PENGARUH PEMBERIAN EKSTRA BIJI KAKAO (Theobroma Cacao) TERHADAP KERUSAKAN SEL GINJAL MENCIT (mus Mucukus) YANG DI INDUKSI PARASETAMOL
SKRIPSI Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran
Khrestyawan L G0006105
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010
1
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah Ginjal merupakan organ utama dalam ekskresi produk sisa metabolisme yang tidak diperlukan lagi oleh tubuh. Selain itu ginjal juga membuang banyak toksin dan zat asing lainnya yang diproduksi atau berasal dari tubuh atau pencernaan, seperti pestisida, obat-obatan dan zat penambah pada makanan (Guyton and Hall,1996). Gangguan fungsi ginjal dapat disebabkan karena kelainan pada hati seperti sirosis atau kerusakan menetap karena virus hepatitis dan keracunan parasetamol (Dische,1995). Acetaminophen, atau yang lebih dikenal dengan Paracetamol, merupakan obat analgesik dan antipeuretik yang sering digunakan. Pemakaian paracetamol dengan dosis yang berlebihan dalam jangka waktu yang lama dapat menyebabkan kerusakan hepar dan ginjal. Phenacetin yang terdapat didalam paracetamol merupakan salah satu bahan yang paling sering menyebabkan nephropati analgesik (Lorz et al.,2004). Kakao (Theobroma cacao) merupakan tumbuhan berwujud pohon yang berasal dari Amerika Selatan. Biji kakao, diketahui mengandung berbagai macam substansi poliphenol seperti catechin dan rantai oligomer C4C8 yang merupakan antioksidan utama pada coklat dan kakao (Osakabe et al., 2002). Flavonoid yang terdapat dalam biji kakao yang terbanyak adalah
2
oligomer procyanidin yang bentuk kompleknya dikenal sebagai flavan-3-ol monomer (Lee et al.,2006). Senyawa flavonoid saat ini banyak mendapat perhatian karena, kelompok senyawa ini dilaporkan mempunyai berbagai aktifitas farmakologis seperti: antinflamasi, antioksidan, antibakteri. Beberapa senyawa yang bersifat sebagai antioksidan dan antiradikal antara lain adalah antosianin, flavon dan flavonol serta flavonoid. Flavonol memiliki aktivitas antioksidan lebih tinggi dibanding jenis flavonoid lain (Mun’im , 2005). Flavonoid berperan sebagai antioksidan karena dapat menangkap radikal bebas (free radical scavengers) dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya. Pemberian atom hidrogen ini akan menyebabkan radikal bebas menjadi stabil sehingga tidak menimbulkan kerusakan sel ( Ide, 2008). Cokelat merupakan bahan makanan yang digemari oleh masyarakat baik di Indonesia maupun didunia, serbuk cokelat berasal dari biji kakao. Biji kakao di ketahui mengandung flavonoid yang merupakan antioksidan. Berdasarkan hal tersebut maka peneliti ingin membuktikan apakah biji kakao dapat mengurangi kerusakan histologis ginjal mencit akibat pemberian parasetamol.
3
B. Perumusan Masalah Perumusan masalah pada penelitian ini adalah: Apakah pemberian ekstrak biji kakao (Theobroma cacao) dapat mengurangi kerusakan histologis ginjal mencit (Mus musculus) yang diinduksi parasetamol?
C. Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini untuk mengetahui pengaruh ekstrak biji kakao (Theobroma cacao) dalam mengurangi kerusakan histologis ginjal mencit (Mus musculus) yang diinduksi parasetamol.
D. Manfaat Penelitian 1. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai ekstrak biji kakao (Theobroma cacao) dalam mengurangi kerusakan histologis ginjal mencit (Mus musculus) yang diinduksi parasetamol. 2. Penelitian ini diharapkan dapat berguna sebagai bahan acuan untuk penelitian lebih lanjut, missalnya penelitian dengan subyek manusia.
4
BAB II LANDASAN TEORI
A. Tinjauan Pustaka 1. Ginjal Ginjal memiliki berbagai fungsi penting bagi tubuh kita, salah satu yang terpenting adalah membuang bahan- bahan sampah tubuh dari hasil pencernaan atau yang diproduksi oleh metabolisme (Guyton and
Hall,
1996).
Selain
berperan
penting
dalam
mengatur
keseimbangan cairan dan elektrolit, ginjal juga merupakan jalan penting untuk mengeluarkan berbagai zat sisa metabolik yang toksik dan senyawa- senyawa asing dari tubuh (Sherwood, 2001). Ginjal merupakan organ yang rentan terhadap efek toksik zat-zat kimia dan obat- obatan. Hal tersebut karena, ginjal menerima 25 persen dari curah jantung, sehingga sering dan mudah kontak dengan zat kimia dalam jumlah besar. Selain itu, ginjal merupakan jalur ekskresi obligatorik untuk kebanyakan obat, sehingga insufisiensi ginjal mengakibatkan penimbunan obat dan peningkatan konsentrasi dalam cairan tubulus (Price dan Wilson, 1994). Ginjal mengatur susunan kimia lingkungan interna dengan prose-proses kompleks yang terdiri atas filtrasi, absorpsi aktif, absorpsi pasif, dan sekresi. Tubulus-tubulus nefron, terutama tubulus kontortus proksimal, mereabsorpsi zat-zat dalam filtrat yang berguna bagi
5
metabolisme tubuh sehingga dapat mempertahankan homeostatis lingkungan interna. Selain itu, juga memindahkan hasil-hasil sisa dari darah ke lumen tubulus yang dikeluarkan lewat urin (Junqueira dan Carneiro, 1988). Ginjal dibagi dalam korteks luar dan medula dalam. Pada manusia, medula renis terdiri atas 10-18 stuktur berbentuk kerucut (piramidal), yaitu piramidal medula. Dari dasar setiap piramidal medula, terjulur berkas-berkas tubulus pararel,berkas medula yang menyusup kedalam korteks. Setiap berkas medula terdiri atas satu atau lebih duktus koligentes bersama bagian lurus beberapa nefron. Korteks ginjal terdiri dari pars konvulata dan pars radiata. Pars konvulata tersusun dari korpuskuli ginjal dan tubuli yang membentuk labirin kortikal (Paulsen, 2000). Unit kerja fungsional ginjal disebut nefron. Setiap ginjal terdapat 1-4 juta nefron, yang pada dasarnya mempunyai struktur dan fungsi yang sama Setiap nefron terdiri atas bagian yang melebar, korpuskulus renal, tubulus kontortus proksimal, segmen tebal dan tebal ansa (lengkung) Henle dan tubulus kontortus distal (Paulsen, 2000). Terdapat dua jenis nefron yaitu nefron korteks dan nefron jukstamedula. Nefron jukstamedula merupakan nefron berlengkung panjang yang penting dalam pembentukan gradien osmotik vertikal medula (Sherwood, 2001).
