Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan Kestabilan Termal Enzim Xilanase Aspergillus niger

Jurnal EduMatSains, 1 (2) Januari 2017, 191-201

Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan Kestabilan Termal Enzim Xilanase Aspergillus niger Nya Daniaty malau*1, Manogari Sianturi2 1,2

Program Studi Pendidikan Fisika, Universitas Kristen Indonesia Jln. Mayjend Sutoyo, No.2, Cawang, Jakarta Timur, 13630 *e-mail: [email protected]

Abstract Enzymes are the same biomolecules such as proteins, has only a functional difference. Enzymes are biocatalyst that recently applied to many industrial fields. To be applied in the field of industrial enzymes should be enhanced stability against temperature. Analysis of the salt bridge is able to demonstrate the potential of residues mutated to improve thermal stability. Molecular dynamics simulations performed by observing the unfolding process. Variations in temperature used is 400 K, 450 K and 500 K, respectively performed for 2.5 ns. Then analyzed the pair a salt bridge is formed. There are 25 pairs of salt bridges at a temperature of 400 K, 24 pairs of salt bridges at a temperature of 450 K, and there are 30 pairs of the salt bridge is formed at a temperature of 500 K. To determine the salt bridge partner is a key enzyme kesstabilan we then plotted salt bridge between distances (Å ) with time (ns) only at a temperature of 500 K, for allegedly at these temperatures has been a process of unfolding. Of the 30 pairs of the salt bridge that had plotted the distance with time, the pair obtained a salt bridge that pattern similar to the pattern chart graph analysis Root-mean-square deviation (RMSD). There are three curves salt bridge that pattern is similar to the pattern of RMSD curve and SASA, namely the salt bridge Glu84-Arg134, Asp104-Arg134 and Asp113-Arg115. The sharp rise in the value of RMSD and the resulting rupture SASA three pairs of the salt bridges. So when carried mutations in-silico candidate mutants that will be transferred is the amino acid residues are thought to play a role in electrostatic interactions and replace it with another amino acid residue on the basis of structural similarities. Keywords: Salt bridge, Electrostatic bond, Mutation, Unfolding

PENDAHULUAN Protein merupakan penyusun kunci

Struktur protein dibagi atas 4 bagian yaitu

dari sel-sel hidup dan terlibat dalam semua

struktur primer, struktur sekunder, struktur

proses dalam kehidupan. Protein disusun

tertier dan kuartener (Triwibowo Yuwono,

dari monomer nya yang disebut asam amino.

2005).

Terdapat 20 jenis asam amino di alam yang

Beragamnya fungsi protein terletak

merupakan penyusun semua jenis protein.

tidak saja dari keragaman susunan asam

Asam amino – asam amino tersebut

aminonya tetapi karena keragaman struktur

dirangkai dalam ikatan peptida. Komposisi

tiga dimensi (struktur sesungguhnya) yang

asam amino dalam ikatan peptida akan

membentuk protein itu sendiri.

menentukan sifat dari struktur protein.

protein 191

hanya

dapat

Fungsi

ditafsirkan

dari

Nya Daniaty Malau, et al.

Jurnal EduMatSains, Januari 2017|Vol.1|No.2

strukturnya (Szila´gyi et al, 2007 ). Untuk

persamaan gerak Newton, metode simulasi

memperoleh bentuk aktifnya secara biologi,

ini merepresentasikan interaksi molekul -

protein dengan struktur sekunder akan

molekul

mengalam pelipatan (folding) untuk dapat

tertentu. Simulasi MD telah memberikan

mencapai struktur aslinya. Pelipatan protein

informasi

di dalam sel merupakan proses kompleks

perubahan konformasi protein. Metode ini

yang membutuhkan bantuan molekul lain

sekarang secara rutin digunakan untuk

dan energi. Kegagalan suatu protein dalam

menyelidiki

proses folding protein (misfolding) ini dapat

termodinamika protein dan interaksi mereka

menyebabkan malfungsi berbagai sistem

dengan substrat, ligan, dan inhibitor (Katrin

biologis yang dapat menimbulkan berbagai

Bidmon ).

