PENGARUH PEMBERIAN CpG-ODN TERHADAP SISTEM KEKEBALAN TUBUH IKAN KERAPU MACAN (Epinephelus fuscoguttatus FORSSKÅL, 1775)
The Influence of CpG-ODN on Immunity Responses of Tiger Grouper Fish (Epinephelus fuscoguttatus FORSSKAL, 1775)
Rhena Amalia Kani1, Alexander Rantetondok2, Asmi Citra Malina2
1) Universitas Hasanuddin Jurusan Perikanan, Makassar 2) Dosen Universitas Hasanuddin Jurusan Perikanan, Makassar
Alamat korespondensi:
Rhena Amalia Kani Fakultas Ilmu Kelautan Dan Perikanan Universitas Hasanuddin Makassar HP: 081355007910 Email:
[email protected]
Abstrak Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi kemampuan CpG ODN dalam meningkatkan respon imun ikan kerapu macan. Disamping itu juga untuk mengetahui sekuen spesifik dari CpG ODN yang cocok untuk ikan kerapu macan. Bahan imunostimulan yang digunakan pada penelitian ini adalah CpG ODN dengan dua sekuen yang berbeda Jenis CpG-ODN yang digunakan ada dua jenis yang diperoleh dari PT. Genetika Science Indonesia. CpGODN yang digunakan adalah CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTTCCTGATGCT) (Tassakka dan Sakai, 2003) dan CpG-ODN 2003 (TCGTCGTTGGTTGTCTTTTGGT) (Kreieg, 2000). Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh CpG-ODN dalam meningkatkan respon imun adalah rancangan acak lengkap dengan 6 perlakuan, tiga ulangan dan kontrol. Ikan kerapu macan kontrol diinjeksi dengan fosfat buffer saline (PBS). Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah indeks phagositosis, aktivitas lisosim dan respiratory burst. Penyuntikan dilakukan pada bagian intramuscular dengan menggunakan spoit 1 mL. Untuk pengamatan respiratory burst (asai letupan respirasi), asai lisozim (lysozyme), dan indeks pagositosis dilakukan dengan mengambilan sampel darah yang dilakukan pada hari ke-1, hari ke-3, hari ke-5 dan hari ke-7 setelah penyuntikan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa CpG 2003 mengandung motif spesifik bagi ikan kerapu macan. Hasil indeks pagositosis tertinggi ditunjukkan pada ikan yang diberikan CpG-ODN 1668 0,1 µg/ml pada hari pertama yaitu 76%. Hasil lisosim tertinggi ditunjukkan oleh ikan yang diberikan CpG-ODN dengan sekuen 2003 dengan dosis 10 µg/ml pada hari ketujuh yaitu sebesar 349 unit. Sedangkan hasil respiratory burst tertinggi di tunjukkan oleh ikan yang diberikan CpG-ODN 2003 dengan dosis 0,1 µg/ml pada hari ketujuh yaitu sebesar 9,8 nmol O2-.
Kata Kunci: Ikan Kerapu Macan, Imunostimulan, CpG-ODN
Abstract This study aims to evaluate the ability of CpG ODN in increase immune response of tiger grouper fish. And, to know the specific sequence of CpG ODN which suitable for Tiger grouper. The immunostimulant material used of this study was CpG ODN with two different sequence of CpG-ODN used there are two obtained of PT. Genetika Science Indonesia. CpG-ODN used was CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTT CCTGATGCT) (Tasakka and Sakai, 2003) and CPG-ODN 2003 (TCGTCGTTGGTTTCTTTTGGT) (Kreig, 2000). The design of experiment used to test the influence of CpG-ODN in increase immune response was full random design with 6 treatments, three repeat and control. The control is injected with fosfat buffer saline (PBS). The parameters observed of this study was phagosytosis index, lysozime activity and respiratory burst. The injection is done in intramuscular part by using 1 mL spoit. For observation of respiratory burst, lysozime, and phagosythosis index is done by taking blood sample with three times repeat for each group treatment and done at day before injection, days 1, 3, 5 dan 7 after injection.Results of this study indicate that CpG 2003 represent optimal sequence of tiger grouper fish. The highest phagosythosis index result is indicated of fish with CpG-ODN 1668 (0,1 µg/ml) at first day that is 76%. For highest lisozyme result is indicated for fish with CpG-ODN 2003 with dose (0,1 µg/ml) at first day, while the highest respiratory burst result is obtained for fish with CpG-ODN 2003 with 0,1 µg/ml.
