PENGARUH PERBEDAAN PERSENTASE PREBIOTIK EKSTRAK TEPUNG UBI JALAR DALAM SINBIOTIK, TERHADAP RESPON IMUN NON SPESIFIK UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei)
(Skripsi)
Oleh INDRI SAPUTRI RAMADHANI
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017
ABSTRACT
THE EFFECT OF PREBIOTIC SWEET POTATO FLOUR EXTRACT WITH DIFFERENCE PERCENTAGE IN SYNBIOTIC, FOR NONSPECIFIC IMMUNE RESPONSE OF WHITE SHRIMP (Litopenaeus vannamei)
By
Indri Saputri Ramadhani
Shrimp is one of the leading commodities of fishery in Indonesia. In shrimp farming, disease attacks become one of the main problems. Prevention of the emergence of disease is very important to support cultivation activities. One of the prevention efforts can be done by giving synbiotic to shrimp as immunostimulan. In this study, extracts of sweet potato flour used as a prebiotic, combined with local isolates of Bacillus sp. D2.2 as a probiotic applied simultaneously as a synbiotic. This study aims to determine the exact percentage of prebiotics in synbiotics, given through feed, so as to enhance non-specific immune responses in white shrimp. The feed was treated with 0% synbiotic treatment (A treatment / control), 0% prebiotic and 6% probiotics (B treatment), 2% prebiotic and 6% probiotics (C treatment), 4% prebiotics and 6% probiotics (D treatment). inspection of non-specific immune response in shrimp covering a total hemocyte count (THC), the activity of phagocytosis (AF), phagocytosis index (IF), the activity of phenoloxidase (PO), and the activity of superoxide dismutase (SOD). Observation of the non-specific immune response of white shrimp after treatment showed that prebiotics with a 2% percentage in the synbiotic administered through feed was the best prebiotic percentage to increase non-specific immune response in white shrimp. Keywords: prebiotics, probiotics, synbiotic, sweet potato, Bacillus sp. D2.2, immunity, white shrimp.
ABSTRAK
PENGARUH PERBEDAAN PERSENTASE PREBIOTIK EKSTRAK TEPUNG UBI JALAR DALAM SINBIOTIK, TERHADAP RESPON IMUN NON SPESIFIK UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei)
Oleh
Indri Saputri Ramadhani
Udang merupakan salah satu komoditas unggulan perikanan di indonesia. Dalam budidaya udang, serangan penyakit menjadi salah satu masalah utama. Pencegahan terhadap munculnya penyakit sangat penting dilakukan untuk menunjang kegiatan budidaya. Salah satu upaya pencegahan dapat dilakukan dengan memberikan sinbiotik pada udang sebagai imunostimulan. Dalam penelitian ini digunakan ekstrak tepung ubi jalar sebagai prebiotik, dikombinasikan dengan isolat lokal Bacillus sp. D2.2 sebagai probiotik yang diaplikasikan secara bersamaan sebagai sinbiotik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui persentase prebiotik yang tepat dalam sinbiotik, yang diberikan melalui pakan, sehingga dapat meningkatkan respon imun non spesifik pada udang vaname. Pakan yang diberikan adalah pakan dengan perlakuan 0% sinbiotik (perlakuan A/kontrol), 0% prebiotik dan 6% probiotik (perlakuan B), 2% prebiotik dan 6% probiotik (perlakuan C), 4% prebiotik dan 6% probiotik (perlakuan D). pemeriksaan respon imun non spesifik pada udang meliputi total hemocyte count (THC), aktifitas fagositosis (AF), indeks fagositosis (IF), aktifitas phenoloxidase (PO), dan aktifitas superoxide dismutase (SOD). Pengamatan pada respon imun non spesifik udang vaname setelah diberi perlakuan menunjukan bahwa prebiotik dengan persentase 2% dalam sinbiotik yang diberikan melalui pakan merupakan persentase prebiotik terbaik untuk meningkatkan respon imun non spesifik pada udang vaname. Kata kunci : prebiotik, probiotik, sinbiotik, ubi jalar, Bacillus sp. D2.2, imunitas, udang vaname.
PENGARUH PERBEDAAN PERSENTASE PREBIOTIK EKSTRAK TEPUNG UBI JALAR DALAM SINBIOTIK, TERHADAP RESPON IMUN NON SPESIFIK UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei)
Oleh INDRI SAPUTRI RAMADHANI
Skripsi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar SARJANA PERIKANAN
Pada
Program Studi Budidaya Perairan Jurusan Perikanan dan Kelautan Fakultas Pertanian Universitas Lampung
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2017
Judul Penelitian
Nama
:
:
PENGARUH PERBEDAAN PERSENTASE PREBIOTIK EKSTRAK TEPUNG UBI JALAR DALAM SINBIOTIK, TERHADAP RESPON IMUN NON SPESIFIK UDANG VANAME (Litopenaeus vannamei) Indri Saputri Ramadhani
No. Pokok Mahasiswa
:
1314111028
Program Studi
:
Budidaya Perairan
Jurusan
:
Perikanan dan Kelautan
Fakultas
:
Pertanian
MENYETUJUI Komisi Pembimbing
Esti Harpeni, S.T., M.AppSc. NIP. 197911182002122001
Tarsim, S.Pi., M.Si. NIP. 197610122000121001
Ketua Jurusan Perikanan dan Kelautan
Ir. Siti Hudaidah, M.Sc. NIP. 196402151996032001
MENGESAHKAN
Tim Penguji Ketua
: Esti Harpeni, S.T., M.AppSc.
