PENAPISAN, IDENTIFIKASI, UJI POTENSI AGENS HAYATI BAKTERI PENGHASIL AHL-LAKTONASE DAN EKSPRESINYA PADA Escherichia coli SYAIFUL KHOIRI

PENAPISAN, IDENTIFIKASI, UJI POTENSI AGENS HAYATI BAKTERI PENGHASIL AHL-LAKTONASE DAN EKSPRESINYA PADA Escherichia coli

SYAIFUL KHOIRI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016 Syaiful Khoiri NIM A352130011

RINGKASAN SYAIFUL KHOIRI. Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli. Dibimbing oleh GIYANTO dan TRI ASMIRA DAMAYANTI. AHL-laktonase merupakan enzim pendegradasi N-acyl homoserine lactone (AHL) dalam quorum sensing (QS). Degradasi AHL dapat mengacaukan komunikasi antar sel bakteri patogen tumbuhan. Mekanisme ini disebut sebagai quorum quenching (QQ). Mekanisme QQ dapat mencegah ekspresi faktor virulensi bakteri patogen yang diekspresikan seperti enzim, toksin, dan eksopolisakarida. AHL-laktonase dihasilkan oleh bakteri tertentu, namun di Indonesia informasi tentang bakteri ini dan potensinya sebagai agens hayati belum banyak dilaporkan. Sehingga penelitian ini bertujuan untuk menapis, mengidentifikasi, mengkloning dan mengekspresikan gen aiiA penyandi AHLlaktonase pada Escherichia coli BL21 (DE3), serta menguji potensi agens hayati bakteri penghasil AHL-laktonase sebagai anti-QS terhadap Chromobacterium violaceum dan Dickeya dadantii. Penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase dilakukan dengan uji anti-QS, antibiosis, dan deteksi gen aiiA dengan PCR menggunakan primer spesifik. Identifikasi bakteri dilakukan dengan perunutan DNA gen 16S rRNA. Gen aiiA dikloning pada plasmid pTZ57R/T dengan metode TA-kloning dan dirunut sekuen nukleotidanya. Sekuen yang diperoleh dianalisis tingkat homologinya terhadap gen aiiA yang ada di GenBank. Gen aiiA disubkloning ke dalam vektor ekspresi pET-28a pada situs enzim restriksi BamHI dan SalI, kemudian diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3). Protein hasil ekspresi dianalisis dengan sodium dedocyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Bobot protein diperkirakan dengan perangkat lunak ExPaSy. Uji potensi agens hayati bakteri penghasil AHL-laktonase dan E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA dilakukan terhadap bakteri penyebab penyakit busuk lunak D. dadantii. Hasil penapisan diperoleh 21 dari 31 isolat bersifat anti-QS terhadap C. violaceum, namun dua isolat bersifat antibiosis yakni isolat B13 dan EKK10. Isolat yang bersifat anti-QS dan tidak bersifat antibiosis selanjutnya dideteksi dengan primer spesifik gen aiiA penyandi AHL-laktonase. Hasil deteksi gen aiiA diperoleh 4 dari 19 isolat tersebut memiliki gen aiiA. Keempat isolat bakteri tersebut yaitu B37, GG3, GG6, dan BT2. Keempat isolat tersebut mampu menekan virulensi D. dadantii dengan ditandai adanya penghambatan busuk lunak pada anggrek dan kentang secara signifikan. Penghambatan tertinggi ditunjukkan oleh isolat GG6 pada anggrek dengan tingkat hambatan relatif sebesar 55.2% dan isolat BT2 pada kentang dengan tingkat hambatan relatif sebesar 36.7%. Hasil perunutan DNA keempat isolat menunjukkan gen aiiA berukuran 753 pb. Analisis sekuen nukleotida gen aiiA dan asam amino AiiA menunjukkan bahwa isolat B37 (aiiAB37/AiiAB37), GG3 (aiiAGG3/AiiAGG3), GG6 (aiiAGG6/AiiAGG6), dan BT2 (aiiABT2/AiiABT2) memiliki homologi yang tinggi dengan sekuen gen aiiA dan AiiA yang telah terdeposit pada GenBank, serta memiliki bagian asam amino terkonservasi yaitu 103SHLHFDH109 dan 166 TPGHSPGH173 yang merupakan ciri kelompok enzim metallo-beta-lactamase.

Struktur protein asam amino AiiA keempat isolat mempunyai kemiripan dengan struktur protein tersier AHL-hidrolase. Bobot molekul protein keempat AiiA berkisar 28.096-28.25 kDa. Analisis protein dengan SDS-PAGE menunjukkan gen aiiA yang diekspresikan berukuran sekitar 32 kDa, yang terdiri dari fusi protein berukuran 3.8 kDa dari plasmid pET-28a dan 28 kDa dari AiiA, namun ekspresi proteinnya perlu dioptimasi lebih lanjut. Gen aiiA yang diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3) dengan IPTG 0.75 mM dan suhu inkubasi 37 oC terekspresi pada fraksi insoluble (pelet sel) dan tidak terekspresi pada supernatan. E. coli BL21 (DE3) rekombinan aiiA mampu menghambat QS yang lebih tinggi terhadap C. violaceum dengan diameter hambat mencapai 34 mm dan mampu menekan virulensi D. dadantii pada kentang dengan tingkat hambatan relatif yang lebih tinggi yakni mencapai 63.3%. Hasil identifikasi berdasarkan sekuen gen 16S rRNA menunjukkan bahwa isolat B37 mempunyai homologi tertinggi dengan Brevibacillus brevis strain NBRC15304, isolat GG3 dan GG6 mempunyai homologi tertinggi dengan Bacillus cereus ATCC14579, dan isolat BT2 mempunyai homologi tertinggi dengan B. thuringiensis ATCC10792. B. brevis belum pernah dilaporkan sebelumnya sebagai bakteri penghasil AHL-laktonase. Sekuen nukleotida dari 16S rRNA dan gen aiiA yang diperoleh dari penelitian ini telah didepositkan pada DDJB/EMBL/GenBank database dengan nomor aksesi: LC055677, LC055679, LC055680, LC055678, LC055758, LC05576, LC055761, dan LC055759. Kemampuan bakteri penghasil AHL-laktonase dalam menekan virulensi D. dadantii ini dapat menjadi infomasi tentang pemanfaatannya sebagai agens hayati. Informasi tersebut menambah pengetahuan terkait mekanisme pengendalian hayati selain antibiosis dan kompetisi. Hasil identifikasi bakteri-bakteri tersebut dapat menambah informasi tentang keragaman isolat-isolat bakteri penghasil AHL-laktonase. Selain itu, gen aiiA penyandi AHL-laktonase dapat digunakan sebagai material genetik untuk produksi AHL-laktonase atau perakitan tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri patogen tumbuhan. Kata kunci: Bacillus, busuk lunak, gen aiiA, quorum quenching, quorum sensing

SUMMARY SYAIFUL KHOIRI. Screening, Identification, Bio-agents Potensial Assay of AHL-lactonase Producing Bacteria, and Its Expression in Escherichia coli. Supervised by GIYANTO dan TRI ASMIRA DAMAYANTI. AHL-lactonase is N-acyl homoserine lactone (AHL) degradative enzyme in quorum sensing (QS). Degradation of AHL can confuse intercell communication of bacterial pathogen which is known as quorum quenching (QQ) mechanism. QQ mechanism prevent the expression of bacterial pathogens virulence factors controlled by QS such as enzymes, toxins, and exopolisaccharides. AHLlactonase is produced by some bacteria, however the information related AHLlactonase producing bacteria and its biocontrol potential is still unexploited yet in Indonesia. Thus, the research aimed to screen, identify, cloning and expression of aiiA gene(s) encoding AHL-lactonase in Escherichia coli BL21 (DE3), and also to test their biocontrol potential ability of AHL-lactonase producing bacteria as anti-QS on Chromobacterium violaceum and Dickeya dadantii. The screening of AHL lactonase-producing bacteria was conducted using the anti-QS assay, antibiosis activity, and detection of aiiA gene encoding AHLlactonase by PCR using specific primer aiiA. Identification of bacteria was conducted by DNA sequencing of 16S rRNA gene. The aiiA gene was clone into TA-cloning vector pTZ57R/T and sequenced. The homology of aiiA nucleotide sequences were analyzed in compare with aiiA sequence on GenBank database. The aiiA gene was subclone into expression vector pET-28a on BamHI and SalI restriction site and expressed in E. coli BL21 (DE3). The expressed protein was analyzed by sodium dedocyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE). The protein was predicted by ExPaSy software. The biocontrol of either AHL-lactonase producing bacteria or E. coli BL21 (DE3) aiiA recombinant was tested against soft rot pathogen D. dadantii. The screening result showed that 21 among 31 tested isolates showed antiQS activity on C. violaceum, however 2 isolates namely B13 and EKK10 showed antibiosis activity. Further, isolates with anti-QS and non antibiosis characters were detected by PCR using specific primer of AHL-lactonase gene. Four among 19 isolates was positively having aiiA gene. Those isolates (in succession code B37, GG3, GG6, and BT2) were having ability to suppress the virulence of D. dadantii either on orchids or potato slices. It is indicate the potential of those bacteria as biocontrol agents by anti-QS mechanism. GG6 and BT2 isolates showed highest relative inhibition level on orchid and potato up to 55.2% and 36.7%, respectively. Nucleotide sequences of aiiA gene of four these isolates sized 753 bp. The aiiA gene and AiiA amino acid sequences of B37 (aiiAB37/AiiAB37), GG3 (aiiAGG3/AiiAGG3), GG6 (aiiAGG6/AiiAGG6), and BT2 (aiiABT2/AiiABT2) has highest homology with corresponding genes deposited in GenBank database. The structure of AiiA amino acid showed similarity with AHL-hidrolase conformation structure. The characteristic of all four AiiA sequences also had conserved amino acid region 103SHLHFDH109 and 166TPGHSPGH173 as typical character of metallo-beta-lactamase enzyme group. Prediction molecular weight of AiiAB37,

AiiAGG3, AiiAGG6, and AiiABT2 ranged from 28.096 kDa - 28.25 kDa. Protein analysis using SDS-PAGE showed that the expressed protein sized approximately 32 kDa, consisting of protein fusion of 3.8 kDa from pET-28a and 28 kDa from AiiA gene. However, the expression of AHL-lactonase protein needs further optimation. The aiiA gene in E. coli BL21 (DE3) recombinant cultured at temperature 37 oC with IPTG concentration 0.75 mM expressed in insoluble fraction (pellet) and not expressed in soluble fraction. The expressed E. coli BL21 (DE3) recombinant bacteria can inhibit quorum sensing of C. violaceum up to 34 mm in diameter. The recombinant able to suppressed the virulence of D. dadantii on potatoes up to 63.3%. Based on nucleotide sequences of 16S ribosomal RNA isolates B37 had highest homology with Brevibacillus brevis strain NBRC15304, GG3 and GG6 isolates as Bacillus cereus ATCC14579 and BT2 isolate as B. thuringiensis ATCC10792. B. brevis is never been reported as AHL-lactonase producing bacteria. All nucleotide sequences obtained from these researches were deposited on DDJB/EMBL/GenBank databases with accession number(s): LC055677, LC055679, LC055680, LC055678, LC055758, LC05576, LC055761, and LC055759. The ability of AHL-producing bacteria to suppress virulence of D. dadantii will be used as information about their potential as a biological control. These information gave knowledge on biological control mechanisms, other than antibiosis and competition. The results of the identification of these bacteria added information about the diversity of AHL-lactonase producing bacteria. In addition, aiiA genes encoding AHL-lactonase can be used as material genetic for the production of AHL-lactonase or genetic engineering of plants that are resistant from plant pathogenic bacteria infection. Key words: aiiA gene, Bacillus, quorum quenching, quorum sensing, soft rot

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

PENAPISAN, IDENTIFIKASI, UJI POTENSI AGENS HAYATI BAKTERI PENGHASIL AHL-LAKTONASE DAN EKSPRESINYA PADA Escherichia coli

SYAIFUL KHOIRI

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Fitopatologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Kikin Hamzah Mutaqin, MSi

Judul Tesis : Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli Nama : Syaiful Khoiri NIM : A352130011

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Dr Ir Giyanto, MSi Ketua

Dr Ir Tri Asmira Damayanti, MAgr Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Fitopatologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 13 April 2016

Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dengan judul Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli yang dilaksanakan pada bulan Oktober 2014 sampai Maret 2016 di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor. Penulis menyampaikan terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan beasiswa pendidikan pascasarjana dalam negeri (BPPDN) tahun 2013. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr Ir Giyanto, MSi dan Dr Ir Tri Asmira Damayanti, MAgr selaku komisi pembimbing, Dr Ir Kikin Hamzah Mutaqin, MSi sebagai penguji luar komisi pada ujian tesis, dan Prof Dr Ir Sri Hendrastuti Hidayat, MSc selaku ketua program studi Fitopatologi yang telah memberikan bimbingan, arahan, kritik dan saran yang sangat bermanfaat dalam penyusunan tesis ini. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada istri dan anak tercinta: Dita Megasari dan Nayaka Amirul Khoiri, kepada orang tua: Bapak Yusuf, Ibu Khuzaemah (alm.), Ibu Muslimah, Bapak Suprijanto dan Ibu Dyah Wiyati, serta saudara Eny Laili dan Diyan Maharani yang telah memberikan dukungan moral dan material sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini. Ucapan terima kasih tidak lupa penulis sampaikan kepada rekan-rekan Fitopatologi 2013, rekan-rekan Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, serta semua pihak yang telah membantu dalam penelitian ini. Semoga karya ilmiah ini dapat menambah informasi dalam ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi masyarakat. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan karya ilmiah ini. Kritik dan saran sangat penulis harapkan untuk perbaikan penelitian dan penyusunan karya ilmiah berikutnya.

Bogor, Juni 2016 Syaiful Khoiri

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL xvii DAFTAR GAMBAR xvii DAFTAR LAMPIRAN xviii 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Rumusan Masalah 2 Ruang Lingkup Penelitian 3 Tujuan Penelitian 4 Manfaat Penelitian 4 Hipotesis 4 2 TINJAUAN PUSTAKA 5 Quorum Sensing pada Bakteri Patogen Tumbuhan 5 Virulensi Bakteri Patogen Tumbuhan Dikendalikan oleh QS 6 Dickeya dadantii sebagai Bakteri Patogen Tumbuhan 6 AHL-laktonase sebagai Anti-QS (quencher) 7 Identifikasi Bakteri berdasarkan Sekuen Gen 16S ribosomal RNA 8 Biologi Molekuler dalam Proteksi Tanaman: Kloning dan Ekspresi Gen 10 3 BAHAN DAN METODE 12 Waktu dan Tempat Penelitian 12 Bahan dan Alat 12 Penapisan Bakteri Penghasil AHL-laktonase 12 Identifikasi Bakteri berdasarkan Analisis Kesejajaran Urutan Nukleotida Gen 16S rRNA 13 Uji Keefektifan Bakteri Penghasil AHL-laktonase dalam Menghambat Virulensi Bakteri D. dadantii 14 Kloning dan Analisis Sekuen Gen aiiA Penyandi AHL-laktonase 15 Sub-kloning dan Ekspresi Gen aiiA pada E. coli BL21 (DE3) 15 Analisis Protein AHL-laktonase dengan SDS-PAGE 17 Analisis fungsional E. coli BL21 (DE3) rekombinan pET-28a::aiiA 18 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 20 Penapisan Bakteri Penghasil AHL-laktonase 20 Identifikasi Bakteri Penghasil AHL-laktonase 21 23 Uji Virulensi D. dadantii pada Anggrek dan Kentang Uji Potensi AHL-laktonase sebagai Penghambat Virulensi D. dadantii secara In-vivo 23 Kloning dan Analisis gen aiiA 24 Sub-kloning dan Ekspresi Gen aiiA Penyandi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE3) 27 Analisis Protein dan Pendugaan Struktur Protein AHL-laktonase (AiiA) 29 Aktivitas Enzim AHL-laktonase dan Potensinya dalam Menghambat Virulensi D. dadantii 32

5 PEMBAHASAN UMUM 6 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP

35 37 37 37 38 45 68

DAFTAR TABEL 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Quorum sensing pada bakteri Gram negatif patogen tumbuhan Beberapa bakteri penghasil AHL-laktonase dan gen penyandinya Primer-primer yang dapat digunakan dalam amplifikasi gen 16S rRNA Komposisi bahan yang digunakan dalam SDS-PAGE Homologi sekuen gen 16S rRNA isolat B37, GG3, GG6, dan BT2 dengan sekuen 16S rRNA pada GenBank Analisis homologi sekuen gen aiiA Analisis homologi sekuen asam amino AiiA Diameter zona hambat ekspresi violacein C. violaceum oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA Tingkat hambatan relatif (THR) E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA terhadap perkembangan busuk lunak pada kentang yang disebabkan D. dadantii

6 8 9 18 22 26 26 33

34

DAFTAR GAMBAR 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

12

13

Alur pelaksanaan penelitian “Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli” Molekul AHL sebagai molekul sinyal utama dalam QS bakteri Gram negatif Mekanisme degradasi AHL oleh AHL-laktonase Peta bagian terkonservasi (berwarna ungu) dan bagian bervariasi (V1-V9) pada 16S rRNA Peta plasmid pTZ57R/T yang digunakan sebagai vektor kloning Peta plasmid pET-28a yang digunakan sebagai vektor ekspresi Hasil uji anti-QS dan antibiosis bakteri uji terhadap C. violaceum Visualisasi DNA hasil amplifikasi gen aiiA dari beberapa isolat yang diduga menghasilkan AHL-laktonase Gejala busuk lunak hasil uji virulensi D. dadantii pada anggrek (A) dan kentang (B) 48 jam setelah inokulasi Aktivitas penghambatan dan persentase penghambatan relatif busuk lunak oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek (A) dan kentang (B) Seleksi biru-putih hasil TA-kloning pTZ57R/T::aiiA pada E. coli DH5α pada media LB agar yang mengandung ampisilin, IPTG, dan X-gal Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli DH5α rekombinan yang telah ditransformasi dengan plasmid pTZ57R/T::aiiA hasil TAkloning Penyejajaran dua bagian terkonservasi AiiA isolat yang diperoleh (AiiAB37, AiiAGG3, AiiAGG6, AiiABT2) dibandingkan dengan AiiABS1 dari B. subtilis BS1 (DQ000640)

3 5 8 9 10 11 20 21 23

24

25

25

27

14

15 16

17

18 19

20

21 22

Visualisasi pita DNA hasil restriksi plasmid pET-28a dan pTZ57R/T::aiiA yang dipotong menggunakan enzmim BamHI dan SalI Hasil transformasi plasmid vektor ekpresi pada E. coli BL21 (DE3) Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli BL21 (DE3) rekombinan yang telah ditransformasi dengan plasmid pET-28a::aiiA menggunakan primer aiiA1 dan aiiA2 Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli BL21 (DE3) yang telah ditransformasi dengan plasmid pET-28a::aiiA menggunakan primer T7 promotor dan T7 terminator Struktur protein tersier AHL-laktonase berdasarkan urutan asam amino gen aiiA yang dibuat dengan perangkat lunak Swiss model Ekspektasi fusi protein pET-28a ( ) dengan gen aiiA ( ) yang terekspresi dari kodon start (ATG) pada pET-28a hingga kodon stop pada gen aiiA (TAG) (A) dan hasil analisis translasi sekuen pET28a::aiiAB37 (B) Hasil analisis protein AHL-laktonase dengan SDS-PAGE dari E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA dengan 0.75 µM IPTG pada suhu 37 oC Pengujian ekspresi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE3) terhadap QS C. violaceum Penekanan virulensi D. dadantii penyebab busuk lunak oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA

27 28

29

29 30

31

32 33 34

DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Daftar isolat bakteri yang digunakan dalam penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase Aktivitas degradasi AHL pada C. violaceum ditandai adanya zona hambat ungu Pengujian antibiosis dalam penapisan bakteri penghasil AHLlaktonase Sekuen gen 16S rRNA isolat B37 yang telah didepositkan di DDBJ Sekuen gen 16S rRNA isolat GG3 yang telah didepositkan di DDBJ Sekuen gen 16S rRNA isolat GG6 yang telah didepositkan di DDBJ Sekuen gen 16S rRNA isolat BT2 yang telah didepositkan di DDBJ Homologi sekuen 16S rRNA isolat B37 dengan Brevibacillus brevis Homologi sekuen 16S rRNA isolat GG3 dengan Bacillus cereus Homologi sekuen 16S rRNA isolat GG6 dengan B. cereus Homologi sekuen 16S rRNA isolat BT2 dengan B. thuringiensis Pengaruh perlakuan terhadap perkembangan gejala busuk lunak yang disebabkan oleh D. dadantii pada kentang dan anggrek(1) Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek dengan α=5%

46 47 47 48 49 50 51 52 53 54 55 57

57

14

15

16

17 18 19 20 21 22 23 24 25

Sidik ragam data penghambatan relatif busuk lunak yang disebabkan D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek dengan α=5% Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada kentang dengan α=5% Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada kentang dengan α=5% Sekuen gen aiiA dari isolat B37 yang telah didepositkan di DDBJ Sekuen gen aiiA dari isolat GG3 yang telah didepositkan di DDBJ Sekuen gen aiiA dari isolat GG6 yang telah didepositkan di DDBJ Sekuen gen aiiA dari isolat BT2 yang telah didepositkan di DDBJ Kesejajaran sekuen gen aiiA hasil sekuensing dari isolat B37, GG3, GG6, dan BT2 Analisis homologi asam amino AiiA dari isolat B37, GG3, GG6, dan BT2 Sidik ragam data diameter zona hambat violacein C. violaceum oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam Sidik ragam diameter busuk lunak pada kentang oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam Sidik ragam tingkat hambatan relatif busuk lunak pada kentang oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam

57

58

58 59 60 61 62 63 64 65 66 67

1 PENDAHULUAN Latar Belakang Bakteri patogen tumbuhan merupakan salah satu jenis patogen penting penyebab penyakit pada tumbuhan. Bakteri patogen tumbuhan terdiri atas mollicutes, bakteri Gram positif, dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif merupakan kelompok terbanyak penyebab penyakit tumbuhan, diantaranya genus Ralstonia, Xanthomonas, Agrobacterium, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Bucholderia, Acidovorax, Xylophilus, Xylella, dan Rhizomonas (Schaad et al. 2001). Faktor virulensi bakteri patogen tumbuhan yaitu enzim, toksin, dan eksopolisakarida (Prasannath 2013). Ekspresi faktor virulensi bakteri patogen tumbuhan dikendalikan oleh mekanisme quorum sensing (QS). QS merupakan mekanisme komunikasi antar sel bakteri Gram negatif pada level populasi tertentu yang diinduksi oleh molekul sinyal N-acyl homoserine lactone (AHL). AHL dengan konsentrasi yang tinggi dapat mengaktifkan transkripsi atau meregulasi protein regulator untuk menginduksi atau menekan ekspresi gen tertentu. QS terlibat dalam fungsi penting biologi, seperti luminescens, produksi antibiotik, transfer plasmid, motilitas, pembentukan biofilm, virulensi, dan regulasi ekspresi gen terkait patogenesis (De Kievit & Iglewski 2000). AHL telah diketahui berperan dalam aktivasi faktor virulensi bakteri patogen tumbuhan melalui mekanisme QS. Beberapa contoh bakteri yang mengekspresikan faktor virulensi melalui sistem QS diantaranya Xanthomonas campestris, Ralstonia solanacearum, Pseudomonas aeruginosa, Pectobacterium antrosepticum, Pantoea stewartii dan kelompok Erwinia (Von Bodman & Farrand 1995; Barber et al. 1997; Dong et al. 2000; Conway & Greenberg 2002; Burr et al. 2006). Pengendalian hayati bakteri patogen tumbuhan meliputi beberapa mekanisme diantaranya yaitu antibiosis, kompetisi, dan penghambatan mekanisme virulensi. Penghambatan virulensi salah satunya dapat dilakukan dengan mengganggu sistem QS. Terkait hal tersebut pada beberapa penelitian telah melaporkan bahwa AHL dapat terdegradasi oleh enzim. Enzim pendegradasi AHL telah diidentifikasi dari beberapa bakteri dan memiliki kemampuan sebagai antiQS, salah satunya yaitu acyl homoserine lactone-lactonase (AHL-laktonase) (Yin et al. 2010). AHL-laktonase merupakan metallo-beta-lactamase (metalloenzyme) yang menon-aktifkan AHL dengan mendegradasi cincin ester laktone pada AHL. Degradasi cincin laktone tersebut dapat mencegah pengenalan oleh protein regulator sehingga menghambat mekanisme QS. Proses penghambatan QS dikenal dengan mekanisme quorum quenching (QQ) (Dong et al. 2001). Enzim AHL-laktonase dikodekan oleh gen tertentu, seperti aiiA yang ditemukan pada Bacillus spp., B. weihenstephanensis strain P65 (Dong et al. 2000; Sakr et al. 2013). Potensi pemanfaatan AHL-laktonase sebagai salah satu alternatif pengendalian bakteri patogen yang lebih aman dan tidak menimbulkan resistensi dibandingkan dengan penggunaan antibiotik. Penggunaan antibiotik terus menerus dapat menyebabkan munculnya generasi patogen yang lebih resisten terhadap antibiotik karena adanya tekanan seleksi (White & Finan 2009). Beberapa penelitian telah melaporkan keefektifan AHL-laktonase dalam menekan virulensi

