Hermin Kombong/J. Prog. Kim. Si. 2011, 1 (1): 8-15
Isolasi Enzim Amiloglukosidase Terimmobilisasi dari Aspergillus Niger Ampas Tepung Sagu Hermin Kombong1) * 1) Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Haluoleo,Kendari, 93232, Indonesia Abstract Amyloglucosidase enzyme was isolated using the media of sago waste flour by batch culture method during 4 (four) days at 32 °C. The supernatant of crude amiloglucosidase was obtained by purification with (NH4)2SO4 80 % (w/v) and then further purification by means of Sepadex G-200 column chromatography. The purified amyloglucosidase enzyme was characterized at the interval of temperature, pH, and concentration of starch substrate are 30-70 °C, 2.5-8.0, and 0.5-3.0%, respectively. The isolate of Aspergillus niger from sago waste flour give the clear zone at the starch agar media by iod reagen addition. The specific activity of enzyme is 0.071 U/mg of protein. The purified enzyme by (NH4)2SO4 shows the specific activity of 0.210 U/mg of protein and increase more three time than the crude enzyme. The specific activity of the enzyme which purified by Sepadex G-200 column chromatography is 1.921 U/mg and more pure 27.1 times than crude enzyme. The optimum temperature, pH, and substrate concentration were obtained at 45 °C, 6.4 and 2.0%, respectively. Keywords: Aspergillus Niger, amyloglucosidase, enzyme, sago waste starch Received: 18 April 2011 Accepted: 29 June 2011 Abstrak Enzim amiloglukosidase dari Aspergillus niger telah diisolasi menggunakan media ampas tepung sagu melalui fermentasi sistem bacth (kultur curah) selama 4 hari pada suhu 32 °C. Supernatan amiloglukosidase kasar diperoleh melalui pemurnian hasil fermentasi dengan (NH4)2SO4 80 % (b/v) dan dilanjutkan dengan kolom kromatografi gel Sepadex G-200. Amiloglukosidase hasil pemurnian dikarakterisasi pada interval suhu 30-70 °C , pH interval 2,5-8,0, dan konsentrasi substrat pati pada interval 0,5-3,0%. Hasil karakterisasi isolat kapang A.niger ampas tepung sagu memberikan zona bening pada media agar pati dengan penambahan reagen iod. Aktivitas spesifik enzim adalah 0,071 U/mg protein. Pemurnian dengan (NH4)2SO4 menunjukkan aktivitas spesifik 0,210 U/mg protein dengan tingkat kemurnian 3 kali dari enzim kasar. Pemurnian dengan kolom kromatografi meningkatkan kemurnian 27,1 kali dari enzim kasar dan aktivitas spesifiknya adalah 1,921 U/mg protein. Suhu, pH, konsentrasi substrat optimum dari amiloglukosidase diperoleh pada masing-masing 45 °C, 6,4 dan 2,0%. Kata Kunci : Aspergillus niger, Amiloglukosidase, Ampas tepung sagu Diterima: 18 April 2011 Disetujui untuk dipublikasikan: 29 Juni 2011 *Penulis Korespondensi/corresponding author: Telp.+ 62 0401 3190877 Fax. +62 0401 3190496 E-mail:
[email protected]
8
Hermin Kombong/J. Prog. Kim. Si. 2011, 1 (1): 8-15
Sekarang ini pengadaan bahan baku
1. Pendahuluan
sumber
Mikroba sebagai mesin hayati yang
mengatasi
dapat mensintesis banyak enzim yang dapat
berfungsi
metabolisme,
dalam
murah,
Untuk
masalah ini, maka digunakan
mudah diperoleh [3,4]. Selain itu tepung sagu jika ditinjau dari kandungan kimianya
beberapa keuntungan, yaitu di antaranya relatif
mahal.
enzim yang harganya lebih murah dan
dan autolisis. Penggunaan
produksi
cukup
tepung sagu sebagai bahan baku sumber
pertumbuhan,
mikroba sebagai penghasil enzim memiliki
biaya
enzim
memiliki potensi untuk digunakan sebagai
dapat
sumber enzim amiloglukosidase dengan
diproduksi dalam waktu singkat sesuai
memanfaatkan A. niger hasil isolasi dari
dengan permintan, memiliki kecepatan
ampas tepung sagu
tumbuh yang tinggi serta mudah dikontrol
Daya hidrolitik suatu enzim dapat
[1].