____________
Sekertaris
: Tarsim, S.Pi., M.Si.
____________
: Limin Santoso, S.Pi., M.Si.
____________
Penguji Bukan Pembimbing
Dekan Fakultas Pertanian
Prof. Dr. Ir. Irwan Sukri Banuwa, M.Si. NIP. 196110201986031002
Tanggal Lulus Ujian Skripsi : 19 Juni 2017
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa : 1. Karya tulis saya, skripsi/laporan akhir ini, adalah asli dan belum pernah diajukan untuk mendapat gelar akademik (Sarjana/Ahli Madya), baik di Universitas Lampung maupun di perguruan tinggi lainnya. 2. Karya tulis ini murni gagasan, rumusan, dan penelitian saya sendiri, tanpa bantuan pihak lain, kecuali arahan tim pembimbing. 3. Dalam karya tulis ini tidak terdapat karya atau pendapat yang ditulis atau dipublikasikan orang lain, kecuali secara tertulis dengan jelas dicantumkan sebagai acuan dalam naskah dengan disebutkan nama pengarang dan dicantumkan dalam daftar pustaka. 4. Pernyataan ini saya buat dengan sesungguhnya dan apabila di kemudian hari terdapat penyimpangan dan ketidakbenaran dalam pernyataan ini, maka saya bersedia menerima sanksi akademik berupa pencabutan gelar yang telah diperoleh karena karya tulis ini, serta sanksi lainnya yang sesuai dengan norma yang berlaku di perguruan tinggi ini.
Bandar Lampung,
Juni 2017
Yang Membuat Pernyataan
Indri Saputri Ramadhani
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jerinjing pada tanggal 25 Januari 1996 dari pasangan Bapak Sukemi dan Ibu Suharlina. Penulis merupakan anak ketiga dari lima bersaudara. Pendidikan formal yang dilalui penulis adalah SDN 01 Baruraharja pada tahun 2001 – 2007, SMP N 02 Sungkai Utara pada tahun 2007 – 2010, dan SMA N 02 Kotabumi pada tahun 2010 – 2013. Pada tahun 2013 penulis diterima di Program Studi Budidaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Lampung melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melakukan praktik umun (PU) di Laboratorium Kesehatan Ikan, Balai Besar Perikanan Budidaya Air Tawar (BBPBAT) Sukabumi, dengan judul “Identifikasi Bakteri Aeoromonas hydropila pada Ikan Lele (Clarias gariepinus)”. Penulis juga pernah menjadi asisten dosen mata kuliah Ikhtiologi semester genap (2014/2015), Ekologi Perairan semester ganjil (2015/2016), Kewirausahaan semester genap (2015/2016) dan Penyakit dan Parasit Organisme Akuatik semester ganjil (2016/2017). Penulis juga aktif sebagai anggota Unit Kegiatan Mahasiswa Tapak Suci Universitas Lampung sejak tahun 2013 dan menjadi pengurus pada tahun 2014 – 2016. Penulis juga aktif sebagai pengurus Himpunan Mahasiswa Budidaya Perairan Unila sebagai anggota bidang Kewirausahaan tahun
2014 – 2015, serta anggota bidang Penelitian dan
Pengembangan 2015 – 2016. Tugas akhir dalam pendidikan tinggi diselesaikan dengan menulis skripsi yang berjjudul “Pengaruh perbedaan persentase prebiotik ekstrak tepung ubi jalar dalam sinbiotik, terhadap respon imun non spesifik udang vaname (Litopenaeus vannamei)”.
SANWACANA
Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulisan skripsi dengan judul “Pengaruh perbedaan persentase prebiotik ekstrak tepung ubi jalar dalam sinbiotik, terhadap respon imun non spesifik udang vaname (Litopenaeus vannamei) dapat diselesaikan dengan baik. Ucapan terimakasih yang tak terhingga penulis sampaikan secara khusus kepada Ibu Esti Harpeni, S.T., M.AppSc. dan Bapak Tarsim, S.Pi, M.Si. selaku komisi pembimbing atas waktu, kebijaksanaan, tuntunan, kesabaran, serta masukan hingga skripsi ini dapat diselesaikan. Penulis juga mengucapkan terimakasih kepada: 1. Keluarga tercinta, Ayahanda Sukemi, S.Pd., M.M. dan Ibunda Suharlina; ayunda Eka Puspa Sari, S.Pd. dan Indah Dwi Sartika S.Pd., M.Pd.; serta adinda Rizki Darmawan dan Rachmah Viantysha, yang telah memberikan cinta dan kasih sayang, doa serta semangat yang tiada henti kepada penulis. 2. Bapak Limin Santoso, S.Pi, M.Si selaku penguji atas segala masukan dan arahan. 3. Pimpinan dan staf Balai Besar Perikanan Budidaya Laut (BBPBL) Lampung, yang telah memberikan fasilitas, dukungan dan bimbingan sehingga penelitian ini dapat terlaksana dengan baik. 4. Teman-teman Akuakultur 2013 yang telah menemani, membantu, serta memberi semangat dalam menjalani masa-masa perkuliahan dan penelitian. 5. Sahabat-sahabat ku, para wanita rempong Akuakultur 2013 yang selalu menjadi keluarga terdekat. 6. Keluarga Besar Unit Kegiatan Mahasiswa Tapak Suci Universitas Lampung yang selalu menjadi rumah bagi penulis dan selalu memberi semangat. 7. Teman-teman angakatan pendadaran XV UKM TS Unila. 8. Staf dan pegawai jurusan Perikanan dan Kelautan FP Unila. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, karena keterbatasan pengetahuan dan wawasan penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran, masukan dan kritikan untuk perbaikan serta kesempurnaan penulisan selanjutnya. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat. Bandar Lampung.