6
Korpuskulus ginjal terdiri dari kapsula Bowman dan rumbai kapiler glomerulus. Kapsula Bowman
merupakan suatu invaginasi
dari tubulus proksimal yang dilapisi oleh sel-sel epitel. Sel-sel epitel parietal berbentuk gepeng dan membentuk bagian terluar dari kapsula sedangkan sel-sel epitel viseral jauh lebih besar dan membentuk bagian dalam kapsula dan melapisi bagian luar dari rumbai kapiler. Membrana basalis membentuk lapisan tengah dinding kapiler, terjepit di antara sel-sel endotel membentuk bagian terdalam dari rumbai kapiler. Tidak seperti sel-sel epitel, sel endotel berkontak kontinu dengan membrana basalis. Sel-sel endotel, membrana basalis, dan sel-sel viseral merupakan
tiga
lapisan
yang
membentuk
membrana
filtrasi
glomerulus. Sel-sel mesangial adalah sel-sel endotel yang membentuk suatu jaringan kontinu antara lengkung-lengkung kapiler glomerulus dan diduga juga berfungsi sebagai jaringan penyokong. Sel-sel mesangial ini bukan merupakan bagian dari membrana filtrasi (Price dan Wilson, 1994). Tubulus kontortus proksimal merupakan segmen awal nefron yang berkelok-kelok dan timbul pada katup urinarius badan ginjal. Pada potongan melintang korteks, tubulus proksimal dibatasi oleh epitel selapis kubis yang sangat asidofil karena banyak terdapat mitokondria yang memanjang. Selain itu, terdapat juga brush border yang merupakan apeks sel yang menghadap ke lumen tubulus yang mengandung banyak mikrovili (Junqueira dan Carneiro, 1988).
7
Darah yang mengalir ke kedua ginjal normalnya 20-25 persen dari curah jantung, arteri renalis memasuki ginjal bersama ureter dan vena renalis, kemudian bercabang secara progresif membentuk arteri interlobaris, arteri arkuata, arteri interlobularis dan arteriol aferen, yang menuju ke kapiler glomerulus dalam glomerulus dimana sejumlah cairan dan zat terlarut difiltrasi untuk memulai pembentukan urin (Guyton and Hall, 1996). Saat arteri renalis masuk ke hilus, arteria tersebut
terbagi menjadi beberapa cabang yang ukurannya relatif
besar, yaitu arteri-arteri interlobar. Arteri ini menuju ke perifer di antara piramid-piramid yang hampir mendekati korteks, yang kemudian membelok dan melengkung seperti busur, yang karenanya diberi nama arteri-arteri arciform atau arcuate. Tiap-tiap arteri arcuate membuat beberapa percabangan arteri interlobar yang selanjutnya menjadi arteriol-arteriol aferen. Setiap arteriol kemudian bercabang dan menyusun suatu jaringan kapiler yang mengelilingi bagian lainnya dari nefron. Arteriol-arteriol yang meninggalkan glomerulus di dekat medula membuat cabang-cabang dan langsung menuju ke medula sebagai arteri rectae, di mana kemudian membentuk jaringan-jaringan kapiler di sekitar tubulus kolektivus dan lengkung Henle ( Price dan Wilson, 1994). Pemakaian analgetik yang berlebihan dan dalam jangka waktu yang lama dapat menyebabkan nefritis interstitial kronis, yang disertai
8
nekrosis papiler ginjal. Asetaminofen, metabolit fenasetin, dapat merusak sel dengan ikatan kovalen dan jejas oksidatif (Robbins dan Kumar, 1995). Selain menyebabkan nefritis intestinal kronis, pemakaian analgetik berlebih dapat pula menyebabkan nekrosis tubuler akut nefrotoksik yang secara histologis ditandai dengan nekrosis segmensegmen pendek tubulus, terutama pada tubulus proksimal, dengan membrana basalis tubuli umumnya masih baik dan secara klinik terjadi supresi akut fungsi ginjal. Hal ini terjadi karena sel epitel tubulus ginjal peka terhadap anoksia dan mudah rusak karena keracunan saat kontak dengan zat-zat yang diekskresi oleh ginjal (Robbins dan Kumar, 1995). Perubahan- perubahan lisis yang terjadi pada sel nekrosis pada umumnya dapat terjadi pada semua bagian sel, tetapi petunjuk paling jelas adalah perubahan yang terjadai pada inti sel (Price and Wilson, 1994)
2. Parasetamol Parasetamol atau asetaminofen merupakan obat yang sering digunakan, karena merupakan obat bebas dan mudah mendapatkannya. Parasetamol merupakan metabolit fenasetin dengan efek antipiretik. Efek antipiretik ditimbulkan oleh gugus aminobenzen (Wilmana, 2001). Parasetamol bekerja dengan menghambat sintesa prostaglandin dalam
9
susunan saraf pusat yang mempengaruhi pusat hipotalamus untuk pengontrolan suhu tubuh dan tidak memiliki efek anti inflamasi yang bermakna (Katzung, 1998).
Efek analgesik parasetamol yaitu
menghilangkan atau mengurangi nyeri ringan sampai sedang seperti nyeri kepala, mialgia, dan keadaan lain. Sebagai analgesik, sebaiknya parasetamol tidak diberikan terlalu lama karena dapat menimbulkan nefropati analgesik (Wilmana, 2001) Parasetamol diberikan secara oral, absorbsinya tergantung masa pengosongan lambung dan puncak konsentrasinya dalam darah biasanya terjadi pada 30-60 menit. Asetaminofen sedikit terikat dengan protein plasma dan sebagian dimetabolisme oleh enzim mikrosom hati, kemudian mengalami glukoronidase dan sulfasi menjadi konjugat yang sesuai. Sekitar 5% hasil metabolisme parasetamol adalah N-asetyl-pbenzoquinone imine (NAPQI). NAPQI adalah hasil metabolisme dari jalur sitokrom P450 yang merupakan metabolit minor yang sangat aktif dan bersifat toksik bagi hati dan ginjal. Selama glutathione tersedia untuk konjugasi parasetamol, hepatotoksisitas tidak akan terjadi. Glutathione yang terpakai akan lebih cepat dari regenerasinya dengan berjalannya waktu dan akhirnya akan terjadi pengosongan glutathione dan terjadi penimbunan NAPQI. Metabolit ini akan berikatan kovalen dengan gugusan nukleofilik yang terdapat pada makromolekul sel seperti protein, DNA, dan mitokondria sehingga menyebabkan hepatotoksisitas (Hodgson dan Levi, 2000).
10
Toksisitas organ dapat terjadi karena N-asetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI) bereaksi dengan gugusan nukleofilik yang terdapat pada makromolekul sel seperti protein, DNA, dan mitokondria. Masa kerja parasetamol sekitar 2-3 jam dan mengganggu fungsi ginjal. Reaksi antara NAPQI dengan makromolekul memacu terbentuknya ROS (Radical Oxygen Species). Selain itu, NAPQI dapat menimbulkan stres oksidatif, yang berarti bahwa NAPQI dapat menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid merupakan bagian dari proses atau rantai reaksi terbentuknya radikal bebas (Rubin et al., 2005). Ion superoksida/radikal bebas oksigen/O2- yang terdapat dalam NAPQI merupakan oksidan bagi sel. O2- ini dapat dinetralisir oleh Superoxide Dismutase (SOD) dan Cu2+ menjadi hydrogen peroxide (H2O2). Radikal hidroksil(OH-) sangat reaktif dan toksik terhadap sel tubuh karena merusak senyawa-senyawa penting tubuh yaitu asam lemak tak jenuh, DNA, dan protein (Tjokroprawiro, 1993). Lipid peroxide merupakan hasil peroksidasi radikal hidroksil yang berikatan dengan asam lemak tak jenuh (komponen glikolipid, fosfolipid dan kolesterol) yang merupakan penyusun membran sel. Malondialdehid (MDA) merupakan hasil pemecahan Lipid peroxide yang sangat toksik dan merusak, dengan akibat kematian sel (Mayes, 1995). Toksisitas
parasetamol
dapat
terjadi
karena pemakaian
berlebih, masa kerja yang lama atau keduanya (Katzung, 1998). Akibat
11
dari dosis toksik parasetamol yang paling serius adalah nekrosis hati, nekrosis tubulus renalis serta koma hipoglikemi (Wilmana, 2001). Pemakaian parasetamol yang berlebihan dapat menyebabkan efek samping
seperti
pusing,
perasaan
senang
dan
disorientasi.
