PENEKANAN EKSPRESI ENZIM COX-2 PADA KULTUR SEL RAJI OLEH EKSTRAK KLOROFORM DAUN CANGKRING (Erythrina fusca Lour.) Zullies Ikawati, Agung Endro Nugroho, Widyah Astutiningsih Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada
ABSTRAK Prostaglandin, salah satu mediator yang bertanggung jawab terhadap proses inflamasi dan perkembangan kanker, disintesis dari asam arakidonat dengan katalisasi enzim siklooksigenase (COX). Enzim COX terdiri dari 2 isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. Enzim COX-2 diketahui meningkat ekspresinya pada inflamasi dan kanker. Daun cangkring (E. fusca) telah dilaporkan memiliki efek antiinflamasi dan antiproliferatif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan ekstrak kloroform daun E. fusca dalam menekan ekspresi enzim COX-2 pada kultur sel Raji. Penelitian diawali dengan uji sitotoksik ekstrak kloroform daun E. fusca dengan kadar masingmasing: 2, 4, 8, 16, 32, dan 64 µg/ml, untuk menentukan harga LC50 yang akan digunakan uji penekanan ekspresi enzim COX-2. Selanjutnya dilakukan uji penekanan ekspresi enzim COX-2 dengan metode immunositokimia. Kemampuan penekanan dinyatakan dalam % dibandingkan dengan kontrol. Hasil uji sitotoksik menunjukkan bahwa harga LC50 adalah sebesar 4,05 µg/ml. Hasil uji penekanan ekspresi enzim COX-2 menunjukkan bahwa kenaikan kadar ekstrak uji berbanding lurus dengan peningkatan kemampuan ekstrak dalam menekan ekspresi enzim COX-2. Penekanan ekspresi enzim COX2 pada kadar ekstrak uji 2, 4, dan 8 µg/ml berturut-turut adalah sebesar (dalam %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ± 1,47; dan 73,35 ± 1,06. Kata kunci: E. fusca, enzim COX-2, kultur sel Raji, imunositokimia
ABSTRACT Prostaglandin, one of the mediators responsible for inflammation process and development of cancer, is synthesized from arachidonic acid with catalization of cyclooxygenase (COX). COX exists in 2 isoforms, i.e. COX-1 and COX-2. COX-2 is highly expressed in inflammation process and cancer development. The leaves of E. fusca has been reported to have antiinflammation and antiproliferation activities. The research aims to study whether the chloroform extract of E. fusca Lour leaves could suppress the expression of COX-2 enzyme that is exposed in Raji cell line. The expression of COX-2 was observed using immunocytochemistry method. The concentration of extract used was determined from LC50 in cytotoxicity study. The LC50 of the extract was 4,05 µg/ml. Results shows that the extract with the concentration of 2, 4, and 8 µg/ml were able to suppress the expression of COX-2 in Raji cell line, with the suppression activity of (in %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ± 1,47; and 73,35 ± 1,06, respectively. Key words : E. fusca leaves, COX-2 expression, Raji cell line, immunocytochemistry.
PENDAHULUAN Tanaman E. fusca (cangkring) telah dilaporkan memiliki aktivitas antiinflamasi pada model kaki tikus terinduksi karagenin (Nurliani, 2003; Ikawati, et al, 20061) dan antiproliferatif pada kultur sel kanker HeLa (Puspitasari, 2004). Tanaman ini juga terbukti mengandung terpenoid, fenol, dan flavonoid dalam ekstrak kloroform daun cangkring (Wahyuningsih, 2004), dimana flavonoid dan terpenoid berperan dalam regulasi enzim siklooksigenase (COX) (Perera et al., 2001). Enzim siklooksigenase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan prostaglandin, suatu mediator inflamasi, produk metabolisme asam arakidonat. Enzim COX terdiri dari 2 isoenzim yaitu: COX-1 dan COX-2. Enzim COX-1 bersifat konstitutif untuk memelihara fisiologi normal dan homeostasis, sedangkan COX-2 merupakan enzim yang terinduksi pada sel yang mengalami inflamasi (Leahy et al., 2000). COX-2 juga berperan dalam proliferasi sel kanker. Overekspresi COX-2 ditemukan pada kebanyakan tumor (Simmons and Moore, 2000). Mengingat besarnya peran COX-2 dalam proses inflamasi dan kanker, maka perlu dilakukan pencarian agen yang dapat mempengaruhi regulasi enzim COX-2, misalnya melalui penekanan ekspresi enzim COX-2. Tanaman E. fusca merupakan salah satu tanaman yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen penghambat COX-2 dengan aktivitasnya sebagai antiinflamasi dan antiproliferasi sel kanker. Ekstrak etanolnya telah dilaporkan dapat menekan ekspresi enzim COX-2 (Ikawati, et al., 20062). Untuk itu, perlu diteliti apakah ekstrak kloroform daun E. fusca Lour juga dapat mempengaruhi regulasi COX-2 melalui mekanisme penekanan ekspresi COX-2. Kultur sel Raji dipilih sebagai media karena memiliki ekspresi COX-2 yang tinggi. Sel Raji merupakan ‘continous cell line’ yang diturunkan dari sel ß-Limfoma manusia (Anonim, 2001). Penelitian oleh Wun melaporkan bahwa sel Raji terbukti mengekspresikan COX-2 dalam jumlah yang cukup besar yaitu 2,2 - 4,3 kali lebih besar daripada sel B normal (Wun, dkk., 2004).