Keyword : tiger grouper, immunostimulant, CpG-ODN 2003.
PENDAHULUAN Salah satu komoditi ikan laut yang potensial dan sudah dapat dibudidayakan adalah ikan Kerapu. Dari hasil penelitian ternyata komoditi Kerapu mempunyai nilai yang menguntungkan antara lain (a) Ikan Kerapu merupakan makanan yang enak dan gurih dan disukai banyak orang sehingga pemasaran ikan ini cukup baik, (b) Dari segi ekonomi, sangat menguntungkan karena harga ikan kerapu macan di pasaran cukup tinggi; dan (c) Pertumbuhan ikan kerapu cepat dan dapat di produksi massal untuk memenuhi permintaan pasar ikan kerapu dalam keadaan hidup dan lain-lain Pada awalnya para pembudidaya kerapu memperoleh bibit dari alam, namun sejak tahun 1993, ikan kerapu macan (Epinephelus fuscoguttatus) sudah dapat dibenihkan. Balai Budidaya Laut Lampung sebagai unit Pelaksana tekhnik pembenihan ikan kerapu macan, telah melakukan upaya untuk menghasilkan benih melalui pembenihan buatan manipulasi lingkungan dan penggunaan hormon (Dirjen Bina Pembenihan, 2011) Namun sebagaimana usaha budidaya lainnya, budidaya ikan Kerapu juga tidak luput dari serangan penyakit seperti penyakit yang disebabkan oleh bakteri, virus, parasit, dan lain-lain. Para pembudidaya harus mengeluarkan biaya ekstra yang cukup besar untuk membeli obatobatan kimia sebagai langkah mengatasi serangan penyakit. Untuk mengobati penyakit dari kultivan khususnya yang disebabkan oleh mikroorganisme, biasanya para pembudidaya menggunakan berbagai jenis antibiotik seperti ampisilin, neosin, gentamisin, penisilin G, dan lain-lain. Fakta belakangan terungkap bahwa antibiotik yang umum digunakan para pembudidaya ikan untuk menyembuhkan penyakit bakterial ternyata menimbulkan strain baru bakteri yang resisten, sehingga tidak efektif dalam penanggulangan penyakit (Rantetondok, 2002). Penggunaan imunostimulan bisa dijadikan alternatif sebagai upaya perlindungan terhadap serangan penyakit, karena dapat meningkatkan sistem kekebalan natural dan adaptif pada ikan. Salah satu jenis imunostimulan yang sangat potensial dan efektif meningkatkan kekebalan tubuh mamalia, ikan, dan udang adalah sekuens nukleotida spesifik yang disebut motif unmethylated cytosin phosphate guanin (CpG) (Tassakka, 2004). Setelah penemuan imunostimulan DNA bakteri yang mengandung CpG (Tokunaga et al., 1984; Yamamoto et al., 1994), selanjutnya ditemukan imunostimulan DNA sintetik yang sekuennya menyerupai CpG DNA bakteri yang disebut CpG oligodeoxynucleotides atau CpG-ODN.
CpG-ODN ini berfungsi sebagai agen
pertahanan terhadap penyakit pada vertebrata (Kreig, 2002).
Pada ikan, selain terjadi
peningkatan respon imun, penelitian menunjukkan bahwa pemberian CpG-ODN pada ikan Atlantik salmon (Salmo salar) juga dapat meningkatkan resistensi terhadap penyakit seperti amoebic gill disease (Bridle et al., 2003).
Jørgensen et al. (2003) memperlihatkan adanya
peningkatan ketahanan tubuh ikan Atlantic salmon terhadap infeksi pancreatic necrosis virus setelah diberi CpG-ODN.
