PENGHAMBATAN ENZIM SIKLOOKSIGENASE-2 OLEH CAMPURAN NANOPARTIKEL EKSTRAK SURUHAN (Peperomia pellucida) DAN JAHE MERAH (Zingiber officinale)
UKDIAH TIARA ASTIATI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Penghambatan Enzim Siklooksigenase-2 oleh Campuran Nanopartikel Ekstrak Suruhan (Peperomia pellucida) dan Jahe Merah (Zingiber officinale) adalah bagian dari penelitian Program Kreativitas Mahasiswa dengan judul Nation (Nanopartikel Lotion): Lotion Antiinflamasi Kombinasi Ekstrak Suruhan (Peperomia pellucida) dan Jahe Merah (Zingiber officinale). Penelitian ini didanai oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Maret 2015 Ukdiah Tiara Astiati NIM G84100048
ABSTRAK UKDIAH TIARA ASTIATI. Penghambatan Enzim Siklooksigenase-2 oleh Campuran Nanopartikel Ekstrak Suruhan (Peperomia pellucida) dan Jahe Merah (Zingiber officinale). Dibimbing oleh SULISTYANI dan EDY DJAUHARI. Kemampuan suruhan maupun jahe merah dalam menghambat siklooksigenase-2 sudah dilaporkan, namun daya hambat campuran kedua ekstrak tersebut masih dianggap rendah. Penelitian ini bertujuan menguji ekstrak suruhan, jahe merah, dan campurannya dalam sediaan nanopartikel sebagai antiinflamasi dengan cara menghambat enzim siklooksigenase-2. Kelompok yang diuji daya hambatnya adalah kelompok normal, nanopartikel suruhan, nanopartikel jahe merah, campuran nanopartikel suruhan-jahe merah 1:1, 2:1, dan 1:2. Nanopartikel dibuat dengan metode homogenasi dan ultrasonikasi. Daya hambat nanopartikel ekstrak diuji dengan menggunakan prinsip Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Nanopartikel suruhan memiliki rata-rata ukuran 90.61 nm dan Indeks Polidispersitas (IP) 0.22, sedangkan nanopartikel jahe merah 173.46 nm dan IP 0.17. Campuran nanopartikel suruhan dan jahe merah 1:2 memiliki daya hambat maksimum 22.99% pada konsentrasi 175 μg/mL. Daya hambat maksimum nanopartikel jahe merah adalah 73.82 % pada konsentrasi 75 μg/mL. Nanopartikel suruhan tidak memiliki daya hambat terhadap siklooksigenase-2, namun campurannya dengan jahe merah (1:2) dapat menghambat aktivitas siklooksigenase-2.
Kata kunci: inflamasi, jahe merah, nanopartikel, siklooksigenase-2, suruhan
ABSTRACT UKDIAH TIARA ASTIATI. Inhibition of Cyclooxygenase-2 by Mixture Nanoparticle Extract of Suruhan (Peperomia pellucida) and Red Ginger (Zingiber officinale). Under the direction of SULISTYANI and EDY DJAUHARI. Both suruhan (Peperomia pellucida) and red ginger (Zingiber officinale) were known to inhibit cyclooxygenase-2 but, the mixture of these two has a low inhibition of cyclooxygenase-2. The aim of this research is to test the potency of suruhan, red ginger, and its mixture in nanoparticle as a cyclooxygenase-2 inhibitor. Groups were divided into suruhan nanoparticle, red ginger nanoparticle, and suruhan-red ginger nanoparticle 1:1, 2:1, and 1:2. Nanoparticle was made using homogenation and ultrasonication. The inhibitory effect was analyzed using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) principle. The average size of suruhan nanopaticle was 90.61 nm and the Polidispersity Index was 0.22. Average size of red ginger nanoparticle was 173.46 nm and IP was 0.17. Maximum inhibition of cyclooxygenase-2 by nanoparticle of red ginger was 73.82% at 75 μg/mL, and 22.99 % by its mixture at 175.75 μg/mL. Nanoparticle of suruhan did not have an inhibitory effect, however its mixture with nanoparticle of red ginger (1:2) can inhibit cylooxygenase-2. Keywords: cyclooxygenase-2, inflammation, nanoparticle, red ginger, suruhan
PENGHAMBATAN ENZIM SIKLOOKSIGENASE-2 OLEH CAMPURAN NANOPARTIKEL EKSTRAK SURUHAN (Peperomia pellucida) DAN JAHE MERAH (Zingiber officinale)
UKDIAH TIARA ASTIATI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2014 ini adalah Penghambatan Enzim Siklooksigenase-2 oleh Campuran Nanopartikel Ekstrak Suruhan (Peperomia pellucida) dan Jahe Merah (Zingiber officinale). Penelitian ini merupakan bagian dari Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian (PKMP) dengan judul Nation: Lotion Antiinflamasi Kombinasi Ekstrak Suruhan (Peperomia pellucida) dan Jahe Merah (Zingiber officinale) yang diselenggarakan oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) tahun 2014. Hal ini diperlukan untuk menentukan konsentrasi nanopartikel campuran yang memiliki daya hambat terbaik terhadap COX-2 untuk dibuat sediaan losion dan diuji daya antiinflamasinya secara in vivo. Terima kasih penulis ucapkan kepada drh Sulistyani, MSc PhD dan Drs Edy Djauhari P, MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan pengarahan dan saran dalam pelaksanaan PKMP dan penyusunan skripsi. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua, adik atas doa, dukungan, kesabaran, dan kasih sayangnya. Penghargaan penulis sampaikan kepada staff laboratorium Biokimia, Ibu Nunuk dan staff laboratorium Pusat Studi Biofarmaka (PSB) yang telah banyak membantu selama proses penelitian. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada seluruh keluarga, Natasha, Pradita, Nailatul, Kak Shelly, Biokimia 47, Esje dan teman-teman yang lain yang tidak dapat penulis sebut satu persatu atas segala doa, saran, dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Maret 2015 Ukdiah Tiara Astiati
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan dan Alat
2
Metode
2
HASIL
4
Rendemen Suruhan dan Jahe Merah
4
Nanopartikel Ekstrak Suruhan dan Jahe Merah
5
Daya Hambat Nanopartikel Ekstrak terhadap Aktivitas Siklooksigenase-2 (COX-2)
5
PEMBAHASAN
7
Rendemen Suruhan dan Jahe Merah
7
Nanopartikel Ekstrak Suruhan Dan Jahe Merah
7
Daya Hambat Nanopartikel Ekstrak terhadap Aktivitas Siklooksigenase-2 (COX-2)
8
SIMPULAN DAN SARAN
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
14
RIWAYAT HIDUP
23
DAFTAR TABEL 1 Rendemen (%) ekstrak suruhan dan jahe merah 2 Hasil karakterisasi nanopartikel suruhan dan jahe merah
5 5
DAFTAR GAMBAR 1 Format plat yang digunakan 2 Prostaglandin (ng/mL) yang dihasilkan 3 Daya hambat nanopartikel ekstrak terhadap COX-2
4 6 6
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6
Nilai Rendemen Ekstrak Suruhan dan Jahe Merah Preparasi larutan uji daya hambat siklooksigenase-2 Konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan (ng/mL) Kurva standar prostaglandin Daya hambat nanopartikel ekstrak terhadap COX-2 Analisis varian (ANOVA) pada α=0.05
14 14 16 18 19 20
1
PENDAHULUAN Salah satu enzim yang memiliki peranan penting dalam tubuh manusia, terutama dalam proses inflamasi atau peradangan adalah siklooksigenase (COX). Enzim ini mengkatalis reaksi biosintesis prostaglandin, yaitu oksidasi asam arakidonat menjadi prostaglandin. Prostaglandin yang terakumulasi pada tempat terjadinya inflamasi akan menyebabkan rasa sakit yang berlebihan (Kee et al 2012). Rasa sakit berlebihan saat inflamasi dapat dikurangi dengan cara menekan produksi prostaglandin. Pengurangan produksi prostaglandin dapat dilakukan dengan menghambat COX (Bill 2006). Enzim COX disintesis di dalam ribosom retikulum endoplasma halus. Ada dua bentuk COX di dalam tubuh manusia, yaitu COX-1 dan COX-2. COX-1 mensintesis prostaglandin yang bekerja melindungi saluran pencernaan dan bersifat konstitutif, sedangkan COX-2 mensintesis prostaglandin yang berperan sebagai mediator inflamasi dan hanya aktif ketika ada induksi dari sitokina seperti interleukin (IL), dan tumor necrosis factor (TNF) (Nelson et al 2008, Dannhardt et al 2000). Penghambatan COX-2 kemudian dijadikan dasar pembuatan obat antiinflamasi. Obat antiinflamasi yang banyak beredar di masyarakat adalah obat antiinflamasi nonsteroid (AINS), seperti aspirin, ibuprofen, dan natrium diklofenak (Kindt et al 2007). Penggunaan obat sintetis seperti AINS yang terlalu banyak dapat menimbulkan efek samping yang tidak diinginkan, seperti kerusakan kardiovaskuler, kerusakan pada ginjal, dan gangguan pada saluran pencernaan (Kindt et al 2007). Oleh karena itu, diperlukan suatu alternatif untuk menghambat COX-2 dalam rangka mengatasi inflamasi tanpa menimbulkan efek samping, yaitu mencari bahan alam atau herbal, seperti suruhan (Peperomia pellucida) dan jahe merah (Zingiber officinale). Hasil penelitian Rahmania (2013) menunjukkan bahwa ekstrak suruhan konsentrasi 100 μg/mL, jahe merah konsentrasi 300 μg/mL, dan campuran keduanya konsentrasi 175 μg/mL dapat menurunkan masing-masing 47.5, 44.4, dan 15.2 % aktivitas COX-2 secara in vitro. Daya hambat terhadap enzim COX-2 yang dihasilkan terutama oleh campuran ekstrak dianggap relatif kecil sehingga perlu dilakukan upaya untuk meningkatkan daya hambatnya, salah satu caranya adalah membuatnya menjadi nanopartikel dan mengubah formula campuran ekstrak yang digunakan. Pembuatan nanopartikel kurkuminoid memiliki khasiat sebagai antioksidan yang jauh lebih baik dibanding ekstrak kasarnya secara in vivo (Afitriansyah 2013). Maulia (2014) menunjukkan bahwa nanopartikel kurkuminoid dapat meningkatkan aktivitas senyawa tersebut sebagai antiinflamasi secara in vivo. Secara in vitro, Hardi et al (2013) menunjukkan bahwa nanopartikel ketoprofen dapat menaikkan daya hambat terhadap COX-2 dibanding dengan ketoprofen yang tidak dalam sediaan nanopartikel. Ukuran nanopartikel yang kecil menyebabkan kelarutannya lebih tinggi karena luas permukaannya meningkat. Hal itu menyebabkan penyebaran zat aktif ke dalam darah lebih mudah dan kemampuan penyerapan ke dalam sel target semakin besar (Mohanraj et al 2006). Pembuatan ekstrak suruhan dan jahe merah menjadi sediaan nanopartikel diharapkan dapat menaikkan daya hambat terhadap COX-2.