METODOLOGI 1. Bahan Daun E. fusca Lour, kloroform (Brataco), RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 (Sigma), Hepes (Sigma), Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisilin-streptomisin 1% (v/v) (Gibco), fungison 0,5% (v/v) (Gibco), kultur sel Raji, DMSO 100%, COX-2mouse monoclonal antibody (Novo Castra), biotinylated Goat Anti-Polyvalent (Lab Vision), Streptavidin-Peroxidase (Lab Vision), DAB (3,3’ Diaminobenzinidine) (Lab Vision). 2. Alat Alat-alat gelas, mikroskop cahaya, tissue culture flask (Nunclon), tabung conical (Nunclon), plate 96 wheel (Nunclon), coverslip, poly-l-lysine slide, plate 24 (Nunclon). 3. Jalannya Penelitian Pembuatan ekstrak kloroform daun E fusca Lour Ekstraksi dilakukan dengan maserasi serbuk daun E. fusca 500 gram menggunakan kloroform. Serbuk direndam sempurna dengan penyari berada 2 cm di atas serbuk sebanyak 3 x sampai sisa ampas jernih, masing-masing maserasi dilakukan selama 2 x 24 jam sambil sesekali digojog. Sari yang diperoleh kemudian dihilangkan dari penyarinya dengan menggunakan evaporator. Sari yang diperoleh disebut sari kloroform. Sari kloroform diuapkan hingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 42,04 gram. Uji sitotoksik dengan metode penghiungan langsung Ke dalam 100,0 µl suspensi sel pada setiap sumuran yang berbeda (kepadatan sel 2 x 104 sel /sumuran) masing-masing ditambahkan 100,0 µl sampel dalam media kultur RPMI 1640 hingga dicapai seri kadar akhir dalam sumuran yaitu 64; 32; 16; 8; 4; dan 2µg/ ml. Pada kontrol media, 100,0 µl senyawa uji diganti dengan 100,0 µl media kultur, sedang pada kontrol pelarut, diganti dengan 5,0 µl
DMSO 0,25 % dan 95,0 µl media kultur. Selanjutnya plate diinkubasikan dalam inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 370C, lalu ditambahkan 50,0 µl larutan biru triptan 0,5 % dalam akuades. Setelah itu larutan dalam tiap sumuran diresuspensi kuat dan diambil 10,0 µl untuk penghitungan sitotoksistas menggunakan metoda penghitungan langsung dengan bantuan biru tripan. Uji penekanan ekspresi enzim COX-2 dengan media sel Raji Ke dalam suspensi sel pada setiap sumuran yang berbeda (kepadatan sel 5 x 105 sel/ sumuran) ditambahkan 1000 µl sampel dalam media kultur RPMI 1640 hingga dicapai seri kadar akhir dalam sumuran yaitu 8; 4; dan 2 µg/ml. Pada kelompok kontrol, 1000 µl sampel diganti dengan 1000 µl media kultur. Selanjutnya plate diinkubasikan dalam inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 370C. Sel yang telah diinkubasi kemudian dipanen dan dibuat apusan pada gelas obyek (polyl-lysine slide) untuk diuji secara imunositokimia menggunakan antibodi (IgG) primer monoklonal mencit anti COX-2, dan divisualisasikan dengan reaksi warna. Ekspresi COX-2 diamati menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang mengekspresikan protein COX-2 akan memberikan warna coklat/gelap, sedangkan yang tidak akan memberikan warna ungu/ biru. Jumlah sel dihitung pada luasan tertentu, baik yang berwarna coklat/gelap maupun yang berwarna biru, kemudian dianalisis seperti tertera di bawah ini.