penyakit, seperti Alzheimer, parkinson,

rinci

dalam

jangka

tentang

struktur,

waktu

fluktuasi

dinamika

dan

dan

Beberapa penelitian telah dilakukan

katarak dan kanker. Untuk

atom

untuk menyelidiki proses folding dari

menentukan

struktur

tiga

sebuah molekul protein kecil seperti yang

dimensi protein dapat dilakukan dengan

dilakukan

teknik X-ray cristallography untuk melihat

mensimulasikan proses unfolding protein

struktur protein dalam bentuk padat/kristal

kecil Trp-cage miniprotein menggunakan

dan teknik Nuclear Magnetic Resonance

Amberff99SB dengan 40 jenis variasi

(NMR) Spectroscopy untuk melihat struktur

temperatur mulai dari 280 K hingga 539,7

protein

dalam

Day

(2002)

serta

dapat

K dengan waktu total 100 mikro detik dan

struktural

pada

didapat hasil protein unfolding pada suhu

keadaan unfoalded yang penting dalam

dengan nilai tinggi yaitu 450 K. Jinhyuk

karakterisasi

protein.

Lee et al (2003) menyelidiki unfolded pada

Tetapi teknik ini membutuhkan biaya yang

protein kecil 1GB1, 3AIT dan 1A2P

besar dan waktu yang cukup lama jika

menggunakan CHARMM dengan variasi

digunakan

temperatur mulai dari 300K, 400K, 500K,

memberikan

cairan

Ryan

informasi

proses

untuk

pelipatan

mengamati

proses

pelipatan protein. Karena tidak efisien maka ditemukan

teknik

baru

yaitu

600K dan 700K dengan waktu 2ns.

dengan

Penelitian ini akan mengamati proses

Simulasi dinamika molekuler.

unfolding pada enzim Xilanase Aspergillus

Dinamika molekul (MD) simulasi

niger. Enzim merupakan biomolekul sama

adalah salah satu alat utama dalam studi

seperti protein, hanya memiliki perbedaan

teoritis molekul biologis.

fungsi

Berdasarkan 192

saja.

Enzim

merupakan

Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan biokatalisator yang belakangan ini banyak

yang memiliki muatan seperti lisin, arginin,

diaplikasikan pada bidang industri. Enzim

asam aspartat, asam glutamat serta asam

merupakan

yang

amino dari ikatan peptida adalah beberapa

dampak

force penting yang menjaga struktur protein.

pencemaran dan pemborosan energi karena

Secara umum, menguatkan force tersebut,

reaksinya tidak membutuhkan energi tinggi,

misalnya dengan merubah asam amino

bersifat

hydrophilic

diharapkan

katalisator dapat

spesifik,

pilihan

mengurangi

dan

tidak

toksik

dalam

lingkungan

yang

(Aunstrup, 1979). Salah satu jenis enzim

hydrophobic, akan menaikkan stabilitas

yang mempunyai peran penting dalam

protein bersangkutan.

bidang industri adalah enzim xilanase

Dalam

(Marisa, 2013).

Analisa

Karakteristik xilanase yang

ada

saat

komersial

ini memiliki

penelitian

Jembatan

ini

dilakukan

Garam

untuk

Meningkatkan Kestabilan Termal Enzim

suhu

Xilanase

optimum kurang dari 50°C (Dhillon dkk.,

Aspergillus niger Wild Type

(ANX).

