PENINGKATAN TERMOSTABILITAS ENZIM ALKALIFILIK XILANASE DENGAN SITE DIRECTED MUTAGENESIS
NADIA ADI PRATIWI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Peningkatan Termostabilitas Enzim Alkalifilik Xilanase dengan Site Directed Mutagenesis yang dilakukan di laboratorium Teknologi Bioindustri LAPTIAB-BPPT adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT).
Bogor, Mei 2013 Nadia AdiPratiwi NIM G84080035
ABSTRAK NADIA ADI PRATIWI. Peningkatan Termostabilitas Enzim Alkalifilik Xilanase dengan Site Directed Mutagenesis. Dibimbing oleh POPI ASRI KURNIATIN dan NIKNIK NURHAYATI. Aplikasi xilanase di industri pulp dan kertas membutuhkan enzim yang tahan terhadap kondisi pH dan suhu tinggi. Oleh karena itu, dibutuhkan xilanase yang bersifat alkali-termostabil. Tujuan penelitian ini adalah memutasi gen alkxynaq1cmu dengan metode Site Directed Mutagenesis (SDM) untuk meningkatkan termostabilitas dari enzim alkalifilik xilanase. Plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu dimutasi menggunakan 5 pasang primer mutagenik, yaitu Q53K, Q62L, E146V, T194I, dan S330I. Hasil restriksi, 2 dari 5 klon termutasi (klon 2.2 dan M3) memiliki situs restriksi XbaI, menghasilkan 3 fragmen DNA. Klon termutasi memiliki aktivitas xilanase yang bervariasi dari 22.7 U/ml hingga 49.3 U/ml. Hasil analisis urutan nukleotida (sequensing) dari 3 klon menunjukkan 2 klon (2.2 & 3.9) mengandung nukleotida single mutation dan satu klon (M3) mengandung nukleotida double mutation. Klon 2.2 berhasil dimutasi dengan primer Q62L mengubah asam amino glutamin menjadi lisin, klon 3.9 dapat dimutasi dengan primer E146V mengubah asam amino asam glutamat menjadi valin, dan klon M3 dapat dimutasi dengan primer E146V dan Q62L. Kata kunci: double mutation, SDM, single mutation, termostabil, xilanase
ABSTRACT NADIA ADI PRATIWI. Improving Thermostability Alkalifilik Xylanase Enzyme by Site Directed Mutagenesis. Under the direction of POPI ASRI KURNIATIN and NIKNIK NURHAYATI. Application of xylanase in the pulp and paper industries required enzyme that is resistant to alkaline and high temperatures conditions. A suitable enzyme for that purpose is an alkalo-thermostable xylanase. The objective of this research is mutated gene alkxynaq1cmu by Site Directed Mutagenesis (SDM) method to increase thermostability of the xylanase. pGEMalkxynaq1cmu recombinant plasmids were mutated separately using 5 pairs of mutagenic primers, namely Q53K, Q62L, E146V, T194I, and S330I. Restriction result, 2 out of 5 mutated clones (2.2 and M3) has a XbaI restriction site that produce 3 DNA fragments. Mutan clones have xylanase activity that were varied from 22.7 U/ml to 49.3 U/ml. The results of sequencing from 3 clones showed 2 clones (2.2 & 3.9) contain a single nucleotide mutation and one clone (M3) contains a double nucleotides mutation. Clones 2.2 has successfully exchanged by Q62L primer that changed the amino acid glutamine to lysine, 3.9 clone has successfully exchanged by E146V primer, amino acid glutamic acid to valine, and M3 has successfully exchanged by E146V and Q62L primers. Keywords: double mutation, SDM, single mutation, thermostable, xylanase
PENINGKATAN TERMOSTABILITAS ENZIM ALKALIFILIK XILANASE DENGAN SITE DIRECTED MUTAGENESIS
NADIA ADI PRATIWI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi : Peningkatan termostabilitas enzim alkalifilik xilanase dengan site directed mutagenesis Nama : Nadia Adi Pratiwi NIM : G84080035
Disetujui oleh
Popi Asri Kurniatin, SSi.Apt.,MSi Pembimbing I
Dr Niknik Nurhayati Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App. Sc Ketua Departemen
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari 2012 adalah biologi molekuler, dengan judul Peningkatan Termostabilitas Enzim Alkalifilik Xilanase dengan Site-Directed Mutagenesis. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Popi Asri Kurniatin, M.Si.Apt dan Ibu Dr. Niknik Nurhayati selaku pembimbing yang telah banyak member bimbingan, ilmu, saran, dan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan baik. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada keluarga tercinta, bapak Daryono RW, ibu Galuh K, dan saudaraku Hana NP yang telah memberikan perhatian, dukungan, dan motivasi. Selain itu, ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada staf, peneliti, dan teman-teman di laboratorium bioindustri BPPT yang telah banyak membantu dan mengajarkan selama menjalani penelitian. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada temanteman biokimia 45 yang telah banyak member perhatian dan motivasi. Akhir kata, semoga Allah SWT membalas setiap kebaikan dengan kebaikan yang jauh lebih besar kepada semua pihak yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis menyadari karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna, namun penulis berharap semoga karya tulis ini dapat memberikan manfaat bagi yang membutuhkan.
Bogor, Mei 2013
Nadia Adi Pratiwi
DAFTAR ISI DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Metode Penelitian
3
HASIL
6
Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmuI
6
Mutasi Kedua Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmuI
7
Analisis Hasil Urutan nukleotida (sequencing)
9
Analisis Termostabilitas Enzim Xilanase
9
PEMBAHASAN
10
SIMPULAN DAN SARAN
12
Simpulan
12
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
26
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil amplifikasi SDM PCR pGEMalkxynaq1cmu dengan primer Q53, Q62L, E146V, T194I, & S330I 2 Analisis hasil restriksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu 3 Hasil uji aktivitas enzim xilanase 4 Analisis hasil restriksi 5 Hasil uji aktivitas enzim xilanase dari mutasi kedua 6 Hasil uji termostabilitas enzim xilanase
6 7 7 8 8 9
DAFTAR LAMPIRAN
1 2 3 4 5 6 7 8
Strategi penelitian Site-directed mutagenesis plasmid pGEMalkxynaq1cmu rekombinan 1 Site-directed mutagenesis plasmid pGEMalkxynaq1cmu rekombinan 2 Alignment gen alkxynaq1cmu single mutation (klon 2.2) Alignment gen alkxynaq1cmu single mutation (klon 3.9) Alignment gen alkxynaq1cmu single mutation (klon M3) Alignment mutasi gen alkxynaq1cmu klon 2.2 & M3 Alignment mutasi gen alkxynaq1cmu klon 3.9 & M3
15 16 17 18 20 22 24 25
1
PENDAHULUAN Teknologi industri pulp dan kertas terus mengalami perkembangan terutama teknologi yang berwawasan lingkungan.Usaha yang saat ini dilakukan adalah mengurangi limbah yang dihasilkan. Pemakaian bahan kimia dalam industri pulp dan kertas tidak dapat dihindari, mengingat kelangsungan proses yang harus terjaga dengan baik. Proses bioteknologi dalam industri pulp dan kertas saat ini telah dikembangkan. Perkembangan bioteknologi ini ditunjukkan dengan penggunaan enzim dalam prosesnya. Enzim dapat digunakan pada beberapa proses pembuatan pulp dan kertas, seperti pada pemasakan, reduksi pitch, dan pemutihan (Haroen dan Artiningsih 2004). Pemakaian enzim memiliki banyak keunggulan seperti menghemat energi, mengurangi kebutuhan bahan kimia, dan meningkatkan kekuatan pulp dan kertas. Namun, apabila dibandingkan dengan proses kimia atau mekanis, aplikasi penggunaan enzim pada industri pulp dan kertas masih menghadapi beberapa kendala, yakni ketersediaan enzim yang masih diimpor, penanganan dan penyimpanan enzim, dan lamanya waktu yang digunakan untuk membuat pulp dan kertas. Hal ini mengakibatkan aplikasi enzim dalam industri jarang digunakan. Penggunaan enzim atau bahan kimia dalam teknologi pulp dan kertas, sebagian besar diaplikasikan pada proses pemutihan. Hal ini disebabkan pada pemutihan dibutuhkan zat yang dapat menghidrolisis lignin sehingga menghasilkan pulp yang memiliki derajat putih yang tinggi. Pemutihan pulp tidak hanya menghasilkan pulp yang lebih putih, tetapi juga membuat lebih stabil sehingga tidak menguning selama penyimpanan. Pemutihan harus menggunakan bahan kimia yang bersifat reaktif untuk melarutkan sisa lignin agar diperoleh derajat putih yang tinggi. Bahan kimia yang digunakan dalam pemutihan adalah klor. Klor merupakan zat bersifat oksidator yang dapat mendegradasi dan menghilangkan lignin dari gugus kromoform. Apabila dalam pemutihan menggunakan klor, maka dari unit ini akan dihasilkan limbah cair yang mengandung chlorinated organic compounds yang dilaporkan sangat berbahaya terhadap lingkungan (Batubara 2006). Penggunaan bahan kimia yang kurang efektif dan tidak ramah lingkungan, membuat industri pulp dan kertas mencari alternatif lain yang dapat membantu pembuatan kertas menjadi lebih efektif dan ramah lingkungan. Salah satunya adalah menggunakan enzim xilanase. Enzim ini dilaporkan dapat membantu pembuatan kertas yang lebih efektif serta ramah lingkungan. Sebagian besar industri pulp dan kertas di negara maju telah menggunakan enzim dalam pembuatan kertas, akan tetapi di Indonesia penggunaan enzim belum sepenuhnya diterapkan di industri pulp dan kertas. Enzim ini terutama digunakan pada pemutihan, karena pada proses ini dapat dihasilkan pulp yang memiliki derajat putih yang tinggi dan stabil. Mekanisme enzim xilanase dalam proses pemutihan terjadi melalui proses hidrolisis hemiselulosa. Proses hidrolisis ini dapat memecah komponen hemiselulosa seperti asam metilglukoronat menjadi satuan-satuan asam kromofor yang masih terikat pada rantai xilan. Xilanase juga dapat melarutkan lignin dengan cara menghidrolisis xilan yang merupakan penyusun utama hemiselulosa, serta membuka struktur pulp selulosa sehingga struktur lignin terbuka dan lebih mudah larut (Polizeli et al. 2005). Kertas yang dihasilkan