2
Penelitian ini bertujuan menguji daya hambat nanopartikel suruhan, jahe merah, campurannya sebagai antiinflamasi dengan cara menghambat COX-2 secara in vitro. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai alternatif baru obat antiinflamasi dari yang sudah beredar secara komersil. Adapun manfaat dari penelitian ini adalah dapat memperkaya informasi ilmiah mengenai daya hambat nanopartikel ekstrak suruhan, jahe merah dan campurannya terhadap COX-2 sehingga dapat dijadikan sebagai obat antiinflamasi.
METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan sebagai bahan baku adalah tanaman suruhan kering (Balittro Bogor) dan rimpang basah jahe merah (PSB IPB). Pengujian penghambatan COX-2 dilakukan dengan menggunakan COX inhibitor screening assay kit (Cayman Chemical katalog 560131). Bahan yang digunakan sebagai kontrol positif adalah natrium diklofenak® (Kimia Farma Dramaga). Bahanbahan lain yang digunakan adalah etanol 70 %, akuades, poloxamer 188, asam palmitat, dan air bebas ion. Peralatan yang digunakan meliputi oven, inkubator bergoyang, vakum evaporator, neraca digital, sonikator, ultraturax homogenizer (Dispergierstation TB.10 IKA), ultrasonikator, Particle Size Analyzer (VASCO), spektrofotometer (Epoch Biotek), termometer, dan alat gelas lainnya. Metode Desain Percobaan Sampel yang diuji daya hambatnya dibagi menjadi beberapa kelompok, yaitu 1) normal (kontrol negatif) yang merupakan kelompok tanpa penambahan nanopartikel ekstrak, 2) nanopartikel ekstrak suruhan (Su) (konsentrasi 400 μg/mL, 200 μg/mL, 100 μg/mL, dan 50 μg/mL), 3) nanopartikel ekstrak jahe merah (JM) (konsentrasi 600 μg/mL, 300 μg/mL, 150 μg/mL, dan 75 μg/mL), 4) campuran nanopartikel ekstrak suruhan-jahe merah 1:1 (SJM1), 2:1 (SJM2), dan 1:2 (SJM3) masing-masing pada konsentrasi 700 μg/mL, 350 μg/mL, 175 μg/mL, dan 87.5 μg/mL, dan 5) kontrol positif natrium diklofenak® konsentrasi 2 μg/mL. Ekstraksi Suruhan dan Jahe Merah (Mudrikah 2006) Rimpang jahe merah basah dibersihkan, diiris lalu dikeringkan di dalam oven selama tiga hari. Suruhan dan rimpang jahe merah kering digiling hingga diperoleh simplisia berukuran 100 mesh. Simplisia suruhan (100 gram) diekstraksi secara maserasi menggunakan etanol 70 % (1000 mL), lalu diletakkan pada inkubator bergoyang selama dua hari, kemudian disaring. Simplisia jahe merah (80 gram) diekstraksi secara refluks dengan akuades (800 mL), lalu dididihkan di atas pemanas selama dua jam, kemudian disaring. Residu suruhan maupun jahe merah dikumpulkan dan dilarutkan kembali dengan pelarutnya masing-masing dan dilakukan sebanyak tiga kali. Filtrat suruhan maupun jahe merah yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vakum evaporator hingga didapatkan ekstrak kering.
3
Nanopartikel Ekstrak (Mujib 2011) Pembuatan Nanopartikel Ekstrak Suruhan dan Jahe Merah. Nanopartikel ekstrak dibuat dengan mencampurkan fase lemak dan fase air. Fase air dibuat dengan melarutkan sebanyak 0.5 gram poloxamer 188 dan 100 mL air ke dalam gelas piala, kemudian ditutup dengan menggunakan plastik pembungkus lalu dipanaskan hingga 75 oC di atas pemanas dan diaduk dengan menggunakan pengaduk magnetik. Fase lemak dibuat dengan menambahkan 1 gram ekstrak dan 1 gram asam palmitat ke dalam gelas piala, kemudian ditutup dengan plastik pembungkus, lalu dipanaskan hingga mencapai suhu 75 oC di dalam sonikator, selanjutnya campuran disonikasi selama lima menit. Fase air dan lemak ini lalu dicampurkan dan diaduk dengan menggunakan pengaduk magnetik selama lima menit pada suhu 75 oC, setelah itu dengan segera diletakkan di atas es batu. Pendinginan menggunakan es batu dilakukan agar suhu campuran segera turun hingga berada pada suhu ruangan, sehingga lemak padat dan ekstrak akan membentuk nanopartikel lemak padat (Weiss et al 2008). Setelah mencapai suhu ruangan, campuran dihomogenasi dengan menggunakan ultraturax homogenizer pada kecepatan 13.500 rpm selama 5 menit. Kemudian sebanyak 25 mL dari 100 mL campuran yang terbentuk diultrasonikasi selama 1 jam dengan amplitudo 20 %. Proses ultrasonikasi diulang sebanyak 4 kali hingga seluruh campuran yang didapatkan sudah diultrasonikasi seluruhnya. Nanopartikel yang sudah terbentuk dianalisis ukurannya terlebih dahulu sebelum digunakan untuk uji selanjutnya. Analisis Ukuran Nanopartikel Ekstrak (Pang et al 2009). Analisis ini dilakukan berdasarkan distribusi jumlah dengan menggunakan Particle Size Analyzer (PSA). Sebanyak 1 mL nanopartikel diambil kemudian dimasukkan ke dalam PSA. Prinsip kerja PSA adalah Dynamic Light Scattering (DLS) (Cordouan Technologies 2010). Dasar dari DLS adalah memanfaatkan gerak Brown dari nanopartikel yang ditentukan ukurannya. Nanopartikel yang ditentukan ukurannya disinari dengan cahaya, kemudian cahaya yang terhamburkan dideteksi dengan sangat cepat. Dari intensitas cahaya yang tersebar, mobilitas partikel dapat dihitung, kemudian ukuran partikel dari sampel dapat ditentukan. Uji Daya Hambat Nanopartikel Ekstrak terhadap Aktivitas Siklooksigenase2 (COX-2) (Cayman Chemical katalog 560131) Uji daya hambat terhadap COX-2 dimulai dari reaksi siklooksigenase, yaitu oksidasi asam arakidonat menjadi prostaglandin. Tahap ini dilakukan dengan memasukkan nanopartikel ekstrak sebanyak 10 μL sebagai inhibitor COX2, 160 μL bufer reaksi, 10 μL larutan Heme, dan 10 μL COX-2 ke dalam tabung effendorf. Tabung ini diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 oC, lalu ditambahkan 10 μL substrat (asam arakidonat). Tabung kemudian divorteks dan diinkubasi kembali pada suhu 37 oC selama tepat dua menit lalu ditambahkan 50 μL HCL 1 M dan 100 μL SnCl2. Prostaglandin yang dihasilkan dikuantifikasi dengan menggunakan prinsip Enzyme-Linked ImmunoasorbentAssay (ELISA). Format plat yang digunakan dapat dilihat pada Gambar 1. Sebanyak 100 μL bufer EIA ditambahkan pada sumur NSB dan 50 μL bufer EIA ditambahkan pada sumur B0. Standar Prostaglandin ditambahkan pada sumur S1-S8. Sebanyak
4
50 μL larutan background (BC) ditambahkan ke dalam sumur BC. Sebanyak 50 μL larutan %A ditambahkan ke dalam sumur IA. Sebanyak 50 μL larutan sampel dimasukan ke dalam sumur E1-E2. Setelah itu ditambahkan 50 μL PG Tracer ke dalam semua sumur, kecuali sumur total activity (TA) dan blanko (Blk). Larutan PG antiserum ditambahkan sebanyak 50 μL ke semua sumur kecuali TA, NSB, dan Blk. Plat ditutup dengan menggunakan plastik film dan diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 18 jam pada suhu ruang. Setelah itu, plat dicuci dengan menggunakan bufer pencuci sebanyak lima kali. Reagen Ellman ditambahkan sebanyak 200 μL pada semua sumur. Larutan PG Tracer sebanyak 5 μL ditambahkan ke dalam sumur TA. Plat kemudian ditutup dengan plastik film dan diinkubasi kembali di atas inkubator bergoyang pada suhu ruang selama 90 menit. Setelah itu, absorbansinya diukur pada panjang gelombang 412 nm.
