 nm. Kemudian hasil absorbansi diplotkan ke kurva standar TEP untuk menghitung kadar MDA plasma. Kadar Enzim SGOT/SGPT Metode analisis serum glutamic-oxaloacetic transaminase (SGOT) dan serum glutamic-pyruvic transaminase (SGPT) yang digunakan adalah metode kinetik berdasarkan International Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Reagen yang digunakan adalah aspartate transaminase (AST) atau glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) (Spectrum) dan alanine transaminase (ALT) atau glutamic-pyruvic transaminase (GPT) (Spectrum) yang kemudian ditambahkan pada plasma darah lalu diinjeksi pada alat RD-60 Semi Auto Biochemistry Analyzer dan dibaca pada panjang gelombang 340 nm. Penentuan hasil analisis dilakukan otomatis oleh alat tersebut. Hasil pembacaan absorbansi dilakukan setelah 90 detik (initial absorbance) dan dibaca lagi setelah 30, 60, dan 90 detik setelah initial absorbance. Hasil analisis akhir adalah rata-rata perubahan absorbansi tersebut per menit yang dihitung dengan rumus sebagai berikut : SGOT(U/L) = 1746 x delta A340nm/menit. DNA Adduct (Rahadianti 2012) Pengambilan Sampel Pengambilan darah puasa responden (15 orang) dilakukan sebelum dan sesudah konsumsi minuman susu kedelai hitam selama 28 hari dengan menggunakan jasa perawat yang terlatih di Klinik dr. Katili. Isolasi DNA (Modifikasi metode Qiagen 2007) Sebanyak 1 mL darah disentrifus, kemudian buang bagian plasma darahnya. 20 µL proteinase K dimasukkan ke dalam tabung eppendorf kemudian masukkan 200 µL eritrosit darah, dan 200 µL Buffer AL lalu lakukan pulse vortex selama 15 detik dan mikrosentrifugasi tabung eppendorf. Selanjutnya, tabung eppendorf diinkubasi pada suhu 56oC selama 30 menit dan dilakukan mikrosentrifugasi. Kedalam tabung eppendorf, ditambahkan 400 µL etanol absolut dingin dan lakukan pulse vortex 15 detik dan mikrosentrifugasi tabung eppendorf. Cairan didalam tabung eppendorf kemudian dipindahkan ke dalam QIAgen column yang telah dipasang dengan QIAgen collection tube. Kolom dan collection tube tersebut kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit pada suhu kamar, ganti collection tube tersebut yang berisi filtrat dengan collection tube yang baru. Kedalam column ditambahkan buffer AW1 sebanyak 500 µL. Kolom dan collection tube tersebut disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit pada suhu kamar. Filtrat pada collection tube kemudian dibuang dan collection tube dipasang kembali. Kedalam kolom ditambahkan buffer AW2 sebanyak 500 µL dan disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 3 menit pada suhu kamar. Filtrat pada collection tube kemudian dibuang dan collection tube dipasang kembali dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 1 menit pada suhu kamar.
11
Collection tube yang berisi filtrat kemudian dibuang dan kolom dipasang pada tabung eppendorf baru. Ke dalam kolom ditambahkan buffer AE sebanyak 50 µL. Kolom dan tabung eppendorf tersebut diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit pada suhu kamar. DNA yang terisolasi di dalam tabung eppendorf dihitung konsentrasinya menggunakan DNA/RNA calculator. Hidrolisis DNA (Warren 1984) Isolat DNA diencerkan terlebih dahulu dengan aquabidest dengan volume yang sebanding. Kemudian ditambahkan larutan asam klorida 0.1 N dengan volume isolat DNA yang telah diencerkan dan inkubasi pada suhu 70oC selama 30 menit. Analisis O6-Metilguanin dalam Sampel Hasil hidrolisis DNA dari sampel darah pasien DM Tipe-2 disuntikkan sebanyak 200 µL kedalam KCKT pada kondisi analisis terpilih. Kromatogram dari hasil elusi, ditentukan ada atau tidaknya O6-metilguanin dengan membandingkannya dengan kromagtogram standar dan dilakukan pengukuran luas puncak. Jika puncak tersebut memiliki luas yang lebih kecil dari luas nilai batas deteksi (limit of detection/LOD) maka puncak tersebut dinyatakan tidak terdeteksi. Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Penentuan Batas Deteksi (LOD) dari O6Metilguanin Sebanyak 200 µL larutan standar O6-metilguanin dengan konsentrasi 25 ng/mL, 70 ng/mL, 100 ng/mL, 300 ng/mL, 500 ng/mL, dan 700 ng/mL disuntikkan kedalam KCKT pada kondisi analisis terpilih. Luas puncak yang diperoleh kemudian dicatat dan dibuat kurva kalibrasinya, lalu dihitung koefisien relasinya (r) serta harga LOD. Pembuatan Larutan Induk Standar O6-metilguanin 1000 µg/mL Timbang secara seksama standar O6-metilguanin sebanyak 25 mg. Kemudian masukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan larutkan dengan asam klorida 0.1 N sampai tanda batas. Dilakukan pengenceran secara kuantitatif.
Analisis Data Semua data hasil pengujian yang didapatkan dikumpulkan dan diolah dengan menggunakan analisis statistik berupa aplikasi perangkat lunak SPSS 17.0. Analisis data yang dikerjakan berupa uji t-student independen dan dependent yang sebelumnya dilakukan uji normalitas persebaran data, bila persebaran data tidak normal dilakukan pengujian secara non parametrik dengan mann whitney (α=0.05). Pada pemilihan formula mikrokapsul MSMn dilakukan pengolahan data dengan Analisis Sidik Ragam (ANOVA). Apabila hasilnya berbeda signifikan dilakukan uji lanjut Duncan pada taraf 5%.
12
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Responden DM Tipe-2 Responden yang berpartisipasi pada penelitian ini memiliki karakteristik seperti yang dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Karakteristik Responden DM Tipe-2 Karakteristik Jumlah responden (n) Jenis Kelamin (Pr/L) Usia (tahun) a. Dewasa (<60 tahun) b. Lansia (≥60 tahun) IMT (kg/m2) a. Kurang (<18.5 kg/m2) b. Normal (18.5-22.9 kg/m2) c. Lebih (≥ 23 kg/m2) Sistol (mmHg) Diastol (mmHg) Glukosa puasa (mg/dL)
Kelompok Intervensi Kontrol 15
11
6 54.93±6.92 6 5 24.60±3.84 1 7 7 154.07±28.35 93.93±14.91 177.20±93.55
7/4 55.36±10.01 8 3 25.90±3.79 0 6 5 168.36 ± 30.39 91.45±13.09 255.27±93.33
Sign
0.37
0.99
0.37 0.74 0.37
Keterangan : Data disajikan dalam bentuk rata-rata dan dilakukan uji statistik t-student independen pada taraf 5%
Penelitian ini dilakukan dengan partisipasi responden yang terdiri dari responden intervensi produk dan responden kontrol. Sebelum masa penelitian berjalan dilakukan proses seleksi responden yang bersedia mengikuti dan memenuhi kriteria inklusi penelitian yang telah ditetapkan. Hasil seleksi tersebut mendapatkan responden sebanyak masing-masing 17 orang untuk tiap perlakuan. Namun selama masa intervensi berjalan responden menjadi berkurang dan tersisa masing-masing 15 orang responden intervensi dengan produk dan 11 orang responden kontrol sehingga jumlah responden akhir yang berpartisipasi dalam penelitian ini adalah 26 orang. Berdasarkan tabel 2 diatas dapat dilihat bahwa karakteristik responden tidak berbeda nyata berdasarkan hasil uji statistik t-student independen pada taraf nyata 5%. Semua responden yang berpartisipasi dalam penelitian ini tidak dilakukan pembatasan atau penghentian menggunakan obat-obatan. Selain itu responden yang digunakan juga tida dilakukan pengaturan pola makan selama proses intervensi dilakukan.
