PENENTUAN TIAMIN, RIBOFLAVIN, DENGAN HPLC SECARA SERENTAK
DAN PIRIDOKSIN
DALAM BERAS
Nur Hidayati*
ABSTRAK PENENTUAN TIAMIN, RIBOFLAVIN, DAN PIRIDOKSIN DALAM BERAS DENGAN I1PLC SECARA SERENTAK. Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan metorle analisis tiamin, riboflavin, dan piridoksin secara serentak agar Icbih sederhana, mudah, dan cepal dengan HPLC. Kolom yang digunakan adalah p-Bondapak CI8, detektor ultra violet pada panjang gelombang 254 nm, dengan eluen campuran metanoi/larutan bufer asetat pad a pH 3,6 (15 + 85) dengan penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat. Kondisi HPLC yang digunakan adalah kecepatan aliran 1,5 ml/menit, kecepatan kertas 0,5 cm/menit, dan kepekaan 0,05, dapal memberikan hasil pemisahan puncak-puncak piridoksin, tiamin, dan riboflavin dengan baik. Analisis secara kuantitatif dari piridoksin, tiamin, dan riboflavin memerlukan waktu tidak lebih dari 20 men it. Hasil recovery dari piridoksin, tiamin, dan riboflavin masing-masing adalah 92%,82%, dan 56%.
ABSTRACT SIMULTANEOUS DETERMINATION OF THIAMINE, RIBOFLAVIN ANI> I)YRII>OXINE IN RICE UY IIIGHI)ERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY. This study was done to develope a simple, easy and rapid method of analysis for simultaneous determination of thiamine, riboflavin and pyridoxine in rice using HPLC. The column used was p-Bondapak C 18 and detection was done using a ultra violet detedor at 254 nm. The mobile phase was a mixture of methanol-acetate buffer (15 + 85) pH 3,6 with the addition of 0,005 M I-heptane sulphonic acid sodium salt. The most satisfadory separation of pyridoxine, thiamine and riboflavin peaks was obtained at flow rate 1.5 ml/min, chart speed 0.5 cm/min, and sensitivity 0,05. Quantitative analysis of the three vitamins could be done in less than 20 minutes. Recoveries of pyridoxine, thiamine, and riboflavin were 92%, 82 %, and 56%, respectively.
PENDAHULUAN Vitamin
8 merupakan
suatu
molekul
organik
yang
tidak termasuk
dalam
golongan protein, karhohidrat atau lemak. Vitamin 8 terdapat dalam jumlah yang kedl dalam hahan makanan, namun sangat penting peranannya hagi heberapa fungsi tertentu dalam tubuh, yaitu untuk proses metabolisme dan pertumbuhan yang normal (I). Vitamin tersebut tidak dapat dibuat oleh tubuh dalam jumlah yang cukup. Oleh karena itu, harus diperoleh dari bahan pang an yang dikonsumsi misalnya beras. Kamlungan vitamin 81 atau tiamin dalam beras giling sekitar 0,12 mg/1 00 g sam pel dan dalam beras merah sekitar 0,21 mg/ 100 g sampel (2), at au antara 100
*
Pusat Aplikasi IsotoI' Jan Radiasi, ~ATAN
III
dan 1000 JLg/IOO g sampel, riboflavin
antara 10 dan 100
JLg/lOO
g sampel, dan
pirido~~in untrrrrr 1000 dnn 10.000 ~2f100 2 ~JmD~10). Peneliti terdahulu telah mempelajari pengawetan beras dengan iradiasi gamma (4). Dalam rangka pengawetan beras dengan iradiasi gamma perlu diketahui pengaruh iradiasi terhadap vitamin .B yang dikandungnya di antaranya vitamin B I atau tiamin, vitamin B2 atau ribotlavin dan vitamin B6 atau piridoksin. Untuk menentukan kandungan tiamin, riboflavin, dan piridoksin dalam beras perlu dikembangkan metode yang sederhana, mudah dan cepat, serta dapat ditentukan secara serentak. SOEYONO (5) telah mengembangkan metode pengukuran riboflavin dengan cara spektrofluorometri pada panjang gelombang eksitasi 440 nm dan panjang gelombang emisi 565 nm, SOEYONO dan PAMUNTJAK (6) telah mengembangkan pula pengukuran tiamin dengan cara spektrofluorometri pada panjang gelombang eksitasi 365 nm dan panjang gelombang emisi 435 nm. Pengukuran secara spektrofluorometri tidak dapat dilakukan secara serentak bila dalam larutan terdapat campuran tiamin, riboflavin dan piridoksin. Salah satu metode yang dapat digunakan ialah dengan cara kromatograti