PENAPISAN BAKTERIOSIN PENGHAMBAT PERTUMBUHAN ESCHERICHIA COLI ENTEROTOKSIGENIK

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2013

PENAPISAN BAKTERIOSIN PENGHAMBAT PERTUMBUHAN ESCHERICHIA COLI ENTEROTOKSIGENIK (Screening of Bacteria Producing Bacteriocin as a Growth Inhibitors of Enterotoksigenik Escherichia coli) Siti Chotiah Balai Besar Penelitian Veteriner Jl. RE Martadinata No. 30, Bogor 16114 [email protected]

ABSTRACT Bacteriocins are antimicrobial peptides that are synthesized ribosomlly by many species of bacteria, and in general just showed bactericidal or bacteriostatic activity against other bacteria that are closely related to the producing strain. The purpose of this study was to determine the barriers to the growth of bacteria producing bacteriocins against local isolates of enterotoxigenic E. coli (ETEC) that cause neonatal diarrhea in calves. One hundred ninety-two samples consisting of 101 rectal swabs and 91 row milk from cows at the farm have been isolated, identified and conducted screening for bacteriocin-producing bacteria using agar diffusion test against strains of ETEC as indicator bacteria. Results showed that 12 isolates of bacteria producing bacteriocins isolated 151 bacterial isolates showed growth inhibition activity with inhibition zone diameter of 15 mm shown by Enterobacter cloacae SRUT, Enterobacter cloacae SRNU and Enterococcus faecalis SK39. Thus, this study indicated that three bacteria producing bacteriocins have the capacity to inhibit ETEC strains would be possible to design new biocontrol of this pathogen in calves. Key Words: Bacteriocin Producing Bacteria, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterotoxigenic E. coli ABSTRAK Bakteriosin adalah peptida antimikroba yang disintesis secara ribosom oleh spesies bakteri, dan pada umumnya hanya menunjukkan aktivitas bakterisidal atau bakteriostatik terhadap bakteri. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui hambatan pertumbuhan bakteri penghasil bakteriosin terhadap isolat lokal galur E. Coli enterotoksigenik (ETEC) yang menyebabkan diare neonatal pada anak sapi. Seratus sembilan puluh dua sampel yang terdiri dari 101 swab rektal dan 91 susu dari sapi peternak telah diisolasi, diidentifikasi dan dilakukan penapisan terhadap bakteri penghasil bakteriosin menggunakan uji difusi agar terhadap galur ETEC sebagai bakteri indikator. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 12 isolat bakteri penghasil bakteriosin dari 151 isolat bakteri yang terisolasi menunjukkan aktifitas hambatan pertumbuhan dengan diameter zona hambat sebesar 15 mm ditunjukkan oleh Enterobacter cloacae SRUT, Enterobacter cloacae SRNU dan Enterococcus faecalis SK39. Studi ini mengindikasikan bahwa tiga bakteri penghasil bakteriosin tersebut potensial untuk digunakan sebagai kontrol biologi pada sapi. Kata Kunci: Bakteri Penghasil Bakteriosin, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterotoksigenik E. coli

PENDAHULUAN Escherichia coli patogenik yang dapat menimbulkan penyakit pada saluran pencernaan diantaranya E. coli enterotoksigenik (ETEC) menyebabkan diare

pada anak babi, sapi dan kambing dan E. coli verotoksigenik (VTEC) menyebabkan hemoragik enterokolitis pada anak sapi, diare pada anak babi baru disapih dan hemoragik kolitis dan hemolitik uremik sindroma pada manusia (Quin et al. 2002). Salah satu agen