2 2 menggunakan xilanase memiliki kualitas kecerahan yang lebih tinggi, lebih lentur, dan permukaannya lebih halus (Rifaat et al. 2005). Xilanase yang digunakan dalam industri pulp dan kertas, sebagian besar prosesnya menggunakan xilanase yang bersifat termostabil dan tahan di pH basa (alkali). Xilanase bersifat alkali bermanfaat karena dapat membantu mendegradasi lignin melalui hidrolisis glukosa yang masih bersatu dengan pulp. Xilanase termostabil bermanfaat karena dapat menurunkan beban pada enzim dan dapat mengurangi kontaminasi dari mikroorganisme. Jumlah xilanase termostabil saat ini masih terbatas, oleh karena itu perbaikan suhu pada xilanase untuk mencapai suhu yang termostabil dilakukan menggunakan metode mutasi dengan pendekatan rasional berdasarkan struktur tiga dimensi. Pendekatan ini kurang efektif digunakan, oleh karena itu perbaikan suhu yang baik dilakukan adalah dengan mutasi dengan pendekatan yang diarahkan (site-directed) (Zhang et al. 2010). Penggunaan enzim dalam pembuatan pulp dan kertas merupakan alternatif yang baik. Namun, enzim yang dihasilkan saat ini belum memiliki ketahanan yang stabil pada suhu yang tinggi. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu metode untuk meningkatkan termostabilitas enzim xilanase. Penelitian ini bertujuan memutasi gen alkxyxaq1cmu dengan site-directed mutagenesis (SDM) untuk meningkatkan termostabilitas dari enzim alkalifilik xilanase. Adapun hipotesis penelitian ini adalah mutasi gen alkxynaq1cmu dengan metode site-directed mutagenesis dapat meningkatkan termostabilitas enzim alkalifilik xilanase. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan gen alkxynaq1cmu yang termutasi sehingga menghasilkan enzim alkalifilik xilanase yang bersifat termostabil.
BAHAN DAN METODE Alat Peralatan yang digunakan adalah mikropipet, alat-alat gelas, jarum ose, elektroforesis (Mupid-exu), Mini Spin (Eppendorf), thermal cycler PCR (Eppendorf), sentrifus dingin (Sorvale Fresco), konsentrator (Eppendorf), dokumentasi gel kodak, thermomixer(Eppendorf), shaker incubator (Kuhner), water purification system (Millipore), electrophoresis documentation and analysis system (EDAS 290 KODAK), laminar air flow class II BSC (ESCO), freezer 85°C (NUAIRE),microwave, autoklaf (IWAKI), alat pengaduk (vortex mixer), spektrofotometer UV-Fis (Hitachi U-2001), pH meter digital (WTW series inolab), neraca analitik (Radwag), dan inkubator (Memert).
Bahan Bahan-bahan media yang digunakan yaitu media Luria bertani (LB), super optimal broth (SOB), dan super optimal broth with catabolite repression (SOC). Bahan yang digunakan untuk SDM yaitu dNTPs, Pfu DNA polymerase, 10x bufer Pfu, enzim restriksi EcoRI, DpnI, dan XbaI, dan Escherichia coli DH5α. Adapun bahan kimia yang digunakan yaitu isopropil β-D-1-thiogalaktopiranosit (IPTG), 5-
3
bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-galaktopiranosil (X-Gal), ampisilin, bufer natrium sitrat pH 6, bufer natrium phosphat pH 7 dan 8, bufer TrisCl pH 8 dan 9, bufer glisin + NaOH pH 10, xilan Beechwood, plasmid klon 3 (pGEMalkxynaq1cmu), asam dinitro salisilat (DNS), ddH2O, etanol 70%, kit untuk ekstraksi (Fermentas).
Metode Penelitian Penelitian ini diawali dengan site directed mutagenesis (SDM) pertama pada plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu yang telah diperoleh dari penelitian sebelumnya. Plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu dimutasi menggunakan primer. Mutasi ini dilakukan menggunakan lima pasang primer. Setelah dimutasi, untuk mengetahui ekspresi dari plasmid rekombinan, maka dilakukan uji aktivitas pada enzim xilanase yang dihasilkan oleh plasmid rekombinan.Plasmid rekombinan yang termutasi dari SDM pertama, kemudian dimutasi kembali (SDM PCR 2). Plasmid rekombinan yang termutasi, kemudian di analisis urutan nukleotida (sequencing) untuk memastikan terjadinya mutasi pada salah satu basa yang diinginkan. Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu 1 Site-Directed Mutagenesis (Zheng et al. 2004). Plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu dimutasi menggunakan metode SDM PCR. Komposisi bahan yang digunakan yaitu 10x Pfu bufer 2.5 µl, 10 mM dNTP mix 0.75 µl, 3U/ µl Pfu DNA Polymerase (invitrogen) 0.5 µl, 1 µl primer forward, 1 µl primer revers, 1-2.5 ng plasmid pGEMalkxynaq1cmu 3 µl, dan ddH2O 25 µl dimasukkan dalam tabung mikro PCR. Mutasi dilakukan dengan program denaturasi (hot start) 95°C selama 2 menit, denaturasi 95°C selama 30 detik, annealing (sesuai dengan masing-masing time melting primer) selama 30 detik, dan elongasi 72°C selama 10 menit. Suhu annealing masing-masing primer berbeda yakni Q53K = 64.6 °C, Q62L = 64.7°C, E146V = 68.9°C, T194I = 64.6°C, dan S330I = 58.5°C. Proses mutasi berlangsung selama 20 siklus, setelah itu elongasi terakhir pada suhu 72°C selama 5 menit.Produk PCR kemudian direstriksi dengan enzim restriksi DpnI. Digesti Produk PCR dengan Enzim Restriksi DpnI (Zheng et al. 2004). Produk hasil mutasi dengan PCR, kemudian direstriksi dengan enzim DpnI. Sebanyak 17 µl produk PCR, 1 µl enzim restriksi DpnI 20 U/ µl, dan 2 µl bufer 4. Setelah itu, diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam, kemudian diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit. Pembuatan Sel Kompeten (Inoue et al. 1990). Hasil potongan produk PCR dengan enzim restriksi DpnI, selanjutnya ditransformasi. Sebelum dilakukan transformasi, E.coli DH5α harus dipersiapkan menjadi sel kompeten agar memiliki efisiensi yang tinggi dalam menerima DNA dari luar pada proses transformasi. Kultur E.coli DH5α dari stok di gores pada media LB agar, kemudian diinkubasi ± 16 jam pada suhu 37°C. Koloni tunggal DH5α dari cawan diinokulasi ke media SOB 50 ml lalu diinkubasi pada 150 rpm, 30°C hingga nilai OD600 = 0.4-0.8. Kultur bakteri kemudian diinkubasi dalam es hingga dingin dan disentrifugasi pada 1006 g selama 15 menit dengan suhu 4°C. Supernatan dibuang
4
4
secara aseptis, sedangkan pelet diresuspensi dengan menambahkan TB bufer dingin sebanyak 16.5 ml, kemudian diinkubasi di es selama 10 menit. Setelah itu, disentrifugasi pada 1006 g selama 15 menit dengan suhu 4°C. Supernatan dibuang secara aseptis dan pelet diresuspensi dengan menambahkan TB bufer dingin sebanyak 4 ml, kemudian diinkubasi di es selama 10 menit. Setelah itu, ditambahkan dimetil sulfoksida (DMSO) 0.3 ml lalu diinkubasi dalam es selama 10 menit. Hasil inkubasi dipindahkan ke dalam tabung mikro masing-masing 0.2 ml, kemudian simpan pada suhu -80°C. Transformasi Hasil Digesti dengan DpnI ke E.coli DH5α (Zheng et al. 2004). Sel kompeten yang telah dibekukan lebih kurang 1 jam, dicairkan dalam es. Sebanyak 8 µl hasil digesti dimasukkan ke dalam sel kompeten, kemudian diinkubasi dalam es selama 30 menit. Inkubasi pada suhu 42°C selama 1 menit dan diinkubasi kembali dalam es selama 2 menit.Setelah itu ditambahkan medium SOC sebanyak 800 µl dan inkubasi dalam shaker inkubator pada 150 rpm dengan suhu 37°C selama 1 jam. Setelah satu jam, sel disentrifugasi pada 4025 g selama 5 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang sebanyak 800 µl, dan sisanya diresuspensi dengan pelet dan disebar merata pada medium LB agar yang mengandung antibiotik ampisilin 100 µg/ml, kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 37°C. Koloni yang diduga positif (koloni putih) diambil dan dikultur dalam medium LB-ampisilin cair untuk selanjutnya diekstrak plasmidnya dan uji aktivitas xilanase. Isolasi Enzim Xilanase dari Sel E.coli DH5α (Huang et al. 2006). Koloni tunggal E.coli DH5α rekombinan yang ditumbuhkan lebih kurang 18 jam (overnight) dalam media LB-ampisilin 5 ml sebagai starter, diinokulasikan ke dalam 50 ml media LB-ampisilin dan ditumbuhkan selama lebih kurang 18 jam (overnight) pada suhu 37°, 150 rpm. Kultur tersebut disentrifugasi selama 15 menit pada 4025 g 4°C. Bagian supernatan dibuang dan pada bagian pelet ditambahkan bufer natrium phosphat 20mM, pH 7 yang mengandung merkapto 1 mM sebanyak 5 ml. Pelet diresuspensi dengan vortex, kemudian disonikasi dengan sonikator selama 5 menit 20 detik (on-off). Sonikasi dilakukan dalam keadaan dingin dan hasil sonikasi disentrifugasi pada 4025 g 4°C, selama 10 menit. Supernatan diambil dan dilakukan uji aktivitas. Uji Aktivitas Xilanase secara Kuantitatif (Bailey 1992). Sebanyak 400 µl bufer natrium phosphat 50 mM pH 7 dimasukkan ke dalam masing-masing tabung mikro, kemudian masukkan 50 µl substrat beech wood xylan 10%. Setelah itu, diinkubasi pada suhu 50°C selama 1 menit. Masing-masing tabung mikro dimasukkan 50 µl enzim kasar, kemudian diinkubasi pada suhu 50°C selama 5 menit. Setelah itu, dimasukkan 750 µl asam dinitro salisilat (DNS), kemudian disentrifugasi pada 4025 g selama 5 menit. Setelah itu, dipanaskan pada suhu 100°C selama 5 menit dan didinginkan. Sampel diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Blanko dibuat dengan mencampurkan 400 µl buffer Tris-Cl 50 mM pH 8 dengan 50µl substrat beech wood xylan 10%, kemudian dipanaskan pada suhu 50°C selama 1 menit. Setelah itu, diinkubasi pada suhu 50°C selama 5 menit, kemudian ditambahkan dengan 750 µl DNS dan 50 µl enzim kasar. Setelah itu, disentrifugasi pada 4025 g selama 5 menit dan dipanaskan pada suhu 100°C selama 5 menit dan didinginkan pada suhu ruang. Nilai absorbansi blanko diukur pada panjang gelombang 540 nm.