2000a) sehingga kurang sesuai dengan kondisi

proses

pra-pemutihan

pulp,

METODE PENELITIAN

sehingga dilakukan berbagai teknik untuk meningkatkan

stabilitas

termal

Waktu dan Tempat Penelitian

enzim

Penelitian

ini

dilakukan

di

tersebut. Salah satu cara yang dapat

Laboratorium Fisika Teori dan Komputasi,

dilakukan

Program

untuk

meningkatkan

termostabilitas suatu enzim adalah dengan

Studi

Pendidikan

Fisika

Universitas Kristen Indonesia.

teknik rekayasa protein. Sifat protein yang mendapat perhatian

Peralatan

dari sekian banyak sifat protein, dalam

Penelitian ini menggunakan peralatan

teknik rekayasa protein adalah stabilitas,

berupa

khususnya stabilitas terhadap suhu. Ini

spesifikasi 3,40 GHz, 12 GB RAM

disebabkan karena sejak proses produksi,

menggunakan sistem operasi Linux Ubuntu

penyimpanan sampai kepada penggunaan,

12.10. Program pendukung VMD 1.9.1

semuanya dipengaruhi oleh panas. Struktur

pada tahap preparasi protein, NAMD 2.9

protein (konformasi) akan mempengaruhi

sebagai simulator, CatDCD 4.0, Gnuplot

fungsinya. Interaksi hidrofobik, jembatan

4.6.4, dan Ms. Excel 2013 sebagai analisa

garam dan interaksi antara asam amino

hasil simulasi. 193

alat

tulis,

komputer

dengan


Jurnal EduMatSains, Januari 2017|Vol.1|No.2 dibutuhkan file parameter medan gaya.

Metode Penelitian

Sebuah

Preparasi Sistem Simulasi

matematis

dari

diperoleh

dalam

Struktur

kristal

enzim

xilanase

medan

gaya

adalah

gaya

potensial

sistem.

ekspresi yang

Sebuah

file

Aspergillus niger (kode PDB: 1UKR)

parameter medan gaya CHARMM berisi

(Krengel

yang

konstanta numerik yang diperlukan untuk

digunakan pada simulasi didapat dari bank

mengevaluasi gaya dan energi, mengingat

data

PSF

dan

Dijkstra,

Protein

Data

1996)

Bank

(PDB)

sebuah

file

struktur

dan

atom

(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do).

coordinates. Parameter CHARMM dapat

Penentuan struktur kristal 1UKR dilakukan

di-download

dengan

dan

//www.charmm.org/. Untuk menjalankan

memiliki resolusi 2.4 Å. Residu asam

simulasi dinamika molekuler dibutuhkan

amino penyusun Xilanase adalah 181 residu.

script. Script simulasi adalah program untuk

File PSF (Protein Structure File) adalah file

menjalankan simulasi NAMD seperti yang

berisikan informasi molekul secara spesifik

diinginkan.

yang dibutuhkan untuk menerapkan medan

konfigurasi dengan menggunakan bahasa

gaya tertentu ke dalam sistem molekul.

scripting Tcl.

Untuk

metode

difraksi

membuat

sinar-X

file

ini

dari

website:

NAMD

http

menjalankan

:

file

NAMD

menyediakan program psfgen.

Simulasi Dinamika Molekul

Untuk lebih menyerupai lingkungan selular,

Simulasi ini dilakukan dengan empat

protein dilarutkan dan dimasukkan kedalam

tahapan menggunakan program NAMD

air. Protein itu dilarutkan dalam bentuk

dengan masukan awal file konfigurasi.

kotak dengan ukuran 100 Å x 100 Å x 100

File ini sebagai pengontrol sistem yang

Å yang berisi molekul air. Molekul air yang

berisi parameter

dipilih sebagai pelarut eksplisit (solvasi)

simulasi. File topologi yang digunakan

pada sistem simulasi adalah model molekul

adalah par_all27_prot_na_lipid.inp. Tahap

air

periodic

pertama adalah minimisasi. Minimisasi

boundary condition (PBC). Sistem ini

bertujuan untuk meminimalkan energi pada

dinetralkan

ion

molekul. Masukan awal adalah file struktur

fisiologis

dan file psf hasil dari preparasi molekul.