401

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2013

bakteri patogen penyebab diare yang banyak ditemukan adalah bakteri ETEC serotipe K99 dan enterohemoragik E. coli (EHEC). Di Indonesia kasus diare neonatal pada sapi perah di Sukabumi dan Bandung berkisar antara 19,3-36% (Supar dan Hirst 1985) dan aplikasi vaksin ETEC terhadap induk sapi perah pada tingkat akhir kebuntingan dapat menurunkan kematian dari rata-rata 13% per bulan menjadi 0,7%. (Supar et al. 1998). Angka kesakitan (morbiditas) dan kematian (mortalitas) pada anak sapi sangat beragam tergantung pada faktor penyebabnya. Menurut Wudu et al. (2008) melaporkan bahwa angka kesakitan dan kematian pada anak sapi masingmasing dapat mencapai 62 dan 22%, kejadian tertinggi sebanyak 39% disebabkan oleh kasus diare. Anak sapi penderita diare akan mengalami kekurangan cairan yang mengandung garam mineral atau elektrolit sehingga terjadi dehidrasi dan asidosis yang dapat menyebabkan kematian. Kerugian ekonomi yang dirasakan oleh peternak akibat biaya obat dan tenaga pengobatan, kematian dan gangguan pertumbuhan pada penderita yang masih bertahan hidup (Anderson et al. 2003; Swift et al. 1996). Tujuan dari studi ini adalah untuk mengisolasi dan karakterisasi bakteri penghasil bakteriosin hasil isolasi dari sapi yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri ETEC pada bahan pangan asal ternak.

dimurnikan dan disimpan dalam medium semi solid untuk dikerjakan lebih lanjut.

MATERI DAN METODE

Pengujian aktifitas antibakteri dikelompokkan menjadi dua kelompok yaitu kelompok bakteri Gram negatif dan kelompok bakteri Gram positif menggunakan metode agar spot tests masing-masing mengacu pada Kumar et al. (2009) dan Herreros et al. (2005) dan dimodifikasi. Setiap isolat bakteri Gram negatif yang akan diuji ditumbuhkan dahulu di dalam medium cair Luria Bertani Miller (LBM) (Diffco, Inggris) selama satu malam pada suhu 37oC sambil digoyang kurang lebih 100 rpm. Sebanyak 1 ml biakan tersebut ditambahkan ke dalam 10 ml medium yang sama dan diinkubasikan selama 1 jam, kemudian ditambahkan mitomycin C (200 ng/ml) dan inkubasi dilanjutkan selama 4 jam. Kultur di sentrifuge dengan kecepatan 10.000 x g selama 5 menit pada suhu 4oC. Filtrat yang diperoleh

Isolasi bakteri Sebanyak 192 sampel yang terdiri dari 101 sampel swab rektal dan 91 susu dari sapi yang diambil di peternakan di Jawa Barat. Sampel diambil seaseptis mungkin, dikumpulkan ke dalam boks berisi pendingin dan dibawa ke laboratorium Bbalitvet. Sampai di laboratorium masing-masing sampel disebarkan kedalam medium penumbuh bakteri Gram negatif dan Gram positif masing-masing berurutan adalah Chromo ID Coli agar (Biomerieux, Perancis) dan De Mean Rogosa Shape (MRS) agar (Oxoid, Inggris). Selanjutnya diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37C kondisi aerob dan anaerob. Koloni bakteri yang tumbuh

402

Isolat bakteri indikator Isolat lokal ETEC serotipe K99 menghasilkan enterotoksin tahan panas dan dapat menyebabkan diare neonatal pada anak sapi perah digunakan sebagai indikator. Isolat diperoleh dari koleksi BB Litvet Culture Collection dengan nomor BCC B2422, digunakan pada penelitian ini sebagai indikator bakteri patogen. Ampul yang berisi isolat tersebut dibuka menggunakan alat pembuka didalam biosavety cabinet (BSC) kelas II. Selanjutnya disuspensikan dalam medium kaldu Brain Hart Inffusion (BHI), diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Biakan dipindahkan kedalam medium padat Chromo ID Coli dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Isolat E. coli tersebur dilakukan identifikasi ulang, dan berdasarkan karakteristik biokemik menggunakan perangkat identifikasi API 20 E (Biomereux, Perancis). Selanjutnya E. coli yang teridentifikasi di uji terhadap antigen perlekatan K99, dan antigen flagela F41 dengan metode standar slide agglutination (Sojka 1965) menggunakan anti serum K99 dan F41 (buatan Bbalitvet). Aktifitas antibakteri terhadap indikator bakteri patogen