5
Restriksi Mutan Plasmid Rekombinan pGEMakxynaq1cmu (New England Biolabs 2005). Plasmid yang telah diekstrak, selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi. Sebanyak 3 µl plasmid alkxynaq1cmu rekombinan, 0.1 µl enzim restriksi EcoRI, 0.5 µl 10x bufer EcoRI, dan ddH2O dimasukkan dalam tabung mikro kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah 30 menit, plasmid yang telah terpotong oleh enzim EcoRI, dipotong kembali menggunakan enzim restriksi XbaI. Sebanyak 0.1 µl enzim restriksi XbaI, 0.7 µl 10x bufer 2 NEB, dan 1.2 µl ddH2O dimasukkan dalam tabung mikro kemudian inkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah 30 menit, plasmid yang telah terpotong dilihat menggunakan elektroforesis gel agarose. Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu 2 (Zheng et al. 2004) Plasmid pGEMalkxynaq1cmu rekombinan yang telah dimutasi, kemudian dimutasi kembali menggunakan metode SDM PCR. Komposisi bahan yang digunakan yaitu 10x Pfu bufer 2.5 µl, 10 mM dNTP mix 0.75 µl, 3U/µl Pfu DNA Polymerase (invitrogen) 0.5 µl, 1 µl primer forward, 1 µl primer revers, 1-2.5 ng plasmid pGEMalkxynaq1cmu 3 µl, dan ddH2O 25 µl dimasukkan dalam tabung mikro PCR. Mutasi dilakukan menggunakan program denaturasi (hot start) 95°C selama 2 menit, denaturasi 95°C selama 30 detik, annealing (sesuai dengan masing-masing time melting primer) selama 30 detik, dan elongasi 72°C selama 10 menit. Suhu annealing setiap primer berbeda yakni Q53K = 64.6 °C, Q62L = 64.7°C, E146V = 68.9°C, T194I = 64.6°C, dan S330I = 58.5°C. Proses mutasi berlangsung selama 20 siklus, elongasi terakhir pada suhu 72°C selama 5 menit. Produk PCR direstriksi dengan enzim restriksi DpnI dan ditransformasi ke dalam sel kompeten E.coli DH5α. Koloni putih yang tumbuh, kemudian diekstraksi dan diisolasi untuk uji aktivitas enzim xilanase. Plasmid rekombinan yang telah diekstraksi, kemudian di restriksi dengan enzim restriksi EcoRI dan XbaI. Analisis Urutan Nukleotida (sequencing) Plasmid yang membawa gen alkxynaq1cmu yangtermutasi, kemudian dianalisis urutan nukleotidanya untuk mengetahui basa yang terdapat pada gen tersebut telah termutasi. Sebelum itu, plasmid yang akan dianalisis urutan nukleotida harus dipurifikasi. Sebanyak 30 µl polietilen glikol (PEG) 20% 2.5 M NaCl ditambahkan dalam larutan plasmid, kemudian dikocok secara perlahan dan diinkubasi dalam es selama satu jam, kemudian disentrifugasi pada 18894 g 4°C selama 5 menit. Bagian supernatan dibuang dan bagian pelet dikeringkan menggunakan konsentrator.Pelet yang telah kering dilarutkan dalam 20 µl Tris-Cl 10 mM pH 8. Plasmid yang telah dipurifikasi, kemudian dilakukan analisis urutan nukleotida (sequencing) melalui Genetika Science. Analisis data urutan nukelotida dilakukan menggunakan software BLAST, Bioedit, dan Genetic. Analisis Data Data yang diperoleh dari uji aktivitas xilanaseberupa absorban, nilai ini dimasukkan ke dalam kurva standar xilosa. Nilai yang diperoleh dimasukkan dalam rumus aktivitas xilanase (Bailey et al. 1992): Aktivitas enzim (U/ml) = konsentrasi enzim × 1000 × faktor pengenceran Bobot molekul xilosa × Volume enzim × waktu reaksi
6
6
Hasil analisis urutan nukleotida dari Genetica Science, dianalisis kembali menggunakan software BLAST, Bioedit, dan Genetic. Analisis menggunakan software tersebut dapat menunjukkan urutan nukleotida yang termutasi.
HASIL Mutasi Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu Site Directed Mutagenesis Plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu yang diperoleh dari penelitian sebelumnya, kemudian dimutasi. Mutasi dilakukan menggunakan lima pasang primer mutagenik yang dibantu dengan PCR. Hasil amplifikasi menunjukkan plasmid rekombinan yang termutasi memiliki ukuran 4300 pb (Gambar 1). 1
2
3
4
5
M
10000 pb 5000 pb
4000 pb 1000 pb 500 pb
Gambar 1 Hasil amplifikasi SDM PCR pGEMalkxynaq1cmu dengan primer Q53K (1), Q62L (2), E146V (3), T194I (4), & S330I (5) Seleksi Mutan Plasmid Rekombinan Plasmid rekombinan yang termutasi diseleksi untuk kemudian dimutasi kembali. Pemilihan plasmid rekombinan diawali dari hasil ekstraksi plasmid. Hasil ekstraksi plasmid ditunjukkan dengan adanya pita pada gel agarose pada posisi 4300 pb (Gambar 2). Setelah itu, plasmid rekombinan diseleksi menggunakan enzim restriksi XbaI. Hasil restriksi menunjukkan terdapat satu klon (2.2) yang dapat terpotong oleh enzim tersebut pada posisi 300 pb (Gambar 3). 10000 bp
M
1.1 2.2 3.9
4.2
5.2
5000 bp 4000 bp 1000 bp 500 bp
Gambar 2 Hasil ekstraksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu, marker (M), plasmid rekombinan mutasi 1 dengan primer Q53K (1.1), Q62L (2.2), E146V (3.9), T194I (4.2), & S330I (5.2)
7
WT2.2 3.9 4.2 5.2 1.1 M 20000 pb 3000 pb 1500 pb
1000 pb 300 pb
Gambar 3 Analisis hasil restriksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu mutasi 1 dengan enzim restriksi E.coRI dan XbaI, pGEMalkxynaq1cmu (WT), klon termutasi dengan primer Q53K (1.1), Q62L (2.2), E146V (3.9), T194I (4.2), & S330I (5.2)
Aktivitas xilanase (U/ml)
Analisis Ekspresi Plasmid Rekombinan Termutasi Klon termutasi (1.1, 2.2, 3.9, 4.2, dan 5.2) diuji ekspresi proteinnya yaitu dengan pengujian aktivitas enzim xilanase. Pengujian aktivitas ini dilakukan pada suhu 50°C dan pH 7. Nilai aktivitas masing-masing klon berbeda (Gambar 4), klon yang memiliki nilai aktivitas terbesar adalah klon 3.9 (mutasi dengan primer E146V) yakni sebesar 49.2963 U/ml dan klon yang memiliki nilai aktivitas terkecil adalah klon 5.2 (mutasi dengan primer S330I) memiliki aktivitas sebesar 22.7218 U/ml. 49.2963
50 40 30
32.4236
32.283
27.2212
22.7218
20 10 0 1.1
2.2
3.9
4.2
5.1
klon
Gambar 4 Hasil uji aktivitas enzim xilanase pada suhu 50°C dan pH 7
Mutasi Kedua Plasmid Rekombinan pGEMalkxynaq1cmu Site Directed Mutagenesis Klon 3.9 yang memiliki nilai aktivitas tertinggi, dimutasi kembali menggunakan primer Q62L. Klon 3.9 yang telah dimutasi, diberi nama klon mutan (M). Klon ini dianalisis menggunakan enzim restriksi XbaI dan menghasilkan pita pada posisi 300 pb (Gambar 5).