Mengkonsumsi 15 gram (250 mg /kg BB) sangat berbahaya karena dapat menyebabkan hepatotoksisitas dengan kerusakan yang timbul berupa nekrosis sentrolobularis dan dapat menyebabkan nekrosis tubulus renal akut (Katzung, 1998).
3. Kakao (Theobroma cacao) Taksonomi Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Anak divisi
: Angiospermae
Kelas
: Dicotyledoneae
Anak kelas
: Dialypetale
Bangsa
: Malvales
Suku
: Sterculiaceae
Jenis
: Theobroma cacao
(Susanto, 2005) Kakao (Theobroma cacao) merupakan tumbuhan berwujud pohon yang berasal dari Amerika Selatan. Kakao telah digunakan suku-suku di Amerika Selatan dan Tengah sejak ratusan tahun lalu. Sekitar tahun 1550, pengenalan kakao semakin meluas ke seluruh daratan Eropa sebagai sumber makanan baru, diawali dari bangsa Spanyol yang membawa coklat dari Amerika Selatan sebagai hadiah
12
bagi rajanya. Karena rasa coklat yang enak, makanan olahan dari coklat semakin populer di Eropa (Ide, 2008). Penanaman tanaman kakao di pulau Jawa baru dimulai sekitar abad ke-19, sebelumnya tanaman kakao di bawa ke Indonesia oleh bangsa Spanyol pada abad ke-16 dan penanaman tanaman kakao pertama kali di daerah Sulawesi (Celebes-Minahasa). Sekarang coklat dan produk olahannya banyak terdapat di seluruh Indonesa (Wahyudi dan Rahardjo, 2008). Biji kakao mengandung sekitar 600 komponen kimia dan lebih dari sepertiganya dianggap bermanfaat bagi kesehatan. Kebanyakan dari komponen ini berupa polifenol (atau flavonoid) yang mampu bertindak sebagai antioksidan. Kenyataannya biji kakao mengandung jumlah flavonoid alami yang lebih kaya dibanding brokoli atau teh hijau (Ide, 2008). Kandungan biji kakao antara lain lemak, terdiri dari minyak kakao, mentega kakao, theobromin, serat, abu, dan protein. Theobromin bertindak sebagai diuretik. Kandungan dalam biji kakao yang berguna dalam pengobatan modern antiastma adalah theobromin, teofilin dan kafein. Biji kakao mentah mengandung 12-18% flavonoid yang setidaknya 60%nya merupakan oligomer procyanidin dari epicatechin. Flavonoid utama dalam kakao adalah flavan-3-ols, epicatechin, dan catechin (unit monomerik), dan polimerik yaitu
13
proanthocyanidins yang juga disebut dengan procyanidin (Noe et al., 2004). Flavonoid diketahui dapat menghambat oksidasi lipid dan pembentukan lipid peroxide melalui mekanisme penangkapan radikal bebas. Kemampuan flavonoid dalam mengikat Cu2+ (logam yang menginduksi oksidasi lipid) tergantung pada komponen struktural yang dimilikinya. Semakin sedikit gugus OH yang dimiliki oleh flavonoid, semakin kecil kemungkinan terjadinya oksidasi flavonoid dan reduksi logam karena kemungkinan lepasnya hidrogen semakin kecil (Hegazi dan El-Hady, 2007). Flavonol dan metabolitnya diserap baik melalui usus bagian atas maupun bagian bawah. Flavonoid dalam kakao diabsorbsi dan masuk ke dalam sirkulasi darah. Degradasi oligomer flavonol di dalam lambung hanya sedikit yang terjadi, sehingga flavonol kakao akan mencapai usus bagian atas. Flavonol dalam bentuk monomer dan dimer diabsorbsi di bagian usus atas, dan dalam waktu 30 menit sampai 1 jam setelah mengkonsumsi coklat kadar flavonol mulai meningkat dalam plasma. Monomer flavonol akan mengalami metabolisme yang lebih luas dengan biotransformasi yang diawali dalam enterosit dan dibawa oleh enzim-enzim yang berasal dari hepar dan ginjal. Jumlah O-methylated, O-glucoronidated, dan derivat flavonol O-sulfated dalam plasma akan meningkat pada metabolisme lanjutan tersebut. Asam fenolik sederhana merupakan hasil dari
14
metabolisme monomer dan oligomer flavonol (yang tidak diabsorbsi di usus kecil) oleh mikroflora kolon di usus besar. Setelah 8-9 jam mengkonsumsi kakao, metabolit asam fenolik dapat dideteksi dalam urin, dan konsentrasi tertingginya dalam waktu 24-48 jam (Uribe and Bektash, 2008). Dari hasil penelitian diketahui bahwa flavonoid banyak terdapat dalam kakao, terutama epicatechin serta procyanidin yang bersifat antioksidan. Antioksidan mampu memberikan elektron kepada molekul radikal bebas tanpa terganggu sama sekali dan dapat memutus reaksi berantai dari radikal bebas sehingga dapat mencegah terjadinya stres oksidatif (Almatsier, 2004).
4.
Kerusakan ginjal akibat toksisitas parasetamol Gagal ginjal kronik akibat kelebihan pemakaian analgesik merupakan permasalahan yang cukup sering dijumpai dan barangkali merupakan suatu bentuk penyakit ginjal yang paling mudah dicegah. Penyebab kerusakan ginjal adalah kombinasi dari aspirin dan fenasetin, karena pemakaian tunggal aspirin atau fenasetin jarang menyebabkan insufisiensi ginjal (Price dan Wilson, 1994). Efek toksik dari metabolit fenasetin pada ginjal akan meningkat pada keadaan berikut (Bennet, 1998): 1) Terjadi iskemia modula, dengan penurunan produksi prostaglandin lokal; PGE2 dan PGI2 merupakan
hormon
vasodilatator
ginjal
yang
kuat
sehingga
meningkatkan efek toksik dari metabolit fenasetin dan memperlambat
15
pengeluaran metabolit tersebut. 2) Proses pembentukan pirau monofosfat heksosa terhambat, dengan demikian akan menurunkan kadar glutation yang secara normal akan menghentikan aktivitas metabolit fenasetin (Price dan Wilson, 1994). Nekrosis pada ginjal merupakan kerusakan yang sering terjadi sebagai akibat dari pemberian parasetamol dengan dosis toksik (Goodman dan Gilman, 2001). Biasanya diperlukan 2 sampai 3 kg aspirin dan fenasetin untuk menimbulkan penyakit ginjal secara klinis (Murray et al., 1978). Nekrosis yaitu kematian sel dan jaringan pada tubuh yang hidup yang tampak nyata pada inti sel. Perubahanperubahan yang terjadi pada inti di antaranya adalah : 1) Hilangnya gambaran kromatin. 2) Inti menjadi keriput, tidak vesikuler lagi. 3) Inti tampak lebih padat, warnanya gelap hitam (pyknosis). 4) Inti terbagi atas fragmen-fragmen, robek (karyorrhexis). 5) Inti tidak lagi mengambil warna banyak karena itu pucat dan tidak nyata (karyolysis) (Saleh,1997). Secara histologis nekrosis tubuler akut nefrotoksik ditandai dengan sel-sel epitel tubulus yang semakin menipis dan datar, brush border menghilang, lumen tubulus melebar dan terisi oleh jaringan nekrotik (Dische, 1995). Sel epitel tubulus ginjal peka terhadap anoksia dan mudah rusak karena keracunan saat kontak dengan zat-zat yang diekskresi oleh ginjal. Dengan berjalannya waktu, inti pada sel yang nekrosis akan menghilang. Sitoplasma akan menjadi masa
16
asidofil suram bergranula. Regenerasi epitel akan tampak sebagai bentuk aktivitas mitosis pada sel epitel tubulus proksimal ginjal yang masih ada, apabila penderita dapat bertahan selama satu minggu (Robbins dan Kumar, 1995).
