PEMURNIAN PROTEIN Ara h3 KACANG TANAH MENGGUNAKAN TEKNIK SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

PEMURNIAN PROTEIN Ara h3 KACANG TANAH MENGGUNAKAN TEKNIK SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY Eriyanto Yusnawan*, C. P. Marquis, and N.A. Lee The University of New South Wales, Sydney, Australia

*e-mail: [email protected]

ABSTRAK Ara h3 telah diidentifikasi memiliki homologi dengan salah satu proteinase inhibitor, yaitu trypsin inhibitor. Proteinase inhibitor terdapat pada biji dan organ penyimpan fotosintat. Trypsin inhibitor berperan penting dalam mekanisme ketahanan tanaman terhadap serangan hama dan infeksi patogen. Penelitian bertujuan untuk memurnikan Ara h3 kacang tanah yang merupakan protein homolog dengan trypsin inhibitor dengan teknik size exclusion chromatography. Pemurnian dilakukan dengan menggunakan kolom Superdex 200 XK 16/60. Langkah pemurnian ini merupakan tindak lanjut setelah pemurnian parsial menggunakan kolom anion exchange. Visualisasi protein dilakukan dengan SDS-PAGE untuk mengetahui protein yang terdapat dalam masingmasing fraksi. Dua varietas kacang tanah yaitu Menzies dan Kelinci memiliki profil kromatogram Ara h3 yang berbeda. Menzies memiliki dua peak utama, sedangkan Kelinci hanya memiliki satu peak utama. Protein yang terdapat pada kedua peak dari kedua varietas tersebut terdisosiasi menjadi beberapa pita protein dengan berat molekul ∼14,5 kDa hingga ∼45 kDa. Identifikasi lebih lanjut dengan mass spectrometry yang didahului dengan 2D elektroforesis diperlukan untuk memastikan kemurnian protein yang diisolasi. Kata kunci: kacang tanah, Ara h3, isolasi, size exclusion chromatography

ABSTRACT Purification of Ara h3 from peanut using size exclusion chromatography. Ara h3 has been identified having homology with trypsin inhibitor. The trypsin inhibitor plays an important role in the plant resistance to insects and pathogens. The objective of this research was to purify Ara h3 from peanut kernels which had homology with the trypsin inhibitor using a size exclusion chromatographic technique. A Superdex 200 XK 16/60 column was employed for purification. This step was a further step after purification of Ara h3 using an anion exchange chromatography. SDSPAGE was conducted to visualize proteins eluted in each fraction. Two peanut varieties, i.e. Menzies and Kelinci had a different chromatographic profile. Menzies had two major peaks, whereas Kelinci had one major peak. The proteins from the peaks of the two varieties dissociated into several protein bands ranging from ∼14,5 kDa to ∼45 kDa. Further identification employing mass spectrometry after 2D electrophoresis was needed to determine the purity of the isolated proteins. Keywords: peanut, Ara h3, isolation, size exclusion chromatography

PENDAHULUAN Kacang tanah telah menjadi komoditas yang diperdagangkan, baik di pasar domestik maupun internasional. Empat tipe kacang tanah yang diperdagangkan di pasar internasional diolah dalam bentuk yang beragam. Tipe Virginia yang memiliki biji besar (lebar polong lebih dari 13,5 mm) terutama digunakan sebagai kacang garing (oven) dan kacang asin yang masih dalam polong maupun tanpa kulit dan makanan ringan. Tipe Spanish yang memiliki ukuran biji lebih kecil digunakan terutama sebagai bahan baku industri selai kacang tanah, kacang garing, dan makanan kecil. Tipe Valencia yang 346