A B C D E F G H
1 Blk Blk NSB NSB B0 B0 B0 TA
2 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
4 BC1 %A2 %B2 E21 E21 E19 E20 E20
5 BC2 %A2 %B2 E21 E19 E19 E20
6 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
7 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
8 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8
9 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16
10 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16
11 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16
12 E17 E17 E17 E18 E18 E18
Gambar 1 Format plat yang digunakan. Blk: Blanko, NSB: Non Spesific Binding, B0: Maximum Binding, TA: Total Activity, S1-S8: Standar prostaglandin, BC: Background, %A-B: 100% Initial Activity, E1-E21: Sampel. Analisis Statistik (Mattjik 2002) Analisis data konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan dilakukan dengan menggunakan analisis ragam (ANOVA) rancangan acak lengkap (RAL) pada tingkat kepercayaan 95 % dan taraf α 0.05. Data dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Statistical Programme for Social Science (SPSS).
HASIL Rendemen Suruhan dan Jahe Merah Rendemen merupakan perbandingan antara ekstrak yang didapatkan dan total simplisia (Kusumawati et al 2008). Nilai rendemen digunakan untuk memperkirakan jumlah ekstrak yang dapat diambil dari total simplisia yang digunakan. Ekstrak suruhan yang didapatkan dari 100.02 gram simplisia adalah 16.25 gram ekstrak. Nilai rendemen yang didapatkan dari hasil ini adalah 16.25 % (Tabel 1). Nilai rendemen jahe merah yang didapatkan dari dua kali ekstraksi adalah 6.68 %.
5
Tabel 1 Rendemen (%) ekstrak suruhan dan jahe merah Sampel Suruhan Jahe Merah
Bobot Simplisia (gram) 100.02 80.02 86.04
Bobot Ekstrak (gram) 16.25 5.12 5.99
Rendemen (%) 16.25 6.39 6.96
Rata-rata (%) 16.25 6.68
Nanopartikel Ekstrak Suruhan dan Jahe Merah Nanopartikel yang dihasilkan merupakan emulsi. Parameter yang digunakan untuk melihat keberhasilan pembuatan nanopartikel adalah ukuran partikel. Nanopartikel suruhan yang dihasilkan memiliki ukuran rata-rata 90.61 nm dengan kisaran ukuran partikel antara 21.39–407.49 nm (Tabel 2). Nanopartikel jahe merah memiliki rata-rata ukuran sebesar 173.46 nm dan kisaran partikel antara 48.99-616.76 nm. Nanopartikel merupakan partikel dengan ukuran 50-1000 nm (Ekambaram et al 2011) dan memiliki nilai indeks polidispersitas (IP) < 0.3 (Yen et al 2008). Ukuran rata-rata nanopartikel dan IP yang dihasilkan menunjukkan bahwa nanopartikel suruhan dan jahe merah yang dihasilkan baik. Tabel 2 Hasil karakterisasi nanopartikel suruhan dan jahe merah Sampel Suruhan Jahe merah
Rata-rata ukuran (nm) 90.61 173.46
Indeks polidispersitas (IP) 0.22 0.17
Daya Hambat Nanopartikel Ekstrak terhadap Aktivitas Siklooksigenase-2 (COX-2) Penentuan daya hambat terhadap COX-2 dilakukan dalam dua tahap yaitu, reaksi siklooksigenase dan reaksi ELISA (Cayman Chem Comp 2011). Terhambatnya COX-2 tercermin dari konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada reaksi siklooksigenase. Konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan bergantung pada kemampuan nanopartikel ekstrak menghambat kerja COX-2 dalam mengkatalis reaksi pembentukan prostaglandin. Prostaglandin yang dihasilkan adalah prostaglandin F2α (PGF2α), yang merupakan hasil reduksi dari PGH2 oleh SnCl2. Gambar 2 merupakan konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada kelompok perlakuan. Prostaglandin yang dihasilkan pada kelompok normal (kontrol negatif) adalah 159.60 ng/mL, sedangkan pada na-diklofenak® 2 μg/mL (kontrol positif) adalah 30.41 ng/mL. Hal ini menunjukkan bahwa na-diklofenak mampu menekan aktivitas COX-2 hingga 80.95 %. Nanopartikel jahe merah (JM), dan nanopartikel SJM 3 konsentrasi 175 dan 75.2 μg/mL memiliki konsentrasi prostaglandin yang lebih rendah dibanding normal, menunjukkan bahwa kelompok nanopartikel tersebut memiliki daya hambat terhadap aktivitas COX-2. Nanopartikel JM konsentrasi 75 μg/mL memiliki daya hambat tertinggi, yaitu 73.82 % (Gambar 3). Kenaikan konsentrasi nanopartikel ekstrak tidak diiringi dengan tingginya daya hambat yang dihasilkan. Campuran nanopartikel SJM 3 konsentrasi 175 μg/mL menghasilkan daya
6
hambat terhadap COX-2 sebesar 22.99 %. Daya hambat yang dihasilkan oleh nanopartikel ekstrak lebih kecil dibanding na-diklofenak® (80.95 %). Nanopartikel suruhan (Su) dan hampir seluruh nanopartikel campuran (SJM) memiliki konsentrasi prostaglandin yang lebih tinggi dibanding normal. Lebih tingginya konsentrasi prostaglandin menunjukkan bahwa nanopartikel tersebut tidak dapat menekan aktivitas COX-2, sehingga dapat dikatakan bahwa nanopartikel tersebut tidak memiliki daya hambat terhadap COX-2. 2500,00 2250,00 Prostaglandin (ng/mL)
2000,00 1750,00 1500,00 1250,00 1000,00 750,00 500,00 250,00 SJM3 87.5
SJM3 175
SJM3 350
SJM3 700
SJM2 175
SJM2 87.5
SJM2 350
SJM2 700
SJM1 87.5
SJM1 175
SJM1 350
JM75
SJM1 700
JM150
JM300
JM600
Su50
Su100
Su200
Su400
Na-diklofenak
Tanpa ekstrak
0,00
Kelompok perlakuan
Daya hambat (%)
Gambar 2 Prostaglandin yang dihasilkan. Su: nanopartikel suruhan, JM: nanopartikel jahe merah. SJM 1: campuran nanopartikel suruhanjahe merah (1:1), SJM 2: campuran nanopartikel suruhan-jahe merah (2:1), SJM 3: campuran nanopartikel suruhan-jahe merah (1:2). 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
80.95
73.82b 57.28ab
56.20a
14.34ab
22.99c
19.07c
Kelompok perlakuan
Gambar 3 Daya hambat nanopartikel ekstrak terhadap COX-2. JM: nanopartikel jahe merah, SJM 3: campuran nanopartikel suruhan-jahe merah (1:2)
7
Analisis statistika dilakukan terhadap konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada masing-masing kelompok perlakuan. Konsentrasi beragam pada nanopartikel suruhan, campuran suruhan-jahe merah 1, dan 2 tidak berbeda signifikan. Konsentrasi beragam pada nanopartikel jahe merah, dan campuran nanopartikel suruhan-jahe merah 3 menunjukkan bahwa konsentrasi memberikan pengaruh yang signifikan terhadap konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan.