CpG-ODN juga dapat berfungsi sebagai adjuvan pada goldfish
(Kanellos et al., 1999). Meskipun demikian, penelitian mengenai peranan CpG-ODN pada sistem pertahanan tubuh ikan maupun hewan akuatik lainnya masih sangat sedikit dibandingkan pada mamalia. Oleh karena itu, penelitian mengenai pengaruh CpG-ODN pada ikan ekonomis penting seperti pada ikan kerapu macan sangat penting untuk mencegah perluasan penyakit, sekaligus memberikan informasi baru mengenai efek CpG-ODN pada ikan yang nantinya dapat memberi kontribusi bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi di bidang vaksin DNA. METODE PENELITIAN Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Politani Pangkep. Untuk pengujian respon imun dilakukan di Laboratorium Parasit dan Penyakit Ikan Fak. Ilmu Kelautan dan Perikanan Jurusan Perikanan Universitas Hasanuddin dan Laboratorium Penyakit Politani Pangkep Alat dan Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ikan kerapu macan yang berukuran 8 sampai 10cm dengan berat berkisar antara 7 sampai 10gr yang berasal dari Balai Besar Riset Perikanan Budidaya Laut Bali, Aquades, Air Laut, Bakteri Staphyloccocus sp, Larutan Metanol, Larutan Pbs, Imunostimulan berupa CpG ODN. Bahan imunostimulan yang digunakan pada penelitian ini adalah CpG ODN dengan dua sekuen spesifik yang berbeda yang diperoleh dari PT Genetika Science Indonesia. CpG oligodeoxynucleotides (CpG-ODN) yang digunakan adalah CpG-ODN 1668 (TCCATGACGTTCCTGATGCT) (Tassakka dan Sakai, 2004) dan CpG-ODN 2003 (TCGTCGTTGGTTGTCTTTTGGT) (Krieg, 2000) dan bahan-bahan lainnya. Prosedur Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh CpG-ODN dalam meningkatkan respon imun adalah rancangan acak lengkap dengan 6 perlakuan, tiga ulangan dan kontrol. Kontrol yang digunakan dalam penelitian ini adalah kontrol positif dengan larutan Phospat Buffer Solution (PBS). Parameter imun yang diuji adalah Indeks pagositosis
Teknik Analisis Data Pengambilan data Indeks Pagositosis, aktivitas lisosim dan Respiratory burst dilakukan pada hari ke-1, hari ke-3, hari ke-5 dan hari ke-7 setelah penyuntikan. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Indeks Pagositosis Dari hasil penghitungan Indeks Pagositosis pada ikan kerapu macan yang disuntikkan CpG 1668 dan CpG 2003, datanya dapat dilihat pada Tabel 2 berikut: Tabel 3. Rata-rata Persentasi Indeks Pagositosis dari Ikan Kerapu Macan Perlakuan
Rata-rata ±SD H1
H3
H5
H7
CpG 1668 (0,1µg/ml)
76d±3
45,1b±15
91,5d±2,5
76,5d±4
CpG 1668 (1µg/ml)
35c±6
29b±9,1
88,5d±3,5
98e±1
CpG 1668 (10µg/ml
3a±0
10a±3
89d±3
89e±1,1
CpG 2003 (0,1µg/ml)
11b±1
77,5c±3,5
72,5c±4
57c±6
CpG 2003 (1µg/ml)
5,5a±0,5
26ab±5
54b±5
87,3d±3,5
CpG 2003 (10µg/ml
4,8a±1
73c±1
19a±3
39,8b±9,3
Kontrol
10a±2
10a±2
10a±2
10a±2
Ket: Huruf yang sama dibelakang angka dalam satu kolom menyatakan tidak berbeda nyata (P>0,05) Hasil analisis ragam dari indeks pagositosis ikan kerapu macan menunjukkan bahwa CpG-ODN yang diberikan memberikan pengaruh nyata (P<0,05) (Lampiran 1). Dan setelah di uji lanjut dengan Uji Tukey diperoleh hasil bahwa pada H1, antara Kontrol, CpG 2003 (10µg/ml), CpG 2003 (1µg/ml) dan CpG 1668 (10µg/ml) tidak berbeda nyata namun pada perlakuan yang lain yaitu CpG 2003 (0,1µg/ml), CpG 1668 (0,1µg/ml) dan CpG 1668 (1µg/ml) menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05). Pada H3, antara Kontrol dengan CpG 2003 (1µg/ml) dan CpG 1668 (10µg/ml) tidak berbeda nyata namun antara CpG 1668 (0,1 µg/ml), CpG 1668 (1 µg/ml), CpG 2003 (0,1 µg/ml) dan CpG 2003 (10 µg/ml) menunjukkan perbedaan yang nyata. Pada H5, antara Kontrol, dengan CpG 2003 (10 µg/ml) tidak menunjukkan perbedaan yang nayata, namun antara CpG 1668 (0,1 µg/ml), CpG 1668 (1 µg/ml), CpG 1668 (10 µg/ml), CpG 2003 (0,1 µg/ml)