Yusnawan et al: Pemurnian protein Ara H3 kacang tanah

mempunyai tiga atau empat biji dalam satu polong dan mempunyai ukuran biji yang hampir sama dengan tipe Spanish umumnya dikonsumsi sebagai kacang rebus dan kacang garing karena rasanya lebih manis dibandingkan dengan tipe kacang tanah yang lain. Tipe Runner bervariasi dalam hal ukuran biji dan pemanfaatannya sangat beragam. Kacang tanah tipe ini digunakan sebagai bahan baku selai, kacang asin, dan makanan kecil (Ory and Flick 1994, Tillman and Stalker 2009). Kacang tanah kaya akan protein, minyak, dan karbohidrat. Kadar protein kasar kacang tanah berkisar antara 25–30%, sedangkan kandungan minyak dan karbohidrat masingmasing berkisar antara 45–50% dan 5–12% (Basha 1992, Natarajan 1980, Savage and Keenan 1994, Yunginger 1996). Protein kacang tanah termasuk kedalam empat famili utama, yaitu vicillin, conglutin, glycinin, dan profilin. Keempat famili protein ini mayoritas mempunyai fungsi biologi sebagai protein biji (seed storage protein) (Van Boxtel et al. 2006, 2008, Koppelman et al. 2003, Krause et al. 2009, Wen et al. 2007). Protein utama yang menyusun kacang tanah adalah Ara h. Protein Ara h dapat menyebabkan alergi bagi sebagian konsumen yang sensitif. Beberapa Ara h, misalnya Ara h3, juga berfungsi sebagai trypsin inhibitor. Sejumlah protein Ara h sudah diidentifikasi dan dikarakterisasi. Hingga saat ini, telah diidentifikasi 13 Ara h, yaitu Ara h1 hingga Ara h13 (van Boxtel et al. 2006, 2008; Koppelman et al. 2003, Krause et al. 2009, Wen et al. 2007, www.allergen.org). Protein Ara h1, Ara h2, Ara h3, dan Ara h6 terdapat dalam jumlah yang relatif lebih banyak dibandingkan dengan Ara h yang lain. Karakteristik Ara h1 terdapat dalam bentuk oligomer, dimana monomer Ara h1 memiliki berat molekul ∼63,5 kDa dan isoelectric point (pI) 4,55 (Burks et al. 1991). Ara h2 memiliki isoform dengan berat molekul ∼18 dan ∼20 kDa (Mondoulet et al. 2005). Ara h3 terdiri dari subunit basa (basic subunit) (∼23 kDa) dan subunit asam (acidic subunit) (∼38, ∼36 kDa) (Koppelman et al. 2003), sedangkan Ara h6 memiliki berat molekul ∼16 kDa (Peeters et al. 2007). Ara h3 memiliki homologi dengan salah satu proteinase inhibitor, yaitu trypsin inhibitor (Dodo et al. 2004). Proteinase inhibitor terakumulasi pada biji dan organ penyimpan fotosintat dan menyusun 1–10% dari total protein. Proteinase inhibitor adalah pathogenesis-related (PR) proteins yang berperan penting dalam mekanisme ketahanan tanaman terhadap serangan hama dan infeksi patogen. Protein ini juga berfungsi sebagai antinutrisi dan mengandung racun yang dapat mengganggu kerja enzim pencernaan dan menghambat perkembangan serangga dan hewan. Protein ini tidak menghambat kerja enzim protease pada tanaman yang menghasilkan (Dodo et al. 2004). Teknologi pengendalian hama dan penyakit tanaman telah memanfaatkan fungsi protein ini sebagai salah satu komponen pengendalian. Tujuan penggunaan protein ini adalah untuk mengurangi dampak aplikasi pestisida secara berlebihan yang dapat mencemari lingkungan dan produk pertanian. Pemurnian dengan menggunakan teknik anion exchange chromatography menghasilkan Ara h3 dengan kemurnian parsial (Yusnawan et al. 2012). Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi protein Ara h3 dari kacang tanah varietas Menzies dan Kelinci dengan teknik kromatografi menggunakan kolom size exclusion Superdex 200 XK 16/60. Langkah pemurnian merupakan tindak lanjut setelah pemurnian parsial menggunakan kolom anion exchange.

Prosiding Seminar Hasil Penelitian Tanaman Aneka Kacang dan Umbi 2013 

347

BAHAN DAN METODE PENELITIAN Ara h3 dengan kemurnian parsial Ara h3 dengan kemurnian parsial diperoleh dari hasil isolasi ekstrak protein kacang tanah varietas Menzies dan Kelinci dengan teknik kromatografi anion exchange menggunakan kolom High Q.

Pemurnian Ara h3 menggunakan size exclusion chromatography Sebelum digunakan, kolom Superdex dikalibrasi menggunakan standard gel filtrasi (Sigma®) yang mengandung campuran berat molekul carbonic anhydrase dari bovine (29 kDa), bovine serum albumin (66 kDa), alcohol dehydrogenase dari yeast (150 kDa), βamylase dari ubijalar (200 kDa), apoferritin dari limpa kuda (443 kDa), bovine thyroglobulin (669 kDa), dan blue dextran (2.000 kDa). Fraksi protein yang mengandung Ara h3 dengan tingkat kemurnian parsial dimurnikan lebih lanjut menggunakan kolom Superdex 200 dengan kecepatan alir 0,4 ml/min pada AKTA purifier system (Pharmacia®). Buffer 20 mM Tris-HCl yang mengandung 0,15 M NaCl digunakan sebagai fase gerak. Fraksi protein ditampung pada tabung 2 ml.

Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel 4–15%. Sampel-sampel protein hasil dari size exclusion chromatography direduksi dan didenaturasi menggunakan buffer Laemmli (1:1 v/v). Sebelum dimasukkan ke dalam well, semua sampel dipanaskan pada suhu 90oC selama 15 menit. Marker dengan berat molekul 6,5; 14,2; 20; 24; 29; 36; 45; 55; 66; 97; 116; dan 200 kDa (Sigma®) digunakan sebagai referensi. Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 150 V menggunakan buffer Tris glisin pH 8,3.

HASIL DAN PEMBAHASAN Kolom Superdex 200 XK 16/60 memiliki karakteristik mampu memisahkan protein dengan berat molekul mulai dari 10 kDa hingga 105 kDa. Hasil purifikasi varietas Menzies yang mewakili tipe Runner dan Kelinci yang mewakili tipe Valencia menunjukkan perbedaan kromatogram (Gambar 1a dan 2a). Hal ini mengindikasikan bahwa Ara h3 disintesis dengan cara yang berbeda antar kedua varietas. Menzies memiliki dua peak dengan proporsi yang hampir sama antara peak pertama dan kedua, sedangkan varietas Kelinci memiliki satu peak yang dominan (peak pertama) dibandingkan dengan peak yang lain (peak kedua). Kedua peak terelusi pada menit ke ∼150 dan ∼165.

348

Yusnawan et al: Pemurnian protein Ara H3 kacang tanah

65 kDa 36 kDa 23 kDa 18 kDa

  1    2  (b) 

(a) 

Gambar 1. (a) Kromatogram Ara h3 dari varietas Menzies setelah size exclusion chromatography. Anak panah menunjukkan peak pertama (1) dan peak kedua (2), (b) SDS-PAGE setelah pemurnian dengan kolom Superdex 200, peak 1 (1) dan peak 2 (2).

65 kDa 36 kDa 23 kDa 18 kDa

    (a) 

    1    2        (b) 

Gambar 2. (a) Kromatogram Ara h3 dari varietas Kelinci setelah size exclusion chromatography. Anak panah menunjukkan peak pertama (1) dan peak kedua (2), (b) SDS-PAGE setelah pemurnian dengan kolom Superdex 200, peak 1 (1) dan peak 2 (2).

Perbedaan kromatogram Ara h3 antar varietas mungkin disebabkan oleh perbedaan biosintesis protein 11S globulin dan stabilitas struktur trimer dan heksamer dalam kadar garam 0,15 M. Protein 11S globulin memiliki berat molekul yang diperkirakan 350 kDa dan terdiri dari subunit asam dan basa. Protein ini merupakan produk dari sintesis prekursor 60 kDa preglobulin yang terdiri dari polipeptida asam dan basa yang terikat dengan ikatan kovalen yang terdeposit dalam organ penyimpanan (Barton et al. 1982). Pada organ penyimpanan, struktur trimer (∼180 kDa) mulai diproduksi (Barton et al. Prosiding Seminar Hasil Penelitian Tanaman Aneka Kacang dan Umbi 2013 

349

1982, Ereken-Turner et al. 1982). Asparagine-dependent endopeptidase kemudian memotong struktur ini dan menghasilkan N-terminal pada rangkaian asam dan C-terminal pada rangkaian basa. Kedua polipeptida ini tervisualisasi sebagai ∼35 kDa dan ∼20 kDa pada SDS-PAGE. Ikatan disulfida merangkai kedua struktur polipeptida ini menjadi subunit dan tervisualisasi ∼60 kDa pada SDS-PAGE (Staswick et al. 1981). Oligomer heksamer kemudian terbentuk sebagai unit yang sempurna dan terdiri dari enam subunit serupa (Staswick et al. 1981). Hal yang sama ditemukan oleh Rabjohn et al. (1999) yang mengungkap bahwa Ara h3 tersusun dari struktur heksamer dengan berat molekul ∼400 kDa. Ara h3 juga berbentuk sebagian sebagai struktur trimer dan umumnya sebagai struktur heksamer pada konsentrasi ion 0,2 M (Koppelman et al. 2003). Perkiraan berat molekul kedua peak varietas Menzies adalah ∼310 kDa dan ∼180 kDa, dan kedua peak varietas Kelinci memiliki perkiraan berat molekul yang hampir sama, yaitu ∼330 kDa dan ∼170 kDa (Tabel 1). Polipeptida dengan berat molekul ∼180 kDa diperkirakan adalah struktur trimer dari Ara h3, sedangkan ∼310 kDa merupakan struktur oligomer. Hal serupa ditemukan oleh Van Boxtel et al. (2006) yang memurnikan Ara h3 dengan satu langkah pemurnian. Ara h3 memiliki berat molekul ∼400 kDa yang terelusi setelah Ara h1 oligomer pada saat purifikasi menggunakan Superdex 200. Tabel 1. Perkiraan berat molekul Ara h3 menggunakan gel filtrasi (Sigma®) sebagai standard Varietas Menzies Kelinci