PEMBAHASAN Rendemen Suruhan dan Jahe Merah Rendemen suruhan hasil ekstraksi secara maserasi adalah 16.25 %. Maserasi merupakan perendaman bahan tanaman tanpa pemanasan. Metode ini bekerja dengan prinsip memecah dinding sel tanaman yang digunakan akibat adanya perbedaan tekanan antara di dalam dan di luar sel. Pecahnya dinding sel membuat senyawa metabolit sekunder yang berada di dalam sel keluar dan terlarut dalam pelarut. Nilai rendemen pada ekstraksi maserasi dipengaruhi oleh ketebalan dinding sel pada tanaman yang digunakan (Nurcholis 2008). Tebalnya dinding sel sendiri dapat dipengaruhi oleh faktor genetik dari tanaman tersebut. Jahe merah diekstraksi secara refluks. Refluks merupakan ekstraksi yang dilakukan berdasarkan titik didih dari pelarut yang digunakan. Penggunaan metode refluks dan akuades untuk ekstraksi jahe merah didasarkan oleh kebiasaan masyarakat (Mudrikah 2006). Masyarakat pada umumnya meminum air hasil rebusan jahe merah untuk mendapatkan khasiat dari jahe merah tersebut. Nilai rendemen jahe merah yang dihasilkan dari dua kali ekstraksi adalah 6.68 %. Ekstraksi suruhan secara maserasi dan jahe merah secara refluks pernah dilakukan sebelumnya oleh Mudrikah (2006) dan Rahmania (2013). Rendemen suruhan yang dihasilkan pada penelitian tersebut adalah 27.20 % dan 24.03 %, nilai tersebut 167.25 % dan 147.87 % lebih besar dibanding rendemen yang dihasilkan pada penelitian ini. Rendemen jahe merah yang dihasilkan pada penelitian Mudrikah (2006) dan Rahmania (2013) berturut-turut adalah 46.23 % dan 21.39 %. Dibanding dengan rendemen yang dihasilkan pada penelitian ini, rendemen pada penelitian sebelumnya lebih besar 692.06 % dan 320.21 %. Perbedaan rendemen yang didapatkan dapat disebabkan oleh beberapa faktor. Harborne (1984) menyatakan rendemen dapat dipengaruhi metode, kondisi, dan juga waktu ekstraksi. Selain itu, ukuran partikel sampel dan kondisi alamiah senyawa juga dapat mempengaruhi nilai rendemen ekstrak. Nanopartikel Ekstrak Suruhan Dan Jahe Merah Nanopartikel dibuat dengan mencampurkan ekstrak dengan asam palmitat, poloxamer 188, dan air. Asam palmitat yang merupakan salah satu lemak jenuh berwujud padatan pada suhu ruangan dan suhu tubuh berperan sebagai pembawa (Bruice 2004). Penggunaan lemak padat sebagai sistem pembawa ekstrak didasarkan pada toksisitasnya yang rendah (Mukherjee et al 2009). Selain itu, nanopartikel lemak padat juga baik untuk dijadikan bahan-bahan yang akan dioleskan ke kulit, seperti losion. Bahan olesan tersebut baik digunakan untuk
8
kulit yang terkena inflamasi karena lemak padat tidak menyebabkan iritasi dan tidak toksik (Ekambaram et al 2012). Poloxamer 188 merupakan surfaktan yang banyak digunakan di dalam dunia farmasi (Liu 2008). Penambahan surfaktan digunakan untuk menstabilkan nanopartikel (Mukherjee et al 2009). Pembuatan nanopartikel dilakukan dengan menggunakan ultraturax homogenizer dan ultrasonikator (Mujib 2011). Penggabungan kedua metode dilakukan untuk menghasilkan ukuran partikel yang lebih kecil dan seragam (Ekambaram et al 2011). Homogenasi pada kecepatan 13500 rpm dilakukan untuk menyatukan fase lemak dan fase berair, serta menyeragamkan ukuran partikel. Ultrasonikasi dilakukan selama 60 menit pada amplitudo 20 %. Gelombang ultrasonik yang dihasilkan akan membuat partikel bertubrukan satu sama lain sehingga partikel yang berukuran besar mengalami pengecilan ukuran. Nanopartikel ekstrak yang didapatkan dikarakterisasi dengan mengukur nanopartikel yang dihasilkan. Ukuran nanopartikel dapat dipengaruhi oleh bahanbahan dan metode yang digunakan dalam pembuatan nanopartikel. Rata-rata ukuran nanopartikel ekstrak suruhan adalah 90.61 nm, sedangkan nanopartikel jahe merah adalah 173.46 nm. Hasil ini menunjukkan bahwa nanopartikel ekstrak yang dihasilkan masih dapat dikatakan sebagai nanopartikel yang baik. Hal ini didukung oleh Ekambaram et al (2011) yang menunjukkan bahwa nanopartikel merupakan partikel dengan ukuran 50-1000 nm. Indeks Polidispersitas (IP) merupakan ukuran lebarnya distribusi partikel. IP digunakan untuk mengetahui keseragaman ukuran nanopartikel yang dihasilkan. Nanopartikel suruhan dan jahe merah memiliki nilai IP di bawah 0.3. Hal ini menunjukkan bahwa nanopartikel yang dihasilkan baik. Nilai IP di bawah 0.3 menunjukkan bahwa nanopartikel tersebut memiliki distribusi ukuran yang sempit, sedangkan IP lebih dari 0.3 menunjukkan bahwa nanopartikel yang dihasilkan memiliki distribusi ukuran yang luas (Yen et al 2008). Keberhasilan pembuatan nanopartikel dilihat dari ukuran dan distribusi ukurannya (Kamble et al 2010). Selain kedua faktor tersebut, keberhasilan nanopartikel bergantung pada kemampuan pelepasan muatan, stabilitasnya dalam ukuran nanometer, dan kemampuan melewati rintangan anatomis. Efisiensi penjerapan dari nanopartikel yang digunakan pada penelitian ini tidak diketahui, sehingga menyulitkan untuk mengetahui kemampuannya untuk melepaskan zat aktif. Nanopartikel yang baik memiliki efisiensi penjerapan zat aktif yang baik (Tiyaboonchai et al 2003). Penjerapan zat aktif pada nanopartikel mempengaruhi kemampuan pelepasannya. Zat aktif akan mudah lepas jika menempel pada permukaan nanopartikel, sedangkan zat aktif yang terjebak di dalam nanopartikel ada kemungkinan tidak seluruhnya dapat keluar dari nanopartikel. Hardi et al (2013) menunjukkan ketoprofen tersalut nanopartikel kitosan termodifikasi natrium tripolifosfat (STPP) memiliki efisiensi penjerapan sebesar 89.663 % dan memiliki daya hambat terhadap COX-2 sebesar 90.86 %. Daya Hambat Nanopartikel Ekstrak terhadap Aktivitas Siklooksigenase-2 (COX-2) Siklooksigenase-2 (COX-2) memiliki dua sisi katalitik, yaitu siklooksigenase dan peroksidase (Suleyman et al 2007). Sisi siklooksigenase berperan mengubah asam arakidonat menjadi prostaglandin G2 (PGG2). Setelah
9
itu, PGG2 diubah menjadi PGH2, yang merupakan prekursor dari prostaglandin yang lain, yaitu prostaglandin E2 (PGE2), prostaglandin I2 (PGI2), tromboksan A2 (TxA2), dan prostaglandin F2α (PGF2α) pada sisi peroksidase. Penghambatan COX-2 akan menghambat pembentukan PGH2 dan juga prostaglandin lainnya. Penghambatan COX-2 oleh nanopartikel dapat terjadi pada reaksi siklooksigenase maupun peroksidase. Perhitungan prostaglandin dilakukan dengan menggunakan prinsip ELISA, yaitu kompetisi antara prostaglandin yang dihasilkan pada reaksi siklooksigenase dengan prostaglandin yang telah terkonjugasi asetilkolinesterase (PG tracer) untuk berikatan pada antibodi (Pradelles et al 1985, Cayman Chem Comp 2011). Jumlah antibodi dan PG tracer terbatas. Ikatan antara antibodi dengan PG tracer akan menimbulkan warna kuning ketika ditambahkan dengan reagen Ellman yang merupakan substrat dari asetilkolinesterase, dan dapat dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 412 nm (Cayman Chem Comp 2011). Intensitas warna berbanding lurus dengan konsentrasi PG tracer namun, berbanding terbalik dengan konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada reaksi siklooksigenase. Konsentrasi yang digunakan untuk menentukan daya hambat terhadap COX-2 pada penelitian ini merupakan nilai LC50, ½ LC50, ¼ LC50, dan 1/8 LC50 dari uji sitotoksisitas BSLT yang dilakukan oleh Rahmania (2013). Tujuan penggunaan konsentrasi yang sama ini adalah menentukan daya hambat yang dihasilkan oleh nanopartikel ekstrak pada konsentrasi yang sama dengan ekstrak kasarnya. Besarnya daya hambat terhadap COX-2 diukur berdasarkan konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada reaksi siklooksigenase. Konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada kelompok normal (kontrol negatif) adalah 159.60 