Juni 2017
Indri Saputri Ramadhani
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI ......................................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix I. PENDAHULUAN ........................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ............................................................................................... 1 1.2 Tujuan Penelitian ........................................................................................... 2 1.3 Manfaat Penelitian ......................................................................................... 2 1.4 Kerangka Pemikiran ...................................................................................... 2 1.5 Hipotesis ........................................................................................................ 4 II. METODE PENELITIAN ................................................................................ 5 2.1 Waktu dan Tempat Penelitian ....................................................................... 5 2.2 Alat dan Bahan .............................................................................................. 5 2.3 Rancangan Penelitian .................................................................................... 5 2.4 Prosedur Penelitian ........................................................................................ 6 2.4.1 Penyiapan probiotik ................................................................................ 6 2.4.2 Penyiapan prebiotik ................................................................................ 6 2.4.3 Persiapan wadah dan media pemeliharaan ............................................. 6 2.4.4 Persiapan hewan uji ................................................................................ 7 2.4.5 Persiapan pakan uji ................................................................................. 7 2.4.6 Pegambilan sampel hemolim .................................................................. 7 2.4.7 Parameter uji ........................................................................................... 8 III. HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................................... 11 3.1 Total hemocyte count (THC) ....................................................................... 11 3.2 Aktivitas Fagositosis (AF) dan Indeks Fagositosis (IF) .............................. 13 3.3 Aktivitas Phenoloxidase (PO) ..................................................................... 17 3.4 Aktivitas Superoxide dismutase (SOD) ....................................................... 18 3.5 Kualitas Air .................................................................................................. 20 IV. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................... 21 4.1 Kesimpulan .................................................................................................. 21 4.2 Saran ............................................................................................................ 21 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 22
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Kerangka Pemikiran .............................................................................. 4 Gambar 2. Rerata total hemocyte count (THC) pada berbagai perlakuan ± SE. .. 12 Gambar 3. Persentase aktivitas fagositosis dari berbagai perlakuan ± SE. ........... 14 Gambar 4. Aktifitas fagositosis oleh hemosit ....................................................... 15 Gambar 5. Indeks fagositosis dari berbagai perlakuan ± SE. ............................... 16 Gambar 6. Aktivitas Phenoloxidase dari berbagai perlakuan ± SE. ..................... 17 Gambar 7. Aktivitas Superoxide dismutase dari berbagai perlakuan ± SE........... 19
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Formulasi pembuatan bahan ......................................................... 26 Lampiran 2. Analisis Data Total Hemosit Count (THC) .................................. 27 Lampiran 3. Analisis Data Aktifitas Fagositosis (AF) ...................................... 30 Lampiran 4. Analisis Data Indeks Fagositosis (IF) ........................................... 32 Lampiran 5. Analisis Data Aktivitas Phenoloxidase (PO)................................ 34 Lampiran 6. Analisis data Aktivitas Superoxide dismutase (SOD) .................. 37 Lampiran 7. Dokumentasi ................................................................................. 41
I.
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Udang vaname (Litopenaeus vannamei) merupakan salah satu komoditas unggulan yang saat ini sedang berkembang pesat di Indonesia. Peningkatan permintaan akan udang vaname di pasaran dapat dilihat dari peningkatan produksi rata-rata pada tahun 2010 – 2014 yang mencapai 20,49% (DJPB-KKP, 2014). Peningkatan permintaan ini mendorong dikembangkannya teknologi budidaya dengan sistem intensif. Namun dalam aplikasi di lapangan, budidaya dengan sistem intensif sering menimbulkan berbagai masalah, salah satunya yaitu munculnya serangan penyakit. Penyakit merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan produksi dan keberlangsungan kegiatan budidaya. Serangan penyakit pada udang dapat muncul sewaktu-waktu, memiliki penyebarannya cepat, dan tidak jarang menyebabkan kematian yang cepat pula. Udang vaname diketahui memiliki sistem imun bawaan atau alami sebagai pertahanan utama terhadap serangan patogen. Sedangkan sistem imun adaptif masih menjadi perdebatan. Upaya peningkatan kekebalan tubuh (imunitas) udang sebagai pencegahan terhadap munculnya penyakit sangat diperlukan untuk mendorong peningkatan produksi. Salah satu cara meningkatkan imunitas udang yaitu dengan memberikan imunostimulan seperti probiotik, prebiotik maupun sinbiotik (probiotik dan prebiotik). Bacillus sp. D2.2 merupakan salah satu bakteri potensial probiotik yang diisolasi dari tambak tradisional di Lampung, dan telah teridentifikasi sebagai Bacillus sp. (Setyawan et. al., 2014). Bakteri ini mampu menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi secara in vitro dan in vivo (Setyawan et. al., 2014; Hardiyani et. al., 2016). Sedangkan prebiotik yang potensial untuk dikembangkan yaitu ekstrak tepung ubi jalar. Indonesia menduduki peringkat keempat terbesar sebagai produsen ubi jalar dunia di bawah China, Uganda, dan Nigeria (Kemendag, 2013). Ubi jalar memiliki nutrisi yang berpotensi sebagai prebiotik yakni senyawa substrat yang mampu menstimulir pertumbuhan probiotik (Rahmawati et. al., 2015). Penggunaan probiotik bersama prebiotik yang tepat
merupakan konsep dasar dari sinbiotik. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui persentase prebiotik yang tepat dalam sinbiotik yang diberikan lewat pakan, yang berpengaruh terhadap respon imun non spesifik udang vaname.