Elution volume (Ve) (ml) Peak 1 Peak 2 59,3 64,9 58,7 65,7

Ve/Vo Peak 1 1,4 1,4

Peak 2 1,5 1,5

Berat molekul (kDa) Peak 1 Peak 2 310 180 330 170

Vo (void volume) = 43,2 ml, merupakan elution volume dari blue dextran (2,000 kDa)

Hasil SDS-PAGE dari kedua peak Menzies menunjukkan dua pita protein utama pada subunit asam dengan berat molekul ∼42 kDa dan ∼38 kDa (Gambar 1b), sedangkan varietas Kelinci memiliki tiga pita protein utama pada subunit asam, yaitu ∼42 kDa, ∼38 kDa, dan ∼36 kDa (Gambar 2b). Satu pita protein ∼23 kDa ditemukan pada kedua varietas yang diuji. Secara umum, selain empat pita protein utama, beberapa pita protein minor mulai dari ∼12 kDa hingga ∼35 kDa tervisualisasi pada SDS-PAGE. Menurut Piersma et al. (2005), pita-pita protein ∼45, ∼43, ∼42, ∼28, ∼27, dan ∼13 kDa, dimana pada penelitian ini tervisualisasi pada ∼42, ∼38, ∼36, ∼26, dan ∼24 kDa adalah polipeptida N-terminal dari subunit asam Ara h3 yang terpotong pada posisi C-terminal yang berbeda. Di lain pihak, pita protein ∼16 dan ∼17 kDa yang dalam penelitian ini tervisualisasi pada ∼15 dan ∼16 kDa merupakan polipeptida C-terminal dari subunit asam yang terpotong pada posisi N-terminal. Perbedaan perkiraan berat molekul ini mungkin disebabkan oleh perbedaan persentase gel yang digunakan, perbedaan rentang berat molekul standard yang digunakan, dan kondisi pada saat elektroforesis.

KESIMPULAN DAN SARAN Pemurnian Ara h3 menggunakan teknik size exclusion chromatography pada varietas Menzies dan Kelinci menghasilkan kromatogram yang berbeda, keduanya merupakan subunit asam dan basa dari Ara h3. Hasil SDS-PAGE Ara h3 menunjukkan adanya keragaman polipeptida pada subunit asam. Polipeptida ∼42 kDa dan ∼38 kDa dijumpai 350

Yusnawan et al: Pemurnian protein Ara H3 kacang tanah

pada varietas Menzies, sedangkan polipeptida ∼42 kDa, ∼38 kDa, dan ∼36 kDa pada varietas Kelinci. Identifikasi lebih lanjut dengan mass spectrometry yang didahului oleh elektroforesis dua dimensi (two dimensional electrophoresis) diperlukan untuk memastikan tingkat kemurnian Ara h3 yang diisolasi.