ng/mL. Konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada penelitian ini lebih rendah dibanding penelitian yang dilakukan oleh Yustinus (2010) dan Rahmania (2013), yaitu 607.70 dan 2445.08 ng/mL secara berturut-turut. Konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada keadaan ini digunakan untuk menentukan kemampuan nanopartikel ekstrak dalam menghambat COX-2. Nanopartikel ekstrak dapat menghambat COX-2 jika memiliki konsentrasi prostaglandin lebih rendah dari normal, dan tidak dapat menghambat COX-2 jika konsentrasi prostaglandin lebih tinggi dari normal. Prostaglandin terendah dihasilkan oleh kontrol positif natrium diklofenak®, yaitu 30.41 ng/mL, dan memiliki daya hambat terhadap COX-2 sebesar 80.95 %. Penelitian yang dilakukan oleh Yustinus (2010) menunjukkan hasil yang serupa, yaitu diklofenak memiliki daya hambat terhadap COX-2 sebesar 95.43 %. Cara kerja obat ini dalam menghambat COX-2 adalah secara kompetitif dan reversibel. Menurut Walker et al (2001), obat AINS dapat menghambat COX-2 secara kompetitif, reversibel maupun ireversibel. Nanopartikel jahe merah memiliki daya hambat yang cukup tinggi terhadap COX-2, yaitu mencapai 73.82 % pada konsentrasi 75 μg/mL. Rahmania (2013) menunjukkan bahwa pada konsentrasi yang sama, ekstrak jahe merah tidak memiliki daya hambat terhadap COX-2. Selain itu, penelitian tersebut juga menunjukkan bahwa daya hambat tertinggi yang dihasilkan oleh ekstrak jahe merah adalah 44.4 % pada konsentrasi 300 μg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa
10
pada konsentrasi yang lebih rendah, nanopartikel jahe merah mampu menghambat COX-2, bahkan daya hambatnya lebih tinggi dibanding dengan ekstrak kasarnya. Tingginya konsentrasi nanopartikel jahe merah tidak diiringi dengan tingginya daya hambat yang dihasilkan. Hal ini dapat disebabkan oleh ekstrak yang digunakan untuk pembuatan nanopartikel merupakan ekstrak kasar. Senyawa fitokimia dalam ekstrak memiliki respon yang berbeda terhadap COX-2. Flavon dan apigenin dapat menghambat COX, sedangkan rutin dapat meningkatkan kerja enzim tersebut (Kim et al 2004). Konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan pada nanopartikel suruhan 400 μg/mL lebih tinggi, yaitu 230.29 ng/mL dibanding normal (159.60 ng/mL). Hal ini menunjukkan bahwa nanopartikel suruhan tidak memiliki daya hambat terhadap COX-2. Hasil yang berbeda ditunjukkan oleh Rahmania (2013), yaitu ekstrak suruhan memiliki daya hambat terhadap COX-2 hingga mencapai 45 %. Ketidakselarasan hasil yang didapatkan dari kedua penelitian ini dapat disebabkan oleh kondisi nanopartikel suruhan kurang optimum, sehingga mempengaruhi pelepasan ekstrak dari bahan penjerapnya dalam sediaan nanopartikel. Di sisi lain, suruhan belum terbukti efek antiinflamasinya secara in vivo. Sahifah (2012) menunjukkan bahwa ekstrak suruhan pada dosis 100 mg/kg BB belum dapat dibuktikan efek antiinflamasinya. Namun pada kasus ini, tidak adanya efek antiinflamasi pada suruhan dapat disebabkan oleh metabolisme yang terdapat pada tubuh tikus (Ma et al 2002). Campuran nanopartikel SJM 3 700 μg/mL memiliki konsentrasi prostaglandin 2461.99 ng/mL, lebih tinggi dibanding keadaan normal (159.60 ng/mL). Tingginya konsentrasi prostaglandin pada kelompok ini menunjukkan bahwa campuran nanopartikel SJM3 700 μg/mL tidak dapat menghambat COX-2, melainkan aktivator. Penelitian Rahmania (2013) menunjukkan konsentrasi prostaglandin campuran ekstrak suruhan-jahe merah pada konsentrasi yang sama adalah 2696.48 ng/mL, lebih tinggi dari kondisi normal, yaitu 2445.08 ng/mL. Hal tersebut menunjukkan bahwa campuran ekstrak kasar suruhan-jahe merah juga tidak dapat menghambat kerja COX-2. Campuran nanopartikel SJM 3 175 μg/mL memiliki daya hambat terhadap COX-2 hingga 22.99 %. Daya hambat ini masih lebih rendah dibandingkan dengan nanopartikel jahe merah tunggal. Selain dari rendahnya konsentrasi prostaglandin pada kondisi normal, hal ini dapat disebabkan oleh tidak adanya daya hambat yang dimiliki oleh nanopartikel suruhan. Interaksi antara ekstrak suruhan dan jahe merah belum diketahui secara pasti namun, lebih rendahnya daya hambat pada campuran nanopartikel ekstrak tersebut menunjukkan bahwa kedua ekstrak tersebut bekerja secara antagonis. Namun demikian, daya hambat yang dihasilkan pada penelitian ini lebih tinggi dibanding hasil penelitian Rahmania (2013) yaitu sebesar 15.2 %. Selain itu, setelah diuji secara in vivo, campuran nanopartikel SJM 3 yang dibuat menjadi sediaan losion memiliki daya antiinflamasi yang sama baiknya dengan obat yang banyak beredar di masyarakat (Arviana 2015). Secara in vivo, ukuran nanopartikel yang kecil membuatnya menjadi lebih mudah melewati membran untuk masuk ke dalam kulit (Desai et al 2010). Selain itu, bahan penyalutnya melindungi zat aktif dari proses metabolisme dalam tubuh sehingga zat aktif dapat sampai ke tempat terjadinya inflamasi tanpa melewati proses metabolisme yang dapat menyebabkan rusaknya zat aktif.
11
Efek antiinflamasi yang dimiliki oleh nanopartikel jahe merah dan campurannya dengan nanopartikel suruhan dipengaruhi oleh kandungan senyawa fitokimia yang dimiliki oleh kedua ekstrak tersebut. Penelitian terhadap kandungan senyawa fitokimia dari esktrak suruhan dan jahe merah yang digunakan pada penelitian ini dilakukan oleh Arviana (2015). Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa ekstrak kasar dari jahe merah dan suruhan yang digunakan dalam penelitian ini mengandung flavonoid, fenolik, terpenoid, tanin, dan alkaloid. Selain itu, ekstrak suruhan diketahui memiliki kandungan saponin. Beberapa senyawa fitokimia yang terkandung dalam ekstrak suruhan dan jahe merah seperti flavonoid, alkaloid, dan tanin diduga dapat menghambat kerja COX-2. Flavonoid, alkaloid, dan tanin diketahui memiliki khasiat sebagai antiinflamasi (Khanbabaee et al 2001, Yang CW et al 2005). Kim et al (2004) menunjukkan bahwa flavonoid telah terbukti dapat menghambat beberapa enzim yang terlibat di dalam proses inflamasi seperti COX, lipoksigenase, dan fosfolipase A2. Beberapa senyawa golongan flavonoid seperti, flavon dan apigenin merupakan inhibitor dari COX, sedangkan rutin dilaporkan dapat meningkatkan aktivitas dari COX. Selain itu, efek antiinflamasi pada jahe merah dapat dipengaruhi oleh kandungan gingerol. Tjendraputra et al (2001) melaporkan bahwa gingerol pada jahe merah juga memiliki daya hambat terhadap COX-2.
SIMPULAN DAN SARAN Nanopartikel suruhan dan jahe merah telah berhasil dibuat. Campuran nanopartikel suruhan-jahe merah 1:2 dapat menghambat COX-2 sebesar 22.99 %, namun lebih rendah dari nanopartikel jahe merah tunggal yang dapat menghambat COX-2 hingga 73.82 %. Sebagai saran, penelitian lebih lanjut untuk menentukan formulasi suruhanjahe merah perlu dilakukan agar didapatkan formulasi yang lebih baik. Penelitian lanjutan mengenai kondisi optimum nanopartikel suruhan, jahe merah, dan campurannya perlu dilakukan agar kondisi optimum dan mekanisme pelepasan zat aktif dapat diketahui secara pasti.
DAFTAR PUSTAKA Afitriansyah E. 2013. Status antioksidan tikus jantan diinduksi CCl4 dengan perlakuan nanopartikel kurkuminoid temulawak lokal Ciemas [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Arviana N. 2015. Khasiat lotion antiinflamasi campuran nanopartikel jahe merah (Zingiber officinale) dan suruhan (Peperomia pellucida) pada edema kaki tikus [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Bill R. 2006. Pharmacology for Veterinary Technicians 3rd Ed. Missouri (US): Mosby. Bruice PY. 2004. Organic Chemistry. California (US): Prentice Hall. [Cayman Chem Comp]. 2011. COX Inhibitor Screening Assay Kit catalog No 560131. US: Cayman Chemical Company.
