KAJIAN METODE EKSTRAKSI ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC) TERHADAP MIKROBA PATOGEN DAN PERUSAK PANGAN Adolf Parhusip1', Sedarnawati Yasni2), Yenni Elisabeth3'. Abstract Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC) is one of wild spices plants, which grows in hill areas of Toba Lake North Sumatera. The purpose of this research is to find most appropriate method of extraction in order to save final product that is still has antimicrobial activities. Extraction process using maceration on methanol-extracted andaliman shows the highest inhibitory effect towards Salmonella typhi (12.61 mm/g sample) while reflux method gives final product that effectively inhibits Escherichia coli (7.61 mm/g sample) Keywords: extract, maceration, reflux, antimicrobial
PENDAHULUAN Andaliman merupakan rempah liar yang tumbuh di kawasan Danau Toba Propinsi Sumatera Utara. Andaliman banyak digunakan masyarakat suku BatakToba sebagai bumbu masakan yang khas, seperti naniarsik, naniura, natinombur. Umumnya masakan-masakan khas Sumatera Utara yang menggunakan andaliman memiliki daya simpan yang cukup lama. Daya awet andaliman diduga karena adanya daya antimikroba yang terkandung didalamnya. Senyawa antimikroba adalah jenis bahan tambahan makanan digunakan dengan tujuan untuk mencegah kebusukan atau keracunan oleh mikroorganisme pada bahan pangan (Brannen dan Davidson, 1993). Efektifitas antimikroba dalam mengawetkan bahan makanan terjadi baik dengan cara mengontrol pertumbuhan mikroorganisme maupun secara langsung memusnahkan seluruh atau sebagaian mikroorganisme.Pengaruh komponen antimikroba terhadap sel mikroba dapat menyebabkan kerusakan sel yang berlanjut pada proses kematian. Kerusakan yang ditimbulkan komponen antimikroba dapat bersifat bakterisidal yang bersifat tetap, atau bakteriostatik yang bersifat dapat pulih kembali.
1)
Dosen part time Jurusan Teknologi Pangan UPH, > Dosen Jurusan TPG-IPB, 3 > Staf PPKS Medan
2
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No.1, Oktober2003
112
Penelitian Yasni (2001) menyatakan bahwa analisis minyak atsii andaliman dengan GC-MS diperoleh minimal 11 komponen dengan 5 komponet utama yang terdeteksi oleh Wiley 229 Library. Kelima komponen tersebu adalah alfa-pinene, limonen, geraniol, citronella dan geranil asetat. Minyal atsiri andaliman mampu menghambat Bacillus cereus, Staphylococcus aureut dan Pseudomonas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh polaritas ekstral1 andaliman baik dengan teknik maserasi maupun dengan refluks terhadap aktivitas antimikroba pada mikroba patogen dan perusak pangan. Hasi penelitian ini diharapakan dapat menambah informasi ilmiah mengenai potens antimikroba andaliman terutama kemungkinan aplikasinya di bidang pangan dan pengobatan. Aktivitas antimikroba andaliman dalam penelitian ini diujikan terhadap bakteri gram negatif, bakteri gram positif dan kapang.
METODOLOGI Bahan dan Alat Andaliman yang telah dikeringbekukan diperoleh dari Medan. Andaliman tersebut digiling hingga berbentuk tepung dan selanjutnya tepung tersebut digunakan sebagai sampel penelitian. Untuk uji aktivitas antimikroba digunakan 4 jenis kultur bakteri patogen (E. coli, S. thypimurium, B. cereus, dan S. aureus), 2 jenis kultur bakteri perusak pangan (Bacillus stearothrmophilus dan Pseudomonas fluorescens) yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan PAL) IPB, serta 3 jenis kapang perusak pangan (Aspergillus flavus, Fusarium, dan Penicillium) yang diperoleh dari Lembaga llmu Pengetahuan Indonesia (LIPI)-Bogor. Proses ekstraksi dilakukan dengan menggunakan heksan, etil asetat dan metanol, sedangkan dimetil sulfoksida (DMSO) digunakan sebagai pelarut ekstrak. Media yang digunakan untuk uji difusi sumur adalah Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB) dan Potato Dextrose Agar (PDA). Peralatan yang digunakan adalah freeze drying, shaker, refluks, rotavapor, sonikator, autoclave, cawan petri, jangka sorong, inkubator, tabung reaksi dan peralatan gelas lainnya.