dengan metode probit untuk menentukan persamaan garis regresi dan harga LC50. Uji immunositokimia Persen penekanan ekspresi COX-2 dihitung dengan rumus: %
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Uji Sitotoksisitas Uji sitotoksisitas dilakukan untuk memberikan gambaran kemampuan ekstrak kloroform daun E. fusca dalam memberikan efek toksik terhadap sel Raji yang dinyatakan dengan harga LC50 (konsentrasi senyawa uji yang dapat menghambat 50% pertumbuhan sel). Uji sitotoksisitas ini dilakukan dengan metode perhitungan langsung (direct counting) dengan bantuan neubauer haemocytometer. Ekstrak kloroform daun E. fusca larut dengan baik dalam DMSO sehingga sebagai pelarut digunakan DMSO. Penggunaan DMSO sampai kadar 1,25% v/v pada sel Hela dan sel Raji relatif tidak berpengaruh terhadap proliferasi sel (Da’i, 2003). Pada percobaan yang dilakukan untuk konsentrasi ekstrak kloroform daun E. fusca tertinggi, konsentrasi pelarut DMSO yang digunakan adalah 0,64% v/v sehingga pengaruh pelarut kemungkinan sangat kecil.
jml sel hidup kontrol – jmlh sel hidup sampel x 100 % jumlah
sel
hidup
Selanjutnya dibuat grafik hubungan antara kadar sampel terhadap persentase kematian sel dan dilakukan uji korelasi
jml sel yang mengekspresikan COX-2 total sel terhitung
Persen penekanan ekspresi enzim COX-2 dianalisis secara statistik dengan metode ANOVA satu jalan, dilanjutkan dengan uji LSD dengan taraf kepercayaan 95%.
Analisis hasil Uji sitotoksisitas Persentase kematian sel dengan rumus sebagai berikut:. % kematian =
penekanan 100 %
x100
Tabel 1. Prosentase kematian dan nilai probit pada uji sitotoksisitas dengan perlakuan seri konsentrasi ekstrak kloroform daun E. fusca pada kultur sel Raji
pemberian
Kadar (µg/ml)
Log Kadar
% kematian sel
probit
2 4 8 16 32 64
0,3010 0,6021 0,9031 12,041 15,051 18,062
42,70 50,52 57,81 62,50 72,39 81,25
4,82 5,02 5,20 5,30 5,58 5,88
Tabel 2. Purata penekanan ekspresi enzim COX-2 oleh ekstrak kloroform daun E. fusca pada kultur sel Raji, dibandingkan dengan kontrol negatif. Percobaan dilakukan 3 kali secara duplikat. Perlakuan
Purata penekanan ekspresi enzim COX-2 (dalam %) ± SEM
Kontrol negatif
0.11 ± 0.11
Kadar 2 µg/ml
45.54 ± 0.16
Kadar 4 µg/ml
53.88 ± 1.47
Kadar 8 µg/ml
73.35 ± 1.06
A
C
B
D
E
Gambar 1. Hasil pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 dengan media sel Raji pada pengamatan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 40 X. A. kontrol negatif, yaitu kelompok tanpa larutan uji dengan pengecatan antibodi spesifik COX-2. Terlihat semua sel tercat coklat, menunjukkan hasil positif terhadap enzim COX-2. B. blangko; kelompok tanpa senyawa uji dan tanpa pengecatan antibodi spesifik COX-2. C s/d E : Perlakuan ekstrak kloroform daun E. fusca dengan kadar 2 µg/ml (C), 4 µg/ml (D), dan kadar 8 µg/ml (E). Tanda panah hitam menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah kuning menunjukkan hasil negatif COX-2.