8
8
M1 M2 M3 M4 M5 M
20000 pb 3000 pb 1500 pb 1000 pb 400 pb 300 pb
Gambar 5 Analisis hasil restriksi dengan enzim restriksi E.coRI dan XbaI pada plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu mutasi 2, marker (M), dan sampel mutan 2 dengan primer Q62L (M1-M5) Analisis Ekspresi Plasmid Rekombinan Termutasi Klon yang asam aminonya telah termutasi di dua lokasi (mutasi ganda), kemudian dilakukan analisis ekspresi protein. Analisis ini dilakukan dengan pemgujian aktivitas enzim. Pengujian aktivitas juga dilakukan pada suhu 50°C dan pH 7. Hasil pengujian aktivitas pada klon mutasi ganda, menghasilkan nilai aktivitas yang berbeda pada masing-masing klon, yaitu klon mutan urutan 1 (klon M1) memiliki aktivitas 3.7401 U/ml, mutan urutan 2 (klon M2) sebesar 7.5365 U/ml, mutan urutan 3 (klon M3) memiliki aktivitas sebesar 32.4236 U/ml, mutan urutan 4 (klon M4) memiliki aktivitas 8.2395 U/ml, dan mutan urutan 5 (klon M5) memiliki aktivitas sebesar 0.3656 U/ml (Gambar 6). Hasil tersebut juga menunjukkan klon M3 memiliki nilai aktivitas xilanase tertinggi. 32.4236
Aktivitas xilanase (U/ml)
35 30 25 20 15
5
8.2395
7.5365
10 3.7401
0.3656
0 M1
M2
M3 klon
M4
M5
Gambar 6 Hasil uji aktivitas enzim xilanase dari mutasi kedua pada suhu 50°C dan pH 7
9
Analisis Hasil Urutan Nukleotida (Sequencing) Plasmid rekombinan yang dianalisis urutan nukleotida adalah plasmid klon 2.2, 3.9, dan M3. Berdasarkan hasil analisis urutan nukleotida, klon 2.2 yang dimutasi dengan primer Q62L mengalami mutasi pada urutan asam amino 62 yaitu asam amino glutamin dengan kodon CAA termutasi menjadi asam amino leusin dengan kodon CTA. Klon 3.9 yang dimutasi dengan primer E146V mengalami mutasi pada urutan asam amino 146 yaitu asam amino asam glutamat dengan kodon GAG termutasi menjadi valin dengan kodon GTG. Klon M3 pada mutasi pertama menggunakan primer E146V dan mengalami mutasi pada urutan asam amino 146 yaitu asam amino asam glutamat dengan kodon GAG termutasi menjadi valin dengan kodon GTG, kemudian klon ini dimutasi kembali dengan primer Q62L yakni mengubah asam amino 62 yaitu asam amino glutamin dengan kodon CAA termutasi menjadi asam amino leusin dengan kodon CTA (Lampiran 7 dan 8).
Analisis Termostabilitas Enzim Xilanase Klon yang telah dianalisis urutan nukleotida (sequencing) dan sudah terbukti termutasi, kemudian dilakukan analisis termostabilitas.Hal ini dilakukan untuk mengetahui kestabilan klon yang termutasi dan nilai aktivitas yang dihasilkan oleh masing-masing pada kondisi suhu dan pH yang berbeda. Klon yang dianalisis termostabilitas adalah klon 2.2, 3.9, dan M3.Klon 2.2 (mutasi tunggal) memiliki nilai aktivitas tertinggi pada suhu 50°C pH 7, klon 3.9 (mutasi tunggal) memiliki nilai aktivitas tertinggi pada suhu 50°C pH 7, sedangkan klon M3 (mutasi ganda) memiliki aktivitas tertinggi pada suhu 75°C pH 10 (Gambar 7). 49.30
Aktivitas xilanase U/ml
50.00
45.18 38.30
38.27
40.00 32.42
32.42
30.00
25.03 20.44
19.80 14.56 14.18
20.00 10.00
6.57
0.00 2.2
3.9 Klon
Series1 50° C pH 7
Series2
60°C pH 10
Series3
M3
Series4
70°C pH 10 75°C pH 10
Gambar 7 Hasil uji termostabilitas pada klon mutasi tunggal (2.2 & 3.9) dan mutasi ganda (M3)
10
10
PEMBAHASAN Mutasi ini dilakukan menggunakan primer yang mengandung satu nukleotida missed match pada titik-titik yang telah ditentukan. Masing-masing missed match tersebut dapat mengubah satu asam amino menjadi asam amino lain. Letak penggantian asam amino ditentukan berdasarkan posisi dari α-heliks. Hal ini disebabkan protein termofilik menunjukkan peningkatan hidrofobisitas di daerah α-heliks. Peningkatan hidrofobisitas juga ditemukan dalam residu, dengan demikian peningkatan hidrofobisitas dengan cara subtitusi asam amino menjadi kekuatan pendorong utama dalam mencapai termostabilitas (Joo et al. 2011; Xu et al. 2009; Wang et al. 2010). Mutasi ini dilakukan menggunakan lima primer, primer yang pertama yaitu Q53K (forward) 5’-GCCTTTTGCATGGAAAGTTGCTTCTCT-3’ dan Q53K (revers) 5’-AGAGAAGCAACTTTCCATGCAAAAGGC-3’. Primer ini memutasi gen alkxynaq1cmu pada urutan asam amino 53 yaitu glutamin yang diubah menjadi lisin. Glutamin termasuk asam amino yang bersifat polar. Asam amino tersebut diubah menjadi lisin yang bersifat polar. Primer kedua adalah Q62L (forward) 5’-CTTTCTGAGCGATATCTAGAGCAGTTTGATATT-3’ dan Q62L (revers) 5’-AATATCAAACTGCTCTAGATATCGCTCAGAAAG-3’. Primer ini mengubah asam amino glutamin menjadi leusin pada urutan asam amino 62. Primer ketiga yaitu E146V (forward) 5’-GCCAAGAGAAGGTGTGT GGAACTGGAAAG-3’ dan E146V (revers) 5’-CTTTCCAGTTCCACACACCT TCTCTTGGC-3’, primer ini mengubah asam amino pada urutan 146 yakni asam glutamat yang bersifat polar menjadi valin yang bersifat non-polar. Primer keempat yang digunakan adalah T194I (forward) 5’-GATGGTGGATGAAATAG ACCCAGATAAAC-3’ dan T194I (revers) 5’-GTTTATCTGGGTCTATTTCAT CCACCATC-3’, primer ini mengubah asam amino pada urutan 194 yakni treonin yang bersifat polar menjadi isoleusin yang bersifat non-polar. Primer kelima yaitu S330I (forward) 5’-GAAAAGTTTACGATTTTAGGATTAGAC-3’ dan S330I (revers) 5’-GTCTAATCCTAAAATCGTAAACTTTTC-3’, primer ini mengubah asam amino serin yang bersifat polar menjadi isoleusin yang bersifat non-polar (Genetika Science). Amplifikasi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu menggunakan pasangan primer mutagenik, menghasilkan DNA dengan ukuran yang sesuai dengan harapan yaitu sekitar 4300 pb. Ukuran plasmid sebelum dimutasi dan sesudah dimutasi sama, yakni 4300 pb. Hal ini disebabkan mutasi yang dilakukan adalah subtitusi. Plasmid rekombinan yang telah termutasi, kemudian diekstraksi dan menunjukkan ukuran plasmid pada 4300 pb. Plasmid rekombinan yang telah diperoleh dari hasil ekstraksi, kemudian dipotong dengan enzim restriksi untuk mengidentifikasi keberadaan situs restriksi yang timbul akibat mutasi. Situs restriksi yang muncul akibat mutasi, hanya terdapat pada plasmid yang dimutasi dengan primer Q62L. Primer ini menghasilkan situs enzim restriksi XbaI pada plasmid yang dimutasi. Analisis enzim restriksi dilakukan menggunakan dua enzim restriksi yaitu EcoRI dan XbaI. Enzim EcoRI digunakan untuk memotong gen alkxynaq1cmu berukuran sekitar 1300 pb yang disisipkan ke dalam plasmid pGEM-T yang berukuran 3000 pb. Sementara itu, enzim XbaI digunakan untuk
11
