Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour (cangkring) terhadap penekanan ekspresi enzim siklooksigenase 2 pada kultur sel raji

Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 85 – 90, 2006 Zullies Ikawati

Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour (cangkring) terhadap penekanan ekspresi enzim siklooksigenase–2 pada kultur sel raji Effect of ethanol extract of Erythrina fusca Lour (cangkring) leaves on suppression of cyclooxygenase-2 expression in raji cell line Zullies Ikawati, Agung Endro Nugroho dan Winda Werdhinindah Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

Abstrak Enzim siklooksigenase (COX) terdapat dalam dua bentuk isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. Ekspresi COX-2 terinduksi pada kondisi inflamasi maupun kanker. Penelitian ini bermaksud menguji efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour (cangkring) terhadap penekanan ekspresi COX-2 pada kultur sel Raji, yang dilakukan menggunakan metode immunositokimia. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun E. fusca Lour dengan kadar 250,0; 125,0; dan 62,50 µg/mL mampu memberikan efek penekanan ekspresi enzim siklooksigenase-2 secara bermakna (p < 0,05) terhadap kontrol, dengan persen penekanan berturut-turut: 70,19 ± 2,14 %; 44,69 ± 1,62 %; dan 23,25 ± 2,21 %. Kata kunci: Ekspresi COX-2, anti inflamasi, antikanker, sel Raji, ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour, immunositokimia

Abstract Cyclooxygenase enzyme (COX) exists on two isoforms, COX-1 and COX-2. COX-2 is expressed highly in inflammation and cancer cells. The effect of ethanol extract of Erythrina fusca Lour (cangkring) toward suppression of COX-2 expression in Raji cells was studied using immunocytochemistry method. This research showed that ethanol extract of E. fusca Lour leaves on concentration of 250,0; 125,0; dan 62,50 µg/mL was able to suppress the COX-2 expression significantly in comparison to control, with the inhibition of 70,19 ± 2,14 %; 44,69 ± 1,62 %; and 23,25 ± 2,21 %. Key words: COX-2 expression, anti-inflammation, anti cancer, Raji cells, ethanol extract of E. fusca leaves, immunocytochemistry

Pendahuluan Enzim siklooksigenase (COX) yang merupakan target aksi Obat Anti Inflamasi Non Steroid (OAINS) terdapat dalam dua isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. Kedua enzim tersebut mengkatalisis reaksi dan menghasilkan produk yang sama, yaitu prostaglandin, tetapi dengan fungsi biologis yang berbeda. COX-1 diekspresikan pada hampir semua jaringan dan bertanggungjawab menghasilkan prostaglandin yang berperan menjaga homeostatis saluran pencernaan, aliran darah ginjal, dan vaskular; Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 2006

sedangkan ekspresi COX-2 terinduksi oleh berbagai stimulan inflamasi atau mitogenik, dan bertanggungjawab pada biosintesis prostaglandin yang terlibat pada reaksi inflamasi dan rasa nyeri. Sebagian besar OAINS yang beredar saat ini masih bersifat non-selektif COX, sehingga selain menghambat COX-2 juga menghambat COX-1. Penghambatan COX-1 inilah yang memunculkan efek samping pada penggunaan OAINS, utamanya pada saluran gastrointestinal (Schror and Meyer-Kirchrath, 2000).

85

Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour.....................