5.
Mekanisme Perlindungan Ekstrak kakao Terhadap Kerusakan Ginjal Akibat Induksi Parasetamol Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa flavonoid kakao bisa meningkatkan sensitivitas insulin, fungsi vaskular, dan tekanan darah yang melemahkan reaktifitas platelet. Mekanisme pengaruh flavonoid kakao tersebut masih terus dalam penelitian. Namun ada beberapa pendapat bahwa modulasi konsentrasi nitrit oksida oleh flavonoid merupakan kunci utama efek-efek fisiologis tersebut, dan modulasi tersebut mungkin mendasari manfaat terhadap kardiovaskular yang berhubungan dengan konsumsi kakao (Uribe and Bektash, 2008). Antioksidan berperan penting dalam mekanisme perlindungan ginjal dari toksisitas parasetamol. Flavonoid dan substansi poliphenol seperti catechin dan rantai oligomer C4-C8 yang merupakan antioksidan utama pada coklat dan kakao (Osakabe et al., 2002). Flavonoid dan procyanidin kakao mampu mendonorkan hidrogen sehingga merupakan perangkap yang kuat untuk oksidan reaktif dan spesies nitrogen yang mampu menangkal radikal bebas hasil dari pembentukan NAPQI pada toksisitas parasetamol (Ide, 2008).
17
B. Kerangka Pemikiran Parasetamol dosis toksis
Ekstrak kakao
Bioaktivasi sitokrom P450
theobromin teofilin kafein catechin
Meningkatkan NAPQI (elektrofilik)
procyanidin
flavonoid
Deplesi glutathione Radikal bebas antioksidan Lipid peroxidase
Ikatan kovalen dgn makromolekul (nukelofilik)
Stres Oksidatif
Keterangan: : memacu : menghambat
Nekrosis sel epitel tubulus proksimal ginjal
Kerusakan ginjal
Variabel luar yang tidak terkendali: kondisi psikologis dan keadaan awal ginjal
Kerusakan makromolekul
18
C. Hipotesis Pemberian ekstrak biji kakao dapat mengurangi kerusakan sel ginjal mencit (Mus musculus) yang diinduksi parasetamol.
19
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik. Peneliti mengadakan perlakuan terhadap sampel yang telah ditentukan yaitu berupa hewan coba di laboratorium.
B. Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
C. Subyek Penelitian Populasi
: Mencit (Mus musculus) jantan dengan galur Swiss webster berusia 2-3 bulan dengan berat badan ± 20 gram.
Sampel
: Menurut Purawisastra (2001), jumlah sampel yang digunakan berdasarkan rumus Federer yaitu : (k-1)(n-1) > 15 (4-1)(n-1) > 15 3 ( n-1) > 15 3n n
> 15+3 >6
20
Keterangan : k
:
Jumlah kelompok
n
:
Jumlah sampel dalam tiap kelompok
Pada penelitian ini jumlah sampel untuk tiap kelompok ditentukan sebanyak 10 ekor mencit (n > 6), dan jumlah kelompok mencit ada 4 sehingga penelitian ini membutuhkan 40 mencit dari populasi yang ada. Sample didapatkan dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gajah Mada (UGM), Yogyakarta.
D. Teknik Sampling Teknik sampling yang dipakai adalah purposive sampling (Murti, 2006).
E. Desain Penelitian Rancangan penelitian ini adalah The post test only control group design (Taufiqqurohman, 2003).
Sampel Mencit 40 ekor
KK : (-)
O0
KP1: (X 1)
O1
KP2: (X 2)
O2
KP3 : (X 3)
O3
Bandingkan dengan uji statistik
21
Keterangan : KK : (-) = Kelompok kontrol tanpa diberi ekstrak biji kakao maupun parasetamol. Pemberian aquades 0,2 ml/ 20grBB mencit perhari selama 17 hari berturut-turut. KP1: (X1) = Kelompok perlakuan I yang diberi parasetamol tanpa diberi ekstrak biji kakao. Pemberian aquades peroral sebanyak 0,2 ml/ 20grBB mencit perhari selama 17 hari berturut-turut dan pada hari ke-15, 16 dan 17 diberi parasetamol 0,1 ml/ 20grBB mencit perhari. KP2: (X 2) = Kelompok perlakuan II yang diberi parasetamol dan ekstrak biji kakao dosis I. Pemberian ekstrak biji kakao peroral dosis I 0,2 ml/ 20grBB mencit perhari selama 17 hari berturut-turut, dimana hari ke-15, 16 dan 17 diberikan juga parasetamol dosis 0,1 ml/ 20grBB mencit perhari 1 jam setelah pemberian ekstrak biji kakao. KP3 : (X 3) = Kelompok perlakuan III yang diberi parasetamol dan ekstrak biji kakao dosis II. Pemberian ekstrak biji kakao dosis II yaitu 0,4 ml/ 20grBB mencit perhari selama 17 hari berturut-turut, dimana hari ke-15, 16 dan 17 diberikan juga
parasetamol dosis 0,1 ml/
20grBB mencit perhari 1 jam setelah pemberian ekstrak biji kakao.
22
O0
=
Pengamatan jumlah inti sel epitel tubulus proksimal ginjal piknosis, karyoreksis dan karyolisis dari 100 sel di pars konvulata korteks ginjal kelompok kontrol.
O1
=
Pengamatan jumlah inti sel epitel tubulus proksimal ginjal piknosis, karyoreksis dan karyolisis dari 100 sel di pars konvulata korteks ginjal KP1.
O2
=
Pengamatan jumlah inti sel epitel tubulus proksimal ginjal piknosis, karyoreksis dan karyolisis dari 100 sel di pars konvulata korteks ginjal KP2.
O3 =
Pengamatan jumlah inti sel epitel tubulus proksimal ginjal piknosis, karyoreksis dan karyolisis dari 100 sel di pars konvulata korteks ginjal KP3 Pengamatan jumlah inti sel epitel tubulus proksimal ginjal
pyknosis, karyorrhexis dan karyolysis dilakukan pada hari ke-18 setelah perlakuan pertama dikerjakan.