Karakteristik Susu Kedelai Hitam (SKH) Formula SKH yang digunakan dalam proses intervensi merupakan formula yang didapatkan dari hasil pra penelitian. Dalam prosesnya, pembuatan minuman SKH diawali dengan merendam kedelai hitam terlebih dahulu selama 12 jam
13
dengan perbandingan air rendaman dan kedelai 3:1 (w/v). Setelah direndam kedelai hitam digiling dengan mesin pembuatan minuman susu kedelai pada perbandingan air hangat yang digunakan yaitu 1:8 (w/v) hingga didapatkan minuman SKH yang sebelumnya dipasteurisasi. Minuman SKH yang didapatkan dilakukan pengujian proksimat. Hasil pengujian proksimat minuman SKH adalah sebagai berikut : Tabel 3. Karakteristik Minuman Susu Kedelai Hitam Parameter Nilai Rata-rata (%) Kadar Protein 2.76±0.13 Kadar lemak 1.17±0.06 Kadar abu 0.12±0.08 Kadar karbohidrat 1.27±0.10 Kadar Air 94.69±0.04 Kadar Serat larut 2 g* Kadar Serat tidak larut 5 g* Keterangan : *berdasarkan hasil pengujian yang dilakukan oleh Adie dan Krisnawati 2012
Nilai hasil uji proksimat minuman SKH yang didapatkan dibandingkan dengan syarat mutu susu kedelai menurut BSN (1995). Syarat mutu menurut BSN (1995) untuk nilai kadar protein minuman susu kedelai adalah 2.00% dan nilai kadar lemak 1.00%. Berdasarkan batas syarat mutu tersebut minuman SKH yang dibuat telah memenuhi standar SNI 01-3830-1995 untuk produk susu kedelai.
Karakteristik Mikrokapsul MSMn Mikrokapsul MSMn yang digunakan sebagai produk yang diberikan pada responden dibuat dengan menentukan formula terpilih untuk diperbanyak. Dalam prosesnya formula mikrokapsul yang dibuat ada 4 yang kemudian diambil satu formula terbaik (Tabel 2). Berdasarkan hasil yang telah didapatkan maka dipilih mikrokapsul formula D untuk diperbanyak. Formula ini dipilih karena memiliki total karotenoid yang paling tinggi dan kelarutan yang cukup tinggi diantara formula mikrokapsul lainnya. Berdasarkan uji statistik DNMRT yang dilakukan, kadar air mikrokapsul MSMn yang dihasilkan berada pada kisaran 0.73±1.00% 1.77±0.15% dan tidak berbeda nyata antar perlakuan pada taraf 5%. Nilai ini berada pada kisaran yang hampir sama dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Fasikhatun (2010) yaitu 0.62–2.92%. Begitupun hasil yang dilaporkan oleh Angka (2015) nilai kadar air mikrokapsul minyak sawit merah yang disalut dengan Na Kaseinat adalah 1.15±0.04%. Apabila dibandingkan kadar air untuk syarat mutu produk kering seperti susu bubuk (SNI 01-2970-1999) dan kopi instan (SNI 01-2983-1992) dengan nilai 4.0% maka nilai yang didapatkan tersebut berada dalam kisaran syarat mutu. Kelarutan merupakan salah satu parameter dalam pemilihan formula mikrokapsul MSMn. Nilai kelarutan yang didapatkan dari hasil pengujian yang dilakukan berkisar antara 61.13±0.38% - 72.98±5.85%. Formula D dipilih untuk diperbanyak karena memiliki nilai kelarutan cukup tinggi yaitu 65.39±2.71%. Formula ini memiliki nilai kelarutannya tidak terpaut jauh dari nilai kelarutan pada formula lainnya dengan pertimbangan total karoten formula D yang cukup
14
tinggi dibandingkan dengan formula lainnya sebagai sasaran utama. Nilai kelarutan mikrokapsul menurut uji statistik DNMRT pada taraf 5% berbeda nyata antar formula, namun dipilih formula D dengan mempertimbangkan nilai total karotan. Total karoten yang didapatkan berkisar antara 236.02± 0.68 ppm – 295.24±7.40 ppm. Nilai total karoten yang didapatkan ini lebih tinggi bila dibandingkan hasil yang dilaporkan oleh Rahman (2015) dengan total karoten berkisar 50.71-116.34 ppm. Begitupun Angka (2015) total karoten mikrokapsul sekitar 123.42±29.22 ppm. Formula mikrokapsul MSMn yang berbeda memberikan pengaruh terhadap nilai total karoten berdasarkan uji lanjut DNMRT pada taraf nyata 5%. Maka berdasarkan hasil pertimbangan 3 parameter yang diukur ini dipilihlah formula D untuk diperbanyak. Tabel 4. Karakteristik Mikrokapsul MSMn Formula A B C D
Kadar Air (%) 1.43±1.28 a 0.73±1.00 a 0.79±0.96 a 1.77±0.15 a
Kelarutan (%) 72.98±5.85 a 71.92±0.28 a 61.13±0.38 b 65.39±2.71 ab
Total Karoten (ppm) 236.02±068 a 243.41±3.36 a 287.34±0.00 b 295.24±7.40 b
Keterangan : notasi huruf yang berbeda menunjukkan terdapat perbedaan nyata antar formula berdasarkan uji lanjut Duncan pada taraf nyata 5%
Kadar Glukosa Darah Puasa (GDP) Glukosa adalah sumber energi bagi tubuh yang berasal dari pencernaan karbohidrat, maupun glukoneogenesis dan glukogenolisis. Tubuh memiliki nilai batasan jumlah glukosa normal. Apabila jumlah glokusa lebih tinggi dari batasan normal maka akan mengakibatkan gangguan homeostasis tubuh. Parameter GDP dapat dijadikan sebagai indikator awal terjangkitnya DM. Menurut Bilous et al. (2015) batas nilai kadar GDP normal adalah 110 mg/dL. Adanya batasan nilai GDP ini perlu untuk diketahui. Hal ini berawal dari hasil studi tahun 1990-an yang menunjukkan bahwa komplikasi mikrovaskular, makrovaskular dan keparahan penyakit DM meningkat dramatis bila nilai GDP diatas ambang nilai normal. Pangan fungsional merupakan suatu pilihan tepat dalam memperbaiki penyakit DM tipe-2 melalui pola diet. Salah satunya adalah minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn. Hasil penelitian yang telah dilakukan dengan melakukan intervensi dengan pemberian minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn terhadap penderita DM Tipe-2 dapat mengontrol kadar GDP responden (Gambar 1) namun tidak memberikan pengaruh menurut uji t-student berpasangan pada taraf nyata 5% (p>0.05).
15
450
Kadar Glukosa Darah (mg/dL)
400 350 300 250 200 150 100 50 0 R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15
Responden Sebelum
Setelah
Gambar 1. Nilai kadar glukosa darah puasa (mg/dL) responden SKH + Mikrokapsul MSMn selama perlakuan Minuman SKH merupakan minuman yang memiliki nilai gizi yang lengkap dengan indeks glikemik rendah, memberikan rasa kenyang yang lama, selain itu juga memiliki kandungan senyawa bioaktif yang tinggi seperti golongan antioksidan, antosianin, dan isoflavon (Powell et al. 2002; Mueller et al. 2012; Martino et al. 2011). Hal tersebut ikut berperan dalam mengontrol kadar GDP responden sehingga selama intervensi kadar GDP responden tidak mengalami kenaikan atau penurunan yang drastis. Produk dengan indeks glikemik rendah dan memiliki serat yang cukup mampu memberikan rasa kenyang tanpa meningkatkan glukosa dalam darah dan memperbaiki sensitivitas insulin (Astawan 2009; Muchtadi 2010; Riccardi et al. 2008). Kandungan serat yang dimiliki produk mampu menurunkan jumlah karbohidrat yang dapat dicerna, menurunkan level hormon pencernaan dan yang penting adalah mampu meningkatkan sensitivitas insulin. Serat kedelai mengandung pektin, galaktomanan dan arabinogalatan yang memiliki viskositas yang tinggi. Komponen serat ini dapat memperlambat laju pencernaan dan penyerapan glukosa (Verschoyle et al. 2007). Pengaruh dari serat kedelai mungkin menjadi penyebab penurunan penyerapan glukosa yang berakibat pada perlambatan laju pencernaan dengan membatasi laju difusi intraluminal glukosa dengan penyerapan permukaan. Produk minuman ataupun makanan yang tinggi serat dapat menunda rasa lapar sehingga memberikan kesempatan bagi hormon insulin dalam tubuh untuk memproses makanan yang tinggi glukosa (Riccardi et al. 2008). Selain serat, komponen senyawa bioaktif juga berperan besar dalam menurunkan dan mengontrol penyakit DM tipe-2. Komponen bioaktif tersebut dapat menurunkan tingkat stres oksidatif dan mencegah terjadinya komplikasi mikro maupun makrovaskular pada penderita DM tipe-2 (Franz 2012; Riccardi et al. 2008). Penelitian ini dilakukan dengan mengikutsertakan responden yang tidak diintervensi dengan produk atau responden kontrol. Hasilnya juga menunjukkan bahwa tidak ada pengaruh terhadap kadar GDP (p>0.05). Trend nilai kadar GDP responden kontrol adalah menurun namun nilainya tidak berpengaruh berdasarkan uji mann whitney (Gambar 2). Hasil pengukuran kadar GDP responden kontrol tersebut dapat dipengaruhi oleh banyak faktor salah satunya adalah edukasi pola makan dan hidup sehat bagi penderita DM.