2 bakteri patogen, diantaranya yaitu kemampuan menekan virulensi Erwinia carotovora, Pseudomonas aureginosa, dan Aeromonas hydrophila (Bainton et al. 1992; Dong & Zhang 2005; Zhang et al. 2007; Chen et al. 2010). Proses seleksi bakteri penghasil AHL-laktonase dapat dilakukan dengan menggunakan Chromobacterium violaceum karena bakteri ini diketahui menghasilkan violacein yang berwarna ungu melalui mekanisme QS (McClean et al. 1997). Bakteri patogen tumbuhan yang digunakan sebagai bakteri uji adalah Dickeya dadantii (syn. Erwinia chrysanthemi). D. dadantii merupakan salah satu patogen pektinolitik penyebab penyakit busuk lunak. Kisaran inang sangat luas seperti kentang, anggrek, wortel, bawang putih, ubi jalar, dan lain-lain (Perombelon & Kelman 1980; Ma et al. 2007). Di Indonesia, penyebaran D. dadantii masih terbatas, dan termasuk kelompok patogen karantina golongan A2 (Kementan 2011). Tahun 2012 D. dadantii dilaporkan menyebabkan penyakit busuk lunak pada anggrek di Jakarta dan Jawa Barat dengan kejadian penyakit mencapai 100% dan keparahan mencapai 95.15% (Muharam et al. 2012). Pada tahun 2015, Kementan menggolongkan D. dadantii ke dalam OPTK A1 (Kementan 2015), karena hasil karakterisasi bakteri penyebab busuk lunak pada kentang yang ada di Indonesia berbeda dengan D. dadantii (Haerani et al. 2015). D. dadantii diketahui mengekspresikan pektat lyase sebagai faktor virulensi melalui mekanisme QS dengan 3-oxo-C6HSL atau C6HSL sebagai sinyal yang berinteraksi dengan ExpI/ExpR sebagai protein regulator (Nasser et al. 1998). Dalam bidang proteksi tanaman, agens hayati yang digunakan umumnya bersifat antibiosis dan kompetisi sedangkan penghambatan QS belum banyak dilaporkan. Perlu dilakukan penelitian untuk menyeleksi, mengidentifikasi, dan menguji kemampuan bakteri penghasil laktonase sebagai agens hayati dalam menghambat ekspresi virulensi bakteri patogen tumbuhan D. dadantii, serta kloning dan ekspresi gen penyandi AHL-laktonase. Rumusan Masalah Bakteri patogen tumbuhan kelompok Gram negatif umumnya memiliki sistem QS dalam memantau kerapatan populasi dan mensintesis protein dari gen tertentu termasuk faktor virulensi. QS diregulasi oleh molekul AHL. Beberapa penelitian telah dilakukan dan diketahui mampu mendegradasi AHL, salah satunya yaitu AHL-laktonase. Degradasi AHL dapat mengganggu proses transfer sinyal QS sehingga dapat menyebabkan ekspresi gen virulensi bakteri patogen tumbuhan tidak terjadi. Berdasarkan informasi tersebut, maka perlu adanya penelitian tentang bakteri penghasil AHL-laktonase, isolasi, ekspresi, analisis sekuen gen penyandi AHL-laktonase, dan pengaruh penekanan terhadap virulensi bakteri patogen tumbuhan. Pengujian aktivitas AHL-laktonase terhadap degradasi AHL menggunakan D. dadantii sebagai model karena telah diketahui bahwa faktor virulensi berupa enzim pectat lyase dikendalikan oleh sistem QS.

3 Ruang Lingkup Penelitian Lingkup penelitian ini meliputi penapisan dan identifikasi isolat-isolat bakteri penghasil AHL-laktonase, isolasi dan karakterisasi gen penyandi AHLlaktonase, kloning dan ekspresi gen AHL-laktonase, analisis protein AHLlaktonase dengan SDS-PAGE, serta uji penekanan virulensi D. dadantii oleh AHL-laktonase. Adapun alur penelitian ini tersaji pada Gambar 1.

Peremajaan isolat bakteri koleksi

  

Penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase: Bioassay anti-QS Bioassay antibiosis Deteksi gen aiiA

Identifikasi bakteri penghasil AHL-laktonase berdasarkan homologi sekuen 16S rRNA

Uji potensi AHL-laktonase sebagai anti-QS

Ekstrak kasar AHL-laktonase dari supernatan bakteri penghasil AHL-laktonase

   

Protein AHL-laktonase dari Kloning dan ekspresi gen aiiA pada E. coli BL21 (DE3)

Diperoleh isolat bakteri penghasil AHL-laktonase Diperoleh gen penyandi AHL-laktonase dan runutan sekuennya Informasi potensi penghambatan virulensi oleh AHL-laktonase Publikasi ilmiah = persiapan

Gambar 1

= proses

= tujuan akhir

Alur pelaksanaan penelitian “Penapisan, Identifikasi, Uji Potensi Agens Hayati Bakteri Penghasil AHL-laktonase dan Ekspresinya pada Escherichia coli”

4 Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini yaitu: 1) Memperoleh isolat dan identitas bakteri penghasil AHL-laktonase. 2) Memperoleh gen penyandi AHL-laktonase dan hasil analisis sekuen nukelotidanya. 3) Mengetahui tingkat penekanan AHL-laktonase terhadap virulensi D. dadantii. Manfaat Penelitian Manfaat penelitian ini diantaranya: 1) Diperoleh isolat-isolat bakteri penghasil AHL-laktonase. 2) Diperoleh gen dan hasil analisis sekuen nukleotida gen penyandi AHLlaktonase. 3) Diperoleh informasi tentang kemampuan penekanan virulensi bakteri patogen tumbuhan oleh AHL-laktonase. Hipotesis 1) 2) 3) 4)

Hipotesis penelitian ini yaitu: Terdapat keanekaragaman bakteri-bakteri penghasil AHL-laktonase. Gen penyandi AHL-laktonase dari isolat-isolat uji dapat diamplifikasi dan dianalisis sekuen nukleotidanya. Kloning dan ekpresi gen penyandi AHL-laktonase dapat dilakukan pada E. coli AHL-laktonase dapat menghambat QS dan menekan virulensi D. dadantii penyebab busuk lunak.

5

2 TINJAUAN PUSTAKA Quorum Sensing pada Bakteri Patogen Tumbuhan Quorum sensing (QS) merupakan komunikasi antar sel untuk meningkatkan atau menekan ekspresi gen dalam merespon fluktuasi kerapatan populasi sel. QS pada bakteri menghasilkan dan melepaskan molekul sinyal kimia yang disebut autoinducer yang meningkat seiring peningkatan kerapatan populasi sel (Kaplan & Greenberg 1985). Beberapa penelitian melaporkan bahwa terdapat ambang batas minimal konsentrasi autoinducer yang dapat memicu ekspresi gen tertentu. Bakteri Gram positif dan Gram negatif menggunakan QS untuk meregulasi aktifitas fisiologi tertentu, diantaranya simbiosis, virulensi, kompetensi, konjugasi, produksi antibiotik, motilitas, sporulasi, dan pembentukan biofilm. Umumnya bakteri Gram negatif menggunakan N-acylated homoserine lactone (AHL) sebagai autoinducer, sedangkan bakteri Gram positif menggunakan oligo-peptida. Namun demikian secara alami sinyal kimia, mekanisme penyampaian sinyal, dan gen target yang dikendalikan sistem QS berbeda untuk tiap spesies (Miller & Bassler 2001). Sistem QS yang menggunakan AHL sebagai autoinducer telah dipelajari dari banyak bakteri Gram negatif, diantaranya yaitu pada genus Agrobacterium, Aeromonas, Burkholderia, Chromobacterium, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Hafnia, Nitrosomonas, Obesumbacterium, Pantoea, Pseudomonas, Rahnella, Ralstonia, Rhodobacter, Rhizobium, Serratia, Vibrio, Xenorhabdus, dan Yersinia. Diantara bakteri Gram negatif tersebut, banyak studi sistem QS merupakan sistem homologi LuxR-LuxI dan kesamaan sinyal molekulnya adalah N-acyl homoserine lactone (AHL), dan pertama dipelajari pada bakteri Vibrio fischeri (Kempner & Hanson 1968) Mayoritas sistem QS pada bakteri Gram negatif memanfaatkan AHL sebagai molekul sinyal. Saat konsentrasi cukup tingi, molekul AHL dapat mengikat dan mengaktifkan aktivator transkripsi, atau R protein yang menginduksi ekspresi gen target. Meskipun R protein sangat sensitif terhadap kesesuaian AHL, namun sebagian R protein mampu merespon beberapa molekul AHL atau AHL turunan dengan konsentrasi tinggi untuk aktivasi (De Kievit & Iglewski 2000). Molekul AHL terdiri atas cincin laktone dan rantai R-acyl (Gambar 2).

Gambar 2 Molekul AHL sebagai molekul sinyal utama dalam QS bakteri Gram negatif

6 Virulensi Bakteri Patogen Tumbuhan Dikendalikan oleh QS Beberapa virulensi bakteri patogen tumbuhan telah diketahui melibatkan sistem QS. Beberapa contoh yaitu Ralstonia solanacearum penyebab penyakit layu menghasilkan 3-hydroxy-palmitic acid methyl ester sebagai molekul sinyal yang bersamaan dengan AHL digunakan untuk meregulasi faktor virulensi (Flavier et al. 1997a). Xanthomonas campestris sebagai patogen pada kubis menghasilkan faktor ekstraseluler yang bersifat dapat berdifusi, namun senyawa tersebut belum terkarakterisasi (Barber et al. 1997). von Bodman et al. (2003) mengkaji mekanisme komplek dari QS pada bakteri patogen tumbuhan yang mengontrol gen patogenisitas dan kolonisasi pada permukaan inang. Regulasi oleh QS meliputi produksi ekstraseluler polisakarida, enzim pendegradasi, antibiotik, siderofor, pigmen, protein Hrp, transfer Tiplasmid, motilitas, pembentukan biofilm, dan kemampuan epifit. Sejak diketahui sistem regulasi QS dibutuhkan dalam patogenesis, gangguan pada sinyal QS menjadi peluang dalam mengendalikan penyakit yang disebabkan oleh bakteri. Beberapa bakteri penting patogen tumbuhan yang dikaji yaitu: A. tumefaciens, P. stewartii, E. carotovora, R. solanacearum, P. syringae, P. aeruginosa, dan X. campestris. Beberapa contoh bakteri patogen tumbuhan kelompok Gram negatif yang telah dilaporkan menghasilkan molekul AHL sebagai sinyal QS untuk meregulasi faktor virulensi tersaji dalam Tabel 1. Tabel 1 Quorum sensing pada bakteri Gram negatif patogen tumbuhan Organisme

Molekul Sinyal Utama

Protein Regulator

A. tumefaciens

3-Oxo-C8-HSL TraI/TraR

E. carotovora subsp. carotovora

3-Oxo-C6-HSL ExpI/ExpR CarI/CarR

E. chrysanthemi

Pectat lyase

E. stewartii

3-Oxo-C6-HSL ExpI/ExpR C6-HSL 3-Oxo-C6-HSL EsaI/EsaR

R. solanacearum

C8-HSL

Belum diketahui

P. antrosepticum

3-Oxo-C6-HSL ExpI/ExpR

SolI/SolR

Fenotip

Referensi

Konjugasi Tiplasmid Eksoenzim Carbapenem Antibiotik

Piper et al. (1993) Bainton et al. (1992); Chhabra et al. (1993) Nasser et al. (1998) Von Bodman & Farrand (1995) Flavier et al. (1997b) Burr et al. (2006)

Eksopolisakarida Faktor virulensi

Eksoenzim Faktor virulensi

Dickeya dadantii sebagai Bakteri Patogen Tumbuhan Dickea dadantii (syn. Erwinia chrysanthemi) merupakan kelompok bakteri Gram negatif, berbentuk batang, dan termasuk ke dalam famili Enterobacteriaceae. Secara taksonomi, D. dadantii sebelumnya merupakan kelompok genus Erwinia. Erwinia dipisahkan kedalam beberapa kelompok yaitu pektinolitik “carotovora”, berpigmen kuning “herbicola”, non-pektinolitik penyebab layu “amylovora”, dan

7 “atypical” Erwinia (Dye 1968; 1969). Berdasarkan kesamaan sekuen 16S rRNA, Erwinia dibagi kedalam empat genus yaitu Pectobacterium, Pantoea, Erwinia, dan Brenneria (Hauben et al. 1998). Menurut Schaad et al. (2001) taksonomi Erwinia masih dapat berubah dan deskripsi tiap genus masih terbatas. Samson et al. (2005) mengklasifikasi ulang E. chrysanthemi menjadi genus Dickeya. D. dadantii berasal dari E. chrysanthemi biovar 3 (Elphinstone & Toth 2007). Secara umum D. dadantii bersifat anaerob fakultatif, menghasilkan nitrat reduktase, motil, sel berukuran 0.8-3.2x0.5-0.8 μm dan mempunyai flagel tipe peritrichus. Di alam, D. dadantii menyebabkan penyakit pada tumbuhan dengan gejala yang ditimbulkan berupa nekrosis, hawar, atau busuk lunak yang ditandai dengan maserasi jaringan. D. dadantii mengandung banyak pektinase yang mampu melunakkan dan memecah material dinding sel. Bagian tumbuhan yang terpapar enzim pektinolitik melepaskan nutrisi yang dimanfaatkan untuk pertumbuhan bakteri. Beberapa tumbuhan yang terinfeksi diantaranya umbi kentang, buahbuahan, tanaman hias (Van Vaerenbergh et al. 2012) dan busuk hati pada nanas (Kaneshiro et al. 2008). D. dadantii menyebabkan penyakit busuk lunak pada banyak inang termasuk beberapa tanaman penting secara ekonomi. D. dadantii lebih dikenal dengan penyakit busuk lunak, busuk coklat, atau busuk hitam. Patogen ini berhasil masuk ke dalam jaringan inang karena banyaknya pektinase yang digunakan untuk mendegradasi dinding sel. Degradasi dinding sel menyebabkan kerusakan struktur jaringan dan maserasi jaringan yang menunjukkan gejala seperti tersiram air panas atau water soaked (Grenier et al. 2006). Kemampuan ekspresi pektinase pada D. dadantii melibatkan sistem QS yang melibatkan AHL. D. dadantii strain 3937 membuat tiga AHL yang berbeda yaitu 3-oxo C6HL, C6HL, dan C10HL yang mengikat regulator gen expI dan expR. Perusakan expI atau expR hanya mempunyai efek sangat sedikit dalam produksi enzim pektolitik secara invitro, dibandingkan dengan tanpa adanya AHL. AHL berperan sebagai sinyal dalam sistem QS untuk regulasi sintesis pektinase sebagai faktor virulensi. Oleh karena itu, D. dadantii dijadikan model dalam mempelajari sistem quorum sensing misalnya untuk pengujian senyawa atau enzim pendegradasi AHL (Nasser et al. 1998). AHL-laktonase sebagai Anti-QS (quencher) Potensi degradasi sinyal QS dalam mikrobiologi penting dipelajari karena beberapa alasan. Sejak AHL diketahui sebagai sinyal dalam mekanisme QS pada banyak bakteri patogen tumbuhan, studi pengendalian dengan target AHL menjadi bagian yang menarik dipelajari (Studier et al. 1990). Bakteri lain yang hidup pada habitat yang sama dengan bakteri penghasil AHL akan mampu berkompetisi dengan cara mendegradasai molekul sinyal AHL bakteri lain. Enzim yang mendegradasi AHL dapat digunakan untuk memanipulasi sistem sinyal antar sel. AHL diketahui stabil pada kondisi asam namun tidak stabil pada kondisi basa (Yates et al. 2002). Sejak diketahui AHL stabil pada kondisi asam, degradasi AHL mempunyai peranan penting pada lingkungan, seperti tanah. Dua tipe enzim pendegradasi AHL telah dilaporkan, yaitu AHL-laktonase (Dong et al. 2001) dan AHL-acylase (Lin et al. 2003). Senyawa penghambat QS disebut quencher.

8 Beberapa bakteri penghasil enzim pendegradasi AHL telah dilaporkan, seperti tersaji pada Tabel 2 (Dong & Zhang 2005). Tabel 2 Beberapa bakteri penghasil AHL-laktonase dan gen penyandinya Spesies

Gen

Enzim

Bacillus sp. 240B1 B. thuringiensis B. cereus B. mycoides B. antrachis A.tumefaciens Arthobacter sp. IBN110 Kleibsiella pneumonia Variovorax paradoxus VAI-C Ralstonia strain XJ12B Pseudomonas strain PAI-A, P. aureginosa PAO1

aiiA aiiA aiiA aiiA aiiA aiiA attM, aiiB ahlD ahlK ND aiiD

AHL-laktonase AHL-laktonase AHL-laktonase AHL-laktonase AHL-laktonase AHL-laktonase AHL-laktonase AHL-laktonase AHL-acylase AHL-acylase AHL-acylase

AHL-laktonase merupakan metallo-beta-lactamase (metalloenzim) yang menginaktivasi AHL. Metalloenzim merupakan salah satu senyawa yang mempunyai kofaktor besi. Mekanisme degradasi AHL oleh enzim AHL-laktonase yaitu dengan memecah cincin ester pada ikatan cincin laktone dari AHL (Dong et al. 2000; Leadbetter 2001; Czajkowski & Jafra 2009) (Gambar 3). Salah satu contoh AHL-laktonase yang telah dideskripsikan dan dikarakterisasi dengan baik adalah AiiA24B1 yang merupakan produk dari aiiA gen dari Bacillus sp 24B1 (Dong et al. 2000). Pan et al. (2008) melaporkan AHLlaktonase yang diproduksi oleh Bacillus thuringiensis, B. cereus and B. anthracis, spesifik menghidrolisis AHL yang disekresikan bakteri Gram negatif dan dapat berpengaruh terhadap perkembangan penyakit yang disebabkan oleh bakteri patogen.

Gambar 3 Mekanisme degradasi AHL oleh AHL-laktonase Identifikasi Bakteri berdasarkan Sekuen Gen 16S ribosomal RNA Ribosom merupakan organel sel yang digunakan untuk translasi protein. Ribosom terdiri atas dua bagian utama, yaitu subunit ribosom besar (large subunit ribosome) dan sub-unit ribosom kecil (small sub-unit ribosome), yang berikatan dengan asam amino. Masing-masing sub-unit terdiri atas satu atau lebih molekul ribosomal RNA (rRNA) dan protein yang berbeda (Jones et al. 2003).

9 Prokariot (bakteria dan archaea) memiliki 70S ribosom, yang terdiri atas subunit kecil 30S dan subunit besar 50S. Sub-unit kecil dikodekan oleh gen 16S rRNA (1540 nukleotida). Gen 16S rRNA saat ini digunakan sebagai cara untuk mengidentifikasi bakteri dengan beberapa alasan, diantaranya: (1) analisis berdasarkan DNA organisme lebih terpercaya dibandingkan identifkasi berdasarkan fenotip, (2) 16S rRNA spesifik untuk prokariot, (3) 16S rRNA relative pendek sekitar 1.5 kb sehingga cepat dan dan murah dibandingkan dengan gen lain, (4) gen 16S rRNA mempunyai bagian terkonservasi, daerah variasi, dan tidak mudah mengalami perubahan, dan (5) banyak informasi sekuen gen 16S rRNA yang telah didepositkan pada database untuk memudahkan pembandingan (Smit et al. 2007; Mizrahi-Man et al. 2013; LBL 2016). Perunutan nukleotida 16S rRNA sebagai metode identifikasi telah dilakukan cukup lama, salah satunya oleh Woese (1987) untuk mempelajari evolusi bakteri. Saat ini 16S rRNA digunakan sebagai penanda molekuler untuk prokariot. Gen 16S rRNA berukuran sekitar 1 500 pb. Meskipun semua prokariot mempunyai gen 16S rRNA, namun gen 16S rRNA memiliki 9 bagian dengan urutan nukleotida yang bervariasi (Gambar 4). Hal ini dapat digunakan sebagai dasar pembeda antar spesies (Mitchell 2014).

5’

3’

Gambar 4 Peta bagian terkonservasi (berwarna ungu) dan bagian bervariasi (V1-V9) pada 16S rRNA Secara umum, pemanfaatan sekuen 16S rRNA dalam identifikasi spesies menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan identifikasi secara konvensional. Keberhasilan identifikasi menggunakan sekuen 16S rRNA dilaporkan dapat mengidentifikasi bakteri ingga 92% (Woo et al. 2008). Sekuen 16S rRNA mampu mengidentifikasi bakteri yang sulit diidentifikasi dengan metode konvensional yakni mencapai >90% mampu mengidentifikasi hingga genus dan 68-83% hingga spesies (Drancourt et al. 2000; Mignard & Flandrois 2006). Amplifikasi gen 16S rRNA mudah dilakukan dengan sepasang primer dapat mengamplifikasi secara penuh dari berbagai jenis bakteri (Weisburg et al. 1991). Telah tersedia banyak primer yang dapat mengamplifikasi gen 16S rRNA. Beberapa pasang primer tersaji pada Tabel 3. Tabel 3 Primer-primer yang dapat digunakan dalam amplifikasi gen 16S rRNA No. Primer

Urutan Nukleotida (5’-3’)

Referensi

1

AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG AAG GAG GTG ATC CAG CC AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG ACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T

Weisburg et al. (1991)

2 3 4

fD1 rD1 8F U1492R 928F 336R 27F 1492R

Eden et al. (1991) Weidner et al. (1996) Jiang et al. (2006)

10 Biologi Molekuler dalam Proteksi Tanaman: Kloning dan Ekspresi Gen Perkembangan teknologi rekayasa genetika dapat menjadi salah satu pengembangan teknologi pengendalian penyakit tumbuhan. Rekayasa genetik tanaman telah memberikan manfaat yang besar antara lain dengan dihasilkannya varietas-varietas unggul tahan terhadap OPT melalui transfer gen atau tanaman transgenik yang dikenal sebagai genetically modified organism (GMO), contohnya GMO dengan menggunakan gen cryI mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap hama (Romeis et al. 2006), gen kitinase mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap cendawan (Neuhaus et al. 1991), dan komplemen gen coat protein virus dengan teknologi RNAi mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap infeksi virus (Tenllado & Llave 2004). Proses rekayasa genetik secara umum meliputi isolasi DNA, karakterisasi DNA, penyambungan pada vektor pembawa, karakterisasi protein hasil ekspresi gen, transformasi pada organisme sasaran, dan evaluasi ekspresi gen. Adapun dasar-dasar pengetahuan tentang gen telah dijabarkan oleh banyak peneliti, salah satunya Lewin (1983). Informasi tentang rekayasa genetik, meliputi teknik isolasi DNA, isolasi plasmid, pemilihan vektor kloning, pemilihan vektor ekspresi, pemilihan enzim restriksi, teknik ligase, dan transformasi gen mengacu pada Sambrook & Russell (2001). Saat ini perkembangan kit kloning sangat beragam, salah satunya adalah pZT57R/T InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo Scientific). Plasmid pTZ57R/T sebagai vektor kloning mempunyai kemampuan dalam ligasi dengan mekanisme TA-cloning dengan cara plasmid pTZ57R/T meligasi 3’-ddT pada 3’-ddA overhang di kedua sisi produk PCR. Seleksi hasil kloning E. coli rekombinan dapat dilakukan dengan seleksi biru-putih pada media LB yang mengandung isopropyl-β–D-thiogalactopyranoside (IPTG) dan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galactopyranoside (X-gal) karena plasmid pTZ57R/T memiliki gen lacZ yang dapat digunakan sebagai seleksi, serta dapat dikonfirmasi dengan PCR menggunakan primer M13/pUC forward dan M13/pUC reverse (Gambar 5).