F. Identifikasi Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Pemberian ekstrak biji kakao. 2. Variabel Terikat Kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal mencit. 3. Variabel luar a. Variabel luar yang dapat dikendalikan
23
Variasi genetik, jenis kelamin, umur, suhu udara, berat badan, dan jenis makanan mencit semuanya diseragamkan. b. Variabel luar yang tidak dapat dikendalikan Kondisi psikologis dan keadaan awal ginjal mencit.
G. Definisi Operasional Variabel Penelitian 1. Variabel bebas. a. Pemberian ekstrak biji kakao Ekstrak biji kakao diberikan secara per oral dengan sonde lambung dalam 2 dosis. Dosis I: 0,2 ml/ 20grBB mencit/ hari yang diencerkan hingga 0,2 cc diberikan pada mencit KP2. Dosis II: 0,4 ml/ 20grBB mencit/ hari yang diencerkan hingga 0,4 cc diberikan pada mencit KP3. Pada kelompok perlakuan ketiga diberikan dosis sebesar dua kali lipat dosis awal untuk melihat adanya perbedaan pengaruh ekstrak biji kakao dalam mengurangi kerusakan ginjal akibat parasetamol pada dosis yang lebih besar. Jenis kakao yang digunakan adalah Criolo (fine kakao atau kakao mulia). Ekstrak biji kakao diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat (BPTO), Karanganyar. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi dengan menggunakan pelarut etanol. Skala pengukuran variabel ini adalah Rasio.
24
2. Variabel terikat : a. Kerusakan sel ginjal Kerusakan sel ginjal adalah gambaran mikroskopis sel epitel tubulus proksimal ginjal mencit yang mengalami kerusakan setelah pemberian parasetamol dan pemberian kakao. Hal ini dinilai dari jumlah sel epitel tubulus proksimal pada suatu daerah tertentu di pars konvulata korteks ginjal. Tiap ekor mencit dibuat 2 irisan jaringan ginjal kanan dan 2 irisan jaringan ginjal kiri kemudian dibuat preparat dan diambil salah satu secara acak dari masing-masing ginjal untuk dilakukan pengamatan, dengan proporsi perhitungan ginjal kanan 50% dan ginjal kiri 50%. Pada irisan jaringan ginjal, diambil 1 daerah di pars konvulata korteks ginjal. Dari 100 sel epitel tubulus proksimal yang ada pada setiap daerah tersebut dihitung jumlah sel epitel tubulus proksimal yang mengalami kerusakan. Jika inti pyknosis, karyorrhexis dan karyolysis masing- masing diberi skor 1. Adapun tanda-tanda kerusakan sel : (a) Sel yang mengalami pyknosis intinya kisut dan bertambah basofil, berwarna gelap batasnya tidak teratur. (b) Sel yang mengalami karyorrhexis inti mengalami fragmentasi atau hancur degan meninggalkan pecahanpecahan zat kromatin yang tersebar di dalam sel. (c) Sel yang mengalami karyolisis yaitu kromatin basofil menjadi pucat, inti sel
25
kehilangan kemampuan untuk diwarnai dan menghilang begitu saja (Price et al., 1994). Maka rumus besarnya skor kerusakan histologis adalah: (1 x P) + (1 x Kr) + (1 x Kl) Keterangan : P
: Jumlah sel epitel tubulus proksimal dengan inti pyknosis.
Kr
: Jumlah sel epitel tubulus proksimal dengan inti karyorrhexis.
Kl
: Jumlah sel epitel tubulus proksimal dengan inti karyolysis.
Sehingga dari setiap mencit diperoleh 2 nilai skor yang merupakan skor preparat ginjal kanan dan ginjal kiri. Setiap kelompok mencit mempunyai 20 nilai skor (jumlah mencit tiap kelompok 10 ekor). Skala ukuran variabel ini adalah skala rasio. 3. Variabel luar a. Variabel luar yang dapat dikendalikan. Variabel ini dapat dikendalikan melalui homogenisasi. 1) Variasi genetik Jenis hewan coba yang digunakan adalah mencit (Mus musculus) dengan galur Swiss webster. 2) Jenis kelamin Jenis kelamin mencit yang digunakan adalah jantan. 3) Umur Umur mencit pada penelitian ini adalah 2-3 bulan. 4) Suhu udara
26
Hewan percobaan diletakkan dalam ruangan dengan suhu udara berkisar antara 25-28o C. 5) Berat badan. Berat badan hewan percobaan + 20 gram. 6) Jenis makanan. Makanan yang diberikan berupa pellet dan minuman dari air PAM. b. Variabel luar yang tidak dapat dikendalikan : kondisi psikologis, dan keadaan awal ginjal mencit. 1) Kondisi psikologis mencit dipengaruhi oleh lingkungan sekitar. Lingkungan yang terlalu ramai dan gaduh, pemberian perlakuan yang berulang kali, dan perkelahian antar mencit dapat mempengaruhi kondisi psikologis mencit. 2) Keadaan awal ginjal mencit tidak diperiksa pada penelitian ini sehingga mungkin saja ada mencit yang sebelum perlakuan keadaan ginjalnya sudah mengalami kelainan.
H. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat. Alat yang digunakan adalah sebagai berikut : a. Kandang mencit 4 buah masing-masing untuk 10 ekor mencit. b. Timbangan hewan. c. Timbangan obat.
27
d. Alat bedah hewan percobaan (scalpel, pinset, gunting, jarum, meja lilin). e. Sonde lambung. f. Alat untuk pembuatan preparat histologi. g. Mikroskop cahaya medan terang. h. Gelas ukur dan pengaduk. i. Kamera digital 2. Bahan. Bahan yang akan digunakan adalah sebagai berikut : a. Parasetamol. b. Makanan hewan percobaan (pellet). c. Aquades. d. Bahan untuk pembuatan preparat histologi dengan pengecatan HE. e. Ekstrak biji kakao.
I. Cara Kerja 1. Dosis dan Pengenceran Ekstrak Biji Kakao Dosis yang diberikan ditentukan berdasar hasil konversi dari tikus ke mencit (Ngatidjan, 1991) dengan menggunakan dosis pada penelitian sebelumnya yaitu sebesar 400 mg/ kgBB pada tikus (McKim et al., 2002). Dosis pemberian ekstrak biji kakao ini diberikan dalam dua dosis, yaitu dosis I = 0,2 ml/ 20grBB mencit dan dosis II = 0,4 ml/ 20grBB mencit. Masing-masing dosis yang disondekan tersebut adalah ekstrak biji kakao
28
yang diencerkan dengan aquades menjadi volume 0,2 ml (untuk dosis I) dan 0,4 ml (untuk dosis II). Ekstrak biji kakao diberikan sehari sekali selama 17 hari berturut-turut pada KP2. Sedangkan ekstrak biji kakao dosis II diberikan sehari sekali selama 17 hari berturut-turut pada KP3. Perhitungan dosis ekstrak biji kakao: a. Dosis I ekstrak biji kakao Nilai konversi x 400 mg/ kgBB = 0,14 x 400 mg/ kgBB = 56 mg/ kgBB = 1,12 mg/ 20grBB Pengenceran Ekstrak Biji Kakao : 56 mg ekstrak biji kakao + aquades à 10 ml larutan ekstrak biji kakao Dalam 1 ml larutan mengandung 5,6 mg ekstrak biji kakao à 0,2 ml larutan mengandung 1,12 mg ekstrak biji kakao Ekstrak biji kakao yang disondekan adalah ekstrak biji kakao yang telah diencerkan. Ekstrak biji kakao yang disondekan pada 1 ekor mencit dengan berat badan 20 gram = 0,2 ml yang diberikan selama 17 hari berturut-turut. b. Dosis II ekstrak biji kakao Ekstrak biji kakao dosis II adalah 2 kali ekstrak biji kakao dosis I yaitu sebesar 2,24 mg. Jadi larutan ekstrak biji kakao yang disondekan pada 1 ekor mencit (20 gram) = 0,4 ml yang diberikan selama 17 hari berturut-turut.