TIP3P

(NaCl)

dengan

dengan

pada

menggunakan autoionize plugin.

metode

menambahkan

konsentrasi VMD Dalam

solvate simulasi

dalam

menjalankan

dan

Kedua, pemanasan, masukan awal adalah

ini

hasil dari minimisasi. Pada awal simulasi 194

Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan sistem bersuhu 0 K, suhu akhir akan

Interaksi elektrostatik yang sering

divariasikan menjadi 400 K , 450 dan 500

disebut sebagai interaksi pasangan ion

K. Ketiga, ekuilibrasi, suhu sistem dijaga

(ion pairs

konstan

Zeikus 2001) atau jembatan garam (salt

dengan

protokol

Langevin.

interaction)

(Vieille

interaksi

dan

Kemudian tahap terakhir adalah production

bridge) merupakan

antara

run. Pada tahap inilah simulasi dinamika

residu-residu

molekul dijalankan. Molekul dibiarkan

Penelitian mengenai pentingnya interaksi

bebas bergerak dengan cara suhu sistem

elektrostatik pertama kali dilaporkan oleh

tidak dikontrol lagi. Tahap ini dilakukan

Perutz (1978) yang menyatakan bahwa

selama 2.5 ns untuk suhu 400K, 450K dan

interaksi ini memiliki kontribusi signifikan

500 K.

untuk menstabilkan protein.

asam amino bermuatan.

Keluaran dari tahap akhir simulasi dinamika molekul adalah file dcd. File

HASIL DAN PEMBAHASAN

ini divisualisasikan pada program VMD. Data

yang

tersebut

kristalisasi oleh Krengel dan Dijkstra

dibutuhkan

pertama kali pada tahun 1996 dengan

analisis jembatan garam dalam

resolusi struktur kristal 2,4 Angstrom.

menghasilkan untuk

diperoleh

Xilanase Aspergillus niger berhasil di

grafik

yang

meningkatkan kestabilan termal

enzim

Struktur ANX ini diambil dari protein data

xilanase Aspergillus niger.

bank (PDB) dengan kode 1UKR dengan berat molekul 13,5 - 14 kDa (Beg dkk., 2001), suhu 22oC sedangkan asam amino

Prosedur Analisa Data Analisa simulasi dinamika molekul

penyusun adalah 181 asam amino.

pada enzim xilanase Aspergillus niger

Representasi

struktur

sekunder

dilakukan untuk mengetahui fleksibilitas

secara new cartoon menggunakan program

enzim dan perubahan struktur yang terjadi.

VMD (Humprey et al. 1996), dapat dilihat

Parameter yang dianalisis antara lain adalah

pada Gambar 1.

Jembatan Garam/ Interaksi elektrostatik.

195



Gambar 1. Representasi struktur sekunder enzim Xilanase Aspergillus niger Interaksi elektrostatik yang sering disebut

jembatan

jembatan garam pada temperatur 450 K dan

garam merupakan

ada 30 pasang jembatan garam yang

interaksi antara residu-residu asam amino

terbentuk pada temperatur 500 K, masing-

bermuatan. Terdapat 25 pasangan jembatan

masing selama 2.5 ns. Perhatikan pada tabel

garam pada temperatur 400 K, 24 pasang

1.

Tabel 1. Pasangan jembatan garam yang muncul selama simulasi 2.5 ns pada suhu 400 K Suhu 400 K

Suhu 450 K

Suhu 500 K

Glu 84 Segname P4 – Arg134


GLU84 segname P4-ARG134

Segname P4

Segname P4

segname P4




Segname P2

Segname P1

segname P1

Asp 113 Segname P2 – Arg115



Segname P2

Segname P2

segname P3


Asp 104 Segname P1 - Arg138

ASP113 segname P2-ARG115

Segname P3

Segname P1

segname P2


ASP113 segname P2- ARG115


Segname P2

segnameP2

segname P1


GLU118 segname P3 -ARG115


Segname P1

segname P3

segname P3

Asp 104 Segname P3 - Arg134



Segname P3

segname P1

segname P2




Segname P1

segname P3

segname P2

196

Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan Asp 104 Segname P2 – Arg134