Kadar Glukosa Darah (mg/dL)
16
500 400 300 200 100 0 RC1 RC2 RC3 RC4 RC5 RC6 RC7 RC8 RC9 RC10 RC11 Responden Sebelum Setelah
Gambar 2. Nilai kadar glukosa darah puasa (mg/dL) responden kontrol selama perlakuan Berdasarkan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Sedaghat (2015) responden DM tipe-2 yang diberikan kedelai sebanyak 30 g pada pagi dan sore selama 8 minggu menunjukkan terjadinya penurunan GDP dari 165.50±51.00 mg/dL menjadi 148.20±49.00 mg/dL. Hasil GDP ini sama dengan yang telah dilakukan dimana juga terjadi penurunan dari 177.00±93.55 menjadi 147.00±66.40 mg/dL namun tidak ada pengaruh berdasarkan uji statistik. Pada responden kontrol Sedaghat (2015) melaporkan peningkatan GDP secara signifikan dari 161.70±41.20 mg/dL menjadi 167.50±42.30 mg/dL. Sedangkan pada responden kontrol yang tidak diintervensi dengan SKH + mikrokapsul MSMn juga terjadi penurunan walaupun secara statistik tidak ada pengaruh dengan nilai 255.00±93.33 mg/dL menjadi 220.00±55.50 mg/dL. Chang et al. (2008) melaporkan hasil sejalan seperti yang telah dilakukan dimana responden kontrolnya juga mengalami penurunan namun secara signifikan dari 183.00±14.70 mg/dL menjadi 173.00±9.80 mg/dL. Chang et al. (2008) melakukan intervensi responden dengan memberikan kedelai total setara 69 g yang dibagi dalam 3 kali sehari dalam bentuk suplemen selama 4 minggu dan hasilnya menunjukkan terjadi penurunan GDP responden yang diintervensi secara signifikan dari 169.70±23.00 mg/dL menjadi 109.90±7.70 mg/dL, hasil memberikan tren yang sama dengan responden SKH + mikrokapsul MSMn. Hal ini diduga karena masa intervensi yang lebih pendek dan terjadinya perbaikan tingkat glukosa darah berlangsung secara perlahan dan bertahap seperti yang tergambar pada hasil penelitian yang dilakukan oleh Sedaghat. Hasil uji statistik nilai kadar GDP antara responden intervensi minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dengan responden kontrol (tidak mendapat intervensi produk) menunjukkan ada pengaruh signifikan (p<0.05) berdasarkan uji mann whitney.
Kadar Enzim Siklooksigenase 2 (COX-2) Hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap responden yang diintervensi dengan produk minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn
17
menunjukkan penurunan nilai OD COX-2 secara signifikan berdasarkan uji tstudent berpasangan (p<0.05) (Gambar 3). Hiperglikemia berkaitan dengan meningkatnya produksi senyawa radikal bebas. Tingginya jumlah senyawa radikal bebas dapat memicu terjadinya gangguan homeostasis tubuh. Inflamasi adalah salah satu yang dapat menganggu homeostasis tersebut (Bilous et al. 2015; Wellen dan Hotamisligil 2005). Reaksi inflamasi tersebut direspon oleh enzim COX-2 yang merupakan golongan enzim COX (Aid dan Bosetti 2011). Menurut Bagi (2006), COX-2 memegang peran penting dalam biosintesis prostaglandin selama inflamasi yang akan meningkatkan keparahan penyakit DM tipe-2. Nilai OD enzim COX-2 yang tinggi menunjukkan tingkat seyawa radikal bebas yang besar sebagai indikasi adanya inflamasi dalam tubuh.
Nilai OD Enzim COX-2
1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15
Responden Sebelum
Setelah
Gambar 3. Nilai OD enzim COX-2 responden intervensi SKH + Mikrokapsul MSMn selama perlakuan Penurunan nilai OD COX-2 responden yang diintervensi produk mengindikasikan adanya penurunan tingkat inflamasi. Hal ini menunjukkan kandungan senyawa bioaktif pada produk seperti β-karoten, isoflavon dan antosianin dapat meredam tingkat inflamasi (Messina 2010; Kim et al. 2013). Hasil ini sesuai dengan parameter lain yang juga menunjukkan perbaikan seperti kadar glukosa darah puasa responden. Kadar glukosa darah puasa responden DM tipe-2 yang menurun memiliki efek terhadap penurunan tingkat inflamasi. Diketahui bahwa penderita DM tipe-2 cenderung memiliki kandungan senyawa radikal tinggi dalam tubuh yang dapat sebagai pemicu terbentuknya inflamasi akibat serangan senyawa radikal tersebut. Selain itu, peningkatan kadar kapasitas antioksidan dan penurunan kadar senyawa malonaldehid yang dialami responden juga mendukung bahwa minuman SKH yang ditambahkan dengan mikrokapsul MSMn dapat menekan dan mengontrol penyakit DM tipe-2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar enzim COX-2 sebagai indikator tingkat inflamasi yang menurun di dalam tubuh penderita DM tipe-2 mengalami perbaikan. Namun penurunan nilai OD enzim COX-2 ini tidak hanya terjadi pada responden yang diintervesi produk tapi juga pada responden kontrol (Gambar 4). Penurunan nilai pengukuran OD enzim COX-2 responden kontrol ini juga berbeda signifikan (p<0.05) berdasarkan uji t-student berpasangan.
18
Nilai OD Enzim COX-2
1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 RC1 RC2 RC3 RC4 RC5 RC6 RC7 RC8 RC9 RC10 RC11 Responden Sebelum Setelah
Gambar 4. Nilai OD enzim COX-2 responden kontrol selama perlakuan Apabila dibandingkan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Anggraeni (2012) selama 2 bulan dengan mengintervensi konsumsi minyak sawit merah terhadap 16 orang responden yang menunjukkan bahwa kadar enzim siksooksigenase 15 responden rata-rata mengalami penurunan. Hal ini sama dengan hasil penelitian yang telah dilakukan dengan intervensi minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn yang juga menunjukkan penurunan yang signifikan (p<0.05). Intervensi minuman SKH yang ditambahkan dengan mikrokapsul MSMn selama 28 hari telah cukup mengambarkan bahwa produk yang diberikan mampu menekan keberadaan enzim COX-2 dan mengontrol komplikasi penyakit DM tipe-2 berdasarkan pengujian parameter terkait. Penurunan OD enzim COX-2 akan menekan pembentukan prostaglandin yang pada akhirnya dapat menekan terbentuknya dan ikut serta dalam perkembangan sel tumor dan kanker. Begitupun dengan hasil uji statistik t-student independen pada taraf nyata 5% yang menunjukkan ada pengaruh antara responden diintervensi minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dengan responden kontrol (tanpa intervensi produk) (p<0.05).
Aktivitas Antiradikal Bebas Plasma DM tipe-2 berkorelasi dengan tingginya kadar glukosa darah yang menyebabkan terjadinya kerusakan jaringan. Hal ini dapat terjadi sebagai akibat dari glukosa yang dapat berperan sebagai substrat bagi berbagai bentuk modifikasi senyawa oksidatif dan juga terlibat dalam proses pembentukan senyawa radikal bebas. Hiperglikemia dapat menyebabkan autooksidasi glukosa, glikasi protein, dan aktivasi jalur poliol sebagai pemicu terbentuknya senyawa oksigen reaktif. Terbentuknya senyawa oksigen reaktif akan meningkatkan risiko kerusakan senyawa lipi, DNA, dan protein didalam tubuh. Semua hal ini dapat terjadi akibat tidak seimbangnya jumlan antioksidan dengan jumlah prooksidan sehingga senyawa radikal bebas mampu merusak dan menggangu sistem jaringan di dalam tubuh (Setiawan dan Suhartono 2005). Konsumsi minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn oleh penderita DM tipe-2 menunjukkan adanya peningkatan kapasitas antiradikal bebas plasma (Gambar 5).