113
Jurnal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No. 1, Oktober 2003
Metode Penelitian Pengujian aktivitas antimikroba serbuk andaliman terhadap bakteri dan kapang dengan uji difusi sumur (Garriga et al., 1993). Untuk melakukan pengujian aktivitas antimikroba, kultur uji harus disegarkanterlebih dahulu dengan menginokulasikan satu ose kultur murni dari agar miring NA ke dalam 10 ml medium cair NB secara aseptik. Kultur uji kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Medium NA steril dipersiapkan dan didinginkan sampai suhu 500C. Kedalam 20 ml NA steril tersebut diinokulasikan sebanyak 0.2% kultur segar dari dari media NB yang telah berusia 24 jam dengan konsentrasi 107-108 sel/ml. Campuran media dan kultur dituangkan ke dalam cawan dan dibiarkan membeku. Setelah membeku dibuatkan lubang sumur (4 sumur per cawan) dengan diameter 6.2 mm dan ke dalam 2 sumur tersebut dimasukkan 60 pi ekstrak andaliman, sedangkan 2 sumur lainnya masing-masing dimasukkan 60 pi kontrol positif dan 60 p kontrol negatif. Selanjutnya agar cawan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Data yang diperoleh adalah selisih diameter penghambatan sampel dengan diameter penghambatan negatif. Diameter penghambatan diperoleh dari selisih diameter areal bening dengan diameter sumur. Selanjutnya dilakukan perhitungan diameter penghambatan untuk setiap gram ekstrak dan gram bahan. Proses ekstraksi serbuk andaliman (Harbone, 1996) Berdasarkan hasil pengujian aktivitas antimikroba serbuk andaliman, selanjutnya dilakukan pemisahan ekstrak. Proses ekstraksi dilakukan dengan dua cara seperti tertera pada Gambar 1. dan Gambar 2. Pada masing-masing jenis ekstrak yang diperoleh dilakukan analisis aktivitas antimikroba dengan menggunakan uji difusi sumur (Garriga et al., 1993). HASIL DAN PEMBAHASAN DMSO sebagai pelarut serbuk ataupun ekstrak memiliki gugus polar dan non polar yang diharapkan mampu berdifusi pada media pertumbuhan NA untuk membawa komponen antimikroba yang terdapat dalam andaliman. Perlakuan dengan DMSO sebagai kontrol negatif menunjukkan pengaruhnya terhadap- mikroba
uji tidak ada, sehingga dapat
diabaikan.
Penggunaan amoxycillin sebagai kontrol positif yang dilarutkan dalam pelarut
Jumal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No. 1, Oktober 2003
114
DMSO dengan konsentrasi 0.1% (w/v) bertujuan untuk membandingkan aktivitas antimikroba andaliman dengan antibiotik sintetis. Pengujian Aktivitas Antimikroba Serbuk Andaliman Serbuk andaliman pada umumnya mampu menghambat mikroba uji. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa pada serbuk andaliman mampu menghambat Salmonella typhimuhum, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens dan Staphylococcus aureus, sedangkan kapang tidak dapat dihambat, seperti disajikan Tabel 1. Tabel 1. Aktivitas Antimikroba Serbuk Andaliman Jenis Mikroba
Daya Hambat (mm/g bahan)
Salmonella typhimurium
158
Escherichia coli
80
Bacillus cereus
70
Pseudomonas fluorescens
70
Staphylococcus aureus
40
Bacillus stearothermophilus
0
Aspergillus flavus
0
PeniciWum
0
Fusarium
0
115
Jumal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No. 1, Oktober 2003
Sampel andaliman (50 gram) diulang
_^,
Diekstrak dengan heksan Disonikator (15 menit)
I
Dishaker suhu 37°C, 1 hari
r Ampas
4 diulang
h
Diekstrak dengan etil asetat
Filtrat Dipekatkan (45°C)
4 Ekstrak heksan Disonikator (15 menit) Dishaker suhu 37°C, 1 hari
f Ampas
J diulang
} Filtrat
I