1.1 Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui persentase prebiotik ekstrak tepung ubi jalar dalam sinbiotik yang diberikan lewat pakan, yang berpengaruh terhadap peningkatan sistem imun non spesifik pada udang vaname.
1.2 Manfaat Penelitian Memberikan informasi ilmiah tentang salah satu cara meningkatkan sistem imun non spesifik pada udang vaname.
1.3 Kerangka Pemikiran Udang vaname merupakan produk perikanan unggulan di Indonesia. Penyakit merupakan salah satu faktor yang sangat menentukan bagi keberhasilan budidaya udang vaname. Penyakit yang muncul disebabkan ketidakseimbangan interaksi antara lingkungan, kondisi inang dan patogen. Penyakit yang muncul pada udang dapat berupa penyakit infeksius maupun non-infeksius. Penyakit infeksius yang paling umum menyerang udang disebabkan oleh bakteri dan virus (Bachere, 2000). Penyakit yang disebabkan oleh bakteri ditemukan pada udang sebagai patogen primer maupun patogen sekunder (Wickins & Lee, 2002). Udang diyakini tidak memiliki reseptor pengingat terhadap patogen, sehingga udang tidak memiliki sistem imun spesifik seperti pada vertebrata, namun sistem imun non-spesifik pada udang cukup efektif untuk melawan patogen. Pertahanan tersebut terdapat pada hemosit yang yang berperan dalam sistem imun seluler dan humoral (Gambar 1). Sistem imun seluler tediri dari apoptosis, enkapsulasi, fagositosis, dan pembentukan nodul, sedangkan sistem imun humoral meliputi sistem prophenoloxidase (proPO) (Yudiati et.al., 2016). Sistem imun seluler utama pada udang bertumpu pada aktivitas fagositosis hemosit (Subagiyo & Fatichah, 2015), sedangkan kunci utama reaksi enzimatik pada sistem imun udang
2
dikatalis oleh enzim phenoloxidase (PO) (Yudiati et.al., 2016). Sistem pertahanan tersebut akan aktif ketika menerima rangsangan berupa protein dan karbohidrat seperti lipopolisakarida, peptidoglikan, glikan, dan manins yang dimiliki oleh bakteri, jamur, dan protozoa (Wickins & Lee, 2002). Upaya pencegahan terhadap munculnya penyakit sangat penting dilakukan untuk dapat menunjang kelangsungan produksi udang. Cara yang dapat dilakukan untuk mencegah munculnya penyakit yaitu dengan meningkatkan kekebalan tubuh udang. Sistem imun pada udang dapat ditingkatkan dengan memberikan sinbiotik (Kesuma, 2014). Sinbiotik diartikan sebagai suplemen gabungan antara probiotik dan prebiotik sehingga dapat meningkatkan efek menguntungkan dari keduanya (Cerezuela et. al., 2011). Probiotik merupakan mikroorganisme atau produknya yang memberikan manfaat bagi kesehatan inangnya dengan meningkatkan keseimbangan mikroba di usus (Irianto & Austin, 2002). Prebiotik merupakan senyawa yang tidak dapat dicerna namun mampu meningkatkan pertumbuhan bakteri dalam saluran pencernaan (Yousefian & Amiri, 2009). Meskipun probiotik dan prebiotik dapat diaplikasikan secara tunggal atau terpisah, namun penggunaan sinbiotik melalui pakan diketahui mampu menghasilkan pertumbuhan, konversi pakan, dan kelangsungan hidup yang lebih baik dibandingkan hanya menggunakan ptobiotik atau prebiotik saja (Widanarni et. al., 2012). Dalam mengkombinasikan probiotik dan prebiotik pada aplikasi sinbiotik haruslah dalam komposisi yang seimbang untuk mendukung kelangsungan hidup dan pertumbuhan bakteri probiotik dalam saluran pencernaan inang. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui persentase prebiotik yang tepat untuk meningkatkan respon imun non-spesifik pada udang vaname. Dalam penelitian ini akan digunakan isolat bakteri Bacillus sp. D2.2 sebagai probiotik dan ekstrak tepung ubi jalar sebagai prebiotik untuk dicampurkan dalam pakan.