29
Pemberian ekstrak biji kakao selama 17 hari berturut-turut dimaksudkan untuk meningkatkan kadar antioksidan sehingga kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal dapat dicegah ketika terpapar parasetamol dosis toksik. Pemberian cokelat dengan kandungan flavonoid yang tinggi selama dua minggu dapat meningkatkan konsentrasi epikatekin plasma (Engler et al., 2004). Di luar jadwal perlakuan, mencit diberi makan pellet dan minum air PAM ad libitum. 2. Dosis dan pengenceran parasetamol LD-50 untuk mencit secara peroral yang telah diketahui adalah 338 mg/KgBB atau 6,76 mg/20 gBB mencit (Alberta, 2006). Dosis parasetamol yang dapat menimbulkan efek kerusakan ginjal
berupa
nekrosis sel epitel tubulus proksimal ginjal tanpa menyebabkan kematian mencit adalah dosis 3/4 LD-50 perhari. Dosis yang digunakan adalah 338 mg/ KgBB x 0,75 = 253,5 mg/ KgBB = 5,07 mg/ 20grBB mencit. Parasetamol 500 mg dilarutkan dalam aquades hingga 9,86 ml, sehingga dalam 0,1 ml larutan parasetamol mengandung 5,07 mg parasetamol. Parasetamol diberikan selama 3 hari berturut-turut yaitu pada hari ke-15, 16, dan 17. Pemberian parasetamol dengan cara ini dimaksudkan untuk menimbulkan kerusakan pada sel epitel tubulus proksimal ginjal tanpa menimbulkan kematian pada mencit.
30
3. Persiapan mencit Mencit diadaptasikan selama tujuh hari di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UNS, Surakarta. Sesudah adaptasi, keesokan harinya dilakukan penimbangan untuk menentukan dosis dan dilakukan perlakuan. 4. Pengelompokan Subjek Pada minggu kedua mulai dilakukan percobaan. Selanjutnya subjek dikelompokkan menjadi empat kelompok secara random, dan masingmasing kelompok terdiri dari 10 mencit. Adapun pengelompokan subjek adalah sebagai berikut: a. KK =
Kelompok kontrol diberi aquadest peroral sebanyak 0,2 ml/ 20grBB mencit perhari selama 17 hari berturut-turut.
b. KP1 =
Kelompok perlakuan I diberi aquades peroral sebanyak 0,2 ml/ 20grBB mencit perhari selama 17 hari berturut-turut dan pada hari ke 15, 16 dan 17 juga diberi parasetamol 0,1ml/ 20grBB mencit peroral perhari.
c. KP2 =
Kelompok perlakuan II diberi ekstrak biji kakao peroral dengan dosis 0,2 ml/ 20grBB mencit perhari selama 17 hari berturut-turut, dimana hari ke-15, 16 dan 17 diberikan juga parasetamol dengan dosis 0,1ml/ 20grBB mencit perhari setelah 1 jam pemberian ekstrak biji kakao.
d. KP3 =
Kelompok perlakuan III diberi ekstrak biji kakao dosis II peroral yaitu 0,2 ml/ 20grBB mencit perhari selama 17 hari berturut-turut, dimana hari ke-15, 16 dan 17 diberikan juga
31
parasetamol dosis 0,1 ml/ 20grBB mencit perhari setelah 1 jam pemberian ekstrak biji kakao.
Setiap sebelum pemberian parasetamol dan ekstrak biji kakao, mencit dipuasakan dahulu ± 5 jam untuk mengosongkan lambung. Pemberian parasetamol dilakukan ± 1 jam setelah pemberian ekstrak biji kakao agar ekstrak biji kakao terabsorbsi terlebih dahulu.
Skema Pemberian Perlakuan Sampel 40 ekor mencit
Kelompok Kontrol
Kelompok Perlakuan 1
Kelompok perlakuan 2
Kelompok Perlakuan 3
Dipuasakan selama + 5 jam
Aquades 0,2 ml
Ekstrak biji kakao 0,2 ml/ 20grBB
Ekstrak biji kakao 0,4 ml/ 20grBB
Setelah + 1 jam
Parasetamol dengan dosis 0,1ml/ 20grBB pada hari ke 15, 16, 17.
Perlakuan sampai hari ke-17. Pemberian parasetamol hanya dilakukan pada hari ke 15, 16 J. dan 17. Pembuatan preparat pada hari ke-18.
32
5. Pengukuran hasil. Pada hari ke-18 setelah perlakuan diberikan, semua hewan percobaan dikorbankan dengan cara neck dislocation. Hal ini dilakukan pada hari ke-18 agar efek dari perlakuan masih tampak nyata. Setiap mencit diambil ginjal kanan dan kiri dengan proporsi perhitungan ginjal kanan 50% dan ginjal kiri 50%, kemudian dibuat 2 irisan secara frontal pada daerah pertengahan ginjal (untuk keseragaman) dengan ketebalan tiap irisan ginjal + 5–7 µm. Preparat ginjal dibuat dengan metode blok parafin dengan pengecatan Hematoksilin Eosin (HE). Masing-masing ginjal diambil salah satu preparat secara acak dari untuk dilakukan pengamatan. Pengamatan preparat jaringan ginjal mula-mula dilakukan dengan perbesaran 100 kali untuk mengamati seluruh bagian irisan, kemudian ditentukan tubulus proksimal yang terletak pada pars konvulata korteks ginjal. Pengamatan dilanjutkan dengan perbesaran 400 kali untuk mengamati inti sel epitel tubulus proksimal ginjal. Pengamatan dilakukan dengan perbesaran 1000 kali untuk melihat dan membedakan inti sel yang pyknosis, karyorrhexis dan karyolysis dengan lebih jelas. Pengamatan dilakukan pada tubulus proksimal ginjal karena pada tubulus proksimal terjadi absorpsi dan sekresi aktif serta kadar sitokrom P450 lebih tinggi untuk mendetoksifikasi atau mengaktifkan toksikan sehingga lebih mudah untuk mengalami kerusakan.
33
Untuk mengetahui sel-sel epitel tubulus proksimal yang mengalami kerusakan maka dari tiap irisan ditentukan 1 daerah di pars konvulata korteks ginjal kemudian pada tiap daerah tersebut dihitung jumlah sel epitel tubulus proksimal yang mengalami kerusakan dari tiap 100 sel epitel tubulus proksimal yang ada di daerah tersebut. Sel dengan inti pyknosis, karyorrhexis dan karyolysis diberi skor 1. Jadi misalnya dari suatu preparat ginjal kanan (seekor mencit) dari 100 sel yang diamati ternyata terdapat 10 inti pyknosis, 15 inti dengan karyorrhexis, dan 5 inti dengan karyolisis, maka jumlah skor dari preparat untuk ginjal kanan adalah (10x1) + (15x1) + (5x1) = 30. Pengamatan pada ginjal kiri terdapat 5 inti pyknosis, 15 inti dengan karyorrhexis, dan 5 inti dengan karyolisis, maka jumlah skor dari preparat ginjal kiri adalah (5x1) + (15x1) + (5x1) = 25. Sehingga dari setiap mencit diperoleh 2 nilai skor yang merupakan skor irisan ginjal kanan dan ginjal kiri. Setiap kelompok mencit berarti terdapat 20 nilai skor (jumlah mencit tiap kelompok 10 ekor). Nilai skor kerusakan histologis ini kemudian dianalisis secara statistik.