bervariasi Kapang A. niger memiliki keunggulan
meskipun
enzim
tersebut
berbeda, hal ini sangat dipengaruhi oleh
dalam memproduksi enzim glukoamilase
mikroba
jika dibandingkan dengan jenis kapang
digunakan. Stabilitas aktivitas dan kondisi
lainnya. Oleh karena A. niger pada kondisi
optimumnya
pH optimum 4,0-4,5 dengan suhu efektif
lingkungan seperti pH, suhu, bahan aditif,
sumber
dan
substrat
dipengaruhi
oleh
yang
faktor
°
60 C yang ditumbuhkan pada pati hanya
dan jenis uji yang digunakan [2,3].
menghasilkan enzim amiloglukosidase [1].
Dengan kemajuan teknologi fermentasi
Enzim amiloglukosidase menghidrolisis
dan rekayasa genetik telah meningkatkan
ikatan glikosida α 1-4 dan
hasil produksi enzim glukoamilase dari
menghasilkan glukosa, sehingga enzim ini
kapang [4]. Hasil penelitian menunjukkan
dapat digunakan untuk pembuatan gula
bahwa enzim amiloglukosidase mutan F-
glukosa
yang
2035 diperoleh dari A. awamori var, dapat
mengandung pati. Glukosa yang diperoleh
mencerna pati jagung mentah dua kali lebih
dari hasil hidrolisis diukur dengan cara
cepat dari glukoamilase lanilla [3, 5].
pati pada
dari
tepung
penentuan gula pereduksi
sagu
dengan cara
Dalam penelitian ini telah diisolasi dan
Smogy-Nelson dan DNS (asam 3,5 dinitro
dikarakterisasi
salisilat) [1, 2]
menggunakan media ampas tepung sagu
9
enzim
amiloglukosidase
Hermin Kombong/J. Prog. Kim. Si. 2011, 1 (1): 8-15
melalui fermentasi sistem bacth (kultur
dextro
Agar),
pembuatan
substrat
curah).
fermentasi ampas sagu pembuatan nutrien, inokulsi A. niger pada media ampas tepung
2. Bahan dan Metode
sagu untuk isolasi enzim amiloglukosidase,
2.1. Bahan dan Alat yang Digunakan
fermentasi dengan sistem bacth selama 4 hari pada suhu 32
Bahan yang akan digunakan dalam
°
C, panenan hasil
penelitian ini, diantaranya: Potata Dextro
fermentasi (isolasi) enzim, dengan sentrifus
Agar (PDA), pereaksi Somogy-Nelson,
pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit,
amilum murni (starct), glukosa murni
karakterisasi
(larutan
nutrisi
dengan pengujian aktivitas terhadap media
pertumbuhan yang terdiri atas: amonium
uji pati murni (starch), Sedangkan untuk
sulfat, MgSO4.7H2O, KH2PO4, dan ZnSO4,
melihat kecepatan reaksinya digunakan
dan pati sagu, larutan buffer fosfat, aquades
variasi terhadap: pengaruh suhu dan pH,
steril, dan kultur murni A. niger.
Enzim
Alat
standar),
larutan
yang digunakan,
enzim
amiloglukosidase
dimurnikan
dengan
fraksi
(NH4)2SO4 80% (b/v) yang kemudian
diantaranya:
autoklaf, inkubator, pH meter, timbangan
dilanjutkan
analitik, spektrofotometer 20 D, sentrifus,
Sepadex
penangas air, pengaduk magnet, dan alat-
dikarakterisasi untuk mengetahui suhu
alat gelas yang umum digunakan di
maksimum,
Laboratorium
optimumnya. Glukosa hasil aktivitas enzim
kimia,
seperti:
pipet
kolom G-200.