Selain terinduksi pada proses inflamasi, overekspresi COX-2 juga ditemukan pada banyak tipe pre-malignan dan malignan neoplasma pada manusia dan organisme lain, seperti pada kanker prostat, payudara, liver, (Hu et al., 2003), dan kolorektal (Moore and Simmons, 2000). Prostaglandin hasil aktivitas COX-2 dinyatakan terlibat dalam karsinogenesis melalui perangsangan proses proliferasi sel, angiogenesis, dan penghambatan apoptosis (Koki and Masferrer, 2002). Sementara ini dapat disimpulkan bahwa aktivitas COX-2, bukan COX-1, memainkan peranan penting dalam proses inflamasi maupun kanker. Penggunaan OAINS selektif terhadap COX-2 diharapkan akan memberikan aksi antiinflamasi setara dengan OAINS non selektif tetapi dengan angka kejadian efek samping yang lebih kecil dan mempunyai profil antikanker yang lebih baik. Hal ini memotivasi pencarian agen yang dapat mempengaruhi regulasi COX-2, baik melalui penekanan ekspresi COX-2 dan/atau melalui penghambatan COX-2 (Perera et al., 2001). Indonesia kaya akan bahan alam, yang salah satu pemanfaatannya adalah sebagai bahan obat. Salah satu tumbuhan yang telah banyak diteliti tentang aktivitasnya sebagai antiinflamasi dan antikanker adalah Erythrina fusca Lour (cangkring). Penelitian-penelitian terdahulu membuktikan bahwa ekstrak metanol daun E. fusca Lour dapat menghambat inflamasi yang diinduksi karagenin (Baroroh, 2003; Rukoyah, 2003). Ekstrak etanol daunnya dilaporkan bersifat antiproliferatif terhadap sel Raji (Riadi, 2002) dan menghambat angiogenesis pada membran korio alantois embrio ayam (CAM) terinduksi bFGF (Nurbayani, 2003). Ekstrak etanol daun E. fusca Lour mengandung flavonoid, suatu golongan senyawa yang telah teridentifikasi sebagai komponen yang mampu mempengaruhi regulasi COX-2 (Perera et al., 2001), sehingga diduga ekstrak etanol daun E. fusca Lour mampu mempengaruhi regulasi COX-2, namun belum tersedia bukti ilmiah tentang kemampuannya tersebut. Oleh karena itu, pada penelitian ini diteliti mengenai kemampuan ekstrak etanol daun cangkring dalam mempengaruhi regulasi COX-2 melalui mekanisme

86

penekanan ekspresi COX-2. Kultur sel Raji dipilih sebagai media karena memiliki ekspresi COX-2 yang tinggi. Metodologi Bahan

Daun E. fusca Lour., etanol (teknis) 80 %, cell line Raji, RPMI 1640 (Gibco), FBS 10 % (Gibco), Fungison 0,5 % (Gibco), penisilin dan streptomisin 1.% (Gibco), DMSO 0,25 %, HEPES (Sigma), Phospat Buffer Saline (PBS), biru tripan 0,5 %, H2O2, serum mencit normal, antibodi primer monoklonal mencit (Novo Castra), antibodi sekunder Biotinylated Goat Anti-Polyvalent (Lab Vision), enzim Streptavidin Peroxidase (Lab Vision), kromogen/substrat 3,3’diaminobenzidine (DAB) (Lab Vision), dan hematoksilin (Dako). Semua bahan yang dipakai berderajat proanalisa kecuali dinyatakan lain. Alat

Seperangkat alat gelas, seperangkat alat penyari, mikroskop fluoresensi (Zeiss MC 80), inverted microscope (Olympus CH-2), sentrifus (Sigma), inkubator CO2 (Heraceus), Laminar air flow cabinet (Nuaire), hemocytometer (Nebauer), tabung conical steril (Nunclone), tissue culture flask (Nunclone), mikroplate 96 sumuran (Nunclone), mikroplate 24 sumuran (Nunclone), vorteks (Genie), gelas obyek (poly-l-lysine slide) (Sigma). Jalannya penelitian Uji sitotoksisitas dengan metode penghitungan langsung

Ke dalam 100,0 µL suspensi sel pada setiap sumuran yang berbeda (kepadatan sel 2 x 104 sel /sumuran) masing-masing ditambahkan 100,0 µL sampel dalam media kultur RPMI 1640 hingga dicapai seri kadar akhir dalam sumuran yaitu 1000; 750; 500; 250; 125; dan 62,5 µg/mL. Pada kontrol media, 100,0 µl senyawa uji diganti dengan 100,0 µl media kultur, sedang pada kontrol pelarut, diganti dengan 5,0 µl DMSO 0,25 % dan 95,0 µl media kultur. Selanjutnya plate diinkubasikan dalam inkubator 5.% CO2 selama 24 jam pada suhu 370C, lalu ditambahkan 50,0 µL larutan biru triptan 0,5 % dalam akuades. Setelah itu larutan dalam tiap sumuran diresuspensi kuat dan diambil 10,0 µL untuk penghitungan sitotoksistas menggunakan metoda penghitungan langsung dengan bantuan biru tripan. Uji immunositokimia

Ke dalam suspensi sel pada setiap sumuran yang berbeda (kepadatan sel 5 x 105 sel/ sumuran) ditambahkan 1000 µL sampel dalam media kultur RPMI 1640 hingga dicapai seri kadar akhir dalam