Gambar 5 Peta plasmid pTZ57R/T yang digunakan sebagai vektor kloning

11 Vektor ekspresi yang dipilih adalah plasmid pET-28a. pET-28a dipilih karena mempunyai promotor T7, lac operator, thrombin site, ribosomal binding site (rbs) dan banyak situs pemotongan enzim restriksi diantara situs kloning (multiple cloning site/MCS), mempunyai gen resistensi kanamisin untuk seleksi, dan kemampuan ekspresi yang tinggi dengan diinduksi IPTG (Gambar 6). Promotor merupakan situs untuk mengawali transkripsi (the site for initiating transcription) Lewin (1983). Ekpresi gen pada plasmid pET-28a dilakukan dengan menggunakan E. coli BL21 (DE3) (BioDynamic laboratory Inc.). E. coli BL21 (DE3) mempunyai kemampuan ekspresi yang tinggi, diinduksi dengan IPTG. Di dalam genom E. coli BL21 (DE3) terdapat non-native RNA polymerase (RNAP) yang dapat mengontrol transkripsi DNA eksogenus. IPTG yang ditambahkan pada media dalam ekspresi mengikat lac repressor. Contoh penggunaan pTZ57R/T dan E. coli BL21 (DE3) berhasil dilakukan oleh Halami & Chandrashekar (2007) untuk kloning dan ekspresi pediocin 6XHis-Xpress-PedA, sedangkan contoh keberhasilan kloning dan ekspresi gen aiiA telah berhasil dilakukan dengan menggunakan plasmid pPIC9 pada Pichia pastoris (Chen et al. 2010) dan menggunakan plasmid pGEX pada E. coli BL21 (Pan et al. 2008).

Gambar 6 Peta plasmid pET-28a yang digunakan sebagai vektor ekspresi

12

3 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai Oktober 2014 hingga Maret 2016. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini yaitu D. dadantii, C. violaceum, Escherichia coli DH5α, E. coli BL21 (DE3) dan 31 isolat bakteri Gram positif koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Institut Pertanian Bogor, Indonesia (Lampiran 1). Plasmid yang digunakan yaitu plasmid pTZ57R/T (InsTAclone Thermo Scientific), plasmid pET-28a (Novagen), enzim restriksi BamHI dan SalI (Thermo Scientific), HiYield Gel/PCR fragment extraction kit (Real Biotech corp.). Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen laktonase yaitu primer forward aiiA1 5'-ATG ACA GTA AAR AAR CTT TAT TTC-3' dan primer reverse aiiA2 5'-TCA CTA TAT ATA YTC MGG GAA CTC3 (Pan et al. 2008). Primer yang telah ditambah dengan enzim restriksi yaitu aiiAF1 5’-CGC GGA TCC ATG ACA GTA AAR AAR CTT TAT TTC-3 (nukleotida yang digarisbawahi merupakan situs restriksi enzim BamHI) dan aiiA-R1, 5-AGC GGT CGA CTC ACT ATA TAT AYT CMG GGA ACT C-3 (nukleotida yang digarisbawahi merupakan situs restriksi enzim SalI). PCR koloni untuk memperoleh sekuen gen aiiA lengkap digunakan primer forward M13 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’ dan primer reverse M13 5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’. Identifikasi bakteri berdasarkan gen 16S rRNA. Amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan dua primer yaitu primer forward 27F 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′ dan primer reverse 1492R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’ (Jiang et al. 2006). Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu mesin PCR Thermocycle (Applied Biosystem), spektrofotometer Spectronic 20D+ (Thermo Spectronic), mesin sentrifugasi Micro 200R (Hettich Zentrifugen), mesin gel electrophoresis (MyRun.NC), SDS-PAGE Electrophoresis (Biorad), dan UV-transilluminator (Ultra.Lum). Penapisan Bakteri Penghasil AHL-laktonase Bio-assay aktivitas anti-QS terhadap C. violaceum Pengujian ini dilakukan untuk melihat penghambatan ekspresi violacein dari bakteri C. violaceum yang diinduksi oleh AHL. Pengujian dilakukan dengan metode disc diffusion assay dengan teknik double layer culture plate sesuai Song et al. (2012) dengan modifikasi. Media LB agar (1.5%) dituang pada cawan petri steril dan didiamkan hingga mengeras, kemudian diatasnya dituang media LB agar (0.5%) yang telah diinokulasi dengan C. violaceum 1% (v/v). Selanjutnya kertas saring steril (diameter 6 mm) direndam dalam supernatan bakteri uji selama

13 20 detik kemudian diletakkan di permukaan agar. Supernatan bakteri uji diperoleh dengan cara disentrifugasi 1.5 ml biakan bakteri pada kecepatan 12 000 rpm selama 10 menit dan disaring menggunakan milipore 0.2 µm (Minisart, Sartorius Stediem Biotech, Germany). Selanjutnya perlakuan diinkubasi pada suhu ruang selama semalam. Penghambatan QS ditandai dengan adanya zona penghambatan produksi violacein disekitar kertas saring. Zona penghambatan produksi violacein ditunjukkan dengan tidak adanya warna ungu. Penghambatan QS terhadap C. violaceum diukur berdasarkan diameter zona penghambatan produksi violacein yang terbentuk. Bio-assay aktivitas antibiosis terhadap C. violaceum Pengujian antibiosis bertujuan untuk memastikan bahwa zona penghambatan produksi violacein yang terbentuk pada pengujian anti-QS terhadap C. violaceum merupakan penghambatan QS, maka dilakukan pengujian aktivitas anti-mikroba (antibiosis) mengikuti metode Song et al. (2012). Sebanyak 6 mL LB diinokulasi dengan C. violaceum OD600=0.05. Sebanyak 50 µL supernatan ditambahkan ke dalam tabung yang berisi C. violaceum OD600=0.05. Kontrol positif menggunakan antibiotik kanamisin 25 mg mL-1 dan kontrol negatif menggunakan LB steril. Tabung diinkubasi selama 12 jam pada suhu 30 oC. Nilai absorbansi untuk mengetahui pertumbuhan bakteri diukur dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 600 nm. Deteksi gen penyandi AHL-laktonase (gen aiiA) Deteksi gen penyandi AHL-laktonase diawali dengan ekstraksi DNA total bakteri. Ekstraksi DNA total bakteri menggunakan DNA Extraction kit (Geneaid). Amplifikasi gen laktonase dilakukan menggunakan primer forward aiiA1 dan primer reverse aiiA2. Komposisi PCR per reaksi meliputi: 1 µL Primer aiiA1 20 pmol, 1 µL primer aiiA2 20 pmol, 12.5 µL PCR ready mix (DreamTaq 2X, Thermo Scientific), 9.5 µL air bebas nuklease, dan 1 µL DNA cetakan (template). Kondisi PCR yang digunakan yaitu pre-denaturation pada suhu 94 oC selama 5 menit, denaturation pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 55 oC selama 1.5 menit, extention pada suhu 72 oC selama 2 menit (diulang 30 siklus), dan final extention akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% pada tegangan 75 volt selama 45 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan UV transilluminator Sambrook et al. (1989). Identifikasi Bakteri berdasarkan Analisis Kesejajaran Urutan Nukleotida Gen 16S rRNA Ekstraksi DNA dan amplifikasi gen 16S rRNA Ekstraksi DNA total menggunakan GeneJet DNA Extraction kit (Thermo Scientific). Amplifikasi gen 16S rRNA dari genom bakteri menggunakan primer universal dengan teknik PCR. Primer yang digunakan yaitu primer forward 27F dan primer reverse 1492R (Jiang et al. 2006). Komposisi PCR per reaksi meliputi: 1 µL primer 27F 20 pmol, 1 µL primer 1492R 20 pmol, 12.5 µL PCR ready mix (DreamTaq 2X, Thermo Scientific), 9.5 µL air bebas nuklease, dan 1 µL DNA cetakan (template). Kondisi PCR meliputi pre-denaturation pada suhu 94 oC selama 3 menit, denaturation pada suhu 94 oC selama 30 detik, annealing pada suhu 57 oC selama 30 detik, extention pada suhu 72 oC selama 1.5 menit (diulang

14 30 siklus), dan final extension pada suhu 72 oC selama 10 menit. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% dan diamati dengan UV transilluminator (Sambrook et al. 1989). Perunutan nuklotida dan analisis kesejajaran gen 16S rRNA Hasil amplifikasi gen 16S rRNA tiap isolat yang diperoleh selanjutnya dikirim ke 1st Base Asia untuk perunutan urutan nukleotida. Hasil sekuensing yang diperoleh kemudian dibandingkan dengan sekuen yang tersedia pada NCBI GenBank Database dengan software Basic Local Allignment Search Tools (BLAST) (Zhang et al. 2000). Uji Keefektifan Bakteri Penghasil AHL-laktonase dalam Menghambat Virulensi Bakteri D. dadantii Pengujian pada anggrek Isolat yang terdeteksi menghasilkan AHL-laktonase selanjutnya diuji kemampuannya dalam menekan virulensi D. dadantii. Pengujian penekanan virulensi D. dadantii dilakukan pada anggrek (Phalaenopsis sp. Hibrida MP-152). Supernatan isolat uji ditambah dengan 0.1X volume D. dadantii OD600=0.5. Sebanyak 25 µL dari campuran tersebut disuntikkan pada bagian bawah daun anggrek. Perlakuan kontrol menggunakan supernatan E. coli DH5α. Tanaman anggrek yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter busuk lunak yang terbentuk. Pengujian pada potongan kentang Pengujian aktivitas AHL-laktonase terhadap D. dadantii juga dilakukan pada kentang menggunakan metode Dong et al. (2004) yang telah dimodifikasi. Kentang disterilisasi permukaan menggunakan etanol 70% selama 1 menit dan dibilas dengan air steril. Kentang dipotong dan dilukai 6 mm pada bagian tengah. Supernatan isolat uji ditambahkan 0.1X volume D. dadantii OD600=0.5. Potongan kentang selanjutnya ditetesi dengan 20 µL campuran suspensi D. dadantii dan supernatan isolat uji. Perlakuan kontrol menggunakan supernatan E. coli DH5α. Semua potongan kentang kemudian diinkubasi pada suhu 28 oC selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter busuk lunak. Rancangan percobaan dan analisis statistik Rancangan percobaan yang digunakan dalam pengujian penghambatan gejala busuk lunak pada kentang dan anggrek adalah rancangan acak lengkap (RAL). Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) menggunakan program Microsoft Office Excel 2010 dan SPSS Statistics versi 17.0. Pengaruh perlakuan yang berbeda nyata dilakukan uji lanjut dengan uji selang berganda Duncan (DMRT) pada taraf nyata 5%. Nilai tingkat penghambatan relatif (THR) perkembangan busuk lunak dihitung dengan rumus:

THR =

(Diameter busuk pada kontrol) – (Diameter busuk pada perlakuan) x 100% (Diameter busuk pada kontrol)

15 Kloning dan Analisis Sekuen Gen aiiA Penyandi AHL-laktonase Kloning gen aiiA pada plasmid pTZ57R/T Analisis gen aiiA dilakukan dengan kloning gen aiiA pada plasmid pTZ57R/T dengan metode TA-kloning menggunakan insTAclone PCR cloning kit (Thermo Scientific). Fragmen gen aiiA diligasi dengan plasmid pTZ57R/T. Komposisi ligasi meliputi 1 µL vektor pTZ57R/T, 1 µL DNA sisipan, 1 µL 10X buffer ligasi, 0.34 µL T4 DNA ligase, dan 6.66 µL air bebas nuclease. Ligasi dilakukan pada suhu 4 oC selama semalam. Hasil ligasi antara plasmid pTZ57R/T dengan fragmen gen aiiA selanjutnya disebut pTZ57R/T::aiiA. Hasil ligasi tersebut ditransformasi pada E. coli DH5α. Seleksi hasil transformasi dilakukan dengan seleksi biru-putih pada media LB agar yang telah ditambah dengan ampisilin 50 µg mL-1, IPTG, dan X-gal. Selanjutnya dilakukan PCR koloni menggunakan primer M13 forward dan M13 reverse untuk mengkonfirmasi DNA sisipan. Hasil amplifikasi gen aiiA yang diperoleh selanjutnya dikirim ke 1st Base Asia untuk perunutan nukleotida. Analisis sekuen gen aiiA dan asam amino AiiA Hasil perunutan nukleotida dibandingkan dengan sekuen yang tersedia pada data NCBI GenBank Database dengan perangkat lunak Basic Local Allignment Search Tools (BLAST) (Zhang et al. 2000). Analisis daerah terkonservasi asam amino dari gen aiiA yang diperoleh dilakukan dengan perangkat lunak MEGA versi 6.0. Deteksi signal peptide dianalisis dengan perangkat lunak signalP. Konstruksi struktur protein tiga dimensi enzim AHL-laktonase dilakukan dengan menggunakan software Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/). Pendugaan ukuran bobot molekul protein dan nilai pI dari asam amino AHL-laktonase dari sekuen gen aiiA dihitung menggunakan perangkat lunak ExPaSy (http://web.expasy.org/compute_pi/). Simulasi translasi ekspresi gen aiiA pada plasmid pET-28a dilakukan dengan perangkat lunak ExPaSy translate tool (http://web.expasy.org/translate/) (Sakr et al. 2013). Sub-kloning dan Ekspresi Gen aiiA pada E. coli BL21 (DE3) Penyiapan fragmen Gen aiiA Penyiapan fragmen gen aiiA diawali dengan isolasi plasmid pTZ57R/T::aiiA. Fragmen gen aiiA diambil dengan cara memotong plamid pTZ57R/T yang diperoleh dengan metode double digest menggunakan enzim BamHI dan SalI sesuai protokol (Thermo Scientific). Hasil restriksi kemudian dielektroforesis selanjutnya fragmen gen laktonase yang terlihat dipurifikasi dengan HiYield Gel/PCR Fragmen Extraction Kit (gel extraction protocol). Hasil purifikasi gen fragmen gen laktonase siap digunakan untuk ligasi. Penyiapan plasmid ekspresi pET-28a E. coli DH5α yang mengandung plasmid pET-28a ditumbuhkan pada media LB agar yang mengandung kanamisin 25 µg/mL dan diinkubasi semalam pada suhu 37 oC. Selanjutnya satu koloni lup bakteri tersebut diinokulasikan pada 2 mL LB yang mengandung kanamisin 25 µg/mL dan diinkubasi pada suhu 37 oC dengan di-shaker dengan kecepatan 150 rpm selama semalam. Sebanyak 1.5 mL biakan dimasukkan pada tabung mikro 1.5 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 1 menit pada 4 oC. Media dibuang, pelet

16 diresuspensi dengan 100 µL solution I dingin. Sebanyak 200 µL solution II ditambahkan dan tabung dibolak-balik lima kali dan segera simpan di es selama 5 menit. Selanjutnya sebanyak 150 µL solution III ditambahkan dan dicampur dengan cara divorteks selama 10 detik. Campuran tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Supernatan paling atas diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikro baru dan ditambah dengan 1X volume P:C (25:24). Selanjutnya divorteks dan disentrifugasi 12 000 rpm selama 2 menit pada suhu 4 oC. Supernatan diambil dan ditambah dengan 2X volume etanol absolut suhu ruang. Tabung divorteks kemudian diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rp selama 5 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet dikeringanginkan. Pelet dicuci dengan etanol 70% dingin dan disentrifugasi kemudian supernatan dibuang. Pelet dikeringanginkan kembali. Plasmid diresuspensi dengan ditambahkan air bebas nuklease. Plasmid disimpan pada suhu -20 oC hingga digunakan. Plasmid pET-28a yang diperoleh selanjutnya direstriksi menggunakan enzim BamHI dan SalI dengan teknik double digest (Thermo Scientific). Plasmid yang terpotong dielektroforesis pada gen agarose 1% dan dipurifikasi menggunakan HiYield Gel/PCR Fragmen Extraction Kit (Gel extraction protocol). Ligasi gen aiiA dan plasmid pET-28a Komposisi ligasi meliputi: 1 µL plasmid pET-28a, 1 µL fragmen gen aiiA, 1 µL bufer ligasi 10X, 6.67 µL air bebas nuklease, dan 0.34 µL T4 DNA ligase. Selanjutnya inkubasi pada suhu 4 ºC selama semalam. Hasil ligasi antara plasmid pET-28a dengan fragmen gen aiiA selanjutnya disebut pET-28a::aiiA. Transformasi pET-28a::aiiA pada E. coli BL21 (DE3) Penyiapan kompeten sel. Kompeten sel dilakukan dengan metode “Ultracompetent cell” yang dideskripsikan oleh Inoue et al. (1990). Sebanyak 1 koloni E. coli BL21 yang telah ditumbuhkan pada media LB agar (setelah inkubasi 16-20 jam pada 37 oC) diinokulasikan pada 25 mL LB dalam tabung 250 ml. Media yang telah diinokulasi kemudian diinkubasi selama 6-8 jam pada 37 oC dengan kecepatan 200 rpm. Kultur tersebut digunakan sebagai starter. Sebanyak 2 ml kultur starter diinokulasi pada 250 ml SOB dalam tabung 1 liter dan diinkubasi semalam pada suhu ruang dengan dishaker kecepatan sedang 75 rpm. Pada pagi harinya diukur OD600 hingga OD mencapai 0.55. Setelah OD600 mencapai 0.55, biakan bakteri dipindahkan pada es selama 10 menit. Sel dipanen dengan disentrifugasi pada kecepatan 4 000 rpm selama 10 menit pada 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan pada kertas serap selama 2 menit dengan kondisi tabung terbalik. Pelet sel diresuspensi dengan 80 mL Inou transformation buffer. Panen kembali sel dengan disentrifugasi 4 000 rpm selama 10 menit pada 4 oC. Supernatan dibuang dan pelet dikeringanginkan kembali selama 2 menit. Resuspensi kembali pelet sel dengan cara ditambahkan 20 ml Inou transformation buffer dingin dan ditambah dengan 1.5 mL DMSO. Selanjutnya inkubasi pada es selama 10 menit. Kompeten sel dibagi ke dalam aliquot 100 µL dan segera disimpan pada freezer -70 oC. Sesaat sebelum digunakan, aliquot kompeten sel diambil dari freezer -70 oC dan diletakkan pada es selama 10 menit. Transformasi. Plasmid pET-28a::aiiA ditambahkan pada kompeten sel E. coli BL21 sebanyak maksimal 5%. Selanjutnya dicampurkan dengan cara dipipet. Dua perlakuan kontrol disiapkan yakni perlakuan tanpa plasmid dan perlakuan

17 dengan plasmid pET-28a tanpa sisipan. Tabung diinkubasi 10 menit dalam es kemudian di heat shock dalam inkubator suhu 42 oC selama 55 detik. Selanjutnya tabung segera dipindahkan dalam es selama 2 menit. Sebanyak 800 µL media SOC ditambahkan dalam masing-masing tabung. Hasil transformasi diinkubasi pada suhu 37 oC selama 45 menit dengan aerasi kuat 150 rpm dan sebanyak 200 µL disebar pada media SOB agar yang mengandung 20 mM MgSO4 dan 25 µg mL-1 kanamisin. Hasil transformasi diinkubasi pada suhu ruang hingga cairan meresap. Selanjutnya inkubasi pada 37 oC selama semalam (12-16 jam). Konfirmasi keberhasilan transformasi Konfirmasi keberhasilan transformasi pET28a::aiiA dilakukan dengan dua metode, yaitu PCR koloni menggunakan primer aiiA1/aiiA2 dan PCR dengan primer T7 pada sekuen pengapit DNA sisipan. PCR koloni dilakukan seperti pada metode deteksi gen aiiA namun template DNA berasal dari koloni hasil transformasi. PCR dengan primer T7 dilakukan dengan komposisi bahan yang digunakan sama dengan PCR sebelumnya, namun primer yang digunakan adalah primer T7 promotor dan primer T7 terminator. Adapun program PCR sekuen T7 yaitu pre-denaturation pada suhu 95 oC selama 5 menit, denaturation pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 55 oC selama 1 menit, extention pada suhu 72 oC selama 1.5 menit (diulang 35 siklus), dan final extention akhir pada suhu 72 oC selama 7 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% pada tegangan 75 volt selama 45 menit. Visualisasi DNA dilakukan dengan UV transilluminator mengikuti metode Sambrook et al. (1989). Ekspresi Gen Penyandi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE3) E. coli BL21 (DE3) yang telah ditransformasi dengan pET-28a::aiiA ditumbuhkan kembali pada media LB agar yang mengandung antibiotik kanamisin 25 µg mL-1 dan diinkubasi selama semalam pada suhu 37 oC. Sebanyak satu koloni diambil dan diinokulasikan pada 3 ml LB yang mengandung antibiotik kanamisin 25 µg mL-1. Selanjutnya diinkubasi pada waterbath incubator dengan kecepatan 100 rpm suhu 37 oC selama semalam. Selanjutnya sebanyak 150 µL dari biakan tersebut diinokulasikan pada 15 ml LB yang mengandung kanamisin 25 µg mL-1 dan diinkubasi pada 37 oC dengan kecepatan 150 rpm. Setiap 30 menit OD600 diukur hingga mencapai 0.5. Biakan tersebut dibagi dalam dua bagian, yaitu: biakan tanpa diinduksi dan biakan yang diinduksi IPTG. Bagian biakan yang diinduksi, ditambah dengan IPTG dengan konsentrasi akhir 0.75 mM. Inkubasi dilanjutkan hingga 12 jam dengan suhu 37 oC dengan kecepatan 100 rpm. Sel dipanen tiap 4 jam dengan cara diambil 1.5 ml ke dalam tabung mikro dan disentrifugasi 6 000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 oC. Pelet sel disimpan pada freezer -70 oC hingga dianalisis proteinnya. Analisis Protein AHL-laktonase dengan SDS-PAGE Penyiapan gel SDS-PAGE Gel yang digunakan terdiri atas dua macam, yaitu: stacking gel dan separating gel. Bahan yang digunakan yaitu solution A (14.6 g acrylamide, 0.4 g bis-acrylamide, ddH2O hingga 50 ml), Bufer B (1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 0.4% SDS), Bufer C (0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 0.4% SDS), solution D (10% ammonium persulfat), dan TEMED. Semua bahan dicampurkan dan dicetak pada cetakan

18 SDS-PAGE. Adapun komposisi bahan pembuatan gel SDS-PAGE terjadi pada tabel 4. Tabel 4 Komposisi bahan yang digunakan dalam SDS-PAGE Bahan H2O Solution A Bufer B Bufer C Solution D TEMED

Separating Gel 12.5%

Stacking Gel

12 mL 15 mL 9 mL 170 µL 20 µL

7.2 mL 1.8 mL 3 mL 45 µL 20 µL

SDS-PAGE Elektroforesis Pelet bakteri yang telah disimpan dan akan dianalisis proteinnya terlebih dahulu ditambah dengan 300 µL bufer loading sampel (1 M Tris, 2 g SDS, Glicerol 17.4%, 10 mg Bromophenol blue, H2O hingga 45 ml, 5 ml 2mercaptoethanol). Sampel divortek selama 15 menit. Sampel dipanaskan pada suhu 95 oC selama 10 menit. Sebanyak 50 µL sampel diambil dan dimasukkan pada gel SDS-PAGE. Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan dengan 150 volt selama 4 jam dalam running buffer (15 g Tris-Base, 72 g Glycine, 5 g SDS, H2O hingga 1 liter). Pewarnaan gel SDS-PAGE Agar diambil dan diletakkan di wadah. Kemudian ditambah akuades 100 ml. Agar SDS-PAGE dioven dengan panas level tinggi selama 1 menit dan diagitasi selama 4 menit pada suhu ruang. Langkah ini diulang tiga kali dengan mengganti akuades. Selanjutnya sebanyak 20 ml PAGE-Blue staining (Fermentas) ditambahkan pada agar. Agar dioven pada level panas yang tinggi selama 30 detik. Agar diagitasi selama 60 menit. Selanjutnya dilakukan pembilasan. Pembilasan dilakukan dengan menambahkan 100 mL air pada agar dan diinkubasi selama 5 menit. Proses pembilasan diulang 3 sampai 5 kali hingga pita-pita protein terlihat jelas. Analisis fungsional E. coli BL21 (DE3) rekombinan pET-28a::aiiA Bio-assay anti-QS terhadap C. violaceum Sebelum dilakukan pengujian terhadap D. dadantii, E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA diuji terhadap C. violaceum untuk mengetahui ekspresi gen aiiA. Pengujian dilakukan dengan supernatan dan pelet E. coli BL21 (DE3) rekombinan. Supernatan disiapkan dengan cara E. coli BL21 rekombinan disentrifugasi dengan kecepatan 10 000 rpm selama 5 menit kemudian supernatan disaring menggunakan milipore 0.2 µm (Minisart, Sartorius Stediem Biotech, Germany). Metode yang digunakan dalam pengujian anti-QS yaitu metode disc diffusion assay dengan teknik double layer culture plate. Metode tersebut sama seperti metode untuk pengujian anti-QS pada bagian penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase mengikuti metode Song et. al. (2012).