pH,
kromatografi Hasil
dan
dari
gel
pemurnian
konsentrasi
volumetrik, pipet ukur, gelas kimia, gelas
amiloglukosidase
pati
murni
ukur, tabung reaksi, elenmeyer, gelas ukur,
ditentukan dengan metode Smogy Nelson
botol semprot.
dan DNS menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm dan kadar protein
2.2. Isolasi Enzim Amiloglukosidase Penelitian
ini
dilakukan
ampas
tepung
sagu,
ditentukan
dengan
metode Biuret pada panjang gelombang
dalam
540 nm.
beberapa langkah, isolasi kapang A. niger dari
terlarutnya
Aktivitas
pengujian
amiloglukosidase
diukur,
kemampuan A. niger pda media agar pati
dengan
dengan reagen iod, peremajaan kultur
A.
kasar dan dimasukkan ke dalam 4 mL
dalam media padat PDA (Potato
larutan pati 4% dalam larutan buffer asetat
niger
10
mengambil 1 mL filtrat enzim
Hermin Kombong/J. Prog. Kim. Si. 2011, 1 (1): 8-15
pH 4,8. Aktivitas glukoamilase diukur
selama 30 menit. Larutan tersebut di atas
dengan mengukur jumlah kadar glukosa
dipipet 5 mL ke dalam gelas kimia 50 mL
yang terbentuk pada suhu 60 °C selama 1
dan ditambahkan 5 mL larutan pereaksi
jam.Pengukuran aktivitas amiloglukosidase
Somogy, kemudian diletakkan dalam air
dilakukan
mendidih
dengan
4
macam
variasi
selama
15
menit.
Larutan
konsentrasi pati sebagai media uji (2%,
kemudian didinginkan, lalu ditambahkan 2
4%, 6%, dan 8%) dengan suhu bervariasi ,
mL larutan Iod-asetat dan 3 mL larutan
yaitu dari 30 °C sampai 70 °C. dan pH
H2SO4 2 N,. Larutan dikocok perlahan-
divariasi mulai dari 2,5- 8,0
lahan
Pengaruh hidrolitik
suhu
terhadap
hingga
semua
endapan
larut.
reaksi
Larutan dibiarkan dalam air dingin
dan denaturasi enzim dapat
selama 5 menit, sambil dikocok beberapa
ditunjukkan dengan persamaan Arrhenius:
kali.
Larutan dititrasi dengan larutan
Na2S2O3 0,005 N yang sudah distandarisasi k = Ae − Ea
RT
(b mL). Dibuat pula blanko dengan cara
(1)
yang sama (a mL). Dengan
Aktivitas
k, Ea, A, R, T masing-masing
amiloglukosidase
dinyatakan dalam satuan Unit Aktivitas
adalah tetapan laju reaksi, Ea = energi
Amiloglukosidase (UAA) ataau unit per
aktivasi (11 kkal/g mol), tetapan Arrhenius,
mL filtrat enzim. Satu unit aktivitas setara
tetapan gas, dan suhu absolut.
dengan 1 mikromol glukosa (sebagai gula
Pengaruh pH terhadap reaksi hidrolitik
pereduksi) yang dihasilkan dari perlakuan
enzim amiloglukosidase ditentukan dengan menggunkan kurva
enzim
enzim tersebut di atas.
untuk melihat pH
Perhitungan
aktivitas amiloglukosidase dapat dihitung
optimum dengan kadar glukosa tertinggi
dengan rumus seperti berikut ini:
[4]. 2.3. Penentuan Aktivitas Amiloglukosidase Sepuluh mL larutan pati 1% dipipet ke
×1000 UAA = 0,1099(a − b ) + 0,048 s×180
dalam tabung reaksi dan ditambahkan 0,5 mL filtrat enzim, kemudian diletakkan dalam penangas air pada suhu 37-40 0C
11
(2)
Hermin Kombong/J. Prog. Kim. Si. 2011, 1 (1): 8-15
dimana UAA adalah unit aktivitas enzim
bening kemudian diperbanyak/diremajakan
amiloglukosidase, a adalah jumlah mL
dalam media agar miring untuk keperluan
titran Na2S2O3 untuk blanko,
produksi enzim.
b adalah
jumlah mL titran Na2S2O3 untuk sampel, c
adalah
faktor
pengenceran,
3.2. Produksi dan Pemurnian Amiloglukosidase Produksi amiloglukosidase dari isolat
s
merupakan bobot sampel (g).
kapang yang diperoleh dilakukan dengan
3. Hasil dan Pembahasan
fermentasi sistem batch (kultur curah).