^ Diekstrak dengan metanol Dipekatkan (45°C) Disonikator (15
I
Ekstrak etil asetat
Dishaker suhu 37°C, 1 hari
} Ampas
Filtrat Dipekatkan (45°C) Ekstrak metanol
Gambar 1. Diagram alir proses ekstraksi metode maserasi
Jumal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No.1, Oktober2003
116
Sampel andaliman diulang
.^
Direfluks dengan heksan 60°C,3jam
r1
} Filtrat
Ampas
I
diulang
I
Direfluks dengan heksan 60°C,3jam
Dipekatkan (45°C)
I Ekstrak heksan
Ampas
Filtrat
I
Dipekatkan (45°C)
Ekstrak etil asetat
•+•
Direfluks dengan heksan 60°C,2jam
* — Ampas
Filtrat Dipekatkan (45°C) Ekstrak mctanol
Gambar 2. Diagram alir proses ekstraksi metode refluks
117
Jumal llmu dan Teknologi Pangan VoU, No.1, Oktober2003
Tabel 2. Rendemen ekstraksi andaliman dengan metode maserasi dan refluks Metode
Jenis Ekstrak
Ekstraksi
Ekstrak heksart
Ekstrak etil asetat
Ekstrak metanol
Maserasi
3.03% (w/w)
4.02% (w/w)
5.13% (w/w)
Refluks
0.87% (w/w)
3.50% (w/w)
6.29% (w/w)
Pada Tabel 2. dapat dilihat bahwa hasil ekstraksi dengan metanol menggunakan metode refluks menghasilkan rendemen tertinggi ekstrak andaliman (6.29%) yang diperoleh dibandingkan dengan metode maserasi (5.13%). Hal ini dapat dijelaskan bahwa metode refluks dalam prosesnya menggunakan suhu yang relatif lebih tinggi (60°C) dibandingkan dengan metode maserasi. Disamping itu metode refluks dapat dilakukan hanya 3 jam dibandingkan dengan maserasi butuh waktu 1 hari. Suhu 60°C ternyata paling mampu mengekstrak komponen antimikroba dari sampel, artinya ekstraksi relatif lebih sempurna. Namun data penghambatan terhadap mikroba uji ternyata metode maserasi lebih efektif menghambat dibandingkan dengan metode refluks. 2. Pengaruh Polaritas Ekstrak Terhadap Aktivitas Antimikroba Ekstraksi yang paling efisien diindikasikan dengan kemampuan penghambatan tertinggi ekstrak yang diperoleh terhadap mikroba uji. Pengaruh tersebut meliputi ekstrak non polar, semipolar dan ekstrak polar. Aktivitas antimikroba terhadap mikroba uji menunjukkan bahwa setiap jenis mikroba mempunyai kepekaan yang berbeda satu dengan yang lainnya tergantung dari jenis mikroba dan jenis ekstrak yang diujikan (Rahayu, 1999). a. Ekstrak heksan Ekstrak non polar diperoleh dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut heksan baik dengan metode maserasi maupun metode refluks. Diharapkan komponen antimikroba yang bersifat non polar terlarut dalam pelarut heksan. Senyawa yang terdapat pada ekstrak non polar adalah trigliserida, asam lemak dan minyak atsiri (Houghton dan Raman, 1998). Pengujian aktivitas antimikroba ekstrak heksan dengan metode maserasi dan metode refluks dapat dilihat pada pada Tabel 3. Jumal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No.1, Oktober 2003
118
Tabel 3. Aktivitas antimikroba ekstrak heksan dengan metode maserasi dan metode refluks Jenis Mikroba
Penghambatan
Penghambatan
maserasi
refluks
(mm/g bahan)
(mm/g bahan)
Salmonella typhimurium
5.05
1.01
Escherichia coll
0.00
0.00
Bacillus cereus
2.34
0.84
Pseudomonas
0.87
0.51
fluorescens
0.00
0.88
Staphylococcus aureus
2.04
0.88
B. stearothermophilus
8.95
1.02
Aspergillus flavus
2.49
0.39
Penicillium
3.14
0.00
Fusarium
Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa ekstrak heksan andaliman metode maserasi mampu menghambat mikroba uji kecuali Escherichia co\\ dan Staphylococcus aureus, sedangkan pada metode refluks juga mampu menghambat mikroba uji kecuali Escherichia coli dan Fusarium. Namun penghambatan ekstrak andaliman dengan metode maserasi lebih tinggi dari metode refluks. Senyawa antimikroba yang diuji dengan metode difusi sumur sebaiknya tidak terlalu banyak mengandung hidrofobik, karena akan menggangu kemampuan senyawa tersebut untuk berdifusi dalam medium agar. Proses difusi yang terganggu atau minimal mengakibatkan daya penghambatannya tidak terdeteksi. Komponen ekstrak non polar banyak mengandung gugus hidrofobik'sehingga kemampuan untuk berdifusi didalam medium agar berkurang bila dibandingkan dengan ekstrak semi polar dan ekstrak polar (Sikkemaetal., 1995). Selanjutnya dikemukakan bahwa senyawa non polar dalam menghambat mikroba diduga karena senyawa non polar dapat menyebabkan perubahan komposisi membran sel dan terjadinya pelarutan membran sel, sehingga membran sel mengalami kerusakan. Selain itu komponen non polar juga dapat berinteraksi dengan protein membran yang menyebabkan kebocoran isi sel. 119
Jumal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No. 1, Oktober 2003
b. Ekstrak etil asetat Ekstraksi komponen semi polar dilakukan dengan menggunakan pelarut etil asetat dengan kekuatan solvent 4.4 (Houghton dan Raman, 1998). Pengujian aktivitas antimikroba pada ekstrak etil asetat andaliman dengan metode maserasi dan metode refluks dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4. Aktivitas antimikroba ekstrak etil asetat dengan metode maserasi dan metode refluks Jem's Mikroba
Penghambatan
Penghambatan
maserasi
refluks
(mm/g bahan)
(mm/g bahan)
Salmonella typhimurium
5.92
2.48
Escherichia coli
4.32
0.81
Bacillus cereus
5.09
3.63
Pseudomonas
7.15
4.15
fluorescens
7.62
2.60
Staphylococcus aureus
5.81
6.11
B. stearothermophilus
4.27
9.05
Aspergillus flavus
2.63
2.65
Penicillium
3.76
1.04
Fusariurn
Ekstrak andaliman dengan metode maserasi maupun metode refluks memberikan hasil positif terhadap 9 jenis mikroba uji. Diameter penghambatan terbesar pada metode maserasi adalah terhadap Staphylococcus aureus (7.62 mm/g bahan), sedangkan pada metode refluks penghambatan terbesar terdapat pada mikroba uji Aspergillus
flavus (9.05 mm/g bahan).
Komponen ekstrak semipolar andaliman mampu menghambat mikroba uji. Kepekaan Bacillus cereus terhadap aktivitas antimikroba karena pada masa germinasi maupun pertumbuhan spora dapat kehilangan daya tahannya terhadap pengaruh panas, radiasi, tekanan dan beberapa senyawa kimia, sehingga ketahanannya sama dengan sel vegetatifnya (Russel, 1991).
Jumal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No. 1, Oktober 2003
120
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak andaliman mengandung senyawa antimikroba yang efektif terhadap bakteri gram positif dan gram negatif serta kapang. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak semipolar andaliman mempunyai spektrum luas yang mampu menghambat bakteri gram positif, negatif dan kapang sehingga dapat digunakan secara efektif sebagai pengawet alami bahan pangan. c. Ekstrak metanol Hasil pengujian aktivitas antimikroba pada ekstrak metanol andaliman metode maserasi dan metode refluks memberikan hasil positif terhadap 9 mikroba uji, seperti disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Aktivitas antimikroba ekstrak metanol dengan metode maserasi dan metode refluks Jenis Mikroba
Penghambatan
Penghambatan
maserasi
refluks
(mm/g bahan)
(mm/g bahan)
12.61
2.41
Escherichia coii
5.62
7.61
Bacillus cereus
3.65
5.33
Pseudomonas
5.09
4.50
Salmonella
typhimurium
fluorescens Staphylococcus B.