3
Sistem imun non spesifik udang vaname Sistem imun seluler
Sistem imun humoral
Aktif ketika mendapat rangsangan berupa lipopolisakarida, peptidoglikan dan β-glukan Pemberian bakteri Bacillus sp. D2.2 dan ekstrak tepung ubi jalar sebagai sinbiotik Mengaktifkan sistem imun non spesifik pada udang vaname Gambar 1. Kerangka Pemikiran
1.4 Hipotesis a. Uji ANOVA H0 : Tidak ada pengaruh perbedaan persentase prebiotik ekstrak tepung ubi jalar dalam sinbiotik terhadap respon imun non spesifik udang vaname H1 : Terdapat pengaruh perbedaan persentase prebiotik ekstrak tepung ubi jalar dalam sinbiotik terhadap respon imun non spesifik udang vaname b. Uji Lanjut BNT H0 : Tidak ada pengaruh perbedaan persentase prebiotik ekstrak tepung ubi jalar dalam sinbiotik terhadap respon imun non spesifik udang vaname H1 : Minimal ada satu persentase prebiotik ekstrak tepung ubi jalar dalam sinbiotik yang berpengaruh terhadap respon imun non spesifik udang vaname
4
II.
METODE PENELITIAN
2.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari – April 2017. Lokasi penelitian di Balai Besar Perikanan Budidaya Laut (BBPBL) Lampung, Kecamatan Padang Cermin, Kabupaten Pesawaran, Lampung.
2.2 Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi bak pemeliharaan berupa kontainer plastik dengan ukuran 55x39x28 cm, instalasi aerasi, timbangan analitik, autoklaf, hotplate and stirrers, centrifuge, labu erlenmeyer, tabung reaksi, petri disc, mikcopipet, yellow tip, microtube, spuit 26G, microplate, microplate reader, kaca preparat, cover glass, mikroskop, haemocytometer, jarum ose, aluminium foil, sprayer, termometer, DO meter, dan waring. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan penelitian ini yaitu udang vaname yang berbobot 12 – 15 gram, pakan komersil protein 30%, air laut steril, akuades, alkohol 70%, gliserol, bacto pepton, bacto agar, ekstrak tepung ubi jalar, Na sitrat 10%, PBS, NaCl 0,85%, safranin 10%, pH paper, bakteri Staphylococcus aureus, reagen nitroblue tetrazolium, cacodylate cytrate buffer, cacodylate buffer, trypsin, L.DOPA, reagen bradfod, BSA, dan isolat bakteri Bacillus sp. D2.2.
2.3 Rancangan Penelitian Penelitian terdiri dari 4 perlakuan (Tabel 1), dengan 3 kali pengulangan. Tabel 1. Komposisi probiotik bakteri Bacillus sp. D2.2, prebiotik ekstrak tepung ubi jalar, dan binder pada pakan Perlakuan A B C D
Probiotik 0 6 6 6
Komposisi (%) Prebiotik 0 0 2 4
Binder 0 2 2 2
2.4 Prosedur Penelitian 2.4.1 Penyiapan probiotik Penyiapan probiotik dilakukan dengan
pertama-tama mengkultur bakteri
probiotik Bacillus sp, D2.2 pada media SWC (Sea water complate) (5 g bactopeptone, 1 g yeast ekstrak, 3 mL gliserol, 750 mL air laut, dan 250 mL akuades) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
2.4.2 Penyiapan prebiotik Pertama-tama ubi jalar dibuat tepung yang mengacu pada metode Harpeni et. al. (2016). Ubi jalar dicuci dan dikupas kulitnya, dikukus, kemudian diiris-iris dengan menggunakan pisau sampai ketebalan sekitar 1 mm. Irisan ubi jalar dikeringkan dalam oven pengering pada suhu 55 °C selama 5 jam hingga irisanirisan tersebut bisa dipatahkan. Irisan ubi yang sudah kering tersebut digiling menggunakan blender dan diayak dengan ukuran ayakan 60 mesh size. Setelah digiling selanjutnya tepung ubi tersebut dikukus terlebih dahulu dengan perbandingan air (1:1) selama 30 menit kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 55 °C sampai tepung kembali kering, kemudian digiling kembali menggunakan blender sampai tepung halus kembali. Pengekstraksian oligosakarida di dalam tepung ubi jalar dilakukan dengan mengacu pada metode Sukenda et. al. (2015). Pertama-tama 5 g tepung ubi jalar dicampur dengan 40 mL air mendidih sambil diaduk. Ekstrak dipertahankan pada suhu 85±2 °C dengan pengadukan terus-menerus selama sepuluh menit.
2.4.3 Persiapan wadah dan media pemeliharaan Wadah uji yang digunakan berupa kontainer plastik dengan ukuran 55x39x28 cm diisi air hingga ¾ dari volume total. Sebelum digunakan wadah disterilisasi terlebih dahulu, kemudian dilakukan pengisian air dan pemasangan perangkat aerasi sebanyak 2 titik aerasi pada setiap wadah. Wadah ditutup menggunakan waring untuk mencegah udang keluar dari wadah dan diberi shelter berupa pipa-pipa pendek sebagai tempat bersembunyi bagi udang saat moulting.
6
2.4.4 Persiapan hewan uji Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini yaitu udang vaname dengan berat 12 – 15 gram. Setelah ditimbang, udang dimasukkan ke dalam kontainer dengan jumlah udang tiap kontainer yaitu 10 ekor.