Segname P2

segname P2

segname P1




Segname P4

segname P4

segname P3




Segname P4

segname P1

segname P3




Segname P1

segname P3

segname P4




Segname P1

segname P1

segname P2




Segname P2

segname P3

segname P1




Segname P3

segname P4

segname P1




Segname P3

segname P2

segname P1




Segname P1

segname P4

segname P2




Segname P3

segname P3

segname P4




Segname P4

segname P4

segname P4




Segname P4

segname P2

segname P4




Segname P2

segname P4

segname P3



ASP104 segnameP2-ARG138

Segname P3

segname P2

segnameP2



GLU118 segnameP4-ARG115

Segname P1

segname P3

segnameP4



GLU84 segnameP2-ARG134

Segname P4

segname P1

segnameP2


ASP113 segnameP4-ARG115

Segname P2

segname P4

197


Jurnal EduMatSains, Januari 2017|Vol.1|No.2 GLU135 segname P1-ARG138 segname P1 ASP104 segname P3-ARG138 segnameP3 GLU84 segnameP1-ARG138 segnameP1 ASP37 segnameP2-ARG115 segnameP2 ASP37 segnameP1-ARG115 segnameP1

Untuk menentukan pasangan jembatan

Arg115. Perhatikan gambar 2. Kenaikan

garam yang menjadi kunci kesstabilan

tajam nilai RMSD dan SASA tersebut

enzim maka selanjutnya jembatan garam

disebabkan

diplot antara jarak (Å) dengan waktu (ns)

jembatan garam tersebut. Sehingga ketika

hanya yang pada suhu 500 K, karena diduga

dilakukan mutasi secara in-silico calon

pada suhu tersebut telah terjadi proses

mutan yang akan dimutasi adalah residu-

unfolding.

residu asam amino yang diduga berperan

Dari 30 pasang jembatan garam yang

dalam

putusnya

interaksi

ketiga

pasang

elektrostatik

dan

telah diplot antara jarak dengan waktu,

menggantinya dengan residu asam amino

maka diperoleh pasangan jembatan garam

yang lain atas dasar kemiripan struktur.

yang pola grafiknya sama dengan pola

Selain

grafik analisa Root-mean-square deviation

elektrostatiknya ketiga pasang jembatan

(RMSD).

garam ini akan kehilangan energinya mulai

itu,

jika

diamati

dari

energi

Selanjutnya jembatan garam diplot

pada selang waktu 0.5 ns hingga 1.5 ns,

antara jarak (Å) dengan waktu (ns). Ada

waktu ini sama dengan waktu unfolding nya.

tiga kurva jembatan garam yang polanya

Ini menandakan bahwa kedua pasang

sama dengan pola kurva RMSD dan SASA

jembatan garam ini merupakan pengunci

yang mana jarak jembatan

kestabilan

garamnya

meningkat mulai pada selang waktu 0.5 ns

Aspergillus niger.

hingga 1.5 ns, yaitu jembatan garam Glu84Arg134,

Asp104-Arg134

dan

termal

Asp113-

198

enzim

Xilanase

Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan

(a)

(b)

(c) Gambar 2. Jarak jembatan garam antara (a) Glu84-Arg134 (b) Asp104-Arg134 (c) Asp113-Arg115 199



KESIMPULAN

review. Applied Microbiology and

Enzim lipase Xilanase Aspergillus niger

Biotechnology. 56: 326-338

mengalami unfolding pada temperatur 500 K

saat

2.5

ns.