19 Bio-assay anti-QS dalam menghambat virulensi D. dadantii Pengujian kemampuan E. coli BL21 (DE3) rekombinan plasmid pET28a::aiiA dilakukan pada kentang. E. coli BL21 (DE3) rekombinan ditumbuhkan terlebih dahulu pada LB 5 ml. Biakan diinkubasi pada shaker 150 rpm dan diukur OD600 hingga mencapai 0.5. Biakan diinduksi dengan IPTG dengan konsentrasi akhir 0.75 mM dan diinkubasi kembali hingga 8 jam. Pelet dan supernatan dipisahkan dengan cara disentrifugasi 10 000 rpm selama 10 menit. Pelet atau supernatant dari E. coli BL21 rekombinan plasmid pET-28a::aiiA dicampur dengan biakan D. dadantii (1:1). Sebanyak 20 µL campuran biakan diuji pada potongan kentang. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter busuk lunak dan dihitung tingkat hambatan relatif (THR) pada 24 dan 48 jam setelah inokulasi. Rancangan percobaan yang digunakan yaitu rancangan acak lengkap (RAL). Olah data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SPSS statistics versi 17.0.

20

4 HASIL DAN PEMBAHASAN Penapisan Bakteri Penghasil AHL-laktonase

Diameter zona hambat tidak ungu (mm)

4.5

Diameter zona hambat nilai OD600

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 KB1 B2 B13 B18 B37 B3a B3b B23 B46 EKK10 BR2 GG1 GG2 GG3 GG4 GG5 GG6 GG7 GL2 GL3 BT2

0

1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Nilai OD600

Bio-assay aktivitas anti-QS terhadap C. violaceum Berdasarkan hasil penapisan dari 31 isolat bakteri diperoleh 21 isolat menunjukkan adanya zona penghambatan produksi violacein di sekitar kertas saring yang diberi perlakuan dengan supernatan bakteri uji. Supernatan dari isolat bakteri uji yang menunjukkan zona hambat ungu pada pengujian ini yaitu: B1, B2, B13, B18, B37, B3a, B3b, B46, EKK10, BR2, GG1, GG2, GG3, GG4, GG5, GG6, GG7, GL2, GL3, BT2. Adapun diameter zona hambat dari masing-masing isolat yang diuji terhadap C. violaceum mempunyai kemapuan penghambatan berbedabeda (Lampiran 2). Diameter rata-rata zona hambat yang terbentuk paling tinggi ditunjukkan oleh isolat GG3 dengan diameter zona hambat 10.2 mm dan B37 dengan diameter 10 mm. Namun, dua isolat menunjukkan aktivitas antibiosis, yaitu isolat B13 dan EKK10 berdasarkan pengukuran OD600 setelah inkubasi 12 jam setelah inokulasi (Gambar 7).

Isolat uji

Gambar 7 Hasil uji anti-QS dan antibiosis bakteri uji terhadap C. violaceum Zona hambat bukan ungu pada pengujian anti-QS dalam penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase menandakan bahwa terjadi penghambatan ekspresi violacein yang berwarna ungu oleh bakteri uji. Ekspresi violacein C. violaceum dikendalikan oleh mekanisme QS (McClean et al. 1997). Pengukuran OD600 dilakukan untuk membuktikan bahwa zona penghambatan produksi violacein bukan disebabkan oleh mekanisme antibiosis karena mekanisme anti-QS berbeda dengan antibiosis. Anti-QS tidak bersifat mematikan bakteri, namun hanya mengganggu regulasi gen-gen tertentu termasuk gen penyandi violacein pada C.

21 violaceum dan gen virulensi pada bakteri patogen tumbuhan, sedangkan antibiosis dapat mematikan bakteri. Mekanisme antibiosis ditunjukkan oleh adanya penghambatan pertumbuhan bakteri C. violaceum terhambat yang ditandai dengan nilai OD600 yang lebih rendah dari kontrol dan secara visual lebih bening (Lampiran 3). Isolat bakteri yang bersifat antibiosis yakni isolat EKK10 dan B13 tidak diuji lebih lanjut untuk menghindari bias karena adanya efek antibiosis. Namun tidak menutup kemungkinan kedua isolat tersebut mampu menghambat QS. Deteksi dan analisis gen penyandi AHL-laktonase (gen aiiA) Sebanyak 19 isolat yang telah menunjukkan aktivitas anti-QS dan tidak bersifat antibiosis terhadap C. violaceum dilakukan deteksi gen aiiA dengan PCR mengunakan primer spesisfik aiiA1 dan aiiA2. Hasil deteksi PCR menunjukkan 4 isolat yang positif mteramplifikasi gen aiiA penyandi AHL-laktonase, yaitu: isolat B37, GG3, GG6, dan BT2. Hasil visualisasi gen aiiA menunjukkan ukuran 753 pb (Gambar 8). Hasil perunutan nukleotida menunjukkan ukuran gen aiiA dari start kodon (AUG) hingga kodon stop sepanjang 753 pb, ukuran tersebut sama dengan gen aiiA yang dimiliki bakteri Bacillus, salah satunya B. subtilis BS1 (Pan et al. 2008). Adapun 15 isolat lain yang tidak terdeteksi adanya gen aiiA dapat disebabkan oleh mekanisme lain, seperti AHL-acylase (Lin et al. 2003).

Gambar 8 Visualisasi DNA hasil amplifikasi gen aiiA dari beberapa isolat yang diduga menghasilkan AHL-laktonase (M = Penanda DNA 1 Kb, K- = Kontrol negatif, B1-BT2 = isolat uji) Identifikasi Bakteri Penghasil AHL-laktonase Sekuen gen 16S rRNA dari isolat B37, GG3, GG6, dan BT2 telah didepositkan pada DDBJ GenBank database (Lampiran 4 sampai 7). Berdasarkan analisis homologi sekuen gen 16S rRNA diketahui bahwa empat isolat yang memiliki gen aiiA penyandi AHL-laktonase merupakan bakteri genus Brevibacillus dan Bacillus (Tabel 5 dan Lampiran 8 sampai 11). Perbandingan analisis 16S rRNA pada spesies terdekat sangat identik sehingga dapat digunakan sebagai analisis awal kesamaan, namun perlu analisis DNA-DNA hibridisasi untuk memastikan taksonomi (Fox et al. 1992). Strain B. cereus dan B. thuringiensis yang memiliki gen aiiA telah banyak dilaporkan di GenBank, namun isolat B37 yang diduga Brevibacillus brevis belum pernah dilaporkan sebagai bakteri penghasil AHL-laktonase. Gen aiiA yang dimiliki oleh B. brevis mirip dengan gen aiiA B. thuringiensis dan B. subtilis. Selain bakteri Gram positif, beberapa bakteri Gram negatif juga mempunyai kemampuan sebagai quorum

22 quenching, diantaranya yaitu Aeromonas sp. (Christianto & Yogiara 2011) dan Agrobacterium tumefaciens yang dikodekan oleh gen lain, gen aiiB (Zhang et al. 2002). Tabel 5 Homologi sekuen gen 16S rRNA isolat B37, GG3, GG6, dan BT2 dengan sekuen 16S rRNA pada GenBank Isolat(1)

Recovery (%)

Homologi (%)

Spesies

Nomor aksesi

B37

90

99

GG3

89

96

GG6

99

97

BT2

99

94

Brevibacillus brevis NBRC15304 B. brevis DSM30 B. brevis GDXJ1 B. brevis LAHP3-2 Bacillus cereus ATCC14579 B. cereus JCM2152 B. cereus CCM 2010 B. cereus NBRC15305 Bacillus cereus ATCC14579 B. cereus JCM2152 B. cereus CCM 2010 B. cereus NBRC15305 Bacillus thuringiensis ATCC10792 B. thuringiensis IAM12077 B. thuringiensis NBRC101235 B. thuringiensis BT407

NR_041524.1 NR_112204.1 JN999872.1 KT216600.1 NR_074540.1 NR_113266.1 NR_115714.1 NR_112630.1 NR_074540.1 NR_113266.1 NR_115714.1 NR_112630.1 NR_114581.1 NR_043403.1 NR_112780.1 NR_102506.1

(1)

Sekuen isolat telah didepositkan pada GenBank DDBJ dengan nomor aksesi: LC055677 (isolat B37), LC055679 (isolat GG3), LC055680 (isolat GG6), dan LC055678 (isolat BT2).

Isolat-isolat yang mempunyai kemampuan sebagai anti-QS sebelumnya telah dilaporkan sebagai agens biokontrol. Hal tersebut menjadi karakter tambahan yang cukup penting bahwa bakteri tersebut juga berpotensi sebagai agens biokontrol yang mampu menghambat virulensi bakteri patogen tumbuhan. B. brevis telah dimanfaatkan untuk mengendalikan cendawan Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici penyebab layu pada tomat (Chandel et al. 2010). B. cereus (strain UW85) sebagai agens biokontrol cendawan Phytophthora megasperma f. sp. medicaginis penyebab rebah kecambah pada alfalfa (Handelsman et al. 1990). Sedangkan B. thuringiensis dapat digunakan sebagai agens biokontrol serangga hama (MacIntosh et al. 1990). Beberapa strain B. thuringiensis juga memiliki kitinase sebagai anti-fungi yang dapat menekan cendawan terbawa benih pada kedelai (Reyes‐Ramírez et al. 2004). Selain B. thuringiensis dan B. cereus, beberapa bakteri gram positif lain juga dilaporkan menghasilkan AHL-laktonase diantaranya yaitu Bacillus mycoides, B. antrachis, B. subtilis, dan B. weihenstephanensis (Dong et al. 2002; Ulrich et al. 2004; Pan et al. 2008; Sakr et al. 2013). Ada pula bakteri gram negatif yang menghasilkan AHL-laktonase, seperti Agrobacterium tumefaciens, Arthrobacter sp., Kleibsiella pneumonia (Zhang et al. 2002; Carlier et al. 2003; Park et al. 2003).

23 Uji Virulensi D. dadantii pada Anggrek dan Kentang Pengujian virulensi dilakukan untuk memastikan bahwa isolat D. dadantii masih virulen sebelum digunakan sebagai bakteri uji. Gejala busuk lunak pada anggrek terlihat seperti tersiram air panas, berair, berwarna kecoklatan, dan mampu menyebabkan busuk pada satu daun dalam waktu 2-3 hari. Sedangkan pada kentang, busuk juga terlihat berair, berwarna coklat-kehitaman, dan terjadi maserasi jaringan (Gambar 9). Infeksi D. dadantii menyebabkan dinding sel terdegradasi dengan cepat dan menyebabkan struktur sel hancur dan terjadi maserasi jaringan. Gejala tersebut disebut water soaked (Grenier et al. 2006). Gejala busuk lunak disebabkan karena adanya produksi dan sekresi enzim pendegradasi. Patogenisitas Dickeya sp. ditentukan oleh banyak faktor diantaranya adalah kemampuan bertahan dalam jangka waktu tertentu, kemampuan ekspresi faktor virulensi yang dikendalikan oleh mekanisme QS, dan adanya regulasi status metabolisme atau cekaman lingkungan (Reverchon & Nasser 2013).

A

B

Gambar 9 Gejala busuk lunak hasil uji virulensi D. dadantii pada anggrek (A) dan kentang (B) 48 jam setelah inokulasi Uji Potensi AHL-laktonase sebagai Penghambat Virulensi D. dadantii secara In-vivo Busuk lunak oleh D. dadantii disebabkan karena adanya aktivitas enzim pectat lyase yang disintesis melalui sistem QS. Enzim pectat lyase menyebabkan degradasi lamela tengah pada dinding sel tumbuhan. Berdasarkan hasil percobaan menunjukkan bahwa perlakuan kontrol positif yang hanya diinokulasi dengan D. dadantii terbentuk gejala busuk lunak pada potongan kentang dan anggrek. Sedangkan perlakuan dengan masing-masing isolat (B37, GG3, GG6, dan BT2) menunjukkan adanya aktivitas penghambatan gejala busuk lunak. Berdasarkan pengukuran diameter busuk lunak dan penghitungan nilai THR menunjukkan bahwa isolat-isolat penghasil AHL-laktonase mampu menekan virulensi D. dadantii. Tingkat hambatan relatif (THR) dari perkembangan gejala busuk lunak berkisar antara 29.5% hingga 55.2% pada anggrek, dan 23.0% hingga 36.7% pada kentang. Penghambatan tertinggi ditunjukkan oleh supernatan dari isolat BT2 pada kentang dan isolat GG6 pada anggrek (Gambar 10 dan Lampiran 12 sampai 16).

24

A

B

Gambar 10 Aktivitas penghambatan dan persentase penghambatan relatif busuk lunak oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek (A) dan kentang (B) Perbedaan kemampuan penekanan gejala busuk lunak sangat tergantung dengan aktivitas enzim AHL-laktonase dalam mendegradasi AHL sebagai substrat. Kemampuan degradasi AHL-laktonase dapat dipengaruhi oleh suhu, pH, dan substrat. Sebagai contoh AHL-laktonase dari B. weihenstephanensis strain P65 mempunyai suhu optimum berkisar antara 28 oC hingga 50 oC, pH 6 sampai 9, dan substrat terbaik C6-HSL dibandingkan dengan C4-HSL, C7-HSL, C8- HSL (Sakr et al. 2013). Kloning dan Analisis gen aiiA Analisis sekuen gen aiiA dilakukan dengan teknik TA-kloning yang selanjutnya dilakukan amplifikasi DNA dari pengapit gen. Hasil amplifikasi DNA dari pengapit tersebut dapat diperoleh sekuen gen aiiA yang utuh. TA-kloning pTZ57R/T::aiiA pada E. coli DH5α berhasil dilakukan dan dikonfirmasi dengan seleksi antibiotik, seleksi biru-putih dan PCR koloni menggunakan primer pengapit M13F dan M13R. Hasil transformasi menunjukkan bahwa koloni E. coli DH5α yang mengandung plasmid pTZ57R/T::aiiA akan tumbuh berwarna putih sedangkan yang tanpa sisipan berwarna biru (Gambar 11). Reaksi warna biru disebabkan karena adanya aktivitas β-galactosidase yang berekasi dengan X-gal sebagai substrat pada media. Enzim β-galactosidase diekspresikan dari gen lacZ α–peptide yang terdapat pada plasmid pTZ57R/T. Sedangkan koloni E. coli DH5α yang berwarna putih diduga telah tersisipi gen aiiA sehingga gen lacZ tidak terekpresi. Keberhasilan pemilihan koloni pada seleksi biru-putih sangat dipengaruhi oleh pemerataan X-gal dan IPTG pada media agar, jumlah koloni yang tumbuh, dan waktu inkubasi, misalnya pada kloning plasmid pUC (Sambrook & Russell 2001; Chow 2005). Ukuran pita DNA hasil PCR koloni menggunakan primer M13 berukuran 907 pb. Ukuran tersebut terdiri atas 753 pb gen aiiA dan 154 pb pengapit yang

25 terdapat pada plasmid pTZ57R/T (Gambar 12). Hasil amplifikasi DNA ini disekuensing sehingga diperoleh sekuen gen aiiA secara lengkap. Sekuen gen aiiA yang diperoleh telah didepositkan pada DDBJ GenBank database (Lampiran 17 sampai 20). Sekuen dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui tingkat kesamaan nukleotida, asam amino hasil translasi, pendugaan stuktur protein, dan penghitungan bobot molekul.

Gambar 11 Seleksi biru-putih hasil TA-kloning pTZ57R/T::aiiA pada E. coli DH5α pada media LB agar yang mengandung ampisilin, IPTG, dan X-gal (1 = E. coli DH5α pada LB agar tanpa ampisilin sebagai kontrol, 2 = E. coli DH5α tanpa plasmid, 3 = E. coli DH5α + pTZ57R/T::aiiAB37, 4 = E. coli DH5α + pTZ57R/T::aiiAGG3, 5 = E. coli DH5α + pTZ57R/T::aiiAGG6, 6 = E. coli DH5α + pTZ57R/T::aiiABT2) M

K-

1a

1b

2a

2b

3a

3b

4a

4b

1500 pb 1000 pb 500 pb

Gambar 12 Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli DH5α rekombinan yang telah ditransformasi dengan plasmid pTZ57R/T::aiiA hasil TA-kloning (M = Penanda DNA 1 Kb, K- = kontrol negatif PCR, 1a-1b = pTZ57R/T::aiiAB37, 2a-2b = pTZ57R/T::aiiAGG3, 3a-3b = pTZ57R/T::aiiAGG6, 4a-4b = pTZ57R/T::aiiABT2) Hasil analisis kesejajaran dari sekuen gen aiiA dan asam amino AiiA dari keempat isolat tersebut mempunyai kesamaan yang tinggi dengan sekuen gen aiiA yang ada di GenBank berkisar antara 97%-99% dan 94%-99%. aiiAB37

26 mempunyai kemiripan tertinggi dengan gen aiiA B. thuringiensis, aiiAGG3 dan aiiAGG6 mempunyai kemiripan tertinggi dengan gen aiiA B. cereus, sedangkan aiiABT2 mempunyai kemiripan tertinggi dengan gen aiiA B. thuringiensis (Tabel 6 dan Tabel 7). Hal ini sesuai dengan hasil identifikasi bakteri dengan 16S rRNA sebelumnya. Namun, isolat B37 memiliki gen aiiA yang mirip dengan B. thuringiensis hal ini disebabkan karena sekuen gen aiiA dari Brevibacillus brevis belum ada pada database. Tabel 6 Analisis homologi sekuen gen aiiA Sekuen(1)

Homologi (%)(2) Sekuen GenBank

aiiAB37

97

aiiAGG3

99

aiiAGG6

99

aiiABT2

99

Nomor aksesi

aiiA gene_Bacillus thuringiensis aiiA gene_Bacillus subtilis aiiA gene_Bacillus cereus aiiA gene_Bacillus thuringiensis aiiA gene_Bacillus cereus aiiA gene_Bacillus thuringiensis aiiA gene_Bacillus thuringiensis aiiA gene_Bacillus subtilis

AF350929.1 DQ00640.1 JF501512.1 AY195570.1 JF501512.1 AY195570.1 AF350929.1 DQ00640.1

(1)

Sekuen gen aiiA yang diperoleh telah dideposit pada GenBank DDBJ dengan nomor aksesi: LC055758, LC055760, LC055761, dan LC055759 (2) Homologi sekuen tertinggi diambil dengan menggunakan program BLAST-N

Tabel 7 Analisis homologi sekuen asam amino AiiA Sekuen

Homologi (%)(1) Sekuen GenBank

AiiAB37

94

AiiAGG3

99

AiiAGG6

99

AiiABT2

99

Lactonase_Bacillus thuringiensis Lactonase_Bacillus subtilis Lactonase_Bacillus cereus Lactonase_Bacillus thuringiensis Lactonase_Bacillus cereus Lactonase_Bacillus thuringiensis Lactonase_Bacillus thuringiensis Lactonase_Bacillus cereus

Nomor aksesi AAY51612.1 AAY51610.1 AEA48310.1 WP000216593.1 AEA48310.1 WP000216593.1 AAY51612.1 WP016111450.1

(1)

Homologi sekuen tertinggi diambil dengan menggunakan program BLAST-X

Gen aiiA yang berhasil diisolasi dari keempat strain mempunyai domain terkonservasi AiiA protein yang mengandung 3 bagian besar yaitu GloB (Thr-78 through Asp-236), metallo-beta-lactamase super family (Leu-33-Thr-195) dan metal dependent hydrolases of the beta-lactamase superfamily II (Asn-22 through Val-161). Hal tersebut menunjukkan bahwa gen aiiA mempunyai ciri kelompok metallo-beta-lactamase (Dong et al. 2000). Selain itu keempat gen aiiA tersebut mempunyai bagian terkonservasi yaitu pada asam amino 103SHLHFDH109 dan 166 TPGHSPGH173 (Gambar 13 dan Lampiran 21 sampai 22). Hal ini seperti karakter gen aiiA penyandi AHL-laktonase yang telah diperoleh dari B. subtilis BS1 seperti yang dilaporkan oleh Pan et al. (2008). Selain dikodekan oleh gen

27 aiiA, beberapa gen juga mengkodekan AHL-laktonase seperti attM, attB, ahlD, dan ahlK (Zhang et al. 2002; Carlier et al. 2003; Park et al. 2003). Hasil analisis deteksi sinyal peptida menggunakan perangkat lunak signalP tidak ditemukan adanya daerah sinyal peptide pada keempat sekuen gen aiiA yang diperoleh. Hal ini sama dengan laporan dari Pan et al. (2008) yang melakukan analisis sinyal peptida sekuen gen aiiA dari B. subtilis BS1. Sinyal peptida dengan panjang 5-30 asam amino yang terdapat pada N-terminal dari produk sintesis protein menentukan translokasi protein (Blobel & Dobberstain 1975). Analisis bioinformasi tersebut penting untuk mengetahui karakter nukleotida dan asam amino suatu gen, domain protein, dan struktur protein (Attwood et al. 2011). AiiAB37 AiiAGG3 AiiAGG6 AiiABT2 AiiABS1

101 101 101 101 101

ISSHLHFDHAGGNGA-60 VSSHLHFDHAGGNGA-60 VSSHLHFDHAGGNGA-60 ISSHLHFDHAGGNGA-60 ISSHLHFDHAGGNGA-60

aa-EVVPGVQLLYTPGHSPGHQS aa-EVVPGVQLLYTPGHSPGHQS aa-EVVPGVQLLYTPGHSPGHQS aa-EVVPGVQLLYTPGHSPGHQS aa-EVVPGVQLLYTPGHSPGHQS

175 175 175 175 175

Gambar 13 Penyejajaran dua bagian terkonservasi AiiA isolat yang diperoleh (AiiAB37, AiiAGG3, AiiAGG6, AiiABT2) dibandingkan dengan AiiABS1 dari B. subtilis BS1 (DQ000640)

Sub-kloning dan Ekspresi Gen aiiA Penyandi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE3) Persiapan subkloning diawali dengan penyiapan fragmen gen aiiA dan plasmid ekspresi pET-28a. Keduanya berhasil terpotong dengan enzim BamHI dan SalI. Plasmid pTZ57R/T::aiiA yang terpotong menunjukkan adanya dua pita yang tediri atas plasmid pTZ57R/T berukuran 2886 pb dan gen aiiA 753 pb. Sedangkan plasmid pET-28a yang terpotong (linier) menunjukkan sedikit perbedaan ukuran pita hasil elektroforesis (Gambar 14). M

1

2

3

4

5

6

7

3000 pb

750 pb

Gambar 14 Visualisasi pita DNA hasil restriksi plasmid pET-28a dan pTZ57R/T::aiiA yang dipotong menggunakan enzmim BamHI dan SalI (M = Penanda DNA 1 Kb, 1 = plasmid pET-28a sirkuler, 2 = plasmid pET-28a::aiiA linear, 3 = plasmid pTZ57R/T sirkuler, 4 = plasmid pTZ57R/T::aiiAB37, 5 = plasmid pTZ57R/T::aiiAGG3, 6 = plasmid pTZ57R/T::aiiAGG6, 7 = plasmid pTZ57R/T::aiiABT2)

28 Sub-kloning plasmid pET28a::aiiA pada E. coli BL21 (DE3) berhasil dilakukan. E. coli BL21 (DE3) yang telah ditransformasi dengan plasmid pET28a::aiiA dapat tumbuh pada media LB agar yang ditambah dengan antibiotik kanamisin 25 µg mL-1. Plasmid pET-28a mempunyai gen kanr yang menyebabkan inang tahan terhadap kanamisin. Sedangkan bakteri yang tidak tersisipi pET-28a atau pET-28a::aiiA tidak tahan terhadap antibiotik kanamisin (Gambar 15). Namun, untuk memastikan bahwa yang tertransformasi adalah pET-28a::aiiA maka diperlakukan konfirmasi lebih lanjut, misalnya PCR koloni sekuen gen sisipan (aiiA) dan sekuen pengapit (T7 promotor-terminator).