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2013

disaring menggunakan filter 0,45 um dan disimpan pada suhu 5C untuk digunakan lebih lanjut. Masing-masing bakteri patogen sebagai indikator atau tantang ditumbuhkan dalam medium kaldu BHI, diinkubasi pada suhu 37oC selama 1 malam. Sebanyak 0,5 ml suspensi biakan tersebut pada konsentrasi sekitar 107 cfu (Mc.Farland nomor 0,5) dicampurkan kedalam 5 ml medium padat lunak LBM (47oC). Selanjutnya dituangkan ke dalam cawan petri yang berisikan 5 ml medium padat LBM dan didiamkan pada suhu 5oC selama 1 jam. Kemudian teteskan 10 l filtrat yang akan diuji diatas medium padat lunak tersebut dan didiamkan pada suhu 4oC selama 1 jam. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 37oC selama 18-24 jam. Amati zona jernih yang terjadi sekitar tetesan dan diukur diameternya. Dengan perlakuan yang sama seperti tersebut diatas dilakukan pula pada semua isolat bakteri Gram positif yang akan diuji. Hanya disini bedanya adalah medium yang dipakai kaldu MRS dan tidak menggunakan starter maupun penambahan mitomycin C dan inkubasi selama 18-24 jam. Medium padat dan lunak yang dipakai adalah BHI. Identifikasi bakteri penghasil bakteriosin (BPB) Identifikasi BPB menggunakan metode standar menurut (Quin et al. 2002; Barrow dan

Feltham 2003) dan dimodifikasi dengan menggunakan medium spesifik untuk masingmasing bakteri. Masing-masing isolat yang berpotensi memproduksi bakteriosin hasil dari penapisan tersebut diatas dalam keadaan murni umur 24 jam diwarnai dengan pewarnaan Gram dan dilakukan pemeriksaan morfologi secara mikroskopik. Kemudian uji biokimia dilakukan dengan API 20 E (Biomereux, Perancis), sedangkan kelompok bakteri Gram positif dengan API 50 CHL (Biomereux, Perancis), BBL Crystal ANR dan BBL Crystal GP (Becton Dickinson, Amerika). HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi bakteri dari 192 sampel yang diperiksa diperoleh 151 isolat bakteri yang terdiri dari 73 isolat kelompok Gram negatif dan 78 isolat kelompok Gram positif. Setelah dipelajari lebih lanjut melalui penapisan terhadap bakteri penghasil bakteriosin yang memiliki aktifitas antibakteri terhadap isolat lokal ETEC serotipe K99, hasilnya dipaparkan di dalam Tabel 1. Pada studi ini, dari 151 isolat bakteri yang ditapis diperoleh 12 isolat BPB yang menunjukkan aktifitas antibakteri terhadap ETEC serotipe K99 yang dapat menyebabkan diare pada anak sapi perah (Supar 1996), isolat selebihnya negatif. Setelah dilakukan identifikasi terhadap 12 isolat BPB, diperoleh 7

Tabel 1. Aktifitas antibakteri terhadap isolat lokal E. coli enterotoksigenik (ETEC) serotipe K99 produksi toksin tahan panas nonor BCC B2422 Kelompok Gram Spesies ETEC serotipe K99 Diameter zona (mm) Negatif E. coli membentuk zona bening 8 E. coli membentuk zona bening 8

Positif

E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. cloacae E. cloacae Bakteri lainnya sebanyak 64 isolat E. faecalis Bifidobacterium dentium Streptococcus uberis Bakteri lainnya sebanyak 75 isolat

membentuk zona bening membentuk zona bening membentuk zona bening membentuk zona bening membentuk zona bening membentuk zona bening membentuk zona bening membentuk zona bening tidak membentuk zona bening membentuk zona bening membentuk zona bening membentuk zona bening tidak membentuk zona bening

8 8 8 8 8 8 15 15 0 15 8 11 0

403

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2013

isolat E. coli, 2 isolat E. cloacae, 1 isolat E. faecalis, 1 isolat Bifidobacterium dentium dan 1 isolat Streptococcus uberis. E. coli dan E. cloacae adalah bakteri Gram positif termasuk dalam kelompok Enterobacteria dan diperoleh dari sampel swab rektal. E. faecalis, B. dentium dan Streptococcus adalah bakteri Gram positif dan termasuk dalam kelompok bakteri asam laktat diperoleh dari sampel susu. Aktifitas anti bakteri dicirikan dengan terbentuknya zona bening, dan dalam pengamatan diperoleh zona terlebar sebesar 15 mm dibentuk oleh E. cloacae SRUT, E. cloacae SRNU dan E. faecalis SK39 Tabel 1 dan Gambar 1.