memotong gen alkxynaq1cmu pada posisi nukleotida 300 pb yang merupakan hasil mutasi oleh primer Q62L. Hasil analisis restriksi pada Gambar 3 menunjukkan hanya satu klon, yakni klon 2.2 yang memiliki 3 fragmen DNA berukuran 3000, 1000, dan 300 pb, sementara klon lainnya hanya terdiri dari dua fragmen. Hasil tersebut menunjukkan bahwa klon 2.2 yang dimutasi dengan primer Q62L memiliki situs enzim restriksi XbaI, sedangkan keempat primer lain tidak memiliki situs enzim restriksi XbaI sehingga hanya dihasilkan 2 fragmen. Hal ini disebabkan keempat primer tidak memiliki situs enzim restriksi XbaI. Koloni putih yang tumbuh pada media LB-ampisilin tidak hanya diekstraksi plasmidnya, tetapi juga diuji ekspresi proteinnya melalui pengujian aktivitas enzim xilanase. Pengujian aktivitas ini dilakukan pada suhu 50°C dan pH 7. Hal ini dikarenakan enzim xilanase yang dapat bekerja pada suhu yang tinggi dan pH alkali. Besarnya aktivitas enzim xilanase pada masing-masing klon berbeda. Nilai aktivitas tertinggi dari klon mutasi tunggal, digunakan untuk memilih klon yang akan dimutasi kembali. Klon yang dipilih untuk dimutasi kembali adalah klon 3.9, dengan nilai aktivitas 49.2963 U/ml. Klon 3.9 yang telah termutasi, dimutasi kembali menggunakan primer Q62L. Primer ini mengubah asam amino pada urutan 62 yaitu glutamin menjadi leusin (Sadeghi et al. 2006). Produk PCR yang berupa plasmid rekombinan (mutan 2), direstriksi dengan enzim restriksi EcoRI dan XbaI, kemudian dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarose. Hasil tersebut menunjukkan terdapat dua pita, pita pertama pada posisi 300 pb merupakan insert (mutan 2) dan posisi 1000 pb merupakan gen alkxynaq1cmu. Hal ini menunjukkan bahwa plasmid rekombinan mutasi ganda(klon M1, M2, M3, M4, dan M5) memiliki situs enzim restriksi XbaI. Analisis ekspresi pada klon mutasi ganda, dilakukan dengan uji aktivitas. Pengujian aktivitas ini dilakukan pada suhu 50°C dan pH 7. Hasil pengujian aktivitas pada klon mutasi ganda, menghasilkan nilai aktivitas yang berbeda pada masing-masing klon. Berdasarkan hasil tersebut, dapat terlihat bahwa klon M3 memiliki nilai aktivitas paling tinggi dari pada klon lainnya. Faktor penyebab perbedaan aktivitas pada klon ini, belum diketahui dan diperoleh secara jelas dalam penelitian ini. Klon M3 yang memiliki nilai aktivitas paling tinggi, juga dipilih untuk selanjutnya dianaliasis urutan nukleotida (sequencing). Hasil restriksi menunjukkan bahwa plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu yang dimutasi dengan satu pasang primer dan dua pasang primer menunjukkan hasil yang positif. Hal ini tidak cukup membuktikan bahwa gen alkxynaq1cmu telah termutasi. Oleh karena itu dilakukan analisis urutan nukleotida (sequencing) untuk mengetahui mutasi yang mengubah satu asam amino menjadi asam amino lain. Plasmid rekombinan yang dianalisis urutan nukleotida adalah plasmid klon 2.2, 3.9, dan M3. Hal ini dikarenakan klon 2.2 merupakan klon yang dimutasi dengan primer 2 (Q62L) dan primer ini digunakan pula untuk mutasi kedua pada klon M3.Klon 3.9 merupakan templat yang digunakan untuk mutasi kedua, sedangkan pada klon M3 dilakukan sekuensing untuk melihat terjadi atau tidaknya mutasi kedua oleh primer Q62L. Berdasarkan hasil sekuensing, klon 2.2 yang dimutasi dengan primer Q62L mengalami mutasi pada urutan asam amino 62 yaitu asam amino glutamin dengan kodon CAA termutasi menjadi asam amino leusin dengan kodon CTA. Klon 3.9 yang dimutasi dengan primer E146V mengalami mutasi pada urutan asam amino 146 yaitu asam
12
12
amino asam glutamat dengan kodon GAG termutasi menjadi valin dengan kodon GTG. Klon M3 pada mutasi pertama menggunakan primer E146V dan mengalami mutasi pada urutan asam amino 146 yaitu asam amino asam glutamat dengan kodon GAG termutasi menjadi valin dengan kodon GTG, kemudian klon ini dimutasi kembali dengan primer Q62L yakni mengubah asam amino 62 yaitu asam amino glutamin dengan kodon CAA termutasi menjadi asam amino leusin dengan kodon CTA (Lampiran 7 dan 8). Hasil analisis urutan nukleotida ini menunjukkan bahwa gen alkxynaq1cmu dapat termutasi sesuai dengan primer yang telah didesain dengan metode site-directed mutagenesis. Klon 2.2, 3.9, dan M3 yang telah terbukti termutasi, dianalisis kembali dengan pengujian termostabilitas. Pengujian ini dilakukan pada suhu yang lebih tinggi dari suhu pengujian aktivitas sebelumnya.Hal ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan kerja enzim xilanase pada suhu dan pH tinggi. Hasilnya menunjukkan bahwa klon 2.2 (mutasi tunggal) memiliki aktivitas tertinggi pada suhu 50°C pH 7, sedangkan pada suhu 60°C, 70°C, dan 75°C pH 10 memiliki nilai aktivitas yang rendah. Hal ini juga terjadi pada klon 3.9 yang memiliki aktivitas tertinggi pada 50°C pH 7, sedangkan pada kondisi yang lebih tinggi nilai aktivitasnya rendah. Klon M3 (mutasi ganda) berbeda dengan klon sebelumnya, klon ini memiliki nilai aktivitas tertinggi pada 75°C pH 10 dan pada suhu dan pH yang rendah klon ini memiliki nilai aktivitas yang rendah. Besar kecilnya nilai aktivitas dipengaruhi oleh penggantian asam amino yang terjadi pada mutasi (Liu et al. 2002; Nath et al. 2001). Ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan interaksi elektrostatik merupakan faktor struktural yang dapat meningkatkan termostabilitas (Vieira and Degreve 2009; Kim et al. 2010). Interaksi hidrofobik terjadi pada asam amino yang bersifat non-polar, karena asam amino ini memiliki residu (Mamo et al. 2009; Liu et al. 2012). Residu-residu ini yang akan saling berinteraksi antar molekul hidrofobik sehingga dapat meningkatkan termostabilitas enzim (Kim et al. 2012; Joo et al. 2010). Selain itu, letak asam amino yang dapat meningkatkan termostabilitas terletak pada α-heliks protein, karena pada posisi tersebut terdapat sisi katalitik enzim xilanase (Fenel et al. 2006; Balaa et al. 2009; Xu et al. 2009). Semakin banyak asam amino yang termutasi pada posisi yang tersebut, maka semakin bersifat termostabil (Fenel et al. 2006; Sriprang et al. 2006). Selain itu, faktor internal jembatan sulfida yang terbentuk karena adanya mutasi, dilaporkan dapat meningkatkan termostabilitas enzim (Jeong et al. 2007). Klon yang termutasi pada penelitian ini belum seluruhnya dapat meningkatkan termostabilitas, akan tetapi aktivitas xilanase terbukti dapat ditingkatkan pada klon yang termutasi ganda.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Gen alkxynaq1cmu telah berhasil termutasi menggunakan metode sitedirected mutagenesis PCR. Proses mutasi yang dilakukan menggunakan primer yang mengandung satu nukleotida missed match pada salah satu asam aminonya, telah berhasil mengganti asam amino yang bersifat polar menjadi nonpolar. Klon
13
yang telah termutasi yaitu klon 2.2 dengan pengubahan asam amino glutamin menjadi leusin dan memiliki aktivitas tertinggi 32.42 U/ml pada 50°C pH 7, klon 3.9 dengan pengubahan asam amino asam glutamat menjadi valin dengan nilai aktivitas tertinggi 49.30 U/ml pada 50°C pH 7, dan klon M3 dengan pengubahan dua asam amino yaitu glutamin menjadi leusin dan asam glutamat menjadi valin, memiliki nilai aktivitas tertinggi 45.18 U/ml pada 75°C pH 10 . Saran Saran dari penulis adalah perlu dilakukan karakterisasi enzim xilanase dari gen alkxynaq1cmu yang telah termutasi untuk melihat sifat termostabilitas. Bentuk karakterisasi yang dapat dilakukan adalah dengan analisis profil pH dan suhu, serta termostabilitas dari enzim xilanase mutan.