19
Kapasitas Antioksidan (%)
70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15
Responden Sebelum
Setalah
Gambar 5. Nilai kapasitas antioksidan (%) responden intervensi SKH + mikrokapsul MSMn selama perlakuan Di dalam tubuh pada sel terdapat antioksidan endogenus seperti bilirubin, senyawa tiol (glutation, asam lioat, N-asetil sistein) NADPH dan NADH, ubiquinon (koenzim Q10) dan asam urat (Krishnamurthy dan Wadhani 2012). Salah satu antioksidan yang paling banyak terdapat didalam sel adalah tripetida 1L-γ-glutamyl-1-cysteinylglycine (GSH). GSH mencegah oksidasi protein grup tiol dengan bereaksi langsung dengan ROS seperti lipid peroksida ataupun secara tidak langsung melalui glutation transferase (Krishnamurthy dan Wadhani 2012). GSH terdapat dalam sel merupakan salah satu antioksidan endogenus yang bertindak sebagai pertahanan pertama terhadap serangan senyawa radikal bebas. Adanya senyawa radikal bebas di dalam tubuh dalam jumlah yang cenderung tinggi membutuhkan asupan dan bantuan dari senyawa antioksidan dari luar. Peningkatan hasil pengujian kapasitas antioksidan ini mempresentasikan bahwa kelompok senyawa yang ada pada produk bersifat fungsional namun hasil pengujian tidak dapat menspesifikasikan jenis senyawa yang bertindak sebagai antiradikal (Biglari et al. 2008). Diduga peningkatan kapasitas antiradikal bebas plasma responden yang diberikan produk karena adanya kandungan senyawa karotenoid, antosianin, polifenol, dan isoflavon (Shokunbi et al. 2011; Xu dan Chang 2008). Terjadi perbedaan aktivitas antiradikal bebas plasma responden yang diberikan produk secara signifikan (p<0.05) antara sebelum dan setelah diintervensi. Adanya asupan pangan fungsional seperti minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dapat membantu kerja enzim antioksidan endogenous. Peningkatan nilai kapasitas antioksidan tidak hanya terjadi pada responden yang diintervensi produk saja, responden kontrol juga mengalami peningkatan aktivitas antiradikal plasma secara signifikan juga berdasarkan uji tstudent berpasangan (p<0.05) (Gambar 6). Peningkatan tersebut dapat disebabkan oleh banyak faktor, pola makan dan aktifitas fisik yang dianjurkan selama masa intervensi pada waktu sosialisasi penyakit diabetes dapat menjadi salah satunya.
20
Kapasitas Antioksidan (%)
70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 R1
R2
R3
R4
R5 R6 R7 R8 Responden Sebelum Setelah
R9
R10 R11
Gambar 6. Nilai kapasitas antioksidan (%) responden kontrol selama perlakuan Peningkatan aktivitas antiradikal bebas plasma pada responden yang diintervensi minuman SKH dengan penambahana mikrokapsul MSMn diduga karena kandungan komponen fungsionalnya. Kelompok senyawa polifenol, isoflavon, betakaroten yang terkandung dalam produk tersebut dapat masuk ke dalam sirkulasi darah dan selanjutnya masuk ke dalam plasma. Di dalam tubuh, komponen flavonoid akan bersikulasi dalam plasma (Grassi et al. 2006). Mekanisme peningkatan aktivitas antiradikal plasma dapat terjadi melalui aktivitas antioksidan primer dimana senyawa antioksidan produk akan bereaksi secara langsung dengan senyawa radikal DPPH yang dapat terukur berdasarkan perubahan warna DPPH yang terbantuk. Pengujian statistik dengan t-student independen pada taraf nyata 5% menunjukkan bahwa antara responden intervensi minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dengan responden kontrol (tidak menerima intervensi produk) tidak ada pengaruh (p>0.05) untuk peningkatan kapasitas antioksidan yang terjadi.
Kadar Malonaldehid (MDA) Malonaldehid merupakan senyawa yang sangat toksik sebagai produk yang terbentuk dari oksidasi lipid dan dapat juga dari prostaglandin dan sintesis tromboksan. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa tingginya konsentrasi MDA berhubungan dengan tingkat keparahan DM tipe-2 (Bose dan Agrawal 2007). Kadar MDA dalam tubuh menjadi indikator tingkat serangan radikal bebas terhadap lipid dan dapat juga menunjukkan tingkat keefektifan produk dalam menangkal senyawa radikal. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, kadar MDA responden DM tipe-2 yang diintervensi dengan produk SKH + mikrokapsul MSMn mengalami penurunan secara signifikan (p<0.05) berdasarkan uji t-student berpasangan (Gambar 7).
Konsentrasi MDA (nmol/ml)
21
7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 1.00 0.00 R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15
Responden Sebelum
Setelah
Gambar 7. Nilai konsentrasi MDA responden intervensi SKH + Mikrokapsul MSMn selama perlakuan
Konsentrasi MDA (nmol/ml)
Hasil penelitian tersebut sejalan dengan pernyataan diatas, begitupun dengan hasil pengujian kadar MDA responden kontrol yang mengalami peningkatan namun tidak berbeda signifikan (p>0.05) dari sebelum masa intervensi dengan setelah masa intervensi (Gambar 8). 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 RC1 RC2 RC3 RC4 RC5 RC6 RC7 RC8 RC9 RC10 RC11 Responden Sebelum Setelah
Gambar 8. Nilai konsentrasi MDA responden kontrol selama perlakuan Penurunan kadar MDA pada responden yang diintervensi produk diduga atas kontribusi senyawa antioksidan baik berupa enzim, vitamin dan senyawa lain yang dimiliki oleh produk tersebut misalnya β-karoten, antosianin, dan isoflavon (Winarsi 2007). Hasil penelitian ini sesuai dengan hipotesis dimana produk minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dapat menurunkan kadar MDA sehingga hipotesisnya dapat diterima. Astuti et al. (2009) dalam hasil penelitiannya juga melaporkan penurunan kadar MDA tikus yang diintervensi selama 2 bulan dengan isoflavon dan tepung kedelai. Eszy et al. (2014) juga melaporkan hal yang sama yaitu penurunan kadar MDA pada tikus yang diintevensi dengan pemberian diet tinggi MSMn. Minuman SKH memiliki kandungan senyawa antioksidan yang dapat bertindak dalam menurunkan dan menekan aksi radikal bebas. Golongan senyawa flavonoid misalnya, dapat bekerja dalam meredam serangan senyawa radikal bebas melalui dua cara. Bertindak dalam mendonorkan ion hidrogen scavenger
22
radikal bebas dan sebagai senyawa pengkelat logam (Signh et al. 2014). Sedangkan minyak kelapa sawit memiliki komponen betakaroten yang dapat bekerja sebagai antioksidan untuk menekan reaksi radikal bebas. Adanya penurunan kadar MDA responden yang diintervensi dengan minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn terbukti dapat menekan reaksi radikal bebas yang berhubungan erat dengan menurun dan terkontrolnya kondisi penyakit DM tipe-2. Hal ini dapat dilihat dari parameter pengukuran kadar GDP responden intervensi produk yang juga cenderung menurun walaupun tidak ada pengaruh secara statistik. Terdapat pengaruh signifikan (p<0.05) antara responden intervensi minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dengan responden kontrol (tidak menerima intervensi minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn). Hal ini terlihat berdasarkan pengujian statistik uji t-student independent pada taraf 5%.