3.1. Isolasi Kapang Aspergilus Niger
Fermentasi
Isolasi kapang A. niger diawali dengan membiarkan
ampas
sagu
ini
dilakukan
dengan
memanfaatkan ampas tepung sagu sebagai
mengalami
induser amiloglukosidase yang merupakan
pembusukan oleh mikroorganisme. Setelah
enzim
tampak
oleh
Fermentasi berlangsung pada suhu 32oC
kemudian
dengan shaker selama empat hari yang
disuspensikan ke dalam larutan fisiologis
didasarkan pada hasil pengukuran optical
NaCl 1% steril dan disebarkan di atas
density dari spora A. niger.
adanya
mikrorganisme,
media
PDA
pembusukan limbah
diinkubasi
dari
A.
niger.
selama
Hasil fermentasi dimurnikan melalui
beberapa hari pada suhu 32 °C. Proses
sentrifus dengan kecepatan 3500 rpm
isolasi ini dilakukan berulang-ulang hingga
selama 15 menit untuk memisahkan cairan
diperoleh kultur kapang A. niger murni.
enzim dari sel-sel kapang dan sisa media
Kapang
dan
ekstraseluler
A. niger tampak sebagai
fermentasi. Supernatan yang diperoleh
koloni dengan hifa berwarna putih pada
merupakan enzim kasar yang selanjutnya
tahap awal pertumbuhan seperti terlihat
dimurnikan melalui fraksinasi (NH4)2SO4
pada Gambar 1. Setelah empat hari,
80% (b/v). Hasil fraksinasi (NH4)2SO4 80%
konidianya mulai tumbuh di atas hifa yang
(b/v) mampu meningkatkan kemurnian
tampak
kecokelatan.
enzim hingga 3 kali dari enzim kasarnya
Kemampuan amilolitik isolat kapang yang
dengan aktivitas spesifik 0,210 U/mg
diperoleh diuji dengan menumbuhkan pada
protein.
media agar pati dan mengamati zona
fraksinasi (NH4)2SO4 80% (b/v), kemudian
bening dengan menggunakan reagen Iod.
diaplikasikan ke dalam kolom filtrasi gel
berwarna
hitam
Isolat A. niger yang memperlihatkan zona 12
Enzim
yang
diperoleh
dari
Hermin Kombong/J. Prog. Kim. Si. 2011, 1 (1): 8-15
Koloni A. niger
Zona bening bening
Kultur A. niger dalam media agar miring
Pembentukan zona bening
Gambar 1. Isolat kapang A. niger
0.6
Aktivitas
[Protein]
1.2 0.4
1
0.3
0.8 0.6
0.2
0.4 0.1
[P ro tein ] (m g /m L )
1.4
0.5
A k tiv ita s (U /m L )
1.6
0.2
0
0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 F14 F15 F16 F17 F18 F19 F20
No. Fraksi
Gambar 2. Pola protein (λ=540 nm) dan aktivitas amiloglukosidase (λ=560 nm) hasil filtrasi gel Sephadex G-200 dengan ukuran 2,5 x 25 cm pada elusi buffer phosfat pH 6,4 dengan menggunakan
Sephadex
pemisahan dengan diperoleh
pola
Hasil
Hasil pemisahan menunjukkan tiga
Sephadex G-200
puncak protein, tetapi yang memiliki
protein
G-200.
dan
aktivitas
aktivitas amiloglukosidase hanya pada
amiloglukosidase seperti pada Gambar 2.
puncak protein antara fraksi F11-F18 sedangkan 13
fraksi
yang
lain
tidak
Hermin Kombong/J. Prog. Kim. Si. 2011, 1 (1): 8-15 menunjukkan
Fraksi
denaturasi
enzim
enzim yang memiliki aktivitas tertinggi
Sedangkan
pengamatan
adalah F15 dengan aktivitas 0,484 U/mL.
terhadap
aktivitas
Proses
adanya
aktivitas.
pemurnian
Sephadex
G-200
telah
pada
suhu
tinggi.
pengaruh
pH
amiloglukosidase
menggunakan
menunjukkan
pH
optimum
meningkatkan
amiloglukosidase berada pada pH 6,4 (Gambar 4).
aktivitas amiloglukosidase sebesar 1,921 U/mg protein. Dengan demikian tahap
100 A k tiv ita s R ela tif (% )
filtrasi gel telah meningkatkan kemurnian enzim 27 kali dari enzim kasarnya.