cair atau High Performance Liquid Chromatography (HPLC). AUGUSTIN (7) telah mengembangkan metode pengukuran dengan cara HPLC untuk tiamin dan ribotlavin. Detektor yang digunakan adalah tluoresensi dengan panjang gelombang eksitasi 360 nm dan panjang gelombang emisi 415 nm, sedangkan WEHLING dan DAVID (8) melakukan pengukuran tiamin, riboflavin dan piridoksin secara HPLC dengan detektor fluoresensi dengan panjang gelombang eksitasi 288 nm dan panjang gelombang emisi 444 nm. KAMMAN dkk. (9) telah mengembangkan metode pengukuran tiamin dan riboflavin dengan metode yang sederhana, mudah, dan cepat, yaitu dengan HPLC, dengan detektor ultra violet yang bekerja pada panjang gelombang 254 nm. FUKLUEN LAM dkk. (10) telah dapat menentukan asam askorbat, niasinamide, tiamin, riboflavin, dan piridoksin dengan HPLC, dan detektor ultra violet (uv). Untuk analisis asam askorbat ditentukan pada panjang gelombang 254 nm, sedangkan untuk analisis vitamin yang lainnya ditentukan pada panjang gelombang 280 nm. Penentuan vitamin B6 atau piridoksin telah pula dikembangkan oleh VANDERSLICE dkk. (II) dengan cara HPLC dengan detek-tor tluoresensi. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode pengukuran tiamin, riboflavin dan piridoksin dalam beras dengan cara HPLC dengan menggunakan detektor uv pada panjang gelombang 254 nm dan dengan kolomn jL-Bondapak C 18. BAlIAN DAN METODE
Bahan. Vitamin yang digunakan sebagai standar adalah tiaminhidroklorida (BDH), ribotlavin dan piridoksin (E. MERCK). Bahan kimia lain yang digunakan
112
ialah trietilamin (Ajax Chemical), garam natrium I-heptan asam sulfonat (BOH), metanol untuk HPLC, asam asetat, natrium asetat, dan asam trikloroasetat (E. MERCK). Sampel beras yang digunakan ialah beras giling cianjur rojolele dan beras merah .
Peralatan. Pada penelitian ini digunakan alat HPLC buatan Waters Associates model 441 Absorbance detektor. Kolom yang digunakan adalah wBondapak C18 (4mm x 30 em). Eluen. Pada penelitian ini digunakan eluen dengan berbagai perbandingan eampuran antara metanol dan larutan bufer asetat pH 3,6 yaitu 20%, 15%, dan 10% dengan dan tanpa penambahan garam natrium I-heptan asam sulfonat. Pembuatan Larutan Rufer Asetat. Ke dalam labu takar 1 titer yang telah berisi aquabidest dimasukkan berturut-turut sebanyak 24 ml asam asetat p.a. dan 5,0 ml trietilamin, lalu ditepatkan menjadi 1 liter dengan aquabidest. Penepatan pH 3,6 diatur dengan menambahkan asam asetat atau trietilamin. Penyiapan Standar dan Kurva Kalibrasi Vitamin. Standar tiamin, riboflavin, dan piridoksin dengan konsentrasi yang paling tinggi masing-masing 10 ppm, 10 ppm, dan 25 ppm dan konsentrasi yang terendah ialah 1 ppm, 1 ppm dan, 2,5 ppm dilarutkan dalam HCI 0, I N. Oari data yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi standar seperti tertera dalam Gambar 4. Sumbu X ialah konsentrasi standar vitamin dalam ppm, dan sumbu Y ialah tinggi puneak dalam em. Penentuan Recovery Standar Vitamin. Ke dalam larutan sampel beras ditambahkan standar vitamin dengan konsentrasi tertentu, dan dibandingkan dengan larutan sampel beras tanpa penambahan standar vitamin. Berdasarkan perbedaan konsentrasi yang diperoleh dari hasil analisis HPLC standar vitamin tersebut, dapat ditentukan harga recovery masing-masing standar vitamin. Penyiapan Sampel. Beras giling eianjur rojolele dan beras merah masingmasing ditumbuk dengan mortar porselen hingga halus. Kemudian ditimbang masing-masing 10 gram, ditambah 10 ml HCI 0,1 N dan dibiarkan semalam pada suhu 35°C. Bubur tepung beras tersebut ditambah natrium asetat 2,5 M sebanyak 5 ml, selanjutnya diinkubasi pada suhu 42°C, selama 2 jam. Kemudian ditambah 2 ml TCA 50% dan diinkubasi pada 42°C selama 2 jam. Bubur tepung beras tersebut disentrifus dan diambil filtratnya, lalu disaring dan diinjeksikan pada HPLC. Analisis dengan HPLC. Kondisi HPLC yang digunakan adalah laju aliran 1,5 ml/menit, kecepatan kertas 5 cm/l0 menit dan kepekaan 0,05. Untuk analisis secara kuantitatif dibuat kurva kalibrasi larutan standar dengan plot tinggi puncak (em) terhadap konsentrasi (ppm).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pellgaruh Eluen Terhadap Hasil Pemisahan. Pada penelitian ini digllnakan herhagai perbandingan