Perhitungan sel pada uji sitotoksik dilakukan dengan mengamati sel hidup dan mati akibat perlakuan. Sel mati ditampilkan dengan warna biru oleh biru tripan, sedangkan sel yang
hidup akan berwarna terang jelas. Hasil uji sitotoksisitas dapat dilihat pada tabel 1. Terlihat bahwa terjadi hubungan yang linier antara kenaikan kadar ekstrak uji dengan
persen kematian sel Raji. Dari hasil analisis probit diperoleh bahwa harga LC50 ekstrak kloroform daun E. fusca adalah sebesar 4,05 µg/ml. Dari hasil uji sitotoksisitas ini ditetapkan kadar untuk uji penekanan ekspresi enzim COX-2 adalah dengan kisaran kadar 2, 4, dan 8 µg/ml. B. Uji penekanan ekspresi enzim COX-2 dengan metode immunositokimia Dalam penelitian ini pengamatan uji penekanan ekspresi enzim COX-2 dilakukan dengan cara imunnositokimia metode Labeled Streptavidin Biotin (LSAB) yang kemudian dianalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Dari analisis secara kualitatif dapat terlihat bahwa dengan peningkatan kadar ekstrak uji, sel-sel yang mengekspresikan COX-2 positif semakin sedikit, menunjukkan bahwa telah terjadi penurunan ekpresi enzim COX-2 pada sel Raji. Hasil pengecatan immunositokimia dapat dilihat pada gambar 1. Selanjutnya, dilakukan analisis kuantitatif untuk mengetahui % penekanan ekspresi enzim COX-2 oleh ekstrak uji Kuantifikasi % penekanan ekspresi enzim COX-2 dilakukan dengan terlebih dahulu menghitung % ekspresi protein COX-2. Hasil perhitungannya dapat dilihat pada tabel 2. Pada tabel 2 terlihat bahwa kenaikan konsentrasi ekstrak kloroform 2; 4; 8 (µg/ml) memberikan rata-rata % penekanan ekspresi COX-2 yang semakin meningkat, yaitu masing-masing sebesar 45,54±0,16%; 53,88±1,47%; dan 73,35±1,06%. Sedangkan pada kontrol rata-rata penekanan enzim adalah sebesar 0,11±0,11%. Selanjutnya data % penekanan ekspresi enzim COX-2 pada masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dianalisis secara statistik menggunakan analisis statistik parametrik ANOVA satu jalan dilanjutkan dengan uji LSD. Analisis statistik menunjukkan % penekanan ekspresi enzim COX-2 pada berbagai kelompok perlakuan dan kontrol memberikan perbedaan yang bermakna (p < 0,05). Kenaikan kadar ekstrak uji yang diberikan mampu memberikan peningkatan % penekanan ekspresi enzim COX-2 secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol. Dengan demikian maka ekstrak kloroform daun E. fusca dikatakan
mempunyai kemampuan dalam penekanan ekspresi enzim COX-2 secara tergantung dosis. Hasil penelitian ini mendukung penelitian sebelumnya mengenai aktivitas ekstrak kloroform daun E. fusca sebagai antiinflamasi (Nurliani, 2003; Ikawati, et al, 20061), dan antiproliferasi sel kanker (Puspitasari, 2004). Enzim COX-2 merupakan enzim yang bertanggung jawab terhadap respon inflamasi dan produksi prostaglandin (Leahy et al., 2000) dan terekspresi tinggi dalam sel tumor (Abukhalaf, 2004). Prostaglandin dilaporkan berperan dalam upregulasi VEGF dan menginduksi angiogenesis pada sel tumor (Akarasereenont et al., 2002). Penekanan produksi prostagandin PGE2 akan menurunkan ekspresi bcl-2, suatu antiapoptosis (Shacter and Weitzman, 2002). Dengan demikian diduga, aktivitas ekstrak uji sebagai antiinflamasi dan antikanker diperantarai oleh penghambatan COX-2 sebagai salah satu mekanismenya. Ekstrak kloroform nampaknya memiliki potensi yang lebih besar dalam penekanan ekspresi COX-2 dibandingkan dengan ekstrak etanol. Jika ekstrak etanol memerlukan konsentrasi 250 µg/ml untuk memberikan penekanan ekspresi COX-2 pada sel Raji sebesar 70,19 % (Ikawati, et al, 20062), ekstrak kloroform dapat menekan