J. Teknik Analisis Data Statistik Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan Uji Oneway Analysis of Variant (ANOVA). Jika terdapat perbedaan yang bermakna maka dilanjutkan dengan uji Post Hoc. Derajat kemaknaan yang digunakan adalah α = 0,05 (Riwidikdo, 2007).
34
Syarat menggunakan uji One-Way ANOVA: 1. Variabel data berupa variabel numerik/ kontinu/ rasio. Data pada penelitian ini adalah skor kerusakan histologis sel ginjal mencit yang dinyatakan dengan angka rasio. 2. Sebaran data harus normal, dibuktikan dengan nilai uji KolmogorovSmirnov atau Saphiro-Wilk yang memiliki nilai p lebih besar daripada nilai alfa. Misal, alfa = 0,05 maka nilai p untuk uji sebaran data harus > 0,05. 3. Varians data harus sama. Hal ini dapat diketahui dengan menggunakan uji Homogeneity of Variances, dimana untuk varians data yang sama akan memiliki nilai p > nilai alfa.
Jika ketiga syarat di atas tidak terpenuhi maka dapat digunakan uji hipotesis alternatif yaitu berupa uji hipotesis non-parametrik Kruskall-Wallis.
35
BAB IV HASIL PENELITIAN
A. Data Hasil Penelitian Data hasil penelitian yaitu hasil rerata skor jumlah kerusakan histologis sel epitel tubulus proksimal ginjal yang diinduksi parasetamol pada masing-masing kelompok disajikan pada tabel 1. Tabel 1.
Rerata Skor Kerusakan Histologis Sel Epitel Tubulus Proksimal Ginjal pada Masing-masing Kelompok Mencit
Kelompok
Rata-rata Skor
± Standar Deviasi
K
32,700
3,622
P1
53,100
3,784
P2
38,900
2,644
P3
37,400
2,716
Sumber: Data Primer, 2010 Keterangan: K
: Kelompok kontrol
P1
: Kelompok perlakuan 1
P2
: Kelompok perlakuan 2
P3
: Kelompok perlakuan 3
36
Skor kerusakan yang paling tinggi adalah pada kelompok P1 yaitu 53,1000 ± 3,78447 dan skor kerusakan paling rendah adalah pada kelompok K yaitu 32,700 ± 3,62246. Gambaran histologis (fotomikrograf) tubulus proksimal pars konvulata korteks ginjal mencit kelompok K yang ditandai dengan pyknosis, karyorrhexis dan karyolysis dapat dilihat pada lampiran 3, gambar 1. Gambaran histologis (fotomikrograf) tubulus proksimal pars konvulata korteks ginjal mencit kelompok P1 yang ditandai dengan pyknosis, karyorrhexis dan karyolysis dapat dilihat pada lampiran 3, gambar 2. Gambaran histologis (fotomikrograf) tubulus proksimal pars konvulata korteks ginjal mencit kelompok P2 yang ditandai dengan pyknosis, karyorrhexis dan karyolysis dapat dilihat pada lampiran 3, gambar 3. Gambaran histologis (fotomikrograf) tubulus proksimal pars konvulata korteks ginjal mencit kelompok P3 yang ditandai dengan pyknosis, karyorrhexis dan karyolysis dapat dilihat pada lampiran 3, gambar 4.
B. Analisis Data Data yang diperoleh dari hasil penelitian, pertama kali diuji apakah ada perbedaan skor rerata kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal mencit yang bermakna antara keempat kelompok dengan uji One-Way ANOVA. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program komputer Statistical Product and Service Solution (SPSS) 17.0 for Windows.
37
Metode analitik yang dapat digunakan untuk menentukan sebaran data normal
atau
tidak
normal
adalah
uji
Kolmogorov-Smirnov
(sampel > 30) atau uji Saphiro-Wilk (sampel < 30). Penelitian ini menggunakan 40 sampel, maka digunakan uji Kolmogorov-Smirnov untuk menentukan apakah sebaran data normal atau tidak. Hasil uji KolmogorovSmirnov dapat dilihat pada lampiran 2, tabel 4. Nilai p dari hasil uji Kolmogorov-Smirnov berturut-turut untuk kelompok kontrol, perlakuan 1, perlakuan 2, dan perlakuan 3 adalah 0,200; 0,200; 0,200 dan 0,200 di mana keempat nilai di atas lebih besar dari alfa (0,05) sehingga dapat dinyatakan bahwa (1) sebaran data kelompok kontrol normal, (2) sebaran data kelompok perlakuan 1 normal, (3) sebaran data kelompok perlakuan 2 normal, dan (4) sebaran data kelompok perlakuan 3 normal.Sehingga syarat kedua untuk menggunakan uji One-Way ANOVA terpenuhi. Syarat ketiga untuk menggunakan uji One-Way ANOVA
adalah
varians data harus sama. Hal ini dapat diketahui dengan menggunakan uji Homogeneity of Variances, dimana untuk varians data yang sama akan memiliki nilai p > nilai alfa. Sebaran data secara deskriptif dapat dilihat pada lampiran, dan hasil uji Homogeneity of Variances dapat dilihat pada lampiran 2, tabel 6. Nilai p yang didapatkan dari uji Homogeneity of Variances adalah 0,353 di mana nilai ini lebih besar dari 0,05 dan dapat diartikan bahwa varians data antar kelompok sama. Syarat ketiga untuk menggunakan uji One-Way ANOVA terpenuhi sehingga uji One-Way ANOVA bisa dilakukan.
38
Hasil uji One-Way ANOVA dapat dilihat pada lampiran 2, tabel 7. Nilai p dari hasil uji One-Way ANOVA adalah 0,000 (p<0,05), jadi terdapat perbedaan skor rata-rata kerusakan histologis sel epitel tubulus proksimal ginjal yang bermakna antara kelompok kontrol, kelompok perlakuan 1, kelompok perlakuan 2 dan kelompok perlakuan 3. Karena didapatkan adanya perbedaan yang signifikan dari empat kelompok tersebut maka uji statistik dilanjutkan dengan Uji Post Hoc untuk mengetahui antar kelompok mana perbedaan rata-rata skor jumlah kerusakan histologis sel epitel tubulus proksimal ginjal dan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Uji LSD. Hasil uji Post Hoc Multiple Comparisons (LSD) dapat dilihat lampiran 2, tabel 8. Ringkasannya adalah sebagai berikut: Tabel 2. Ringkasan hasil uji LSD (α = 0,05) Kelompok
p
Perbedaan
K – P1
0,000
Bermakna
K – P2
0,000
Bermakna
K – P3
0,003
Bermakna
P1 – P2
0,000
Bermakna
P1 – P3
0,000
Bermakna
P2 – P3
0,306
Tidak bermakna
39
Dari hasil perhitungan dengan menggunakan uji statistik LSD tampak adanya perbedaan yang signifikan pada semua pasangan antar kelompok kecuali pada kelompok P2 – P3, terdapat pebedaan yang tidak signifikan.