Gambar 15 Hasil transformasi plasmid vektor ekpresi pada E. coli BL21 (DE3) (1 = E. coli BL21+ pET-28a, 2 = E. coli BL21 tanpa plasmid, 3 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAB37, 4 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAGG3, 5 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAGG6, 6 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiABT2) Hasil PCR koloni dengan menggunakan primer aiiA1 dan aiiA2 menunjukkan adanya pita DNA berukuran 753 pb (Gambar 16). PCR dengan primer T7 promotor dan T7 terminator berukuran 1081 pb. Ukuran tersebut sesuai dengan ukuran gen aiiA (753 pb) ditambah dengan sekuen pengapit pada plasmid pET-28a (328 pb) (Gambar 17). Hal tersebut menunjukkan bahwa koloni yang positif teramplifikasi pada PCR gen aiiA dan sekuen pengapit menunjukkan bahwa koloni yang tumbuh adalah E. coli BL21 (DE3) yang mengandung plasmid pET-28a::aiiA. Koloni yang telah dikonfirmasi tersebut digunakan untuk ekspresi, analisis protein, dan uji potensi dalam menghambat virulensi D. dadantii.

29 M

2

1

3

6

5

4

7

8

1500 pb 750 pb 250 pb

Gambar 16

Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli BL21 (DE3) rekombinan yang telah ditransformasi dengan plasmid pET28a::aiiA menggunakan primer aiiA1 dan aiiA2 (M = Penanda DNA 1 Kb, 1-2 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAB37, 3-4 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAGG3, 5-6 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAGG6, 7-8 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiABT2) M

K+

K-

1

2

3

4

5

6

7

8

1500 pb 1000 pb 750 pb

Gambar 17 Visualisasi pita DNA hasil PCR koloni E. coli BL21 (DE3) yang telah ditransformasi dengan plasmid pET-28a::aiiA menggunakan primer T7 promotor dan T7 terminator (M = Penanda DNA 1 Kb, K+ = kontrol positif pET-28a::aiiAB37, K- = kontrol negatif PCR, 1-2 = rekombinan pET-28a::aiiAB37, 3-4 = rekombinan pET28a::aiiAGG3, 5-6 = koloni pET-28a::aiiAGG6, 7-8 = koloni pET28a::aiiABT2) Analisis Protein dan Pendugaan Struktur Protein AHL-laktonase (AiiA) Berdasarkan urutan asam amino yang telah diperoleh dari masing-masing sekuen gen aiiA dapat diduga struktur protein dari AHL-laktonase. Hasil konstruksi menunjukkan bahwa hasil konstruksi protein dari gen aiiA dari isolat B37, GG3, GG6, dan BT2 mempunyai struktur protein yang sangat mirip dengan protein N-Acyl Homoserine Lactone Hydrolase (nomor aksesi 3dhc.1.A). AHLlaktonase dari isolat B37 mempunyai kemiripan 93.6%, AHL-laktonase dari isolat GG3 dan GG6 mempunyai kemiripan 94.8%, dan AHL-laktonase dari isolat BT2 mempunyai kemiripan 99.6%. Adapun hasil konstruksi protein AHL-laktonase dari masing-masing isolat ditunjukkan oleh Gambar 18. Hasil analisis juga menunjukkan bahwa struktur AHL-laktonase dari empat isolat tersebut mempunyai situs pengikatan terhadap atom Zn. Struktur AHL-laktonase pembanding, yaitu dari B. subtilis, dan B. thuringiensis juga memiliki struktur

30 protein yang mirip dengan AiiA dari isolat yang dianalisis. Karakter tersebut juga dimiliki oleh AHL-laktonase dari B. Weihenstephanensis (Sakr et al. 2013). Pendugaan bobot molekul protein AiiA secara teoritis dari sekuen gen aiiA diketahui bahwa asam amino AiiA dari isolat B37 mempunyai nilai pI/bobot molekul 5.23/28096.30 Da, AiiA dari isolat GG3 mempunyai nilai pI/bobot molekul sebesar 4.84/28100.06 Da, AiiA dari isolat GG6 mempunyai nilai pI/bobot molekul sebesar 4.84/28100.06 Da, dan AiiA dari isolat BT2 mempunyai nilai pI/bobot molekul sebesar 4.84/28250.20 Da. Simulasi translasi gen aiiA yang disisipkan pada pET-28a dianalisis untuk memastikan bahwa gen terbaca sebagai kodon. Hasil simulasi menunjukkan bahwa keempat gen aiiA yang disisipkan pada pET-28a dapat terbaca sesuai kodon asli dan tidak terjadi pergeseran translasi. Gen aiiA ditranslasi mulai dari kodon start yang dimiliki oleh pET-28a dan beberapa basa setelahnya termasuk menyandikan 6XHis. Penambahan beberapa asam amino yang ditranslasi dapat berpengaruh terhadap ukuran protein gen sisipan. Salah satu contoh adalah simulasi translasi gen aiiAB37 dan tidak ada perbedaan ekspresi untuk gen aiiA dari isolat lain (GG3, GG6, dan BT2). Perbedaan nukleotida ditandai pada nukleotida-nukleotida yang digaris bawah pada gen aiiA dan tidak berpengaruh pada ekspresi protein (Gambar 19 dan Lampiran 22).

Gambar 18

Struktur protein tersier AHL-laktonase berdasarkan urutan asam amino gen aiiA yang dibuat dengan perangkat lunak Swiss model (a = AiiAB37, b = AiiAGG3, c = AiiAGG6, d = AiiABT2, e = AiiA B. subtilis, f = AiiA B. thuringiensis)

31 A pET-28a N

BamHI

SalI

GGATCC

GTCGAC

102 pb (3.8 kDa)

gen aiiA 753 pb (28 kDa)

NcoI 6X His - Tag TATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCAC Met Gly Ser Ser His His His His His His

B

1 1 46 16 91 31 136 46 181 61 226 76 271 91 316 106 361 121 406 136 451 151 496 166 541 181 586 196 631 211 676 226 721 236 766 251 811 266

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtg M G S S H H H H H H S S G L V ccgcgcggcagccatatggctagcatgactggtggacagcaaatg P R G S H M A S M T G G Q Q M ggtcgcggatccatgacagtaaagaagctttatttcatcccagca G R G S M T V K K L Y F I P A ggtcgttgyatgttrgatcattcktctgttaayagtrcrytmrcr G R C M L D H S S V N S A L T ccggggaawytattraacttrcckgtrtggtgttatcttttggag P G K L L N L P V W C Y L L E acrgaagaaggkcctattttagtagayacaggtatgccagaaagt T E E G P I L V D T G M P E S gcagttaataatgaagggctttttaacggtacatttgttgaaggr A V N N E G L F N G T F V E G cagatyttaccgaaaatgactgaagaagatagaatcgtraatata Q I L P K M T E E D R I V N I ttaaagcgtgtaggggatgagccggacgaccttttatatattrtt L K R V G D E P D D L L Y I I agttctcacttacattttgatcatgcaggaggaaacggtgctttt S S H L H F D H A G G N G A F acaaatacaccrattattgtgcarcgaahggaatatgaggcagca T N T P I I V Q R M E Y E A A cttcatagagaagaatatatgaaagaatgtatattaccgcatttg L H R E E Y M K E C I L P H L aactacaaaattattgaaggggattatgaagtggtaccaggtgtt N Y K I I E G D Y E V V P G V caattattgtatacgccaggtcattctccaggccatcagtcgcta Q L L Y T P G H S P G H Q S L ttmattgagacggarmaatccggtycagtwttattaacgattgat F I E T E Q S G S V L L T I D gcatcktayacgaaagaraaytttgtwgatgaagtgccgytcgcr A S Y T K E N F V D E V P L A ggakttgatycrgaawtagctttatcttcmattaaacgtttaara G V D P E I A L S S I K R L R gaagttgtgrmraaaragaarccaattattttctttggtcrtgak E V V K K K K P I I F F G R E atagarmagrraaagrgtkktaragagttcccsgmaawtatatag I E K R K S V R E F P A N I *

C TAG

*

45 15 90 30 135 45 180 60 225 75 270 90 315 105 360 120 405 135 450 150 495 165 540 180 585 195 630 210 675 225 720 235 765 250 810 265 855 280

Gambar 19 Ekspektasi fusi protein pET-28a ( ) dengan gen aiiA ( ) yang terekspresi dari kodon start (ATG) pada pET-28a hingga kodon stop pada gen aiiA (TAG) (A) dan hasil analisis translasi sekuen pET28a::aiiAB37 (B). 6X His-Tag (garis bawah), nukleotida dan asam amino gen aiiA (cetak tebal)

32 Hasil ekspresi menunjukkan bahwa sekuen gen aiiA yang diperoleh berhasil diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3) dibawah T7 promotor. Hasil analisis protein dengan SDS-PAGE menunjukkan ukuran protein AHL-laktonase sekitar ~32 kDa. Ukuran tersebut terdiri atas 3.8 kDa protein pembawa yang ada dalam plasmid pET-28a dan protein AHL-laktonase ~28 kDa (Gambar 20). Pan et al. (2008) melaporkan hasil ekspresi gen aiiA pada pGEX berukuran 54 kDa yang terdiri atas GST-carrier protein berukuran 26 kDa dan AiiA 28 kDa. Ukuran AHL-laktonase pada SDS-PAGE yang lebih besar dari nilai pendugaan bobot molekul pernah dilaporkan yaitu AHL-laktonase dari Bacillus sp. B546 (aiiAB546). Gen aiiAB546 yang diligasi pada pPIC19 dan diekspresikan pada Pichia pastoris yang dianalisis dengan SDS dan dipurifikasi dengan HiTRap Q berukuran 33.6 kDa (Chen et al. 2010). Contoh keberhasilan penggunaan vektor pET-28a dengan E. coli BL21 (DE3) digunakan untuk ekspresi pediocin 6XHisXpress-PedA (Halami & Chandrashekar 2007).

Gambar 20 Hasil analisis protein AHL-laktonase dengan SDS-PAGE dari E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA dengan 0.75 µM IPTG pada suhu 37 oC (M = Penanda ukuran protein, 1 = E. coli BL21 tanpa pET-28a, 2 = BL21 + pET28a, 3 = uninduced BL21 + pET28a::aiiAB37, 4-6 = BL21 + pET-28a::aiiAB37, 7 = uninduced BL21 + pET-28a::aiiAGG3, 8-10 = BL21 + pET-28a::aiiAGG3, 11 = uninduced BL21 + pET-28a::aiiAGG6, 12-14 = BL21 + pET28a::aiiAGG6, 15 = uninduced BL21 + pET-28a::aiiABT2, 16-18 = BL21 + pET-28a::aiiABT2) Aktivitas Enzim AHL-laktonase dan Potensinya dalam Menghambat Virulensi D. dadantii Ekspresi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE) menggunakan plasmid ekpresi pET-28a menunjukkan bahwa AHL-laktonase terekspresi pada pelet dan tidak terekspresi pada supernatan (Gambar 21). Diameter penghambatan zona ungu E. coli BL21 (DE3) rekombinan aiiAB37, aiiAGG3, aiiAGG6, aiiABT2 berturutturut 19 mm, 16 mm, 18.7 mm, 21.3 mm. Aktivitas anti-QS tertinggi gen aiiA yang diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3) ditunjukkan oleh ekspresi gen aiiA dari isolat BT2. Secara umum, ekspresi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE3) yang diinduksi IPTG meningkat dibandingkan dengan ekspresi pada isolat tersebut, bahkan mencapai tiga kali untuk aiiAB37 setelah 48 jam inkubasi (Tabel 8 dan Lampiran 23 dan Lampiran 24). Gen yang disisipkan pada plasmid pET-28a

33 yang diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3) mampu meningkatkan ekpresinya dengan diinduksi IPTG. Tabel 8 Diameter zona hambat ekspresi violacein C. violaceum oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA Diameter zona hambat (mm)(1) Isolat E. coli BL21 (Kontrol) E. coli BL21+pET-28a E. coli BL21+pET-28a::aiiAB37 E. coli BL21+pET-28a::aiiAGG3 E. coli BL21+pET-28a::aiiAGG6 E. coli BL21+pET-28a::aiiABT2

24 jam setelah inokulasi

48 jam setelah inokulasi

0.0 a 0.0 a 19.0 c 16.0 b 18.6 c 21.3 d

1.0 a 1.0 a 34.0 c 25.3 b 23.3 b 26.0 b

(1)

Angka pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada P = 0.05

A

B

Gambar 21 Pengujian ekspresi AHL-laktonase pada E. coli BL21 (DE3) terhadap QS C. violaceum (A = supernatan, B = pelet; 1 = kontrol, 2 = E. coli BL21 + pET-28a, 3 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAB37, 4 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAGG3, 5 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiAGG6, 6 = E. coli BL21 + pET-28a::aiiABT2) Pengujian E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA menunjukkan penghambatan gejala busuk lunak pada kentang (Gambar 22). Pada kentang yang diberi perlakuan E. coli BL21 (DE3) rekombinan plasmid pET-28a::aiiAB37, aiiAGG3, aiiAGG6, dan aiiAGG3 terlihat penghambatan perkembangan gejala busuk lunak yang nyata dibandingkan perlakuan kontrol atau perlakuan menggunakan E. coli BL21 (DE3) tanpa gen aiiA. Hal ini mengindikasikan bahwa gen aiiA yang diekspresikan mampu menghidrolisis AHL sehingga dapat menghambat virulensi D. dadantii. Efektivitas AHL-laktonase dalam menghambat faktor virulensi dapat menghambat perkembangan penyakit busuk lunak hingga 48 jam setelah inokulasi, namun belum diketahui berapa lama enzim AHL-laktonase tetap aktif.

34 A

B

Gambar 22 Penekanan virulensi D. dadantii penyebab busuk lunak oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA (1 = kontrol D. dadantii, 2 = D. dadantii dan E. coli BL21 + pET-28a, 3 = D. dadantii dan E. coli BL21 + pET-28a::aiiAB37, 4 = D. dadantii dan E. coli BL21 + pET28a::aiiAGG3, 5 = D. dadantii dan E. coli BL21 + pET-28a::aiiAGG6, 6 = D. dadantii dan E. coli BL21 + pET-28a::aiiABT2) Tingkat hambatan relatif (THR) perkembangan busuk lunak oleh D. dadantii pada perlakuan E. coli BL21 (DE3) rekombinan plasmid pET-28a::aiiA berkisar antar 41.4% hingga 63.3%. THR tertinggi ditunjukkan oleh isolat rekombinan aiiAGG6 yang mencapai 63.3% pada 24 jam setelah inokulasi (Tabel 9 dan Lampiran 24 sampai 25). Nilai THR ini lebih tinggi dibandingkan dengan nilai THR pada pengujian sebelumnya menggunakan isolat bakteri asal B37, GG3, GG6, dan BT2. Hal ini membuktikan bahwa ekspresi gen aiiA pada E. coli berhasil meningkatkan ekspresi AHL-laktonase dan kemampuannya dalam mendegradasi AHL. Pan et al. (2008) melaporkan bahwa gen aiiA dari B. subtilis yang diekspresikan pada E. coli BL21 dengan plasmid ekspresi pGEX-4T-3 mampu menekan gejala busuk lunak yang disebabkan E. carotovora pv. carotovora setelah inkubasi 16 jam pada suhu 28 oC. Tabel 9 Tingkat hambatan relatif (THR) E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA terhadap perkembangan busuk lunak pada kentang yang disebabkan D. dadantii Isolat E. coli BL21 (Kontrol) E. coli BL21+pET-28a E. coli BL21+pET-28a::aiiAB37 E. coli BL21+pET-28a::aiiAGG3 E. coli BL21+pET-28a::aiiAGG6 E. coli BL21+pET-28a::aiiABT2 (1)

Diameter busuk lunak (mm)(1) 24 jam 48 jam

24 jam

48 jam

25.2 a 17.8 ab 7.2 b 9.2 b 9.8 b 12.2 b

(-) 23.5 a 62.3 b 63.3 b 49.4 ab 41.8 ab

(-) 17.4 a 57.5 b 62.2 b 41.4 ab 46.1 b

31.4 a 25.0 ab 11.0 b 13.2 b 18.6 ab 14.8 b

THR (%)

Angka pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada P = 0.05 (-) Nilai THR tidak bisa dihitung

35

5 PEMBAHASAN UMUM Penggunaan isolat bakteri penghasil AHL-laktonase sebagai agens hayati berpotensi mampu menghambat virulensi bakteri patogen tumbuhan. Penghambatan QS berpotensi menjadi salah satu mekanisme pengendalian bakteri patogen tumbuhan selain antibiosis, kompetisi, dan induksi resistensi. Namun, isolat penghasil AHL-laktonase dan informasi keefektifan agens hayati penghasil AHL-laktonase dalam menekan virulensi bakteri patogen tumbuhan masih belum banyak diketahui. Sehingga kajian terkait menjadi menarik dalam perkembangan metode pengendalian bakteri patogen tumbuhan, khususnya di Indonesia. Keempat isolat yang diperoleh dalam penelitian ini merupakan Brevibacillus brevis, B. cereus, dan B. thuringiensis. B. cereus dan B. thuringiensis telah banyak dilaporkan sebelumnya sebagai bakteri penghasil AHL-laktonase (Tinh et al. 2013; Nusrat et al. 2011). Sedangkan Brevibacillus brevis sampai saat ini belum pernah dilaporkan sebagai bakteri penghasil AHL-laktonase. Hal ini menambah informasi baru terkait spesies bakteri penghasil AHL-laktonase. Selain bakteri tersebut, AHL-laktonase dimiliki oleh beberapa spesies bakteri lain diantaranya B. subtilis, B. weihenstephanensis, Bacillus anthrachis, B. mycoides, A. tumefaciens, Arthobacter sp. IBN110, Kleibsiella pneumonia, Serratia marcescens, B. aquimaris, B. altitudinis, B. marisflavi, B. axarcuiensis dan bakteri lainnya (Pan et al. 2007; Sakr et al. 2013; Nusrat et al. 2011; Dong & Zhang 2005; Fitriyah 2015). Keempat isolat dalam penelitian ini menunjukkan kemampuan dalam menekan virulensi D. dadantii dengan ditandai adanya penghambatan busuk lunak pada anggrek dan kentang secara signifikan; mengindikasikan potensi keempat isolat bakteri dalam menekan virulensi D. dadantii. Penggunaan D. dadantii sebagai patogen uji didasarkan beberapa alasan penting diantaranya yaitu: (1) D. dadantii menggunakan molekul C6-HSL sebagai sinyal QS dalam mengekspresikan faktor virulensi, (2) faktor virulensi berupa enzim pektat-lyase yang bersifat pektinolitik dengan gejala maserasi jaringan sehingga mudah diamati dan diukur, serta perkembangan gejala yang cepat (Grenier et al. 2006; (Elphinstone & Toth 2007), (3) D. dadantii merupakan salah satu OPT karantina di Indonesia berdasarkan peraturan Menteri Pertanian nomor 51/Permentan/KR.010/9/2015, dan (4) D. dadantii mempunyai kisaran inang yang sangat luas diantaranya: kentang, wortel, bawang putih, ubi jalar, anggrek, dan nanas (Perombelon & Kelman 1980; Ma et al. 2007; Kaneshiro et al. 2008; Van Vaerenbergh et al. 2012). Beberapa komoditas tersebut merupakan komoditas penting yang ada di Indonesia. Ekspresi protein AiiA berdasarkan analisis SDS-PAGE menunjukkan berhasil terekspresi, namun ekspresinya belum melimpah. Sehingga masih perlu dilakukan optimasi ekspresi protein untuk mendapatkan ekpresi yang melimpah dalam pemanfaatannya sebagai agens hayati bakteri patogen tumbuhan. Beberapa faktor yang mempengaruhi ekspresi gen ini dan perlu dioptimasi antara lain penggunaan strain bakteri ekspresi yang lebih sesuai, suhu inkubasi saat ekspresi, konsentrasi IPTG, dan waktu pemanenan (Sadeghan et al. 2013). Ekspresi E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA walau belum optimal, namun potensinya menghambat produksi violacein dan menghambat virulensi D. dadantii menunjukkan lebih tinggi dibandingkan dengan ekspresinya pada bakteri asal.

36 Tidak hanya dalam virulensi, QS pada Erwinia juga mengontrol sejumlah penentu virulensi lain dan metabolit sekunder (Barnard et al. 2007). Aktivitas AHLlaktonase sangat dipengaruhi oleh banyak faktor penting, seperti pH dan substrat (Wang et al. 2004). Penggunaan agens hayati bakteri penghasil AHL-laktonase atau senyawa AHL-laktonase berpotensi sebagai salah satu cara pengendalian bakteri patogen, misalnya penghambatan virulensi P. carotovorum, E. carotovora pv. carotovora, E. stewartii (Dong & Zhang 2005). Fenomena kemampuan AHL-laktonase dalam menghambat virulensi D. dadantii mungkin berpotensi menghambat virulensi bakteri patogen lain yang juga menggunakan AHL sebagai sinyal QS dalam ekspresi virulensi, seperti X. campestris, R. solanacearum, P. aeruginosa, P. antrosepticum, P. stewartii, dan E. carotovora (Von Bodman & Farrand 1995; Barber et al. 1997; Dong et al. 2000; Conway & Greenberg 2002; Burr et al. 2006). AHL-laktonase dilaporkan juga telah diuji menekan virulensi bakteri patogen ikan, seperti Aeromonas hydrophila (Chen et al. 2010). Hubungan antara AHL dengan QS berimplikasi pada beberapa aspek yang dapat digunakan untuk pengendalian bakteri patogen. Selain mendegradasi AHL yang dapat menghambat QS (faktor virulensi tidak terekspresi), paparan AHL pada fase awal pertumbuhan bakteri dapat menginduksi bakteri patogen dalam mengekspresikan gen tertentu. Hal ini menyebabkan (1) populasi sel tidak cukup untuk infeksi, dan (2) menyebabkan faktor virulensi yang diekspresikan bakteri patogen dikenali oleh sistem pertahanan tanaman, sehingga menghambat proses infeksi (LaSarre & Federle 2013). Selain itu gen aiiA penyandi AHL-laktonase yang diperoleh dapat digunakan sebagai material genetik dalam merakit tanaman transgenik yang tahan terhadap infeksi bakteri patogen tumbuhan seperti halnya perakitan tanaman transgenik dengan gen cryI penyandi BT toksin yang menyebabkan tanaman tahan terhadap serangan hama Lepidoptera (Romeis et al. 2006), atau gen chiA penyandi kitinase yang menyebabkan tanaman tahan terhadap infeksi cendawan (Neuhaus et al. 1991).