2.4.5 Persiapan pakan uji Pakan yang digunakan pada penelitian ini yaitu pakan komersial dengan kadar protein 30%, lemak 6% dan serat 3,5%. Proses persiapan pakan uji meliputi pencampuran probiotik, prebiotik, dan kuning telur ke dalam pakan komersial, mengacu pada Sukenda et. al. (2015). Jumlah probiotik dan prebiotik yang dibutuhkan ditentukan terlebih dahulu sesuai dengan masing-masing perlakuan. Setelah itu kuning telur dengan komposisi 2% dari jumlah pakan dimasukkan ke dalam wadah menggunakan pipet ukur. Selanjutnya probiotik dan prebiotik yang sudah ditentukan komposisinya dicampurkan dengan kuning telur. Bahan-bahan diaduk secara merata kemudian pakan dimasukkan lalu diaduk kembali hingga kuning telur, probiotik, dan prebiotik melekat pada pakan. Setelah campuran bahan-bahan tersebut merata, kemudian dilakukan pengeringan menggunakan suhu ruang dan pakan siap diberikan ke udang.
2.4.6 Pengambilan sampel hemolim Pengambilan hemolim mengacu pada (Subagiyo & Fatichah, 2015). Hemolim diambil sebanyak 0,3 ml dari bagian chepalothorax antara kaki jalan dan kaki renang. dengan menggunakan alat suntik steril (1 ml) dengan ukuran jarum 26 gauge (G) yang telah dibilas dengan anti-koagulan (Natrium Sitrat 10%). Sampel hemolim selanjutnya ditempatkan dalam mikrotube dan disimpan dalam cool box untuk pengamatan parameter respon imun udang. Pengambilan sampel hemolim dilakukan pada 3 ekor udang, setiap 4 hari sekali selama 12 hari pemeliharaan.
7
2.4.7 Parameter uji Parameter uji yang diamati untuk mengetahui respon imun non spesifik udang vaname antara lain THC (total hemocyte count), AF (aktivitas fagositosis), IF (indeks fagositosis), aktivitas PO (phenoloxidase) dan aktivitas SOD (superoxide dismutase).
2.4.7.1 Total Hemocyte Count (THC) Hemolim segar (10 µL) diencerkan 3X dengan PBS (20 µL) dan langsung diamati di bawah mikroskop dengan menggunakan hemocytometer pada 25 kotak kecil yang berada di tengah (1x1x0,1 mm3). Nilai THC dihitung berdasarkan metode Blaxhall dan Daishley (1973), dengan rumus sebagai berikut : T C ∑ sel x
olume kotak
x P
FP = Faktor pengenceran
2.4.7.2 Aktivitas dan Indeks fagositosis Hemolim segar (20 µL) dimasukkan ke sumuran mikroplate dan ditambahkan dengan 10 µL suspensi bakteri Staphilococcus aureus yang telah dilemahkan dengan 1% formalin selama 24 jam. Campuran hemolim dan suspensi bakteri diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit. Selanjutnya diambil 5 µL untuk dibuat apusan di atas gelas preparat dan dibiarkan hingga kering. Preparat yang sudah kering selanjutnya direndam dalam NaCl 0,9% selama 20 menit dan dibilas dengan NaCl 0,9% dan dikeringkan kembali. Selanjutnya preparat dicat dengan cat safranin 0,25% selama 20 menit dan dikeringkan. Preparat selanjutnya diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 100X. Aktivitas fagositosis (AF) dan indeks fagositosis (IF) dihitung berdasarkan Berger dan Jurcova (2012), sebagai berikut:
8
∑ ∑ ∑ ∑
2.4.7.3 Aktivitas Phenoloxidase (PO) Prosedur pengamatan aktivitas PO mengacu pada Yudiati et. al.,(2016). Hemolim (100 µL) diencerkan dengan PBS (1:1) kemudian disentrifuge pada 700 g, 4 0C, selama 20 menit. Supernatan dibuang dan endapan ditambahkan 100 µL cacodylate cytrate buffer (0,1M sodium cacodylate trihidrate; 0,45M NaCl, dan 0,01M sodium sitrat), disentrifuge pada 700 g, pada suhu 4 0C selama 20 menit. Supernatan dibuang dan endapan ditambahkan 100 µL buffer cacodylate (0,01M sodium cacodylate trihydrate; 0,45M NaCl; 0,01M CaCl2.2H2O; 0,26M MgCl2.6H2O), dimasukkan dalam 96 well microplate. Kemudian masing-masing sumuran yang sudah berisi sampel ditambahkan dengan 100 µL trypsin (sigma aldrich), diresuspensi dan diinkubasi selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 50 µL L-DOPA dan diukur absorbansinya dengan microplate reader pada panjang gelombang 490 nm. Aktivitas PO (phenoloxidase) didapatkan dari nilai absorbansi tersebut.
2.4.7.4 Aktivitas Superoxide dismutase (SOD) Prosedur pengamatan aktivitas SOD mengacu pada Yudiati et. al.,(2016). Sebanyak 50 µL hemolim dimasukkan dalam microtube dan diencerkan dengan 150 µL PBS (4x pengenceran), divortex kemudian disentrifuge pada 700 g. Selanjutnya supernatan diambil dan dipanaskan dalam waterbath pada suhu 65 0C selama 5 menit sehingga didapatkan ekstrak kasar SOD. Ekstrak kasar SOD bisa disimpan dulu dalam suhu -20 0C hingga digunakan untuk uji SOD. Uji SOD dilakukan dengan mengambil 100 µL ekstrak kasar SOD dicampur dengan 50 µL reagen nitroblue tetrazolium, NBT (NBT 0,1%), kemudian diinkubasi di suhu kamar selama 2 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm. Aktivitas SOD didapatkan dari nilai absorbansi tersebut.