12
[Cordouan Technologies]. 2010. Particle Size Analyzer VASCO [internet]. www.cordouan-tech.com/en/product/physical-chemistry-analysis/particlescharacterization/particle-size-analyzer-vasco (22 Agustus 2014). Dannhardt, S Laufer. 2000. Structural approaches to explain the selectivity of COX-2 inhibitors: is there a common pharmachopore?. Curr. Med. Chem. 7:1101-1112. Desai P, Ram RP, Mandip S. 2010. Interaction of nanoparticles and cellpenetrating peptides with skin for transdermal drug delivery. Mol Membr Biol. 27(7): 247-259. Ekambaram P, Abdul HS, Priyanka K. 2012. Solid lipid nanoparticles: a review. Sci. Revs. Chem. Commun 2(1):80-102. Hamberg M, Sauelsson B. 1973. Detection and isolation of an enderoperoxide intermediate in prostaglandin biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci 70: 899903. Harborne JB. 1984. Phytochemical Methods 2nd Ed. New York (US): Chapman and Hall. Hardi J, Sugita P, Ambarsari L. 2013. Dissolution behaviour, stability, and antiinflammatory activity of ketoprofen coated tripolyphosphare modified chitosan nanoparticles. Indo. J. Chem. 13 (2): 149-157. Kamble VA, Deepali MJ, Vilasrao JK. 2010. Solid lipid nanoparticles as drug delivery system. Int J of Phar and Bio Sci 1(3):1-9 Kee JL, Evelyn R, Linda E. 2012. Pharmacology: A Nursing Process Approach 7th Ed. Philadelphia (US): Elsevier Saunders. Khanbabaee K, Teunis R. 2001. Tannins: classification and definitions. Nat. Prod. Rep. 18: 641-649. Kim HP, Kun HS, Hyeun WC, Sam SK. 2004. Anti-inflammatory plant flavonoids and cellular action mechanism. J Pharmacol Sci 96: 229-245. Kindt T, Richard AG, Barbara AO. 2007. Kuby Immunology. New York (US): WH Freeman and Company. Kusumawati R, Tazwir, Wawasto A. 2008. Pengaruh rendemen dalam asam klorida terhadap kualitas gelatin tulang kakap merah (Lutjanus sp.). Jurnal Pascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan. 3(1): 63-68. Liu R. 2008. Water-Insoluble Drug Formulation. New York (US): CRC Press. Ma MK, Woo MH, McLeod HC. 2002. Genetic basic of drug metabolism. Am J Health Syst Pharm 59: 2061-2069. Mattjik AA. 2002. Rancangan Percobaan. Bogor (ID): IPB Pr. Maulia P. 2014. Aktivitas antiinflamasi sediaan nanopartikel ekstrak kurkuminoid temulawak tersalut asam palmitat secara in vivo [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Mohanraj VJ, Y Chen. 2006. Nanoparticles. Trop J of Pharmac Rsch 5(1): 561573. Mudrikah F. 2006. Potensi ekstrak jahe merah (Zingiber officinale Rosc.) dan campurannya dengan herba suruhan (Peperomia pellucida [L]) sebagai antihiperurisemia pada tikus [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Mujib MA. 2011. Pencirian nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat [tesis]. Bogor (ID): Insitut Pertanian Bogor.
13
Mukherjee S, Ray S, Thakur RS. 2009. Solid lipid nanoparticles: a modern formulation approach in drug delivery system. Indian J. Pharm. Sci. 71(4): 349-358. Nelson DL, Michael MC. 2008. Lehninger Principle of Biochemistry 5th Ed. New York (US): WH Freeman and Company. Nurcholis W. 2008. Profil senyawa penciri bioaktivitas tanaman kunyit pada agrobiofisik berbeda [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Pang X, Fude C, Jie T, Jiajun C, Jie Z, Weilie Z. 2009. Preparation and characterization of magnetic solid lipid nanoparticles loaded with ibuprofen. Asian J of Pharmac Sci 4(2): 132-137 Pradelles P, Jacques G, Jacques M. 1985. Enzyme immunoassays of eicosanoids using acetylcholine esterase as label: an alternative of radioimmunoassay. Anal. Chem. 57(7): 1170-1172. Rahmania S. 2013. Daya hambat siklooksigenase-2 oleh campuran ekstrak suruhan (Pepermoia pellucida) dan jahe merah (Zingiber officinale) dalam inflamasi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Sahifah E. 2012. Khasiat antiinflamasi ekstrak herba suruhan (Peperomia pellucida [L]) dan campurannya dengan jahe merah (Zingiber officinale Rosc.) pada tikus [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Suleyman H, Berna D, Yalcin K. 2007. Anti-inflammatory and side effect of cyclooxygenase inhibitors. Pharmacological Reports 59: 247-258. Tiyaboonchai W, Ritthidej GC. 2003. Development of indometachin sustained release microcapsule using chitosan-carboxymethyl cellulose complex coacervation. Songklanakarin J Sci Technol 25:245-254. Tjendraputra E, Van HT, Liu-Brennan D, Basil DR, Colin CD. 2001. Effect on ginger constituents and synthetic analogues on cyclooxygenase-2 enzyme intact cells. Bioorg Chem 29: 156-163. Walker MC, Kurumbail R, Kiefer J, Moreland K, Konoldt C, Isakson P, Seibert K, Gierse J. A three-step kinetic mechanism for selective inhibition of cyclooxygenase-2 by diarylheterocyclic inhibitors. Biochme J. 357: 709-718. Weiss J, Eric AD, Julian D. 2008. Solid Lipid Nanoparticle as Delivery System for Bioactive Food Components. Food Biophysics 3: 146-154. Yang CW, Chen WL, Wu PL, Tseng HY, Lee SJ. 2006. Antiinflammatory mechanism of phhenanthroindolizidine alkaloids. Mol. Pharmacol 69: 749758. Yen FL, Tzu HW, Liang TL, Thau MC, Chun CL. 2008. Nanoparticles formulation of Cuscuta chinensis prevents acetaminophen-induced hepatoxicity in rats. Food and Chemical Toxicology 46: 1771-1777. Yustinus CS. 2010. Daya inhibisi ekstrak rimpang jahe merah dan kulit kayu manis terhadap aktivitas enzim siklooksigenase-2 dan enzim xantin oksidase secara in vitro [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
14
Lampiran 1 Nilai Rendemen Ekstrak Suruhan dan Jahe Merah Sampel Suruhan Jahe Merah
Bobot Simplisia (gram) 100.02 80.02 86.04
Bobot Ekstrak (gram) 16.25 5.12 5.99
Rendemen (%) 16.25 6.39 6.96
Rata-rata (%) 16.25 6.68
Contoh perhitungan : % rendemen = Bobot ekstrak (g) x 100 % Bobot simplisia (g) = 16.25 g x 100% 100.02 g = 16.25 % Lampiran 2 Preparasi larutan uji daya hambat siklooksigenase-2 Preparasi Larutan untuk Reaksi Siklooksigenase Bufer reaksi dibuat dengan cara melarutkan 5 mL larutan bufer stok dengan 45 mL air bebas ion di dalam labu 50 mL. Larutan HCl 0.1 M dibuat dengan mencampurkan 50 μL HCL 1M dengan 4.5 mL air bebas ion. Larutan Heme dibuat dengan cara mencampurkan sebanyak 40 μL larutan stok dengan 960 μL bufer reaksi. Larutan SnCl2 dibuat dengan mencampurkan stok SnCl2 dengan 5 mL HCl 0.1 M lalu divorteks. Asam arakidonat dibuat dengan mencampurkan 50 μL stok dengan 50 μL KOH kemudian divorteks dan ditambahkan 400 μL air bebas ion. Seluruh larutan ini disimpan pada suhu ruang. Selain nanopartikel ekstrak, disiapkan juga tabung background (BC) dan 100 % Initial Activity (% A). Tabung BC diisi dengan 20 μL COX-2 yang telah diinaktifasi (pada suhu 100 oC selama 3 menit), 160 μL bufer reaksi, dan 10 μL heme. Tabung % A diisi dengan 160 μL larutan bufer reaksi, 10 μL heme, dan 10 μL COX-2. Tabung sampel diisi dengan 160 μL larutan bufer reaksi, 10 μL larutan heme, 10 μL COX-2, dan 10 μL sampel. Seluruh tabung ini kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 oC. Setelah 10 menit, asam arakidonat ditambahkan sebanyak 10 μL ke masing-masing tabung kemudian divorteks dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama dua menit tepat. Setelah itu setiap tabung ditambahkan HCl sebanyak 10 μL lalu dipindahkan ke suhu ruang, lalu ditambahkan larutan SnCl2 sebanyak 20 μL kemudian divorteks. Pembuatan Larutan untuk Reaksi EIA Bufer EIA dibuat dengan mancampurkan larutan stok dengan 90 mL air bebas ion. Larutan Prostaglandin screening AChE tracer (PG tracer) dibuat dengan mencampurkan larutan stok dengan 6 mL bufer EIA. Larutan Prostaglandin screening EIA antiserum dibuat dengan mencampurkan larutan stok dengan 6 mL bufer EIA. Reagen Ellman dibuat dengan mencampurkan stok dengan 20 mL air bebas ion kemudian simpan di tempat gelap. Bufer pencuci dibuat dengan mencampurkan larutan stok, 0.5 mL larutan polisorbat, dan 1 L air bebas ion.