A k tiv ita s R ela tif (% )
100 90
75
50
25
80
3.2
4
4.8
70
5.6
6.4
7.2
8
pH
60
Gambar 4. Pengaruh pH terhadap aktivitas glukoamilase
50 30
35
40
45
50
55
60
65
70
o
Suhu ( C) 100 Aktivitas Relatif (%)
Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas glukoamilase 3.3. Karakterisasi Amiloglukosidase Pengamatan pengaruh suhu terhadap aktivitas amiloglukosidase dilakukan pada
Gambar
3.
Hasil
Aktivitas enzim kemudian turun diatas yang
disebabkan
1.5
2
2.5
Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat pati terhadap aktivitas glukoamilase
mencapai maksimum pada suhu 45oC.
C
1
[Substrat] (%)
terus meningkat diatas suhu 30 C dan
45
60
pengamatan o
suhu
70
0.5
menunjukkan aktivitas amiloglukosidase
°
80
50
interval suhu 30-70 °C yang diperlihatkan pada
90
Selain pengaruh suhu dan pH, pengaruh
oleh
konsentrasi
14
substrat
terhadap
aktivitas
3
Hermin Kombong/J. Prog. Kim. Si. 2011, 1 (1): 8-15 enzim
juga
diamati.
Gambar
5
J. Industrial Microbiology, 22 (2): 16-
memperlihatkan penambahan konsentrasi
21.
substrat pati dapat meningkatkan aktivitas
2. Kulp,
glukoamilase
hingga
mencapai
K.
1975.
Carbohydrates.
Academic Press. New York. p: 45.
optimumnya pada konsentrasi pati 2%
3. Fukuda,
Y.,
K.
Teramoto,
S.
(b/v). Diatas konsentrasi pati 2% (b/v),
Hayashida, 1992, The hyperdigestion
aktivitas enzim tidak bertambah lagi dan
of raw starch by a carbohydrate rich
menunjukkan pola yang konstan. Hal ini
glucoamylase from a protease and
disebabkan enzim telah jenuh dengan
glycosidase-negative
substrat.
Aspergilus awomori var. kawachi F-
mutant
of
2035, Journal of Biosci, Biotech.
4. Kesimpulan Enzim Aspergilus
Biochem. 56(1), 8-12.
amiloglukosidase niger
telah
dari
4. Azis, S.A., D.C Ang, H.M. Yusof,
diisolasi
M.I.A. Karim, A.B. Ariff, K.Uchiyama,
menggunakan media ampas tepung sagu
S. Shioya, 2001, Effect of C/N ratio
melalui fermentasi sistem bacth (kultur
and starch concentration on ethanol
curah) dan dikarakterisasi pada interval
production from sago starch using
suhu 30-70 °C, pH interval 2,5-8,0, dan
recombinant yeast, World Journal of
konsentrasi substrat pati pada interval 0,5-
Microbiology & Biotechnology,
3,0%. Suhu, pH, dan konsentrasi substrat
17:
713-719.
optimum dari amiloglukosidase diperoleh
5. Darwis, A.A. dan Sukara, E. 1990.
pada masing-masing 45 °C, 6,4 dan 2,0%.
Isolasi, purifikasi dan karakterisasi enzim.
Penuntun
Praktikum.
5. Pustaka
Depdikbud. DIKTI. PAU-Biotek. IPB.
1. Ji, L.N., Zhao, X.R., dan Yang, H.Y.
Bogor.
1992. Effects of Trace Elements on citric acid fermentation by Aspergillus niger and treatment of cane molasses,
15