Majalah Farmasi Indonesia, 17(2), 2006

Zullies Ikawati

sumuran yaitu 250; 125; dan 62,5 µg/mL. Pada kelompok kontrol, 1000 µL sampel diganti dengan 1000 µL media kultur. Selanjutnya plate diinkubasikan dalam inkubator 5.% CO2 selama 24 jam pada suhu 370C. Sel yang telah diinkubasi kemudian dipanen dan dibuat apusan pada gelas obyek (poly-l-lysine slide) untuk diuji secara imunositokimia menggunakan antibodi (IgG) primer monoklonal mencit anti COX-2, dan divisualisasikan dengan reaksi warna. Ekspresi COX-2 diamati menggunakan mikroskop cahaya. Sel yang mengekspresikan protein COX-2 akan memberikan warna coklat/gelap, sedangkan yang tidak akan memberikan warna ungu/ biru. Jumlah sel dihitung pada luasan tertentu, baik yang berwarna coklat/ gelap maupun yang berwarna biru, kemudian dianalisis seperti tertera di bawah ini. Analisis Data Uji sitotoksisitas

Persentase kematian sel dengan rumus

sebagai berikut:. Selanjutnya dibuat grafik hubungan antara kadar sampel terhadap persentase kematian sel dan dilakukan uji korelasi dengan metode probit untuk menentukan persamaan garis regresi dan harga LC50. Uji immunositokimia

Persen penekanan ekspresi COX-2 dihitung

dengan rumus: Persen penekanan ekspresi enzim COX-2 dianalisis secara statistik dengan metode ANOVA satu jalan, dilanjutkan dengan uji LSD dengan taraf kepercayaan 95.%.

Hasil Dan Pembahasan Uji sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas ekstrak etanol E. fusca Lour (selanjutnya disebut ekstrak uji) terhadap sel Raji dilakukan untuk menentukan harga LC50, yang kemudian digunakan sebagai patokan kisaran kadar yang digunakan pada uji penekanan ekspresi COX-2. Adapun hasilnya dapat dilihat pada Tabel I. Terlihat bahwa terdapat hubungan langsung antara perubahan konsentrasi ekstrak uji dengan tingkat kematian sel Raji. Pada konsentrasi ekstrak uji tertinggi


yaitu 1000 µg/mL diperoleh nilai persentase kematian sebesar 73,43.%, dengan nilai LC50 ekstrak uji terhadap sel Raji adalah 149,85 µg/mL. Immunositokimia

Pada pengecatan immunositokimia terdapat lima kelompok perlakuan, yaitu kelompok kadar 250, 125, dan 62,5 µg/mL, kontrol (media dengan perlakuan antibodi primer), dan blanko (media tanpa perlakuan antibodi primer). Penentuan kisaran kadar ekstrak uji didasarkan pada hasil LC50, yaitu di atas dan di bawah LC50. Hasil ekspresi COX-2 pada kelompok perlakuan kemudian dibandingkan dengan ekspresi pada kelompok kontrol sehingga dapat dilihat pengaruh ekstrak etanol daun E. fusca Lour terhadap ekspresi COX-2. Hasil pengecatan immunositokimia diamati menggunakan mikroskop cahaya. Ekspresi COX-2 positif apabila sitoplasma sel berwarna coklat, dan negatif apabila sitoplasma berwarna biru/gelap (Gambar 1). Pada kelompok perlakuan terlihat bahwa ekspresi COX-2 menurun seiring peningkatan kadar ekstrak etanol daun E. fusca Lour. Selanjutnya dilakukan perhitungan penekanan ekspresi COX-2, yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel II. Dari Tabel II terlihat bahwa perlakuan ekstrak uji terhadap sel Raji memberikan efek penekanan terhadap ekspresi COX-2 apabila dibandingkan dengan kelompok kontrol. Penurunan konsentrasi ekstrak uji memberikan peningkatan ekspresi COX-2 yang berbanding terbalik dengan penekanan ekspresi COX-2. Untuk melihat apakah antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan terdapat perbedaan ekspresi COX-2 yang bermakna, maka data kemudian dianalisis dengan metode ANOVA satu jalan, dilanjutkan dengan uji LSD untuk membandingkan perlakuan satu dengan yang lain (Hasil analisis data tidak ditampilkan). Hasil uji statistik menunjukkan bahwa ekstrak uji mampu menekan ekspresi COX-2 secara berbeda bermakna terhadap kelompok kontrol. Senyawa alam yang terdeteksi di dalam senyawa uji adalah flavonoid, alkaloid, saponin, dan terpenoid (Riadi, 2002). Efek biologis dari flavonoid sepertinya terjadi akibat interaksi dengan protein tirosin kinase dan enzim