campllran eluen antara metanol/asetonitril
dengan larlltan
113
bufer asetat pH 3,6 tanpa penambahan garam natrium I-heptan asam sulfonat. Dari hasil kromatogram yang diperoleh ternyata puncak-puncak tiamin, riboflavin dan piridoksin tidak terpisah. Hal ini mungkin disebabkan ketiga vitamin tersebut mempunyai sifat kimia seperti kestabilan, kepolaran, dan keasaman yang karakteristik. Untuk mendapatkan pemisahan puncak tiamin, riboflavin, dan piridoksin yang baik, perlu diperhatikan pemilihan eluen dengan pH yang sesuai. Banyak sekali pelarut yang dapat digunakan sebagai fase mobil, dengan syarat utama yang harus diperhatikan, yaitu komponen-komponen dalam sampel harus dapat larut dengan baik dalam fase mobil tersebut. Pada waktu pemilihan pelarut yang akan dipakai sebagai fase mobil perlu diperhatikan kepolarannya. Pada perbandingan eluen eampuran metanol dan larutan bufer asetat (pH 3,6) 20% dengan penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat, terjadi pemisahan puncak-puncak tiamin, riboflavin, dan piridoksin, namun kurang baik karena puneak-puncak ketiga vitamin tersebut jaraknya berdekatan, atau waktu yang dilalui sejak sampel diinjeksikan sampai tereatatnya respons maksimum (tR) ketiga vitamin tersebut berdekatan (Gambar I). Pada perbandingan eluen 10%, terjadi pemisahan yang eukup baik, namun tR ketiga vitamin tersebut eukup jauh, sehingga memerlukan waktu yang lama dan kurang efisien (Gambar 2). Pada perbandingan eluen 15%, terjadi pemisahan yang cukup baik dengan waktu retensi (tR) tiamin, riboflavin dan piridoksin masing-masing 4,8; 9,6; dan 19,0 menit (Gambar 3). Kurva Kalibrasi Standar Vitamin. Pada penelitian ini diperoleh persamaan linier untuk piridoksin, tiamin, dan riboflavin berturut-turut sebagai berikut Y = 0,1294 X, Y = 0,5608 X, dan Y = 0,3700 X (Y ialah tinggi puneak standar vitamin dalam em, dan X ialah konsentrasi standar vitamin dalam ppm). Kurva kalibrasi piridoksin, tiamin, dan riboflavin dapat dilihat pada Gambar 4. Kandungan Tiamin, Riboflavin, dan Piridoksin dalam Beras. Hasil kromatogram dari sam pel beras dapat dilihat pada Gambar 5 & 6. Kandungan ketiga vitamin dalam sampel beras yang diperoleh pada pereobaan ini dapat dilihat pada Tabel I. Nilai yang diperoleh masuk dalam kisaran nilai yang tertera dalam Handbook of Vitamins and Hormones (3) dan hampir sam a dengan hasil analisis yang diperoleh oleh SOEYONO dkk (5,6). Hasil recovery yang diperoleh pada analisis ini ialah tiamin dan piridoksin masuk dalam kisaran nilai 80 dan 100 %, sedangkan riboflavin hanya 56%. Kandungan riboflavin dalam sampel beras giling cianjur rojolele tidak terdeteksi (Gambar 6). Kelebihan analisis dengan cara ini ialah ketiga vitamin tersebut dapat diukur seeara serentak, sehingga lebih mudah dan eepat. KESIMPULAN Penentuan piridoksin, tiamin, dan riboflavin dalam beras dapat dilakukan secara serentak dengan eara HPLC menggunakan kolom I1-Bondapak C 18, detektor ultra violet pada panjang gelombang 254 nm, dan eluen yang digunakan adalah
114
campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (15 + 85) dengan menambahkan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat. Pada kondisi tersebut piridoksin, tiamin, dan ribotlavin terpisah baik dengan waktu retensi (tR) berturut-turut 4,8 menit, 9,5 menit, dan 19,0 menit.
UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada Ibu Surtipanti yang telah membantu penulisan ini, dan kepada semua pihak yang telah membantu, sehingga percobaan ini terlaksana dengan baik.
PUSTAKA 1. WINARNO, EG., Kimia Pang an dan Gizi, Gramedia, Jakarta (1984). 2. SOEDARMO, P., dan SEDlAOETOMO, nya, Dian Rakyat, Jakarta (1974).
A.D., Masalah Gizi dan Perbaikan-
3. ROMAN J. KUTSKY, Handbook of Vitamins and HORMONES, Van Nostrand. Reinhold Company, New York, Cincinnati, Toronto, London, Melbourne (1973). 4. ANONIM, "Penelitian Pengawetan Beras dengan Radiasi Sinar Gamma", (Laporan Akhir Kerjasama BULOG-BATAN), P2PsD/39/1970. 5. SOEYONO, "Pengaruh Radiasi Sinar Gamma Co-60 terhadap Riboflavin dalam Beras", P2PsD/54/1971. 6. SOEYONO dan PAMUNTJAK, Beras" P2PsD/33/1970.
M., "Pengaruh Radiasi (Co-60) pada thiamin
7. AUGUSTIN, 1., Simultaneous determination of thiamine and ribotlavin in foods by liquid chromatography, J. AOAC, 67 (1984) 1012. 8. WEHLING
RANDY, L. and WETZEL DAVID, L., Simultaneous
determina-
tion of pyridoxine,riboflavin and thiamine in fortitied cereal J1 products high(1984) by1326. performance liquid chromatography, J. Agric. Food Chern., 9. KAMMAN, J.E, LABUZA, T.P. and WARTHESEN, Thiamine and riboflavin analysis by high performance liquid chromatography, J. Food Science, 45 (1980) 1497. 10. FUK-LUEN LAM, IRA J. HOLCOMB, and FUSARI A. SALVATORE, Liquid chromatographic assay of ascorbic acid, niacinamide, pyridoxine, thiamine, and ribotlavin in multivitamin-mineral preparation, J. AOAC, 67 (1984) 1007.
115
II.
VANDERSLICE,
J.T.,
BROWNLEE
MARIANN, Liquid9997. chromatographic AOAC, 67 (I 984)
Tabel
R. STELLA, determination
and CORTISSOZ
of vitamin
1. Kandungan vitamin B1, B2, dan B6 dalam giling cianjur rojolele dan beras merah
Kandungan
vitamin,
B6 in foods,
sampel
ug/100 9 sampel
Sampel Bl
B2
Beras giling cianjur rojolele
221,83
tt
2284,79
Beras merah
406,65
164,09
7568,38
Basil rata-rata dari 3 ulangan tt = tidak terdeteksi.
1 ]6
percobaan.
B6
E. J.
beras
~
U 0.. cO c:: c:: ='
n
2
F= 050
I'
I ':1
Waktu retensi
Gambar
10
Hasil kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluen campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (20 + 80) dengan penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat (1) piridoksin,
(2) tiamin, dan (3) ribotlavin
117
00
"
,I
I
,I
/:3
::::
I
I~
..>C
'" ~ = =
c.
/.
~ ~ =
I
E=
,
.
! i
~4r
~
:
f
I I J
'
_
~
--------
Waktu retensi
Gambar
2.
HasH kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluen campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (10 + 90) dengan penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat (I) piridoksin,
(2) tiamin,
dan (3) ribot1avin
2
--------A~-
----------
Waktu retensi
Gambar 3.
Hasil kromatogram piridoksin, tiamin, dan ribotlavin dengan eluen campuran metanol/larutan bufer asetat pH 3,6 (15 + 85) dengan penambahan 0,005 M garam natrium I-heptan asam sulfonat (1) piridoksin,
(2) tiamin, dan (3) ribotlavin
oN
a. u
c::E U c:: :::s OJ) E=, '---' .~ :'<:S
5,0 6,0 7,0 4,0 3,0
..10::
,.......
1,02,0 0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
Konsentrasi (ppm) Gambar 4. Kurva kalibrasi standar tiamin, ribotlavin, piridoksin (A)
piridoksin,
(D)
tiamin, dan
(A:)
ribotlavin
Waktu retensi
Gambar 5. HasH kromatogram sampel beras merah (1) piridoksin,
(2) tiamin, dan (3) ribotlavin
121
--
\,~ j (J, '-
\.'---
"------------
__0' __
Waktu retensi
Gamhar 6. Hasil kromatogram sampel beras giling Cianjur Rojolele (I) piridoksin,
122
(2) tiamin, dan (3) ribotlavin