ekspresi COX-2 sebesar 75.35% pada konsentrasi hanya 8 µg/ml. Karena itu, ekstrak kloroform ini lebih potensial untuk dikembangkan sebagai obat, penekan ekspresi COX-2. Senyawa aktif apa yang terutama bertanggungjawab terhadap semua efek ini belum diteliti lebih lanjut, namun ada dugaan bahwa senyawa aktifnya adalah flavonoid dan terpenoid, karena Perera et al (2001) melaporkan bahwa flavonoid dan terpenoid pberperan dalam regulasi enzim COX-2. Namun demikian, Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui fraksi aktif apa dari ekstrak uji yang memiliki efek penekanan ekspresi COX-2. Hal ini diharapkan dapat memperkaya bukti-bukti ilmiah akan aktivitas ekstrak tersebut sebagai antiinflamasi dan antikanker. KESIMPULAN
Dari penelitian dengan menggunakan ekstrak kloroform daun E. fusca Lour dapat ditarik kesimpulan bahwa ekstrak kloroform daun E. fusca Lour dengan kadar 2; 4; dan 8 µg/ml mampu menekan ekspresi enzim COX2 secara bermakna dibandingkan kelompok kontrol pada media sel Raji, berturut-turut sebesar (dalam %) 45,54 ± 0,16; 53,88 ± 1,47; dan 73,35 ± 1,06. DAFTAR PUSTAKA Abukhalaf, I.K., von Deutsch, D.A., Bayorh, M.A., 2004, Cyclooxygenase Inhibitors, Disease-Modifying Antirheumatic Agents, and Drugs Used in Gout, dalam Handbook of Drug Interaction A Clinical and Forensic Guide, 2004, 337-365, Homana Press, New Jersey Akarasereenont, P.C., Techatraisak, K., Thaworn, A., and Chotewuttakorn, S., 2002, The expression of COX-2 in VEGF-treated endothelial cells is mediated through protein tyrosine kinase, Mediators Inflamm., 11 (1), 17-24 Anonima, 2001, Raji, http://www.biowhittaker.be., Juni 2005 Ikawati, Z., Sismindari, Nugroho, A.E., 20061, Efek ekstrak daun Erythrina fusca Lour terhadap edema dan rekrutmen neutrofil pada respon inflamasi akut pada tikus, MOT, 11(36), 37-41 Ikawati Z., Nugroho, A.E., Windha, W., 20062, Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour terhadap penekanan ekspresi enzim siklooksigenase-2 pada kultur sel Raji, MFI, accepted, in press Leahy, K.M., Ornberg, R.L., Wang, Y., Zweifel, B.S., Koki, A.T., dan Masferrer, J.L., 2002, Cyclooxygenase-2 Inhibition by Celecoxib Reduces Proliferation and Induces Apoptosis in Angiogenic Endothelial Cells in Vivo, Cancer Res., 62, 625–631 Nurliani, M., 2003, Uji Antiinflamasi Ekstrak Metanol Daun Cangkring (Erythrina fusca Lour.) terhadap Inflamasi Akibat Reaksi Anafilaksi Kutaneus Aktif pada Tikus Wistar Jantan, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yoyakarta Perera, P., Ringbom, T., Huss, U., Vasage, M., and Bohlin, L., 2001, Search for Natural Product which Affect Cyclooxygenase-2, in Tringali, C., (Ed.), Bioactive Compounds from Natural Sources: Isolation, Characterisation, and
Biological Properties, 434-465, Taylor and Francis, London. Puspitasari, E., 2004, Efek Antiproliferatif Ekstrak Kloroform Daun Tumbuhan E. fusca Lour (Erythrina fusca Lour.) dan Beberapa Isolatnya terhadap Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Shacter, E., and Weitzman, S.A., 2002, Chronic Inflammation and Cancer, Oncology, 16 (2), 217-232. Simmons, D.L., Moore, B.C., 2000, COX-2 Inhibition, Apoptosis, and Chemoprevention by Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs, Curr Med Chem, 7, 1131-1144 Wahyuningsih, P., 2004, Isolasi dan Identifikasi Senyawa yang Terkandung dalam Ekstrak Kloroform Daun Cangkring (Erythrina fusca Lour.), Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta Wun T, Mc Knight H, Tuscano JM., 2004, Increased cyclooxygenase-2 (COX-2): a potential role in pathogenesis of lymphoma, Leuk Res. 28(2):179-90.