37

6 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa: 1) Diperoleh empat isolat penghasil AHL-laktonase yaitu: isolat B37, GG3, GG6, dan BT2. Isolat tersebut teridentifikasi sebagai Brevibacillus brevis, Bacillus cereus, dan B. thuringiensis. 2) Sekuen gen dan asam amino AHL-laktonase yang diperoleh mempunyai tingkat homologi yang tinggi dengan AHL-laktonase yang telah terdeposit di GenBank serta memiliki struktur tersier seperti AHL-hidrolase. 3) Gen aiiA penyandi AHL-laktonase berhasil dikloning dan diekspresikan pada E. coli BL21 (DE3). Fusi protein hasil ekspresi memiliki ukuran ~32 kDa, namun ekspresi protein belum optimal. 4) Isolat bakteri penghasil AHL-laktonase dan E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA mampu menghambat QS serta menekan virulensi bakteri penyebab penyakit busuk lunak D. dadantii. E. coli rekombinan tersebut mampu menekan virulensi D. dadantii lebih tinggi daripada isolat bakteri asal. Saran Beberapa hal yang dapat dilakukan untuk penelitian selanjutnya diantaranya yaitu: 1) Optimasi ekspresi gen aiiA penyandi AHL-laktonase pada strain E. coli, dan kondisi ekspresi yang berbeda. 2) Pengujian keefektifan AHL-laktonase sebagai biopestisida terhadap bakteri patogen lain, seperti: P. stewartii, P. syringae, X. oryzae, R. solanacearum, dan bakteri lainnya. 3) Formulasi AHL-laktonase yang tepat sebagai biopestisida. 4) Perakitan tanaman transgenik yang tahan terhadap bakteri patogen tumbuhan dengan memanfaatkan gen aiiA sebagai material genetik.

38

DAFTAR PUSTAKA Attwood TK, Gisel A, Eriksson NE, Bongcam-Rudloff E. 2011. Concepts, historical milestones and the central place of bioinformatics in modern biology: a European perspective. Bioinformatics–Trends and Methodologies, hlm. 1-37. Bainton N, Stead P, Chhabra S, Bycroft B, Salmond G, Stewart G, Williams P. 1992. N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone regulates carbapenem antibiotic production in Erwinia carotovora. Biochemical Journal. 288:9971004. Barber C, Tang J, Feng J, Pan M, Wilson T, Slater H, Dow J, Williams P, Daniels M. 1997. A novel regulatory system required for pathogenicity of Xanthomonas campestris is mediated by a small diffusible signal molecule. Molecular Microbiology. 24(3):555-566. Blobel G, Dobberstain B. 1975. Transfer of proteins across membranes: presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. The Journal of Cell Biology. 67(3):835-851. Burr T, Barnard AM, Corbett MJ, Pemberton CL, Simpson NJ, Salmond GP. 2006. Identification of the central quorum sensing regulator of virulence in the enteric phytopathogen, Erwinia carotovora: the VirR repressor. Molecular Microbiology. 59(1):113-125. Carlier A, Uroz S, Smadja B, Fray R, Latour X, Dessaux Y, Faure D. 2003. The Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens harbors an attM-paralogous gene, aiiB, also encoding N-Acyl homoserine lactonase activity. Applied Environmental Microbiology. 69:4989-4993. Chandel S, Allan EJ, Woodward S. 2010. Biological control of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici on tomato by Brevibacillus brevis. Journal of Phytopathology. 158(7‐8):470-478. Chen R, Zhou Z, Cao Y, Bai Y, Yao B. 2010. High yield expression of an AHLlactonase from Bacillus sp. B546 in Pichia pastoris and its application to reduce Aeromonas hydrophila mortality in aquaculture. Microbial Cell Factories. 9(1):1-10. Chhabra S, Stead P, Bainton NJ, Salmond G, Stewart G, Williams P, Bycroft BW. 1993. Autoregulation of carbapenem biosynthesis in Erwinia carotovora by analogues of N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone. The Journal of Antibiotics. 46(3):441-454. Chow P. 2005. Cloning of λ DNA fragments into pUC19 vector to study the ligation efficiency of NdeI-digested pUC19 and HindIII-digested pUC19 by T4 DNA ligase. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 8:8-13. Christianto B, Yogiara. 2011. Screening of quorum quenching activity of bacteria isolated from ant lion. Microbiology Indonesia. 5(1):8. Conway BA, Greenberg E. 2002. Quorum-sensing signals and quorum-sensing genes in Burkholderia vietnamiensis. Journal of Bacteriology. 184(4):11871191.

39 Czajkowski R, Jafra S. 2009. Quenching of acyl-homoserine lactone-dependent quorum sensing by enzymatic disruption of signal molecules. Acta Biochimica Polonica. 56(1):1-16. De Kievit TR, Iglewski BH. 2000. Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships. Infection and Immunology. 68(9):4839-4849. Dong Y-H, Wang L-H, Xu J-L, Zhang H-B, Zhang X-F, Zhang L-H. 2001. Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase. Nature. 411(6839):813-817. Dong Y-H, Gusti AR, Zhang Q, Xu JL, Zhang LH. 2002. Identification of quorum quenching N-acyl homoserine lactonases from Bacillus species. Applied Environment Microbiology. 68:1754-1759. Dong Y-H, Xu J-L, Li X-Z, Zhang L-H. 2000. AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. [Internet]. Proceedings of the National Academy of Sciences. March 28, 2000. hlm 3526-3531. 9(7). Dong Y-H, Zhang L-H. 2005. Quorum sensing and quorum-quenching enzymes. The Journal of Microbiology. 43(1):101-109. Dong Y-H, Zhang X-F, Xu J-L, Zhang L-H. 2004. Insecticidal Bacillus thuringiensis silences Erwinia carotovora virulence by a new form of microbial antagonism, signal interference. Applied Environmental Microbiology. 70(2):954-960. Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, Martelin R, Gayral J-P, Raoult D. 2000. 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial isolates. Journal of Clinical Microbiology. 38(10):3623-3630. Dye DW. 1968. A taxonomic study of the genus Erwinia. I. The amylovora group. New Zealand Journal of Agricultural Research. 11: 590-607. Dye DW. 1969. A taxonomic study of the genus Erwinia. II. The carotovora group. New Zealand Journal of Agricultural Research. 12:81-97. Dye DW. 1969. A taxonomic study of the genus Erwinia. III. The herbicola group. New Zealand Journal of Agricultural Research. 12(2):223-236. Eden PA, Schmidt TM, Blakemore RP, Pace NR. 1991. Phylogenetic analysis of Aquaspirillum magnetotacticum using polymerase chain reaction-amplified 16S rRNA-specific DNA. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41(2):324-325. Elphinstone J, Toth I. 2007. Erwinia chrysanthemi (Dickeya spp.) - The Facts. London (GB): British Potato Council. Fitriyah D. 2015. Karakterisasi bakteri penghasil asil homoserin lakton laktonase dan asilase yang diisolasi dari lahan pertanian [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Flavier AB, Clough SJ, Schell MA, Denny TP. 1997. Identification of 3hydroxypalmitic acid methyl ester as a novel autoregulator controlling virulence in Ralstonia. Molecular Microbiology. 26(2):251-259. Flavier AB, Ganova-Raeva LM, Schell MA, Denny TP. 1997. Hierarchical autoinduction in Ralstonia solanacearum: control of acyl-homoserine lactone production by a novel autoregulatory system responsive to 3hydroxypalmitic acid methyl ester. Journal of Bacteriology. 179(22):70897097.

40 Fox GE, Wisotzkey JD, Jurtshuk JR P. 1992. How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 42(1):166-170. Grenier A-M, Duport G, Pagès S, Condemine G, Rahbé Y. 2006. The phytopathogen Dickeya dadantii (Erwinia chrysanthemi 3937) is a pathogen of the pea aphid. Applied Environmental Microbiology. 72(3):1956-1965. Haerani H, Nawangsih AA, Damayanti TA. 2015. Deteksi dan Identifikasi Dickeya sp. sebagai Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina A2 pada Tanaman Kentang di Jawa. Jurnal Fitopatologi Indonesia. 11(4):105-112. Halami PM, Chandrashekar A. 2007. Heterologous expression, purification and refolding of an anti-listerial peptide produced by Pediococcus acidilactici K7. Electronic Journal of Biotechnology. 10(4):563-569. Handelsman J, Raffel S, Mester EH, Wunderlich L, Grau CR. 1990. Biological control of damping-off of alfalfa seedlings with Bacillus cereus UW85. Applied Environmental Microbiology. 56(3):713-718. Hauben L, Moore ERB, Vauterin L, Steenackers M, Mergaert J, Verdonck L, Swings J. 1998. Phylogenetic position of phytopathogen within the Enterobacteriaceae. Systematic and Applied Microbiology. 21(3):384-397. Inoue H, Nojima H, Okayama H. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96(1):23-28. Jiang H, Dong H, Zhang G, Yu B, Chapman LR, Fields MW. 2006. Microbial diversity in water and sediment of Lake Chaka, an athalassohaline lake in northwestern China. Applied Environmental Microbiology. 72(6):3832-3845. Jones D, Roach P, Hartmann J, Setter J. 2003. English Pronouncing Dictionary. Cambridge (GB): Cambridge University Press. Kaneshiro WS, Burger M, Vine BG, de Silva AS, Alvarez AM. 2008. Characterization of Erwinia chrysanthemi from a bacterial heart rot of pineapple outbreak in Hawaii. Plant Disease. 92(10):1444-1450. Kaplan HB, Greenberg E. 1985. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system. Journal of Bacteriology. 163(3):1210-1214. [Kementan]. 2011. Jenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina. Peraturan Menteri Pertanian (Permentan), no.93/Permentan/OT.140/12/2011, 29 Desember 2011. [Kementan]. 2015. Jenis Organisme Pengganggu Tumbuhan Karantina. Peraturan Menteri Pertanian (Permentan), no.51/Permentan/KR.010/9/2015, 23 September 2015. Kempner ES, Hanson FE. 1968. Aspects of Light Production by Photobacterium fischeri. Journal of Bacteriology. 95(3):975-979. LaSarre B, Federle MJ. 2013. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77(1):73-111. [LBL]. 2016. 16S rRNA gene. diakses pada tanggal 9 Mei 2016. tersedia pada http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/JD_Tutorial/nph-16S.cgi Leadbetter JR. 2001. Plant microbiology: Quieting the raucous crowd. Nature 411(6839):748-749. Lewin B. 1983. Genes. New York (US): John Wiley & Sons.

41 Lin YH, Xu JL, Hu J, Wang LH, Ong SL, Leadbetter JR, Zhang LH. 2003. Acyl‐homoserine lactone acylase from Ralstonia strain XJ12B represents a novel and potent class of quorum‐quenching enzymes. Molecular Microbiology. 47(3):849-860. Ma B, Hibbing ME, Kim H-S, Reedy RM, Yedidia I, Breuer J, Breuer J, Glasner JD, Perna NT, Kelman A. 2007. Host range and molecular phylogenies of the soft rot enterobacterial genera Pectobacterium and Dickeya. Phytopathology. 97(9):1150-1163. MacIntosh SC, Stone TB, Sims SR, Hunst PL, Greenplate JT, Marrone PG, Perlak FJ, Fischhoff DA, Fuchs RL. 1990. Specificity and efficacy of purified Bacillus thuringiensis proteins against agronomically important insects. Journal of Invertebrate Pathology. 56(2):258-266. McClean KH, Winson MK, Fish L, Taylor A, Chhabra SR, Camara M, Daykin M, Lamb JH, Swift S, Bycroft BW. 1997. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactones. Microbiology. 143(12):3703-3711. Mignard S, Flandrois J. 2006. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. Journal of Microbiological Methods 67(3):574-581. Miller MB, Bassler BL. 2001. Quorum sensing in bacteria. Annual Reviews in Microbiology. 55(1):165-199. Mitchell J. 2014. Genome Jigsaw: Implications of 16S Ribosomal RNA Gene Fragment Position for Bacterial Species Identification [disertasi]. Waterloo (CA): Wilfried Laurier University. Mizrahi-Man O, Davenport ER, Gilad Y. 2013. Taxonomic classification of bacterial 16S rRNA genes using short sequencing reads: evaluation of effective study designs. PloS one. 8(1):e53608. Muharam A, Indrasti R, Hanudin. 2012. Occurance of Dickeya dadantii the causal agent of bacterial soft rot on orchid in DKI Jakarta and west Java Indonesia. Crop & Environment. 3:37-44. Nasser W, Bouillant ML, Salmond G, Reverchon S. 1998. Characterization of the Erwinia chrysanthemi expI–expR locus directing the synthesis of two N‐acyl‐homoserine lactone signal molecules. Molecular Microbiology. 29(6):1391-1405. Neuhaus J-M, Ahl-Goy P, Hinz U, Flores S, Meins Jr F. 1991. High-level expression of a tobacco chitinase gene in Nicotiana sylvestris. Susceptibility of transgenic plants to Cercospora nicotianae infection. Plant Molecular Biology. 16(1):141-151. Nusrat H, Shankar P, Kushwah J, Bhushan A, Joshi J, Mukherjee T, Raju SC, Purohit HJ, Kalia VP. 2011. Diversity and polymorphism in AHL-lactonase gene (aiiA) of Bacillus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 21(10):1001-1011. Pan J, Huang T, Yao F, Huang Z, Powell CA, Qiu S, Guan X. 2008. Expression and characterization of aiiA gene from Bacillus subtilis BS-1. Microbiological Research. 163(6):711-6.

42 Park SY, Lee SJ, Oh TK, Oh JW, Koo BT, Yum DY, Lee JK. 2003. ahlD, an Nacylhomoserine lactonase in Arthrobacter sp. and predicted homologues in other bacteria. Environmental Microbiology. 149:1541-1550. Perombelon MCM, Kelman A. 1980. Ecology of the soft rot Erwinias. Annual Review of Phytopathology. 18(1):361-387. Piper KR, von Bodman SB, Farrand SK. 1993. Conjugation factor of Agrobacterium tumefaciens regulates Ti plasmid transfer by autoinduction. Nature. 362(6419):448-450. Prasannath K. 2013. Pathogenicity and virulence factors of phytobacteria. Scholars Academic Journal of Biosciences. 1(1):24-33. Reyes‐Ramírez A, Escudero‐Abarca B, Aguilar‐Uscanga G, Hayward‐Jones P, Barboza‐Corona JE. 2004. Antifungal activity of Bacillus thuringiensis chitinase and its potential for the biocontrol of phytopathogenic fungi in soybean seeds. Journal of Food Science. 69(5):M131-M134. Reverchon S, Nasser W. 2013. Dickeya ecology, environment sensing and regulation of virulence programme. Environmental Microbiology Report. 5(5):622-636. Romeis J, Meissle M, Bigler F. 2006. Transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis toxins and biological control. Nature Biotechnology. 24(1):6371. Sadeghan AA, Shams-bakhsh M, Yakhechali B. 2013. Expression of Citrus tristeza virus coat protein gene in Escherichia coli. Journal of Crop Protection. 2(4):387-393. Sakr M, Aboshanab KMA, Aboulwafa MM, Hassouna AHN. 2013. Characterization and complete sequence of lactonase enzyme from Bacillus weihenstephanensis isolate P65 with potential activity against acyl homoserine lactone signal molecules. BioMed Research International: Hindawi Publishing. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory press. Sambrook J, Russell D. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Press Samson R, Legendre JB, Christen R, Fischer-Le Saux M, Achouak W, Gardan L, 2005. Transfer of Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al. 1953) Brenner et al. 1973 and Brenneria paradisiaca to the genus Dickeya gen. nov as Dickeya chrysanthemi comb. nov and Dickeya paradisiaca comb. nov and delineation of four novel species, Dickeya dadantii sp nov., Dickeya dianthicola sp nov., Dickeya dieffenbachiae sp nov and Dickeya zeae sp nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 55:1415-1427. Schaad NW, Jones JB, Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. Minnesota (US): APS Press. Smit S, Widman J, Knight R. 2007. Evolutionary rates vary among rRNA structural elements. Nucleid Acids Research. 35(10):3339-3354. Song C, Ma H, Zhao Q, Shuishan S, Zhenhua J. 2012. Inhibition of quorum sensing activity by ethanol extract of Scutellaria baicalensis georgi. Journal of Plant Pathology & Microbiology. S7:001-004.

43 Studier FW, Rosenberg AH, Dunn JJ, Dubendorff JW. 1990. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymology. 185:60-89. Tenllado F, Llave C. 2004. RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants. Virus Research. 102(1):85-96. Tinh NTN, Dung NV, Trung CT, Thuy VT. 2013. In Vitro Characterization of a Recombinant AHL-Lactonase from Bacillus cereus Isolated from a Striped Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) Pond. Indian Journal of Microbiologyi. 53(4):485-487. Ulrich RL. 2004. Quorum quenching: enzymatic disruption of N-acyl homoserine lactone-mediated bacterial communication in Burkholderia thailandensis. Applied Environmental Microbiology. 70:6173-6180. Van Vaerenbergh J, Baeyen S, De Vos P, Maes M. 2012. Sequence diversity in the Dickeya fliC gene: phylogeny of the Dickeya genus and TaqMan® PCR for ‘D. solani’, new biovar 3 variant on potato in Europe. PloS One. 7(5):e35738. Von Bodman SB, Bauer WD, Coplin DL. 2003. Quorum sensing in plantpathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 41(1):455-482. Von Bodman SB, Farrand SK. 1995. Capsular polysaccharide biosynthesis and pathogenicity in Erwinia stewartii require induction by an Nacylhomoserine lactone autoinducer. Journal of Bacteriology. 177(17):5000-5008. Wang LH, Weng LX, Dong HY, Zhang LH. 2004. Spesifity and enzyme kinetics of the quorum quenching AHL-lactonase. The Journal of Biological Chemistry. 279:13645-13651. Weidner S, Arnold W, Puhler A. 1996. Diversity of uncultured microorganisms associated with the seagrass Halophila stipulacea estimated by restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-amplified 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology. 62(3):766-771. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173(2):697703. White CE, Finan TM. 2009. Quorum quenching in Agrobacterium tumefaciens: chance or necessity?. Journal of Bacteriology. 191(4):1123-1125. Woese CR. 1987. Bacterial evolution. Microbiological reviews. 51(2):221-271. Woo PCY, Lau SKP, Teng JLL, Tse H, Yuen KY. 2008. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology Infection. 14(10):908-934. Yates EA, Philipp B, Buckley C, Atkinson S, Chhabra SR, Sockett RE, Goldner M, Dessaux Y, Cámara M, Smith H. 2002. N-acylhomoserine lactones undergo lactonolysis in a pH-, temperature-, and acyl chain lengthdependent manner during growth of Yersinia pseudotuberculosis and Pseudomonas aeruginosa. Infection and Immunology. 70(10):5635-5646. Yin X-T, Xu L, Fan S-S, Xu L-N, Li D-C, Liu Z-Y. 2010. Isolation and characterization of an AHL lactonase gene from Bacillus amyloliquefaciens. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 26(8):1361-1367.

44 Zhang H-B, Wang L-H, Zhang L-H. 2002. Genetic control of quorum-sensing signal turnover in Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99(7):4638-4643. Zhang L, Ruan L, Hu C, Wu H, Chen S, Yu Z, Sun M. 2007. Fusion of the genes for AHL-lactonase and S-layer protein in Bacillus thuringiensis increases its ability to inhibit soft rot caused by Erwinia carotovora. Applied Microbiology and Biotechnology. 74(3):667-675. Zhang Z, Schwartz S, Wagner L, Miller W. 2000. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7(1-2):203-214.

45

LAMPIRAN

46 Lampiran 1

Daftar isolat bakteri yang digunakan dalam penapisan bakteri penghasil AHL-laktonase

No.

Kode isolat

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44

B1 B2 B11 B12 B13 B14 B15 B18 B22 B24 B25 B26 B31 B33 B34 B35 B37 B45 B47 B48 B3a B3b Bs 168 B16 B21 B23 B46 B19 B17 EKK10 BR2 GG1 GG2 GG3 GG4 GG5 GG6 GG7 GL1 GL2 GL3 GL4 GL5 BT2

Asal isolat

No. koleksi

Tembilahan, Riau Tembilahan, Riau Tembilahan, Riau Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Tembilahan, Riau Bogor, Jawa Barat Tembilahan, Riau Tembilahan, Riau Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Tembilahan, Riau Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Tembilahan, Riau Tembilahan, Riau Tembilahan, Riau Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Bogor, Jawa Barat Tembilahan, Riau Bogor, Jawa Barat Tembilahan, Riau Tembilahan, Riau Bogor, Jawa Barat

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 49 100 119 127 128 129 130 134 140 153 155 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218

47 Lampiran 2 Aktivitas degradasi AHL pada C. violaceum ditandai adanya zona hambat ungu

Keterangan: A=antibiotik Kanamisin, B =Kontrol negatif, C = isolat B13, D = isolat B2, E = isolat B13, F = isolat B18, G = isolat B37, H = isolat B3a, I = isolat B3b, J = isolat B23, K = isolat B46, L = isolat EKK10, M = isolat BR2, N = isolat GG1, O = isolat GG2, P = isolat GG3, Q = isolat GG4, R = isolat GG6, S = isolat GG7, T = isolat GL2, U = isolat GL3, V = isolat BT2

Lampiran 3

Pengujian antibiosis dalam penapisan bakteri penghasil AHLlaktonase

GG3 GG5 GG6 GL2

CV

Kan

CV

Kan B3a

GG4

GG7

BT2

CV

CV

Kan

Kan

B13

B23

B1

B2

B46

B18

EKK10

GG2

CV

Kan

B37

B3b

BR2 GG1

Keterangan: CV = C. violaceum (kontrol) Kan = C. violaceum + Kan 25 µg/ml

48 Lampiran 4 Sekuen gen 16S rRNA isolat B37 yang telah didepositkan di DDBJ LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL

FEATURES source

LC055677 602 bp DNA linear BCT 19-NOV-2015 Brevibacillus sp. B37 gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence. LC055677 LC055677.1 GI:953763863 . Brevibacillus sp. B37 Brevibacillus sp. B37 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae;Brevibacillus. 1 Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. Identification of Quorum Quenching Bacteria Base on 16S ribosomal RNA, partial sequence Unpublished 2 (bases 1 to 602) Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. Direct Submission Submitted (18-MAY-2015) Contact:Syaiful Khoiri Bogor Agricultural University, Plant Protection; Jl. Kamper, Bogor, West Java 16680,Indonesia URL :http://ptn.ipb.ac.id Location/Qualifiers 1..602 /organism="Brevibacillus sp. B37" /mol_type="genomic DNA" /strain="B37" /isolation_source="rhizosphere soil of banana" /db_xref="taxon:1656140" /country="Indonesia: West Java, Bogor" /collection_date="2013-07-13" /collected_by="Giyanto" /PCR_primers="fwd_name: 27F, fwd_seq: agagtttgatcctggctcag, rev_name: 1492R, rev_seq: ggttaccttgttacgactt" rRNA <1..>602 /product="16S ribosomal RNA" 146 a 140 c 189 g 127 t

BASE COUNT ORIGIN 1 ttgcctgcac 61 acgggtgagt 121 gctaataccg 181 cactgggaga 241 acgatgcgta 301 ctcctacggg 361 gccgcgtgaa 421 ccgttcgaat 481 ccagcagccg 541 cgcgcaggcg 601 tc

aagctgagct aacacgtagg gataggtttt tgggcctgcg gccgacctga aggcagcagt cgatgaaggt agggcggtac cggtaatacc gctatgtaaa

tggatcacga caacctgcct tggatcgcat gcgcattagc gagggtgacc agggaatttt cttcggattg cttgacggta taggtggcaa ttctggtgtt

cttgagctga ctcagactgg gatccgaaaa tagttggtgg ggccacactg ccacaatgga taaagttctg cctgacgaga gcgttgtccg aaagcccggg

gtctcggatg gataacatag gaaaaggcgg ggtaacggcc ggactgagac cgaaagtctg ttgttaggga aagccacggc gatttattgg gctcaactcc

atactctcgg ggaaacttat cttcggctgt taccaaggcg acggcccaga atggagcaac cgaataagta taactacgtg gcgtaaagcg cggtttcgca