Residu-residu

David B. Kony, Philippe H. Hu¨nenberger,

yang

Wilfred F. Van Gunsteren. 2007.

bertanggung jawab terhadap kestabilan

Molecular dynamics simulations of

termal enzim Xilanase Aspergillus niger

the native and partially folded states

berdasarkan analisa pasangan jembatan

of ubiquitin: Influence. of methanol

garam atau

interaksi elektrostatik yaitu

cosolvent, pH, and temperature on

pasangan asam amino Glutamat pada residu

the protein structure and dynamics.

84 dan Arginin pada residu 134 , pasangan

Protein Science. 16 : 1101-1118

asam amino Asam Aspartat pada residu 104

Dhillon, A., J. K. Gupta, and S. Khanna.

dan Arginin pada residu 134 serta pasangan

2000a.

asam amino Asam Aspartat pada residu 113

purification and characterization of

dan Arginin pada residu 115. Sehingga

a novel cellulase-poor thermostable,

berdasarkan

alkalitolerant xylanase from Bacillus

Interaksi

Elektrostatik/

Enhanced

jembatan garam ketiga pasang jembatan

circulans

garam

Biochemistry. 35:849- 856

ini

memiliki

meningkatkan

potensi

kestabilan

dilakukan mutasi

untuk

termal

AB

production,

16.

Process

jika

Humphrey W, Dalke A, Schulten K. 1996.

pada ketiga pasang

VMD: visual molecular dynamics. J. Mol. Graph, 14(1) : 27 – 38.

jembatan garam tersebut.

Jinhyuk Lee, Soonmin Jang, Youngshang Pak, and Seokmin Shin. 2003. Folding Dynamics of β-Hairpins:

DAFTAR PUSTAKA Aunstrup, K.O., Andressen, Falch, and Nielsen. Microbial

1979.

Production

Enzymes.

Molecular Dynamics Simulations.

of

Korean Chem. 24 (6) : 787-791

Microbial

Katrin Bidmon dan Guido Reina. Time-

Technology. Vol. 1. Academic Press

Based Haptic Analysis of Protein

Inc. New York

Dynamics.

Beg, Q. K., M. Kapoor, L. Mahajan, and G.S.

Visualization

and

Interactive Systems Group (VIS).

Hoondal. 2001. Microbial xylanases

University of Stuttgart, Germany

and their industrial applications: a

Krengel, U. and B.W. Dijkstra. 1996. Three-dimensional 200

structure

of

Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan Endo-1,4-beta-xylanase

I

from

Stumpe,

Martin.

2007.

De

Aspergillus niger: molecular basis

denaturantium-On

for its low pH optimum. J.Mol.Biol.

basis

263: 70-78

denaturation [disertasi]. Der Georg-

of

the

natura

molecular

urea-indunced

protein

Marisa A. Lima. 2013. Aspergillus nigerβ-

August-Universitat zu Gottingen :

Glucosidase Has a Cellulase-like

der Matematish-Naturwissen schaft

Tadpole

lichen Fakultaten

Molecular

Shape.

The

Journal of Biological Chemistry.

Szila´gyi. A, Kardos J. Osva´th. S. Barna

288 : 32991-33005

L. Za´vodszky. P. Protein Folding.

Perutz M. 1978. Electrostatic effects in proteins.

Science.

Vieille

201(4362) :

C,

Zeikus

GJ.

Hyperthermophilic

1187-1191.

sources,

Rico, Manuel . Protein structure, dynamics

uses,

mechanisms

for

2001. enzymes:

dan

molecular

thermostability.

and function by NMR. Instituto de

Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65(1) : 1-

Química Física “Rocasolano”. Spain

43.

Ryan Day, Dietmar Paschek, and Angel E. Garcia.

2002.

Yuwono,

Microsecond

Triwibowo.

2005.

Biologi

Molekuler. Jakarta : Erlangga. Hlm

simulations of the folding/unfolding

23-25

thermodynamics of the Trp-cage mini protein. Proteins. 78 : 18891899

201

Analisa Jembatan Garam untuk Meningkatkan Kestabilan Termal Enzim Xilanase Aspergillus niger

Recommend Documents