KESIMPULAN DAN SARAN Tiga galur isolat lokal bakteri penghasil bakteriosin yang terdiri dari E. cloacae SRUT, E. cloacae SRNU dan E. faecalis SK39 potensial penghambat pertumbuhan ETEC serotipe K99 yang dapat menyebabkan diare neonatal pada anak sapi. Perlu penelitian lebih lanjut secara komprehensif dalam aplikasinya sebagai kontrol biologi pada ternak dan lingkungannya. DAFTAR PUSTAKA Anderson DC, Kress DD, Bernardini MM, Davis KC, Boss DL, Doornbos DE. 2003. The effect of scours on calf weaning weight. The Professional Animal Scientist. 19:399-403. Barrow GI, Feltham RKA, Cowan, Steel`S. 2003. Manual for the identification of medical bacteria. 3rd Ed. Cambridge University Press, UK. p. 118-119. Herreros MA, Sandoval H, González L, Castro JM, Fresno JM, Tornadijo ME. 2005. Antimicrobial activity and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a Spanish goats’ milk cheese). Food Microbiol. 22:455-459.

Gambar 1. Zona hambat yang dibentuk oleh E. faecalis SK39 terhadap E.coli K99 enterotoksigenik BCC B2422

Bakteri penghsil bakteriosin galur Nissle 1917 telah digunakan untuk mengobati diare neonatal anak sapi (Von et al. 2005). Di Jerman, galur Nissle 1917 telah disetujui sebagai persiapan probiotik untuk anak sapi sejak tahun 2001 dan saat ini dikomersialisasikan dengan merek "Ponsocol." Hasil studi mengindikasikan bahwa tiga galur BPB ini memiliki kapasitas untuk menghambat pertumbuhan ETEC serotipe K99 yang dapat menyebabkan diare neonatal pada anak sapi. Oleh karena itu, memungkinkan untuk digunakan sebagai kontrol biologi terhadap bakteri enterotoksigenik tersebut baik antar ternak maupun lingkungannya.

404

Kumar P, Ferzin S, Chintan S, Kumar GN. 2009. Isolation and characterization of potential probiotic Escherichia coli strains from rat faecal samples. Am J Infect Dis. 5:112-117. Sojka WJ. 1965. Escherichia coli in domestic animals and poultry. Commonwealth Agricultural Bureaux. Farnham Royal, Bucks, England. p. 195-196. Supar, Hirst R. 1985. Detection of enteropathogenic Escherichia coli in calves and pigs. In: Proceedinga of the fourth national congress of Indonesian Society for Mycrobiology and the first meeting of Asean Microbiology. Jakarta, 2-4 December 1985. Jakarta, Indonesia. Supar. 1996. Kolibasilosis pada anak sapi perah di Indonesia. Wartazoa. 5:26-32. Supar, Kusmiyati, Poerwadikarta MB. 1998. Aplikasi vaksin enterotoksigenik Echerichia coli (ETEC) K99, F41 polivalen pada induk sapi perah bunting dalam upaya pengendalian kolibasilosis dan kematian pedet neonatal. JITV. 3:27-33.

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2013

Swift BL, Nelms GE, Coles R. 1996. The effect of neonatal diare on subsequent weight gains in beef calves. Vet Med Small Anim Clin. 71:1269-1272. Von B, Jaekel RI, Schubotz E, Schwarz S, Stroff T, Krueger M. 2005. Escherichia coli strain Nissle 1917: significant reduction of neonatal calf diarrhae. J Dairy Sci. 88:317-323.

Wudu T, Kelay B, Mekonnen HM, Tesfu K. 2008. Calf morbidity and mortality in small holder dairy farm in Ada`a Liben district of Oromia, Ethiophia. Tropical Animal Health Production. 40:369-376. Quinn PJ, Markey BK, Carter ME, Donnelly JW, Leonard FC. 2002. Veterinary microbiology and mycrobial disease: enterobacteriaceae. Blackwell Press, Oxford, UK. p. 84-123.

405