49 Lampiran 5 Sekuen gen 16S rRNA isolat GG3 yang telah didepositkan di DDBJ LOCUS DEFINITION

LC055679 1430 bp DNA linear BCT 19-NOV-2015 Bacillus sp. GG3(2015) gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence. ACCESSION LC055679 VERSION LC055679.1 GI:953763865 KEYWORDS . SOURCE Bacillus sp. GG3(2015) ORGANISM Bacillus sp. GG3(2015) Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Identification of Quorum Quenching Bacteria Base on 16S ribosomal RNA, partial sequence JOURNAL Unpublished REFERENCE 2(bases 1 to 1430) AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (18-MAY-2015) Contact:Syaiful Khoiri Bogor Agricultural University, Plant Protection; Jl. Kamper, Bogor, West Java 16680,Indonesia URL :http://ptn.ipb.ac.id FEATURES Location/Qualifiers source 1..1430 /organism="Bacillus sp. GG3(2015)" /mol_type="genomic DNA" /strain="GG3" /isolation_source="rhizosphere soil of rice" /db_xref="taxon:1656142" /country="Indonesia: West Java, Bogor" /collection_date="2014-02-06" /collected_by="Giyanto" /PCR_primers="fwd_name: 27F, fwd_seq: agagtttgatcctggctcag, rev_name: 1492R, rev_seq: ggttaccttgttacgactt" rRNA <1..>1430 /product="16S ribosomal RNA" BASE COUNT 372 a 340 c 428 g 289 t 1 others ORIGIN 1 atgggcaatg cggctctata atgcagtcga gcgatggatt aagagcttgc tcttatgaag 61 ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc ataagactgg gataactccg 121 ggaaaccggg gctaataccg gataacattt tgaaccgcat ggttcgaaat tgaaaggcgg 181 cttcggctgt cacttatgga tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 241 caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 301 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 361 acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 421 agaacaagtg ctagttgaat aagctggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 481 taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg 541 gcgtaaagcg cgcgcaggtg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 601 gagggtcatt ggaaactggg agacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccatgtgta 661 gcggtgaaat gcgtagagat atggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt 721 aactgacact gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 781 cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgaagttaac 841 gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg 901 gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 961 ggtcttgaca tcctctgaca accctagaga tagggcttct ccttcgggag cagaatgaca 1021 ggtggtgcat ggttgtcgtc agctccgggc cggagaatgt tggggttaag tcccgcaacc 1081 aagcgcaacc ctttgatctt agttgccatc ctttaatttg ggcactctaa ggggactgcc 1141 cggtgacaaa ccngaaggaa ggtggggatg aacgccaaat catcatggcc ccttatagcc 1201 tggggttaac cacgtggtta caatgggacg gtaccaaaag cctgccaaaa ccccgaggtt 1261 ggatcttaat cccaaaaaac ccgttcccat gtccggaatg gggggttcgg aacttcgccc 1321 cattgaaaat gggaaaccct atggaatccc gcgatacaat agcgcccggg gagaaaactt 1381 tccccgggcc ctggaaccac ccccccgccc ccacccaaga gattgttaac

50 Lampiran 6 Sekuen gen 16S rRNA isolat GG6 yang telah didepositkan di DDBJ LOCUS DEFINITION

LC055680 1236 bp DNA linear BCT 19-NOV-2015 Bacillus sp. GG6(2015) gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence. ACCESSION LC055680 VERSION LC055680.1 GI:953763866 KEYWORDS . SOURCE Bacillus sp. GG6(2015) ORGANISM Bacillus sp. GG6(2015) Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Identification of Quorum Quenching Bacteria Base on 16S ribosomal RNA, partial sequence JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1236) AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (18-MAY-2015) Contact:Syaiful Khoiri Bogor Agricultural University, Plant Protection; Jl. Kamper, Bogor, West Java 16680, Indonesia URL :http://ptn.ipb.ac.id FEATURES Location/Qualifiers source 1..1236 /organism="Bacillus sp. GG6(2015)" /mol_type="genomic DNA" /strain="GG6" /isolation_source="rhizosphere soil of cabbage" /db_xref="taxon:1656143" /country="Indonesia: West Java, Bogor" /collection_date="2014-02-06" /collected_by="Giyanto and Khoiri,S." /PCR_primers="fwd_name: 27F, fwd_seq: agagtttgatcctggctcag, rev_name: 1492R, rev_seq: ggttaccttgttacgactt" rRNA <1..>1236 /product="16S ribosomal RNA" BASE COUNT 320 a 276 c 381 g 259 t ORIGIN 1 ggggcatggc gggtctataa tgcagtcgag cgaatggatt aagagcttgc tcttatgaag 61 ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgccc ataagactgg gataactccg 121 ggaaaccggg gctaataccg gataacattt tgaaccgcat ggttcgaaat tgaaaggcgg 181 cttcggctgt cacttatgga tggacccgcg tcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 241 caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 301 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 361 acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggc tttcgggtcg taaaactctg ttgttaggga 421 agaacaagtg ctagttgaat aagctggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 481 taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg gaattattgg 541 gcgtaaagcg cgcgcaggtg gtttcttaag tctgatgtga aagcccacgg ctcaaccgtg 601 gagggtcatt ggaaactggg agacttgagt gcagaagagg aaagtggaat tccatgtgta 661 gcggtgaaat gcgtagagat atggaggaac accagtggcg aaggcgactt tctggtctgt 721 aactgacact gaggcgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 781 cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttaga gggtttccgc cctttagtgc tgaagttaac 841 gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg 901 gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 961 ggtcttgaca tcctctgaca accctagaga tagggcttct ccttcgggag cagagtgaca 1021 ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc tggaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1081 cgcaaccctt tgatcttaat tgcccaccat ttaatttggg cactctaaag gtaactgccc 1141 gttgacaaac ccggaagaaa ggtggggatg accgtcaaat catcctggcc ccttaagacc 1201 tggggctacc accgtggtta caatggaacg gtacca

51 Lampiran 7 Sekuen gen 16S rRNA isolat BT2 yang telah didepositkan di DDBJ LOCUS DEFINITION

LC055678 1335 bp DNA linear BCT 19-NOV-2015 Bacillus sp. BT2 gene for 16S ribosomal RNA, partial sequence. ACCESSION LC055678 VERSION LC055678.1 GI:953763864 KEYWORDS . SOURCE Bacillus sp. BT2 ORGANISM Bacillus sp. BT2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Identification of Quorum Quenching Bacteria Base on 16S ribosomal RNA, partial sequence JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 1335) AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (18-MAY-2015) Contact:Syaiful Khoiri Bogor Agricultural University, Plant Protection; Jl. Kamper, Bogor, West Java 16680,Indonesia URL :http://ptn.ipb.ac.id Location/Qualifiers FEATURES source 1..1335 /organism="Bacillus sp. BT2" /mol_type="genomic DNA" /strain="BT2" /isolation_source="rhizosphere soil of rice" /db_xref="taxon:1656141" /country="Indonesia: West Java, Bogor" /collection_date="2014-06-02" /collected_by="Giyanto" /PCR_primers="fwd_name: 27F, fwd_seq: agagtttgatcctggctcag, rev_name: 1492R, rev_seq: ggttaccttgttacgactt" rRNA <1..>1335 /product="16S ribosomal RNA" BASE COUNT 342 a 287 c 423 g 283 t ORIGIN 1 gttggcgggt gctataatgc agtcgagcga tggattaaga gcttgctctt atgaagttag 61 cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccataa gactgggata actccgggaa 121 accggggcta ataccggata acattttgaa ctgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc 181 ggctgtcact tatggatgga cccgcgtcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 241 aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 301 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 361 agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa 421 caagtgctag ttgaataagc tggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 481 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt 541 aaagcgcgcg caggtggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg 601 gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg 661 tgaaatgcgt agagatatgg aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact 721 gacactgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 781 gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat 841 taagcactcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 901 ccgcacaagc ggtggagcat gtgggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 961 cttgacatcc tctgaaaacc ctagagatag ggctttccct ttccggagca gagtgacagg 1021 gtggtgcatg gttggtcgtc agctccgtgt cgtggagatg gtggggttaa gtccccgcaa 1081 ccgagccgca acccctttga tcttaagttg gccatcattt aaagttgggg cactcttaag 1141 ggggactggc cggtggacaa aaccgggaaa gaaggggggg ggattgacgt caaaatcaat 1201 catggcccct ttatggccct ggggcttaca acacgttgtt acaatgggac gggtacaaaa 1261 gagcttgcaa agaccccgca agggggaagc ttattcctta taaaacctgg tttccaagtt 1321 cgggattgtg aggtg

52 Lampiran 8 Homologi sekuen 16S rRNA isolat B37 dengan Brevibacillus brevis Brevibacillus brevis strain NBRC 15304 16S ribosomal RNA geneSequence ID: ref|NR_041524.1|Length: 1461 Range 1: 63 to 604

Score 976 bits(528) Query 58 Sbjct 63 Query 118 Sbjct 123 Query 178 Sbjct 183 Query 238 Sbjct 243 Query 298 Sbjct 303 Query 358 Sbjct 363 Query 418 Sbjct 423 Query 478 Sbjct 483 Query 538 Sbjct 543 Query 598 Sbjct 600

Alignment statistics for match #1 Expect Identities Gaps 0.0 540/545(99%) 3/545(0%)

Strand Plus/Plus

CGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTCTCAGACTGGGATAACATAGGGAAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTCTCAGACTGGGATAACATAGGGAAACT

117

TATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATCGCATGATCCGAAAAGAAAAGGCGGCTTCGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATCGCATGATCCGAAAAGAAAAGGCGGCTTCGGC

177

TGTCACTGGGAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGTCACTGGGAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAG

122

182 237 242

GCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC

297

AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGC

357

AACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGAATAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGAATAA

417

GTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTAC

477

GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACCTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAA |||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAA

537

GCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAATTCTGGTGTTAAAGCCCGGGGCTCAACTCCCGGTTTC |||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||| | GCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAG-TCTGGTGTTAAAGCCCGGGGCTCAAC-CCCGGTT-C

597

GCATC ||||| GCATC

602 604

302

362

422

482

542

599

53 Lampiran 9 Homologi sekuen 16S rRNA isolat GG3 dengan Bacillus cereus Bacillus cereus ATCC 14579 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Sequence ID: ref|NR_074540.1|Length: 1512 Range 1: 51 to 1315 Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 2085 bits(1129) 0.0 1236/1284(96%) 23/1284(1%) Plus/Plus Query 18 Sbjct 51 Query 75 Sbjct 111 Query 135 Sbjct 171 Query 195 Sbjct 231 Query 255 Sbjct 291 Query 315 Sbjct 351 Query 375 Sbjct 411 Query 435 Sbjct 471 Query 495 Sbjct 531 Query 555 Sbjct 591 Query 615 Sbjct 651 Query 675 Sbjct 711 Query 735 Sbjct 771 Query 795 Sbjct 831 Query 855 Sbjct 891 Query 915 Sbjct 951

ATA-ATGC-AGTCGAGCG-ATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGG ||| |||| ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGG

74 110

GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTA

134

ATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACT

194

TATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGA

254

TGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCC

314

TACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCG

374

CGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAG

434

TTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAG

494

CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCG

554

CAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAA

614

ACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGT

170

230

290

350

410

470

530

590

650 674 710

AGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGG

734

CGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATG

794

AGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCC

854

GCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGC

914

GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCT

974

770

830

890

950

1010

54 Query 975 Sbjct 1011 Query 1035 Sbjct 1071 Query 1094 Sbjct 1126 Query 1154 Sbjct 1184 Query 1214 Sbjct 1240 Query 1274 Sbjct 1294

CTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAATGACAGGTGGTGCATGGTT |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| CTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTT

1034

GTCGTCAGCTCCGGGCCG-GAGAATGTTGGGGTTAAGTCCCGCAACCAAGCGCAACCCTT ||||||||||| | | || |||| |||| ||||||||||||||||| | ||||||||| | GTCGTCAGCTC-GTGTCGTGAGA-TGTT-GGGTTAAGTCCCGCAACGA-GCGCAACCC-T

1093

TGATCTTAGTTGCCATCCTTTAATTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCCGGTGACAAACCN ||||||||||||||||| |||| ||||||||||||||| ||||| ||||||||||||| TGATCTTAGTTGCCATCA-TTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTG-CCGGTGACAAACCG

1153

GAAGGAAGGTGGGGATGAACGCCAAATCATCATGGCCCCTTATAGCCTGGGGTTAACCAC | ||||||||||||||| ||| |||||||||||| |||||||| |||||| | || || G-AGGAAGGTGGGGATG-ACGTCAAATCATCATG-CCCCTTATGACCTGGGCTACAC-AC

1213

GTGGTTACAATGGGACGGTACCAAAAGCCTGCCAAAACCCCGAGGTTGGATCTTAATCCC ||| | ||||||| ||||||| || ||| || ||| ||| |||||| ||| | ||||| | GTGCT-ACAATGG-ACGGTACAAAGAGC-TG-CAAGACCGCGAGGT-GGAGC-TAATCTC

1273

AAAAAACCCGTTCCCATGTCCGGA | |||||| |||| || || |||| ATAAAACC-GTTCTCA-GTTCGGA

1070

1125

1183

1239

1293

1297 1315

Lampiran 10 Homologi sekuen 16S rRNA isolat GG6 dengan B. cereus Bacillus cereus ATCC 14579 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Sequence ID: ref|NR_074540.1|Length: 1512 Range 1: 41 to 1258 Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 2080 bits(1126) 0.0 1199/1231(97%) 17/1231(1%) Plus/Plus Query 8 Sbjct 41 Query 65 Sbjct 101 Query 125 Sbjct 161 Query 185 Sbjct 221 Query 245 Sbjct 281 Query 305 Sbjct 341 Query 365 Sbjct 401 Query 425 Sbjct 461 Query 485 Sbjct 521 Query 545 Sbjct 581

GGCGGGTCT-ATA-ATGC-AGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAG |||| | || ||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAG

64 100

CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAA

124

ACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTC

184

GGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC

244

160

220

280

AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG

304

CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGG

364

AGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAA

340

400 424 460

CAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAAC

484

TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGT

544

AAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGG

604

520

580

640

55 Query 605 Sbjct 641 Query 665 Sbjct 701 Query 725 Sbjct 761 Query 785 Sbjct 821 Query 845 Sbjct 881 Query 905 Sbjct 941 Query 965 Sbjct 1001 Query 1025 Sbjct 1061 Query 1085 Sbjct 1121 Query 1145 Sbjct 1176 Query 1205 Sbjct 1232

GTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGG 664 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGG 700 TGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACT

724

GACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCC

784

760

820

GTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCAT 844 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCAT 880 TAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC

904

CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTC

964

TTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTG |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTG

1024

GTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCTGGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA |||||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||||||| GTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA ACCCTTTGATCTTAATTGCCCACCATTTAATTTGGGCACTCTAAAGGTAACTGCCCGTTG |||| ||||||||| ||||| | || |||| ||||||||||| ||||| |||||| || | ACCC-TTGATCTTAGTTGCC-ATCA-TTAAGTTGGGCACTCT-AAGGTGACTGCCGGT-G ACAAACCCGGAAGAAAGGTGGGGATGACCGTCAAATCATCCTGGCCCCTTAAGACCTGGG ||||||| ||| | ||||||||||||| |||||||||||| | |||||||| |||||||| ACAAACC-GGAGG-AAGGTGGGGATGA-CGTCAAATCATCAT-GCCCCTTATGACCTGGG GCTAC-CACCGTGGTTACAATGGAACGGTAC |||| ||| ||| | |||||||| |||||| -CTACACAC-GTGCT-ACAATGGA-CGGTAC

940

1000

1060 1084 1120 1144 1175 1204 1231

1234 1258

Lampiran 11 Homologi sekuen 16S rRNA isolat BT2 dengan B. thuringiensis Bacillus thuringiensis strain ATCC 10792 16S ribosomal RNA gene Sequence ID: ref|NR_114581.1|Length: 1482 Range 1: 20 to 1305 Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 2001 bits(1083) 0.0 1262/1337(94%) 57/1337(4%) Plus/Plus Query 3 Sbjct 20 Query 57 Sbjct 80 Query 117 Sbjct 140 Query 177 Sbjct 200 Query 237 Sbjct 260

TGGCGG-GTG-CT-ATA-ATGC-AGTCGAGCG-ATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAG |||||| ||| || ||| |||| ||||||||| ||||||| |||||||||||| | |||| TGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTGAGAGCTTGCTCTCAAGAAG

56 79

TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCG

116

GGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGG

176

CTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCT

236

CACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGAC

296

139

199

259

319

56 Query 297 Sbjct 320 Query 357 Sbjct 380 Query 417 Sbjct 440 Query 477 Sbjct 500 Query 537 Sbjct 560 Query 597 Sbjct 620 Query 657 Sbjct 680 Query 717 Sbjct 740 Query 777 Sbjct 800 Query 837 Sbjct 860 Query 897 Sbjct 920 Query 957 Sbjct 979 Query 1017 Sbjct 1038 Query 1077 Sbjct 1092 Query 1137 Sbjct 1143 Query 1197 Sbjct 1192 Query 1257 Sbjct 1242 Query 1317 Sbjct 1292

ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTG ACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGA AGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGG GCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTG GAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTA GCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGT

356 379 416 439 476 499 536 559 596 619 656 679 716 739

AACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA

776

CGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAAC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAAC

836

GCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGG

896

799

859

919

GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||| GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGT-GGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC

956

AGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTTCCGGAGCAGAGTGA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||| |||||||||||| AGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCC-TTCGGGAGCAGAGTGA

1016

CAGGGTGGTGCATGGTTGGTCGTCAGCTCCGTGTCGTGGAGATGGTGGGGTTAAGTCCCC || ||||||||||||||| |||||||||| |||||||| ||||| |||| ||||||||| CA-GGTGGTGCATGGTTG-TCGTCAGCTC-GTGTCGTG-AGATGTTGGG-TTAAGTCCC-

1076

GCAACCGAGCCGCAACCCCTTTGATCTTAAGTTGGCCATCATTTAAAGTTGGGGCACTCT ||||| |||| ||||||| || ||||||| |||| |||||||| || |||||| |||||| GCAAC-GAGC-GCAACCC-TT-GATCTTA-GTTG-CCATCATT-AA-GTTGGG-CACTCT

1136

TAAGGGGGACTGGCCGGTGGACAAAACCGGGAAAGAAgggggggggATTGACGTCAAAAT |||| | |||| |||||| ||||| |||| | ||||| |||| || ||||||||| | -AAGGTG-ACTG-CCGGTG-ACAAA-CCGG-AG-GAAGGTGGGG--AT-GACGTCAAA-T

1196

CAATCATGGCCCCTTTATGGCCCTGGGGCTTACAACACGTTGTTACAATGGGACGGGTAC || ||||| |||||| ||| || |||| || ||| ||||| | |||||||| |||| ||| CA-TCATG-CCCCTT-ATGACC-TGGG-CT-ACA-CACGT-GCTACAATGG-ACGG-TAC

1256

AAAAGAGCTTGCAAAGACCCCGCAAGGGGGAAGCTTATTCCTTATAAAACCTGGTTTCCA ||| ||||| |||| |||| || | || ||| ||| || | | |||||||| | | || | AAA-GAGCT-GCAA-GACCGCG-A-GGTGGA-GCTAAT-C-TCATAAAACC-GTTCTC-A

1316

AGTTCGGGATTGTGAGG |||||| ||||| ||| -GTTCGG-ATTGT-AGG

1333 1305

978

1037

1091

1142

1191

1241

1291

57 Lampiran 12 Pengaruh perlakuan terhadap perkembangan gejala busuk lunak yang disebabkan oleh D. dadantii pada kentang dan anggrek(1) Perlakuan

Diameter of soft rot (mm)

D. dadantii (control) D. dadantii +DH5α D. dadantii +B37 D. dadantii +GG3 D. dadantii +GG6 D. dadantii +BT2

Penghambatan relatif busuk lunak (%)(2)

Kentang

Anggrek

Kentang

Anggrek

55.00 a 48.83 ab 42.00 bc 38.00 bc 38.50 bc 34.50 c

46.25 a 42.50 ab 34.00 abc 32.50 abc 19.50 c 22.75 bc

00.00 a 11.04 b 23.01 c 30.85 cd 30.99 cd 36.74 d

00.00 a 08.78 a 29.46 b 32.62 b 55.22 c 49.03 c

(1)

Angka pada kolom yang sama yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada P = 0.05 Nilai diperoleh dari rumus PI=(D0-D1)/D0 x 100% (PI=persen penghambatan, D0=diameter busuk lunak pada perlakuan kontrol, D1=diameter busuk lunak pada perlakuan)

(2)

Lampiran 13

Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek dengan α=5%

Sumber keragaman Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

5 1 5 18 24 23

2217.333 26004.167 2217.333 3030.500 31252.000 5247.833

Kuadrat tengah

F hitung

443.467 2.634 26004.167 154.455 443.467 2.634 168.361

Pr>F .059 .000 .059

Nilai R2 = 0.423

Lampiran 14

Sumber keragaman Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi Nilai R2 = 0.830

Sidik ragam data penghambatan relatif busuk lunak yang disebabkan D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada anggrek dengan α=5% Derajat bebas 5 1 5 18 24 23

Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah

9407.125 20441.758 9407.125 1929.088 31777.971 11336.213

1881.425 20441.758 1881.425 107.172

F hitung

Pr>F

17.555 190.739 17.555

.000 .000 .000

58 Lampiran 15

Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada kentang dengan α=5%

Sumber keragaman Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

5 1 5 30 36 35

1777.806 65963.361 1777.806 2277.833 70019.000 4055.639

Kuadrat tengah 355.561 65963.361 355.561 75.928

F hitung 4.683 868.765 4.683

Pr>F .003 .000 .003

Nilai R2 = 0.438

Lampiran 16

Sidik ragam data penekanan busuk lunak yang disebabkan D. dadantii oleh bakteri penghasil AHL-laktonase pada kentang dengan α=5%

Sumber keragaman Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi Nilai R2 = 0.823

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah

5 1 5 30 36 35

5888.236 17590.954 5888.236 1262.202 24741.391 7150.437

1177.647 17590.954 1177.647 42.073

F hitung

Pr>F

27.990 418.102 27.990

.000 .000 .000

59 Lampiran 17 Sekuen gen aiiA dari isolat B37 yang telah didepositkan di DDBJ LOCUS DEFINITION

LC055758 753 bp mRNA linear BCT 19-NOV-2015 Brevibacillus sp. B37 aiiA mRNA for AHL-lactonase, complete cds. ACCESSION LC055758 VERSION LC055758.1 GI:953763867 KEYWORDS . SOURCE Brevibacillus sp. B37 ORGANISM Brevibacillus sp. B37 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Brevibacillus. REFERENCE 1 AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Detection of aiiA Gene from Bacillus and Their Potential as Quorum Sensing Inhibitor JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 753) AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-MAY-2015) Contact:Syaiful Khoiri Bogor Agricultural University, Plant Protection; Jl. Kamper, Bogor, West Java 16680,Indonesia URL :http://ptn.ipb.ac.id FEATURES Location/Qualifiers source 1..753 /organism="Brevibacillus sp. B37" /mol_type="mRNA" /strain="B37" /isolation_source="rhizosphere soil of banana" /db_xref="taxon:1656140" /country="Indonesia: West Java, Bogor" /collection_date="2013-07-13" /collected_by="Giyanto" /PCR_primers="fwd_name: aiiA1, fwd_seq: atgacagtaaaraarctttatttc, rev_name: aiiA2, rev_seq: tcactatatataytcmgggaactc" gene 1..753 /gene="aiiA" CDS 1..753 /gene="aiiA" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="AHL-lactonase" /protein_id="BAT57264.1" /db_xref="GI:953763868" /translation="MTVKKLYFIPAGRCMLDHSSVNSALTPGKLLNLPVWCYLLETEE GPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGDEPDDLLYIIS SHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRMEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPG VQLLYTPGHSPGHQSLFIETEQSGSVLLTIDASYTKENFVDEVPLAGVDPEIALSSIK RLREVVKKKKPIIFFGREIEKRKSVREFPANI" BASE COUNT 245 a 115 c 175 g 218 t ORIGIN 1 atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gcatgttgga tcattcgtct 61 gttaacagtg cgttaacacc ggggaaacta ttaaacttgc cggtgtggtg ttatcttttg 121 gagacggaag aaggtcctat tttagtagac acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 181 gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagatct taccgaaaat gactgaagaa 241 gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta ggggatgagc cggacgacct tttatatatt 301 attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacacca 361 attattgtgc agcgaatgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 421 tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 481 gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgctatt cattgagacg 541 gagcaatccg gttcagtttt attaacgatt gatgcatcgt acacgaaaga gaactttgta 601 gatgaagtgc cgctcgcagg agttgatcca gaaatagctt tatcttcaat taaacgttta 661 agagaagttg tgaaaaaaaa gaaaccaatt attttctttg gtcgtgagat agaaaagaga 721 aagagtgtta gagagttccc cgcaaatata tag