87


Tabel I. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanol E. fusca Lour. terhadap sel Raji No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Kelompok Kontrol media Kontrol pelarut 0,25 % DMSO Kadar 1000 µg/mL Kadar 750 µg/mL Kadar 500 µg/mL Kadar 250 µg/mL Kadar 125 µg/mL Kadar 62,5 µg/mL

Jumlah sel hidup rata-rata (x 103) 32 32,33 8,5 8, 33 11,67 13,66 16,33 19,33

% kematian sel 0 0 73,43 73,96 63,54 57,29 48,95 39,58

Tabel II. Hasil perhitungan ekspresi COX-2 pada sel Raji Kelompok Kontrol Kadar 62,5 µg/mL Kadar 125 µg/mL Kadar 250 µg/mL

Purata % penekanan ekspresi ± SEM 0,62 ± 0,62 23,25 ± 2,21 44,69 ± 1,62 70,19 ± 2,14

Gambar 1. Hasil pengamatan ekspresi COX-2 dengan menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 40 x. a.Kontrol (kontrol media dengan perlakuan antibodi primer); b. Blangko (kontrol media tanpa perlakuan antibodi primer); c. Perlakuan dengan kadar 62,5 µg/mL; d. Kadar 125 µg/mL; dan e. Kadar 250 µg/mL.

siklooksigenase. Walaupun dalam penelitian ini belum diteliti lebih jauh jenis flavonoid yang terdapat pada daun E. fusca, namun diduga flavonoid lebih banyak berperan dalam efek penekanan ekspresi COX-2 ini. Hal ini seperti yang dijumpai pada genistein, misalnya, flavonoid yang hampir semuanya terdapat dalam tanaman famili Leguminosae (Papilionaceae), yang dilaporkan dapat menghambat ekspresi COX-2 pada makrofag

88

yang diinduksi oleh LPS dengan nilai IC50 52 nM (Perera et al, 2001). Hasil aktivitas COX adalah prostaglandin yang merupakan hasil metabolisme asam arakidonat. Prostaglandin berperan banyak dalam sistem tubuh manusia, tetapi ketika diekspresikan secara berlebihan, dilaporkan terlibat dalam tumorigenesis (Zecha et al., 2004). Prostaglandin hasil aktivitas COX-2


Zullies Ikawati

dilaporkan berperan dalam upregulasi VEGF (vascular endothelial growth factor) dan menginduksi angiogenesis pada tumor (Akarasereenont et al., 2002). VEGF sendiri dapat meningkatkan protein dan aktivitas COX-2 pada human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (Akiyama et al., 1987). Nurbayani (2003) melaporkan bahwa ekstrak uji mampu menghambat angiogenesis pada membran korio alantois embrio ayam terinduksi bFGF. Hal ini menguatkan dugaan bahwa ekstrak uji dapat menekan ekspresi COX-2, yang pada gilirannya dapat menurunkan produksi PGE2 dan VEGF sehingga menghambat angiogenesis. Sebagai media uji adalah sel Raji. Sel Raji merupakan sel limfosit-β yang terinfeksi oleh Eipstein-Barr Virus (EBV) (Alfieri and Joncas, 1987). Sel yang terinfeksi EBV akan mengekspresikan protein bcl-2 yang menjadikan sel resisten terhadap sistem apoptosis (Komano et al., 1998). Karakteristik resistensi sel Raji terhadap apotosis ini kemungkinan diperantarai oleh overekspresi COX-2 oleh sel Raji (Wun et al, 2004). Dalam penelitian ini, ekstrak uji dapat menekan ekspresi COX-2 pada sel Raji, maka dapat diasumsikan bahwa ekstrak uji dapat menekan konversi asam arakidonat menjadi PGE2. Penurunan konversi asam arakidonat akan meningkatkan ketersediaan asam arakidonat, sehingga akan meningkatkan

ketersediaan ceramide, suatu induktor apoptosis poten (Lema, 2002), sedang penekanan produksi PGE2 akan menurunkan ekspresi bcl-2, suatu antiapoptosis (Shacter and Weitzman, 2002). Maka diduga kemampuan ekstrak uji menginduksi apoptosis pada sel Raji adalah melalui penekanan ekspresi COX-2, sehingga meningkatkan induktor apoptosis poten, ceramide, dan menekan ekspresi onkogen antiapoptosis bcl-2. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun E. fusca Lour dapat menekan ekspresi COX-2 secara bermakna terhadap kontrol. Hal ini diharapkan dapat memperkaya bukti-bukti ilmiah akan aktivitas ekstrak tersebut sebagai antiinflamasi dan antikanker. Kesimpulan Dari penelitian menggunakan ekstrak etanol daun E. fusca Lour dapat ditarik kesimpulan bahwa ekstrak etanol daun E. fusca Lour dengan kadar 250,0; 125,0; dan 62,50 µg/mL mampu memberikan efek penekanan ekspresi enzim siklooksigenase-2 secara bermakna (p < 0,05) dibandingkan dengan kontrol, dengan persen penekanan berturutturut 70,19 ± 2,14 %; 44,69 ± 1,62 %; dan 23,25..±..2,21.%.