DAFTAR PUSTAKA Barton, K.A., J.F. Thomson, J.T. Madison, R. Rosenthal, N.P. Jarvis, and R.N. Beachy. 1982. The biosynthesis and processing of high molecular weight precursors of soybean glycinin subunits. J. Biol. Chem. 257: 6089–6095. Basha, S.M. 1992. Effect of location and season on peanut seed protein and polypeptide composition. J. Agric. Food Chem. 40: 1784–1788. Burks, A.W., L.W. Williams, R.M. Helm, C. Connaughton, G. Cockrell, and T.J. O’Brien. 1991. Identification of a major peanut allergen, Ara h I, in patients with atopic dermatitis and positive peanut challenges. J. Allergy Clin. Immunol. 88: 172–179. Dodo, H.W., Viquez, O.M., Maleki, S.J. & Konan, K.N. 2004. cDNA clone of a putative peanut (Arachis hypogaea L.) trypsin inhibitor has homology with peanut allergens Ara h 3 and Ara h 4. J. Agric. Food Chem. 52: 1404–1409. Ereken-Tumer, N., J.D. Richter and N.C. Nielsen. 1982. Structural characterization of the glycinin precursors. J. Biol. Chem. 257: 4016–4018. Koppelman, S.J., E.F. Knil, R.A.A. Vlooswijk, M. Wensing, A.C. Knulst, S.L. Hefle, H. Gruppen, and S. Piersma. 2003. Peanut allergen Ara h 3: Isolation from peanuts and biochemical characterization. Allergy. 58: 1144–1151. Krause, S., G. Reese, S. Randow, D. Zennaro, D. Quaratino, P. Palazzo, M.A. Ciardiello, A. Petersen, W. Becker, and A. Mari. 2009. Lipid transfer protein (Ara h 9) as a new peanut allergen relevant for a Mediterranean allergic population. J. Allergy Clin. Immunol. 124: 771–778.e5. Mondoulet, L., E. Paty, M.F. Drumare, S. Ah-Leung, P. Scheinmann, R.M. Willemont, J.M. Wal, and H. Bernard. 2005. Influence of Thermal Processing on the Allergenicity of Peanut Proteins. J. Agric. Food Chem. 53: 4547–4553. Natarajan, K.R. 1980. Peanut protein ingredients: preparation, properties, and food uses. In Chichesters, E.M.M. and G.F. Stewart (Eds). Advances in Food Research. Academic Press. Ory, R.L. amd G.J. Flick. 1994. Peanut and cottonseed proteins for food uses. In:Hudson, B.J.F. (Ed.). New and Developing Source of Food Protein. London: Chapman & Hall. Peeters, K.A.B.M, S.J. Koppelman, E.V. Hoffen, C.W.H.V.D. Tas, C.F.D.H. Jager, A.H. Penninks, S.L. Hefle, C.A.F.M. Bruijnzeel-Koomen, E.F. Knol, and A.C. Knulst. 2007. Does skin prick test reactivity to purified allergens correlate with clinical severity of peanut allergy? Clin. Exp. Allergy. 37: 108–115. Piersma, S.R., M. Gaspari, S.L. Hefle and S.J. Koppelman. 2005. Proteolytic processing of the peanut allergen Ara h3. Molecular Nutrition and Food Research. 49: 744–755. Rabjohn, P., E.M. Helm, J.S. Stanley, C.M. West, H.A. Sampson, A.W. Burks, and G.A. Bannon. 1999.Molecular cloning and epitope analysis of the peanut allergen Ara h 3. J. Clin. Invest. 103: 535–542. Savage, G.P. and J.I. Keenan. 1994. The composition and nutritive value of groundnut kernels. In Smartt, J. (Ed.). The Groundnut Crop. London: Chapman & Hall. Staswick, P.E., M.A. Hermodson, and N.C. Nielson. 1981. Identification of the acidic and basic subunit complexes of the glycinin. J. Biol. Chem. 256: 8752–8755. Tillman, B.L. and H.T. Stalker. 2009. Peanut. In Vollmann, J. and I. Rajcan (Eds.) Oil Crops.New York: Springer. Van Boxtel, E.L., L.A.M. Van Den Broek, S.J. Koppelman, and H. Gruppen. 2008. Legumin Prosiding Seminar Hasil Penelitian Tanaman Aneka Kacang dan Umbi 2013 

351

allergens from peanuts and soybeans: Effects of denaturation and aggregation on allergenicity. Mol. Nutrition Food Res. 52: 674–682. Van Boxtel, E.L., M.M.C. Van Beers, S.J. Koppelman, L.A.M. Van Den Broek, and H. Gruppen. 2006. Allergen Ara h 1 occurs in peanuts as a large oligomer rather than as a trimer. J. Agric. Food Chem. 54: 7180–7186. Wen, H., W. Borejsza-Wysocki, W., T.R. Decory, and R.A. Durst. 2007. Peanut allergy, peanut allergens, and methods for the detection of peanut contamination in food products. Comprehensive Rev. Food Sci. Food Safety. 6: 47–58. www.allergen.org. Accessed October 2012. Yunginger, J.W. 1996. Food antigens. In Metcalfe, D.D.S. and R.A. Simon. (Eds.) Food Allergy: Adverse Reactions to Food and Food Additives. Cambridge, USA: Blackwell Science Inc. Yusnawan, E., N.A. Lee and C. Marquis. 2012. Optimasi pemurnian Ara h3 dari kacang tanah, protein homolog dengan trypsin inhibitor. Seminar Nasional Kacang-kacangan dan Umbiumbian. Malang. In press.

352

Yusnawan et al: Pemurnian protein Ara H3 kacang tanah