DAFTAR PUSTAKA Bailey MJ, Biely P, Poutanen K. 1992. Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. J Biotechnol. 23:257-270. Balaa BA, Brijs K, Gebruers K, Vandenhaute J, Wouters J, Housen I. 2009. Xylanase XYL1p from Soytalidium acidophilum: site directed mutagenesis and acidophilic adaptation. Bioresource Technology. 100: 6465-6471. Batubara R. 2006. Teknologi bleaching ramah lingkungan [tesis]. Medan: Program Pascasarjana, Universitas Sumatera Utara. Fenel F, Zitting AJ, Kantelinen A. 2006. Increased alkali stability in Trichoderma reesei endo-1,4-β xylanase II by site directed mutagenesis. Journal of Biotechnology. 121: 102-107. Haroen WK, Artiningsih T. 2004. Penggunaan enzim polyporaceae pada pemutihan pulp kraft Acacia mangium. Prosiding Seminar MIPA IV, ITB. Bandung. hlm 347-351. Huang J, Wang G, Xiao L. 2006. Cloning, sequencing, and expression of the xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia coli. Bioresource Technology. 97: 802-808. Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990.High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96: 23-28. Jeong MY, Kim S, Yun CW, Choi YJ, Cho S. 2007.Engineering a de novo internal disulfide bridge to improve the thermal stability of xylanase from Bacillus stearothermophilus No 236. Journal of Biotechnology. 127: 300-309. Joo JC, Pohkrel S, Pack SP, Yoo YJ. 2010. Thermostabilization of Bacillus circulans xylanase via computational design of a flexible surface cavity. Journal of Biotechnology. 146: 31-39. Joo JC, Pack SP, Kim YH, Yoo YJ. 2011. Thermostabilization of Bacillus circulans xylanase: Computational optimization of unstable residues based on thermal fluctuation analysis. Journal of Biotechnology. 151:56-65. Kim DY, Han MK, Oh HW, Bae KS, Jeong TS, Kim SU, Shin DH, Kim IH, Rhee YH, Son KH, Park HY. 2010. Novel intraselular GH10 xylanase from Cohnella laeviribasi HY-21: Biocatalytic properties and alterations of substrate
14
14
specifities by site directed mutagenesis of Trp residues. Bioresource Technology. 101: 8814-8821. Kim T, Joo JC, Yoo YJ. 2012. Hydrophobic interaction network analysis for thermostabilization of mesophilic xylanase. Journal of Biotechnology. 161: 4959. Liu L, Zeng L, Wang S, Cheng J, Li X, Song A, Wu K, Chen H. 2012. Activity and thermostability increasw of xylanase following transplantation with modules sub-divided from hyper-thermophilic CBM9 1-2. Process Biochemistry. 47: 853-857. Liu X, Qu Y, You F, Liu Y. 2002.Studies on the key amino acid residues responsible for the alkali-tolerance of the xylanase by site directed mutagenesis or random. Journal of Molecular Catalysis Enzymatic. 18: 307-313. Mamo G, Thunnissen M, Kaul RH, Mattiasson B. 2009. An alkaline active xylanase: Insights into mechanisms of high pH catalytic adaptation. Biochimie. 91: 1187-1196. Nath D, Rao M. 2001. pH dependent conformational and structural changes of xylanase from an alkalophilic thermophilic Bacillus sp (NCIM 59). Enzyme and Microbial Technology. 28: 397-403. New England Biolabs. 2005. Catalog and Technical Reference. Jakarta: Gene Craft Labs. Polizeli M, RizzattiACS, Monti R, FterenziH, Jorge JA, Amorim DS. 2005. Xylanases from fungi properties and industrial applications. Journal Applied Microbiol Biotechnol. 67: 577-591. Rifaat HM, Nagieb ZA, Ahmed YM. 2005. Productions of xylanases by Streptomyces sp and theirbleacing effect on rice straw pulp. Environ. 4: 151160. Sadeghi M, Manesh HN, Zarabi M, Ranjbar B. 2006. Effective factors in thermostability of thermophilic protein. Biophysical Chemistry. 119: 256-270. Sriprang R, Asano K, Gobsuk J, Tanapongpipat S, Champreda V, Eurwilaichitr L. 2006. Improvement of thermostability of fungal xylanase by using site directed mutagenesis. Journal of Biotechnology. 126: 454-462. Wang C, Chan H, Lin H, Shyu Y. Production, purification, and characterization of a novel halostable xylanase from Bacillus sp NTU-06. Ann Appl Biol. 156: 187-197. Xu W, Yan M, Xu L, Ding L, Ouyang P. 2009. Engineering the activity of thermophilic xylose isomerase by site directed mutation at subunit interface. Enzyme and Microbial Technology. 44: 77-83. Zhang ZG, Yi ZL, Pei XQ, Wu ZL. 2010. Improving the thermostability of Geobacillus stearothermophilius xylanase XT6 by directed evolution and sitedirected mutagenesis. Bioresource Technology. 101:9272-9278. ZhengL, Baumann U, Reymond JL. 2004. An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol. Nucl Acids Res. 32: 115.
15
Lampiran 1 Strategi Penelitian Analisis enzim restriksi Site-directed Mutagenesis PCR 1 plasmid rekombinan Uji aktivitas
pGEMalkxynaq1cmu
Analisis enzim restriksi Site-directed Mutagenesis PCR 1 plasmid rekombinan
Uji aktivitas
pGEMalkxynaq1cmu
Sekuensing
Uji aktivitas
16
16
Lampiran 2 Site-Directed Mutagenesis Plasmid pGEMalkxynaq1cmu Rekombinan 1
• • • • •
SDM-PCR single mutasi plasmid
Primer Q53K Primer Q62L Primer E146V Primer T194I Primer S330I
pGEMalkxynaq1cmu dengan PfuDNA Polimerase
Digesti produk PCR dengan enzim restriksi DpnI
Transformasi konstruk pGEMTalkxynaq1cmu ke dalam E. coli DH5α kompeten
Seleksi koloni putih biru pada media
Seleksi koloni berzona bening pada
agar LB Ampisilin + IPTG dan X-
media agar LB Ampisilin + xylan
Gal
Kultivasi klon positif dalam media cair LB + Ampisilin pada T= 37ºC, 150 rpm
Assay aktivitas xilanase rekombinan dengan metode Bailey Ekstraksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu (Minipreps)
Analisis enzim restriksi mutan plasmid pGEMakxynaq1cmu rekombinan.
• • •
Mutan plasmid pGEMalkxynaq1cmu
•
rekombinan terverifikasi
•
Mutan 1.1 Mutan 2.2 Mutan 3.9 Mutan 4.2 Mutan 5.2
17
Lampiran 3 Site-Directed Mutagenesis Plasmid pGEMalkxynaq1cmu Rekombinan 2 SDM-PCR double mutasi plasmid
•
Primer Q62L
pGEMalkxynaq1cmu dengan Pfu-
•
Mutan 3.9
DNA Polimerase
Digesti produk PCR dengan enzim restriksi DpnI
Transformasi konstruk pGEMTalkxynaq1cmu ke dalam E. coli DH5α kompeten
Seleksi koloni putih biru pada media
Seleksi koloni berzona bening pada
agar LB Ampisilin + IPTG dan X-
media agar LB Ampisilin + xylan
Gal
Kultivasi klon positif dalam media cair LB + Ampisilin pada T= 37ºC, 150 rpm
Assay aktivitas xilanase rekombinan dengan metode Bailey
Ekstraksi plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu (Minipreps)
Analisa enzim restriksi mutan plasmid pGEMakxynaq1cmu rekombinan.