15
Lampiran 2 (Lanjutan) Preparasi Standar Prostaglandin Larutan standar prostaglandin 10 ng/mL dibuat dengan mencampurkan larutan stok dengan 1 mL bufer EIA. Setelah itu disiapkan sebanyak 8 tabung dan diberi nomor dari S1 hingga S8. Larutan stok prostaglandin 10 ng/mL diambil sebanyak 200 μL dan dimasukan ke dalam tabung S1 lalu dilarutkan dengan bufer EIA sebanyak 800 μL hingga terbentuk larutan S1 dengan konsentrasi 2000 pg/mL. Setelah itu sebanyak 500 μL larutan S1 diambil dan dimasukkan ke dalam tabung S2 lalu ditambahkan 500 μL larutan bufer EIA hingga terbentuk larutan S2 dengan konsentrasi 1000 pg/mL. perlakuan diulang untuk tabung S3-S8 hingga terbentuk larutan S3-S8 dengan konsentrasi 500, 250, 125, 62.5, 31.3, dan 15.6 pg/mL. Pengenceran Larutan dari Reaksi Siklooksigenase Larutan BC diencerkan dengan mencampurkan 10 μL larutan BC dengan 990 μL bufer EIA. Larutan % A dibuat dua kali pengenceran, tabung % A1 dan % A2. Sebanyak 10 μL larutan % A diambil dan dimasukkan ke dalam tabung % A1 lalu dilarutkan dengan 990 μL bufer EIA kemudian divorteks. Sebanyak 50 μL larutan % A1 diambil dan dimasukkan ke dalam tabung % A2 lalu ditambahkan 950 μL larutan bufer EIA dan divorteks. Tabung sampel dibuat dua kali pengenceran, tabung EC1 dan EC2. Sebanyak 10 μL larutan E diambil dan dimasukkan ke dalam tabung EC1 lalu dilarutkan dengan 990 μL bufer EIA kemudian divorteks. Sebanyak 50 μL larutan EC1 diambil dan dimasukkan ke dalam tabung EC2 lalu ditambahkan 950 μL larutan bufer EIA dan divorteks.
16 16
Lampiran 3 Konsentrasi prostaglandin yang dihasilkan (ng/mL) Abs blanko
Abs koreksi
0.1685±0.020
0.001±0.020
0.001
0.4336±0.058
0.266±0.058
0.265±0.058
1.5235
1.5225
S1
1.691 0.1855±0.007
0.018±0.007
0.017±0.007
6.41±2.93
2000
S2
0.206±0.008
0.038±0.008
0.037±0.008
14.14±3.20
1000
S3
0.231±0.005
0.063±0.005
0.063±0.005
23.57±2.13
500
S4
0.275±0.009
0.107±0.009
0.106±0.009
40.61±3.73
250
S5
0.325±0.006
0.158±0.006
0.157±0.006
59.20±2.40
125
S6
0.323±0.002
0.155±0.002
0.154±0.002
58.26±1.07
62.5
S7
0.400±0.007
0.232±0.007
0.231±0.007
87.29±2.67
31.3
S8
0.416±0.065
0.249±0.065
0.248±0.065
93.51±24.80
15.6
BC
0.325±0.037
0.158±0.037
0.157±0.037
59.20±14.12
Normal diklofenak
0.333±0.011
0.165±0.011
0.164±0.011
0.413±0.039
0.246±0.039
Su400
0.322±0.033
Su200
0.288±0.032
Su100 Su50 JM600 JM300
Sumur
ABS
BLK
0.1675±0.033
NSB Bo TA
B/B0 (%)
[PG] (pg/mL)
[PG]XFP (pg/mL)
[PG] koreksi
[PG] (ng/mL)
112.18±77.19
11218.38±7719.00
11218.38±7719.00
62.03±4.26
85.41±19.22
170820.18±38433.31
159601.80±38433.31
159.60±38.43
0.245±0.039
92.45±14.07
20.81±17.48
41623.73±34963.08
30405.35±34963.08
30.41±34.96
0.155±0.033
0.154±0.033
58.01±12.47
120.76±78.69
241512.45±157180.51
230294.07±157180.51
230.29±157.18
0.121±0.032
0.120±0.032
45.31±12.26
233.38±131.80
466755.82±263608.95
455537.44±263608.95
455.54±263.61
0.314±0.008
0.146±0.008
0.146±0.008
54.99±3.207
123.77±20.13
247545.99±40266.40
236327.61±40266.40
236.33±40.27
0.290±0.036
0.122±0.036
0.121±0.036
45.81±12.64
234.91±151.77
469815.67±303534.97
458597.29±303534.97
458.60±303.53
0.373±0.023
0.205±0.023
0.204±0.023
76.99±8.65
40.56±15.89
81120.11±31775.07
69901.73±31775.07
69.90±31.78
0.177±0.027
0.176±0.027
66.43±10.33
73.97±41.81
147936.98±83623±66
136718.60±83623.66
136.72±83.62
JM150
0.345±0.027 0.373±0.021
0.205±0.021
0.204±0.021
77.24±8.06
39.70±14.58
79394±29165.80
68176.29±29165.80
68.18±29.17
JM75
0.391±0.006
0.223±0.006
0.222±0.006
83.90±2.47
26.50±3.53
53000.11±7056.60
41781.73±7056.60
41.78±7.06
0.27
17
Lampiran 3 (Lanjutan) SJM1 700
0.287±0.011
0.120±0.011
0.119±0.011
44.93±4.17
212.82±47.83
425642.76±95655.70
414424.38±95655.70
414.42±95.66
SJM1 350
0.332±0.034
0.164±0.034
0.163±0.034
61.65±12.96
101.82±75.10
203631.84±150206.87
192413.46±150206.87
192.41±150.21
SJM1 175
0.247±0.034
0.079±0.034
0.078±0.034
29.60±12.84
554.81±387.81
1109620.6±775619.98
1098402.31±775619.98
1098.4±775.62
SJM1 87.5
0.284±0.039
0.116±0.039
0.115±0.039
43.43±14.92
284.64±244.43
569277.97±488858.28
558059.59±488858.28
558.06±488.86
SJM2 700
0.311±0.045
0.143±0.045
0.142±0.045
53.61±17.11
177.00±169.29
353990.67±338577.72
342772.29±338577.72
342.77±338.58
SJM2 350
0.286±0.014
0.118±0.014
0.117±0.014
44.31±5.28
222.17±61.78
444339.94±123557.11
433121.56±123557.11
433.12±123.56
SJM2 175
0.316±0.068
0.148±0.068
0.147±0.068
55.74±25.95
228.33±303.13
456657.63±606264.96
445439.25±606264.96
445.44±606.26
SJM2 87.5
0.318±0.036
0.151±0.036
0.149±0.037
56.60±13.91
132.89±81.10
265773.77±162206.80
254555.39±162206.80
0.203±0.022
0.035±0.022
0.034±0.022
12.88±8.60
1236.6±582.79
2461989.41±1165585 1145557.68±584233.04
254.56±162.21 2461.99±1165. 59 1145.56±584.2 3
SJM3 700
0.241±0.027
0.074±0.027
0.073±0.027
27.59±10.21
578.39±292.12
2473207.79±1165585 1156776.06±584233.0 4
SJM3 175
0.355±0.039
0.187±0.039
0.186±0.039
70.32±14.81
67.06±53.94
134129.66±107878.23
122911.28±107878.23
122.91±107.88
SJM3 87.5
0.344±0.017
0.176±0.017
0.175±0.017
66.30±6.64
70.19±26.69
140386.43±53377.14
129168.05±53377.14
129.17±53.38
SJM3 250
17
18
2 18 Lampiran 4 Kurva standar prostaglandin 100,00 90,00 80,00 B/B0 (%)
70,00 y = -18.8ln(x) + 145.4 R² = 0.973
60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0
500
1000 1500 [PG] (pg/mL)
2000
2500
Keterangan: % B/B0 : perbandingan antara prostaglandin tracer pada sampel dan total prostaglandin tracer yang dapat berikatan dengan antiserum Kurva absorbansi dan konsentrasi prostaglandin 1,6
Abs terkoreksi
1,4 1,2
y = -0,05ln(x) + 0,3857 R² = 0,9733
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0
500
1000 1500 [PG] pg/mL
2000
2500
Contoh perhitungan konsentrasi prostaglandin untuk Su 400 : = Absorbansi Su 400 – Absrobansi blanko = 0.354 – 0.1675 = 0.1865 Absorbansi terkoreksi = Absorbansi blanko Su 400 – Absorbansi NSB = 0.1865 – 0.001 = 0.1855 Keterangan: NSB: Non specific binding, senyawa yang dapat berikatan dengan antiserum selain dari prostaglandin dan prostaglandin tracer Absorbansi blanko Su 400