Daftar Pustaka Akarasereenont, P.C., Techatraisak, K., Thaworn, A., and Chotewuttakorn, S., 2002, The expression of COX-2 in VEGF-treated endothelial cells is mediated through protein tyrosine kinase, Mediators Inflamm., 11 (1), 17-24 Akiyama T., Ishida, J., Nakagawa, S., Ogawara, H., Watanabe, S., Itoh, N., Shibuya, M, and Fukami, Y., 1987, Genistein, a Spesific Inhibitor of Tyrosine-spesific Protein Kinases, J Biol Chem, 262 (12), 5592-5595. Alfieri, C, and Joncas, J.H., .1987, Biomolecular analysis of a defective nontransforming EpsteinBarr virus (EBV) from a patient with chronic active EBV infection, J Virol. 61(10):3306-9. Baroroh, H.N., 2003, Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Metanol Daun Cangkring (Erythrina fusca Lour.) pada Pasca Inflamasi Akut yang Diinduksi Karagenin, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Hu, K., Yu, C., Mineyama, Y., McCracken, J.D., Hillebrand, D.J., and Hasan, M., 2003, Inhibited proliferation of cyclooxygenase-2 expressing human hepatoma cells by NS-398, a selective COX-2 inhibitor, Int J Oncol, 22, 757-763. Koki, A.T., and Masferrer, J.L., 2002, Celecoxib: A Specific COX-2 Inhibitor with Anti Cancer Properties, Cancer Control, 9 (2), 28-35.


89


Komano J, Sugiura M, and Takada K. 1998, Epstein-Barr virus contributes to the malignant phenotype and to apoptosis resistance in Burkitt's lymphoma cell line Akata. J Virol. 72(11): 9150-6. Lema, M.J., 2002, Coxib Therapy and Colorectal Cancer: Emerging options with coxib therapy, Cleve Clin J Med, 69, 176-184. Moore, B.C., and Simmons, D.L., 2000, Cox-2 Inhibition, Apoptosis, and Chemoprevention by Nonsteroidal Anti-inflamatory Drugs, Curr Med Chem, 7, 1131-1144. Nurbayani, N., 2003, Efek Penghambatan Angiogenesis Ekstrak Etanol Daun Tanaman Cangkring (Erythrina fusca Lour) pada Membran Korio Alantois Embrio Ayam Terinduksi bFGF, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Perera, P., Ringbom, T., Huss, U., Vasage, M., and Bohlin, L., 2001, Search for Natural Product which Affect Cyclooxygenase-2, in Tringali, C., (Ed.), Bioactive Compounds from Natural Sources: Isolation, Characterisation, and Biological Properties, 434-465, Taylor and Francis, London. Riadi, I., 2002, Efek Antiproliferatif Ekstrak Etanol Daun Tanaman Cangkring (Erythrina fusca Lour.) terhadap Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Rukoyah, U., 2003, Pengaruh Pra Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Cangkring (Erythrina fusca Lour.) terhadap Inflamasi Akut pada Tikus Jantan yang Diinduksi Karagenin, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Schror, K. and Meyer-Kirchrath, J., 2000, Cyclooxygenase-2 Inhibition and Side-effects of Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs in the Gastrointestinal Tract, Curr Med Chem, 7, 1121-1129. Shacter, E., and Weitzman, S.A., 2002, Chronic Inflammation and Cancer, Oncology, 16 (2), 217-232. Wun, T., McKnight, H., and Tuscano, J.M., 2004, Increased cyclooxygenase-2 (COX-2): a potential role in the pathogenesis of lymphoma, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/, Desember 2005 Zecha, G., Lin, D.W., and Montgomery, R.B., 2004, The increasing role of CAM in prostate cancer, JAAPA, 17, 37-44.

90


Efek ekstrak etanol daun Erythrina fusca Lour (cangkring) terhadap penekanan ekspresi enzim siklooksigenase 2 pada kultur sel raji

Recommend Documents