40
BAB V PEMBAHASAN
Gambaran sel epitel tubulus proksimal ginjal secara normal berbentuk kuboid selapis dengan batas sel yang tidak jelas, sitoplasma eosinofilik bergranula dan inti sel besar, bulat, berbentuk sferis di tengah sel. Puncakpuncak sel yang menghadap ke lumen tubulus mempunyai mikrovili cukup panjang yang disebut brush border (Gartner dan Hiatt, 2007). Sel epitel tubulus proksimal ginjal mencit yang dipapar parasetamol akan mengalami kerusakan yang digambarkan dengan terdapatnya inti sel yang piknotik, karioreksis dan kariolisis. Sedangkan pemberian parasetamol ditambah ekstrak biji kakao, derajat kerusakan sel epitel proksimal ginjal yang didapatkan akan lebih sedikit dibandingkan dengan pemberian parasetamol tanpa ekstrak biji kakao karena ekstrak biji kakao memiliki efek protektif pada ginjal terhadap efek toksik yang disebabkan parasetamol. Hal tersebut sesuai dengan penelitian sebelumnya bahwa kakao memiliki efek protektif terhadap induksi alkhohol pada tikus (McKim et al., 2002). Kelompok kontrol digunakan sebagai pembanding terhadap kelompok perlakuan dengan parasetamol dan kelompok perlakuan dengan parasetamol dan ekstrak biji kakao. Kelompok kontrol hanya diberikan aquades sebagai placebo, dengan harapan kerusakan sel epitel proksimal ginjal yang terjadi minimal dan dianggap sebagai derajat normal.
41
Dari uji One-Way ANOVA didapatkan perbedaan yang bermakna antara keempat kelompok perlakuan. Hasil uji LSD menunjukkan perbedaan bermakna pada kelompok K-P1, K-P2, K-P3, P1-P2, P1-P3, tetapi pada kelompok P2-P3 menunjukkan perbedaan yang tidak bermakna. Hasil uji LSD menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna dari skor rata-rata kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal antara kelompok K dan kelompok P1. Hal ini terjadi karena pemberian parasetamol dosis toksik pada kelompok P1 menyebabkan kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal. Hasil tersebut sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa parasetamol dosis toksik mampu menginduksi kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal akibat NAPQI yang reaktif dan toksik. NAPQI akan bereaksi dengan gugus nukleofilik pada protein, DNA, dan mitokondria, serta menimbulkan stres oksidatif sehingga dapat menyebabkan kematian sel (Rubin et al., 2005). Pada kelompok kontrol didapatkan pula gambaran sel epitel tubulus proksimal ginjal yang mengalami piknosis, karyoreksis dan karyolisis. Hal ini kemungkinan dikarenakan proses penuaan dan kematian sel secara fisiologis serta karena pengaruh variabel luar yang tidak dapat dikendalikan. Hasil analisis skor kerusakan sel antara kelompok P1-P2 didapatkan perbedaan yang bermakna. Hal ini berarti pemberian ekstrak biji kakao dengan dosis I yaitu 0,2 ml/ 20grBB mencit selama 14 hari berturut-turut dapat mengurangi jumlah sel epitel tubulus proksimal ginjal yang mengalami kerusakan akibat pemberian parasetamol. Toksisitas ginjal akibat pemberian parasetamol
dapat
dikurangi
dengan
pemberian
antioksidan.
Kakao
42
mengandung antioksidan dalam bentuk flavonoid. Flavonoid menangkap radikal bebas (free radical scavengers) dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya dan memutus reaksi berantai dari radikal bebas sehingga dapat mencegah terjadinya stres oksidatif
(Almatsier, 2004). Melalui
mekanisme antioksidan ini ekstrak biji kakao dapat mencegah kerusakan histologis sel epitel tubulus proksimal ginjal. Kelompok P2 merupakan kelompok perlakuan setelah pemberian ekstrak biji kakao dosis 0,2 ml/ 20grBB mencit dan parasetamol. Hasil analisis kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal pada kelompok P2 menunjukkan perbedaan bermakna dengan kelompok K dan kelompok P1. Hal ini berarti pemberian ekstrak biji kakao dengan dosis 0,2 ml/ 20grBB mencit dapat mengurangi kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal mencit akibat pemberian parasetamol, tetapi tidak dapat mengembalikan sel epitel tubulus proksimal ginjal pada kondisi seperti kelompok K. Hasil kelompok P3 menunjukkan perbedaan yang bermakna dengan kelompok P1 dan kelompok K. Hal ini berarti pemberian ekstrak biji kakao dengan dosis 0,4 ml/ 20grBB mencit sebelum pemberian parasetamol mampu mengurangi jumlah kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal yang diinduksi parasetamol, tetapi belum dapat mengembalikan sel epitel tubulus proksimal ginjal ke kondisi seperti kelompok K. Hal ini dapat disebabkan dosis II ekstrak biji kakao yang diberikan yaitu 0,4 ml/ 20gr BB mencit masih kurang optimal untuk melindungi sel ginjal dari kerusakan yang ditimbulkan oleh parasetamol.
43
Derajat kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal kelompok P2 lebih besar dari pada kelompok P3, namun hasil uji LSD menunjukkan perbedaan yang tidak bermakna. Hal ini berarti peningkatan dosis ekstrak biji kakao dapat meningkatkan efek proteksi terhadap kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal yang ditimbulkan oleh parasetamol, tetapi peningkatannya tidak signifikan. Pengaruh ekstrak biji kakao terhadap kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal yang diinduksi parasetamol dapat dianalogikan sebagai kurva hubungan antara dosis dan efek obat yang berbentuk sigmoid dengan suatu bagian tengah yang lurus atau linier. Dengan bertambahnya dosis obat, peningkatan respon berkurang, dan akhirnya dosis maksimal tercapai di mana responnya tidak bisa ditingkatkan lagi. Apabila dosis ekstrak biji kakao digambarkan dalam kurva hubungan antara dosis dan efek obat, maka efek dosis I dan dosis II berada pada bagian kurva yang hampir lurus atau linier sehingga peningkatan efeknya tidak terlalu signifikan (Bourne dan Roberts , 1998). Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa terbukti adanya efek proteksi ekstrak biji kakao terhadap sel epitel tubulus proksimal ginjal berupa pengurangan jumlah kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal mencit yang diinduksi parasetamol pada dosis I, yaitu 0,2 ml/ 20grBB, meskipun belum optimal karena hasilnya belum sebanding dengan kelompok kontrol. Sedangkan pada dosis yang lebih besar, dosis II, yaitu 0,4 ml/ 20grBB terbukti adanya peningkatan efek proteksi ekstrak biji kakao terhadap sel
44
ginjal, meskipun perbedaannya tidak signifikan dibandingkan dengan dosis I dan hasilnya cukup optimal karena hasilnya mendekati kelompok kontrol.
45
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan Pemberian ekstrak biji kakao dapat mengurangi kerusakan sel ginjal mencit (Mus musculus) yang diinduksi parasetamol.
B. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui zat aktif dalam ekstrak biji kakao yang paling berperan sebagai renoprotektor. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan metode lain misalnya, biomolekuler dengan marker Malondialdehid (MDA) atau glutathione.