• • • •
Mutan plasmid pGEMalkxynaq1cmu rekombinan terverifikasi
•
Mutan M1 Mutan M2 Mutan M3 Mutan M4 Mutan M5
18
18
Lampiran 4 Alignment Gen alkxynaq1cmu mutasi tunggal (klon 2.2) dengan program BLAST > gb|AF534180.1| gene, complete cds Length=1470
Bacillus halodurans endo-1,4-beta-xylanohydrolase (xyn10A)
Subject start position Score = 1332 bits (721), Expect = 0.0 Identities = 883/953 (93%), Gaps = 44/953 (5%) Strand=Plus/Plus Query
367
Sbjct
449
Query
427
Sbjct
509
Query
487
Sbjct
569
Query
547
Sbjct
629
Query
607
Sbjct
689
Query
667
Sbjct
749
Query
727
Sbjct
809
Query
787
Sbjct
869
Query
847
Sbjct
929
Query
907
Sbjct
989
Query
967
Sbjct
1048
Query
1027
Sbjct
1106
Query
1087
Sbjct
1163
Query
1147
Sbjct
1215
TTTCTGAGCGATATCTAGAGCAGTTTGATATTGGAGCAGCGGTTGAGCCCTATCAATTAG ||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTCTGAGCGATATCAAGAGCAGTTTGATATTGGAGCAGCGGTTGAGCCCTATCAATTAG
426
AAGGGAGACAAGCCCAAATTTTAAAGCATCATTATAACAGCCTTGTGGCGGAAAATGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGGAGACAAGCCCAAATTTTAAAGCATCATTATAACAGCCTTGTGGCGGAAAATGCAA
486
TGAAGCCTGAATCACCCCAGCCAAGAGAAGGTGAGTGGAACTGGGAAGGCGCTGACAAAA ||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAGCCTGAATCACTCCAGCCAAGAGAAGGTGAGTGGAACTGGGAAGGCGCTGACAAAA TTGTGGAGTTTGCCCGCAAACATAACATGGAGCTTCGCTTCCACACGCTCGTTTGGCACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGTGGAGTTTGCCCGCAAACATAACATGGAGCTTCGCTTCCACACGCTCGTTTGGCACA GCCAAGTACCAGAATGGTTTTTCATCGATGAAGACGGCAATCGGATGGTGGATGAAACAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCAAGTACCAGAATGGTTTTTCATCGATGAAGACGGCAATCGGATGGTGGATGAAACAG ACCCAGATAAACGTGAAGCGAATAAACAGCTGTTATTAGAGCGCATGGAAAACCATATTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCCAGATAAACGTGAAGCGAATAAACAGCTGTTATTAGAGCGCATGGAAAACCATATTA AAACGGTTGTTGAACGTTATAAAGATGATGTGACTTCATGGGACGTGGTCAATGAAGTTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAACGGTTGTTGAACGTTATAAAGATGATGTGACTTCATGGGACGTGGTCAATGAAGTTA TTGACGATGGCGGGGGCCTGCGTGAATCGGAATGGTATCAAATAACAGGCACTGACTACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGACGATGGCGGGGGCCTGCGTGAATCGGAATGGTATCAAATAACAGGCACTGACTACA
508
568 546 628 606 688 666 748 726 808 786 868 846 928
TTAAGGTAGCTTTCGAAACCGCAAGAAAATATGGTGGTGAAGAGGCAAAGTTGTACATTA ||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAAGGTAGCTTTTGAAACCGCAAGAAAATATGGTGGTGAAGAGGCAAAGTTGTACATTA
906
ATGATTACAACACCGAAGTTCCTTCAAAAAGAGATGACCTTTACAACCTGGGTGAAAGAC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| ATGATTACAACACCGAAGTTCCTTCAAAAAGAGATGACCTTTACAACCTGG-TGAAAGAC
966
TTATTAAAGCAAGGGATTGCCAATTGGACGGGGTAGGACATCAGTCCCATATCCAATTCG |||||| ||||||| | ||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||| ||| TTATTAGAGCAAGG-AGTGCCAATTG-ACGGGGTAGGACATCAGTCGCATATCCAAATCG GCTGGCCTTCCATTGAAAATACAAGAACTTCCTTTTGAAAAGTTTACCAAGTTTAGGGAT ||||||||||||||||| |||||||| |||| ||||||||||||||| | ||||||| || GCTGGCCTTCCATTGAAGATACAAGAGCTTC-TTTTGAAAAGTTTACGA-GTTTAGG-AT TAGCCAATCCAGGTAACTGGAGCTAAGACATGAATTCTCTATTGGGCTGGGCCACCGGAC ||| ||||| || |||||| ||||| ||||||| | |||||| || |||| |||||| || TAGACAATCAAG-TAACTG-AGCTA-GACATGAGT-CTCTAT-GG-CTGG-CCACCG-AC AGGGGGCATAACCCCGTCATATGGACGACCTTTCCAACCAAAAATTCCCTTTCAGGCCCA ||||| |||| | | |||||||| ||||| || ||| | | || | || || || ||||| AGGGG-CATA-CAC-GTCATATG-ACGACATT-CCAGC-AGAACT-CC-TT-CAAGCCCA
988
1047 1026 1105 1086 1162 1146 1214 1206 1265
19
Lampiran 4 (lanjutan) Query
1207
Sbjct
1266
Query
1267
Sbjct
1315
AGGCAAGACCGGTTACGATTCAGCtttttttGAAGTTATACAGAAAAAATAAGCCTGGCT |||| ||||| ||||||| |||||||| || ||||||| ||| || || || || || -GGCA-GACCG-TTACGAT-CAGCTTTTC--GA-GTTATAC-GAAGAATTA-GC-TG-CT GGAATATAAACCAAGTGAAACTTTTTCGGGGGGAAATTGCCTGAATAACCATA | | ||| | | | ||| |||||| | |||| || |||| ||| |||||||| G-A-TATTAGC-A-GTGTAACTTTCT-GGGG--AA-TTGC-TGA-TAACCATA
1319 1357
1266 1314
20
20
Lampiran 5 Alignment Gen alkxyn aq1cmu mutasi tunggal (klon 3.9) dengan program BLAST > gb|AF534180.1| gene, complete cds Length=1470
Bacillus halodurans endo-1,4-beta-xylanohydrolase (xyn10A)
Score = 1738 bits (941), Expect = 0.0 Identities = 998/1023 (98%), Gaps = 13/1023 (1%) Strand=Plus/Plus Query
166
Sbjct
280
Query
226
Sbjct
340
Query
286
Sbjct
400
Query
346
Sbjct
460
Query
406
Sbjct
520
Query
466
Sbjct
580
Query
526
Sbjct
640
Query
586
Sbjct
700
Query
646
Sbjct
760
Query
706
Sbjct
820
Query
766
Sbjct
880
Query
826
Sbjct
940
Query
886
Sbjct
1000
Query
946
Sbjct
1060
Query
1006
Sbjct
1120
ATGATAACACTGTTTAGAAAACCTTTTGTTGCTGGGCTAGCGATCTCTTTATTAGTTGGA ||||| ||||| |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGATTACACTTTTTAGAAAGCCTTTTGTTGCTGGGCTAGCGATCTCTTTATTAGTTGGA
225
GGGGGGATCGGCAATGTAGCTGCTGCTCAAGGAGGACCACCAAAATCCGGAGTCTTTGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGGGGATCGGCAATGTAGCTGCTGCTCAAGGAGGACCACCAAAATCCGGAGTCTTTGGA
285
GAAAATGAAAAAAGAAATGATCAGCCTTTTGCATGGCAAGTTGCTTCTCTTTCTGAGCGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAAATGAAAAAAGAAATGATCAGCCTTTTGCATGGCAAGTTGCTTCTCTTTCTGAGCGA
345
TATCAAGAGCAGTTTGATATTGGAGCAGCGGTTGAGCCCTATCAATTAGAAGGGAGACAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATCAAGAGCAGTTTGATATTGGAGCAGCGGTTGAGCCCTATCAATTAGAAGGGAGACAA
405
GCCCAAATTTTAAAGCATCATTATAACAGCCTTGTGGCGGAAAATGCAATGAAGCCTGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCCAAATTTTAAAGCATCATTATAACAGCCTTGTGGCGGAAAATGCAATGAAGCCTGAA
465
TCACCCCAGCCAAGAGAAGGTGTGTGGAACTGGGAAGGCGCTGACAAAATTGTGGAGTTT |||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCACTCCAGCCAAGAGAAGGTGAGTGGAACTGGGAAGGCGCTGACAAAATTGTGGAGTTT
525
GCCCGCAAACATAACATGGAGCTTCGCTTCCACACGCTCGTTTGGCACAGCCAAGTACCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCCGCAAACATAACATGGAGCTTCGCTTCCACACGCTCGTTTGGCACAGCCAAGTACCA
585
GAATGGTTTTTCATCGATGAAGACGGCAATCGGATGGTGGATGAAACAGACCCAGATAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAATGGTTTTTCATCGATGAAGACGGCAATCGGATGGTGGATGAAACAGACCCAGATAAA
645
CGTGAAGCGAATAAACAGCTGTTATTAGAGCGCATGGAAAACCATATTAAAACGGTTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTGAAGCGAATAAACAGCTGTTATTAGAGCGCATGGAAAACCATATTAAAACGGTTGTT GAACGTTATAAAGATGATGTGACTTCATGGGACGTGGTCAATGAAGTTATTGACGATGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGTTATAAAGATGATGTGACTTCATGGGACGTGGTCAATGAAGTTATTGACGATGGC
339
399
459
519
579
639
699
759 705 819 765 879
GGGGGCCTGCGTGAATCGGAATGGTATCAAATAACAGGCACTGACTACATTAAGGTAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGGGCCTGCGTGAATCGGAATGGTATCAAATAACAGGCACTGACTACATTAAGGTAGCT
825
TTCGAAACCGCAAGAAAATATGGTGGTGAAGAGGCAAAGTTGTACATTAATGATTACAAC || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTGAAACCGCAAGAAAATATGGTGGTGAAGAGGCAAAGTTGTACATTAATGATTACAAC
885
ACCGAAGTTCCTTCAAAAAGAGATGACCTTTACAACCTGGTGAAAGACTTATTAGAGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCGAAGTTCCTTCAAAAAGAGATGACCTTTACAACCTGGTGAAAGACTTATTAGAGCAA
945
GGAGTGCCAATTGACGGGGTAGGACATCAGTCGCATATCCAAATCGGCTGGCCTTCCATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAGTGCCAATTGACGGGGTAGGACATCAGTCGCATATCCAAATCGGCTGGCCTTCCATT
1005
GAAGATACAAGAGCTTCTTTTGAAAAGTTTACGAAGTTTAGGATTAGACAATCCAGGTAA |||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| || ||| GAAGATACAAGAGCTTCTTTTGAAAAGTTTACGA-GTTTAGGATTAGACAATCAAG-TAA
1065
939
999
1059
1119
1177
21
Lampiran 5 (lanjutan) Query
1066
Sbjct
1178
Query
1126
Sbjct
1232
Query
1186
Sbjct
1287