60 Lampiran 18 Sekuen gen aiiA dari isolat GG3 yang telah didepositkan di DDBJ LOCUS DEFINITION

LC055760 753 bp mRNA linear BCT 19-NOV-2015 Bacillus sp. GG3(2015) aiiA mRNA for AHL-lactonase, complete cds. ACCESSION LC055760 VERSION LC055760.1 GI:953763871 KEYWORDS . SOURCE Bacillus sp. GG3(2015) ORGANISM Bacillus sp. GG3(2015) Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Detection of aiiA Gene from Bacillus and Their Potential as Quorum Sensing Inhibitor JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 753) AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-MAY-2015) Contact:Syaiful Khoiri Bogor Agricultural University, Plant Protection; Jl. Kamper, Bogor, West Java 16680, Indonesia URL :http://ptn.ipb.ac.id FEATURES Location/Qualifiers source 1..753 /organism="Bacillus sp. GG3(2015)" /mol_type="mRNA" /strain="GG3" /isolation_source="rhizosphere soil of rice" /db_xref="taxon:1656142" /country="Indonesia: West Java, Bogor" /collection_date="2014-02-06" /collected_by="Giyanto" /PCR_primers="fwd_name: aiiA1, fwd_seq: atgacagtaaaraarctttatttc, rev_name: aiiA2, rev_seq: tcactatatataytcmgggaactc" gene 1..753 /gene="aiiA" CDS 1..753 /gene="aiiA" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="AHL-lactonase" /protein_id="BAT57266.1" /db_xref="GI:953763872" /translation="MTVKKLYFIPAGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEE GPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIVS SHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRKEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPG VQLLYTPGHSPGHQSLLIETEKSGPVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDSELALSSIK RLKEVVAKEKPIIFFGHDIEQEKGCKEFPEYI" BASE COUNT ORIGIN 242 a 108 c 172 g 231 t 1 atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 61 gttaatagta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 121 gagacagaag aggggcctat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 181 gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa gggcagattt taccgaaaat gactgaagaa 241 gatagaatcg taaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 301 gttagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 361 attattgtgc aacgaaagga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 421 tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 481 gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgctatt aattgagaca 541 gaaaaatccg gtcctgtatt attaacgatt gatgcatctt atacgaaaga aaattttgaa 601 gatgaagtgc cgttcgcggg atttgattcg gaattagctt tatcttccat taaacgttta 661 aaagaagttg tggcgaaaga gaagccaatt attttctttg gtcatgatat agagcaggaa 721 aagggttgta aagagttccc ggaatatata tag

61 Lampiran 19 Sekuen gen aiiA dari isolat GG6 yang telah didepositkan di DDBJ LOCUS DEFINITION

LC055761 753 bp mRNA linear BCT 19-NOV-2015 Bacillus sp. GG6(2015) aiiA mRNA for AHL-lactonase, complete cds. ACCESSION LC055761 VERSION LC055761.1 GI:953763873 KEYWORDS . SOURCE Bacillus sp. GG6(2015) ORGANISM Bacillus sp. GG6(2015) Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Detection of aiiA Gene from Bacillus and Their Potential as Quorum Sensing Inhibitor JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 753) AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-MAY-2015) Contact:Syaiful Khoiri Bogor Agricultural University, Plant Protection; Jl. Kamper, Bogor, West Java 16680, Indonesia URL :http://ptn.ipb.ac.id FEATURES Location/Qualifiers source 1..753 /organism="Bacillus sp. GG6(2015)" /mol_type="mRNA" /strain="GG6" /isolation_source="rhizosphere soil of cabbage" /db_xref="taxon:1656143" /country="Indonesia: West Java, Bogor" /collection_date="2014-02-06" /collected_by="Giyanto and Khoiri,S." /PCR_primers="fwd_name: aiiA1, fwd_seq: atgacagtaaaraarctttatttc, rev_name: aiiA2, rev_seq: tcactatatataytcmgggaactc" gene 1..753 /gene="aiiA" CDS 1..753 /gene="aiiA" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="AHL-lactonase" /protein_id="BAT57267.1" /db_xref="GI:953763874" /translation="MTVKKLYFIPAGRCMLDHSSVNSTLAPGNLLNLPVWCYLLETEE GPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIVS SHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRKEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPG VQLLYTPGHSPGHQSLLIETEKSGPVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDSELALSSIK RLKEVVAKEKPIIFFGHDIEQEKGCKEFPEYI" BASE COUNT 242 a 108 c 172 g 231 t ORIGIN 1 atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gtatgttaga tcattcttct 61 gttaatagta cactcgcgcc ggggaattta ttgaacttac ctgtatggtg ttatcttttg 121 gagacagaag aggggcctat tttagtagat acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 181 gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa gggcagattt taccgaaaat gactgaagaa 241 gatagaatcg taaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 301 gttagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacaccg 361 attattgtgc aacgaaagga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 421 tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 481 gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgctatt aattgagaca 541 gaaaaatccg gtcctgtatt attaacgatt gatgcatctt atacgaaaga aaattttgaa 601 gatgaagtgc cgttcgcggg atttgattcg gaattagctt tatcttccat taaacgttta 661 aaagaagttg tggcgaaaga gaagccaatt attttctttg gtcatgatat agagcaggaa 721 aagggttgta aagagttccc ggaatatata tag

62 Lampiran 20 Sekuen gen aiiA dari isolat BT2 yang telah didepositkan di DDBJ LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM

LC055759 753 bp mRNA linear BCT 19-NOV-2015 Bacillus sp. BT2 aiiA mRNA for AHL-lactonase, complete cds. LC055759 LC055759.1 GI:953763869 . Bacillus sp. BT2 Bacillus sp. BT2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus. REFERENCE 1 AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Detection of aiiA Gene from Bacillus and Their Potential as Quorum Sensing Inhibitor JOURNAL Unpublished REFERENCE 2(bases 1 to 753) AUTHORS Khoiri,S., Damayanti,T.A. and Giyanto. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-MAY-2015) Contact:Syaiful Khoiri Bogor Agricultural University, Plant Protection; Jl. Kamper, Bogor, West Java 16680, Indonesia URL :http://ptn.ipb.ac.id FEATURES Location/Qualifiers source 1..753 /organism="Bacillus sp. BT2" /mol_type="mRNA" /strain="BT2" /isolation_source="rhizosphere soil of rice" /db_xref="taxon:1656141" /country="Indonesia: West Java, Bogor" /collection_date="2014-06-02" /collected_by="Giyanto" /PCR_primers="fwd_name: aiiA1, fwd_seq: atgacagtaaaraarctttatttc, rev_name: aiiA2, rev_seq: tcactatatataytcmgggaactc" gene 1..753 /gene="aiiA" CDS 1..753 /gene="aiiA" /codon_start=1 /transl_table=11 /product="AHL-lactonase" /protein_id="BAT57265.1" /db_xref="GI:953763870" /translation="MTVKKLYFIPAGRCMLDHSSVNSALTPGKLLNLPVWCYLLETEE GPILVDTGMPESAVNNEGLFNGTFVEGQILPKMTEEDRIVNILKRVGYEPDDLLYIIS SHLHFDHAGGNGAFTNTPIIVQRTEYEAALHREEYMKECILPHLNYKIIEGDYEVVPG VQLLYTPGHSPGHQSLFIETEQSGSVLLTIDASYTKENFEDEVPFAGFDPELALSSIK RLKEVVKKEKPIIFFGHDIEQEKSCREFPEYI" BASE COUNT 244 a 113 c 173 g 223 t ORIGIN 1 atgacagtaa agaagcttta tttcatccca gcaggtcgtt gcatgttgga tcattcgtct 61 gttaacagtg cgttaacacc ggggaaacta ttaaacttgc cggtgtggtg ttatcttttg 121 gagacggaag aaggtcctat tttagtagac acaggtatgc cagaaagtgc agttaataat 181 gaagggcttt ttaacggtac atttgttgaa ggacagatct taccgaaaat gactgaagaa 241 gatagaatcg tgaatatatt aaagcgtgta gggtatgagc cggacgacct tttatatatt 301 attagttctc acttacattt tgatcatgca ggaggaaacg gtgcttttac aaatacacca 361 attattgtgc agcgaacgga atatgaggca gcacttcata gagaagaata tatgaaagaa 421 tgtatattac cgcatttgaa ctacaaaatt attgaagggg attatgaagt ggtaccaggt 481 gttcaattat tgtatacgcc aggtcattct ccaggccatc agtcgctatt cattgagacg 541 gagcaatccg gttcagtttt attaacgatt gatgcatcgt acacgaaaga gaattttgaa 601 gatgaagtgc cgttcgcagg atttgatcca gaattagctt tatcttcaat taaacgttta 661 aaagaagttg tgaaaaaaga gaaaccaatt attttctttg gtcatgatat agagcaggaa 721 aagagttgta gagagttccc ggaatatata tag

63 Lampiran 21 Kesejajaran sekuen gen aiiA hasil sekuensing dari isolat B37, GG3, GG6, dan BT2 aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 5 ATGACAGTAA ATGACAGTAA ATGACAGTAA ATGACAGTAA

....|....| 15 AGAAGCTTTA AGAAGCTTTA AGAAGCTTTA AGAAGCTTTA

....|....| 25 TTTCATCCCA TTTCATCCCA TTTCATCCCA TTTCATCCCA

....|....| 35 GCAGGTCGTT GCAGGTCGTT GCAGGTCGTT GCAGGTCGTT

....|....| 45 GCATGTTGGA GTATGTTAGA GTATGTTAGA GCATGTTGGA

....|....| 55 TCATTCGTCT TCATTCTTCT TCATTCTTCT TCATTCGTCT

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 65 GTTAACAGTG GTTAATAGTA GTTAATAGTA GTTAACAGTG

....|....| 75 CGTTAACACC CACTCGCGCC CACTCGCGCC CGTTAACACC

....|....| 85 GGGGAAACTA GGGGAATTTA GGGGAATTTA GGGGAAACTA

....|....| 95 TTAAACTTGC TTGAACTTAC TTGAACTTAC TTAAACTTGC

....|....| 105 CGGTGTGGTG CTGTATGGTG CTGTATGGTG CGGTGTGGTG

....|....| 115 TTATCTTTTG TTATCTTTTG TTATCTTTTG TTATCTTTTG

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 125 GAGACGGAAG GAGACAGAAG GAGACAGAAG GAGACGGAAG

....|....| 135 AAGGTCCTAT AGGGGCCTAT AGGGGCCTAT AAGGTCCTAT

....|....| 145 TTTAGTAGAC TTTAGTAGAT TTTAGTAGAT TTTAGTAGAC

....|....| 155 ACAGGTATGC ACAGGTATGC ACAGGTATGC ACAGGTATGC

....|....| 165 CAGAAAGTGC CAGAAAGTGC CAGAAAGTGC CAGAAAGTGC

....|....| 175 AGTTAATAAT AGTTAATAAT AGTTAATAAT AGTTAATAAT

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 185 GAAGGGCTTT GAAGGGCTTT GAAGGGCTTT GAAGGGCTTT

....|....| 195 TTAACGGTAC TTAACGGTAC TTAACGGTAC TTAACGGTAC

....|....| 205 ATTTGTTGAA ATTTGTTGAA ATTTGTTGAA ATTTGTTGAA

....|....| 215 GGACAGATCT GGGCAGATTT GGGCAGATTT GGACAGATCT

....|....| 225 TACCGAAAAT TACCGAAAAT TACCGAAAAT TACCGAAAAT

....|....| 235 GACTGAAGAA GACTGAAGAA GACTGAAGAA GACTGAAGAA

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 245 GATAGAATCG GATAGAATCG GATAGAATCG GATAGAATCG

....|....| 255 TGAATATATT TAAATATATT TAAATATATT TGAATATATT

....|....| 265 AAAGCGTGTA AAAGCGTGTA AAAGCGTGTA AAAGCGTGTA

....|....| 275 GGGGATGAGC GGGTATGAGC GGGTATGAGC GGGTATGAGC

....|....| 285 CGGACGACCT CGGACGACCT CGGACGACCT CGGACGACCT

....|....| 295 TTTATATATT TTTATATATT TTTATATATT TTTATATATT

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 305 ATTAGTTCTC GTTAGTTCTC GTTAGTTCTC ATTAGTTCTC

....|....| 315 ACTTACATTT ACTTACATTT ACTTACATTT ACTTACATTT

....|....| 325 TGATCATGCA TGATCATGCA TGATCATGCA TGATCATGCA

....|....| 335 GGAGGAAACG GGAGGAAACG GGAGGAAACG GGAGGAAACG

....|....| 345 GTGCTTTTAC GTGCTTTTAC GTGCTTTTAC GTGCTTTTAC

....|....| 355 AAATACACCA AAATACACCG AAATACACCG AAATACACCA

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 365 ATTATTGTGC ATTATTGTGC ATTATTGTGC ATTATTGTGC

....|....| 375 AGCGAATGGA AACGAAAGGA AACGAAAGGA AGCGAACGGA

....|....| 385 ATATGAGGCA ATATGAGGCA ATATGAGGCA ATATGAGGCA

....|....| 395 GCACTTCATA GCACTTCATA GCACTTCATA GCACTTCATA

....|....| 405 GAGAAGAATA GAGAAGAATA GAGAAGAATA GAGAAGAATA

....|....| 415 TATGAAAGAA TATGAAAGAA TATGAAAGAA TATGAAAGAA

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 425 TGTATATTAC TGTATATTAC TGTATATTAC TGTATATTAC

....|....| 435 CGCATTTGAA CGCATTTGAA CGCATTTGAA CGCATTTGAA

....|....| 445 CTACAAAATT CTACAAAATT CTACAAAATT CTACAAAATT

....|....| 455 ATTGAAGGGG ATTGAAGGGG ATTGAAGGGG ATTGAAGGGG

....|....| 465 ATTATGAAGT ATTATGAAGT ATTATGAAGT ATTATGAAGT

....|....| 475 GGTACCAGGT GGTACCAGGT GGTACCAGGT GGTACCAGGT

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 485 GTTCAATTAT GTTCAATTAT GTTCAATTAT GTTCAATTAT

....|....| 495 TGTATACGCC TGTATACGCC TGTATACGCC TGTATACGCC

....|....| 505 AGGTCATTCT AGGTCATTCT AGGTCATTCT AGGTCATTCT

....|....| 515 CCAGGCCATC CCAGGCCATC CCAGGCCATC CCAGGCCATC

....|....| 525 AGTCGCTATT AGTCGCTATT AGTCGCTATT AGTCGCTATT

....|....| 535 CATTGAGACG AATTGAGACA AATTGAGACA CATTGAGACG

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 545 GAGCAATCCG GAAAAATCCG GAAAAATCCG GAGCAATCCG

....|....| 555 GTTCAGTTTT GTCCTGTATT GTCCTGTATT GTTCAGTTTT

....|....| 565 ATTAACGATT ATTAACGATT ATTAACGATT ATTAACGATT

....|....| 575 GATGCATCGT GATGCATCTT GATGCATCTT GATGCATCGT

....|....| 585 ACACGAAAGA ATACGAAAGA ATACGAAAGA ACACGAAAGA

....|....| 595 GAACTTTGTA AAATTTTGAA AAATTTTGAA GAATTTTGAA

64

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 605 GATGAAGTGC GATGAAGTGC GATGAAGTGC GATGAAGTGC

....|....| 615 CGCTCGCAGG CGTTCGCGGG CGTTCGCGGG CGTTCGCAGG

....|....| 625 AGTTGATCCA ATTTGATTCG ATTTGATTCG ATTTGATCCA

....|....| 635 GAAATAGCTT GAATTAGCTT GAATTAGCTT GAATTAGCTT

....|....| 645 TATCTTCAAT TATCTTCCAT TATCTTCCAT TATCTTCAAT

....|....| 655 TAAACGTTTA TAAACGTTTA TAAACGTTTA TAAACGTTTA

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 665 AGAGAAGTTG AAAGAAGTTG AAAGAAGTTG AAAGAAGTTG

....|....| 675 TGAAAAAAAA TGGCGAAAGA TGGCGAAAGA TGAAAAAAGA

....|....| 685 GAAACCAATT GAAGCCAATT GAAGCCAATT GAAACCAATT

....|....| 695 ATTTTCTTTG ATTTTCTTTG ATTTTCTTTG ATTTTCTTTG

....|....| 705 GTCGTGAGAT GTCATGATAT GTCATGATAT GTCATGATAT

....|....| 715 AGAAAAGAGA AGAGCAGGAA AGAGCAGGAA AGAGCAGGAA

....|....| 735 GAGAGTTCCC AAGAGTTCCC AAGAGTTCCC GAGAGTTCCC

....|....| 745 CGCAAATATA GGAATATATA GGAATATATA GGAATATATA

...

aiiA_B37 aiiA_GG3 aiiA_GG6 aiiA BT2

....|....| 725 AAGAGTGTTA AAGGGTTGTA AAGGGTTGTA AAGAGTTGTA

TAG TAG TAG TAG

Keterangan: ATG = start kodon TAG = stop kodon

Lampiran 22 Analisis homologi asam amino AiiA dari isolat B37, GG3, GG6, dan BT2 AiiA_B37

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| MTVKKLYFIP AGRCMLDHSS VNSALTPGKL LNLPVWCYLL ETEEGPILVD TGMPESAVNN

AiiA_GG3 AiiA_GG6

MTVKKLYFIP AGRCMLDHSS VNSTLAPGNL LNLPVWCYLL ETEEGPILVD TGMPESAVNN MTVKKLYFIP AGRCMLDHSS VNSTLAPGNL LNLPVWCYLL ETEEGPILVD TGMPESAVNN

AiiA_BT2

MTVKKLYFIP AGRCMLDHSS VNSALTPGKL LNLPVWCYLL ETEEGPILVD TGMPESAVNN

AiiA_B37 AiiA_GG3

....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 65 75 85 95 105 115 EGLFNGTFVE GQILPKMTEE DRIVNILKRV GDEPDDLLYI ISSHLHFDHA GGNGAFTNTP EGLFNGTFVE GQILPKMTEE DRIVNILKRV GYEPDDLLYI VSSHLHFDHA GGNGAFTNTP

AiiA_GG6 AiiA_BT2

EGLFNGTFVE GQILPKMTEE DRIVNILKRV GYEPDDLLYI VSSHLHFDHA GGNGAFTNTP EGLFNGTFVE GQILPKMTEE DRIVNILKRV GYEPDDLLYI ISSHLHFDHA GGNGAFTNTP ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

AiiA_B37

125 135 145 155 165 175 IIVQRMEYEA ALHREEYMKE CILPHLNYKI IEGDYEVVPG VQLLYTPGHS PGHQSLFIET

AiiA_GG3 AiiA_GG6

IIVQRKEYEA ALHREEYMKE CILPHLNYKI IEGDYEVVPG VQLLYTPGHS PGHQSLLIET IIVQRKEYEA ALHREEYMKE CILPHLNYKI IEGDYEVVPG VQLLYTPGHS PGHQSLLIET

AiiA_BT2

IIVQRTEYEA ALHREEYMKE CILPHLNYKI IEGDYEVVPG VQLLYTPGHS PGHQSLFIET ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 185 195 205 215 225 235

AiiA_B37

EQSGSVLLTI DASYTKENFV DEVPLAGVDP EIALSSIKRL REVVKKKKPI IFFGREIEKR

AiiA_GG3 AiiA_GG6

EKSGPVLLTI DASYTKENFE DEVPFAGFDS ELALSSIKRL KEVVAKEKPI IFFGHDIEQE EKSGPVLLTI DASYTKENFE DEVPFAGFDS ELALSSIKRL KEVVAKEKPI IFFGHDIEQE

AiiA_BT2

EQSGSVLLTI DASYTKENFE DEVPFAGFDP ELALSSIKRL KEVVKKEKPI IFFGHDIEQE ....|....| . 245

AiiA_B37 AiiA_GG3

KSVREFPANI * KGCKEFPEYI *

AiiA_GG6 AiiA_BT2

KGCKEFPEYI * KSCREFPEYI *

Keterangan: * Merupakan kodon stop 103 SHLHFDH109 dan 166TPGHSPGH173 merupakan karakteristik famili metallo-beta-lactamase.

65 Lampiran 23 Sidik ragam data diameter zona hambat violacein C. violaceum oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam Sumber keragaman

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah

F hitung

Pr>F

3.570 86.119 3.570

.015 .000 .015

60.077 626.273 60.077

.000 .000 .000

24 jam Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi

5 1 5 24 30 29

1144.567 5521.633 1144.567 1538.800 8205.000 2683.367

228.913 5521.633 228.913 64.117

Nilai R2=0.427

48 jam Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi Nilai R2=962

5 1 5 12 18 17

2937.111 6123.556 2937.111 117.333 9178.000 3054.444

587.422 6123.556 587.422 9.778 587.422 6123.556

66 Lampiran 24 Sidik ragam diameter busuk lunak pada kentang oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam Sumber keragaman

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah

F hitung

Pr>F

3.570 86.119 3.570

.015 .000 .015

2.275 80.720 2.275

.079 .000 .079

24 jam Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi

5 1 5 24 30 29

1144.567 5521.633 1144.567 1538.800 8205.000 2683.367

228.913 5521.633 228.913 64.117

Nilai R2=0.427

48 jam Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi Nilai R2=0.332

5 1 5 24 30 29

1526.000 10830.000 1526.000 3220.000 15576.000 4746.000

305.200 10830.000 305.200 134.167

67 Lampiran 25 Sidik ragam tingkat hambatan relatif busuk lunak pada kentang oleh E. coli BL21 (DE3) rekombinan gen aiiA setelah 24 jam dan 48 jam Sumber keragaman

Derajat bebas

Jumlah kuadrat

Kuadrat tengah

F hitung

Pr>F

3.477 148.615 3.477

.026 .000 .026

4.023 132.445 4.023

.015 .000 .015

24 jam Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi

4 1 4 20 25 24

5406.766 57768.890 5406.766 7774.279 70949.934 13181.045

1351.691 57768.890 1351.691 388.714

Nilai R2=0.410

48 jam Model terkoreksi Intercept Perlakuan Error Total Total terkoreksi Nilai R2=0.446

4 1 4 20 25 24

6129.319 50448.271 6129.319 7617.979 64195.569 13747.297

1532.330 50448.271 1532.330 380.899

68

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Rembang pada tanggal 10 Agustus 1990 sebagai anak kedua dari dua bersaudara dari pasangan Yusuf dan Khuzaemah (alm.). Tahun 2008 penulis diterima di IPB untuk melanjutkan pendidikan sarjana progam studi Proteksi Tanaman melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI) dan lulus tahun 2013. Pada tahun yang sama penulis diterima di Program Studi Fitopatologi pada Program Pascasarjana IPB dengan memperoleh beasiswa pendidikan pascasarjana dalam negeri (BPPDN) tahun 2013 oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI). Selama mengikuti program S2, penulis menjadi pengurus Forum Mahasiswa Pascasarjana Entomologi-Fitopatologi periode 2013/2014 dan 2014/2015. Penulis juga menjadi asisten mata kuliah Bakteri Patogen Tumbuhan dan Pengendalian Hayati & Pengelolaan Habitat. Selain itu penulis juga aktif dalam kegiatan internasional. Pada tahun 2015 penulis mengikuti kegiatan International Summer Course Institut pertanian Bogor dan perguruan tinggi Jepang diantaranya Ibaraki University, Tokyo University of Agriculture and Technology, University of the Ryukyus, dan Ehime University. Dalam kegiatan tersebut penulis memperoleh predikat “Best Poster dan Best Group”. Tahun 2016, penulis mengikuti program International winter course di Okinawa yang diselenggarakan oleh University of the Ryukyus dan diikuti oleh beberapa universitas di Asia, yaitu Institut Pertanian Bogor, Khon Kaen University (Thailand), Shar-e Bangla Agricultural University (Bangladesh), dan University of Ruhuna (Sri Lanka). Karya ilmiah yang berjudul “Identification of Quorum Quenching Bacteria and Their Biocontrol Potential against Soft Rot Disease Bacteria, Dickeya dadantii” yang merupakan bagian dari tesis ini diterbitkan pada jurnal AGRIVITA Journal of Agricultural Sciences (AJAS).