dan CpG 2003 (1 µg/ml) mennjukkan perbedaan yang nyata. Pada H7 antara kontrol dengan perlakuan yang lain menunjukkan perbedaan yang nyata. Secara umum, dari keempat kali pengambilan sampel untuk penghitungan indeks pagositosis, CpG 1668 menunjukkan persentasi tertinggi ditiga kali waktu pengambilan sampel yaitu pada hari ke 1, hari ke 5 dan hari ke 7. CpG-ODN 1668 dikenal mampu meningkatkan respon imun pada ikan. Indikasi meningkatnya respon imun salah satunya ditandai dengan tingginya indeks pagositosis. Aktivitas fagositosis adalah suatu kemampuan dari sel respon imun nonspesifik untuk memfagosit agen penyakit yang masuk ke dalam tubuh. Sel yang berfungsi menelan dan mencerna partikel atau substansi cairan disebut sel fagositik, terdiri dari sel fagosit mononuklear dan fagosit polimorfonuklear. Fagosit (phagocyte) adalah golongan dari sel darah putih yang berperan dalam sistem kekebalan dengan cara fagositosis/menelan patogen. Fagosit berarti “sel” yang dapat memakan atau menelan material padat. Menurut Jhonny, dkk (2005), peningkatan aktivitas pagositik ini dapat ditingkatkan antara lain dengan imunostimulan. Dari percobaan ini, terlihat indeks pagositosis dari ikan kerapu mengalami peningkatan setelah diberikan imunostimulan berupa CpG-ODN. Proses Fagositosis bakteri Staphilococcus sp dapat dilihat pada Gambar 4 berikut ini
Bakteri Staphilococcus sp
Sel darah
Gambar 4. Proses Fagositosis Sel pada Ikan Kerapu Macan (Pembesaran 400x)
PENUTUP A. Kesimpulan 1. Imunostimulan berupa CpG ODN dengan sekuens 2003 mampu memacu peningkatan kekebalan nonspesifik pada benih ikan kerapu
macan yang ditandai dengan
meningkatnya Indeks Pagositas 2. Diantara kedua sekuens CpG yang di berikan pada ikan kerapu macan yaitu CpG 1668 dan CpG 2003, terlihat bahwa CpG 2003 mengandung motif spesifik bagi ikan kerapu macan. B. Saran Diharapkan ada penelitian-penelitian lanjutan yang dilakukan untuk menemukan ekspresi gen sehingga dapat digunakan sebagai adjuvant untuk vaksin bagi ikan kerapu macan.
Daftar pustaka Direktorat Bina Pembenihan, Direktorat Jendral Perikanan, Departemen Pertanian, 1996, Pembenihan Ikan Kerapu Macan (Epinephelus fuscoguttatus). Jakarta Johnny, F., D.Roza., K Mahardika., Zafran, dan A Prijono. 2005. Penggunaan Imunostimulan Untuk meningkatkan Kekebalan Non-Spesifik Benih Ikan Kerapu Lumpur, Ephinephelus coioides Terhadap Infeksi Virus Irido. Jurnal Penelitian Perikanan Indonesia Volume 11 Nomor 5 Tahun 2005 Jørgensen, J.B., Johansen, L-H., Steiro, K., Johensen, A., 2003. CpG DNA Includes Protective Antiviral Immune Responses in Athlantic Salmon (Salmo salar L.). J.Virol Kanellos, T.S., Sylvester, I.D., Butler, V.L., Ambali, A.G., Partidos, C.D., Hamblin, A.S., Russel, P.H., 1999. Mammalian granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and some CpG motifs have an effect on the immunogenicity of DNA and subunit vaccines in fish. Immunology 96, 507-510 Krieg, A.M., 2000. The Role of CpG Motifes in Innate Immunity. Curr. Opin. Immunol, 12. 34-43 Krieg, A.M., 2002. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Immunol. 20, 709-760
Annu. Rev.
Rantetondok. A, 2002, Pengaruh Imunostimulan Β-Glukan Dan Lipopolisakarida Terhadap Respon Imun Dan Sintasan Udang Windu (Peneus monodon FABRICIUS), Program Pasca Sarjana Universitas Hasanuddin, Makassar
Tassakka, A.C.M.A.R., Sakai., 2004. Expression of Immune-related genes in The Common carp (Cyprinus carpio L) After Stimulation by CpG oligodeoxynucleotides. Aquaculture Tokunaga, T., Yamamoto, H., Shimada, S., Abe, H., Fukuda, T., Fujisawa, Y., Furutani, Y., Yano, O., Kataoka, T., Sudo, T., 1984. Antitumor activity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis BCG: Isolation, Physicochemical characterization, and antitumor activity. J. Natl. Cancer Inst. 72, 955-962 Usman. 2011. Budidaya Ikan Pada Keramba Jaring Apung. Balai Riset Perikanan Budidaya Air Payau. Maros