CTGGAGCTAGACATGGAGTCTCTTATGGCTTGGCCACCGACCAGGGGCATTACACGTCAT ||| ||||||||||| ||||||| |||||| |||||||||| |||||||| ||||||||| CTG-AGCTAGACATG-AGTCTCT-ATGGCT-GGCCACCGAC-AGGGGCAT-ACACGTCAT ATTGACGAACTTTCCAGCAGAAATCCCTTCAAGGCCCAGGAAGACCGGTACGAATAAGCT || ||||| | ||||||||||| ||| |||||| |||||| |||||| ||||| | |||| AT-GACGA-CATTCCAGCAGAACTCC-TTCAAG-CCCAGGCAGACCGTTACGA-TCAGCT TTT ||| TTT
1188 1289
1125 1231 1185 1286
22
22
Lampiran 6 Alignment Gen alkxynaq1cmu mutasi ganda (klon M3) dengan program BLAST > gb|AF534180.1| gene, complete cds Length=1470
Bacillus halodurans endo-1,4-beta-xylanohydrolase (xyn10A)
Score = 2039 bits (1104), Expect = 0.0 Identities = 1161/1187 (98%), Gaps = 10/1187 (1%) Strand=Plus/Plus Query
168
Sbjct
280
Query
228
Sbjct
340
Query
288
Sbjct
400
Query
348
Sbjct
460
Query
408
Sbjct
520
Query
468
Sbjct
580
Query
528
Sbjct
640
Query
588
Sbjct
700
Query
648
Sbjct
760
Query
708
Sbjct
820
Query
768
Sbjct
880
Query
828
Sbjct
940
Query
888
Sbjct
1000
Query
948
Sbjct
1060
Query
1008
Sbjct
1120
ATGATAACACTGTTTAGAAAACCTTTTGTTGCTGGGCTAGCGATCTCTTTATTAGTTGGA ||||| ||||| |||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGATTACACTTTTTAGAAAGCCTTTTGTTGCTGGGCTAGCGATCTCTTTATTAGTTGGA
227
GGGGGGATCGGCAATGTAGCTGCTGCTCAAGGAGGACCACCAAAATCCGGAGTCTTTGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGGGGATCGGCAATGTAGCTGCTGCTCAAGGAGGACCACCAAAATCCGGAGTCTTTGGA
287
GAAAATGAAAAAAGAAATGATCAGCCTTTTGCATGGCAAGTTGCTTCTCTTTCTGAGCGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAAATGAAAAAAGAAATGATCAGCCTTTTGCATGGCAAGTTGCTTCTCTTTCTGAGCGA TATCTAGAGCAGTTTGATATTGGAGCAGCGGTTGAGCCCTATCAATTAGAAGGGAGACAA |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATCAAGAGCAGTTTGATATTGGAGCAGCGGTTGAGCCCTATCAATTAGAAGGGAGACAA
339
399 347 459 407 519
GCCCAAATTTTAAAGCATCATTATAACAGCCTTGTGGCGGAAAATGCAATGAAGCCTGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCCAAATTTTAAAGCATCATTATAACAGCCTTGTGGCGGAAAATGCAATGAAGCCTGAA
467
TCACCCCAGCCAAGAGAAGGTGTGTGGAACTGGGAAGGCGCTGACAAAATTGTGGAGTTT |||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCACTCCAGCCAAGAGAAGGTGAGTGGAACTGGGAAGGCGCTGACAAAATTGTGGAGTTT
527
GCCCGCAAACATAACATGGAGCTTCGCTTCCACACGCTCGTTTGGCACAGCCAAGTACCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCCGCAAACATAACATGGAGCTTCGCTTCCACACGCTCGTTTGGCACAGCCAAGTACCA
587
GAATGGTTTTTCATCGATGAAGACGGCAATCGGATGGTGGATGAAACAGACCCAGATAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAATGGTTTTTCATCGATGAAGACGGCAATCGGATGGTGGATGAAACAGACCCAGATAAA
647
CGTGAAGCGAATAAACAGCTGTTATTAGAGCGCATGGAAAACCATATTAAAACGGTTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTGAAGCGAATAAACAGCTGTTATTAGAGCGCATGGAAAACCATATTAAAACGGTTGTT
707
GAACGTTATAAAGATGATGTGACTTCATGGGACGTGGTCAATGAAGTTATTGACGATGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAACGTTATAAAGATGATGTGACTTCATGGGACGTGGTCAATGAAGTTATTGACGATGGC
767
GGGGGCCTGCGTGAATCGGAATGGTATCAAATAACAGGCACTGACTACATTAAGGTAGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGGGCCTGCGTGAATCGGAATGGTATCAAATAACAGGCACTGACTACATTAAGGTAGCT
827
TTCGAAACCGCAAGAAAATATGGTGGTGAAGAGGCAAAGTTGTACATTAATGATTACAAC || ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTTGAAACCGCAAGAAAATATGGTGGTGAAGAGGCAAAGTTGTACATTAATGATTACAAC
887
ACCGAAGTTCCTTCAAAAAGAGATGACCTTTACAACCTGGTGAAAGACTTATTAGAGCAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCGAAGTTCCTTCAAAAAGAGATGACCTTTACAACCTGGTGAAAGACTTATTAGAGCAA
947
GGAGTGCCAATTGACGGGGTAGGACATCAGTCGCATATCCAAATCGGCTGGCCTTCCATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAGTGCCAATTGACGGGGTAGGACATCAGTCGCATATCCAAATCGGCTGGCCTTCCATT
1007
GAAGATACAAGAGCTTCTTTTGAAAAGTTTACGAGTTTAGGATTAGACAATCAAGTAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGATACAAGAGCTTCTTTTGAAAAGTTTACGAGTTTAGGATTAGACAATCAAGTAACT
1067
579
639
699
759
819
879
939
999
1059
1119
1179
23
Lampiran 6 (lanjutan) Query
1068
Sbjct
1180
Query
1128
Sbjct
1240
Query
1188
Sbjct
1300
Query
1248
Sbjct
1359
Query
1307
Sbjct
1416
GAGCTAGACATGAGTCTCTATGGCTGGCCACCGACAGGGGCATACACGTCATATGACGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGCTAGACATGAGTCTCTATGGCTGGCCACCGACAGGGGCATACACGTCATATGACGAC
1127
ATTCCAGCAGAACTCCTTCAAGCCCAGGCAGACCGTTACGATCAGCTTTTTGAGTTATAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| ATTCCAGCAGAACTCCTTCAAGCCCAGGCAGACCGTTACGATCAGCTTTTCGAGTTATAC
1187
GAAGAATTAGCTGCTGATATTAGCAGTGTAACTTTCTGGGGGAATTGCTGATAACCATAC ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||| GAAGAATTAGCTGCTGATATTAGCAGTGTAACTTTCTGGGG-AATTGCTGATAACCATAC
1247
ATGGCTTGGATGGCCCCCCTA-AGAAGTACAATAATGGAATTAGGGACCGATGCACCATT |||||||| |||||| | ||| ||| ||||||||||||| | ||||| |||||||||||| ATGGCTTG-ATGGCCGCGCTAGAGA-GTACAATAATGGAGT-AGGGATCGATGCACCATT TGGTTTTTGACC-TAACCATTCGAGGGGAACCTGCCTTACTGG-GAA || ||||||| | |||| || |||| | ||||||| ||||||| ||| TG-TTTTTGATCATAACTAT-CGAGTGAAACCTGC-TTACTGGAGAA
1351 1459
1239
1299
1358 1306 1415
24
25 26
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bandung pada tanggal 30 September 1990 dari bapak Daryono Restu Wahono dan ibu Galuh Kencana.Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Tangerang Selatan dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih mayor Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis mengikuti organisasi Cybertron, yang merupakan salah satu organisasi asrama TPB IPB. Penulis menjadi pengajar Microsoft Office dan desain selama di asrama TPB IPB (2008-2009). Setelah keluar asrama, penulis mengikuti organisasi Koperasi Mahasiswa dari tahun 2009 sampai 2010. Pada organisasi ini, penulis bergabung dalam divisi event organizer. Selama bergabung dalam organisasi ini, penulis beserta anggota event organizer berhasil merangkai beberapa acara, seperti bazaar KOPMA, bazaar telkomsel, pendidikan dasar 1 dan 2 untuk anggota baru KOPMA, dan pembagian jas almamater dan jas laboratorium dalam penerimaan mahasiswa baru. Selain itu, penulis juga mengikuti organisasi Community of Research and Education in Biochemistry (Creb’s) pada tahun 2010-2011 sebagai kepala divisi Fund Rising. Organisasi ini bertugas mencari dana tambahan untuk keperluan kegiatan organisasi. Penulis dan beberapa teman, pada tahun 2011 berkesempatan mengikuti program kreativitas mahasiswa (PKM) yang diterima DIKTI dan dibiayai. Program kreativitas mahasiswa yang lolos dan dibiayai DIKTI yakni berjudul Bakso Talas “EROT” (Enak Rasanya Ok Tempatnya) sebagai Alternatif MakananBergiziKhas Bogor, Sediaan Obat Herbal Antikolesterol berbasis Limbah Kulit Kayu Mahoni (Swietenia marcophylla KING) yang diinduksi terhadap tikus Sprague Dawley, dan Yoghurt Buah Naga untuk Melancarkan Pencernaan dan Kaya akan Provitamin A. Penulis juga mengikuti praktek kerja lapangan di Bioteknologi BPPT-Serpong dan menghasilkan sebuah karya ilmiah yang berjudul Verifikasi Metode Analisis Nitrit dalam Daging Olahan secara Spektrofotometri.
Lampiran 7 Alignment Mutasi Gen alkxynaq1cmu Klon 2.2 dan M3
a
b
c
c
Keterangan : a.plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu double mutation (klon M3) b.plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu single mutation (klon 2.2) c.plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu wild type (tidak dimutasi)
24
25
Lampiran 8 Alignment Mutasi Gen alkxynaq1cmu Klon 3.9 dan M3
a
b
c
Keterangan : a. plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu double mutation (klon M3) b. plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu single mutation (klon 3.9) c. plasmid rekombinan pGEMalkxynaq1cmu wild type (tidak dimutasi)