9
2.4.7.5 Kualitas Air Kualitas air merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap kehidupan udang, sehingga dalam penelitian ini parameter kualitas air menjadi salah satu pertimbangan dari hasil yang didapatkan. Parameter kualitas air yang diamati dalam penelitian ini antara lain suhu, oksigen terlarut, pH, dan salinitas. Pengamatan kualitas air dilakukan pada awal, tengah dan akhir pemeliharaan, atau sebanyak tiga kali selama pelaksanaan penelitian.
2.5 Analisis data Parameter total hemocyte count (THC), aktivitas fagositosis (AF), indeks fagositosis (IF), aktivitas phenoloxidase (PO), dan aktivitas Superoxide dismutase (SOD) dianalisis dengan uji analisis sidik ragam (Anova) dengan selang kepercayaan 95%. Apabila hasil uji antarperlakuan berbeda nyata maka akan dilakukan uji lanjut BNT. Data pengamatan kualitas air dianalisis secara deskritif.
10
DAFTAR PUSTAKA
Alifuddin, M. (2002). Imunostimulasi pada hewan akuatik. Jurnal Akuakultur Indonesia, 1, 87 - 92. Anduro, G. G., Valle, F. A., Uriarte, A. B., Cordova, A. C., & Plascencia, G. Y. (2012). Cytosolic manganese superoxide dismutase genes from the white shrimp Litopenaeus vannamei are differentially expressed in response to lipopolysaccharides, white spot virus and during ontogeny. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, 162, 120 -125. Bachere, E. (2000). Shrimp immunity and disease control. Aquaculture, 191, 3 11. Berger, J., & Jarcova, M. (2012). Phagocytosis of insect haemocytes as a new alternative model. Journal of Applied Biomedicine, 10, 35 - 40. Braak, K. V. (2002). Hemocytic defence in black tiger shrimp (Penaeus monodon). Belanda: Wageningen. Cerezuela, R., Meseguer, J., & Esteban, M. A. (2011). Current knowledge in synbiotic use for fish aquaculture: A Review. J Aquaculture Research and Development, S1 : 008, 1-7. Chang, C. F., Su, M. S., & Chen, H. Y. (1999). A rapid method to quantity total haemocyte count of Penaeus monodon using ATP analysing. Fish Pathology, 34, 211 - 212. Chayati, T. N. (2012). Kinerja imunitas udang vaname Litopenaeus vannamei dalam teknologi bioflok dan probiotik terhadap koinfeksi infectious myonecrosis virus dan Vibrio harveyi. [Skripsi]. Bogor: IPB. Cook, M. T., Hayball, P. J., Hutchinson, W., Nowak, B. F., & Hayball, J. D. (2003). Administration of a commercial immunostimulant preparation, EcoActivaTM as a feed supplement enhances mecrophage respiratory brust and the growthrate of snapper (Pagrus auratus, Spariade (Bloch and Scneider)) in winter. Fish and Shellfish Imunology, 14, 333 - 345. DJPB-KKP. (2014). Udang vaname dan windu masih andalan ekspor Indonesia. Retrieved 11 3, 2016, from Direktorat Jendral Budidaya: http://www.djpb.kkp.go.id/arsip/c/246/Udang-Vaname-dan-UdangWindu-Masih-Andalan-Ekspor-Indonesia/?category_id=13
Ekawati, A. W., Nursyam, H., Widjayanto, E., & Marsoedi. (2012). Diatomae Chaetoceros dalam formula pakan meningkatkan respon imun seluler udang windu (Penaeus monodon Fab.). J. Exp. Life Sci, 2, 20 - 28. Hardiyani, S., Harpeni, E., Setyawan, A., & Supono. (2016). Patogenicity and in vivo study of local isolate Bacillus sp. D2.2 at the vannamei culture (Litopenaeus vannamei). Aquasains, 5, 421 - 426. Harpeni, E., Setyawan, A., Santoso, L., & Arifin, M. Z. (2016). Efektivitas ekstrak tepung ubi jalar sebagai media teknis bakteri probiotik. Dalam : Peran Penelitian Ilmu Dasar dalam Menunjang Pembangunan Berkalanjutan. Prosiding Seminar Nasional MIPA. Universitas Padjajaran. Bandung. pp. 127 - 130. Irianto, A., & Austin, B. (2002). Probiotics in aquaculture: Review. Journal of Fish Disease, 25, 633-642. Ji, P. F., Yao, C. L., & Wing, Z. Y. (2009). Immune response and gene expression in shrimp (Litopenaeus vannamei) hemocytes and hepatopancreas against some pathogen associated molecular patterns. Fish Shellfish Immunology, 27, 563 - 570. Johansson, M. W., Keyser, P., Sritunyalucksana, K., & Soderhall, K. (2000). Crustacean haemocytes and haemotopoiiesis. Aquaculture, 191, 45 - 92. Kemendag. (2013). MARKET BRIEF: Ubi kayu, ubi jalar dan talas atas perdagangan Tokyo. Tokyo: KBRI Tokyo. Kesuma, R. A. (2014). Pengaruh perbedaan sinbiotik terhadap kinerja produksi udang vaname Litopenaeus vannamei di tambak Pinang Gading, Bakauheni, Lampung. [Skripsi]. Bogor: IPB (Institut Pertanian Bogor). Madhumathi, M. (2011). Antioxidant status of Penaeus monodon fed with Dunaliella salina supplemented diet and resistance against WSSV. J. Eng. Sci. Technol., 3, 7249 - 7259. Manoppo, H., & Kolopita, M. E. (2014). Respon imun krustase. Budidaya Perairan, 2, 22-26. McGraw, W. J., & Scarpa, J. (2002). Determining ion concentration for Litopenaeus vannamei culture in freshwater. Global Aquaculture Advocate, 5, 36 - 37. Munaeni, W., Yuhana, M., & Widanarni. (2014). Effect of micro-encapsulated synbiotic at different frequencies for luminous vibriosis control white shrimp (Litopenaeus vannamei). Microbiology Indonesia, 8, 73 - 80.