19
Lampiran 4 (Lanjutan) x 100 % % B/B0 Su 400 = Abs terkoreksi Abs terkoreksi B0 = 0.1855 x 100 % 0.2652 = 69.95 % Persamaan garis: y = -18.8 ln (x) + 145.4 69.95 = -18.8 ln (x) + 145.4 X = 55.34 [PG] = 110647.50 pg/mL Keterangan: Y = % B/B0 X = [PG] (pg/mL) [PG] terkoreksi Su 400 =([PG] Su 400 x FP) – ([PG]BC x FP) = (110674.50 x 2000) – (11218.38 x 100) = 99456.12 pg/mL [PG] Su400 (ng/mL) = [PG] terkoreksi Su400 (pg/mL) x 1 pg 1000 ng = 99456.12 pg/mL x 1 pg 1000 ng = 99. 46 ng/mL Faktor Pengenceran (FP): BC = 100 x Normal = 2000 x Sampel = 2000 x Lampiran 5 Daya hambat nanopartikel ekstrak terhadap COX-2 Sampel Na-diklofenak JM 600 JM 300 JM 150 JM 75 SJM 3 175 SJM 3 87.5
[Prostaglandin] (ng/mL) 30.41 69.90 136.72 68.18 41.78 122.91 129.17
Daya hambat (%) 80.95 56.20 14.34 57.28 73.82 22.99 19.07
Contoh perhitungan daya hambat untuk JM 600: % Daya Hambat
= [PG] terkoreksi normal – [PG] terkoreksi JM 600 x 100% [PG] terkoreksi normal = 159.61 ng/mL - 69.90 ng/mL x 100 % 159.61 ng/mL = 56.20 %
20
Lampiran 6 Analisis varian (ANOVA) pada α=0.05 Suruhan Deskripsi statistik (variabel tergantung: [Prostagalandin]) Kelompok Su400 Su200 Su100 Su50 Total
Rata-rata 2.3029E2 4.5554E2 2.3633E2 4.5860E2 3.4519E2
Standar Deviasi 157.18263 263.60748 40.26805 303.53463 218.70950
N 3 3 3 3 12
Uji pengaruh antar subjek (Variabel tergantung: [Prostagalandin]) Sumber keragaman Model terkoreksi Intersep Kelompok Kesalahan Total Total terkoreksi
Jumlah kuadrat tipe III 150272.174a 1429866.729 150272.174 375900.145 1956039.048 526172.319
df
Kuadrat tengah
F
Sig.
3 1 3 8 12 11
50090.725 1429866.729 50090.725 46987.518
1.066 30.431 1.066
.416 .001 .416
a R kuadrat = .286 (R kuadrat disesuaikan .018) Sig Kel > 0.05 tidak berbeda nyata, konsentrasi berbeda memberikan respon sama Jahe Merah Deskripsi statistik. Variabel tergantung: [Prostagalandin] Kelompok JM600 JM300 JM150 JM75 Total
Rata-rata 69.9000 1.3672E2 68.1767 41.7833 79.1442
Standar Deviasi 31.77584 83.622237 29.16815 7.05799 54.40129
N 3 3 3 3 12
Uji pengaruh antar subjek (variabel tergantung: [Prostagalandin]) Sumber keragaman Model terkoreksi Intersep Kelompok Kesalahan Total Total terkoreksi
Jumlah kuadrat tipe III 14748.496a 75165.589 14748.496 17806.002 107720.088 32554.498
df
Kuadrat tengah
F
Sig.
3 1 3 8 12 11
4916.165 75165.589 4916.165 2225.750
2.209 33.771 2.209
.165 .000 .165
a R kuadrat = .453 (R kuadrat disesuaikan .248) Sig Kel > 0.05 tidak berbeda nyata, konsentrasi berbeda memberikan respon sama
21
Lampiran 6 (Lanjutan) Suruhan Jahe Merah 1 Deskripsi statistik (variabel tergantung: [Prostagalandin]) Kelompok SJM1700 SJM1350 SJM1175 SJM187.5 Total
Rata-rata 4.1442E2 1.9241E2 1.0984E3 5.5806E2 5.6583E2
Standar Deviasi 95.65353 150.21101 775.61768 488.85812 529.38489
N 3 3 3 3 12
Uji pengaruh antar subjek (variabel tergantung: [Prostagalandin]) Sumber keragaman Model terkoreksi Intersep Kelompok Kesalahan Total Total terkoreksi
Jumlah kuadrat tipe III 1.338E6 3841906.484 1338175.986 1744555.988 6924638.459 3082731
df
Kuadrat tengah
F
Sig.
3 1 3 8 12 11
446058.662 3841906.484 446058.662 218069.499
2.045 17.618 2.045
.186 .003 .186
a R kuadrat = .434 (R kuadrat disesuaikan .222) Sig Kel > 0.05 tidak berbeda nyata, konsentrasi berbeda memberikan respon sama Suruhan Jahe Merah 2 Deskripsi statistik (variabel tergantung: [Prostagalandin]) Kelompok SJM2700 SJM2350 SJM2175 SJM287.5 Total
Rata-rata 3.4277E2 4.3312E2 4.4544E2 2.5456E2 3.6897E2
Standar Deviasi 338.57998 123.55877 606.26061 162.20301 318.91147
N 3 3 3 3 12
Uji pengaruh antar subjek (variabel tergantung: [Prostagalandin]) Sumber keragaman Model terkoreksi Intersep Kelompok Kesalahan Total Total terkoreksi
Jumlah kuadrat tipe III 71219.962a 1633695.849 71219.962 1047529.962 2752445.649 1118749.801
df 3 1 3 8 12 11
Kuadrat tengah 23739.987 1633695.849 23739.987 130941.230
F .181 12.477 .181
Sig. .908 .008 .908
a R kuadrat = .064 (R kuadrat disesuaikan -.287) Sig Kel > 0.05 tidak berbeda nyata, konsentrasi berbeda memberikan respon sama
22
Lampiran 6 (Lanjutan) Suruhan Jahe Merah 3 Deskripsi statistik (variabel tergantung: [Prostagalandin]) Kelompok SJM3700 SJM3350 SJM3175 SJM387.5 Total
Rata-rata 2.4620E3 1.1456E3 1.2291E2 1.2917E2 9.6491E2
Standar Deviasi 1165.58871 584.23218 107.87907 53.37582 1147.04140
N 3 3 3 3 12
Uji pengaruh antar subjek (variabel tergantung: [Prostagalandin]) Sumber keragaman Model terkoreksi Intersep Kelompok Kesalahan Total Total terkoreksi
Jumlah kuadrat tipe III 1.1047E7a 1.117E7 1.104E7 3428822.310 2.565E7 1.447E7
df
Kuadrat tengah
F
Sig.
3 1 3 8 12 11
3681307.092 1.117E7 3681307.092 428602.789
8.589 26.067 8.589
.007 .001 .007
a R kuadrat = .763 (R kuadrat disesuaikan .647) Sig Kelompok < 0.05 berbeda nyata, konsentrasi berbeda memberikan respon berbeda
23
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 18 November 1992 di Palembang dari Ayahanda Adang Iskandar dan Ibunda Napisah. Penulis terlahir sebagai anak pertama dari dua bersaudara. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMA Negeri 4 Bogor pada tahun 2010 dan pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama masa perkuliahan, penulis aktif di organisasi Himpuran Profesi Biokimia 2012 dan Unit Kegiatan Mahasiswa Music Agriculture Xpression 20102012. Penulis pernah mengikuti kepanitiaan Pesta Sains (2012) dan ACRA (2011 dan 2012). Penulis pernah menjadi asisten praktikum di Departemen Biokimia pada tahun 2013-2014. Penulis melaksanakan praktik lapangan di Balai Besar Pascapanen pada tahun 2013 dengan judul Analisis Gula Reduksi Nira Sorgum Manis (Sorghum bicolor {L} Moench) secara Titrimetri. Tahun 2014 penulis mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa didanai DIKTI bidang penelitian dengan judul Nation (Nanopartikel Lotion): Lotion Antiinflamasi Kombinasi Ekstrak Suruhan (Peperomia pellucida) dan Jahe Merah (Zingiber officinale).