Kadar Enzim SGOT dan SGPT Hati merupakan organ terbesar dan penting yang berguna untuk metabolisme. Di dalam tubuh hati berfungsi mengambil nutrisi, untuk menyimpan nutrisi, menyediakan nutrisi bagi organ lain dan menyaring serta menetralisir zat yang berpotensi sebagai perusak, misal bakteri dan obat-obatan (Ramadori et al. 2008). Terganggunya fungsi kerja hati dapat terjadi akibat stres oksidatif. Dalam tubuh akan dapat dijumpai enzim Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase (SGOT) dan enzim Serum Glutamic Pyruvic Transaminase (SGPT). Kadar enzim SGOT dan SGPT berhubungan dengan tingkat kerusakan sel-sel hati. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan terhadap 15 orang responden yang diintervensi dengan produk minuman SKH yang ditambahkan dengan mikrokapsul MSMn terjadi penurunan kadar enzim SGOT (Gambar 9). Batas atas 40 U/L
Kadar Enzim SGOT (U/l)
40 35 30 25 20 15 10
Batas bawah 5 U/L
5 0 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15
Responden
Sebelum
Setelah
Gambar 9. Nilai kadar SGOT responden intervensi SKH + Mikrokapsul MSMn selama perlakuan Pemberian konsumsi minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn tidak berpengaruh terhadap nilai kadar enzim SGOT menurut statistik pada uji mann whitney (p>0.05) begitupun dengan penurunan yang terjadi pada enzim SGPT juga tidak ada pengaruh (p>0.05). Apabila dibandingkan dengan nilai batas
23
maksimal kadar enzim SGOT maka nilai tersebut masih berada dalam nilai normal. Begitupun nilai enzim SGPT yang juga masih berada pada kisaran normal kecuali 1 responden, walaupun setelah intervensi terjadi penurunan namun nilainya masih diatas batas maksimal enzim SGPT (Gambar 10). Kadar Enzim SGPT (U/l)
60 50 Batas atas 42 U/L
40 30 20 10
Batas bawah 5 U/L
0 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15
Responden
Sebelum
Setelah
Gambar 10. Nilai kadar SGPT responden intervensi SKH + Mikrokapsul MSMn selama perlakuan Terjadinya penurunan kedua kadar enzim tersebut didalam plasma diduga adanya perbaikan kondisi hati karena kandungan senyawa pada produk yang diberikan. Produk SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn memiliki kandungan berupa isoflavon, antosianin, β-karoten, tokoferol dan tokotrienol. Senyawa tersebut memiliki kemampuan dalam menghambat pembentukan peroksida lemak dan gangguan akibat senyawa radikal bebas. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Adeneye dan Banebo (2007) menyatakan bahwa minyak sawit memiliki kemampuan hepatoprotektor, hal ini terbukti dari tikus yang diintervensi dengan minyak sawit mengalami penurunan kadar enzim SGOT dan SGPT. Selain itu Friday et al. (2009) menyebutkan bahwa retinol dan αtokoferol juga dapat menurunkan kadar enzim penanda kesehatan hati tersebut. Perdani (2012) dalam penelitiannya dengan pemberian MSMn pada ibu rumah tangga di Dramaga juga mendapatkan hasil bahwa terjadi penurunan SGOT dan SGPT dalam plasma responden.
Analisis DNA ADDUCT DNA adduct atau addition product merupakan hasil reaksi antara DNA dengan senyawa lain menghasilkan bagian DNA yang terikat kovalen ke senyawa kimia tersebut (Crystalia 2013). Di dalam tubuh DNA addcut biasanya terjadi pada gugus nukleofilik yang ada pada DNA, khususnya posisi N7 guanin yang nukleofilisitas paling tinggi. Selain N7 guanin yang memungkinkan menerima serangan elektrofil adalah N1, N3, dan O6 guanin; N1, N3 dan N7 adenin; O4 timin; dan N3 sitosin (Smith dan Clark 2011). Crystalia (2013) menyatakan bahwa DNA adduct N7-metilguanin sebagai DNA adduct utama pada paparan terhadap agen pemetilasi, kurang bersifat mutagenik dibandingkankan dengan O6-metilguanin yang toksik dan mutagenik. Kadar adduct pada organ tertentu dapat digunakan
24
untuk memprediksi risiko kanker dan semakin tinggi kadarnya maka risikonya pun semakin meningkat (Otteneder dan Lutz 1998). Berdasarkan hasil uji terhadap responden yang diintervensi dengan minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn tidak terdeteksi adanya DNA adduct O6-metilguanin (Tabel 4). Tabel 5. Data Kadar O6-metilguanin Responden SKH + mikrokapsul MSMn Jumlah DNA Terisolasi (µg/mL)
Respo nden Sebelum R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15
Luas Area
Kadar O6 Metilguanin (ng/mL)
Interv.
Setelah Interv.
Area Sebelum
Area Setelah
Sebelum Interv.
Setelah Interv.
369.3 209.6 214 228.6 383.1 97 364 361.1 107 287.3 264.5 118.2 129.5 217.9 135.4
275.8 132.7 129.4 235 107.5 127.2 363.6 309 320.9 332.2 461.4 404.7 406.4 305.5
6.476 4.191 5.385 8.121 4.625 7.038 9.321 5.743 3.189 6.544 2.080 8.280 5.508 7.266 9.236
18.264 17.185 18.465 5.066 9.224 14.764 10.508 19.692 18.328 19.628 17.327 26.633 17.081 17.003 15.312
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Keterangan Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi
6
Keterangan : Kadar O -metilguanin berada dibawah nilai LOD dan LOQ
Dalam pengujiannya sampel DNA didapatkan dari hasil hidrolisis sampel darah responden melalui tahap lisis, pengikatan, pencucian dan pengelusian. Hidrolisis DNA perlu terlebih dahulu dilakukan dengan asam seperti asam format untuk memutus ikatan dalam fosfodiester yang sebagai tulang punggung DNA dan ikatan N-glikosida sehingga DNA terputus-putus dan dalam bentuk basanya seperti adenin, guanin, timin, dan sitosin sebelum dapat dianalisis kadarnya. Hasil pengujian penentuan kadar O6-metilguanin menunjukkan bahwa responden intervensi dengan minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn tidak terdeteksi adanya O6-metilguanin. Hal ini menunjukkan bahwa responden DM tipe-2 tidak terjadi kesalahan DNA atau potensi terbentuknya kanker. Nilai kadar O6-metilguanin responden intervensi yang didapatkan dari hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 4, dimana pada semua responden tidak ditemukan adanya O6metilguanin yang terbentuk atau dibawah nilai LOD (1.69 ng/mL) dan LOQ (5.65 ng/mL). Hal ini diduga karena tingkat keparahan penyakit DM tipe-2 yang diderita responden belum komplek atau penyakit DM tipe-2 memiliki kemungkinan yang cukup rendah dalam komplikasi hingga terbentuknya sel kanker dan mungkin kondisi tubuh para responden yang dapat melakukan
25
perbaikan kesalahan DNA dengan DNA repair. Faktor lain yang mungkin menyebabkan tidak terdeteksinya DNA adduct yang terbentuk pada respnden DM tipe-2 adalah senyawa DNA adduct yang terbentuk mungkin saja bukan O6metilguanin namun basa DNA lain yang tidak diamati. Hasil ini sama seperti yang dilaporkan oleh Mardiah (2014) bahwa pemberian ekstrak rosela pada tikus diabetes yang diinduksi dengan streptozotosin tidak berpengaruh pada hasil DNA adduct yang didapatkan (tidak terdeteksi). Tabel 6. Data Kadar O6-metilguanin Responden Kontrol
Respo nden RC1 RC2 RC3 RC4 RC5 RC6 RC7 RC8 RC9 RC10 RC11
Jumlah DNA Terisolasi (µg/mL)
Luas Area
Kadar O6Metilguanin (ng/mL)
Sebelum Interv.
Setelah Interv.
Area Sebelum
Area Setelah
Sebelum Interv.
Setelah Interv.
174.2 365.5 140.3 447 290.5 132.4 221.7 184.6 129.4 342.5 139.7
245.2 146.9 362.6 337.7 339.7 88.4 155.3 170.8 276.4 121.5 -
7.096 10.155 8.032 5.570 7.633 12.840 4.638 14.193 11.595 7.425 17.926
4.780 8.665 6.134 4.857 5.464 2.667 28.319 7.343 10.071 7.564 10.952
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Keterangan Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi Tdk terdeteksi
6
Keterangan : Kadar O -metilguanin berada dibawah nilai LOD dan LOQ
Tidak terdeteksinya kadar O6-metilguanin sejalan dengan adanya penurunan kadar enzim COX-2 sebagai indikator awal adanya inflamasi apabila ada serangan senyawa radikal yang dapat merusak sel. Selain itu penurunan kadar MDA dan peningkatan kadar kapasitas antioksidan juga mendukung bahwa responden yang diintervensi mengalami peningkatan dan perbaikan kondisi tubuh dari serangan senyawa radikal yang mungkin dapat berakibat pada terbentuknya tumor dan kanker. Hasil pengujian kadar O6-metilguanin pada responden yang tidak diintervensi dengan minuman SKH yang ditambahkan mikrokapsul MSMn dapat dilihat pada Tabel 5. Berdasarkan hasil tersebut kadar O6-metilguanin juga tidak terdeteksi atau nilai luas area tiap responden masih dibawah nilai luas area kurva standar (Lampiran 5).