aureus
stearothermophilus
3.86
0.00
3.93
6.45
0.38
7.22
Aspergillus flavus
1.40
2.58
Penicitlium
2.71
1.55
Fusarium
Untuk ekstrak metanol andaliman metode maserasi dan metode refluks memberikan hasil positif terhadap 9, kecuali pada S. aureus (metode refluks). S. typhimurium memiliki daya penghambatan paling besar (12.61 mm/g bahan) baik dengan metode maserasi maupun metode refluks. Menurut Mulia (2001) ekstrak polar andaliman memberikan daya penghambatan yang paling efektif terhadap beberapa jenis bakteri dibanding dari ekstrak etil asetat dan heksan. Aktivitas antimikroba yang optimum sangat ditentukan oleh keseimbangan hidrofilik-lipofilik. Sifat hidrofilik dibutuhkan agar zat antimikroba dapat larut di dalam air yang merupakan tempat tumbuh mikroba, sedangkan karakteristik lipofilik diperlukan agar zat tersebut dapat bereaksi dengan membran sel mikroba. 12!
Jumal llmu dan Teknologi Pangan VoH, No.1, Oktober2003
KESIMPULAN Andaliman berpotensi dalam menghambat beberapa jenis bakteri patogen dan perusak makanan serta kapang perusak makanan sehingga potensial sebagai sumber alternatif senyawa antimikroba alami. Rendemen tertinggi diperoleh dengan menggunakan pelarut metanol, namun metode refluks menghasilkan rendemen tertinggi yaitu 6.29% (w/w) sedangkan metode maserasi diperoleh 5.13% (w/w). Metode maserasi pada ekstrak metanol menunjukkan daya penghambatan tertinggi terhadap Salmonella typhimurium sebesar 12.61 mm/g bahan, sedangkan metode refluks pada ekstrak metanol penghambatan tertinggi pada Escherichia coli sebesar 7.61 mm/g bahan. DAFTAR PUSTAKA Bloomfield, S.F. 1991. Assessing Antimicrobial Activity. Di dalam: Denyer, S.P., dan Hugo, W.B. (eds). Mechanism of Action of Chemical Biocides. Blackwell Scientific Publicat., Oxford. Garriga, M., Hugas. M., Aymerich, T. dan Monfort, J.M. 1993. Bacteriocinogenic Activity of Lactobacilli from Fermentor Sausages. J. Appl. Bacterio. 75: 142-148. Fardiaz, S, 1996. Strategi Riset Bidang Mikrobiologi Untuk Meningkatkan Keamanan Pangan di Indonesia. Orasi llmiah Guru BesarTetap llmu Mikrobiologi Pangan. Fateta IPB, Bogor. Davidson, P.M. dan A.L. Brannen. 1993. Antimicrobials in Food. Marcel Dekker Inc., New York. Harbone, J.B. 1996. Phytochemical methods. Chapman and Hall Ltd. London. Houghton, P.J. dan Raman, A. 1998. Laboratory Handbook for the Fractination of Natural Extracts. Thomson Science, London. Mulia, L. 2000. Kajian Aktivitas Antimikroba Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium) dan Antarasa {Litse cubeba). Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Bogor
122 Jumal llmu dan Teknologi Pangan Vol1, No. 1, Oktober 2003
Nuraida, L, Andarwulan, N. dan Kristikasari, E. 1999. Aktivitas Antimikroba Biji Picung (Pangium edule Reinw.) Segar dan Terfermentasi Terhadap Bakteri Patogen dan Perusak Makanan. J. Ilmu dan Tek. Pangan 4 (2): 18-26. Rahayu, W.P. 1999. Kajian Aktivitas Antimikroba Ekstrak dan Fraksi Rimpang Lengkuas {Alpha galanga L. Swart) Terhadap Mikroba Patogen dan Perusak Makanan. Disertasi. Program Pascasarjana IPB, Bogor. Russel, A.D. 1991. Mechanism of Bacterial Resistance to Non-Antibiotic: Food Additives and Food Pharmauceutical Preservatives. J. Appl. Bacteriol. 71: 191. Yasni, S. 2001. Pangan Tradisional. Basis Bagi Industri Pangan Fungsional dan Suplemen. Pusat Kajian Makanan Tradisional IPB. Bogor.
123
Jumal Ilmu dan Teknologi Pangan Vol1, No.1, Oktober2003