23
Permana, G. N., Haryanti, & Rustidja. (2010). Perubahan histologi, protein hemolim dan ekspresi allozyme (GPI, PGM EST, SOD dan SP) pada udang L.vannamei selama infeksi taura syndrome virus (TSV). Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur (pp. 473 - 482). Jakarta: Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan Budidaya, Badan Penelitian dan Pengembangan Kelautan dan Perikanan. Rahmawati, I. S., Zubaidah, E., & Saparianti, E. (2015). Evaluasi pertumbuhan isolat probiotik (L. casei dan L. plantarum) dalam medium fermentasi berbasis ubi Jalar (Ipomoea batatas L.) selama proses fermentasi (kajian jenis isolat dan jenis tepung ubi jalar). Jurnal Aplikasi Teknologi Pangan, 4(4), 133-141. Ridho, A., & Pramesti, R. (2009). Aplikasi ekstrak rumput laut sebagai agen imunostimulan sistem pertahanan non spesifik pada udang (Litopenaeus vannamei). Ilmu Kelautan, 14, 133-137. Septiani, D.R. (2016). Uji kinetika dan aktivitas antibakteri dari bakteri biokontrol Bacillus sp. D2.2 pada salinitas dan pH yang berbeda. [Skripsi]. Lampung : Universitas Lampung. Setyawan, A., Harpeni, E., Ali, M., Mariska, D. C., & Aji, M. B. (2014). Potensi agen bakteri biokontrol indigenous tambak tradisional udang windu (Penaeus monodon) di Lampun Timur strain D2.2, terhadap bakteri patogen pada udang dan ikan. Dalam : Peranan Ilmu Mikrobiologi dalam Kesehatan Ikan dan Lingkungan. Prosiding Pertemuan Ahli Kesehatan Ikan 2014. Loka Pemeriksaan Penyakit Ikan dan Lingkungan. Serang. pp. 24 - 31. SNI. (2006). Produksi udang vaname (L. vannamei) di tambak dengan teknologi intensif. Jakarta: Badan Standarisasi Nasional : SNI-01-7246-2006. Sritunyaluksana, K., Wongsuesantati, K., Johansson, M. W., & Soderhall, K. (2001). Peroxinectin, acell adhesive protein associated with the proPO system from the black tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev Comp Immunol, 25, 353 - 363. Subagiyo, & Fatichah, D. I. (2015). Potensi hot water extract rumput laut Caulerpa sp. dan Sargassum sebagai komponen immunonutrisi pada budidaya udang vannamei (Litopenaeus vannamei). Jurnal Kelautan Tropis, 18, 154-159. Sukenda, Praseto, R., & Widanarni. (2015). Efektifitas sinbiotik dengan dosis berbeda pada pemeliharaan udang vaname di tambak. Jurnal Akuakultur Indonesia, 14, 1-8. Syahailatua, Y. D. (2009). Seleksi bakteri sebagai stimulator sistem imun pada udang vaname Litopenaeus vannamei. [Tesis]. Bogor: IPB. 24
Wickins, J. F., & Lee, D. O. (2002). Crustacean farming ranching and culture. Osney Mead, Oxford: Blackwell Science. Widanarni, Widagdo, P., & Wahjuningrum, D. (2012). Aplikasi probiotik, prebiotik, dan sinbiotik melalui pakan pada udang vaname (Litopenaeus vannamei) yang diinveksi bakteri Vibrio harveyi. Jurnal Akuakultur Indonesia, 11, 54-63. Yin, G., Jeney, G., Racs, T., Xu, P., Jun, X., & Jeney, Z. (2006). Effect of two Chinese herbs (Astragalus radixand Scutellaria radix) on nonspesific immune system of tilapia Oreochromis niloticus. Aquaculture, 253, 39 47. Yousefian, M., & Amiri, M. S. (2009). A review of the use of prebiotic in aquaculture for fish and shrimp. African Journal of Biotecnology, 8, 7313 7318. Yudiati, E., Isnansetyo, A., Murwantoko, Ayuningtyas, Triyanto, & Handayani, C. R. (2016). Innate immune-stimulating and immune genes up-regulating activites of three types of alginate from Sargassum siliquosum in pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish and Shellfish Immunology, 54, 46-53.
25