26
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan Minuman SKH yang diperkaya mikrokapsul MSM memiliki peran fungsional dalam menurunkan reaksi inflamasi, stres oksidatif dengan pengukuran terhadap parameter COX-2, DPPH dan MDA yang signifikan berpengaruh terhadap penyakit DM tipe 2. Namun menunjukkan hasi yang tidak signifikan untuk pengukuran kadar GDP, kadar enzim SGOT/SGPT, dan konsentrasi O6metilguanin yang tidak terdeteksi.
Saran Dalam upaya melihat peran pangan fungsional yang digunakan ini diperlukan penambahan masa intervensi. Pada pengujian DNA adduct untuk responden DM tipe-2 diperlukan penelusuran senyawa adduct yang mungkin terbentuk pada gugus nukleofilik DNA akibat serangan senyawa radikal.
DAFTAR PUSTAKA
Adeneye AA, Banebo AS. 2007. Ameliorating the effects of acetaminophen-induced hepatotoxicity in rats with African red palm oil extract. Asian J of Tradit Med 2: 244-248. Adie MM, Krisnawati A. 2012. Kedelai Hitam : varietas, kandungan gisi dan prospek bahan baku industri. Seminar badan litbang pertanian, 22 Mei 2012. Pemulian Kedelai Balitkabi. Badan Litbang Pertanian. Balai Penelitian Tanaman kacangkacangan dan umbi-umbian. Aid S, Bosetti F. 2011. Targeting cyclooxygenases-1 and -2 in neuroinflammation: therapeutic implications. Biochimie. 93:46–51. Anggraeni M. 2012. Konsumsi minyak sawit merah meningkatkan jumlah sel natural killer dan menurunkan kadar enzim siklooksigenase 2 pada limposit ibu rumah tangga di kecamatan Dramaga Bogor [Tesis]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor. Angka S. 2015. Reformulasi mikrokapsul minyak sawit merah dengan bahan penyalut maltodekstrin dan natrium kaseinat serta aplikasinya pada mi instan [Skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor. Astawan M. 2009. Sehat dengan hidangan kacang dan biji-bijian. Jakarta: Penebar Swadaya. Astuti S, Muchtadi D, Astawan M, Purwantara B, Wresdiyati T. 2009. Pengaruh pemberian tepung kedelai kaya isoflavon terhadap kadar malonaldehid (MDA) aktivitas superoksida dismutase (SOD) testis dan profil Cu, Zn-SOD tubuli seminiferi testis tikus jantan. J Teknol dan Industri Pangan. 20(2):129-134.
27
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2005. Official method of analysis. 16th Edition. Chapter 12, Microchemical Methods. Association of Official Analytical Chemistry International, Gaithersburg. Bagi Z, erdei N, Papp Z, Edes I, Koller A. 2006. Up-regulation of vascular cyclooxygenase-2 in diabetes mellitus. Pharmacol Rep. 58:52-56. Biglari F, Alkarkhi AFM, Easa AM. 2008. Antioxidant activity and phenolic content of various date palm (Phoenix dactylifera) fruits from Iran. Food Chem. 107:1636–1641. Bilous R, Donelly R. 2015. Buku Pegangan Diabetes. Yudha EK, penerjemah; Bariid NB, editor. Jakarta (ID): Penerbit Bumi Mustika. Terjemahan dari: Handbook of Diabetes. Ed ke-4. Boateng CO, Lee KT. 2013. Sustainable utilization of oil palm wastes for bioactive phytochemicals for the benefit of the oil palm and nutraceutical industries. Phytochem Rev. 12: 173–190. Bose KSC, Agrawal BK. 2007. Effect of short term supplementation of tomatoes on antioxidant enzymes and lipid peroxidation in type–II diabetes. Indian J Clin Biochem. 22(1):95-98. [BSN] Badan Standardisasi Nasional. 1999. SNI susu bubuk (SNI 01-2970-1999). Jakarta. _____________________________. 1995. SNI susu kedelai (SNI 01-2983-1995). Jakarta. _____________________________. 1992. SNI kopi instan (SNI 01-2983-1992). Jakarta. Chang JH, Kim MS, Kim TW, Lee SS. 2008. Effects of soybean supplementation on blood glucose, plasma lipid levels, and erythrocyte antioxidant enzyme activity in type-2 diabetes mellitus patients. Nutr Res Pract. 2(3):152-157. Chen L, Bai G, Yang R, Zang J, Zhou T, Zhao G. 2014. Encapsulation of bcarotene within ferritin nanocages greatly increases its water-solubility and thermal stability. Food Chem. 149:307-312. Crystalia Y. 2013. Analisis o6-metilguanin dalam darah pasien kanker yang menerima siklofosfamid pada regimen terapi secara kromatografi cair kinerja ultra tinggi tandem spektrometri massa [Skripsi]. Depok (ID) : Universitas Indonesia. Dubey R, Tsami TC, Rao KUB. 2009. Microencapsulation technologi and preparation. Defence Science J. 59(1): 82-95. Erniati, Fransiska RZ, Bambang PP. 2012. Efek konsumsi minuman bubuk kakao (Theobroma cacao L.) bebas lemak terhadap sifat antioksidatif limfosit subyek perempuan. J Teknol dan Industri Pangan. 23(1): 81–85. Eszy MS, Sastri S, Masri M. 2014. Pengaruh pemberian diet tinggi minyak sawit terhadap kadar malondialdehid darah tikus wistar. J Kesehatan Andalas. 3 (3): 409-414. Fasikhatun T. 2010. Pengaruh konsentrasi maltodekstrin dan gum arab terhadap karakteristik mikrokapsul minyak sawit merah dengan metode spray drying [Skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor. Franz MJ. 2012. Medical Nutrition Theraphy for Diabetes Mellitus and Hypoglycemia of Nondiabetic Origin. In: Mahan LK, Stump SE, editors. Krause’s Food and the Nutrition Care Process 13th edition. Philadelphia: WB Saunders Company. 675-710.
28
Friday EU, Patrick E, Ime BU. 2009. Comparative Hepatoprotective Effect of Vitamins A and E Against Gasoline Vapor Toxicity in Male and Female Rats. Gastroenterology Research. 2(5):295-302. [GAPKI] Gabungan Pengusaha Kelapa Sawit Indonesia. 2014. refleksi industri kelapa sawit 2013 dan prospek 2014 [Internet]. [diunduh 2015 nov 23]. Tersedia pada : http://www.gapki.or.id/Page/PressReleaseDetail?guid=d414bf22-e99e-4cbd9305-1deb5d019f4e. Grassi D, Ferri C. 2014. Polyphenols in human health and disease. Academic Press. 2:1009-1023. [IDF] International Diabetes Federation. 2013. IDF Diabetes Atlas. Sixth Edition. http://www.idf.org/diabetesatlas [20 Oktober 2014]. Kim K, Lim KM, Shin HJ, Seo DB, Noh YJ, Kang S, Chung HY, Shin S, Chung JH, Bae ON. 2013. Inhibitory effects of black soybean on platelet activation mediated through its active component of adenosine. Thromb Res. 131:254261. Kim SL, Berhow MA, Kim JT, Chi HY, Lee SJ, Chung IM. 2006. Evaluation of soyasaponin, isoflavone, protein, lipid, and free sugar accumulation in developing soybean seeds. J Agric Food Chem. 54(26):10003-10010. Krishnamurthy P, Wadhani A. 2012. Antioxidant enzymes and human health. Di dalam : Antioxidant Enzyme. Mohammed Amr El-Missiry, editor. HR: InTech. Lameshow S, Hosmer Jr, Klar J, Lwanga SK. 1997. Besar sampel dalam penelitian kesehatan. Gajah Mada University Press. Liao HF, Chen YJ, Yhang YC. 2004. A novel polysaccharide of black soybean promotes myelopoiesis and reconstitutes bone marrow after 5-flurouracil- and irradiation-induced myelosuppression. Life Sci. 77:400-413. Lim T K. 2012. Elaeis guineensis. Edible Medicinal and Non-Medicinal Plants. 1:335-392. Mardiah. 2014. Mekanisme ekstrak rosela ungu (Hibiscuc sabdariffa Lina) dalam memperbaiki petanda keparahan diabetes pada tikus percobaan [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Martino HSD, Cardoso LM, Ribeiro SMR, Dantas MIS, Piovesan ND, Mejia ED. 2011. Nutritional and bioactive compounds of soybean : benefits on human health. Intechopen. 21:465-489. Messina M. 2010. Soybean isoflavone exposure does not have feminizing effects on men: a critical examination of the clinical evidence. Fertil Steril. 93(7):20952104. Muchtadi D. 2010. Kedelai Komponen untuk Kesehatan. Alfabeta. Bogor. Mueller NT, Odegaard AO, Gross MD, Koh WP, Yu MC, Yuan JM, Pereira MA. 2012. Soy intake and risk of type-2 diabetes mellitus in Chinese Singaporeans. Eur J Nutr. 51:1033-1040. Otteneder M, Lutz WK. 1998. Corelation of DNA adduct level with tumor incidence : carcinogenic potency of DNA adducts. J Mut Research. 424:234-247. Perdani CG. 2012. Konsumsi minyak sawit mentah meningkatkan kadar retinol plasma dan menurunkan aktivitas enzim penanda kesehatan hati pada ibu rumah tangga di kecamatan dramaga kabupaten bogor [Tesis]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor. [PORIM] Palm Oil Research Institute of Malaysia. 2005. Test methods for palm oil and palm oil products. Kuala Lumpur.
29
Powell KF, Holt SHA, Miller JCB. 2002. International table of glycemic index and glycemic load values. Am J Clin Nutr. 76 : 5-56. Quassinti L, Bramucci M, Lupidi G, Barboni L, Ricciutelli M, Sagratini G, Papa F, Caprioli G, Petrelli D, Vitali LA, Vittori S, Maggi F. 2013. In vitro biological activity of essential oils and isolates furanosesquiterpens from neglected vegetable Smyrium olastrum L. Food Chemistry. 138 : 808-813. Qiagen. 2007. QIAamp DNA mini and blood mini handbook. Mainz : Qiagen. Rahadianti SP. 2012. Analisisi O6- Metilguanin dalam darah pasien yang mendapat siklofosfamid dalam regimen kemoterapi secara kemoterapi kinerja tinggi [Skripsi]. Depok (ID) : Universitas Indonesia. Rahman H. 2015. Peningkatan skala produksi mikrokapsul minyak sawit merah dan aplikasinya pada beberapa produk pangan [Skripsi]. Bogor (ID) : Institut Pertanian Bogor. Ramadori G, Moriconi F, Malik I, Dudas J. 2008. Physiology and pathophysiology of liver inflamtion, demage and repair. 59(1) : 107 – 117. Riccardi G, Rivellese AA, Giacco R. 2008. Role of glycemic Index and Glycemic Load in the Healthy State, in Prediabetes, and in Diabetes. Am J Clin Nutr. 87(1):269S-274S. Sedaghat A, Shahbazian H, Haidari F, Payami SP, Jahanshahi A, Latifi SM. 2015. The effect of soy nuts on glycemic control, lipid profile and insulinresistance in type-2 diabetic patients. J Endocr Metab Dis. 5:1-7. Seino Y, Nanjo K, Tajima N, Kadowai T, Kashiwagi A, Araki E, Ito C, Inagaki N, Iwamoto Y, Kasuga M, Hanafusa T, Haneda M, Ueki K. 2010. Report of the committee on the classification and diagnostic criteria of diabetes mellitus. J Diabetes Invest. 1(5):212-228. Setiawan B, Suhartono E. 2005. Stres oksidatif dan peran antioksidan pada diabetes melitus. Majalah Kedokteran Indonesia. 55(2): 86–90. Shokunbi OS, Babajide OO, Otaigbe DO, Tayo GO. 2011. Effect of coagulants on the yield nutrient and antinutrient composition of Tofu. Arch Appl Sci Res. 3(3): 522 – 527. Singh BP, Vij S, Hati S. 2014. Functional significance of bioactive peptides derived from soybean. Peptide. 54 : 171 – 179. Singh RP, Murthy, KNC, Jayaprakasha. 2002. Studies on antioxidant activity of pomegranate (punica granatum) peel and seed extracts using in vitro models. J Agric Food Chem. 50 : 81–86. Slavin M, Lu Y, Kaplan N, Yu L. 2013. Effects of baking on cyanidin-3-glucoside content and antioxidant properties of black and yellow soybean crackers. Food Chem. 141 : 1166-1174. Smith FT, Clark CR. 2011. Antineoplastic agent. Dalam JM Beale, JH Block (Penyunt) Wilson and Gisvold’s textbook of organic medical and pharmaceutical chemistry 12th edition (pp. 358-372). Philadelphia: Lippincott Williams, Wilkins. Takahashi R, Ohmori R. Kiyose C, Momiyama Y, Ohsuzu F, Kondo K. 2005. Antioxidant activities of black and yellow soybeans against low density lipoprotein oxidation. J Agric Food Chem. 53(11) : 4578-4582. Verschoyle RD, Greaves P, Cai H, Edwards RE, Steward WP, Gescher AJ. 2007. Evaluation of the cancer chemopreventive efficacy of rice bran in genetic mouse models of breast, prostate and intestinal carcinogenesis. Brit J Cancer. 96(2) : 248-254.
30
Warren W. 1984. The analysis of alkylated DNA by High Pressure Liquid Chromatography. Dalam S Venitt & JM Parry (Penyunt). Mutagenicity testing : A practical approach. Oxford : IRL Press. Wellen KE, Hotamisligil GS. 2005. Inflammation, stress, and diabetes. J Clin Invest. 115 (5) : 1111-1119. [WHO] World Health Organization. 2001. Technical Report Series. Diakses dari http://www.who.com. Widowati W. 2008. Potensi Antioksidan sebagai Antidiabetes. J Kesehatan Masyarakat. 7(2):1-11. Winarsi H. 2007. Antioksidan alami dan radikal bebas. Ed ke-2 Kanisnus Yogyakarta : Kanisius. Wulandari N, Adawiyah DR, Pramuhadi G. 2014. Drying process of microencapsulated red palm oil. Seafast Center. Institut Pertanian Bogor. Xu B, Chang K. 2008. Total phenolics, phenolic acids, isoflavones, and anthocyanins and antioxidant properties of yellow and black soybeans as affected by thermal processing. J Agric Food Chem. 56:7165–7175. Zakaria FR, Azni IN, Syamsir E, Amalia KM, Yamani C. 2014. Pengaruh konsumsi minuman beroksigen terhadap inflamsi dan kapasitas antioksidan penderita paru obstruktif kronik (PPOK). J Teknol dan Industri Pangan. 25 (1).
31
LAMPIRAN
32
Lampiran 1. Flowchart Pembuatan Susu Kedelai Hitam (Muchtadi 2010) Persiapan Bahan dan Alat (sterilisasi alat)
Sortasi Kedelai Hitam
Perendaman dengan Air (1:3 b/v) selama 12 jam
Pencucian dan pembersihan kedelai (1:3 b/v) 3 kali pencucian
Pengilingan (kedelai : air (80⁰C = 1 : 8 bk/v)dan penyaringan (80 mesh)
Pasteurisasi suhu 85oC selama 15 menit
Susu Kedelai Hitam
33
Lampiran 2. Flowchart Pembuatan Mikroenkapsulasi CPO (Modifikasi Kristi 2012) Maltodekstrin, Isolat protein kedelai dan aquades
Pencampuran dan pemanasan (T=50o
60 C)
Homogenisasi (1100 rpm, t= 1 menit) MSMn Homogenisasi (1200 rpm, t= 3 menit)
Emulsi MSMn
o
o
Spray dryer (T inlet = 180 C, outlet = 80 C)
Mikrokapsul MSMn
34
Lampiran 3. Ethical Clearance
35
Lampiran 4. Tabel Analisis Sidik Ragam 1. Uji Mikrokapsul MSMn Sum of Squares Karoten Between 5436.394 Groups Within Groups 66.391 Total 5502.785 KA Between 1.537 Groups Within Groups 3.593 Total 5.130 Kelarutan Between 188.367 Groups Within Groups 41.834 Total 230.201 Uji Lanjut Karoten Duncana
Formula 1.00 2.00 3.00 4.00 Sig.
N 2 2 2 2
Subset for alpha = 0.05 1 2 236.0250 243.4100 287.3400 295.2400 0.144 0.125
Uji Lanjut Kadar Air Duncana Subset for alpha = 0.05 1 2 .7300 2 .7900 2 1.4250 2 1.7750 .336
Formula N 2.00 3.00 1.00 4.00 Sig.
Uji Lanjut Kadar Air Duncana
Formula 3.00 4.00 2.00 1.00 Sig.
N 2 2 2 2
Subset for alpha = 0.05 1 2 61.1250 65.3850 65.3850 71.9200 72.9800 .258 .083
df
Mean Square 3
1812.131
4 7
16.598
3
0.512
4 7
0.898
3
62.789
4 7
10.459
F
Sig.
109.180 0.000
0.570 0.664
6.004 0.058
36
2. Kadar Glukosa Darah Puasa Responden Perlakuan Mann-Whitney Test Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks GDP 1 15 17.57 263.50 2 15 13.43 201.50 Total 30 Test Statisticsa GDP Mann-Whitney U 81.500 Wilcoxon W 201.500 Z -1.287 Asymp. Sig. (2-tailed) 0.198 Exact Sig. [2*(1-tailed 0.202b Sig.)]
3. Kadar Glukosa Darah Puasa Responden Kontrol Paired Samples Test Paired Differences
Pair 1 Sebelum - Setelah
Mean 35.182
Std. Deviation 98.938
Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Difference Upper t Pair 1 Sebelum Setelah
-
101.649
1.179
95% Confidence Interval of the Difference Std. Error Mean Lower 29.831 -31.286
df
Sig. (2-tailed) 10
0.266
4. Kadar Enzim Siklooksigenase (COX-2) Responden Perlakuan Paired Samples Test Paired Differences
Mean Pair 1 Sebelum - Setelah 0.186667
Std. Deviation 0.080060
95% Confidence Interval of the Difference Std. Error Mean Lower 0.020671 0.142331
37
Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Difference Upper t Pair 1 Sebelum Setelah
-
0.231002
Df
9.030
Sig. (2-tailed) 14
0.000
5. Kadar Enzim Siklooksigenase (COX-2) Responden Kontrol Paired Samples Test Paired Differences
Mean Pair 1 Sebelum - Setelah 0.065973
Std. Deviation 0.068747
Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Difference Upper t Pair 1 Sebelum Setelah
-
0.112158
3.183
95% Confidence Interval of the Difference Std. Error Mean Lower 0.020728 0.019788
Df
Sig. (2-tailed) 10
0.010
6. Kadar Kapasitas Antioksidan (DPPH) Responden Perlakuan Paired Samples Test Paired Differences
Mean Pair 1 Sebelum - Setelah -6.54067
Std. Deviation 4.87586
95% Confidence Interval of the Difference Std. Error Mean Lower 1.25894 -9.24083
38
Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Difference Upper t Pair 1 Sebelum Setelah
-
-3.84051
Df
-5.195
Sig. (2-tailed) 14
.000
7. Kadar Kapasitas Antioksidan (DPPH) Responden Kontrol Paired Samples Test Paired Differences
Mean Pair 1 Sebelum - Setelah -8.00182
Std. Deviation 7.99689
Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Difference Upper t Pair 1 Sebelum Setelah
-
-2.62944
-3.319
95% Confidence Interval of the Difference Std. Error Mean Lower 2.41115 -13.37420
Df
Sig. (2-tailed) 10
0.008
8. Kadar Malonaldehid (MDA) Responden Perlakuan Paired Samples Test Paired Differences
Pair 1 Sebelum - Setelah
Mean 0.71133
Std. Deviation 0.69369
95% Confidence Interval of the Difference Std. Error Mean Lower 0.17911 0.32718
39
Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Difference Upper t Pair 1 Sebelum Setelah
-
1.09549
Df
3.971
Sig. (2-tailed) 14
0.001
9. Kadar Malonaldehid (MDA) Responden Kontrol Paired Samples Test Paired Differences
Mean Pair 1 Sebelum - Setelah -0.37182
Std. Deviation 0.85564
95% Confidence Interval of the Difference Std. Error Mean Lower 0.25798 -0.94664
Paired Samples Test Paired Differences 95% Confidence Interval of the Difference Upper t Pair 1 Sebelum Setelah
-
0.20301
-1.441
10. Kadar Enzim SGOT Responden Perlakuan Mann-Whitney Test Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks SGOT 1 15 17.43 261.50 2 15 13.57 203.50 Total 30 a Test Statistics SGOT Mann-Whitney U 83.500 Wilcoxon W 203.500 Z -1.210 Asymp. Sig. (2-tailed) 0.226 Exact Sig. [2*(1-tailed 0.233b Sig.)]
Df
Sig. (2-tailed) 10
0.180
40
11. Kadar Enzim SGPT Responden Perlakuan Mann-Whitney Test Kelompok N Mean Rank Sum of Ranks SGPT 1 15 18.40 276.00 2 15 12.60 189.00 Total 30 Test Statisticsa SGPT Mann-Whitney U 69.000 Wilcoxon W 189.000 Z -1.808 Asymp. Sig. (2-tailed) 0.071 Exact Sig. [2*(1-tailed 0.074b Sig.)]
12. Selisih Kadar Glukosa Darah Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances F GDP
Equal variances assumed Equal variances not assumed
t-test for Equality of Means
Sig. 0.408
t 0.529
df
-1.963
24
-1.961
21.620
Independent Samples Test t-test for Equality of Means
Sig. (2tailed) GDP
Equal variances assumed Equal variances not assumed
Mean Difference
Std. Error Difference
95% Confidence Interval of the Difference Lower
0.061
-48.07879
24.48791
-98.61934
0.063
-48.07879
24.51455
-98.97067
Independent Samples Test t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference Upper GDP Equal variances assumed 2.46177 Equal variances not assumed 2.81309
41
13. Selisih Kadar Enzim Siklooksigenase 2 (COX-2) Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances F COX- Equal variances 2 assumed Equal variances not assumed
t-test for Equality of Means
Sig. 0.216
t
0.647
df
4.095
24
4.198
23.338
Independent Samples Test t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference Sig. (2Mean Std. Error tailed) Difference Difference Lower COX- Equal variances assumed 0.000 0.12230 0.02986 0.06067 2 Equal variances not 0.000 0.12230 0.02913 0.06208 assumed
Independent Samples Test
COX-2
Equal variances assumed Equal variances not assumed
t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference Upper 0.18394 0.18252
14. Selisih Kadar Malonaldehida (MDA) Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances F MDA Equal variances assumed Equal variances not assumed
0.250
Sig. 0.622
t-test for Equality of Means t
df
3.559
24
3.443
18.848
42
Independent Samples Test t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Mean Difference Sig. (2- Differen Std. Error tailed) ce Difference Lower MDA Equal variances assumed 0.002 1.08267 0.30421 0.45481 Equal variances not 0.003 1.08267 0.31444 0.42418 assumed Independent Samples Test
MDA
Equal variances assumed Equal variances not assumed
t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference Upper 1.71052 1.74115
15. Selisih Kapasitas Antioksidan Plasma (DPPH) Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances F DPPH Equal variances assumed Equal variances not assumed
3.180
t-test for Equality of Means
Sig.
t
0.087
df
0.578
24
0.537
15.379
Independent Samples Test t-test for Equality of Means
Sig. (2tailed) DPPH Equal variances assumed Equal variances not assumed
95% Confidence Mean Std. Error Interval of the Differen Differenc Difference ce e Lower
0.568 1.46115
2.52666
-3.75363
0.599 1.46115
2.72003
-4.32404
43
DPPH
Independent Samples Test t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference Upper Equal variances assumed 6.67593 Equal variances not assumed 7.24634
44
Lampiran 5. Hasil pengukuran Kurva Kalibrasi Standar O6-metilguanin dan penentuan LOD dan LOQ Konsentrasi Area LOD LOQ y' y-y' (y-y')2 (ng/mL) (y) (ng/mL) (ng/mL) 517 476.54 40.46 1 1637.0116 733 681.74 51.26 2 2627.5876 1.69 5.65 1415 1297.34 117.66 13843.8756 5 4537 4375.34 161.66 26133.9556 20 6425 6427.34 -2.34 30 5.4756 8382 8479.34 -97.34 40 9475.0756 2 Ʃ(y-y’) 53722.9816 Kurva Kalibrasi Standar O6-metilguanin 9000 8000
y = 205.2x + 271.34 R² = 0.9981
7000 6000 5000
Series1
4000
Linear (Series1)
3000 2000 1000 0 0
10
20
30
40
50
45
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kota Sungai Penuh, Provinsi Jambi pada Tanggal 12 September 1990 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Papa Apardi, S.PdI dan Mama Daryani, S.PdI. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Sungai Penuh, Provinsi Jambi dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Universitas Andalas pada Program Studi Teknologi Hasil Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian (FATETA). Gelar Sarjana Teknologi Pertanian diraih oleh penulis pada Bulan Januari Tahun 2013. Penulis mendaftar sebagai mahasiswa Ilmu Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pertanian Sekolah Pascasarjana IPB pada Tahun 2013 melalui Jalur Beasiswa Pendidikan Dalam Negeri yang diselengrakan oleh DIKTI.
